CN111849763A - 一种光调控病毒繁殖系统及构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种光调控病毒繁殖系统，所述系统包括光源与光敏感NSP9降解系统：所述光源能够发射蓝光，且该光源能够调节光调控病毒繁殖系统所需的光照时间、光照强度和光照频率；所述光敏感NSP9降解系统包括光敏感蛋白vhhNB‑Fc和E3泛素连接酶TRIM21。本发明系统可以通过调整光照条件来调控病毒增殖的的关键性蛋白NSP9的降解，从而调控PRRSV的繁殖，简单高效，便于操纵。

Description

一种光调控病毒繁殖系统及构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是一种利用光调控病毒繁殖系统及构建方法和应用。
背景技术
猪繁殖和呼吸障碍综合症主要由猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)所引起，每年 造成巨大的经济损失，是影响全世界养猪产业的一个重要的病原体。PRRSV可通过多种途径 侵入免疫系统，包括调节IL-10，抑制巨噬细胞和树突细胞功能，以及抑制I型干扰素(IFN-α/β) 的产生，导致持续的病毒感染。因此研究病毒感染的机制，有效控制PRRSV感染成为当前 研究的迫切需求。PRRSV为单股正链RNA病毒，属动脉炎病毒科动脉炎病毒属，有囊膜， 囊膜表面有纤突，似球状，直径45～60纳米，它通过受体介导的内吞作用进入宿主，并通过 翻译病毒基因组产生病毒结构蛋白与非结构蛋白，在所有的非结构蛋白中，非结构蛋白9 (NSP9)具有RNA依赖性RNA聚合酶活性，在病毒基因复制和转录中起关键作用，被认为 是抑制病毒增殖的目标。因此，通过调控NSP9的表达可以有效地抑制病毒增殖。
通过光来调控病毒增殖，有利于研究病毒繁殖机制，探索更有效的抗病毒方式。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种光调控病毒繁殖的系统及构建方 法和应用，该系统可以通过调整光照条件来调控影响病毒增殖的的关键性蛋白NSP9的降解， 从而调控PRRSV的繁殖，简单高效，便于操纵。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种光调控病毒繁殖系统，所述系统包括光源与光敏感NSP9降解系统：
所述光源能够发射蓝光，且该光源能够调节光调控病毒繁殖系统所需的光照时间、光照 强度和光照频率；
所述光敏感NSP9降解系统包括光敏感蛋白vhhNB-Fc和E3泛素连接酶TRIM21。
而且，所述系统的作用机理为：呼吸障碍综合症病毒通过受体介导的内吞作用进入宿主 细胞，并通过翻译病毒基因组产生病毒结构蛋白和非结构蛋白NSP9，光敏感蛋白vhhNB-Fc 在蓝光光照条件下驱动表达，通过其vhhNB端识别NSP9蛋白并与之结合，通过Fc端招募E3泛素连接酶TRIM21，经过泛素化-蛋白酶体降解途径，将NSP9蛋白送入蛋白酶体降解； NSP9被降解后，呼吸障碍综合症病毒失去促进病毒基因组转录的关键性蛋白，繁殖能力下降。
如上所述的光调控病毒繁殖系统的构建方法，步骤如下：
⑴搭建光控设备作为光源，对感染病毒的细胞进行光照处理，光控设备由蓝光LED阵列 与信号发生器组成，由外部电源供电；LED工作模式为：连续、脉冲，发光强度由电源控制；
⑵构建光敏感NSP9蛋白降解系统，该系统包括光敏感蛋白vhhNB-Fc与E3泛素连接酶 TRIM21；
所述光敏感蛋白vhhNB-Fc的质粒表达载体的构建：该光控融合蛋白由两部分组成：光 响应的转录激活因子表达载体pcDNA3.1(+)-Gal4(65)-VVD-P65AD和转录因子调控表达的融 合蛋白Pu5-vhhNB-Fc；
所述pcDNA3.1(+)-Gal4(65)-VVD-P65AD表达质粒的构建步骤如下：
以pcDNA3.1(+)为载体，以XbaI和BamHI为酶切位点，将-Gal4(65)-VVD-P65AD-序列 通过分子克隆的方式连接到载体上；
其中，所述-Gal4(65)-VVD-P65AD-序列的氨基酸序列为SEQ.No.1；
所述pU5-vhhNB-Fc质粒表达载体的构建步骤如下：
以pcDNA3.1(+)为载体，以NruI和BamHI为酶切位点，将 poly(A)-5XUASG-TATA-vhhNB-Fc序列通过分子克隆的方式连接到载体上；
poly(A)-5XUASG-TATA-vhhNB-Fc序列的核苷酸序列为SEQ.No.2；
所述E3泛素连接酶TRIM21表达质粒pcDNA3.1(+)-TRIM21的构建步骤如下：
以pcDNA3.1(+)为载体，以XbaI和BamHI为酶切位点，将TRIM21序列通过分子克隆的方式连接到载体上；
TRIM21序列的核苷酸序列为SEQ.No.3；
⑶细胞表达光敏感NSP9蛋白降解系统：
培养MARC-145细胞，将上述质粒pcDNA3.1(+)-Gal4(65)-VVD-P65AD，pU5-vhhNB-Fc, pcDNA(+)-TRIM21在MARC-145细胞中转染表达，即得表达光敏感NSP9降解系统并感染病 毒的细胞；
⑷对表达光敏感NSP9降解系统并感染病毒的细胞进行光照处理。
利用如上所述的光调控病毒繁殖系统抑制呼吸障碍综合症病毒增殖的方法，步骤如下：
呼吸障碍综合症病毒感染表达光敏感NSP9蛋白降解系统后避光处理的细胞，并利用蓝 光LED光照设备提供特定的光照条件，即波长470nm，功率0.8mWmm-2，频率15s/min， 光照时间24h，从而达到抑制呼吸障碍综合症病毒增殖。
一种利用如上所述的光调控病毒繁殖系统用于调控病毒繁殖的方法，步骤如下：
呼吸障碍综合症病毒感染表达光敏感NSP9蛋白降解系统后避光处理的细胞，并利用蓝 光LED光照设备提供不同的光照条件，即波长470nm，功率0.8mWmm-2，频率15s/min， 光照时间0h～24h梯度变化，光控启动子驱动vhhNB-Fc融合蛋白表达，靶向识别NSP9蛋白 并招募泛素-蛋白酶体降解系统，实现不同程度的NSP9降解，从而调控PRRSV病毒繁殖。
如上所述的光调控病毒繁殖系统在抑制呼吸障碍综合症病毒的增殖方面中的应用。
如上所述的光调控病毒繁殖系统在调控呼吸障碍综合症病毒繁殖状况方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明利用哺乳动物细胞内天然存在的泛素化-蛋白酶体降解途径，具有直接在翻译 后蛋白质水平调控、不产生中间效应等特殊优点。
2、本发明利用非结构蛋白9特异性的纳米抗体，具有靶向性和精准性识别目的蛋白的特 点。
3、本发明可以通过调整光照条件来控制关键蛋白NSP9的降解程度，从而调控PRRSV病 毒繁殖状况。
4、本发明通过光调控病毒繁殖，可以提供一种有效的抗病毒方法，同时对研究病毒机理， 抗病毒机制提供新的思路。
附图说明
图1为本发明中光敏感蛋白vhhNB-Fc表达载体(pU5-vhhNB-Fc)的构建示意图；
图2为本发明中光控融合蛋白vhhNB-Fc在光照和黑暗条件下相关RNA的表达量图；
图3为本发明中光控融合蛋白vhhNB-Fc在不同的光照条件的蛋白表达的免疫印迹图；
图4为本发明中PRRSV的关键蛋白NSP9在不同的光照条件下表达的免疫印迹图；
图5为本发明中光照和黑暗条件对病毒繁殖的影响图；
图6为本发明中不同的光照时间对病毒繁殖的影响图；
图7为本发明中不同光照时间对病毒TCID50的影响图；
图8为本发明中荧光倒置显微镜下，光照和黑暗条件下不同感染复数的病毒对感染细胞 的影响图；
图9为本发明中不同感染复数的病毒在光照和黑暗条件下对病毒活性的影响图。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的， 不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法， 如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种光调控病毒繁殖系统，所述系统包括光源与光敏感NSP9降解系统：
所述光源能够发射蓝光，且该光源能够调节光调控病毒繁殖系统所需的光照时间、光照 强度和光照频率；
所述光敏感NSP9降解系统包括光敏感蛋白vhhNB-Fc和E3泛素连接酶TRIM21。
而且，所述系统的作用机理为：呼吸障碍综合症病毒通过受体介导的内吞作用进入宿主 细胞，并通过翻译病毒基因组产生病毒结构蛋白和非结构蛋白NSP9，光敏感蛋白vhhNB-Fc 在蓝光光照条件下驱动表达，通过其vhhNB端识别NSP9蛋白并与之结合，通过Fc端招募 E3泛素连接酶TRIM21，经过泛素化-蛋白酶体降解途径，将NSP9蛋白送入蛋白酶体降解； NSP9被降解后，呼吸障碍综合症病毒失去促进病毒基因组转录的关键性蛋白，繁殖能力下降。
如上所述的光调控病毒繁殖系统的构建方法，步骤如下：
⑴搭建光控设备作为光源，对感染病毒的细胞进行光照处理，光控设备由蓝光LED阵列 与信号发生器组成，由外部电源供电；LED工作模式为：连续、脉冲，发光强度由电源控制 (该种结构为本领域技术人员非常容易想到的，因此不具体描述)；
⑵构建光敏感NSP9蛋白降解系统，该系统包括光敏感蛋白vhhNB-Fc与E3泛素连接酶 TRIM21；
所述光敏感蛋白vhhNB-Fc的质粒表达载体的构建：该光控融合蛋白由两部分组成：光 响应的转录激活因子表达载体pcDNA3.1(+)-Gal4(65)-VVD-P65AD和转录因子调控表达的融 合蛋白Pu5-vhhNB-Fc；
所述pcDNA3.1(+)-Gal4(65)-VVD-P65AD表达质粒的构建步骤如下：
以pcDNA3.1(+)为载体，以XbaI和BamHI为酶切位点，将-Gal4(65)-VVD-P65AD-序列 通过分子克隆的方式连接到载体上；
其中，所述-Gal4(65)-VVD-P65AD-序列的氨基酸序列为SEQ.No.1；
-Gal4(65)-VVD-P65AD-序列的氨基酸序列如下：
MKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVE SRLERLERSIATRSHTLYAPGGYDIMGYLIQIMKRPNPQVELGPVDTSVALILCDLKQKDTPI VYASEAFLYMTGYSNAEVLGRNCRFLQSPDGMVKPKSTRKYVDSNTINTMRKAIDRNAEV QVEVVNFKKNGQRFVNFLTMIPVRDETGEYRYSMGFQCETELQYPYDVPDYAEFQYLPDT DDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLS TINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLN QGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMD FSALLSQISSDYKDDDDK
所述pU5-vhhNB-Fc质粒表达载体的构建步骤如下：
以pcDNA3.1(+)为载体，以NruI和BamHI为酶切位点，将poly(A)-5XUASG-TATA-NB-Fc 序列通过分子克隆的方式连接到载体上；
poly(A)-5XUASG-TATA-vhhNB-Fc序列的核苷酸序列为SEQ.No.2；
Gagtttctagacggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgactcgagcggagtactgtcctccgatcggagtactgtcctccg cgaattccggagtactgtcctccgaagacgctagcggggggctataaaagggggtgggggcgttcgtcctcactctagatctgcgatctaagta agcttggccaccatgcaggtccaactgcaggagtctgggggaggctcggtgcagtctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctggat acaccatcactaatagttaccgcatggcctggttccgccaggctccagggaaggagcgcgagggggtcgcagctatcaatagtggtggttcta caacatacgcagactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacgcccagaacacgctgtatttgcagatgaacagcctgaaagccg aggacacggccatgtattactgtgcggcagggcgcgtacagtggtggcctgtactacgcgcgctgaacgaggatgattatctctactggggcc aggggacccaggtcaccgtctcctcacagctgatggttagatctgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggg gaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagc acgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctccca gcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgacc aagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaaca actacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcagggg aacgtcttctcatgctccgtgatgcacgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
所述E3泛素连接酶TRIM21表达质粒pcDNA3.1(+)-TRIM21的构建步骤如下：
以pcDNA3.1(+)为载体，以XbaI和BamHI为酶切位点，将TRIM21序列通过分子克隆的方式连接到载体上；
TRIM21序列的核苷酸序列为SEQ.No.3；
TRIM21序列的氨基酸序列如下：
MASAARLTMMWEEVTCPICLDPFVEPVSIECGHSFCQECISQVGKGGGSVCPVCRQRF LLKNLRPNRQLANMVNNLKEISQEAREGTQGERCAVHGERLHLFCEKDGKALCWVCAQS RKHRDHAMVPLEEAAQEYQEKLQVALGELRRKQELAEKLEVEIAIKRADWKKTVETQKS RIHAEFVQQKNFLVEEEQRQLQELEKDEREQLRILGEKEAKLAQQSQALQELISELDRRCHS SALELLQEVIIVLERSESWNLKDLDITSPELRSVCHVPGLKKMLRTCAVHITLDPDTANPWL ILSEDRRQVRLGDTQQSIPGNEERFDSYPMVLGAQHFHSGKHYWEVDVTGKEAWDLGVC RDSVRRKGHFLLSSKSGFWTIWLWNKQKYEAGTYPQTPLHLQVPPCQVGIFLDYEAGMVS FYNITDHGSLIYSFSECAFTGPLRPFFSPGFNDGGKNTAPLTLCPLNIGSQGSTDY
⑶细胞表达光敏感NSP9蛋白降解系统：
培养MARC-145细胞，将上述质粒pcDNA3.1(+)-Gal4(65)-VVD-P65AD，pU5-vhhNB-Fc, pcDNA(+)-TRIM21在MARC-145细胞中转染表达，即得光调控病毒繁殖系统。
具体地，可以为：细胞表达光敏感NSP9蛋白降解系统：
绿猴胚胎肾细胞Marc-145使用完全培养基(DMEM培养基中添加质量终浓度10％胎牛 血清和质量终浓度1％双抗)在37℃，含5％的二氧化碳培养箱中培养，待细胞在培养皿内 生长达到80％-90％汇合度传代培养，通过EntransterTM-H4000转染试剂进行转染实验，提 前一天将细胞种植在孔板中，将质粒和转染试剂分别按照该试剂说明书所示转染比例与无血 清培养基混合；室温静置5min；将转染试剂稀释液加到DNA稀释液中，充分混匀，室温静 置15min；将转染复合物加入到含细胞和完全培养基的培养容器里，培养4-6h后更换完全培 养基。
(4)对表达光调控NSP9降解质粒组分并感染病毒的细胞进行光照处理。
利用如上所述的光调控病毒繁殖系统抑制呼吸障碍综合症病毒增殖的方法，步骤如下：
呼吸障碍综合症病毒感染表达光敏感NSP9蛋白降解系统后避光处理的细胞，并利用蓝 光LED光照设备提供特定的光照条件，即波长470nm，功率0.8mWmm-2，频率15s/min， 光照时间24h，从而达到抑制呼吸障碍综合症病毒增殖。
利用如上所述的光调控病毒繁殖系统用于调控病毒繁殖的方法，步骤如下：
呼吸障碍综合症病毒感染表达光敏感NSP9蛋白降解系统后避光处理的细胞，并利用蓝 光LED光照设备提供不同的光照条件，即波长470nm，功率0.8mWmm-2，频率15s/min， 光照时间0h～24h梯度变化，光控启动子驱动vhhNB-Fc融合蛋白表达，靶向识别NSP9蛋白 并招募泛素-蛋白酶体降解系统，实现不同程度的NSP9降解，从而调控PRRSV病毒繁殖。
具体地，对感染病毒的细胞进行光照处理可以为：
本发明中使用的病毒株为高致病性PRRSV SD16(HP-PRRSV/SD16)(GenBank ID：EF112445.1)，于-80℃保存，根据实际实验中所需病毒的MOI来计算所需添加的病毒原液，PFU＝MOI×细胞数＝TCID50×0.7，细胞数目为铺板时每孔的细胞数，从-80℃冰箱中取出病毒 原液，在冰上融化，按照一定的稀释倍数(MOI＝0.001～1)吸取一定量的病毒原液加入含3％ 血清的DMEM维持培养基中混匀，将待接毒细胞孔板中原有的培养基除去，PBS洗两次，加 入含有病毒的DMEM维持培养基。放入细胞培养箱中培养，使用蓝光LED相关设备，对细 胞进行不同光照条件处理(470nm，功率0.8mWmm-2，频率15s/min，光照时间0h～24h梯度变化)，之后通过实时荧光定量PCR实验和免疫印迹实验等对相关指标进行鉴定。
如上所述的光调控病毒繁殖系统可以应用在抑制呼吸障碍综合症病毒的增殖方面中。
如上所述的光调控病毒繁殖系统可以应用在调控呼吸障碍综合症病毒繁殖状况方面中。
更具体地，相关制备及检测如下：
一、光敏感融合蛋白vhhNB-Fc质粒表达载体Pu5-vhhNB-Fc的构建：
(1)poly(A)-5XUASG-TATA-vhhNB-Fc序列的核苷酸序列为SEQ.No.2，具体如下：
(2)用含有酶切位点NruI和BamHI的引物，通过PCR的方法扩增目的片段，产物回收后 克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)的酶切位点NruI和BamHI之间。重组质粒的构建过程如图1 所示，两端含有酶切位点NruI和BamHI的片段由公司根据提供序列合成，分别将片段与真核 表达质粒pcDNA3.1(+)经限制性内切酶NruI和BamHI切割后，T4连接酶连接。
二、为了验证构建的融合蛋白vhhNB-Fc的光响应表达能力，对转染pU5-vhhNB-Fc与 pcDNA3.1(+)-Gal4(65)-VVD-P65AD质粒的Marc-145细胞通过LED光照平台进行了时长1h 的光照处理(波长470nm，功率0.8mWmm-2，频率15s/min)，通过qPCR实验检测了胞内vhhNB-Fc mRNA的相对表达量，实验结果如图2所示，光照1h后，胞内vhhNB-Fc mRNA 的相对表达量是黑暗条件下的13倍左右，光照可迅速起始vhhNB-Fc融合蛋白的表达。之后， 对转染Pu5-vhhNB-Fc与pcDNA3.1(+)-Gal4(65)-VVD-P65AD质粒的Marc-145细胞在原有光 照频率的基础上进行了不同时长的光照处理(光照时间分别为0h，12h，24h)，并提取胞内 总蛋白，通过Western-blot实验检测了胞内vhhNB-Fc融合蛋白的表达量。实验结果如图3所 示，随着光照时间的延长，细胞内vhhNB-Fc融合蛋白的表达量逐渐增加，呈上升趋势，光 照24h后，胞内vhhNB-Fc的表达量是黑暗条件下的120倍左右，该光敏感的vhhNB-Fc融 合蛋白具有良好的光响应表达能力。
三、为了探索不同光照条件对NSP9降解的影响，将PRRSV(SD16，MOI＝0.1)感染 已表达光控蛋白降解系统相关质粒的Marc-145细胞，并通过LED光照平台提供不同的光照 条件(波长470nm，功率0.8mWmm-2，频率15s/min，光照时间0h，12h，24h)，通过 Western-blot蛋白定量实验对Marc-145细胞内和培养基中的NSP9蛋白进行了定量分析。实 验结果表明，随着光照时间的延长，NSP9逐渐被细胞内的泛素化-蛋白酶体降解系统降解， 细胞内NSP9蛋白质含量逐渐减少，在光照24h后，近60％的NSP9被降解(图4)。
四、为了探索蓝光通过调控NSP9蛋白降解对PRRSV繁殖的影响，首先设计了如下实验 探索光照对PRRSV繁殖能力的影响：将在相同条件下感染PRRSV的Marc-145细胞分为2组，黑暗组与光照组，黑暗组始终处于黑暗条件，光照组通过LED光照平台提供24h光照 条件(波长470nm，功率0.8mWmm-2，频率15s/min)。提取细胞和上清中的RNA，通过 qPCR实验检测PRRSVRNA的相对含量。实验结果表明，光照组与黑暗组PRRSV RNA的 相对含量没有显著性差异，蓝光对病毒增殖没有明显影响(图5)。
五、引入蓝光响应的NSP9蛋白降解系统，探索在该系统中，不同的光照时间对PRRSV 繁殖的影响。实验设计如下：PRRSV感染已表达光调控NSP9蛋白降解系统相关组分质粒的 Marc-145细胞，细胞被分为3组，分别提供不同时长的光照条件(光照时间0h，12h和24h)。 通过qPCR实验检测PRRSV RNA的相对含量，实验结果表明，相对PRRSV RNA水平随光照时间的延长逐渐降低，与在黑暗环境中相比，蓝光显著抑制了PRRSV基因组复制，病毒 感染受到了抑制。通过TCID50实验检测病毒产率，实验结果表明，经过12h和24h的光处 理后，病毒产量分别下降了约100倍和1000倍(图6，7)。
六、为了进一步探索光诱导的蛋白质降解系统的抗病毒能力，使用不同感染复数的 PRRSV(SD16，MOI＝1、0.1、0.01和0.001)感染表达光控NSP9降解系统质粒组分的Marc-145 细胞系。实验设计如下：细胞分为两组：(1)黑暗组：始终保持在黑暗条件下；(2)光照组： 通过蓝光LED平台提供光照条件(波长470nm，功率0.8mWmm-2，频率15s/min)，感染后 通过荧光倒置显微镜监测PRRSV繁殖情况，观察PRRSV诱导细胞病变效应(cytopathiceffect, CPE)的产生。与黑暗组相比，光照组CPE的产生时间出现了延迟，在感染后第三天，光照 组中MOI＝0.001时未观察到CPE的产生(图8)。通过MTT实验检测两组之间的CPE程度。实验结果证明，当MOI＝0.001的PRRSV感染表达光诱导的NSP9降解系统的细胞，并提供 光照条件时，PRRSV诱导的细胞损伤得到了完全保护(图9)。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本 发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的 范围不局限于实施例和附图所公开的内容。
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种光调控病毒繁殖系统及构建方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 508
<212> PRT
<213> Gal4(65)-VVD-P65AD(Unknown)
<400> 1
Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu
1 5 10 15
Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu
20 25 30
Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro
35 40 45
Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu
50 55 60
Glu Arg Ser Ile Ala Thr Arg Ser His Thr Leu Tyr Ala Pro Gly Gly
65 70 75 80
Tyr Asp Ile Met Gly Tyr Leu Ile Gln Ile Met Lys Arg Pro Asn Pro
85 90 95
Gln Val Glu Leu Gly Pro Val Asp Thr Ser Val Ala Leu Ile Leu Cys
100 105 110
Asp Leu Lys Gln Lys Asp Thr Pro Ile Val Tyr Ala Ser Glu Ala Phe
115 120 125
Leu Tyr Met Thr Gly Tyr Ser Asn Ala Glu Val Leu Gly Arg Asn Cys
130 135 140
Arg Phe Leu Gln Ser Pro Asp Gly Met Val Lys Pro Lys Ser Thr Arg
145 150 155 160
Lys Tyr Val Asp Ser Asn Thr Ile Asn Thr Met Arg Lys Ala Ile Asp
165 170 175
Arg Asn Ala Glu Val Gln Val Glu Val Val Asn Phe Lys Lys Asn Gly
180 185 190
Gln Arg Phe Val Asn Phe Leu Thr Met Ile Pro Val Arg Asp Glu Thr
195 200 205
Gly Glu Tyr Arg Tyr Ser Met Gly Phe Gln Cys Glu Thr Glu Leu Gln
210 215 220
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Glu Phe Gln Tyr Leu Pro Asp
225 230 235 240
Thr Asp Asp Arg His Arg Ile Glu Glu Lys Arg Lys Arg Thr Tyr Glu
245 250 255
Thr Phe Lys Ser Ile Met Lys Lys Ser Pro Phe Ser Gly Pro Thr Asp
260 265 270
Pro Arg Pro Pro Pro Arg Arg Ile Ala Val Pro Ser Arg Ser Ser Ala
275 280 285
Ser Val Pro Lys Pro Ala Pro Gln Pro Tyr Pro Phe Thr Ser Ser Leu
290 295 300
Ser Thr Ile Asn Tyr Asp Glu Phe Pro Thr Met Val Phe Pro Ser Gly
305 310 315 320
Gln Ile Ser Gln Ala Ser Ala Leu Ala Pro Ala Pro Pro Gln Val Leu
325 330 335
Pro Gln Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Met Val Ser Ala Leu
340 345 350
Ala Gln Ala Pro Ala Pro Val Pro Val Leu Ala Pro Gly Pro Pro Gln
355 360 365
Ala Val Ala Pro Pro Ala Pro Lys Pro Thr Gln Ala Gly Glu Gly Thr
370 375 380
Leu Ser Glu Ala Leu Leu Gln Leu Gln Phe Asp Asp Glu Asp Leu Gly
385 390 395 400
Ala Leu Leu Gly Asn Ser Thr Asp Pro Ala Val Phe Thr Asp Leu Ala
405 410 415
Ser Val Asp Asn Ser Glu Phe Gln Gln Leu Leu Asn Gln Gly Ile Pro
420 425 430
Val Ala Pro His Thr Thr Glu Pro Met Leu Met Glu Tyr Pro Glu Ala
435 440 445
Ile Thr Arg Leu Val Thr Gly Ala Gln Arg Pro Pro Asp Pro Ala Pro
450 455 460
Ala Pro Leu Gly Ala Pro Gly Leu Pro Asn Gly Leu Leu Ser Gly Asp
465 470 475 480
Glu Asp Phe Ser Ser Ile Ala Asp Met Asp Phe Ser Ala Leu Leu Ser
485 490 495
Gln Ile Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
500 505
<210> 2
<211> 1305
<212> DNA/RNA
<213> poly(A-5XUASG-TATA-Nb6-Fc序列Unknown)
<400> 2
gagtttctag acggagtact gtcctccgag cggagtactg tcctccgact cgagcggagt 60
actgtcctcc gatcggagta ctgtcctccg cgaattccgg agtactgtcc tccgaagacg 120
ctagcggggg gctataaaag ggggtggggg cgttcgtcct cactctagat ctgcgatcta 180
agtaagcttg gccacatgca agtgcagctg caagagagcg gaggaggcag cgtgcaaagc 240
ggaggctctc tgagactgag ctgcgctgcc agcggctaca ccatcaccaa ctcctacaga 300
atggcttggt tcagacaagc ccccggcaag gaaagagagg gagtggctgc catcaacagc 360
ggcggcagca caacatacgc cgacagcgtg aagggaagat tcaccatcag ccaagacaac 420
gcccagaaca cactgtatct gcagatgaac tctctgaagg ccgaggacac cgccatgtac 480
tactgcgctg ccggcagagt gcaatggtgg cccgtgctga gggctctgaa cgaggatgac 540
tatctgtact ggggccaagg cacacaagtg accgtgagct cccaccacca tcaccaccac 600
tgacagctga tggttagatc tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 660
ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 720
tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 780
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 840
gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 900
ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 960
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1020
tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1080
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1140
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 1200
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcacga ggctctgcac 1260
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatga 1305
<210> 3
<211> 475
<212> PRT
<213> TRIM21序列的氨基酸序列(Unknown)
<400> 3
Met Ala Ser Ala Ala Arg Leu Thr Met Met Trp Glu Glu Val Thr Cys
1 5 10 15
Pro Ile Cys Leu Asp Pro Phe Val Glu Pro Val Ser Ile Glu Cys Gly
20 25 30
His Ser Phe Cys Gln Glu Cys Ile Ser Gln Val Gly Lys Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Val Cys Pro Val Cys Arg Gln Arg Phe Leu Leu Lys Asn Leu Arg
50 55 60
Pro Asn Arg Gln Leu Ala Asn Met Val Asn Asn Leu Lys Glu Ile Ser
65 70 75 80
Gln Glu Ala Arg Glu Gly Thr Gln Gly Glu Arg Cys Ala Val His Gly
85 90 95
Glu Arg Leu His Leu Phe Cys Glu Lys Asp Gly Lys Ala Leu Cys Trp
100 105 110
Val Cys Ala Gln Ser Arg Lys His Arg Asp His Ala Met Val Pro Leu
115 120 125
Glu Glu Ala Ala Gln Glu Tyr Gln Glu Lys Leu Gln Val Ala Leu Gly
130 135 140
Glu Leu Arg Arg Lys Gln Glu Leu Ala Glu Lys Leu Glu Val Glu Ile
145 150 155 160
Ala Ile Lys Arg Ala Asp Trp Lys Lys Thr Val Glu Thr Gln Lys Ser
165 170 175
Arg Ile His Ala Glu Phe Val Gln Gln Lys Asn Phe Leu Val Glu Glu
180 185 190
Glu Gln Arg Gln Leu Gln Glu Leu Glu Lys Asp Glu Arg Glu Gln Leu
195 200 205
Arg Ile Leu Gly Glu Lys Glu Ala Lys Leu Ala Gln Gln Ser Gln Ala
210 215 220
Leu Gln Glu Leu Ile Ser Glu Leu Asp Arg Arg Cys His Ser Ser Ala
225 230 235 240
Leu Glu Leu Leu Gln Glu Val Ile Ile Val Leu Glu Arg Ser Glu Ser
245 250 255
Trp Asn Leu Lys Asp Leu Asp Ile Thr Ser Pro Glu Leu Arg Ser Val
260 265 270
Cys His Val Pro Gly Leu Lys Lys Met Leu Arg Thr Cys Ala Val His
275 280 285
Ile Thr Leu Asp Pro Asp Thr Ala Asn Pro Trp Leu Ile Leu Ser Glu
290 295 300
Asp Arg Arg Gln Val Arg Leu Gly Asp Thr Gln Gln Ser Ile Pro Gly
305 310 315 320
Asn Glu Glu Arg Phe Asp Ser Tyr Pro Met Val Leu Gly Ala Gln His
325 330 335
Phe His Ser Gly Lys His Tyr Trp Glu Val Asp Val Thr Gly Lys Glu
340 345 350
Ala Trp Asp Leu Gly Val Cys Arg Asp Ser Val Arg Arg Lys Gly His
355 360 365
Phe Leu Leu Ser Ser Lys Ser Gly Phe Trp Thr Ile Trp Leu Trp Asn
370 375 380
Lys Gln Lys Tyr Glu Ala Gly Thr Tyr Pro Gln Thr Pro Leu His Leu
385 390 395 400
Gln Val Pro Pro Cys Gln Val Gly Ile Phe Leu Asp Tyr Glu Ala Gly
405 410 415
Met Val Ser Phe Tyr Asn Ile Thr Asp His Gly Ser Leu Ile Tyr Ser
420 425 430
Phe Ser Glu Cys Ala Phe Thr Gly Pro Leu Arg Pro Phe Phe Ser Pro
435 440 445
Gly Phe Asn Asp Gly Gly Lys Asn Thr Ala Pro Leu Thr Leu Cys Pro
450 455 460
Leu Asn Ile Gly Ser Gln Gly Ser Thr Asp Tyr
465 470 475

Claims (7)

1.一种光调控病毒繁殖系统，其特征在于：所述系统包括光源与光敏感NSP9降解系统：
所述光源能够发射蓝光，且该光源能够调节光调控病毒繁殖系统所需的光照时间、光照强度和光照频率；
所述光敏感NSP9降解系统包括光敏感蛋白vhhNB-Fc和E3泛素连接酶TRIM21。
2.根据权利要求1所述的光调控病毒繁殖系统，其特征在于：所述系统的作用机理为：呼吸障碍综合症病毒通过受体介导的内吞作用进入宿主细胞，并通过翻译病毒基因组产生病毒结构蛋白和非结构蛋白NSP9，光敏感蛋白vhhNB-Fc在蓝光光照条件下驱动表达，通过其vhhNB端识别NSP9蛋白并与之结合，通过Fc端招募E3泛素连接酶TRIM21，经过泛素化-蛋白酶体降解途径，将NSP9蛋白送入蛋白酶体降解；NSP9被降解后，呼吸障碍综合症病毒失去促进病毒基因组转录的关键性蛋白，繁殖能力下降。
3.如权利要求1或2所述的光调控病毒繁殖系统的构建方法，其特征在于：步骤如下：
⑴搭建光控设备作为光源，对感染病毒的细胞进行光照处理，光控设备由蓝光LED阵列与信号发生器组成，由外部电源供电；LED工作模式为：连续、脉冲，发光强度由电源控制；
⑵构建光敏感NSP9蛋白降解系统，该系统包括光敏感蛋白vhhNB-Fc与E3泛素连接酶TRIM21；
所述光敏感蛋白vhhNB-Fc的质粒表达载体的构建：该光控融合蛋白由两部分组成：光响应的转录激活因子表达载体pcDNA3.1(+)-Gal4(65)-VVD-P65AD和转录因子调控表达的融合蛋白Pu5-vhhNB-Fc；
所述pcDNA3.1(+)-Gal4(65)-VVD-P65AD表达质粒的构建步骤如下：
以pcDNA3.1(+)为载体，以XbaI和BamHI为酶切位点，将-Gal4(65)-VVD-P65AD-序列通过分子克隆的方式连接到载体上；
其中，所述-Gal4(65)-VVD-P65AD-序列的氨基酸序列为SEQ.No.1；
所述pU5-vhhNB-Fc质粒表达载体的构建步骤如下：
以pcDNA3.1(+)为载体，以NruI和BamHI为酶切位点，将poly(A)-5XUASG-TATA-vhhNB-Fc序列通过分子克隆的方式连接到载体上；
poly(A)-5XUASG-TATA-vhhNB-Fc序列的核苷酸序列为SEQ.No.2；
所述E3泛素连接酶TRIM21表达质粒pcDNA3.1(+)-TRIM21的构建步骤如下：
以pcDNA3.1(+)为载体，以XbaI和BamHI为酶切位点，将TRIM21序列通过分子克隆的方式连接到载体上；
TRIM21序列的核苷酸序列为SEQ.No.3；
⑶细胞表达光敏感NSP9蛋白降解系统：
培养MARC-145细胞，将上述质粒pcDNA3.1(+)-Gal4(65)-VVD-P65AD，pU5-vhhNB-Fc,pcDNA(+)-TRIM21在MARC-145细胞中转染表达，即得表达光敏感NSP9降解系统并感染病毒的细胞；
⑷对表达光敏感NSP9降解系统并感染病毒的细胞进行光照处理。
4.利用如权利要求1或2所述的光调控病毒繁殖系统抑制呼吸障碍综合症病毒增殖的方法，其特征在于：步骤如下：
呼吸障碍综合症病毒感染表达光敏感NSP9蛋白降解系统后避光处理的细胞，并利用蓝光LED光照设备提供特定的光照条件，即波长470nm，功率0.8mWmm-2，频率15s/min，光照时间24h，从而达到抑制呼吸障碍综合症病毒增殖。
5.一种利用如权利要求1或2所述的光调控病毒繁殖系统用于调控病毒繁殖的方法，其特征在于：步骤如下：
呼吸障碍综合症病毒感染表达光敏感NSP9蛋白降解系统后避光处理的细胞，并利用蓝光LED光照设备提供不同的光照条件，即波长470nm，功率0.8mWmm-2，频率15s/min，光照时间0h～24h梯度变化，光控启动子驱动vhhNB-Fc融合蛋白表达，靶向识别NSP9蛋白并招募泛素-蛋白酶体降解系统，实现不同程度的NSP9降解，从而调控PRRSV病毒繁殖。
6.如权利要求1或2所述的光调控病毒繁殖系统在抑制呼吸障碍综合症病毒的增殖方面中的应用。
7.如权利要求1或2所述的光调控病毒繁殖系统在调控呼吸障碍综合症病毒繁殖状况方面中的应用。
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