CN103087155A - 一种狂犬病毒疫苗增效蛋白及编码该蛋白的基因和应用 - Google Patents

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CN103087155A CN2013100191080A CN201310019108A CN103087155A CN 103087155 A CN103087155 A CN 103087155A CN 2013100191080 A CN2013100191080 A CN 2013100191080A CN 201310019108 A CN201310019108 A CN 201310019108A CN 103087155 A CN103087155 A CN 103087155A
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Abstract

发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种狂犬病毒疫苗增效蛋白及编码该蛋白的基因和应用。将该蛋白的cDNA用基因工程方法克隆至原核细胞、真核（酵母、动物、植物）细胞表达由该cDNA编码的蛋白。该蛋白与狂犬病毒疫苗具有高亲和性，与狂犬病毒（抗原）疫苗联用可显著加速狂犬病毒（抗原）抗体产生的时间，提高疫苗的免疫效果，提高动物体内保护性抗体滴度。本发明的蛋白可以用作狂犬病毒疫苗的佐剂，用于开发高效快速的增效型狂犬病毒疫苗，以达到在动物受病毒侵染后应急防治保护作用。

Description

一种狂犬病毒疫苗增效蛋白及编码该蛋白的基因和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种狂犬病毒疫苗增效蛋白及编码该蛋白的基因和应用。
背景技术
狂犬病是当前威胁人类健康的一种比较严重的急性传染病，人类患者一旦被病畜咬伤而发病，死亡率高达95%以上。当前我国狂犬病形势也相当严峻，发病率居世界第二位，仅次于印度。通过注射狂犬病毒疫苗预防狂犬病的感染是当前控制狂犬病发病的重要途径。但是目前狂犬病毒疫苗的免疫效果在人群中存在较大差异，且注射后体内狂犬病毒抗体的滴度上升到具有保护效力的滴度所需要的时间较长，不足以在病毒潜伏期内产生足够的抗体以抵抗狂犬病毒的感染和发病。因此寻找能够有效增强狂犬病毒疫苗免疫源性的分子作为佐剂是解决该问题的一个重要途径。
采用基因工程原理，应用原核（如大肠杆菌）表达系统或真核（如酵母、哺乳动物细胞等）表达系统克隆表达某种蛋白是获取大量该蛋白的最为有效的方法。将其与狂犬病毒疫苗一同免疫动物，再用ELISA方法测定动物体内狂犬病毒特异性抗原的抗体效价，可以很方便地观察到该蛋白是否能够增强狂犬病毒疫苗的免疫效果，从而推断该蛋白在狂犬病毒疫苗领域是否具有潜在的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种狂犬病毒疫苗的增效蛋白及编码该蛋白的基因，并提供表达该蛋白的方法和应用。
本发明提供的狂犬病毒疫苗的增效蛋白（记为SBP），其核苷酸序列为SEQ.ID.NO.1所示，具有如下功能特征：① 可与狂犬病毒疫苗亲和，测得亲和常数可达1.16×107L/mol；②与狂犬病毒疫苗注射动物或人体，可以缩短达到保护效力的抗体滴度的时间，提高免疫应答效率和强度。
本发明还提供编码所述狂犬病毒疫苗的增效蛋白的基因，其氨基酸序列为SEQ.ID.N0.2所示。
通过基因工程改造，本发明还获得了一系列同源性达80%以上的具有对狂犬病毒疫苗有增效功能的序列。具体包含以下序列：
1、通过体外扩增拼接或DNA人工合成得到若干具有和SBP同样免疫增效功能的基因序列，基因序列号为SEQ.ID.NO.3-- SEQ.ID.NO.5，经过修饰的蛋白序列：SEQ.ID.NO.6、SEQ.ID.NO.7。
2、通过定点突变、基因重组等手段获得了几种具有更强亲和力免疫增效功能的蛋白序列：SEQ.ID.NO.8、SEQ.ID.NO.9。
3、通过各种方法获得的与上述基因或蛋白质序列（SEQ.ID.NO.1-- SEQ.ID.NO.9）同源性达80%以上并具有与狂犬病毒疫苗高度亲和性及对狂犬病毒疫苗具有显著增效功能的序列，上述序列统称为SBPs。 
将上述DNA序列/片段直接克隆到pBV220或其它原核表达载体，经诱导表达获得重组蛋白；也可将上述表达片段克隆到真核表达载体如pEGFP-N1、pICZα(a,b,c)等在哺乳细胞和酵母中表达。运用Ni-NTA agarose、交联有SPA、ConA、mAb等的亲和柱进行纯化，最终得到纯化的目的蛋白。
本发明的核苷酸序列为SEQ.ID.NO.1的蛋白可作为狂犬病毒疫苗佐剂。该蛋白与狂犬病毒疫苗具有高亲和性，与狂犬病毒（抗原）疫苗联用可显著加速狂犬病毒（抗原）抗体产生的时间，提高疫苗的免疫效果，提高动物体内保护性抗体滴度，可用于在动物受病毒侵染后应急防治保护。
本发明的氨基酸序列为SEQ.ID.NO.2的蛋白可作为狂犬病毒疫苗佐剂。通过重组表达与SBP具有80%以上同源性的蛋白，包括和其他抗原成分（如各种蛋白多肽）的融合、聚合、混合等各种联合方式一起使用，产生协同增效作用的有效形式。
该蛋白对狂犬病毒疫苗亲和性实验的结果:用不同稀释度的疫苗液体(1:5、1:10、1:20、1:40、1:80)包被96孔酶标板，孵育后加入SBP作为一抗，抗人IgG为二抗进行ELISA反应，测得的OD值与未加入SBP的结果进行对照，观察SBP与狂犬病毒疫苗的亲和性。结果证明SBP与狂犬病毒具有极强的亲和力，亲和常数Ka>107L/mol。
该蛋白对狂犬病毒疫苗免疫效果的影响:将实验动物分为试验组和对照组。以小鼠为例，按常规方法用狂犬病毒疫苗免疫小鼠，皮下注射。在免疫后的第12、20、28、42天从小鼠尾静脉取血，分离血清。用ELISA方法测定小鼠体内抗狂犬病毒抗体的滴度。SPSS软件分析试验组和对照组的差异。结果发现该蛋白可以明显增强小鼠体内抗体的滴度，即该蛋白可以增强狂犬病毒疫苗的免疫效果。
由此可见，该蛋白对狂犬病毒疫苗具有极强的亲和性，利用该蛋白可以增强狂犬病毒疫苗的免疫原性，可降低狂犬病毒抗体在体内达到保护性作用滴度的时间，有利于体内在短时间内生成具有保护性的狂犬病毒抗体。因此可将其作为一种狂犬病毒疫苗的增效分子即佐剂而应用于狂犬病毒疫苗领域，提高现有狂犬病毒疫苗的效力，降低狂犬病的发病率和致死率。
附图说明
图1 该蛋白对狂犬病毒疫苗的亲和性。
图2 该蛋白对Balb/c小鼠抗狂犬病毒抗体效价的影响。
具体实施方式
一、基因序列的获得与改造 
通过人工合成、体外基因扩增拼接的方式对SBP基因序列进行修饰或同义突变，获得多种和SBP具有相同功能的基因序列（SEQ.ID.NO.3-5）。例如，在该cDNA的N或C端引入6×his purification tag和肠激酶酶切位点DDDDK，6×his purification tag有利于目的融合蛋白的亲和纯化，肠激酶酶切位点可以使纯化的融合蛋白在肠激酶的作用下切除掉6×his tag和DDDDK。
根据SBP和HBsAg三维互作模式，特别是静电分布状态的分析结果，采用点突变和基因重组的方法对SBP进行结构改造（如：V3D，T8D），获得具有强化免疫增效功能的蛋白序列（SEQ.ID.NO.8-9）。
二、基因工程表达和纯化目的蛋白  
1、原核表达。在该cDNA的N端引入6×his purification tag和肠激酶酶切位点DDDDK。将这一完整的DNA克隆到pBV220原核表达载体中，转化大肠杆菌，筛选阳性转化子。挑取阳性单克隆于液体培养基中培养并进行温度诱导发酵：首先在37 C，250rpm培养转化的大肠杆菌至OD600=0.5~0.6，然后迅速升温至42℃开始诱导发酵5小时。发酵结束后离心收集菌体，裂解菌体以提取包涵体，包涵体粗纯后用Ni-NTA agarose柱亲和纯化，经透析复性后最终得到目的蛋白。用Western和ELISA实验验证所获得的蛋白正是所需要的目的蛋白；
2、酵母真核表达。将上述基因克隆到真核表达载体pICZα（a,b,c）转化毕赤酵母（GS115），在BMMY培养基中进行甲醇诱导培养，重组蛋白可经交联有SPA、ConA、mAb的亲和柱和离子交换柱等分离纯化，最后得到了较高纯度的目的蛋白；  
3、真核细胞表达。将上述基因序列及其改造后的序列克隆到pEGFP-N1等哺乳细胞表达载体中,转染CHO细胞，经RPMI-1640完全培养基中大量培养，收获细胞并在不损害蛋白活性的前提下裂解细胞，经Ni-NTA agarose柱及经交联有SPA、ConA、mAb的亲和柱亲和纯化，获得高活性的目的蛋白。
三、SBP蛋白对狂犬病毒疫苗效果的影响评价 
1、该蛋白对狂犬病毒疫苗亲和性实验的结果:用不同稀释度的疫苗液体(1:5、1:10、1:20、1:40、1:80)包被96孔酶标板，孵育后加入SBP作为一抗，抗人IgG为二抗进行ELISA反应，测得的OD值与未加入SBP的结果进行对照，观察SBP与狂犬病毒疫苗的亲和性。结果证明SBP与狂犬病毒具有极强的亲和力，亲和常数Ka>107L/mol。
2、蛋白对狂犬病毒疫苗免疫效果的影响:将实验动物分为试验组和对照组。以小鼠为例，按常规方法用狂犬病毒疫苗免疫小鼠，皮下注射。在免疫后的第12、20、28、42天从小鼠尾静脉取血，分离血清。用ELISA方法测定小鼠体内抗狂犬病毒抗体的滴度。SPSS软件分析试验组和对照组的差异。
结果（图1、图2）发现，SBP与狂犬病毒疫苗具有极强的亲和作用。实验小鼠在免疫后14天左右抗体效价达到了8000，而对照组在免疫14天后抗体仍未产生。在免疫后20天，实验组的小鼠抗体效价达到了10000，而对照组的抗体仅为4000。以上结果说明SBP蛋白能够通过增强与狂犬病毒疫苗的亲和力而上调小鼠体内抗狂犬病毒抗体的能力，可以增强狂犬病毒疫苗的免疫效果。
四、具体应用 
传统的狂犬病毒疫苗往往不能在短时间内提高体内抗体的滴度，从而不能很好地在狂犬病毒潜伏期内提供足够的抗体水平以抵抗病毒的侵染。本发明提供的这种狂犬病毒疫苗增效蛋白能够在短时期内显著提高小鼠体内狂犬病毒抗体的滴度水平，明显增强狂犬病毒疫苗的免疫效果，因此，可将其用于狂犬病毒疫苗佐剂的开发。在注射狂犬病毒疫苗的同时，注射一定量的该蛋白，能够增强狂犬病毒疫苗的免疫原性，在短时间内增加体内抗狂犬病毒抗体的效价，从而提高疫苗的免疫效率，并减少狂犬病毒疫苗的用量和注射次数。
<110>  复旦大学
<120>  一种狂犬病毒疫苗增效蛋白及编码该蛋白的基因和应用
<130>  001
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    50                  55                  60                 
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
65                  70                  75                  80 
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
                85                  90                  95     
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
            100                 105                 110        
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
        115                 120                 125            
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
    130                 135                 140                
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
145                 150                 155                 160
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
                165                 170                 175    
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
            180                 185                 190        
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
        195                 200                 205            
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
    210                 215                 220                
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
225                 230                 235                 240
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
                245                 250                 255    
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
            260                 265                 270        
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
        275                 280                 285            
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
    290                 295                 300                
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
305                 310                 315                 320
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
                325                 330                 335    
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
            340                 345                 350        
Pro Gly Lys
        355
 
<210>  7
<211>  350
<212>  PRT
<213>  
<400>  7
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
1               5                   10                  15     
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
            20                  25                  30         
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
        35                  40                  45             
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
    50                  55                  60                 
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
65                  70                  75                  80 
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
                85                  90                  95     
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
            100                 105                 110        
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
        115                 120                 125            
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
    130                 135                 140                
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
145                 150                 155                 160
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
                165                 170                 175    
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
            180                 185                 190        
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
        195                 200                 205            
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
    210                 215                 220                
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
225                 230                 235                 240
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
                245                 250                 255    
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
            260                 265                 270        
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
        275                 280                 285            
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
    290                 295                 300                
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
305                 310                 315                 320
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
                325                 330                 335    
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys His His His His His His
            340                 345                 350
 
<210>  8
<211>  344
<212>  PRT
<213>  
<400>  8
Met Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
1               5                   10                  15     
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
            20                  25                  30         
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
        35                  40                  45             
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
    50                  55                  60                 
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
65                  70                  75                  80 
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
                85                  90                  95     
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
            100                 105                 110        
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
        115                 120                 125            
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
    130                 135                 140                
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
145                 150                 155                 160
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
                165                 170                 175    
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
            180                 185                 190        
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
        195                 200                 205            
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
    210                 215                 220                
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
225                 230                 235                 240
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
                245                 250                 255    
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
            260                 265                 270        
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
        275                 280                 285            
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
    290                 295                 300                
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
305                 310                 315                 320
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
                325                 330                 335    
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
            340                
 
<210>  9
<211>  344
<212>  PRT
<213>  
<400>  9
Met Asp Asp Trp Gly Gln Gly Asp Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
1               5                   10                  15     
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
            20                  25                  30         
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
        35                  40                  45             
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
    50                  55                  60                 
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
65                  70                  75                  80 
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
                85                  90                  95     
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
            100                 105                 110        
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
        115                 120                 125            
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
    130                 135                 140                
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
145                 150                 155                 160
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
                165                 170                 175    
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
            180                 185                 190        
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
        195                 200                 205            
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
    210                 215                 220                
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
225                 230                 235                 240
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
                245                 250                 255    
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
            260                 265                 270        
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
        275                 280                 285            
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
    290                 295                 300                
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
305                 310                 315                 320
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
                325                 330                 335    
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
            340                
 
 

Claims (7)

1.一种狂犬病毒疫苗增效蛋白，其特征在于核苷酸序列为SEQ.ID.NO.1。
2.一种编码如权利要求1所述狂犬病毒疫苗增效蛋白的基因，其特征在于氨基酸序列为SEQ.ID.N0.2。
3.一种具有与权利要求1所述狂犬病毒疫苗增效蛋白同样功能的蛋白，其特征在于核苷酸序列为SEQ.ID.NO.3-- SEQ.ID.NO.5之一所示。
4.一种经过修饰的蛋白序列，其特征在于氨基酸序列为SEQ.ID.NO.6或SEQ.ID.NO.7所示。   
5.一种表达如权利要求1所述的狂犬病毒疫苗增效蛋白的方法，其特征在于具体步骤为：将基因序列克隆到原核表达载体pBV220转化大肠杆菌，或真核表达载体pICZα（a,b,c）转化毕赤酵母（GS115），或pEGFP-N1哺乳细胞表达载体中,转染CHO细胞，经过诱导表达和纯化，获得一系列高纯度的目的蛋白。
6.如权利要求1所述蛋白作为狂犬病毒疫苗佐剂的应用。
7.如氨基酸序列为SEQ.ID.NO.2的蛋白基因作为狂犬病毒疫苗佐剂的应用。
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