CN116444682A - 靶向降解prrsv关键复制酶的生物型蛋白降解靶向嵌合体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向降解PRRSV关键复制酶的生物型蛋白降解靶向嵌合体及其应用。所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体由1至多个PRRSVnsp9纳米抗体nsp9nb及/或nsp2纳米抗体nsp2nb串联后再与E3泛素连接酶接头蛋白SPOP中BTB结构域融合后得到。本发明利用筛选出的特异性结合PRRSV关键复制酶Nsp2，Nsp9蛋白的纳米抗体，并用纳米抗体替代E3泛素连接酶复合体(SPOP)底物识别结构域，构建靶向降解PRRSV关键复制酶的生物型蛋白降解靶向嵌合体。本发明的提出为PRRS的治疗以及抗PRRS育种提供了新的技术手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种靶向降解PRRSV关键复制酶的生物型蛋白降解靶向嵌合体，还涉及该生物型蛋白降解靶向嵌合体在抑制PRRSV复制中的应用。本发明属于生物技术领域。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive andrespiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndromevirus，PRRSV)引起的一种猪的急性高度接触性传染病。发病仔猪的主要临床症状表现为严重的呼吸系统障碍以及妊娠母猪早产、胎儿死亡、木乃伊胎等严重的繁殖障碍，且易与其他病毒和细菌引起继发感染。自1987年在美国暴发以来迅速传播至全球，我国最早于1995年首次出现病例，并成为影响我国生猪养殖业的重要病原。2006年一种高致病性PRRSV以高发病率、高死亡率的特征流行于我国多个省份，给我国的生猪养殖行业造成沉重打击。2008年，美国发现了一种新基因2型毒株-NADC30，而后在我国中部地区分离出NADC30样毒株并成为我国现今优势流行毒株，命名为PRRSVNADC30-like。
PRRSV为单股正链RNA病毒，基因组全长14.9-15.5kb，由5’UTR、3’UTR及已知的11个ORFs组成，分别编码多种复制酶蛋白及结构蛋白。多种非结构蛋白相互作用形成病毒复制和转录复合体(RTC)，同时还能和一些宿主因子相互作用，引发机体对病毒复制的调控。作为病毒的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)，nsp9被认为是RTCs的核心成分。其“右手”结构域主导病毒基因组复制且能够与病毒其他蛋白及宿主细胞蛋白相互作用影响病毒的合成。此外，有研究表明病毒nsp9存在是HP-PRRSV毒力增强的因素，其中aa519、aa544、aa586、aa592四个氨基酸残基通过提高PRRSV复制效率而使HP-PRRSV致病力增强。同样，蛋白酶Nsp2也是病毒复制复合体的重要组成部分，主要负责病毒非结构蛋白的酶切加工并参与病毒的先天免疫过程。由于PRRSV具有基因多样性、易变异性、多糖屏蔽作用和抗体依赖性增强作用等逃逸宿主体液免疫应答机制的特点，为PRRSV疫苗研发不断带来新的挑战。弱毒疫苗作为防控PRRSV最有效方法之一，其安全性和交叉保护性问题突出，凭借已有商品化疫苗无法给予猪群提供完全免疫保护。目前，没有有效的治疗性药物获批上市，因此研发安全、有效的新型PRRSV疫苗和抗PRRSV药物成为PRRSV研究热点之一。
蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)由靶蛋白配体、E3泛素连接酶配体以及连接二者而特殊设计的连接肽结构3部分组成。PROTAC的靶蛋白配体招募靶蛋白，E3泛素连接酶配体和细胞内的E3泛素连接酶的底物结合区结合，从而通过连接肽将E3连接酶募集到靶点蛋白附近，形成靶蛋白-PROTAC-E3连接酶的三元复合物，促进靶蛋白的泛素化修饰并通过泛素蛋白酶体系统UBS将靶蛋白降解。自2001年以来，PROTAC分子的设计日益受到关注，从首个通过招募多肽E3诱导MetAP-2的PROTAC到基于小分子VHLA或CRBN的PROTAC，该技术已经广泛应用于多个领域，并被多种肿瘤疾病和传染性疾病用作临床治疗候选药物。目前，基于PROTAC技术已相继衍生出CMA、LYTAC、AUTAC、RIBOTAC等多种降解技术并不断丰富药物研发领域。PROTAC技术具有靶向以往不可成药性靶点，克服耐药性，通过催化发挥作用，给药浓度低，毒副作用小等优势。
抗体药物在当下已成为新型药物类型，目前已有超过100种抗体药物在全球获批上市，而且还在快速增加。纳米抗体(Nanobody,Nb)为骆驼重链抗体(HCAbs)可变结构域衍生而来的单链抗体片段(VHH)，体外表达分子量仅约15kDa，晶体结构直径约2.5nm。由于其体积小易于遗传操作、组织渗透能力好、特异性强等特点，目前已被广泛用于开发治疗性抗体药物。周恩民等研究团队分别筛选了针对PRRSV nsp9和nsp4蛋白的纳米抗体，利用其能够特异性结合nsp4和nsp9并间接阻止病毒复制和转录复合体组装的能力，在Marc-145细胞上初步验证了其抗PRRSV效果。随后又将抗PRRSV的纳米抗体连接细胞穿膜肽(Cell-penetrating peptides，CPPs)，使其穿入易感细胞并抑制PRRSV的复制。由此可见纳米抗体在抗PRRSV方面的优越性。
由于目前许多癌症及抗病毒药物都面临着靶标特异性和规避耐药性问题，PROTAC技术在新型抗病毒药物的开发中占据有利地位。其另一个潜在优势在于消除了靶蛋白的所有功能(酶活性、特定结构)，达到更好的药效，且能够降解不具有药物催化活性或功能未知的病毒蛋白。丙型肝炎病毒(HCV)的NS3/4A、流感病毒H1N1的NA等病毒蛋白相继被作为PROTAC抗病毒分子的理想作用靶点。因此由抗体和PROTAC技术相结合的药物具有更多的优势。相关研究已开发出使用纳米抗体取代E3泛素连接酶复合体中底物识别结构域，构建生物型蛋白降解靶向嵌合体(bioPROTAC)分子，促进细胞内源性蛋白质的靶向降解，并被广泛用作药物开发策略。
本发明利用筛选出的特异性结合PRRSV关键复制酶Nsp2，Nsp9蛋白的纳米抗体，并用纳米抗体替代E3泛素连接酶复合体(SPOP)底物识别结构域，构建靶向降解PRRSV关键复制酶的生物型蛋白降解靶向嵌合体。该生物型蛋白降解靶向嵌合体具有开发成PRRS治疗性药物的潜力以及为抗PRRS育种策略提供研究基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向降解PRRSV关键复制酶的生物型蛋白降解靶向嵌合体(Nspxnb-SPOP)及一种稳定表达该Nspxnb-SPOP分子的细胞系用于表达纯化Nspxnb-SPOP分子及其在抗病毒及抗PRRS育种领域中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明通过真核表达载体pCDNA3.1和原核表达载体pGEX-6P-1分别构建PRRSVnsp9纳米抗体(nsp9nb)、nsp2纳米抗体(nsp2nb)与E3泛素连接酶接头蛋白SPOP中BTB结构域的融合表达系统。并通过真核表达载体pCAGGS分别构建PRRSVnsp9，nsp2靶蛋白真核表达系统，通过GST Pull down与Co-IP实验证明作为靶蛋白配体的nsp9nb与nsp2nb对于作为靶标蛋白的nsp9和nsp2蛋白具有良好的亲和力，并且Nsp2nb-SPOP，Nsp9nb-SPOP分子与靶蛋白无论在体外还是细胞内均表现良好的相互作用。
以靶蛋白和NspXnb-SPOP分子真核表达质粒共转染的方式验证nsp9nb-SPOP分子对nsp9蛋白的降解作用，并通过将两个nsp9nb及两个nsp2nb分别串联后连接，并以柔性多肽连接构建的(NspXnb)2-SPOP分子，利用Western blot、激光共聚焦成像等方式验证其具备更好的降解效果，进一步验证(NspXnb)2-SPOP降解靶蛋白呈剂量依赖性关系以及靶向降解作用起始时间。
以泛素分子真核表达质粒与靶蛋白和Nsp9nb-SPOP分子真核表达质粒共转染的方式进行Co-IP实验，验证泛素化反应的发生。用泛素蛋白酶体途径抑制剂MG132处理共转染24h后的293T细胞，检测到靶蛋白的降解受到明显抑制，进一步证明该Nsp9nb-SPOP分子降解靶蛋白的途径为泛素蛋白酶体途径。以仅表达FLAG的空载质粒为对照，进行间接免疫荧光实验，激光共聚焦镜下观察发现未处理组靶蛋白(nsp9)主要存在于胞质，Nsp9nb-SPOP分子主要定位于细胞核内并以复合体核斑点形式存在；经过Nsp9nb-SPOP分子处理的nsp9靶蛋白信号显著降低，且SPOP复合体核斑点的现象不明显，并散在出现于胞质内与靶蛋白共定位，说明Nsp9nb-SPOP分子特异性靶向靶蛋白并在胞质内发挥一定的降解作用；通过在Marc-145细胞中分别转染(Nsp9nb)2-SPOP，(Nsp2nb)2-SPOP分子24小时后感染100TCID50的PRRSV病毒的实验进一步验证(NspXnb)2-SPOP分子的抗PRRSV活性。
以编码目的基因的PLEX-(nsp9nb)2-SPOP-IRES-Cherry质粒、包装质粒GAG POL及VSVG三种质粒组成慢病毒包装系统，共转染293T细胞进行慢病毒包装，收获的慢病毒经浓缩后感染Marc-145细胞，并通过流式分选筛选出阳性单克隆细胞经扩大培养后，得到稳定表达(Nsp9nb)2-SPOP分子的Marc-145细胞系，命名为Marc-145-(Nsp9nb)2-SPOP，用于Nsp9nb-SPOP蛋白的纯化，抗PRRSV感染效率以及(NspXnb)2-SPOP在PRRSV抗病育种方面的研究。
在上述研究的基础上，本发明提出了一种靶向降解猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)关键复制酶的生物型蛋白降解靶向嵌合体，所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体由1至多个PRRSV nsp9纳米抗体nsp9nb及/或nsp2纳米抗体nsp2nb串联后再与E3泛素连接酶接头蛋白SPOP中BTB结构域融合后得到。
其中，优选的，所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6-9任一所示。
编码所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体的多核苷酸也在本发明的保护范围之内。其中，优选的，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-5任一所示。
进一步的，本发明还提出了一种表达载体，所述的载体中含有所述的多核苷酸。
其中，优选的，所述的载体为原核表达载体或真核表达载体。更优选的，所述的真核表达载体为pCAGGS，所述的原核表达载体为pGEX-6P-1。
更进一步的，本发明还提出了一种稳定表达所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体的Marc145细胞系，所述的细胞系通过以下方法构建得到：
(1)以含有编码所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体基因的质粒、包装质粒GAG POL及VSVG三种质粒组成慢病毒包装系统，待293T细胞长至80％-90％，弃掉一半培养基后，以3：2：1的比例转染293T细胞，转染6h后，换成2ml含有5％v/vFBS的DMEM培养基；
(2)转染后24h收取细胞培养上清并置于4℃保存，293T细胞补液2ml继续培养，转染后48h收上清，将所收集到的所有细胞上清混合后，4℃离心去沉淀，用0.45um滤膜过滤后分装，长期保存于-80℃备用；
(3)慢病毒感染：将1.0×105个Marc-145细胞均匀接种于6孔板，待细胞融合度达到50％时，将1mlDMEM与1ml慢病毒充分混合后，加入Marc-145细胞中并置于37℃孵育1.5至2h，然后将细胞培养液换成用含10％v/v FBS的DMEM培养基继续培养；
(4)慢病毒感染48h后，使用流式分选系统根据荧光信号将表达红色荧光信号的阳性细胞按照每孔1个细胞的密度分选至96孔板中培养继续培养，最终得到稳定表达权利要求1所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体的Marc145细胞系。
更进一步的，本发明还提出了所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体在制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的用途。以及
所述的表达载体在制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的用途。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明利用特异性结合PRRSVNsp9和Nsp2蛋白的纳米抗体，与E3泛素连接酶配体(SPOP)相结合的策略，研制出NspXnb-SPOP纳米抗体药物构建平台可用于抗PRRSV小分子开发研究。利用该策略研制出的NspXnb-SPOP以及(NspXnb)2-SPOP小分子通过劫持宿主体内的泛素蛋白酶体系统高效且特异性靶向降解PRRSV关键复制酶中的Nsp9和Nsp2蛋白，从而有效降低PRRSV在细胞内的复制效率，其中(Nsp9nb)2-SPOP小分子可以减少70％以上PRRSV引起的细胞病变效应，具有高效抗PRRSV感染的效果。Nsp9和Nsp2非结构蛋白是PRRSV RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)的重要组成蛋白，这两种蛋白与病毒基因组复制和非结构蛋白的酶切加工密切相关，针对这两种蛋白的靶向降解将抑制PRRSV的基因组合成，影响病毒的复制能力。因此，NspXnb-SPOP以及(Nsp9nb)2-SPOP小分子用于PRRSV治疗药物使用，可以作为PRRSV疫苗防控的补充手段。达到抑制PRRSV在宿主体内复制，减少动物发病程度和病毒扩散，降低PRRSV感染引起的动物死亡率，提高养猪企业经济效益的目的。此外，本发明研发的NspXnb-SPOP平台作为抗病毒小分子开发策略，也可以通过快速替换相应的特异性纳米抗体用于其他种类病毒的药物研发工作。此外，本发明建立的能够稳定表达(NspXnb)2-SPOP小分子的稳定表达细胞系，也可用于(NspXnb)2-SPOP小分子表达，纯化以及(NspXnb)2-SPOP分子在抗病育种方面的研究工作，为PRRSV抗病育种提供新的研究靶点。
附图说明
图1为nsp9nb-SPOP小分子与靶蛋白nsp9相互作用关系验证；
其中，图A.SDS-PAGE检测GST-flag-nsp9nb-SPOP真核表达体系nsp9nb-SPOP表达结果(1：GST-flag-nsp9nb-SPOP；2：GST)；图B.GST pull-down检测结果(1.Input(HA-nsp9)；2.Pull down(GST+HA-nsp9)；3.Pull down(GST-flag-nsp9nb-SPOP+HA-nsp9)；图C.Co-IP检测结果(使用FLAG标签抗体beads进行孵育，用HA和FLAG标签抗体进行WB检测相互作用蛋白)；
图2为验证Nsp9nb-SPOP分子对靶蛋白降解功能及降解途径分析；
其中，图A.Nsp9nb-SPOP分子在转染后24h对靶蛋白nsp9表现出显著降解效果；图B.靶蛋白nsp9与Nsp9nb-SPOP分子共表达时检出明显的泛素化信号；图C.使用MG132抑制剂能够明显抑制Nsp9nb-SPOP降解nsp9的效率，说明Nsp9nb-SPOP小分子主要通过泛素蛋白酶体途径靶向降解nsp9蛋白；
图3为(NspXnb)2-SPOP分子对靶蛋白的降解效率分析；
其中，图A.(Nsp9nb)2-SPOP分子对靶蛋白nsp9表现出显著的剂量依赖性降解效果；图B.(Nsp9nb)2-SPOP分子对靶蛋白nsp9具有显著长效降解效果；图C.(Nsp9nb)2-SPOP小分子显著降低nsp9蛋白在细胞内的表达水平；图D.(Nsp9nb)2-SPOP分子同样能够显著靶向降解细胞内nsp2蛋白表达量；
图4为(NspXnb)2-SPOP小分子抗PRRSV感染效果验证；
其中，(Nsp9nb)2-SPOP和(Nsp2nb)2-SPOP小分子具有显著的抗PRRSV病毒感染的效果。能够明显减少PRRSV感染引起的致细胞病变作用。
图5为构建(Nsp9nb)2-SPOP稳定表达细胞系。
其中，构建得到能够稳定表达(Nsp9nb)2-SPOP小分子的细胞系，稳定表达细胞系中(Nsp9nb)2-SPOP小分子在细胞核中高效表达。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明不限于以下实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神及范围下可对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1、靶向降解PRRSV关键复制酶的生物型蛋白降解靶向嵌合体NspXnb-SPOP的构建及与靶点蛋白相互作用验证
1.1生物型蛋白降解靶向嵌合体NspXnb-SPOP的构建及表达
参考NCBI数据库公布的我国高致病性PRRSV HuN4(EF635006.1)、猪源SPOP基因(XM_021067137.1)以及本实验保存的nsp9纳米抗体(nsp9nb)以及nsp2纳米抗体(nsp2nb)真核表达质粒图谱，分别设计针对PRRSVNsp9，Nsp2全长、nsp9纳米抗体、nsp2纳米抗体与SPOPBTB结构域(499-1125)的扩增引物(其中nsp9纳米抗体及nsp2纳米抗体上游扩增引物携带FLAG标签基因)，并委托睿博兴科生物科技有限公司合成，相关引物序列见表1。
表1引物序列
分别采用本实验室保存的高致病性HuN4毒株、本实验室保存nsp9nb真核表达质粒、nsp2nb真核表达质粒及猪肺泡巨噬细胞基因组为模板，分别使用Nsp9 F/R、Nsp2F/R、6P-1-FLAG-9nb F/R、6P-1-FLAG-2nb F/R、SPOP F/R通过PCR扩增nsp9全长序列、nsp2全长序列、携带FLAG标签的nsp9nb序列、携带FLAG标签的nsp2nb序列及猪源SPOP序列，并使用同源重组酶将扩增得到的nsp9及nsp2全长片段克隆至经EcoR1与Xhol1双酶切后的真核表达质粒pCAGGS-HA中。将扩增得到携带FLAG标签的nsp9nb序列及nsp2nb序列克隆至经限制性内切酶BamH1与Xhol1双酶切后的原核表达质粒pGEX-6p-1中，并在下游引入酶切位点Kpn1后将猪源SPOP序列克隆至Kpn1与Xhol1之间，构建完整FLAG-nsp9nb-SPOP或FLAG-nsp2nb-SPOP分子。使用酶切、T4连接酶连接等方法将FLAG-nsp9nb-SPOP或FLAG-nsp2nb-SPOP分子分别克隆至真核表达质粒pCDNA3.1的BamH1与Xhol1酶切位点之间以及pLEX-IRES-Cherry的BamH1位点处。通过进一步将两个携带FLAG标签的nsp9nb及两个nsp2nb分别串联后连接，并以柔性多肽连接猪源SPOP序列构建的(NspXnb)2-SPOP分子，最终得到原核重组质粒pGEX-6p-1-FLAG-nsp9nb-SPOP、pGEX-6p-1-FLAG-(nsp9nb)2-SPOP、pGEX-6p-1-FLAG-nsp2nb-SPOP、pGEX-6p-1-FLAG-(nsp2nb)2-SPOP、pGEX-6p-1-FLAG-nsp9nb-nsp2nb-SPOP。真核重组质粒pCAGGS-HA-nsp9、pCAGGS-HA-nsp2、pCDNA3.1-FLAG-nsp9nb-SPOP、pCDNA3.1-FLAG-(nsp9nb)2-SPOP、pCDNA3.1-FLAG-nsp2nb-SPOP、pCDNA3.1-FLAG-(nsp2nb)2-SPOP、pCDNA3.1-FLAG-nsp9nb-nsp2nb-SPOP、pLEX-FLAG-nsp9nb-SPOP-IRES-Cherry、pLEX-FLAG-(nsp9nb)2-SPOP-IRES-Cherry、pLEX-FLAG-nsp2nb-SPOP-IRES-Cherry、pLEX-FLAG-(nsp2nb)2-SPOP-IRES-Cherry、pLEX-FLAG-nsp9nb-nsp2nb-SPOP-IRES-Cherry、以及pLEX-FLAG-9nb-IRES-Cherry、pLEX-FLAG-nbn-SPOP-IRES-Cherry(其中，nbn为一种不与nsp9发生反应的纳米抗体)等相关对照质粒，其中，nsp9nb-SPOP、nsp2nb-SPOP、(nsp9nb)2-SPOP、(nsp2nb)2-SPOP以及nsp9nb-nsp2nb-SPOP的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-5所示，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6-9所示。
首先通过“热激”法，将重组质粒pGEX-6p-1-FLAG-nsp9nb-SPOP与pGEX-6p-1空载质粒转化到感受态菌BL21(DE3)中进行表达，接种具备氨苄霉素抗性的LB固体培养基，置于37℃过夜培养(14～16小时)。挑取阳性菌落扩大培养，待OD值在0.6～0.8之间加入终浓度1μM的IPTG进行诱导，以220r/min，16℃条件下培养20h。收取菌液进行超声破碎处理，经SDS-PAGE分析蛋白实现可溶性表达，使用GST亲和层析介质进行纯化后SDS-PAGE结果如图1A所示，GST-nsp9nb-SPOP融合表达蛋白分子量在65.5kDa，GST空载蛋白分子量在25.5kDa。
使用PEI转染试剂，以质粒(μg)：剂量(μl)为1:3的比例将重组质粒pCAGGS-HA-nsp9转染至293T细胞中，36h后收取并裂解细胞提取蛋白。准备两个EP管，每管50μlGSTbeads，4℃，1000g离心5min，除乙醇保护液，再1ml PBS洗涤3次；取同等浓度GST与GST-nsp9nb-SPOP融合蛋白加入EP管中，4℃旋转孵育过夜；4℃，1000g离心2min，吸出上清，再1ml PBS洗涤3次；每管加入200μl细胞裂解液，4℃环境旋转孵育4h；4℃，1000g离心2min，吸出上清，再1ml PBS洗涤3次；最后每管加40μl PBS和10μl 5×loading buffer，制样后进行WB检测。结果如图1B所示，在靶蛋白HA-nsp9都存在的情况下，利用GST亲和树脂分别沉淀GST蛋白与GST-nsp9nb-SPOP融合蛋白，泳道2中未检测到靶蛋白，而泳道3中检测到靶蛋白，说明靶蛋白在体外与GST-nsp9nb-SPOP融合蛋白存在相互作用。
使用PEI转染试剂，以质粒(μg)：剂量(μl)为1:3的比例将重组质粒pCAGGS-HA-nsp9与pCDNA3.1-FLAG-nsp9nb-SPOP分别各自转染及共同转染至293T细胞中，36h后分别收取并裂解细胞提取蛋白，各取20μl裂解液作Input对照；准备3个EP管，每管加入30μlFLAGbeads和150μl裂解液，4℃环境下摇床感作过夜；4℃，5000g离心5min；弃上清后用1mlRIPA洗涤树脂3次；最后一次离心后加入适量PBS与2×loading buffer，制样后进行WB检测。结果如图1C所示，靶蛋白与Nsp9nb-SPOP融合蛋白在细胞内存在相互作用。上述实验证明作为靶蛋白配体的nsp9纳米抗体对于作为靶标蛋白的nsp9蛋白具有良好的亲和力，为进一步研究Nsp9nb-SPOP分子对靶标蛋白降解功能的验证奠定基础。
实施例2、Nsp9nb-SPOP小分子对靶标蛋白降解的效果及主要降解途径分析
使用1μg pCAGGS-HA-nsp9分别与0μg、1μg的剂量的pCDNA3.1-FLAG-nsp9nb-SPOP共同转染293T细胞，并在转染后的12h和24h分别收取细胞蛋白样品，并进行westernblot验证nsp9nb-SPOP分子对nsp9蛋白的降解作用。结果如图2A所示，在转染24h后开始观察到有降解作用，靶向降解Nsp9蛋白的效率达到40％。将pCDNA3.1-FLAG-Ub、pCAGGS-HA-nsp9与pCDNA3.1-FLAG-nsp9nb-SPOP共同转染293T细胞，24h后收取细胞蛋白样品。准备2个EP管，使用去尖枪头每管加入100μl ProteinA/GAgarose，4℃预冷PBS，3000rpm离心3min，重复清洗3次；每管加入稀释后的HA标签抗体与ProteinA/GAgarose偶联，4℃旋转混匀2h；每管加入70μl细胞裂解液，4℃孵育过夜；PBS离心清洗3次，吸除上清，处理沉淀进行westernblot。结果如图2B所示，当靶蛋白nsp9与Nsp9nb-SPOP分子共表达细胞时检出明显的泛素化信号，说明Nsp9nb-SPOP分子激活了nsp9蛋白的泛素化。使用一定剂量泛素蛋白酶体途径抑制剂MG132在单独转染表达nsp9与共转染表达nsp9和Nsp9nb-SPOP的293T细胞中处理4h，裂解细胞提蛋白，处理后进行westernblot。结果如图2C所示，使用终浓度为20μm的MG132处理细胞后，靶蛋白的降解受到明显抑制，进一步证明Nsp9nb-SPOP小分子通过泛素蛋白酶体途径靶向降解nsp9蛋白。
实施例3、(NspXnb)2-SPOP小分子降解靶标蛋白效果分析
为进一步提高Nsp9nb-SPOP的降解效率，在此基础上构建pCDNA3.1-FLAG-(nsp9nb)2-SPOP真核表达系统，在SPOP BTB结构域的N端串联两个nsp9nb，三者之间以柔性多肽进行连接，命名为(Nsp9nb)2-SPOP。分别以0μg、1μg、2μg、3μg的剂量的上述质粒与1μgpCAGGS-HA-nsp9共同转染293T细胞36后收取细胞蛋白样品，并进行western blot，结果如图3A所示，新型(nsp9nb)2-SPOP对靶蛋白nsp9的降解效果显著增强且呈剂量依赖性。使用1μgpCAGGS-HA-nsp9与3μg的pCDNA3.1-FLAG-(nsp9nb)2-SPOP共转染293T细胞，分别于6h至36h，6个时间点收取细胞蛋白样品并进行western blot验证。结果如图3B所示，靶蛋白在转染后18h后开始被大量检测到，而(Nsp9nb)2-SPOP处理组仅有少量靶蛋白信号，并且随着时间延长，靶蛋白信号未见明显增强，说明(Nsp9nb)2-SPOP分子可以高效靶向降解PRRSVnsp9蛋白。此外，将293T细胞接种于共聚焦小皿，待细胞长满90％的时候，进行pCAGGS-HA-nsp9质粒分别与pCDNA3.1-FLAG-(nsp9nb)2-SPOP及pCDNA3.1空载共转染，在转染后36h，使用多聚甲醛固定，0.3％Triton X-100透膜，1％BSA封闭后依次使用鼠源Flag单抗和兔源HA一抗室温孵育1h，而后分别用稀释后的Alexa FluorTM 568goat anti-mouse IgG和AlexaFluorTM 488goat anti-rabbit IgG作为荧光二抗室温孵育1h，封片后用激光共聚焦显微镜进行检测。观察nsp9绿色荧光细胞定位和表达水平并针对荧光表达进行统计学分析，结果如图3C所示。与空载体对照组比较，(Nsp9nb)2-SPOP小分子处理组明显降低nsp9蛋白的表达水平显著降低，说明(Nsp9nb)2-SPOP对靶蛋白nsp9发挥非常强的靶向降解作用，可以有效降低PRRSV nsp9在细胞内的含量，可用于后续降解条件优化、功能验证及抗病毒应用的研究。与此同时，针对(Nsp2nb)2-SPOP靶向降解Nsp2蛋白的效率也通过western blot实验进行了验证。使用1μg pCAGGS-HA-nsp2与3μg的pCDNA3.1-FLAG-(nsp2nb)2-SPOP共转染293T细胞，36h后收取细胞蛋白进行，结果如图3D所示，(Nsp2nb)2-SPOP小分子同样可以高效靶向降解PRRSVNsp2蛋白。以上结果说明，通过串联纳米抗体增加抗体与靶蛋白的亲和力，(NspXnb)2-SPOP小分子构建策略可以提高靶向降解PRRSV关键复制复合体蛋白的效率。
实施例4、(NspXnb)2-SPOP小分子抗病毒效果验证
将质粒pCDNA3.1-FLAG-(nsp9nb)2-SPOP、pCDNA3.1-FLAG-(nsp2nb)2-SPOP分别转染生长至融合程度达到60％-70％的Marc-145细胞，在转染后24h接种100TCID50剂量的PRRSV感染性克隆株(HuN4-GFP)，分别于接毒后72h及96h镜下观察并拍照记录如图4。荧光结果显示PRRSV感染转染有(Nsp9nb)2-SPOP及(Nsp2nb)2-SPOP小分子的细胞引起的细胞致病变作用显著低于空白对照组，其中Nsp9nb-SPOP的抑制细胞病变作用高于70％。初步证明(NspXnb)2-SPOP分子在体外水平具备抗病毒活性。
实施例5、稳定表达(Nsp9nb)2-SPOP的Marc145细胞系的构建
以编码目的基因的pLEX-(nsp9nb)2-SPOP-IRES-Cherry质粒、包装质粒GAG POL及VSVG三种质粒组成慢病毒包装系统，待293T细胞长至80％-90％，弃掉一半培养基后，以3：2：1的比例转染293T细胞，转染6h后，换成2ml含有5％FBS的DMEM培养基。转染后24h收取细胞培养上清并置于4℃保存，293T细胞补液2ml继续培养。转染后48h收上清。将所收集到的所有细胞上清混合后，4℃离心去沉淀，用0.45um滤膜过滤后分装，长期保存于-80℃备用。慢病毒感染：将1.0×105个Marc-145细胞均匀接种于6孔板，待细胞融合度达到50％时，将1ml DMEM与1ml慢病毒充分混合后，加入Marc-145细胞中并置于37℃孵育1.5至2h，然后将细胞培养液换成用含10％FBS的DMEM培养基继续培养。慢病毒感染48h后，使用流式分选系统根据荧光信号将表达红色荧光信号的阳性细胞按照每孔1个细胞的密度分选至96孔板中培养继续培养。最终成功得到3株稳定表达(Nsp9nb)2-SPOP的Marc145细胞系。
Claims (10)
1.靶向降解猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)关键复制酶的生物型蛋白降解靶向嵌合体，其特征在于，所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体由1至多个PRRSVnsp9纳米抗体nsp9nb及/或nsp2纳米抗体nsp2nb串联后再与E3泛素连接酶接头蛋白SPOP中BTB结构域融合后得到。
2.如权利要求1所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体，其特征在于，所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6-9任一所示。
3.编码权利要求1或2所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO.1-5任一所示。
5.一种表达载体，其特征在于，所述的载体中含有权利要求3或4所述的多核苷酸。
6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述的载体为原核表达载体或真核表达载体。
7.如权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述的真核表达载体为pCAGGS，所述的原核表达载体为pGEX-6P-1。
8.一种稳定表达权利要求1所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体的Marc145细胞系，其特征在于，所述的细胞系通过以下方法构建得到：
(1)以含有编码权利要求1所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体基因的质粒、包装质粒GAGPOL及VSVG三种质粒组成慢病毒包装系统，待293T细胞长至80％-90％，弃掉一半培养基后，以3：2：1的比例转染293T细胞，转染6h后，换成2ml含有5％v/vFBS的DMEM培养基；
(2)转染后24h收取细胞培养上清并置于4℃保存，293T细胞补液2ml继续培养，转染后48h收上清，将所收集到的所有细胞上清混合后，4℃离心去沉淀，用0.45um滤膜过滤后分装，长期保存于-80℃备用；
(3)慢病毒感染：将1.0×105个Marc-145细胞均匀接种于6孔板，待细胞融合度达到50％时，将1mlDMEM与1ml慢病毒充分混合后，加入Marc-145细胞中并置于37℃孵育1.5至2h，然后将细胞培养液换成用含10％v/vFBS的DMEM培养基继续培养；
(4)慢病毒感染48h后，使用流式分选系统根据荧光信号将表达红色荧光信号的阳性细胞按照每孔1个细胞的密度分选至96孔板中培养继续培养，最终得到稳定表达权利要求1所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体的Marc145细胞系。
9.权利要求1或2所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体在制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的用途。
10.权利要求5或7任一项所述的表达载体在制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的用途。
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