CN104710528A - 一种特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9纳米抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株特异性抗PRRS病毒非结构蛋白Nsp9的纳米抗体,同时公布了该纳米抗体的VHH序列以及编码该纳米抗体的DNA序列。本发明还提供了一种表达载体,其可以在Marc145细胞中表达纳米抗体-eGFP融合蛋白。本发明的抗Nsp9的纳米抗体可以特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9,并且具有抑制PRRS病毒经典毒株和高致病毒株在Marc-145细胞中增殖的功能。本发明的纳米抗体可开发成治疗PRRS的药物,其对应的基因可用于抗PRRS转基因猪的研制。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种抗PRRS病毒非结构蛋白Nsp9的纳米抗体及其在抗PRRS病毒中的应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratorysyndrome,PRRS)又名蓝耳病,是由PRRS病毒(PRRSV)感染所致的一种猪的急性传染病。由于PRRS病毒具有抗原变异性、嗜巨噬细胞性、抗体依赖性增强作用(ADE)和持续性感染等特征(Chand R J:Pathogenesis of porcine reproductive and respiratory syndromevirus.Curr Opin Virol,2012,2(3):256-263),现有疫苗对该病的保护作用非常有限,而且目前还没有抗PRRS病毒的特效药物。
PRRS病毒为单股正链RNA病毒,其基因的复制和转录依赖于病毒自身编码的非结构蛋白,其中非结构蛋白Nsp9具有RNA依赖的RNA聚合酶活性(Fang Y:The PRRSV replicase:exploring themultifunctionality of an intriguing set of nonstructuralproteins.Virus Research,2010,154(2):61-76),是病毒最重要的复制酶,并且最新的研究发现Nsp9与病毒的毒力有着密切的关系。因此Nsp9非常合适作为抗病毒药物靶点。
1993年Hamers等人发现骆驼体内存在一种仅具有重链的抗体,将其称为重链抗体(heavy-chain antibodies,HCAbs)(Hamers-Casterman C:Naturally occurring antibodies devoid oflight chains.Nature,1993,6428(363):446-448)。这类抗体的抗原结合位点仅由重链的可变区VHH(variable domain of the heavychain of HCAbs,VHH)单结构域形成。尽管天然缺失轻链可变区,却仍具有良好和广泛的抗原结合力。VHH抗体是目前所发现的具有完整功能的最小分子抗体片段,分子量为15kDa,仅为常规抗体的1/10,其分子高度4.8nm,直径2.2nm,故被称为纳米抗体(nanobody)。VHH抗体重要的特征之一是其具有更长的抗原互补结合区(CDR),可结合一些常规抗体无法接近的抗原表位,如位于酶蛋白裂隙中的活性中心结构(De Genst E:Molecular basis for the preferential cleftrecognition by dromedary heavy-chain antibodies.Proc NatlAcad Sci USA,2006,103(12):4586-4591)。另外,它还具有易表达,水溶性好,稳定性强,免疫原性弱,组织穿透性好等优点,使得该抗体作为一种小型化的基因工程抗体在基础研究、药物开发等领域有广阔的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种针对PRRS病毒非结构蛋白Nsp9并可以抑制PRRS病毒增殖的纳米抗体,同时提供该纳米抗体的编码序和一种真核表达载体。
本发明是通过以下的技术方案实现的:
一种针对PRRS病毒Nsp9的纳米抗体的VHH链,包括框架区FR和互补决定区CDR,所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列:SEQID NO:1所示的FR1,SEQ ID NO:2所示的FR2,SEQ ID NO:3所示的FR3,SEQ ID NO:4所示的FR4;所述互补决定区CDR选自下组的CDR氨基酸序列:SEQ ID NO:5所示的CDR1,SEQ ID NO:6所示的CDR2,SEQ ID NO:7所示的CDR3。
所述的VHH链具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
一种特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9纳米抗体,所述的纳米抗体来源于双峰驼重链抗体可变区片段,可以特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9,具有权利要求1和2所述的Nsp9纳米抗体的VHH链。
一种DNA序列,所述DNA序列编码所述的Nsp9纳米抗体的VHH链,或所述的纳米抗体。
所述的DNA序列具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。
一种表达载体,它含有所述的DNA序列。
所述的表达载体可以在Marc-145细胞中表达纳米抗体-eGFP融合蛋白,并可以抑制PRRS病毒在Marc-145细胞中的增殖。
所述的表达载体,具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
所述的纳米抗体在制备用于治疗和防治PRRS药物中的应用。
所述的DNA序列在开发抗PRRS转基因猪中的应用。
本发明的有益效果为:
本发明通过噬菌体展示技术筛选到了抗PRRS病毒非结构蛋白Nsp9特异性纳米抗体。此纳米抗体可以特异性结合Nsp9,利用该纳米抗体的DNA序列构建真核表达载体,将其导入Marc-145细胞,纳米抗体-eGFP以融合蛋白的形式在细胞中表达,并且具有抑制PRRS病毒增殖的功能。该纳米抗体可以开发为治疗PRRS的药物,其基因序列可用于抗PRRS转基因猪的研制。
附图说明
图1是VHH基因电泳图;其中泳道1和2是PCR扩增重链抗体可变区基因片段,泳道M是DNA分子标准。
图2是ELISA实验鉴定Nsp9纳米抗体结果。
图3是检测Marc-145细胞中表达的Nanobody-eGFP融合蛋白的Western Blot图。泳道1是Marc-145细胞,泳道2是转染了Nanobody-eGFP融合蛋白真核表达载体的Marc-145细胞。图4不同PRRSV毒株接种细胞48小时后培养上清中子代病毒滴度(TCID50)。
具体实施方式
本发明首先将Nsp9重组蛋白免疫一只阿拉善双峰驼,经过5次免疫之后分离该双峰驼外周血淋巴细胞并构建了Nsp9特异的单域重链抗体文库。将可溶性Nsp9重组蛋白包被在酶标板上,利用噬菌体展示技术筛选特异性结合Nsp9的纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库),获得了Nsp9特异性纳米抗体。构建纳米抗体真核表达载体,将其导入Marc-145细胞,胞质内表达的Nsp9纳米抗体可以高效地抑制PRRS病毒在Marc-145细胞中的增殖。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。
实施例1:针对于PRRS病毒非结构蛋白Nsp9的纳米抗体文库的构建:
(1)将5ml Nsp9重组蛋白(1mg/ml)与弗氏佐剂等体积混合并乳化均匀,免疫一只阿拉善双峰驼,每两周1次,共免疫5次,除第一次使用弗氏完全佐剂,剩余几次全部使用弗式不全佐剂。(2)4次免疫结束后,提取骆驼外周血淋巴细胞并提取总RNA,参照QIAGEN RNA提取试剂盒说明书操作。(3)按照InvitrogenIII第一链合成系统试剂盒说明书,将提取的RNA反转录成cDNA并利用套式PCR扩增VHH链,第一轮PCR:
上游引物:GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
下游引物:GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
扩增重链抗体信号肽和抗体CH2之间的片段,55℃退火,28个循环;回收700bp附近目的条带。
第二轮PCR:
以第一轮PCR回收产物作模板,
上游引物:CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGR
下游引物:CTAGTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT
扩增重链抗体可变区(VHH)基因,55℃退火,18个循环,回收目的片段,结果如图1显示,目的条带~500bp。(4)使用限制性的内切酶(购自NEB)PstI及NotI酶切20μg pCANTAB 5E噬菌体展示载体,及7μg VHH,并用T4DNA连接酶(NEB)连接两个片段。(5)将连接产物电转化至电转感受态细胞TG1中,活化后涂布于LB-AMP琼脂平板,37℃过夜培养,收集菌苔-80℃保存。与此同时,通过菌落PCR检测所建文库的阳性率,并测定库容大小及多样性,检测结果阳性率为98%,显示菌落PCR结果,库容大小为4x108具有较好的多样性。(6)取50μl-80℃保存的甘油菌,接种于100ml LB-AMP培养基,待细菌生长至对数期,用20MOI M13KO7辅助噬菌体感染TG1细胞,过夜培养后纯化噬菌体,得到骆驼纳米抗体噬菌展示基因库。
实施例2:针对Nsp9的纳米抗体筛选过程:
(1)将溶解在0.01摩尔pH7.4PBS中的Nsp9重组蛋白(10μg/孔)包被在NUNC酶标板上,4℃放置过夜,同时设立阴性对照。(2)第二天加入200微升2.5%脱脂奶粉,室温封闭2小时。(3)2小时后,每孔加入100μl噬菌体(1x1011pfu骆驼纳米抗体噬菌展示基因库),在室温下作用1小时。(4)用PBST(PBS中含有0.05%吐温20)洗15遍,洗去不结合的噬菌体。(5)用三乙基胺(100mM)洗脱与Nsp9特异性结合的噬菌体,将噬菌体感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1,产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选。经过3轮筛选,富集阳性克隆。
实施例3:用酶联免疫方法(ELISA)鉴定单个阳性克隆:
(1)经过3轮筛选后,将感染噬菌体的TG1细胞按一定稀释比例涂布于LB-AMP琼脂平板,随机挑取96个单克隆接种于TB-AMP培养基中生长至对数期后,加入终浓度1mM的IPTG,37℃培养过夜。(2)收集菌体,-20℃冻融一次,上清中应含有纳米抗体片段。(3)取100μl上清加入包被Nsp9的ELISA板孔中,同时分别取100μl上清加入对照蛋白Nsp4包被的和未包被的ELISA板孔中,室温放置1小时。(4)用PBST洗5次,加入Rabbit anti-E tag antibody(兔源多克隆抗体,购自南京金斯瑞公司),室温放置1小时。(5)用PBST洗5次,加入HRP G antiRabbit antibody(山羊抗兔辣根过氧化物标记抗体,购自Jackson公司),在室温下放置1小时。(6)用PBST洗5次,加入TMB显色底物,在405nm波长,读取吸收值。(7)当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时,判为阳性克隆孔。(8)对阳性克隆经行测序分析,最终得到抗Nsp9特异性纳米抗体,ELISA结果如图2所示,氨基酸序列为SEQID NO:9所示。
实施例4:Nsp9特异性纳米抗体在Marc-145细胞中的表达
(1)通过overlap PCR将纳米抗体基因与增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因通过GS-linker融合,并在上下游分别引入NheI和NotI酶切位点。(2)使用限制性内切酶NheI和NotI双酶切PCR产物和pEGFP–N1质粒,并用T4DNA连接酶连接两个片段,得到pEGFP–GS-Nb真核表达载体。(3)将pEGFP–GS-Nb转染Marc-145细胞,参照罗氏X-tremeGENE-HP-DNA转染试剂说明书操作,转染48h后换用G418新霉素选择性培养基加压筛选转染的细胞,在荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光的表达情况。(4)Wessern-blot进一步验证纳米抗体-eGFP融合蛋白的表达,结果如图3显示,在40kDa附近出现特异性的目的条带,说明融合蛋白表达。
实施例5:病毒感染实验
将Marc-145细胞和上述表达纳米抗体-eGFP融合蛋白的Marc-145细胞铺在24孔细胞培养板,至细胞达到80%饱和,接种0.1MOI的不同的PRRSV毒株(SD-16、JX-A1、Li-10、VR2332)。感染48h后收集细胞上清,检测病毒滴度(TCID50),结果如图4显示,表达纳米抗体-eGFP融合蛋白的Marc-145细胞子代病毒滴度显著低于Marc-145细胞。
Claims (10)
1.一种特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9纳米抗体的VHH链,包括框架区FR和互补决定区CDR,其特征在于,所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列:SEQ ID NO:1所示的FR1,SEQ ID NO:2所示的FR2,SEQ ID NO:3所示的FR3,SEQ ID NO:4所示的FR4;所述互补决定区CDR选自下组的CDR氨基酸序列:SEQ ID NO:5所示的CDR1,SEQ ID NO:6所示的CDR2,SEQ ID NO:7所示的CDR3。
2.据权利要求1所述的特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9纳米抗体的VHH链,其特征在于,具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
3.一种特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9纳米抗体,其特征在于,所述的纳米抗体来源于双峰驼重链抗体可变区片段,可以特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9,具有权利要求1和2所述的Nsp9纳米抗体的VHH链。
4.一种DNA序列,其特征在于,所述DNA序列编码权利要求1或2所述的Nsp9纳米抗体的VHH链,或权利要求3所述的纳米抗体。
5.权利要求4所述的DNA序列,其特征在于,具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。
6.一种表达载体,其特征在于,它含有权利要求4或5所述的DNA序列。
7.权利要求6所述的表达载体,其特征在于,它可以在Marc-145细胞中表达纳米抗体-eGFP融合蛋白,并可以抑制PRRS病毒在Marc-145细胞中的增殖。
8.权利要求7所述的表达载体,其特征在于,具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
9.根据权利要求3所述的纳米抗体在制备用于治疗和防治PRRS药物中的应用。
10.根据权利要求4或5所述的DNA序列在开发抗PRRS转基因猪中的应用。
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