CN108034677A - 一种重组载体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组载体及其制备方法和应用，所述重组载体包含膜固定白介素15的基因和膜固定白介素21的基因；本发明通过设计膜固定白介素15和膜固定白介素21，将分泌蛋白改为跨膜蛋白，与包括41BBL、CD64、CD86和CD19的共刺激信号传导结构域协同激活并长期保持NK细胞的增殖和功能发挥，提高扩增效率，在体外诱导NK细胞的分化成熟，膜固定白介素15和膜固定白介素21相互搭配，协助增强对NK细胞的激活功能，并辅以共刺激信号结构域，全面稳定保持对NK细胞的激活及诱导分化成熟功能；本发明提供的制备方法简洁高效，便于操作，应用于NK细胞扩增领域，能实现NK细胞的高效扩增，具有广阔的应用前景。

Description

一种重组载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种重组载体及其制备方法和应用。

背景技术

自然杀伤细胞(Nature killer cell,NK细胞)是一种机体内重要的天然免疫系统淋巴细胞，其主要来源于骨髓CD34+淋巴细胞，表型一般为CD3-CD16+CD56+。NK细胞的生物学意义在于其无需抗原致敏和MHC的限制即可以识别并且杀伤肿瘤细胞，与此同时，NK细胞又可以分泌多种细胞因子和趋化因子，调节获得性免疫应答，是连接固有免疫应答和获得性免疫应答的桥梁。NK细胞在抗病毒、抗肿瘤中扮演了重要的角色，因其作用不需初次免疫活化，因此在过继免疫治疗中有很大的应用前景，但NK细胞在外周血淋巴细胞中所占的比例较低，限制了其在各领域的应用。

γ链细胞因子在NK细胞增殖及功能发挥上均发挥了重要作用。该家族成员包括IL2、IL4、IL7、IL9、IL15和IL21。在NK细胞分化过程中，不同的细胞因子都具有不同的作用。在这些不同种细胞因子中，IL2、IL15、IL21被认为是NK功能有力激活剂。IL-15在NK细胞的生长成熟中发挥重要作用，同时，IL15分子还能调节NK细胞平衡。IL15分子最初被发现是因其具有与类似IL2的促进T与NK细胞增殖的功能，且其信号通路均涉及IL2-Rβ(IL15-Rβ)复合物。在很多组织和单个核血细胞、激活的巨噬细胞、上皮细胞系中均能检测到IL15分子mRNA的存在。IL-15不仅激活NK细胞，也同时激活CD8+T细胞和NKT细胞，不会扩增调节性T细胞Tregs。IL-21是一种由活化的CD4+T细胞分泌的细胞因子，分子结构与IL-15分子类似，它能够协同IL-15分子作用，促进骨髓前体细胞增殖以及NK细胞增殖、分化和增强细胞毒活性。IL21联合IL2以及IL15刺激细胞后，能够诱导NK细胞相关分子如CD16、NKG2D、NKp30、NKp44、Ly49、穿孔素、颗粒酶B的mRNA表达水平改变。也有文献报道，经膜结合型IL21刺激扩增的NK细胞端粒长度增长，能够在体外更长时间维持NK细胞的扩增。41BBL属于TNF超家族，与其配体结合后介导的共刺激信号促进T、NK细胞增殖。CD86提升NK细胞对肿瘤细胞、微环境中肿瘤相关巨噬细胞和B细胞的杀伤作用，CD19有助于激活NK细胞识别并杀伤肿瘤微环境中的B细胞。CD64有助于增强NK细胞的ADCC效应。

传统的NK细胞扩增技术是在NK细胞培养体系中添加IL2、IL15等细胞因子以促进NK细胞增殖，但由于扩增效率不高且纯度不够未能得到广泛应用。

CN105985931A公开了一种NK细胞体外扩增组合物及NK细胞扩增方法，该组合物包括NK扩增滋养细胞、IL-2、灭活的自体血浆和GT-T551H3培养基。扩增方法：用GT-T551H3培养基将PBMCs重悬后，接入培养瓶，加入IL2、NK扩增滋养细胞及自体血浆，体外共培养15天，其中培养第7天时补加一次NK扩增滋养细胞，培养过程中补充培养基，培养13和15天收集细胞进行检测。CN102994449A公开了一种体外大量扩增NK细胞的方法，主要步骤包括：a.将外周血单个核细胞接种在CD3McAb和CD226McAb预包被的培养瓶中共培养，b.加入IL-2和IL-18共培养72小时以刺激扩增NK细胞，c.将NK细胞与经致死处理的K562细胞和含有IL-2和IL-18的无血清培养基转入细胞培养袋中共培养，d.收获NK细胞。CN106754730A公开了一种高效扩增NK细胞的方法，具体是一种使用高表达膜蛋白CD19、CD137L、CD86、CD64及跨膜蛋白IL21的K562工程细胞联合人IL2突变体高效扩增NK细胞的方法，但上述现有技术步骤复杂，扩增效率较低，纯度不高，仍有较大提升空间。

综上所述，构建一种用于诱导扩增NK细胞的重组载体用于研究NK细胞的功能，并为肿瘤的细胞免疫治疗奠定基础，具有广阔的应用前景和市场价值。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种重组载体及其制备方法和应用，通过设计膜固定白介素15和膜固定白介素21，与包括41BBL、CD64、CD86和CD19的共刺激信号传导结构域协同激活并长期保持NK细胞的增殖和功能发挥，提高扩增效率，在体外诱导NK细胞的分化成熟，制备方法简洁高效，便于操作，应用于NK细胞扩增领域，能实现NK细胞的高效扩增，具有广阔的应用前景。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种重组载体，所述重组载体包含膜固定白介素15(mb IL15)的基因和膜固定白介素21(mb IL 21)的基因。

发明人在长期实验过程中，发现综合使用各种细胞因子有助于NK细胞的增殖及效应功能，在充分了解NK细胞的扩增特性及生长需求后，深入研究各类细胞因子的功能和效果，设计大量实验多重筛选组合，最终发现膜固定白介素15和膜固定白介素21相互搭配，协助增强对NK细胞的激活功能，并辅以共刺激信号结构域，协同激活并全面稳定地保持对NK细胞的激活功能。

优选地，所述膜固定白介素15的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述膜固定白介素21的核酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述SEQ ID NO:1-2所示的核酸序列如下：

膜固定白介素15(SEQ ID NO:1)：

GCCCTTCCACCATGGGACTGAGTAACATTCTCTTTGTGATGGCCTTCCTGCTCTCTGGTGCTGCTCCTCTGAAGATTCAAGCTAACTGGGTGAATGTAATAAGTGATTTGAAAAAAATTGAAGATCTTATTCAATCTATGCATATTGATGCTACTTTATATACGGAAAGTGATGTTCACCCCAGTTGCAAAGTAACAGCAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCACTTGAGTCCGGAGATGCAAGTATTCATGATACAGTAGAAAATCTGATCATCCTAGCAAACAACAGTTTGTCTTCTAATGGGAATGTAACAGAATCTGGATGCAAAGAATGTGAGGAACTGGAGGAAAAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACATATTGTCCAAATGTTCATCAACACTTCTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGGGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGTAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGGACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGGATTACAGCTGTACTTCCAACAGTTATTATATGTGTGATGGTTTTCTGTCTAATTCTATGG；

膜固定白介素21(SEQ ID NO:2)：

GCCCTTCCACCATGGGACTGAGTAACATTCTCTTTGTGATGGCCTTCCTGCTCTCTGGTGCTGCTCCTCTGAAGATTCAAGCTATGAGATCCAGTCCTGGCAACATGGAGAGGATTGTCATCTGTCTGATGGTCATCTTCTTGGGGACACTGGTCCACAAATCAAGCTCCCAAGGTCAAGATCGCCACATGATTAGAATGCGTCAACTTATAGATATTGTTGATCAGCTGAAAAATTATGTGAATGACTTGGTCCCTGAATTTCTGCCAGCTCCAGAAGATGTAGAGACAAACTGTGAGTGGTCAGCTTTTTCCTGTTTTCAGAAGGCCCAACTAAAGTCAGCAAATACAGGAAACAATGAAAGGATAATCAATGTATCAATTAAAAAGCTGAAGAGGAAACCACCTTCCACAAATGCAGGGAGAAGACAGAAACACAGACTAACATGCCCTTCATGTGATTCTTATGAGAAAAAACCACCCAAAGAATTCCTAGAAAGATTCAAATCACTTCTCCAAAAGATGATTCATCAGCATCTGTCCTCTAGAACACACGGAAGTGAAGATTCCTGAGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGGGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGTAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGGACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGGATTACAGCTGTACTTCCAACAGTTATTATATGTGTGATGGTTTTCTGTCTAATTCTATGG.

优选地，所述膜固定白介素15由CD86信号肽、白介素15和CD86跨膜区组成。

优选地，所述膜固定白介素21由CD86信号肽、白介素21和CD86跨膜区组成。

优选地，所述重组载体还包括共刺激信号传导结构域。

优选地，所述共刺激信号传导结构域包括41BBL、CD64、CD86或CD19中的任意一种或至少两种的组合，例如可以是41BBL和CD64的组合，CD64和CD86的组合，CD19和CD64的组合，41BBL、CD64、CD86和CD19的组合，优选为41BBL、CD64、CD86和CD19的组合。

本发明中，41BBL(CD137L)属于TNF超家族，与其配体结合后介导的共刺激信号促进T、NK细胞增殖；CD86提升NK细胞对肿瘤细胞、微环境中肿瘤相关巨噬细胞和B细胞的杀伤作用；CD19有助于激活NK细胞识别并杀伤肿瘤微环境中的B细胞；CD64增强NK细胞的ADCC效应。

优选地，所述41BBL基因的核酸序列如SEQ ID NO:3所示。

优选地，所述CD64基因的核酸序列如SEQ ID NO:4所示。

优选地，所述CD86基因的核酸序列如SEQ ID NO:5所示。

优选地，所述CD19基因的核酸序列如SEQ ID NO:6所示。

优选地，所述重组载体沿着真核表达载体的转录方向依次可操作地连接有膜固定白介素15基因、膜固定白介素21基因、41BBL基因、CD64基因、CD86基因和CD19基因。

优选地，所述真核表达载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-PURO。

优选地，所述重组载体的结构中还包括T2A序列，用于避免融合蛋白的产生。

其中，所述T2A基因的核酸序列如SEQID NO:7所示。

优选地，所述重组载体中连接的基因中均包含Kozak序列，用于增强蛋白表达。

第二方面，本发明提供一种制备如第一方面所述重组载体的方法，包括如下步骤：

(1)合成目的基因mbIL15-mbIL21-41BBL-CD64-CD86-CD19并连接到pUC57载体上；

(2)将步骤(1)得到的载体通过PCR扩增，酶切连接至pCDH载体上。

第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的重组载体用于诱导扩增NK细胞。

第四方面，本发明提供一种采用如第一方面所述的重组载体扩增NK细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1’)质粒大提：将包含pCDH-mbIL15-mbIL21-41BBL-CD64-CD86-CD19目的基因的表达载体和包装载体工程菌进行过夜培养，将过夜培养的菌液利用SDS碱裂解法结合硅胶模滤膜进行大提；

(2’)病毒包装：将重组载体和包装质粒共转染细胞进行包装，收集和浓缩病毒液，并进行滴度检测和MOI值的测定；

(3’)构建工程细胞株：培养K562细胞，接种病毒，更换培养基，嘌呤霉素筛选，收获细胞鉴定基因表达，进行表型观察分析并通过浓度为50-100μg/mL的丝裂霉素C孵育1h或Co60射线100-200Gy照射进行灭菌处理；

(4’)将工程细胞按(0.1-1):1和脐血单核细胞或外周血单核细胞混合，联合180-220U/mL的IL2，共同刺激培养NK细胞。

所述丝裂霉素C的浓度为50-100μg/mL，例如可以是50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL、90μg/mL或100μg/mL。

所述工程细胞和脐血单核细胞或外周血单核细胞的混合比例为(0.1-1):1，例如可以是0.1:1、0.2:1、0.3:1、0.5:1、0.7:1、0.9:1或1:1。

所述IL2的浓度为180-220U/mL，例如可以是180U/mL、190U/mL、200U/mL、210U/mL或220U/mL。

发明人提供了一种改良型的NK细胞体外扩增技术，该技术应用了一种表达了NK细胞分化成熟所必需的IL15、IL21、41BBL、CD64、CD86和CD19分子的工程细胞，该细胞在辐照后能够作为饲养细胞在体外诱导NK细胞的分化成熟，实现高效扩增NK细胞，得到大量活性较高的NK细胞。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供的重组载体通过设计膜固定白介素15和膜固定白介素21，将分泌蛋白改为跨膜蛋白，与包括41BBL、CD64、CD86和CD19的共刺激信号传导结构域协同激活并长期保持NK细胞的增殖和功能发挥，提高扩增效率，在体外诱导NK细胞的分化成熟，膜固定白介素15和膜固定白介素21相互搭配，协助增强对NK细胞的激活功能，并辅以共刺激信号结构域，全面稳定保持对NK细胞的激活及诱导分化成熟功能；

(2)本发明提供的制备方法简洁高效，便于操作，特异性针对本发明提供的重组载体，精准稳定地制备产出重组载体，应用于NK细胞的扩增技术，实现NK细胞的高效扩增及持续分化成熟。

附图说明

图1为本发明的pCDH-CMV-MCS-EF1-PURO载体信息，其中，图1(A)为载体图谱，图1(B)为MCS区碱基序列；

图2为本发明的重组蛋白示意图；

图3为本发明的K562基因工程细胞中的蛋白表达情况图，其中，图3(A)为IL15在K562基因工程细胞中的表达情况，图3(B)为IL21在K562基因工程细胞中的表达情况，图3(C)为41BBL在K562基因工程细胞中的表达情况，图3(D)为CD64在K562基因工程细胞中的表达情况，图3(E)为CD19在K562基因工程细胞中的表达情况，图3(F)为CD86在K562基因工程细胞中的表达情况；

图4为本发明的CBMC/PBMC细胞体外扩增线性图；

图5为本发明的CBMC/PBMC细胞体外扩增前后流式数据图，其中，图5(A)为CBMC的CD56、CD3的表达情况，图5(B)为CBMC在K562基因工程细胞刺激14d后，CD56、CD3的表达情况，图5(C)为PBMC的CD56、CD3的表达情况，图5(D)为PBMC在K562基因工程细胞刺激14d后，CD56、CD3的表达情况。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1慢病毒表达载体的构建

通过生工生物工程(上海)股份有限公司全基因合成mbIL15-mbIL21-41BBL-CD64-CD86-CD19目的基因并连接到pUC57载体上，再以pUC57-mbIL15-mbIL21-41BBL-CD64-CD86-CD19为模板，设计带有酶切位点的引物，扩增目的基因，通过酶切位点BamHI和NotI连接到pCDH载体上，pCDH的载体图谱如图1(A)和图1(B)所示。

PCR反应体系(PCR扩增试剂盒，生工，B532071)：

引物F(SEQ ID NO:8)：CGGATCCGGCCCTTCCACCAT；

引物R(SEQ ID NO:9)：TTGCGGCCGCAAAAGATGAAGAAT；

具体反应体系如下：

PCR条件为：95℃预变性2min，95℃变性20s，63℃退火140s，72℃延伸30s，30个循环；72℃最终延伸5min；

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，mbIL15-mbIL21-41BBL-CD64-CD86-CD19的PCR产物用Takara琼脂糖凝胶试剂盒回收，用BamH I和Not I双酶切纯化产物，同时用BamHI和Not I双酶切pCDH；

酶切反应体系如下：

37℃反应2h；

将酶切后的基因及载体进行连接反应；

20μL连接反应体系如下：

反应条件：22℃孵育30min；

连接产物表达的重组蛋白结构示意图如图2所示；

采用热击法将连接产物转化到感受态细胞E.coli DH5α中，然后每管中加入SOC培养液1mL，37℃条件下复苏60min，将复苏过的菌液涂布平板上，37℃培养16-18小时，从转化平板挑取4-8个单克隆，接种于5mL LB培养基中、37℃、220r/min培养12-16h，采用TaKaRa的质粒小提试剂盒进行质粒小提，按上述方法进行酶切及核酸电泳鉴定。

对比例1

与实施例1相比，除不插入mb IL 15外，其他条件与实施例1相同。

对比例2

与实施例1相比，除不插入mb IL 21外，其他条件与实施例1相同。

对比例3

与实施例1相比，除了插入的共刺激传导结构域为41BBL和CD64的组合外，其他条件与实施例1相同。

对比例4

与实施例1相比，除了插入的共刺激传导结构域为41BBL外，其他条件与实施例1相同。

实施例2质粒大提

对现有的对照载体(pCDH-GFP)、实施例1和对比例1-4制备得到的目的基因表达载体以及包装载体工程菌(PSPAX2和PMD2G)进行菌体培养，然后大提；

利用SDS碱裂解法结合硅胶模滤膜进行大提，从LB培养基过夜培养的菌液中纯化得到高纯度且无内毒素的质粒DNA溶液，质粒溶解于Tris缓冲液中，得到的质粒可直接用于转化、测序、转录以及酶切反应；

大提的具体步骤为：从-80℃取出相应的菌株，进行平板划线，培养过夜(12-24h)；次日挑取单克隆(2-4个)，进行小体积(5mL)摇菌(6-8h)；从小摇的体系中取菌液，按体积比1:100转大摇，用OMEGA大提试剂盒进行提取。

实施例3磷酸钙病毒包装

用构建的慢病毒表达载体和包装质粒采用磷酸钙转染方法共转染293T细胞(磷酸钙转染试剂盒，碧云天，产品编号为：C0508)，包装病毒，采用超滤离心方式(超滤离心装置，Millipore，产品编号：UFC910096，100kD)进行病毒的收集与浓缩，储存和稀释并进行滴度检测和MOI值的测定；

采用不饱和侵染流式法测定病毒滴度：接种293T细胞与六孔板数孔，使贴壁后融合度达到70％，并对接种细胞进行计数为N；细胞贴壁后6-8h，梯度加入病毒液V(如10μL、7.5μL、5μL、2.5μL)，流式检测各梯度的侵染百分率，选择接近50％的侵染组，设侵染率为M；

按照公式T＝N×M/V×1000(TU/mL)进行病毒滴度计算；

Lent-GFP和Lent-重组载体(实施例1和对比例1-4的重组载体)侵染293T细胞(4×10⁵个)，48H后流式检测目的蛋白表达情况，通过不饱和侵染计算病毒滴度，Lent-重组载体≥3.4×10⁸U/mL，Lent-GFP：0.96×10⁸U/mL；

实施例4工程细胞株的构建

在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到70％-80％的密度，CO₂孵箱过夜培养；

第二天准备3mL无抗生素无血清培养基，加入聚凝胺(polybrene)使其终浓度为8μg/mL，将已经制备的病毒颗粒0.5mL加至上述培养基，轻吹混匀，去除60mm培养皿内的旧的培养基，加入含病毒培养基；

病毒感染后24小时，换用含最优浓度嘌呤霉素的培养基，以后每隔一天换用新鲜含嘌呤霉素的无抗生素无血清培养基，以替换含大量死细胞的培养基，直到抗性群落能在筛选后10到12天被识别出；

待抗性细胞长满以后，细胞转入10cm培养皿，同时留一部分细胞在原来的60mm平皿内，60mm平皿内细胞长满后，收获细胞，在蛋白或mRNA水平鉴定基因表达效率，K562基因工程细胞中的蛋白表达情况图如图3(A)-图3(F)所示；

由图3(A)-图3(F)可知，流式结果显示，工程细胞中IL15、IL21、41BBL、CD64、CD19五种蛋白表达量为98％以上，即插入的外源基因均在工程细胞中稳定且高表达。

传代冻存：10cm培养皿内的细胞待长满后传代，首先每种稳定细胞系冻存4-5支细胞，待基因表达鉴定清楚后，解冻冻存细胞，进行表型观察分析，通常情况下，由于慢病毒为复制缺陷型病毒，受感染的细胞不能产生新的病毒，因此从加入病毒颗粒开始，经过5-6次换液后，培养基内已不存在病毒颗粒，可以移至普通细胞培养室内培养研究。

K562-重组载体工程细胞在100-200Gy的γ射线下照射，进行灭菌处理。

实施例5NK细胞制备及培养

一、细胞分离、培养流程

1)转移外周血(PBMC)/脐血(CBMC)：先用碘伏充分擦拭抗凝管盖缝隙处，待晾干后打开抗凝管盖，小心把抗凝管中的外周血用移液管抽出，加入50mL离心管中，每管不超过35mL；

2)离心：将离心管配平，2900rpm/min离心10分钟；

3)转移血浆：离心所得的上层血浆转移至50mL离心管中，收集血浆；

40℃水浴30min，然后1500r/min离心10min去除沉淀，将上层血浆转移至新的50mL离心管置于4℃冰箱保存备用(如果在冰箱放置后又有沉淀析出，则再次离心)；

4)稀释：用生理盐水按体积比约为2:1稀释脐带血，混匀；

5)铺层加样：将稀释血液小心加到分离液上，每支50mL离心管加分离液15mL，稀释血液和分离液体积比为2:1，1500rpm/min，离心20min；

6)分层：离心完毕后，离心管内出现明显的分层，由下到上分别为：血浆层(含部分血小板)、白膜层(含单核细胞和及少量的血小板)、分离液层、粒细胞及红细胞层，吸出单个核细胞层的细胞悬液；

7)洗涤：吸出的单个核细胞液中混有部分细胞分离液，用生理盐水加以洗涤，加生理盐水将细胞液稀释，生理盐水：细胞液＝2:1，混匀，1700rpm/min，离心10min，离心后弃上清；

8)再次洗涤：每个离心管中加入5mL左右生理盐水，吹打混匀细胞，把多个离心管的细胞悬液转移到一个离心管内，并加入生理盐水至40mL(留取0.5mL进行培养前计数)，1000rpm/min离心10min，离心后弃上清；

9)将收集到的细胞用培养液悬浮，根据计数调整细胞浓度1-2×10⁶/mL装至75cm²培养瓶中，加入GT-T561培养液(含200U/mL IL-2)20mL+自体血清(1000μL，5％)+滋养细胞(1mL/支，需离心去除冻存液后添加)+硫酸庆大霉素(80U/mL)，平放在CO₂恒温培养箱中培养；

二、原代细胞培养观察与收获

1)第3天，将培养瓶中培养液按300g离心8min，弃去上清，用30mL新鲜的GT-561(含200U/mL IL-2)悬浮沉淀，加入5％自体血浆+硫酸庆大霉素(80U/mL)，至于培养箱中培养；

2)第4天，观察细胞，若细胞状态良好，培养液无明显发黄，可不做处理，如果培养液发黄，可酌情加10mL GT-561(含200U/mL IL-2)+1％血浆+硫酸庆大霉素(80U/mL)，至于培养箱中培养；

3)第5天，观察细胞，细胞状态良好，密度大，培养液发黄，可酌情加GT-561(含200U/mL IL-2)+1％血浆+硫酸庆大霉素(80U/mL)。根据发黄程度，很黄30mL，比较黄20mL，微黄补10mL；

4)第6天，观察细胞，细胞状态良好，密度大，培养液发黄，可酌情加GT-561(含200U/mL IL-2)+1％血浆+硫酸庆大霉素(80U/mL)，转至175cm2培养瓶中培养；

三、原代细胞传代

5)细胞转移：第7-8天计数，转入640cm²培养袋中，加入K562-重组载体工程细胞(包括实施例1和对比例1-4的重组载体)，离心去掉冻存液，补加GT-561培养液(含200U/mLIL-2)+1％血浆+硫酸庆大霉素(80U/mL)，补加培养液量与原培养液体积比为1:1；

6)补加培养液：细胞转移后，第8-11天观察细胞悬液颜色变化，显微镜下观察细胞生长情况，若细胞悬液明显变黄且细胞克隆较多，补加GT-T561培养液(含200U/Ml IL-2)+1％血浆+硫酸庆大霉素(80U/mL)，补加培养液量与原培养液体积比为1:1；

7)补加培养液：第12-14天每天观察，观察细胞悬液颜色变化，显微镜下观察细胞生长情况，若细胞悬液明显变黄且细胞克隆较多，补加GT-T561培养液(含200U/Ml IL-2)+1％血浆+硫酸庆大霉素(80U/mL)，补加培养液量与原培养液体积比为1:2；

8)细胞补满15天左右即可收集细胞，收集前1-2天从细胞培养袋内取8mL培养液进行细胞计数及血培养，并送质检部门进行细菌内毒素、支原体、革兰氏染色、细胞表面抗体检测，CBMC/PBMC细胞体外扩增线性图如图4所示，CBMC/PBMC细胞体外扩增前后流式数据图如图5(A)-图5(D)所示；

由图4可知，脐血来源的单个核细胞(CBMC)和外周血来源的单个核细胞(PBMC)在K562工程细胞(包含实施例1的重组载体)刺激下，细胞大量扩增，在6-15天进入对数生长期，扩增倍数在150倍以上。

由图5(A)-图5(D)可知，脐血来源的单个核细胞(CBMC)和外周血来源的单个核细胞(PBMC)在K562工程细胞(包含实施例1的重组载体)刺激下NK细胞表面标志CD56+CD3-由最初的5.1％上调至90.65％(脐血)，由17.87％上调至96.9％(外周血)。

而对比例1-4中的重组载体缺少mb IL 15和mb IL 21中的任意一种，或共刺激信号传导结构域不是本发明提供的组合，其构建的工程细胞对NK细胞的扩增效率及生长状态均较差，无法满足实验及生产要求，说明重组载体中的插入基因缺一不可，协同增效，相互搭配共同实现NK细胞的高效扩增。

综上所述，本发明提供的重组载体通过设计膜固定白介素15和膜固定白介素21，与包括41BBL、CD64、CD86和CD19的共刺激信号传导结构域协同激活并长期保持NK细胞的增殖和功能发挥，提高扩增效率，在体外诱导NK细胞的分化成熟；膜固定白介素15和膜固定白介素21相互搭配，协助增强对NK细胞的激活功能，并辅以共刺激信号结构域，全面稳定保持对NK细胞的激活及分化成熟功能；本发明提供的制备方法简洁高效，便于操作，特异性针对本发明提供的重组载体，精准稳定地制备产出重组载体，应用于NK细胞的扩增技术，实现NK细胞的高效扩增及持续分化成熟。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 河南省华隆生物技术有限公司

<120> 一种重组载体及其制备方法和应用

<130> 2017

<141> 2017-12-28

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1175

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

gcccttccac catgggactg agtaacattc tctttgtgat ggccttcctg ctctctggtg 60

ctgctcctct gaagattcaa gctaactggg tgaatgtaat aagtgatttg aaaaaaattg 120

aagatcttat tcaatctatg catattgatg ctactttata tacggaaagt gatgttcacc 180

ccagttgcaa agtaacagca atgaagtgct ttctcttgga gttacaagtt atttcacttg 240

agtccggaga tgcaagtatt catgatacag tagaaaatct gatcatccta gcaaacaaca 300

gtttgtcttc taatgggaat gtaacagaat ctggatgcaa agaatgtgag gaactggagg 360

aaaaaaatat taaagaattt ttgcagagtt ttgtacatat tgtccaaatg ttcatcaaca 420

cttctgagtc caaatatggt cccccatgcc caccatgccc agcacctgag ttcctggggg 480

gaccatcagt cttcctgttc cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc 540

ctgaggtcac gtgcgtggtg gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact 600

ggtacgtgga tggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca 660

acagcacgta ccgtgtggtc agggtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggta 720

aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct 780

ccaaagccaa agggcagccc cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg 840

agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca 900

tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggaggacaa ctacaagacc acgcctcccg 960

tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt 1020

ggcaggaggg gaatgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca 1080

cacagaagag cctctccctg tctccgggta aatggattac agctgtactt ccaacagtta 1140

ttatatgtgt gatggttttc tgtctaattc tatgg 1175

<210> 2

<211> 1322

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

gcccttccac catgggactg agtaacattc tctttgtgat ggccttcctg ctctctggtg 60

ctgctcctct gaagattcaa gctatgagat ccagtcctgg caacatggag aggattgtca 120

tctgtctgat ggtcatcttc ttggggacac tggtccacaa atcaagctcc caaggtcaag 180

atcgccacat gattagaatg cgtcaactta tagatattgt tgatcagctg aaaaattatg 240

tgaatgactt ggtccctgaa tttctgccag ctccagaaga tgtagagaca aactgtgagt 300

ggtcagcttt ttcctgtttt cagaaggccc aactaaagtc agcaaataca ggaaacaatg 360

aaaggataat caatgtatca attaaaaagc tgaagaggaa accaccttcc acaaatgcag 420

ggagaagaca gaaacacaga ctaacatgcc cttcatgtga ttcttatgag aaaaaaccac 480

ccaaagaatt cctagaaaga ttcaaatcac ttctccaaaa gatgattcat cagcatctgt 540

cctctagaac acacggaagt gaagattcct gagagtccaa atatggtccc ccatgcccac 600

catgcccagc acctgagttc ctggggggac catcagtctt cctgttcccc ccaaaaccca 660

aggacactct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg gacgtgagcc 720

aggaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggatgg cgtggaggtg cataatgcca 780

agacaaagcc gcgggaggag cagttcaaca gcacgtaccg tgtggtcagg gtcctcaccg 840

tcctgcacca ggactggctg aacggtaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaaggcc 900

tcccgtcctc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga gagccacagg 960

tgtacaccct gcccccatcc caggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc 1020

tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg 1080

aggacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca 1140

gcaggctaac cgtggacaag agcaggtggc aggaggggaa tgtcttctca tgctccgtga 1200

tgcatgaggc tctgcacaac cactacacac agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat 1260

ggattacagc tgtacttcca acagttatta tatgtgtgat ggttttctgt ctaattctat 1320

gg 1322

<210> 3

<211> 776

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

gcccttccac catggaatac gcctctgacg cttcactgga ccccgaagcc ccgtggcctc 60

ccgcgccccg cgctcgcgcc tgccgcgtac tgccttgggc cctggtcgcg gggctgctgc 120

tgctgctgct gctcgctgcc gcctgcgccg tcttcctcgc ctgcccctgg gccgtgtccg 180

gggctcgcgc ctcgcccggc tccgcggcca gcccgagact ccgcgagggt cccgagcttt 240

cgcccgacga tcccgccggc ctcttggacc tgcggcaggg catgtttgcg cagctggtgg 300

cccaaaatgt tctgctgatc gatgggcccc tgagctggta cagtgaccca ggcctggcag 360

gcgtgtccct gacggggggc ctgagctaca aagaggacac gaaggagctg gtggtggcca 420

aggctggagt ctactatgtc ttctttcaac tagagctgcg gcgcgtggtg gccggcgagg 480

gctcaggctc cgtttcactt gcgctgcacc tgcagccact gcgctctgct gctggggccg 540

ccgccctggc tttgaccgtg gacctgccac ccgcctcctc cgaggctcgg aactcggcct 600

tcggtttcca gggccgcttg ctgcacctga gtgccggcca gcgcctgggc gtccatcttc 660

acactgaggc cagggcacgc catgcctggc agcttaccca gggcgccaca gtcttgggac 720

tcttccgggt gacccccgaa atcccagccg gactcccttc accgaggtcg gaataa 776

<210> 4

<211> 1136

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 4

gcccttccac catgtggttc ttgacaactc tgctcctttg ggttccagtt gatgggcaag 60

tggacaccac aaaggcagtg atcactttgc agcctccatg ggtcagcgtg ttccaagagg 120

aaaccgtaac cttgcattgt gaggtgctcc atctgcctgg gagcagctct acacagtggt 180

ttctcaatgg cacagccact cagacctcga cccccagcta cagaatcacc tctgccagtg 240

tcaatgacag tggtgaatac aggtgccaga gaggtctctc agggcgaagt gaccccatac 300

agctggaaat ccacagaggc tggctactac tgcaggtctc cagcagagtc ttcacggaag 360

gagaacctct ggccttgagg tgtcatgcgt ggaaggataa gctggtgtac aatgtgcttt 420

actatcgaaa tggcaaagcc tttaagtttt tccactggaa ttctaacctc accattctga 480

aaaccaacat aagtcacaat ggcacctacc attgctcagg catgggaaag catcgctaca 540

catcagcagg aatatctgtc actgtgaaag agctatttcc agctccagtg ctgaatgcat 600

ctgtgacatc cccactcctg gaggggaatc tggtcaccct gagctgtgaa acaaagttgc 660

tcttgcagag gcctggtttg cagctttact tctccttcta catgggcagc aagaccctgc 720

gaggcaggaa cacatcctct gaataccaaa tactaactgc tagaagagaa gactctgggt 780

tatactggtg cgaggctgcc acagaggatg gaaatgtcct taagcgcagc cctgagttgg 840

agcttcaagt gcttggcctc cagttaccaa ctcctgtctg gtttcatgtc cttttctatc 900

tggcagtggg aataatgttt ttagtgaaca ctgttctctg ggtgacaata cgtaaagaac 960

tgaaaagaaa gaaaaagtgg gatttagaaa tctctttgga ttctggtcat gagaagaagg 1020

taatttccag ccttcaagaa gacagacatt tagaagaaga gctgaaatgt caggaacaaa 1080

aagaagaaca gctgcaggaa ggggtgcacc ggaaggagcc ccagggggcc acgtag 1136

<210> 5

<211> 983

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 5

gcccttccac catgggactg agtaacattc tctttgtgat ggccttcctg ctctctggtg 60

ctgctcctct gaagattcaa gcttatttca atgagactgc agacctgcca tgccaatttg 120

caaactctca aaaccaaagc ctgagtgagc tagtagtatt ttggcaggac caggaaaact 180

tggttctgaa tgaggtatac ttaggcaaag agaaatttga cagtgttcat tccaagtata 240

tgggccgcac aagttttgat tcggacagtt ggaccctgag acttcacaat cttcagatca 300

aggacaaggg cttgtatcaa tgtatcatcc atcacaaaaa gcccacagga atgattcgca 360

tccaccagat gaattctgaa ctgtcagtgc ttgctaactt cagtcaacct gaaatagtac 420

caatttctaa tataacagaa aatgtgtaca taaatttgac ctgctcatct atacacggtt 480

acccagaacc taagaagatg agtgttttgc taagaaccaa gaattcaact atcgagtatg 540

atggtattat gcagaaatct caagataatg tcacagaact gtacgacgtt tccatcagct 600

tgtctgtttc attccctgat gttacgagca atatgaccat cttctgtatt ctggaaactg 660

acaagacgcg gcttttatct tcacctttct ctatagagct tgaggaccct cagcctcccc 720

cagaccacat tccttggatt acagctgtac ttccaacagt tattatatgt gtgatggttt 780

tctgtctaat tctatggaaa tggaagaaga agaagcggcc tcgcaactct tataaatgtg 840

gaaccaacac aatggagagg gaagagagtg aacagaccaa gaaaagagaa aaaatccata 900

tacctgaaag atctgatgaa gcccagcgtg tttttaaaag ttcgaagaca tcttcatgcg 960

acaaaagtga tacatgtttt taa 983

<210> 6

<211> 950

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 6

gcccttccac catgccacct cctcgcctcc tcttcttcct cctcttcctc acccccatgg 60

aagtcaggcc cgaggaacct ctagtggtga aggtggaaga gggagataac gctgtgctgc 120

agtgcctcaa ggggacctca gatggcccca ctcagcagct gacctggtct cgggagtccc 180

cgcttaaacc cttcttaaaa ctcagcctgg ggctgccagg cctgggaatc cacatgaggc 240

ccctggccat ctggcttttc atcttcaacg tctctcaaca gatggggggc ttctacctgt 300

gccagccggg gcccccctct gagaaggcct ggcagcctgg ctggacagtc aatgtggagg 360

gcagcgggga gctgttccgg tggaatgttt cggacctagg tggcctgggc tgtggcctga 420

agaacaggtc ctcagagggc cccagctccc cttccgggaa gctcatgagc cccaagctgt 480

atgtgtgggc caaagaccgc cctgagatct gggagggaga gcctccgtgt ctcccaccga 540

gggacagcct gaaccagagc ctcagccagg acctcaccat ggcccctggc tccacactct 600

ggctgtcctg tggggtaccc cctgactctg tgtccagggg ccccctctcc tggacccatg 660

tgcaccccaa ggggcctaag tcattgctga gcctagagct gaaggacgat cgcccggcca 720

gagatatgtg ggtaatggag acgggtctgt tgttgccccg ggccacagct caagacgctg 780

gaaagtatta ttgtcaccgt ggcaacctga ccatgtcatt ccacctggag atcactgctc 840

ggccagtact atggcactgg ctgctgagga ctggtggctg gaaggtctca gctgtgactt 900

tggcttatct gatcttctgc ctgtgttccc ttgtgggcat tcttcatctt 950

<210> 7

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 7

ggaagcggag ctaccaactt ctccctgctg aagcaggccg gcgacgtgga ggagaacccc 60

ggcccc 66

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 8

cggatccggc ccttccacca t 21

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 9

ttgcggccgc aaaagatgaa gaat 24

Claims (10)

1.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含膜固定白介素15的基因和膜固定白介素21的基因。

2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述膜固定白介素15的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述膜固定白介素21的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求1或2所述的重组载体，其特征在于，所述膜固定白介素15由CD86信号肽、白介素15和CD86跨膜区组成。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组载体，其特征在于，所述膜固定白介素21由CD86信号肽、白介素21和CD86跨膜区组成。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体还包括共刺激信号传导结构域；

优选地，所述共刺激信号传导结构域包括41BBL、CD64、CD86或CD19中的任意一种或至少两种的组合，优选为41BBL、CD64、CD86和CD19的组合；

优选地，所述41BBL基因的核酸序列如SEQ ID NO:3所示；

优选地，所述CD64基因的核酸序列如SEQ ID NO:4所示；

优选地，所述CD86基因的核酸序列如SEQ ID NO:5所示；

优选地，所述CD19基因的核酸序列如SEQ ID NO:6所示。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体沿着真核表达载体的转录方向依次可操作地连接有膜固定白介素15基因、膜固定白介素21基因、41BBL基因、CD64基因、CD86基因和CD19基因。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的重组载体，其特征在于，所述真核表达载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-PURO；

优选地，所述重组载体的结构中还包括T2A序列；

其中，所述T2A基因的核酸序列如SEQID NO:7所示；

优选地，所述重组载体中连接的基因中均包含Kozak序列。

8.一种制备如权利要求1-7中任一项所述重组载体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)合成目的基因mbIL15-mbIL21-41BBL-CD64-CD86-CD19并连接到pUC57载体上；

(2)将步骤(1)得到的载体通过PCR扩增，酶切连接至pCDH载体上。

9.一种如权利要求1-7中任一项所述的重组载体用于诱导扩增NK细胞。

10.一种采用如权利要求1-7中任一项所述的重组载体扩增NK细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1’)质粒大提：将包含pCDH-mbIL15-mbIL21-41BBL-CD64-CD86-CD19目的基因的表达载体和包装载体工程菌进行过夜培养，将过夜培养的菌液利用SDS碱裂解法结合硅胶模滤膜进行大提；

(2’)病毒包装：将重组载体和包装质粒共转染细胞进行包装，收集和浓缩病毒液，并进行滴度检测和MOI值的测定；

(3’)构建工程细胞株：培养K562细胞，接种病毒，更换培养基，嘌呤霉素筛选，收获细胞鉴定基因表达，进行表型观察分析并灭菌处理；

(4’)将工程细胞按(0.1-1):1和脐血单核细胞或外周血单核细胞混合，联合180-220U/mL的IL2，共同刺激培养NK细胞。