CN116444682A - 靶向降解prrsv关键复制酶的生物型蛋白降解靶向嵌合体及其应用 - Google Patents
靶向降解prrsv关键复制酶的生物型蛋白降解靶向嵌合体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116444682A CN116444682A CN202310342828.4A CN202310342828A CN116444682A CN 116444682 A CN116444682 A CN 116444682A CN 202310342828 A CN202310342828 A CN 202310342828A CN 116444682 A CN116444682 A CN 116444682A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- spop
- targeting
- prrsv
- degradation
- protein degradation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 title claims abstract description 54
- 230000008685 targeting Effects 0.000 title claims abstract description 43
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 title claims abstract description 29
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 title claims abstract description 14
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 title description 32
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 title description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 101000642268 Homo sapiens Speckle-type POZ protein Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102100036422 Speckle-type POZ protein Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 102000006275 Ubiquitin-Protein Ligases Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108010083111 Ubiquitin-Protein Ligases Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 101800000511 Non-structural protein 2 Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 24
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 17
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 17
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 12
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 10
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 7
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 7
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 claims description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 claims description 6
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims description 4
- 108010027225 gag-pol Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 claims description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 claims description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 3
- 102000025443 POZ domain binding proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108091014659 POZ domain binding proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 206010041047 Slow virus infection Diseases 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 62
- 208000005342 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Diseases 0.000 abstract description 8
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 6
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 4
- 102000008836 BTB/POZ domains Human genes 0.000 abstract description 3
- 108050000749 BTB/POZ domains Proteins 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 56
- 101800001554 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 21
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 101800000482 Non-structural protein 9 Proteins 0.000 description 13
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 9
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 7
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 6
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 230000006663 ubiquitin-proteasome pathway Effects 0.000 description 5
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 5
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 3
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 3
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 3
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 101800000514 Non-structural protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 2
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 230000006490 viral transcription Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 1
- 102000015367 CRBN Human genes 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 101000941994 Homo sapiens Protein cereblon Proteins 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 102100023174 Methionine aminopeptidase 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000192 Methionyl aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101710144111 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 208000005107 Premature Birth Diseases 0.000 description 1
- 206010036590 Premature baby Diseases 0.000 description 1
- 101800000980 Protease nsP2 Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108010067674 Viral Nonstructural Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000002155 anti-virotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 238000010226 confocal imaging Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000008358 core component Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 208000021601 lentivirus infection Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007762 localization of cell Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000003068 pathway analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 101150036301 spop gene Proteins 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 101150003509 tag gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
- C12N5/0686—Kidney cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种靶向降解PRRSV关键复制酶的生物型蛋白降解靶向嵌合体及其应用。所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体由1至多个PRRSVnsp9纳米抗体nsp9nb及/或nsp2纳米抗体nsp2nb串联后再与E3泛素连接酶接头蛋白SPOP中BTB结构域融合后得到。本发明利用筛选出的特异性结合PRRSV关键复制酶Nsp2，Nsp9蛋白的纳米抗体，并用纳米抗体替代E3泛素连接酶复合体(SPOP)底物识别结构域，构建靶向降解PRRSV关键复制酶的生物型蛋白降解靶向嵌合体。本发明的提出为PRRS的治疗以及抗PRRS育种提供了新的技术手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种靶向降解PRRSV关键复制酶的生物型蛋白降解靶向嵌合体，还涉及该生物型蛋白降解靶向嵌合体在抑制PRRSV复制中的应用。本发明属于生物技术领域。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive andrespiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndromevirus，PRRSV)引起的一种猪的急性高度接触性传染病。发病仔猪的主要临床症状表现为严重的呼吸系统障碍以及妊娠母猪早产、胎儿死亡、木乃伊胎等严重的繁殖障碍，且易与其他病毒和细菌引起继发感染。自1987年在美国暴发以来迅速传播至全球，我国最早于1995年首次出现病例，并成为影响我国生猪养殖业的重要病原。2006年一种高致病性PRRSV以高发病率、高死亡率的特征流行于我国多个省份，给我国的生猪养殖行业造成沉重打击。2008年，美国发现了一种新基因2型毒株-NADC30，而后在我国中部地区分离出NADC30样毒株并成为我国现今优势流行毒株，命名为PRRSVNADC30-like。
PRRSV为单股正链RNA病毒，基因组全长14.9-15.5kb，由5’UTR、3’UTR及已知的11个ORFs组成，分别编码多种复制酶蛋白及结构蛋白。多种非结构蛋白相互作用形成病毒复制和转录复合体(RTC)，同时还能和一些宿主因子相互作用，引发机体对病毒复制的调控。作为病毒的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)，nsp9被认为是RTCs的核心成分。其“右手”结构域主导病毒基因组复制且能够与病毒其他蛋白及宿主细胞蛋白相互作用影响病毒的合成。此外，有研究表明病毒nsp9存在是HP-PRRSV毒力增强的因素，其中aa519、aa544、aa586、aa592四个氨基酸残基通过提高PRRSV复制效率而使HP-PRRSV致病力增强。同样，蛋白酶Nsp2也是病毒复制复合体的重要组成部分，主要负责病毒非结构蛋白的酶切加工并参与病毒的先天免疫过程。由于PRRSV具有基因多样性、易变异性、多糖屏蔽作用和抗体依赖性增强作用等逃逸宿主体液免疫应答机制的特点，为PRRSV疫苗研发不断带来新的挑战。弱毒疫苗作为防控PRRSV最有效方法之一，其安全性和交叉保护性问题突出，凭借已有商品化疫苗无法给予猪群提供完全免疫保护。目前，没有有效的治疗性药物获批上市，因此研发安全、有效的新型PRRSV疫苗和抗PRRSV药物成为PRRSV研究热点之一。
蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)由靶蛋白配体、E3泛素连接酶配体以及连接二者而特殊设计的连接肽结构3部分组成。PROTAC的靶蛋白配体招募靶蛋白，E3泛素连接酶配体和细胞内的E3泛素连接酶的底物结合区结合，从而通过连接肽将E3连接酶募集到靶点蛋白附近，形成靶蛋白-PROTAC-E3连接酶的三元复合物，促进靶蛋白的泛素化修饰并通过泛素蛋白酶体系统UBS将靶蛋白降解。自2001年以来，PROTAC分子的设计日益受到关注，从首个通过招募多肽E3诱导MetAP-2的PROTAC到基于小分子VHLA或CRBN的PROTAC，该技术已经广泛应用于多个领域，并被多种肿瘤疾病和传染性疾病用作临床治疗候选药物。目前，基于PROTAC技术已相继衍生出CMA、LYTAC、AUTAC、RIBOTAC等多种降解技术并不断丰富药物研发领域。PROTAC技术具有靶向以往不可成药性靶点，克服耐药性，通过催化发挥作用，给药浓度低，毒副作用小等优势。
抗体药物在当下已成为新型药物类型，目前已有超过100种抗体药物在全球获批上市，而且还在快速增加。纳米抗体(Nanobody,Nb)为骆驼重链抗体(HCAbs)可变结构域衍生而来的单链抗体片段(VHH)，体外表达分子量仅约15kDa，晶体结构直径约2.5nm。由于其体积小易于遗传操作、组织渗透能力好、特异性强等特点，目前已被广泛用于开发治疗性抗体药物。周恩民等研究团队分别筛选了针对PRRSV nsp9和nsp4蛋白的纳米抗体，利用其能够特异性结合nsp4和nsp9并间接阻止病毒复制和转录复合体组装的能力，在Marc-145细胞上初步验证了其抗PRRSV效果。随后又将抗PRRSV的纳米抗体连接细胞穿膜肽(Cell-penetrating peptides，CPPs)，使其穿入易感细胞并抑制PRRSV的复制。由此可见纳米抗体在抗PRRSV方面的优越性。
由于目前许多癌症及抗病毒药物都面临着靶标特异性和规避耐药性问题，PROTAC技术在新型抗病毒药物的开发中占据有利地位。其另一个潜在优势在于消除了靶蛋白的所有功能(酶活性、特定结构)，达到更好的药效，且能够降解不具有药物催化活性或功能未知的病毒蛋白。丙型肝炎病毒(HCV)的NS3/4A、流感病毒H1N1的NA等病毒蛋白相继被作为PROTAC抗病毒分子的理想作用靶点。因此由抗体和PROTAC技术相结合的药物具有更多的优势。相关研究已开发出使用纳米抗体取代E3泛素连接酶复合体中底物识别结构域，构建生物型蛋白降解靶向嵌合体(bioPROTAC)分子，促进细胞内源性蛋白质的靶向降解，并被广泛用作药物开发策略。
本发明利用筛选出的特异性结合PRRSV关键复制酶Nsp2，Nsp9蛋白的纳米抗体，并用纳米抗体替代E3泛素连接酶复合体(SPOP)底物识别结构域，构建靶向降解PRRSV关键复制酶的生物型蛋白降解靶向嵌合体。该生物型蛋白降解靶向嵌合体具有开发成PRRS治疗性药物的潜力以及为抗PRRS育种策略提供研究基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向降解PRRSV关键复制酶的生物型蛋白降解靶向嵌合体(Nspxnb-SPOP)及一种稳定表达该Nspxnb-SPOP分子的细胞系用于表达纯化Nspxnb-SPOP分子及其在抗病毒及抗PRRS育种领域中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明通过真核表达载体pCDNA3.1和原核表达载体pGEX-6P-1分别构建PRRSVnsp9纳米抗体(nsp9nb)、nsp2纳米抗体(nsp2nb)与E3泛素连接酶接头蛋白SPOP中BTB结构域的融合表达系统。并通过真核表达载体pCAGGS分别构建PRRSVnsp9，nsp2靶蛋白真核表达系统，通过GST Pull down与Co-IP实验证明作为靶蛋白配体的nsp9nb与nsp2nb对于作为靶标蛋白的nsp9和nsp2蛋白具有良好的亲和力，并且Nsp2nb-SPOP，Nsp9nb-SPOP分子与靶蛋白无论在体外还是细胞内均表现良好的相互作用。
以靶蛋白和NspXnb-SPOP分子真核表达质粒共转染的方式验证nsp9nb-SPOP分子对nsp9蛋白的降解作用，并通过将两个nsp9nb及两个nsp2nb分别串联后连接，并以柔性多肽连接构建的(NspXnb)2-SPOP分子，利用Western blot、激光共聚焦成像等方式验证其具备更好的降解效果，进一步验证(NspXnb)2-SPOP降解靶蛋白呈剂量依赖性关系以及靶向降解作用起始时间。
以泛素分子真核表达质粒与靶蛋白和Nsp9nb-SPOP分子真核表达质粒共转染的方式进行Co-IP实验，验证泛素化反应的发生。用泛素蛋白酶体途径抑制剂MG132处理共转染24h后的293T细胞，检测到靶蛋白的降解受到明显抑制，进一步证明该Nsp9nb-SPOP分子降解靶蛋白的途径为泛素蛋白酶体途径。以仅表达FLAG的空载质粒为对照，进行间接免疫荧光实验，激光共聚焦镜下观察发现未处理组靶蛋白(nsp9)主要存在于胞质，Nsp9nb-SPOP分子主要定位于细胞核内并以复合体核斑点形式存在；经过Nsp9nb-SPOP分子处理的nsp9靶蛋白信号显著降低，且SPOP复合体核斑点的现象不明显，并散在出现于胞质内与靶蛋白共定位，说明Nsp9nb-SPOP分子特异性靶向靶蛋白并在胞质内发挥一定的降解作用；通过在Marc-145细胞中分别转染(Nsp9nb)2-SPOP，(Nsp2nb)2-SPOP分子24小时后感染100TCID50的PRRSV病毒的实验进一步验证(NspXnb)2-SPOP分子的抗PRRSV活性。
以编码目的基因的PLEX-(nsp9nb)2-SPOP-IRES-Cherry质粒、包装质粒GAG POL及VSVG三种质粒组成慢病毒包装系统，共转染293T细胞进行慢病毒包装，收获的慢病毒经浓缩后感染Marc-145细胞，并通过流式分选筛选出阳性单克隆细胞经扩大培养后，得到稳定表达(Nsp9nb)2-SPOP分子的Marc-145细胞系，命名为Marc-145-(Nsp9nb)2-SPOP，用于Nsp9nb-SPOP蛋白的纯化，抗PRRSV感染效率以及(NspXnb)2-SPOP在PRRSV抗病育种方面的研究。
在上述研究的基础上，本发明提出了一种靶向降解猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)关键复制酶的生物型蛋白降解靶向嵌合体，所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体由1至多个PRRSV nsp9纳米抗体nsp9nb及/或nsp2纳米抗体nsp2nb串联后再与E3泛素连接酶接头蛋白SPOP中BTB结构域融合后得到。
其中，优选的，所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6-9任一所示。
编码所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体的多核苷酸也在本发明的保护范围之内。其中，优选的，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-5任一所示。
进一步的，本发明还提出了一种表达载体，所述的载体中含有所述的多核苷酸。
其中，优选的，所述的载体为原核表达载体或真核表达载体。更优选的，所述的真核表达载体为pCAGGS，所述的原核表达载体为pGEX-6P-1。
更进一步的，本发明还提出了一种稳定表达所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体的Marc145细胞系，所述的细胞系通过以下方法构建得到：
(1)以含有编码所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体基因的质粒、包装质粒GAG POL及VSVG三种质粒组成慢病毒包装系统，待293T细胞长至80％-90％，弃掉一半培养基后，以3：2：1的比例转染293T细胞，转染6h后，换成2ml含有5％v/vFBS的DMEM培养基；
(2)转染后24h收取细胞培养上清并置于4℃保存，293T细胞补液2ml继续培养，转染后48h收上清，将所收集到的所有细胞上清混合后，4℃离心去沉淀，用0.45um滤膜过滤后分装，长期保存于-80℃备用；
(3)慢病毒感染：将1.0×105个Marc-145细胞均匀接种于6孔板，待细胞融合度达到50％时，将1mlDMEM与1ml慢病毒充分混合后，加入Marc-145细胞中并置于37℃孵育1.5至2h，然后将细胞培养液换成用含10％v/v FBS的DMEM培养基继续培养；
(4)慢病毒感染48h后，使用流式分选系统根据荧光信号将表达红色荧光信号的阳性细胞按照每孔1个细胞的密度分选至96孔板中培养继续培养，最终得到稳定表达权利要求1所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体的Marc145细胞系。
更进一步的，本发明还提出了所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体在制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的用途。以及
所述的表达载体在制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的用途。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明利用特异性结合PRRSVNsp9和Nsp2蛋白的纳米抗体，与E3泛素连接酶配体(SPOP)相结合的策略，研制出NspXnb-SPOP纳米抗体药物构建平台可用于抗PRRSV小分子开发研究。利用该策略研制出的NspXnb-SPOP以及(NspXnb)2-SPOP小分子通过劫持宿主体内的泛素蛋白酶体系统高效且特异性靶向降解PRRSV关键复制酶中的Nsp9和Nsp2蛋白，从而有效降低PRRSV在细胞内的复制效率，其中(Nsp9nb)2-SPOP小分子可以减少70％以上PRRSV引起的细胞病变效应，具有高效抗PRRSV感染的效果。Nsp9和Nsp2非结构蛋白是PRRSV RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)的重要组成蛋白，这两种蛋白与病毒基因组复制和非结构蛋白的酶切加工密切相关，针对这两种蛋白的靶向降解将抑制PRRSV的基因组合成，影响病毒的复制能力。因此，NspXnb-SPOP以及(Nsp9nb)2-SPOP小分子用于PRRSV治疗药物使用，可以作为PRRSV疫苗防控的补充手段。达到抑制PRRSV在宿主体内复制，减少动物发病程度和病毒扩散，降低PRRSV感染引起的动物死亡率，提高养猪企业经济效益的目的。此外，本发明研发的NspXnb-SPOP平台作为抗病毒小分子开发策略，也可以通过快速替换相应的特异性纳米抗体用于其他种类病毒的药物研发工作。此外，本发明建立的能够稳定表达(NspXnb)2-SPOP小分子的稳定表达细胞系，也可用于(NspXnb)2-SPOP小分子表达，纯化以及(NspXnb)2-SPOP分子在抗病育种方面的研究工作，为PRRSV抗病育种提供新的研究靶点。
附图说明
图1为nsp9nb-SPOP小分子与靶蛋白nsp9相互作用关系验证；
其中，图A.SDS-PAGE检测GST-flag-nsp9nb-SPOP真核表达体系nsp9nb-SPOP表达结果(1：GST-flag-nsp9nb-SPOP；2：GST)；图B.GST pull-down检测结果(1.Input(HA-nsp9)；2.Pull down(GST+HA-nsp9)；3.Pull down(GST-flag-nsp9nb-SPOP+HA-nsp9)；图C.Co-IP检测结果(使用FLAG标签抗体beads进行孵育，用HA和FLAG标签抗体进行WB检测相互作用蛋白)；
图2为验证Nsp9nb-SPOP分子对靶蛋白降解功能及降解途径分析；
其中，图A.Nsp9nb-SPOP分子在转染后24h对靶蛋白nsp9表现出显著降解效果；图B.靶蛋白nsp9与Nsp9nb-SPOP分子共表达时检出明显的泛素化信号；图C.使用MG132抑制剂能够明显抑制Nsp9nb-SPOP降解nsp9的效率，说明Nsp9nb-SPOP小分子主要通过泛素蛋白酶体途径靶向降解nsp9蛋白；
图3为(NspXnb)2-SPOP分子对靶蛋白的降解效率分析；
其中，图A.(Nsp9nb)2-SPOP分子对靶蛋白nsp9表现出显著的剂量依赖性降解效果；图B.(Nsp9nb)2-SPOP分子对靶蛋白nsp9具有显著长效降解效果；图C.(Nsp9nb)2-SPOP小分子显著降低nsp9蛋白在细胞内的表达水平；图D.(Nsp9nb)2-SPOP分子同样能够显著靶向降解细胞内nsp2蛋白表达量；
图4为(NspXnb)2-SPOP小分子抗PRRSV感染效果验证；
其中，(Nsp9nb)2-SPOP和(Nsp2nb)2-SPOP小分子具有显著的抗PRRSV病毒感染的效果。能够明显减少PRRSV感染引起的致细胞病变作用。
图5为构建(Nsp9nb)2-SPOP稳定表达细胞系。
其中，构建得到能够稳定表达(Nsp9nb)2-SPOP小分子的细胞系，稳定表达细胞系中(Nsp9nb)2-SPOP小分子在细胞核中高效表达。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明不限于以下实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神及范围下可对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1、靶向降解PRRSV关键复制酶的生物型蛋白降解靶向嵌合体NspXnb-SPOP的构建及与靶点蛋白相互作用验证
1.1生物型蛋白降解靶向嵌合体NspXnb-SPOP的构建及表达
参考NCBI数据库公布的我国高致病性PRRSV HuN4(EF635006.1)、猪源SPOP基因(XM_021067137.1)以及本实验保存的nsp9纳米抗体(nsp9nb)以及nsp2纳米抗体(nsp2nb)真核表达质粒图谱，分别设计针对PRRSVNsp9，Nsp2全长、nsp9纳米抗体、nsp2纳米抗体与SPOPBTB结构域(499-1125)的扩增引物(其中nsp9纳米抗体及nsp2纳米抗体上游扩增引物携带FLAG标签基因)，并委托睿博兴科生物科技有限公司合成，相关引物序列见表1。
表1引物序列
分别采用本实验室保存的高致病性HuN4毒株、本实验室保存nsp9nb真核表达质粒、nsp2nb真核表达质粒及猪肺泡巨噬细胞基因组为模板，分别使用Nsp9 F/R、Nsp2F/R、6P-1-FLAG-9nb F/R、6P-1-FLAG-2nb F/R、SPOP F/R通过PCR扩增nsp9全长序列、nsp2全长序列、携带FLAG标签的nsp9nb序列、携带FLAG标签的nsp2nb序列及猪源SPOP序列，并使用同源重组酶将扩增得到的nsp9及nsp2全长片段克隆至经EcoR1与Xhol1双酶切后的真核表达质粒pCAGGS-HA中。将扩增得到携带FLAG标签的nsp9nb序列及nsp2nb序列克隆至经限制性内切酶BamH1与Xhol1双酶切后的原核表达质粒pGEX-6p-1中，并在下游引入酶切位点Kpn1后将猪源SPOP序列克隆至Kpn1与Xhol1之间，构建完整FLAG-nsp9nb-SPOP或FLAG-nsp2nb-SPOP分子。使用酶切、T4连接酶连接等方法将FLAG-nsp9nb-SPOP或FLAG-nsp2nb-SPOP分子分别克隆至真核表达质粒pCDNA3.1的BamH1与Xhol1酶切位点之间以及pLEX-IRES-Cherry的BamH1位点处。通过进一步将两个携带FLAG标签的nsp9nb及两个nsp2nb分别串联后连接，并以柔性多肽连接猪源SPOP序列构建的(NspXnb)2-SPOP分子，最终得到原核重组质粒pGEX-6p-1-FLAG-nsp9nb-SPOP、pGEX-6p-1-FLAG-(nsp9nb)2-SPOP、pGEX-6p-1-FLAG-nsp2nb-SPOP、pGEX-6p-1-FLAG-(nsp2nb)2-SPOP、pGEX-6p-1-FLAG-nsp9nb-nsp2nb-SPOP。真核重组质粒pCAGGS-HA-nsp9、pCAGGS-HA-nsp2、pCDNA3.1-FLAG-nsp9nb-SPOP、pCDNA3.1-FLAG-(nsp9nb)2-SPOP、pCDNA3.1-FLAG-nsp2nb-SPOP、pCDNA3.1-FLAG-(nsp2nb)2-SPOP、pCDNA3.1-FLAG-nsp9nb-nsp2nb-SPOP、pLEX-FLAG-nsp9nb-SPOP-IRES-Cherry、pLEX-FLAG-(nsp9nb)2-SPOP-IRES-Cherry、pLEX-FLAG-nsp2nb-SPOP-IRES-Cherry、pLEX-FLAG-(nsp2nb)2-SPOP-IRES-Cherry、pLEX-FLAG-nsp9nb-nsp2nb-SPOP-IRES-Cherry、以及pLEX-FLAG-9nb-IRES-Cherry、pLEX-FLAG-nbn-SPOP-IRES-Cherry(其中，nbn为一种不与nsp9发生反应的纳米抗体)等相关对照质粒，其中，nsp9nb-SPOP、nsp2nb-SPOP、(nsp9nb)2-SPOP、(nsp2nb)2-SPOP以及nsp9nb-nsp2nb-SPOP的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-5所示，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6-9所示。
首先通过“热激”法，将重组质粒pGEX-6p-1-FLAG-nsp9nb-SPOP与pGEX-6p-1空载质粒转化到感受态菌BL21(DE3)中进行表达，接种具备氨苄霉素抗性的LB固体培养基，置于37℃过夜培养(14～16小时)。挑取阳性菌落扩大培养，待OD值在0.6～0.8之间加入终浓度1μM的IPTG进行诱导，以220r/min，16℃条件下培养20h。收取菌液进行超声破碎处理，经SDS-PAGE分析蛋白实现可溶性表达，使用GST亲和层析介质进行纯化后SDS-PAGE结果如图1A所示，GST-nsp9nb-SPOP融合表达蛋白分子量在65.5kDa，GST空载蛋白分子量在25.5kDa。
使用PEI转染试剂，以质粒(μg)：剂量(μl)为1:3的比例将重组质粒pCAGGS-HA-nsp9转染至293T细胞中，36h后收取并裂解细胞提取蛋白。准备两个EP管，每管50μlGSTbeads，4℃，1000g离心5min，除乙醇保护液，再1ml PBS洗涤3次；取同等浓度GST与GST-nsp9nb-SPOP融合蛋白加入EP管中，4℃旋转孵育过夜；4℃，1000g离心2min，吸出上清，再1ml PBS洗涤3次；每管加入200μl细胞裂解液，4℃环境旋转孵育4h；4℃，1000g离心2min，吸出上清，再1ml PBS洗涤3次；最后每管加40μl PBS和10μl 5×loading buffer，制样后进行WB检测。结果如图1B所示，在靶蛋白HA-nsp9都存在的情况下，利用GST亲和树脂分别沉淀GST蛋白与GST-nsp9nb-SPOP融合蛋白，泳道2中未检测到靶蛋白，而泳道3中检测到靶蛋白，说明靶蛋白在体外与GST-nsp9nb-SPOP融合蛋白存在相互作用。
使用PEI转染试剂，以质粒(μg)：剂量(μl)为1:3的比例将重组质粒pCAGGS-HA-nsp9与pCDNA3.1-FLAG-nsp9nb-SPOP分别各自转染及共同转染至293T细胞中，36h后分别收取并裂解细胞提取蛋白，各取20μl裂解液作Input对照；准备3个EP管，每管加入30μlFLAGbeads和150μl裂解液，4℃环境下摇床感作过夜；4℃，5000g离心5min；弃上清后用1mlRIPA洗涤树脂3次；最后一次离心后加入适量PBS与2×loading buffer，制样后进行WB检测。结果如图1C所示，靶蛋白与Nsp9nb-SPOP融合蛋白在细胞内存在相互作用。上述实验证明作为靶蛋白配体的nsp9纳米抗体对于作为靶标蛋白的nsp9蛋白具有良好的亲和力，为进一步研究Nsp9nb-SPOP分子对靶标蛋白降解功能的验证奠定基础。
实施例2、Nsp9nb-SPOP小分子对靶标蛋白降解的效果及主要降解途径分析
使用1μg pCAGGS-HA-nsp9分别与0μg、1μg的剂量的pCDNA3.1-FLAG-nsp9nb-SPOP共同转染293T细胞，并在转染后的12h和24h分别收取细胞蛋白样品，并进行westernblot验证nsp9nb-SPOP分子对nsp9蛋白的降解作用。结果如图2A所示，在转染24h后开始观察到有降解作用，靶向降解Nsp9蛋白的效率达到40％。将pCDNA3.1-FLAG-Ub、pCAGGS-HA-nsp9与pCDNA3.1-FLAG-nsp9nb-SPOP共同转染293T细胞，24h后收取细胞蛋白样品。准备2个EP管，使用去尖枪头每管加入100μl ProteinA/GAgarose，4℃预冷PBS，3000rpm离心3min，重复清洗3次；每管加入稀释后的HA标签抗体与ProteinA/GAgarose偶联，4℃旋转混匀2h；每管加入70μl细胞裂解液，4℃孵育过夜；PBS离心清洗3次，吸除上清，处理沉淀进行westernblot。结果如图2B所示，当靶蛋白nsp9与Nsp9nb-SPOP分子共表达细胞时检出明显的泛素化信号，说明Nsp9nb-SPOP分子激活了nsp9蛋白的泛素化。使用一定剂量泛素蛋白酶体途径抑制剂MG132在单独转染表达nsp9与共转染表达nsp9和Nsp9nb-SPOP的293T细胞中处理4h，裂解细胞提蛋白，处理后进行westernblot。结果如图2C所示，使用终浓度为20μm的MG132处理细胞后，靶蛋白的降解受到明显抑制，进一步证明Nsp9nb-SPOP小分子通过泛素蛋白酶体途径靶向降解nsp9蛋白。
实施例3、(NspXnb)2-SPOP小分子降解靶标蛋白效果分析
为进一步提高Nsp9nb-SPOP的降解效率，在此基础上构建pCDNA3.1-FLAG-(nsp9nb)2-SPOP真核表达系统，在SPOP BTB结构域的N端串联两个nsp9nb，三者之间以柔性多肽进行连接，命名为(Nsp9nb)2-SPOP。分别以0μg、1μg、2μg、3μg的剂量的上述质粒与1μgpCAGGS-HA-nsp9共同转染293T细胞36后收取细胞蛋白样品，并进行western blot，结果如图3A所示，新型(nsp9nb)2-SPOP对靶蛋白nsp9的降解效果显著增强且呈剂量依赖性。使用1μgpCAGGS-HA-nsp9与3μg的pCDNA3.1-FLAG-(nsp9nb)2-SPOP共转染293T细胞，分别于6h至36h，6个时间点收取细胞蛋白样品并进行western blot验证。结果如图3B所示，靶蛋白在转染后18h后开始被大量检测到，而(Nsp9nb)2-SPOP处理组仅有少量靶蛋白信号，并且随着时间延长，靶蛋白信号未见明显增强，说明(Nsp9nb)2-SPOP分子可以高效靶向降解PRRSVnsp9蛋白。此外，将293T细胞接种于共聚焦小皿，待细胞长满90％的时候，进行pCAGGS-HA-nsp9质粒分别与pCDNA3.1-FLAG-(nsp9nb)2-SPOP及pCDNA3.1空载共转染，在转染后36h，使用多聚甲醛固定，0.3％Triton X-100透膜，1％BSA封闭后依次使用鼠源Flag单抗和兔源HA一抗室温孵育1h，而后分别用稀释后的Alexa FluorTM 568goat anti-mouse IgG和AlexaFluorTM 488goat anti-rabbit IgG作为荧光二抗室温孵育1h，封片后用激光共聚焦显微镜进行检测。观察nsp9绿色荧光细胞定位和表达水平并针对荧光表达进行统计学分析，结果如图3C所示。与空载体对照组比较，(Nsp9nb)2-SPOP小分子处理组明显降低nsp9蛋白的表达水平显著降低，说明(Nsp9nb)2-SPOP对靶蛋白nsp9发挥非常强的靶向降解作用，可以有效降低PRRSV nsp9在细胞内的含量，可用于后续降解条件优化、功能验证及抗病毒应用的研究。与此同时，针对(Nsp2nb)2-SPOP靶向降解Nsp2蛋白的效率也通过western blot实验进行了验证。使用1μg pCAGGS-HA-nsp2与3μg的pCDNA3.1-FLAG-(nsp2nb)2-SPOP共转染293T细胞，36h后收取细胞蛋白进行，结果如图3D所示，(Nsp2nb)2-SPOP小分子同样可以高效靶向降解PRRSVNsp2蛋白。以上结果说明，通过串联纳米抗体增加抗体与靶蛋白的亲和力，(NspXnb)2-SPOP小分子构建策略可以提高靶向降解PRRSV关键复制复合体蛋白的效率。
实施例4、(NspXnb)2-SPOP小分子抗病毒效果验证
将质粒pCDNA3.1-FLAG-(nsp9nb)2-SPOP、pCDNA3.1-FLAG-(nsp2nb)2-SPOP分别转染生长至融合程度达到60％-70％的Marc-145细胞，在转染后24h接种100TCID50剂量的PRRSV感染性克隆株(HuN4-GFP)，分别于接毒后72h及96h镜下观察并拍照记录如图4。荧光结果显示PRRSV感染转染有(Nsp9nb)2-SPOP及(Nsp2nb)2-SPOP小分子的细胞引起的细胞致病变作用显著低于空白对照组，其中Nsp9nb-SPOP的抑制细胞病变作用高于70％。初步证明(NspXnb)2-SPOP分子在体外水平具备抗病毒活性。
实施例5、稳定表达(Nsp9nb)2-SPOP的Marc145细胞系的构建
以编码目的基因的pLEX-(nsp9nb)2-SPOP-IRES-Cherry质粒、包装质粒GAG POL及VSVG三种质粒组成慢病毒包装系统，待293T细胞长至80％-90％，弃掉一半培养基后，以3：2：1的比例转染293T细胞，转染6h后，换成2ml含有5％FBS的DMEM培养基。转染后24h收取细胞培养上清并置于4℃保存，293T细胞补液2ml继续培养。转染后48h收上清。将所收集到的所有细胞上清混合后，4℃离心去沉淀，用0.45um滤膜过滤后分装，长期保存于-80℃备用。慢病毒感染：将1.0×105个Marc-145细胞均匀接种于6孔板，待细胞融合度达到50％时，将1ml DMEM与1ml慢病毒充分混合后，加入Marc-145细胞中并置于37℃孵育1.5至2h，然后将细胞培养液换成用含10％FBS的DMEM培养基继续培养。慢病毒感染48h后，使用流式分选系统根据荧光信号将表达红色荧光信号的阳性细胞按照每孔1个细胞的密度分选至96孔板中培养继续培养。最终成功得到3株稳定表达(Nsp9nb)2-SPOP的Marc145细胞系。
Claims (10)
1.靶向降解猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)关键复制酶的生物型蛋白降解靶向嵌合体，其特征在于，所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体由1至多个PRRSVnsp9纳米抗体nsp9nb及/或nsp2纳米抗体nsp2nb串联后再与E3泛素连接酶接头蛋白SPOP中BTB结构域融合后得到。
2.如权利要求1所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体，其特征在于，所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6-9任一所示。
3.编码权利要求1或2所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO.1-5任一所示。
5.一种表达载体，其特征在于，所述的载体中含有权利要求3或4所述的多核苷酸。
6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述的载体为原核表达载体或真核表达载体。
7.如权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述的真核表达载体为pCAGGS，所述的原核表达载体为pGEX-6P-1。
8.一种稳定表达权利要求1所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体的Marc145细胞系，其特征在于，所述的细胞系通过以下方法构建得到：
(1)以含有编码权利要求1所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体基因的质粒、包装质粒GAGPOL及VSVG三种质粒组成慢病毒包装系统，待293T细胞长至80％-90％，弃掉一半培养基后，以3：2：1的比例转染293T细胞，转染6h后，换成2ml含有5％v/vFBS的DMEM培养基；
(2)转染后24h收取细胞培养上清并置于4℃保存，293T细胞补液2ml继续培养，转染后48h收上清，将所收集到的所有细胞上清混合后，4℃离心去沉淀，用0.45um滤膜过滤后分装，长期保存于-80℃备用；
(3)慢病毒感染：将1.0×105个Marc-145细胞均匀接种于6孔板，待细胞融合度达到50％时，将1mlDMEM与1ml慢病毒充分混合后，加入Marc-145细胞中并置于37℃孵育1.5至2h，然后将细胞培养液换成用含10％v/vFBS的DMEM培养基继续培养；
(4)慢病毒感染48h后，使用流式分选系统根据荧光信号将表达红色荧光信号的阳性细胞按照每孔1个细胞的密度分选至96孔板中培养继续培养，最终得到稳定表达权利要求1所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体的Marc145细胞系。
9.权利要求1或2所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体在制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的用途。
10.权利要求5或7任一项所述的表达载体在制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310342828.4A CN116444682B (zh) | 2023-03-31 | 2023-03-31 | 靶向降解prrsv关键复制酶的生物型蛋白降解靶向嵌合体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310342828.4A CN116444682B (zh) | 2023-03-31 | 2023-03-31 | 靶向降解prrsv关键复制酶的生物型蛋白降解靶向嵌合体及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116444682A true CN116444682A (zh) | 2023-07-18 |
| CN116444682B CN116444682B (zh) | 2023-12-08 |
Family
ID=87134989
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310342828.4A Active CN116444682B (zh) | 2023-03-31 | 2023-03-31 | 靶向降解prrsv关键复制酶的生物型蛋白降解靶向嵌合体及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116444682B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104710528A (zh) * | 2015-03-13 | 2015-06-17 | 西北农林科技大学 | 一种特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9纳米抗体及其应用 |
| CN107299133A (zh) * | 2017-06-09 | 2017-10-27 | 上海长海医院 | 一种前列腺癌的标志物spop及其在指导肿瘤治疗中的应用 |
| CN110055272A (zh) * | 2019-04-18 | 2019-07-26 | 西北农林科技大学 | 一种抑制prrs病毒增殖的靶向抗体治疗剂 |
| CN111057145A (zh) * | 2019-11-22 | 2020-04-24 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白纳米抗体及其应用 |
| WO2022081928A1 (en) * | 2020-10-14 | 2022-04-21 | C4 Therapeutics, Inc. | Tricyclic heterobifunctional compounds for degradation of targeted proteins |
| CN114891119A (zh) * | 2022-04-29 | 2022-08-12 | 青岛大学附属医院 | 降解PD-L1的生物大分子靶向蛋白水解嵌合体BioPROTAC及其制备方法和应用 |
-
2023
- 2023-03-31 CN CN202310342828.4A patent/CN116444682B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104710528A (zh) * | 2015-03-13 | 2015-06-17 | 西北农林科技大学 | 一种特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9纳米抗体及其应用 |
| CN107299133A (zh) * | 2017-06-09 | 2017-10-27 | 上海长海医院 | 一种前列腺癌的标志物spop及其在指导肿瘤治疗中的应用 |
| CN110055272A (zh) * | 2019-04-18 | 2019-07-26 | 西北农林科技大学 | 一种抑制prrs病毒增殖的靶向抗体治疗剂 |
| CN111057145A (zh) * | 2019-11-22 | 2020-04-24 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白纳米抗体及其应用 |
| WO2022081928A1 (en) * | 2020-10-14 | 2022-04-21 | C4 Therapeutics, Inc. | Tricyclic heterobifunctional compounds for degradation of targeted proteins |
| CN114891119A (zh) * | 2022-04-29 | 2022-08-12 | 青岛大学附属医院 | 降解PD-L1的生物大分子靶向蛋白水解嵌合体BioPROTAC及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HUAWEI LI: "Research Progress on Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus NSP7 Protein", ANIMALS, vol. 13, no. 14, pages 1 - 11 * |
| 朱惠惠等: "泛素特异性蛋白酶在抗病毒感染免疫中的作用研究进展", 浙江大学学报, vol. 44, no. 5, pages 578 - 583 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116444682B (zh) | 2023-12-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111560074B (zh) | 一种基于幽门螺旋杆菌铁蛋白的新型冠状病毒s蛋白单区域亚单位纳米疫苗 | |
| CN111217919B (zh) | 一种基于火球菌铁蛋白的新型冠状病毒s蛋白双区域亚单位纳米疫苗 | |
| CN111217918B (zh) | 一种基于2,4-二氧四氢喋啶合酶的新型冠状病毒s蛋白双区域亚单位纳米疫苗 | |
| CN111607002B (zh) | 一种基于幽门螺旋杆菌铁蛋白的新型冠状病毒s蛋白双区域亚单位纳米疫苗 | |
| CN112175086B (zh) | 一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体及应用 | |
| CN110327461B (zh) | 一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用 | |
| CN111304253B (zh) | 非洲猪瘟病毒疫苗、其制备方法与应用 | |
| US20230203137A1 (en) | Preparation method of artificial antibody | |
| WO2016106178A1 (en) | Multitargeting onocolytic adenovirus, methods of use, and methods of making | |
| CN111718958B (zh) | 一种兔出血症病毒1型和2型vp60二价重组杆状病毒载体灭活疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN107586322B (zh) | 牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原表位多肽及其抑制剂和单抗及其应用 | |
| CN116444682B (zh) | 靶向降解prrsv关键复制酶的生物型蛋白降解靶向嵌合体及其应用 | |
| CN112279921A (zh) | 用于胞内递送分子的复合物 | |
| WO2023159887A1 (zh) | 制备猪源干扰素δ5的方法和猪源干扰素δ5的应用 | |
| CN116444661A (zh) | 一种广谱中和SARS-CoV-2的中和抗体P186-1H2及其应用 | |
| WO2022116528A1 (zh) | 环状rna、包含环状rna的疫苗及用于检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒 | |
| CN115160435A (zh) | 一种双特异性抗hiv-1抗体 | |
| CN117362417A (zh) | 广谱中和沙贝病毒的抗体及其应用 | |
| CN110893240B (zh) | Nme2基因在抑制禽呼肠病毒复制中的应用 | |
| US20030148265A1 (en) | Anti-viral conjugate comprising a factor allowing the translocation of a protein across a cell membrane and comprising a single-chain antibody fragment directed against a viral protein | |
| CN1517437B (zh) | 特异性治疗肿瘤或胞内感染的疫苗及应用 | |
| CN113912708B (zh) | 单域重链抗体及其编码基因和制备方法及应用和药物组合物 | |
| CN115725724B (zh) | Pop基因或蛋白为靶点在筛选抑制小rna病毒科病毒复制药物中的应用 | |
| CN114907490B (zh) | 强效双功能hiv进入抑制剂及其应用 | |
| CN113880947B (zh) | 小分子抗体及其编码基因和制备方法及应用和药物组合物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |