CN101848936B - 生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通过改变期望的开放阅读框的密码子来降低产生蛋白质表达细胞系所需的可滴定的可选择压力的水平、扩增循环的数量和花费的时间的方法。通过为此目的使用密码子适应，本发明的方法在细胞系开发活动中在节省了许多周的更快的时间期内一致地提供了充足的产量。此外，本发明的方法还利用比早先可实现的更低的选择和扩增试剂浓度产生细胞系。因而，观察到最终的细胞系中选择和扩增标记物的更低水平。

Description

生产方法
本发明提供了生产能够分泌治疗蛋白质的细胞系的方法。所述方法包括利用密码子适应的基因序列，其当通过选择和扩增系统产生例如抗体生产细胞系时导致所需流程时间线(timeline)降低和所需的抗叶酸物的浓度的降低。
哺乳动物细胞例如CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、NS0和PerC6细胞常规地在生物药产业中采用来制造生物药物。这些细胞以一定方式被遗传工程化、然后选择，来确保产生的细胞系在生物反应器中培养时观察到期望的蛋白质的高滴度表达。
当前存在许多方法来工程化及然后选择最好的细胞用于这种目的。通常，这些方法包括“扩增”来提高整合的表达载体(单种或复数种)的拷贝数，来改善期望的蛋白质的观察到的产量。这些“扩增”方法早先由Bebbington和Hentschel(DNA Cloning Volume III(IRLpress，1987))很好地描述了。作者解释道，许多可选择标记物(其通常是编码酶的核酸序列的形式，所述酶涉及新陈代谢并且对于宿主细胞在某些培养基条件下的存活是必不可少的)可以可操作地连接到被设计以表达期望的蛋白质的表达载体，从而在对可选择标记物选择之时，人们也选择了期望的蛋白质的表达。然而，由于在这样的选择之后，产生的期望的蛋白质的滴度一般不是足够高的，被选择的细胞还经历“扩增”方案。这些方案通常包括使所述细胞遭遇某些抑制可选择标记物的毒性药物。通过这样的抑制，将选择出具有这种标志物的提高的表达水平的细胞的群体。通常，这也导致了可操作连接的表达盒的提高的表达水平。这样提高的表达或“扩增”通常由于基因组重排、产生可选择标记物与可操作连接的表达盒的提高的拷贝数而发生。通常，通过这样的“共同扩增”，滴度被充分地改善，以采用产生的最好的克隆来产生期望的蛋白质(单种或复数种)的适当地高的水平。当在经历了扩增方案的单独的细胞中的载体拷贝数被进一步研究时，注意到的是，一直到接近蛋白质生产的“平台期”，观察到的生产水平一般与基因拷贝数提高成比例(Bebbington和Hentshcel，如上)。
迄今为止已经鉴定了许多适合于扩增的不同的可选择标记物，称为可扩增的选择标记物。各自鉴定的还有在选择和扩增方案期间添加到细胞培养基中的相关的“选择和扩增”试剂。这样的可选择标记物/试剂组合的实例包括：腺苷脱氨酶/脱氧柯福霉素、天冬氨酸氨甲酰基转移酶/N(磷乙酰基)-L-天冬氨酸盐、二氢叶酸还原酶/甲氨蝶呤、谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸砜酰亚胺(methionine sulphoximine)、金属巯蛋白-I/重金属、多药物抗性/阿霉素(参见Bebbington andHentschel如上，Kellems 1991；Current Opinion in Biotechnology 2：pp723-729)。另外，更新近报道的是，抗生素选择标记物例如赋予对新霉素/G418和zeocin的抗性的那些有时也被采用来提高拷贝数，并且因此当与合适的相关的选择和扩增(基于抗生素的)可选择试剂组合时，有时已经用作选择和扩增标记物(例如，Sauttle and Enenkel：Biotech Bioeng 2004 89 pp530-538，和Kwaks等：Nature Biotech2003；21；pp553-558)。
虽然存在许多方法来选择用于这种目的的最佳遗传工程化的细胞，两种最常用的选择压力是基于谷氨酰胺合成酶(GS)和二氢叶酸还原酶(DHFR)的选择方法。
GS方法涉及将谷氨酰胺合成酶表达盒可操作地连接到治疗蛋白质的表达盒(单个或复数个)。随后可操作连接的载体递送到细胞，通过从培养细胞的培养基中耗尽或抽出谷氨酰胺来选择载体染色体整合。谷氨酰胺合成酶抑制物例如甲硫氨酸砜酰亚胺(methioninesulfoximine，MSX)的添加物常常被加入到培养基中，以确保谷氨酰胺合成酶活性高于和超出所选择的内源宿主细胞水平的活性。可选择的DHFR选择方法涉及将DHFR选择压力可操作连接到治疗蛋白质表达盒(单个或复数个)。可操作连接的载体被递送给细胞，通过抽出或耗尽核苷(例如，次黄嘌呤和胸苷)来选择载体染色体整合。一般地，对于DHFR方法，通常是采用DHFR阴性宿主菌株，例如CHODG44或CHO DUX-B11。还通常采用选择和扩增试剂例如甲氨蝶呤(MTX)。
在各自的GS和DHFR选择系统中提高数量的MSX或MTX选择和扩增试剂的添加或逐步滴加是常常采用的，以通过提高基因拷贝数来增加表达。这样的方法可以包括直接向细胞培养物添加选择和扩增试剂。做为选择，试剂可以在培养基在这样的细胞培养物中使用之前添加到生长培养基。这些试剂直接向细胞培养物、或向用于细胞培养物之前的培养基的这种添加或滴加一般称为“扩增”。例如在GS系统中，MSX水平可以添加或提高达到或超过500μM，而对于DHFR系统，MTX抗叶酸物水平可以添加或提高达到和超过1μM浓度水平。通过这样使用这些试剂，和随后的容许选择在选择试剂的新浓度下生长的细胞的培养期(每个浓度阶段称为一“轮”扩增)，已经显示的是，带有选择压力的基因组的区域也可以扩增，从而提高可选择标记物的拷贝数。因此，当可选择标记物与治疗蛋白质表达盒可操作地连接时，这些盒也可以扩增。当使用GS和DHFR选择系统时通过利用合适的选择和扩增试剂，期望的蛋白质的产量可以被显著地改善，直到接近“生产平台期”(参见Bebbington andHentschel(如上))。结果，通过这样的选择和扩增生长的克隆然后对滴度/产量进行筛选，选出最好的克隆并进一步评估。根据这样的滴定和筛选，典型的是鉴定然后交付克隆用于期望的蛋白质(单种或复数种)的随后的生产。
一般地，扩增的“轮”数和采用的选择和扩增试剂的浓度在选择和扩增方案中不是设定或固定的。相反，对于选择和扩增方案典型的是变得逐渐严格直到某一点，在此接近生产阈值或平台期。特别是，当表达抗体时，我们和其他人已经观察到，接近这种平台期的克隆在当前扩大的未给料分批培养模型和生产生物反应器中产生最终的滴度在0.3g到1.5g每升的范围内。这一般转换为在这样的未给料分批培养条件期间10-100pg/细胞/每天的细胞生产力(Qp)。然而，公知的是，虽然Qp(pg/细胞/每天)是重要的，这不是生产力的专用决定因子，因为具有最高Qp的克隆不总是产生最高的体积滴度。新近的综述参见Wurm 2004；Nature Biotechnology Vol 22；pp1393-1398。
已经成功地采用选择和扩增方法来产生细胞系，用于制造方法以制备在临床试验中使用的期望的蛋白质。然而，虽然通过选择和扩增方法产生的滴度是足够的，由于许多理由，包括时间、成本和安全性，这样的方法仍然是不希望的。例如，在细胞系“扩增”方案中扩增和选择试剂的滴度延缓了克隆选择和菌落生长，每一轮扩增需要一个月或更久来完成。第二，选择和扩增试剂如甲氨蝶呤和甲硫氨酸砜酰亚胺是有毒化学品，如果要用于治疗必需被除去。第三，选择和扩增试剂抗性可能在哺乳动物细胞中存在，其可以产生较低严格性的选择压力和引起克隆和产物产量的不稳定性。第四，扩增可能偶尔游离基因地发生。这样的游离体和任何可操作连接的功能表达盒在细胞分裂期间不总是等同地遗传的，产生培养物中提高的变异性和不稳定性。第五，在扩增方案期间产生的基因组重排可能产生对宿主细胞基因组的显著改变，导致产生的克隆中可变的表型。第六，选择和扩增试剂副产物，例如多谷氨酸化的甲氨蝶呤可能抑制细胞的其他功能(例如，Allegra et al 1985 JBiological Chem 260；17pp9720-9726)。第七，这些选择和扩增试剂中的许多种，如果以高水平暴露，对于培养细胞和运行生物反应器中涉及的操纵子也是潜在有毒的。第八，还观察到的是，在哺乳动物宿主细胞中提高整合的表达载体的拷贝数可能引起宿主细胞的重复诱导的基因沉默(repeat-induced-gene-silencing，RIGS)的提高的活性，其最终可能引起每个整合的表达载体的表达水平的降低(例如，参见McBurney MW et al Exp Cell Res 2002274：1-8)。
因此，高度希望的是，在降低的扩增轮数下采用具有降低的选择和扩增试剂水平的选择和扩增方法，而仍然实现治疗蛋白质的相同的最终产量，从而产生最终细胞系花费的时间更少，和/或产生最终的细胞系所需的不期望的毒性试剂的水平在细胞系产生、选择和培养期间被降低或完全消除(M.Celina de la Cruz Edmonds等，MolBiotechnology2006 34：179-190)。
有64种三联碱基对密码子组合，而氨基酸仅20种，已经知道几十年的是，在遗传密码中存在冗余。然而，利用密码子偏爱来提高表达直到1980年代才被认识。例如，在1982年，Bennetzen和Hall(J BiolChem 257 pp3026-3031)观察到在原核生物和真核生物的强烈表达的基因中的物种特异性密码子偏爱。他们还注意到这种偏爱是分类学上趋异的。结果，很快认识到，人们可以修改开放阅读框的密码子利用，从而提高重组表达系统中的表达。例如，Kotula和Curtis(BiotechnolgyNY(1991)9：1386-9))通过开放阅读框的密码子适应使密码子利用偏向高度表达的内源酵母基因偏爱的那些密码子，实现了在酵母中哺乳动物抗体轻链的显著改善的表达。另一个非常显著的实例是绿色荧光蛋白质的密码子适应以改善哺乳动物细胞中的表达(Zolotukhin S JVirol(1996)70：4646-54 and Yang et alNucleic Acids Res 199624：4592-3)。
新近的数据表明，通过提高编码抗体重链和轻链的开放阅读框的密码子适应指数(CAI)分值，当产生的适应的表达盒与谷氨酰胺合成酶可选择标记物可操作地连接时，以及当细胞与MSX选择和扩增试剂孵育时，人们可以略微地改善哺乳动物宿主细胞中的产品产量。该数据(在IBC 2005细胞系开发和工程化会议上提出的)表明，虽然平均表达水平没有显著地改善，群体中的中值阳性克隆确实略微地提高了(从37.8μg/ml到51.3μg/ml)，但是仅在重链和轻链开放阅读框都被密码子适应时才发生。更近一些，M.Celina de la CruzEdmonds等人(如上)也认识到，当利用选择和扩增方案的帮助产生表达期望蛋白质的工程化细胞系时降低选择和扩增试剂水平的希望。他们展现了，通过转染的细胞的接种密度的修改，人们可以降低采用的MSX的水平，以及降低产生和维持表达等量或更高水平期望的蛋白质的遗传工程化细胞系所需的星期数。
新近公开的著作研究了与利用谷氨酰胺合成酶可选择标记物组合的密码子优化的方法。例如，Kawley等(Molecular Biotechnology2006 Vol 34；pp151-156)呈现的工作评估了密码子适应对所产生的随后的表达水平的影响，然而，所报道的结果仅表明实现了表达水平上很小的改善。
再更近期，Carton等人(Protein Expression and Purification 55(2007)pp279-286)也研究了密码子优化的影响。他们的工作包括通过各种方法对重链和轻链抗体开放阅读框的部分密码子优化。这些修饰的编码序列然后在骨髓瘤细胞中作为与gpt可选择标记物可操作地连接的表达盒中的小基因形式(即，含有内含子)来表达。没有讨论扩增方法。
本领域中，在采用与可扩增选择标记物可操作地连接的表达系统时，需要降低所需的选择和扩增试剂的水平。
本发明的内容
本发明提供了通过改变期望的开放阅读框的密码子、降低产生蛋白质表达细胞系所需的可滴定的可选择压力的水平、扩增循环的数量和花费的时间的方法。通过为此目的使用密码子适应，本发明的方法在细胞系开发活动中在节省了许多周的更快的时间期内一致地提供了充足的产量。此外，本发明的方法还产生具有比早先可实现的更低的选择和扩增试剂浓度的细胞系。因而，观察到最终的细胞系中选择和扩增标记物的更低水平。
本发明提供了生产产生治疗蛋白质的细胞系的方法，包括步骤：
a)获得编码所述治疗蛋白质的第一多核苷酸序列，
b)改变所述第一多核苷酸序列来获得第二多核苷酸序列，其中所述第二多核苷酸序列的密码子适应指数大于所述第一多核苷酸序列的密码子适应指数，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸编码相同的治疗蛋白质，
c)用步骤(b)的所述第二多核苷酸序列和编码选择标记物的第三多核苷酸序列转化至少一种细胞，所述选择标记物能够提供在所述细胞内所述第二多核苷酸序列的扩增，
d)在培养基中生长步骤(c)的所述至少一种细胞来产生包含复数个细胞的第一细胞系，所述培养基含有一定浓度的选择试剂，所述一定浓度的选择试剂抑制所述细胞系中表达不足水平的由步骤(c)的所述第三多核苷酸编码的选择标记物的细胞的生长，从而与达到在用所述第一多核苷酸转化的细胞系中产生的所述蛋白质生产的相等的平台期所必需的相比，用更少轮数的扩增和/或在更低浓度的选择试剂下达到所述第二多核苷酸编码的蛋白质的生产的平台期。
在此处描述的所有相比较的方法中，除非另有说明，所有其他参数，如扩增方案或选择试剂的浓度保持恒定。
在本发明的一个实施方式中，所述第一细胞系在生物反应器中培养，产生的所述治疗蛋白质被纯化。
在本发明的一个实施方式中，所述第二多核苷酸序列的密码子适应指数大于0.9，在进一步的实施方式，所述第二多核苷酸序列的密码子适应指数大于0.91，在又进一步的实施方式中，所述第二多核苷酸序列的密码子适应指数大于0.92，在又进一步的实施方式中，所述第二多核苷酸序列的密码子适应指数大于0.95。
在本发明的另一个实施方式中，当与利用所述第一多核苷酸序列的相同方法所使用的选择试剂的数量相比时，达到算术上相等的治疗蛋白质生产产量所需的选择试剂的水平被降低到低于50％，在进一步的实施方式中，当与利用所述第一多核苷酸序列的相同方法所使用的选择试剂的数量相比时，所述选择试剂的水平被降低到低于25％，在又进一步的实施方式中，当与利用所述第一多核苷酸序列的相同方法所使用的选择试剂的数量相比时，所述选择试剂的水平被降低到低于5％，在又进一步的实施方式中，当与利用所述第一多核苷酸序列的相同方法所使用的选择试剂的数量相比时，所述选择试剂的水平被降低到低于3％。
在本发明的一个实施方式中，提供了生产产生治疗蛋白质的细胞系的方法，包括步骤：
a)获得第一多核苷酸序列，其编码治疗蛋白质并具有低于0.9的密码子适应指数分值。
b)获得第二多核苷酸序列，其编码治疗蛋白质，其中所述多核苷酸序列的密码子适应指数大于0.9。
c)用编码所述治疗蛋白质的所述第二多核苷酸序列和编码选择标记物的第三多核苷酸序列转化细胞系，所述选择标记物能够提供所述第二多核苷酸的扩增，
d)在培养基中生长步骤(c)的所述至少一种细胞来产生包含复数个细胞的第一细胞系，所述培养基含有一定浓度的选择试剂，所述一定浓度的选择试剂抑制所述细胞系中表达不足水平的由步骤(c)的所述第三多核苷酸编码的选择标记物的细胞的生长，从而与达到在用所述第一多核苷酸转化的细胞系中产生的所述蛋白质生产的相等的平台期所必需的相比，用更少轮数的扩增和/或在更低浓度的选择试剂下达到所述第二多核苷酸编码的蛋白质的生产的平台期。
在本发明的一个实施方式中，要被转化的细胞系由于内源的细胞酶的破坏或抑制是代谢缺陷性的。
在本发明的进一步的实施方式中，要被转化的细胞系是在核苷合成途径方面缺陷性的。
在本发明的一个实施方式中，所述治疗蛋白质是抗体、其衍生物或抗原结合片段。
在本发明的一个实施方式中，所述治疗蛋白质是单克隆抗体。
在本发明的一个实施方式中，所述选择标记物是编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的多核苷酸，所述选择试剂是抗叶酸物。在进一步的实施方式中，所述抗叶酸物是甲氨蝶呤。
在本发明的另一个实施方式中，所述选择标记物是编码谷氨酰胺合成酶的多核苷酸，所述选择试剂是甲硫氨酸砜酰亚胺。
在本发明的一个实施方式中，达到蛋白质生产的平台期仅需要一轮扩增。
在本发明的一个实施方式中，所述治疗蛋白质的最终产量在未给料的批次中大于0.3g/L，在进一步的实施方式中，所述最终产量在未给料的批次中大于0.5g/L，在又进一步的实施方式中，所述最终产量在未给料的批次中大于0.8g/L。
在本发明的另一个实施方式中，使用的MTX的浓度低于50nM或低于25nM或低于10nM。在本发明的进一步的实施方式中，使用的MTX的浓度是5nM。
在本发明的另一个实施方式中，仅一个扩增步骤、以及从而仅一个浓度的选择和扩增试剂，是在细胞培养基中达到在所述培养基中选择的细胞中蛋白质生产的平台期所需的。
在本发明的一个实施方式中，提供了通过本发明的方法生产的抗体。在进一步的实施方式中，提供了通过这种方法生产的抗体，其中生产的抗体包含至少一个重链，并且其具有小于或等于5％的非糖基化的重链。在进一步的实施方式中，所述抗体的重链是95％糖基化的，或是96％糖基化的，或是97％糖基化的，或是98％糖基化的，或是99％糖基化的。在又进一步的实施方式中，所述抗体是100％糖基化的。在本发明的一个实施方式中，高度糖基化的抗体是单克隆抗体。在进一步的实施方式中，所述高度糖基化的抗体是抗β-淀粉样蛋白的抗体。在又进一步的实施方式中，所述抗体具有SEQ ID NO：18的重链序列和SEQ IDNO：19的轻链序列。
在本发明的另一个实施方式中，提供了根据此处描述的发明的抗原结合片段，其中所述片段是Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、双特异性的、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody)、微型抗体(miniantibody)、微抗体(minibody)、分离的可变重链区域或分离的可变轻链区域、血清衍生的蛋白(例如，生长因子、细胞因子、白蛋白，等等)或其组合的融合物。
在本发明的另一个实施方式中，提供了包含载体的稳定地转化的宿主细胞，所述载体包含编码在此描述的抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的一个或更多个表达盒。例如，这样的宿主细胞可以包含编码所述轻链的第一载体和编码所述重链的第二载体。做为选择，这样的表达盒可以在递送之前组合。
在本发明的另一个实施方式中，提供了根据在此描述的发明的宿主细胞，其中所述细胞是真核的，例如，其中所述细胞是哺乳动物的。这样的细胞系的实例包括中国仓鼠卵巢、BHK、HEK-293、NS0或PerC6。(新近的综述参见Wurm 2004：Nature Biotechnology 22；11pp1393-1398)。这样的宿主细胞还可以含有有益的遗传型和/或表型改变，例如，CHO-DG44宿主株具有它的dhfr基因失效的拷贝，而其他宿主可能谷氨酰胺合成酶基因失效。可选择的修饰可以是针对涉及蛋白质糖基化的酶机制的(例如，Yamane-Ohnuki et al，Biotech Bioeng2004 87：pp 614-622，Kanda et al，Journal of Biotechnology，2007130：pp 300-310，Imai-Nishiya et al BMC Biotechnol，2007 7：84)。而其他的可能具有对宿主细胞凋亡、表达和存活途径有益的遗传型和/或表型修饰(例如Tey et alBiotechnol Bioeng 2000 68：31-43，Yallop et alModern Biopharmaceuticals 2005Chapter 3 pp779-807，Nivitchanyang etal Biotechnol Bioeng 2007 98：825-41，Figueroa et al Biotechnol Bioeng200797：87-92)。宿主的这些和其他修饰单独地或组合地，可以通过标准技术产生，例如非宿主或宿主基因的过量表达、基因敲除方法、基因沉默方法(例如，siRNA)或具有期望的表型的亚株系的进化和选择。这样的技术是本领域公知的。
在本发明的另一个实施方式中，提供了用于根据在此描述的发明的治疗蛋白质的生产的方法，所述方法包括在培养基，例如无血清培养基中培养宿主细胞的步骤。
在本发明的另一个实施方式中，提供了根据在此描述的发明的方法，其中所述治疗蛋白质相对于含无血清培养基的所述抗体被进一步纯化到至少95％或更高(例如，98％或更高)。
在本发明的一个实施方式中，提供了含有开放阅读框的哺乳动物表达载体，所述开放阅读框具有高于0.9的CAI分值，并且其编码抗体、抗体相关多肽或其衍生物或融合物。
在另一个实施方式中，提供了用第二多核苷酸序列转化的第一细胞系，所述第二多核苷酸序列具有大于第一多核苷酸序列的密码子适应指数，其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸编码相同的蛋白质，所述第一细胞系进一步包含编码选择标记物的第三多核苷酸序列，所述选择标记物能够提供所述第一多核苷酸序列的扩增，其中当在可选择培养基中生长时，与用编码所述治疗蛋白质的所述第一多核苷酸转化的第二所述细胞系相比，所述第一细胞系产生更高产量的所述治疗蛋白质。
在进一步的实施方式中，提供了用第二多核苷酸序列转化的第二细胞系，所述第二多核苷酸序列编码治疗蛋白质并具有大于0.9的密码子适应指数，所述第二细胞系进一步包含编码选择标记物的第三多核苷酸序列，所述选择标记物能够提供第二多核苷酸序列的扩增，其中当在可选择培养基中生长时，与用编码所述治疗蛋白质的第一多核苷酸转化的第一所述细胞系相比，所述第二细胞系生产更高产量的所述治疗蛋白质，其中所述第一多核苷酸具有低于0.9的密码子适应指数。
在本发明的一个实施方式中，高于0.9的CAI分值是使用如表6中描述的EMBOSSCAI计分量度计算的。
在本发明的另一个实施方式中，提供了包含根据在此描述的早先的实施方式的载体或表达盒的细胞系。
在又进一步的实施方式中，提供了可通过本发明的方法获得的细胞系或它的子代。
在本发明的另一个实施方式中，提供了具有基因组的哺乳动物细胞，所述基因组含有整合的或游离地维持的开放阅读框，所述开放阅读框具有超过0.9的CAI分值(利用EMBOSS密码子利用表E.human.cut得出的)，其编码抗体、抗体相关多肽或其衍生物。
在当前的说明书和附随的权利要求中，术语“包含”包括“由......组成”。也就是说，“包含”意图表达，在情境允许时没有特别地叙述的其他元素或整体的可能的包括。
在本说明书和附随的权利要求中，术语“生产的平台期”是指在扩大的未给料分批培养中接近的表达的水平，从而另外轮次的扩增一般产生相对于亲本扩增克隆提高至低于2倍。当克隆被特别地工程化来生产抗体时，当使用当前的未给料扩大的培养方式和培养基配方时，在标准的扩大未给料生产培养中产生0.3g到1.5g每升的克隆一般被认为是接近这种生产平台期。
接近生产平台期的最终克隆的单细胞亚克隆可以通过许多标准方法来进行，包括流式分选(例如，在96孔平板的每个反应孔中沉积一个细胞)、软琼脂菌落挑选或限制性稀释克隆。为了确保在接受反应孔中的单细胞生长，有时还采用条件培养基或暂时饲喂培养物来支持另外沉积的单独细胞的生长。如果需要活的饲喂共培养物，则这些可以容易地包含没有整合的可选择载体的亲本宿主细胞，因为一旦沉积的单细胞克隆开始健康地分裂，这样的宿主细胞可以被选出。
在本说明书中使用的术语开放阅读框(ORF)是指核酸编码序列，所述序列编码期望的多肽链(单个或复数个)。这样的ORF编码序列内含有的密码子可以是连续的，或作为选择它们可以含有内含子。当被包括时，这样的内含子或间插序列然后一般通过剪接反应，在形成成熟的mRNA中最终的连续的开放阅读框之前从宿主细胞中移除。
在本说明书中使用的“产量”是指在溶液(例如，培养肉汤或细胞裂解混合物或缓冲液)中产物(例如，异源表达的多肽)的浓度，它通常表示为mg/L或g/L。产量的提高可以指在两种规定的条件组之下产生的产物的浓度方面的绝对或相对提高。
术语可操作地连接的是指所采用的可选择和扩增标记物来选择含有表达期望的蛋白质产物的表达盒的宿主细胞的用途。这可以通过将所述可选择和扩增标记物克隆到含有表达期望的蛋白质的表达盒的同一质粒或载体中来实现，或作为选择可以在独立的质粒或载体上递送给细胞。
附图的简要说明
附图1：在方案2、3、4、5、6(a)、6(b)和7(a)中使用的基于RSV启动子的载体的示意图。对于基于EF-1α启动子的评估(方案6和7)，RSV启动子被替换为人类EF-1α来源的启动子加第一内含子(参见Kim DW Gene 199091：217-23)。这通过从人类基因组DNAPCR来获得。这种EF-1α启动子然后克隆到这些载体中代替基于RSV的启动子。
附图2：方案5的未适应的重链具有0.809的CAI分值，在方案5(a)中采用，SEQ IDNO：10。
附图3：方案5的未适应的轻链具有0.761的CAI分值，在方案5(a)中采用，SEQ IDNO：11。
附图4：具有提高的CAI分值(0.847)的方案5(b)的重链ORF。参见表5。参见SEQ ID12。
附图5：具有提高的CAI分值(0.833)的方案5(b)的轻链ORF。参见表5。参见SEQ ID13。
附图6：具有提高的CAI分值(0.872)的方案5的重链ORF。这个序列在抗体方案5(c)中采用。参见SEQ ID NO：14。
附图7：具有提高的CAI分值(0.894)的方案5的轻链ORF。这个序列在抗体方案5(c)中采用。参见SEQ ID NO：15。
附图8：具有提高的CAI分值(0.982)的方案5的重链ORF。这个序列在抗体方案5(d)中采用。也参见SEQ ID NO：16。
附图9：具有提高的CAI分值(0.976)的方案5的轻链ORF。这个序列在抗体方案5(d)中采用。也参见SEQ ID NO：17。
附图10：用于抗体方案5的重链和轻链RNA和蛋白质水平。
附图11：详细的密码子适应方法。
附图12：在方案5最终的克隆选择期间获得的实例产物NGHC数据。
附图13：利用在最终细胞系扩增和选择之后大约3个月另外的开发工作，从O97-7(方案5(d)，5nM MTX选择克隆CAI HC 0.982，LC 0.976)产生的实例滴度。
附图14：在各种方案中工程化细胞中观察到的DHFR基因拷贝和蛋白质以及Neo基因拷贝的相对水平。
详细说明
编码根据本发明生产的治疗多肽的基因的密码子利用率频率通过密码子适应指数(CAI)测量和定义。
密码子适应是开放阅读框的密码子适应为在人类/哺乳动物基因中偏爱的同义密码子，而避免引入阻碍产生的开放阅读框的表达的不需要的二级序列功能。我们注意到，偏爱的人类密码子也是非常适合的，即使当随后的表达在非人类哺乳动物细胞(例如，仓鼠来源的细胞)中进行时。然而，如果任何给定氨基酸的最偏爱的密码子在给定的哺乳动物物种中不同，则可以采用这个代替人类的偏爱物。对每个开放阅读框产生的“CAI分值”强调了开放阅读框适合于人类/哺乳动物基因最偏爱的同义密码子使用的程度。在本发明上下文中，1的CAI分值意味着在每个密码子位置对每个氨基酸使用最佳的密码子。对于本发明的方法中最佳的结果，编码治疗蛋白质的基因具有足够地接近1的CAI，例如，CAI至少0.9、或至少0.95或至少0.975，从而，相对于当表达天然存在的起始序列时观察到的，所述治疗蛋白质的期望的表达水平以显著地更少的选择和扩增试剂和/或在更快的时间内达到。
然而，不必要的是用最偏爱的密码子替换所有密码子，或用更为偏爱的密码子替换所有较不偏爱的密码子。仅有的要求是，产生的序列具有非天然的高CAI分值，并且不含有表达破坏性元件。商业上可获得的软件例如Leto 1.0(Entelechon，Regensburg，Germany)可以设计适当地高CAI分值的序列。为了进一步帮助指导设计用于本发明的密码子适应的序列，已经分析了来自NCBI基因组build编号36的24044 RefSEQ数据库人类转录产物(NM_prefixed登记号码)。计算CAI分值范围，从0.593到0.894，平均分值0.720。这个数据库中已知的和表达的基因(而不是理论性的)的最高分值(0.894)是角蛋白相关蛋白质5-8(KRTAP5-8；NM_021046)和晚期角化的包膜1A(LCE1A；NM_178348)产生的。另外，21182种人类IgG cDNA的数据库揭示了从0.576到0.878、平均值0.766的IgG分值范围。为了帮助指导本领域技术人员，适用于本发明的序列可以具有高于和超过天然存在的最高的人类基因例如晚期角化的包膜1A(LCE1A；NM_178348)的CAI分值。更优选地应当采用高于0.9的CAI分值。
可以观察到的是，如果密码子适应在更短的序列(例如，仅可变区)上进行，则观察到高产克隆的提高的水平，然而当密码子适应在整个开放阅读框上进行时，则产生的高产克隆的广度(即，数量)被更进一步提高(参见表5)。
由于偏爱的密码子的序列，典型的适应方法通常将默认避免引入高计分ARE(富AU元件，参见Akashi et al Blood 1994；Vol 83 pp3182-3187))RNA不稳定性序列。然而，在密码子适应之后偶尔地，需要除去偶然地引入的表达破坏性序列元件。这些包括但不限于：
(i)功能性剪接位点，
(ii)二联体对称(例如，直接的、反向的或回文序列)的区域，其显著地降低表达水平和/或提高序列之间的重组率。
(iii)功能性不稳定性序列。
在罕有的情况下，当这些不需要的破坏性元件在适应期间产生时，建议的是采用较低偏爱的、而不是最低偏爱的人类密码子(除非选择被限制)来破坏局部的序列来使功能失活。距离最大分值的小的偏差将不会显著地影响产生的开放阅读框在本发明中的使用。还认识到的是，如果开放阅读框的小区域保持未适应(例如，保持有用的限制性位点)，则这将不会显著地影响总体CAI分值。
如果开放阅读框编码融合的、杂合的或嵌合的蛋白质，鼓励的是CAI分值按照上文描述的相同方法来提高。再一次地，向着宿主细胞用于高表达内源基因的表达所偏爱的同义密码子的这种适应，应当为融合的或工程化的开放阅读框的基因或相关cDNA的每一个部件进行。对于在蛋白质中存在的纯粹合成的编码序列(即，不存在先有序列的序列)，建议的是按照精确地相同的方式引入非天然的高人类基因CAI分值。具有高于和超过晚期角化的包膜1A人类基因的CAI分值的开放阅读框应当在本发明中采用。
在此描述的本发明首先描述了通过编码蛋白质的开放阅读框的密码子适应来降低所需的可选择和扩增试剂的水平、所需的时间和所需的扩增周期数的方法，以产生表达期望的蛋白质水平的遗传工程化的细胞系。通过为此目的使用密码子适应，在更快的时间期内观察到足够的产量，从而在细胞系开发活动中节省了许多周的时间。此外，我们还通过使用比我们早先曾实现的更低浓度的选择和扩增试剂产生了等价的或改进的细胞系。实际上可能的是，当在此描述的这样的改进与标准的细胞培养和接种方案改进组合时，例如Celina de la CruzEdmonds et al(如上)所描述的那些，从遗传工程化的细胞系产生等价或改进的产量所需的选择和扩增试剂的水平的进一步降低、以及时间的进一步降低将被观察到。
本发明适合于在治疗蛋白质是糖蛋白时使用。虽然早先的工作公开了下列事实，即人们可以通过修改处理持续时间、温度、pH值、渗透性和培养基组成成分和添加剂等等来控制蛋白质产物糖基化(例如，参见WO2002076578和其中的参考文献)，我们发现的是，编码治疗多肽序列(对于抗体治疗多肽来说)的开放阅读框的密码子适应能够独立于CHO细胞亚型、选择和扩增方式或培养基培养条件地，降低不完全的糖基化的水平、以及降低的位点占据的水平。这种令人惊讶的观察结果首次展现了，人们可以通过开放阅读框密码子适应来影响蛋白质糖基化分布。通过采用在此描述的密码子适应方法，因而可以确保有效的制造过程，其取决于基因的序列而不是宿主细胞所生长的条件。随后，这容许了更多的机会通过传统的培养基和给料开发迭代法来改进培养条件和给料方式，而没有对产物糖基化分布所产生的影响的过度关注。
密码子适应的程度可以使用Sharp和Li(Nucleic Acid Res 198715：1281-95)首先描述的方法来测量。Sharp和Li提出了密码子适应指数(CAI)分值，其基本上来自密码子偏爱性统计，但是对每个氨基酸标准化了，以排除在不同的基因之间的氨基酸组成的变异的影响。这种CAI度量是可容易地获得的(例如，通过EMBOSS，TheEuropean MolecularBiology Open Software Suite(参见Rice et al 2000：Trends in Genetics 16；pp276-277))。
为了对预计在本发明中使用的开放阅读框计分，人们首先必需使用合适的参考数据库。首先，人们应当考虑要使用的细胞宿主，然后人们应当确定所述细胞宿主中表达的基因的相对同义密码子利用(RSCU)的参考表。一般地，当在任何哺乳动物细胞类型中表达产生的开放阅读框时，人类RSCU数据库适用于参考。数据库的一个实例是EMBOSS所提供的，其使用了Ehum.cut密码子利用表作为参考来确定人类细胞中的密码子利用偏爱性。可选择的参考密码子利用表是Massaer等人(如上)描述的，在其中更少数量的高度表达的人类基因被采用来确定密码子偏爱性。虽然这两个参考表对于最偏爱的密码子是广泛一致的，对于一个氨基酸(精氨酸)存在着一个显著的差异。因而，当设计用于本发明的开放阅读框时，合理的是交叉参考相同的密码子利用表来(i)确定最偏爱的密码子以包括在开放阅读框中，然后(ii)对随后产生的开放阅读框进行CAI计分来确保所述分值足够高而适合于在本发明中使用。例如，如果常规地采用Massaer等人的数据库来设计用于在人类和哺乳动物细胞中表达的开放阅读框，因而CGC密码子被认为是编码精氨酸最偏爱的，则合理的是当确定所产生的开放阅读框的CAI分值时也使用这种偏爱性参考数据。
当表达抗体或其衍生物时，此处描述的方法学是特别适合的，当与由来自EF-1α基因的启动子和表达元件驱动的表达盒组合时，是特别有效的。由其他启动子和表达元件(例如，来自RSV LTR)驱动的表达盒也是适合的。本领域公知的是，表达盒元件(例如，启动子、增强子、基质附着区域(MARS)、绝缘子、非翻译区域、间插序列例如内含子和多聚腺苷酸化位点)可以按许多不同的组合来组合，来产生合适的表达盒以驱动期望的开放阅读框的表达，和驱动本发明中采用的选择和扩增标记物的表达。
一旦在任何给定的细胞系开发方案中的克隆在未给料的扩大分批生产中接近生产平台期，可以看出的是其他的实验室活动最好集中于一些方法，例如(i)最佳克隆物的单细胞克隆，(ii)进料-分批过程开发，(iii)灌流型过程开发，(iv)预定培养基和给料配方和方案，和(v)进一步的培养适应。例如，一旦对单独的克隆达到了生产阈值，与通过以更严格水平的选择和扩增试剂的进一步选择和扩增方案所产生的扩增的子代克隆相比，它来源的单细胞亚克隆通常是更为稳定的和高产的。实际上，提高已经接近生产阈值的最终克隆的选择和扩增常常导致不稳定性，并且在开始的改进之后，常常可能最终导致与扩增的亲本克隆相比在扩大的未给料生产模型分批培养中相似的或甚至更低的滴度。因而，虽然认识到在罕有和偶然的情况下进一步的扩增事件可能在某些情况下提高滴度至超过2倍，一旦接近了表达阈值，存在着更为可靠的技术可被替代采用来更进一步提高稳定的滴度。
本发明通过以下实施例来例示，而不是受其限制。
实施例
过去，DHFR选择方法已经对超过十五种抗体方案采用。在所有情况下，当使用这种方法时，至少两轮扩增和最少50nM MTX作为选择和维持压力来产生具有适合的产量的细胞系是必需的。通过这种方法在这个时间段内产生的典型结果由表1中的抗体1、2、3和4代表。抗体方案1是使用当时可用的标准方法进行的。抗体方案2-9是根据以下材料和方法进行的。
研究了改善开放阅读框的密码子适应指数(CAI)的影响。
抗体5首先被选择用于研究。这项研究包括从野生型(即，非密码子适应的)重链和轻链抗体开放阅读框(记录为抗体5(a))、具有仅可变域编码序列的密码子广泛适应的重链和轻链开放阅读框(记录为抗体5(b)或5(c))或整个重链和轻链开放阅读框的密码子适应(记录为抗体5(d))表达抗体产物。这项研究的结果在表1-5中示出。
实施例1，材料和方法
1.1 DNA克隆和载体构建
所有DNA克隆通过已建立的基于限制性内切酶的亚克隆和PCR组装方法(参见Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Third Edition：Sambrook et al(CSHLaboratory Press))来进行。显示了表达和选择载体的示意图(参见附图1)。显示的载体例示了RSV启动子，然而，根据表1使用了不同的启动子。在所有其他方面，载体保持不变。
1.2密码子适应
在研究CAI适应的ORF序列的方案中，在克隆和序列确认之前，与标准融合聚合酶链式反应(PCR)的帮助相组合、利用期望的重叠寡核苷酸产生了它们；所有都通过标准的方法(参见Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Third Edition：Sambrook et al(CSHLaboratoryPress)and Stemmer et al.，Gene.164(1)：49-53，1995)。方案5(b)和5(c)的ORF的适应的区域的序列利用人类/哺乳动物细胞的Massaer密码子利用偏爱来设计(参见附图11)。
对于抗体方案5(d)，密码子适应的ORF序列由合同服务提供者1来设计和产生。产生的ORF具有＞0.9的CAI分值。编码抗体方案6的抗体可变域的密码子适应的序列由合同服务提供者2设计和产生。然后通过标准的亚克隆以及位于恒定区和可变区之间的独特的克隆位点(对重链使用Spel，轻链使用BsiWI)的帮助，这些可变域与方案5(d)的密码子适应的恒定域编码序列组合(方案6(b)和6(d))。编码方案6(b)和6(d)的全长抗体的产生的ORF各自具有＞0.9的CAI分值。抗体方案7的完全密码子适应的ORF由合同服务提供者2设计和产生，产生的ORF具有＞0.9的CAI分值。方案8和9的ORF采用Leto软件算法来设计可变域序列。按照阅读框的全长开放阅读框然后通过将这些序列与合适的恒定域编码序列组合(再次使用如上述的Spel和BsiWI位点)来产生：对于抗体8，编码可变域的序列与来自方案7的各自的恒定域编码序列融合。对于抗体9，产生的可变域编码序列与来自方案6(d)的各自的恒定域编码序列融合。再一次，产生的编码方案8和9的全部重链和轻链的ORF各自具有＞0.9的CAI分值。
在附图11(A)中。编码抗体方案5的CDR1的轻链序列被显示为代表性样品序列。显示了这个CDR的氨基酸序列。实例性的潜在的auuua不稳定性AU富含元件(ARE)是加方框和粗体显示的(也参见Akashi et al Blood 83：pp3182-3187)。精氨酸密码子也被突出了。首先，提高的密码子适应方法产生了整个ORF上提高的CAI分值。这个抗体在方案5(b)中采用。如所示，这种方法包括最偏爱的密码子(例如，对于Tyr)，但不是在所有的场合(例如，Leu)。第二，最大CAI分值采用了根据Massaer等人的最偏爱的密码子。这个序列在抗体方案5(c)中采用。提供的最终序列采用了根据例如密码子利用数据库网站上可获得的更大的数据库最偏爱的密码子。这个抗体序列在方案5(d)中采用。在附图11(B)中。根据Massaer等修改的人类中高度表达的基因的密码子偏爱表。在附图11(c)中，根据智人的密码子利用数据库(www.kazusa.orq.ip/codon)(包括89533个CD的(38691091个密码子)修改的人类基因的密码子偏爱表。
注意对于重链和轻链ORF，独特的Hind III(5′)和EcoRI位点(3′)是常规采用的，来将开放阅读框穿梭到表达载体中。在转染中使用之前确认所有的序列。
例如，序列参见附图2、3、4、5、6、7、8和9，其记录了方案5的原始的和适应的开放阅读框序列。注意到，在方案5中，仅5(d)是在开放阅读框的区域上充分地密码子适应的，产生的CAI分值超过了0.9。
对于在此报道的所有CAI分值，Ehum.cut密码子利用表被用作参考(通过EMBOSS可获得的)。
这些分值使用密码子适应指数应用程序计算，其采用了Sharp和Li(如上)首先描述的方法。这个应用程序是EMBOSS套装的一部分。版本2.8.0Ehum.cut密码子利用文件和默认参数设置被用于确定这些序列的CAI分值。
表6
来自EMBOSS的Ehum.cut密码子利用表。A栏：密码子序列；B栏：编码的氨基酸；C栏：在它的冗余组中给定密码子的利用比例；D栏：每1000个密码子的密码子数；E栏：在用于产生表格的数据集中观察到的密码子的次数。
1.3细胞培养
悬浮适应的CHO DG44细胞在它们早先适应了的、没有动物来源成分的培养基中常规地传代。这种培养基由含有氨基酸、痕量元素、维生素、葡萄糖和酵母水解产物的基础制剂组成。这个培养基还补充有重组胰岛素、脂质和核苷。碳酸氢钠添加到培养基中作为缓冲剂。许多等效的无动物来源成分的培养基配方是本领域已知的。载体转化的细胞的初步选择通过核苷抽出(用于DHFR选择)和G418添加(用于新霉素磷酸转移酶选择)来进行。对于滴度排序，96孔分析滴度倾向于被细胞生长、接种数量、培养基分配体积和平板间的蒸发动力学诱导而变异。结果，摇瓶生产模型中产生的滴度是对在高产量、扩增的细胞系中细胞系排位顺序更有指示性的。对于这样的模型，所有的细胞以相同的初始密度接种。在这样的模型中，还监测生存力和生长。
1.4转染之前的DNA制备
等量的(15μg)重链和轻链表达载体在200μl体积eppendorf反应中线性化至完成(用NotI)，然后乙醇/乙酸钠沉淀。团粒然后在70％乙醇中洗涤、风干并重悬浮在50μl的分子生物学级别水中。
1.5转染之前CHO DG44细胞的制备
健康生长细胞的1.2×107个细胞(每次转染)在15或50mL试管中旋转(1000rpm 2-10分钟)，在15mL冰冷的PBS/蔗糖中洗涤，再次旋转，然后重悬浮在800μl冰冷的PBS蔗糖中。这种细胞悬浮液然后添加到早先制备的DNA中，在冰上放置15分钟，之后转移到冷却的电穿孔比色杯中。
1.6电穿孔
含有制备的DNA和细胞的比色杯在设置到25μF和0.38kV的Gene Pulser上电穿孔，然后放回冰上10分钟。然后移除细胞，添加到240mL的非选择性培养基中，然后以2-5×103个细胞每反应孔(即，50μL每反应孔)平板接种在40×96孔平皿中的非选择性培养基中。平板然后以箔片包装，在37℃和5％CO2孵育48小时。
1.7选择、扩增和克隆鉴定
电穿孔后48小时，150μL的选择培养基添加到每个反应孔中。这个选择培养基含有G418，没有核苷。此后每周一次地，140μl培养基小心地交换为新鲜的选择培养基，不干扰沉积的细胞层，在3-4周后，所有生长的克隆(一般每个反应孔0.1个菌落生长；即，在每个96孔平板中10个反应孔中生长)来滴定抗体生产。鉴定的最高级的克隆(一般20-100)然后在相同的选择培养基中通过24孔平皿和直至6孔平皿来扩大。这些克隆然后以1000个细胞/每反应孔在96孔平皿(每个克隆96孔)中平板接种，然后以200μl每孔的体积在还含有5nM甲氨蝶呤的选择培养基上选择。在另外两到三周孵育之后，最好的克隆再次扩大，重新以1000个细胞每孔、但是在50nM MTX中平板接种。在2-3周的生长之后这些克隆也在96孔平板中筛选，最好的被扩大，然后以1000个细胞每反应孔平板接种到有150nM MTX的96孔平皿中。为了评估最终的克隆的生产潜力，在150nM MTX下最好的克隆然后被扩大，在摇瓶生产模型中评估产生的产物的滴度和质量。方案5(a)的最好的克隆是标记为17-9-6-1的克隆。这在未给料生产模型中产生0.3g每升的最终滴度。
NB.在步骤1.7中需要的甲氨蝶呤的水平和扩增的轮数取决于方案和序列是否是密码子适应的。
1.8滴度分析
对于从96孔平板获得的培养基样品，通过用厂家的推荐和标准方法在IGEN M-Series M8/384分析仪(Bioveris，MaryLand，USA)上的自动化96孔夹心ELISA式方法测定了抗体滴度。夹心物由链霉抗生物素蛋白包被的磁性包被的珠子、生物素化的蛋白A和钌标记的F(ab)2片段组成。对测试样品产生的信号然后与抗体参考标准物的连续稀释物比较。虽然是高敏感性的分析，由于与96孔培养物中细胞生长变量组合的分析变异性，分析中间精确度和重现性对于用于高产、扩增的细胞系的这种分析是相对低的。对于在摇瓶和生物反应器生产建模期间获得的培养基样品，借助浊度测定方法测量了抗体滴度，其中利用Beckman Coulter图象系统(Buckinghamshire，England)和厂家的推荐和标准方法，光信号被反应溶液中不溶的免疫沉淀素散射。测试样品产生的信号再一次与抗体参考标准物的连续稀释物比较。报道的所有滴度是近似的。
1.9生物反应器摇瓶模型(扩大的未给料分批生产模型)
一般地，细胞以800,000个细胞每ml接种在具有通气盖子、含有无动物来源成分的培养基的标准的250ml组织培养摇动烧瓶中，到120ml的总体积。这些烧瓶然后在富含二氧化碳的空气和设定的温度中搅动孵育，来鼓励和维持细胞生长。对每个克隆测试各种条件，例如，在各种温度条件下。在此报道的结果中，例示了测试的每个克隆(横跨各种标准条件)的最高滴度。一般地，在此报道的生产模型终点滴度在细胞生存力跌至大约50％的时点记录，所述细胞生存力通过基于锥虫蓝排除的分析利用标准的Vi-Cell CHO参数设置和厂家建议的方案在Vi-Cell(Beckman)上测定。一般地，这种终点滴度在孵育10-20天后产生。
1.10生物反应器培养方法
在所有时候都采用标准的生物反应器培养方法和设备。一般地，为了产生种子列，细胞被扩大到更大的体积并以重复3天然后4天的方式每周两次地传代。对于附图13中显示的工作，种子细胞被用于接种3升Applikon台式生物反应器(2升工作体积)，在以下工艺条件下运行：温度34℃、pH值设置点6.95，DO设置点30％。与摇瓶模型一样，培养物被扩大直到细胞生存力跌至大约50％。这些生物反应器广泛地模拟了用于提供临床试验材料等的摇瓶和更大的生物反应器的终点滴度。
1.11 RT-QPCR分析(结果参见附图10)
CHO RNA提取和RT-QPCR反应通过利用MagNA Pure和RNA高性能RNA分离试剂盒和方案(Roche)，通过自动化的基于硅石的提取来进行。在使用随机的六聚体逆转录之后，使用ABI-7700(AppliedBiosystems)进行PCR反应，利用标准方法通过ΔΔCt相对定量算法来分析。反应是多重的(18S+目标基因[重链/轻链])，作为最丰富的目标的18S是限制的引物，以防止目标反应的抑制作用。根据SEQ IDNO：1-9来使用对Q-PCR采用的探针和侧翼引物对。
注意到，上述重链和轻链探针/引物不适合于方案5(d)，这是由于在这个方案中进行的提高的ORF密码子适应，由此它们从附图10(A)中排除了。
1.12 Western印迹分析(结果参见附图10)
采用标准方法，标准方法是在其它地方详细描述了的(例如，参见Sambrook etal，上文的)。简言之，使用完整的细胞裂解物和蛋白质提取缓冲液制备多克隆的等量的细胞提取物。等量的每种提取物然后与Laemmli加载缓冲液热孵育，然后加载到SDS-Page凝胶上并运行，使用三-甘氨酸运行缓冲液来分离蛋白质级分。一旦被分离，蛋白质然后电转移印迹到硝酸纤维素膜上，然后用完整的抗人类IgG(HRP缀合的)来探测。通过与HRP底物孵育产生信号，用X射线底片记录。额外更久的暴露是检测方案5(a)的抗体轻链产物所需的。
1.13荧光甲氨蝶呤染色来测定生产期望的重组蛋白质的克隆中的DHFR水平
每个克隆没有甲氨蝶呤地培养4-5天，之后添加10μMAlexa-Fluor 488-甲氨蝶呤(Molecular Probes/invitrogen，Paisley)在37℃ 5％ CO2 18-22小时到700,000个活细胞中。然后收获染色的细胞，用培养基洗涤并在37℃、5％ CO2孵育30分钟。收获的细胞用培养基再次洗涤，然后重悬浮在培养基中，过滤，添加活/死排除染料碘化丙锭(Sigma，StLouis)，之后在BD FACS ARIA上分析。附图14(A)中显示的数据是仅门选的(gated)活细胞。
1.14 DHFR和Neo水平的基因组DNA的qPCR分析
使用来自Qiagen的标准试剂盒进行CHO基因组DNA提取。在利用分光光度计读取结果的DNA定量和标准化之后，使用ABI-7700(Applied Biosystems)进行PCR反应，通过利用标准方法的ΔCt相对定量算法来分析。根据SEQ ID NO：20-25使用对Q-PCR采用的探针和侧翼引物对。结果在附图14(B)中显示。
实施例2，在CHO细胞中单克隆抗体重链和轻链的表达
令人惊讶地，虽然有高CAI分值ORF，方案5(c)的天然分值(即，低于观察到最高的天然人类ORF的，例如晚期角化的包膜a！LCE1A；NM 1783480的)仍然产生了比方案5(d)的非天然高CAI分值开放阅读框更高的最高滴度，5(d)中高生产者的广度(数量)被改善了(参见表5)。5(a)、(c)和(d)的最佳的克隆然后被进一步扩增和评估。根据这种进一步的评估，5(a)克隆作为对照来发展，代表在此处描述的结果之前观察到的典型的方案滴度。这项工作的结果以出乎意料地短时间和以降低的扩增水平从方案5(d)产生了高产的、稳定的克隆(滴度和生长观察了40代)。实际上，与产生从方案5(a)的非密码子适应的开放阅读框表达类似或更低水平的同样蛋白质产物的等效的细胞系所需要的相比，从5(d)产生最终细胞系所需的甲氨蝶呤的水平是显著更低的(降低97％的甲氨蝶呤)(参见表1)。进行了进一步详细的分析，参见表2-4。为了研究修改CAI分值的ORF所产生的重组蛋白质的结合性质是否受到密码子适应的影响，比较和分析了由CAI分值0.809(HC)/0.761(LC)的ORF或由CAI分值0.982(HC)/0.976(LC)的ORF编码的方案5的抗体的结合特征。在生物反应器中产生两种材料，然后通过等同的纯化方式来纯化。通过这种比较，可以显示的是，抗体的结合特征不受到编码这种抗体的ORF的CAI改变的影响。
对于方案5(d)，如表1中显示的，最高产的克隆097-7被单细胞克隆来确保细胞系的克隆性，相对于未克隆的亲本，最好的子克隆产生的滴度在未给料扩大分批培养中提高到接近2-倍。附图13中显示的滴度是在如1.10中描述的两个独立的3-升Applikon台式生物反应器中的未给料分批培养产生的。
表1
从每个方案中，呈现了为随后的进一步开发和入库所选择的最终的克隆。还突出了的是在其细胞系开发的每个阶段对每个最终克隆产生的96孔滴度(ng/ml)。在此处描述的结果之前产生的典型的数据被表示为抗体方案1、2、3和4。注意到，方案2和方案4表达了相同的产物。对于方案2和4，所有的活动使用相同的载体、宿主细胞和方案，除了不同的实验室操作员和设备，在两个独立的实验室中进行。在0、5、50和150nM MTX下显示的所有滴度是在96孔阶段产生的滴度。更高的滴度显示了在分批生产模型中没有显著的改进，因此更低的MTX克隆继续进行(参见表2)。FIO＝仅提供信息，不是需要的。由于来自方案6(b)-6(d)的更好的滴度，方案6(a)在到达平台期之前被停止。
表1
抗体 1 2 3 4 5(a) 5(d) 6(a) 6(b) 6(c) 6(d) 7(a) 7(b) 8 9
最终的最好克隆 ACC522(L4) 15-27-4 C9-13-9 129-1-3-1(DRC349) 17-9-6-1 O97-7 141-6-4(最好的A2 96-孔滴度 280-9-6 58-3-3 P100-1 C65-5 74-3 454-6 390-8
OnM MTX 120 110 20 41 12 340 16 78 76 2350 64 2054 1280 2055
5nM MTX 530 180 150 920 32 880 72 1140 1160 2025 5700 2125 1690 14055
50nM MTX 1720 1240 490 5231 310 6700(FIO) 438 4170 5775 不需要 不需要 不需要 不需要 不需要
150nMMTX 不需要 不需要 1910 23000 1670 不需要 未进行-需要 不需要 不需要 不需要 不需要 不需要 不需要 不需要
密码子优化？ 否 否 否 否 否 是 否 是 否 是 是 是 是 是
启动子 CMV RSV RSV RSV RSV RSV RSV RSV EF-1a EF-1a RSV EF-1a EF-1a Ef-1A
CAI (重链) 0.679 0.811 0.814 0.811 0.809 0.982 0.818 0.976 0.818 0.976 0.977 0.977 0.954 0.975
CAI (轻链) 0.674 0.767 0.763 0.767 0.761 0.976 0.755 0.978 0.755 0.978 0.973 0.973 0.919 0.973
在96孔中产生最终细胞系的周数 ～15 12 19.5 18 19 7 ＞15 14 ～15 10 8.5 8.5 7.5 8
未给料生产生物反应器模型(％MTX) 0.3g(100％) 0.3g(100％) 0.5g(300％) 0.9g(300％) 0.2g(300％) 0.7g(10％) 未测定，估计＜0.1g(100％) 0.5g(100％) 0.9g(100％) 0.9g(10％) 0.4g(10％) 0.5g(10％) 0.6g(10％) 2.2g(10％)
表5
通过标准转染和选择方案产生的然后在核苷抽出和G418添加时选择的未扩增的克隆的滴度比较。所有细胞系含有表达相同的抗体(方案5的)、但是来自具有不同CAI分值的编码开放阅读框的相同的载体。对于方案5(a)(未优化的)，进行三次进一步的转染，但是没有显示，因为结果基本上是背景的。在附图(A)中，“滴度＞5ng的％”是指在筛选超过5ng/ml的记录之后反应孔的％。“滴度＞50ng/ml的％”是指记录超过50ng/ml的筛选的反应孔的％。“最高滴度(top titre)”是指所有被筛选的最高分值的滴度。“第50值”是指筛选的第50好的滴度。“第20值”是指筛选的第20好的滴度。在(B)中，最高的、第20和第50滴度的平均值被报道在(A)中，以直方图形式呈现。
(A)
转染 HC CAI分值 LC CAI分值 滴度＞5ng/ml的％ 滴度＞50ng/ml的％ 最高滴度 第50值 第20值
1 0.809 0.761 23 0 43 6 8
2 0.809 0.761 26 0 16 5 6
3 0.809 0.761 26 0 23 6 7
4 0.847 0.833 43 7 376 2 17
5 0.847 0.833 62 24 778 9 76
6 0.872 0.894 47 20 674 23 105
7 0.872 0.894 63 30 923 12 103
8 0.982 0.976 57 25 706 46 178
9 0.982 0.976 82 61 653 80 171
表3
方案的96孔平板中的详细的滴度分析在表1中示出。显示了在G418添加和核苷抽出选择、但是没有甲氨蝶呤添加之后，最好的和第50好克隆的滴度。
方案 密码子适应？ 驱动抗体ORF表达所使用的启动子 最高滴度(ng/ml) 第50滴度(ng/ml)
2345(a)5(d)6(a)6(b)6(c)6(d)7(a)7(b)89 否否否否是否是否是是是是是 RSVRSVRSVRSVRSVRSVRSVEF-1aEF-1aRSVEF-1aEF-1aEF-1a 130711524365311684011532499830346740903108 2(22nd)1222680148987142650528739573
表4
在方案5和6中观察到的前20-100个克隆然后扩大到6孔平皿中，之后重新平板接种到96孔中含有5nM甲氨蝶呤的培养基中。在96孔平皿中甲氨蝶呤抗叶酸物的5nM(A1)和50nM(A2)浓度下选择的、实验5和6中观察到的生长克隆的平均和最高滴度显示如下。
表2
生产平台期的实施例：实施例(A)方案5(d)的最终选择的克隆在50nM MTX中进一步扩增。显示了亲本克隆的未给料生产模型滴度(阴影的)和产生的“扩增的”子代克隆的最高滴度。还显示了类似的实施例(B、C、D、E、F、G)。对于每个实施例，记录了在进一步扩增后子代克隆的最高滴度。这展现了与尝试通过进一步轮次的扩增达到更高滴度相比，更早达到更高滴度是更为有益的。
实施例3，抗体6和7和EF-1a启动子
进行抗体6的重链和轻链的开放阅读框的密码子适应，再次产生ORF的最终CAI分值超过＞0.9(参见表1)。野生型/起始和密码子适应的开放阅读框在基于RSV的启动子表达载体、以及基于人类延伸因子-1α(EF-1α)启动子的表达载体中表达，其中顺式作用绝缘子、增强子和启动子表达元件从非病毒启动子来源替代地提供。这个工作的结果再次展现了，当期望的蛋白质的开放阅读框首先密码子适应时，产生最终的高产的细胞系需要显著更少的甲氨蝶呤。实际上，在接近生产平台期的细胞的产生之前在5nM MTX阶段，其中抗体6由未适应的ORF(即，CAI分值＜0.9)编码的转染6(a)被放弃。在转染6(a)中没有进一步继续扩增方案，因为明显的是，相对于已经从其中采用＞0.9的ORF的细胞系所获得的产量(即，转染6(b)和6(d))，产生能够生产相等产量蛋白质的细胞系将需要显著更多的资源和时间。此外，当比较加上或减去密码子适应的类似载体时，观察到的是，密码子适应总是降低所需的抗叶酸物水平。再一次，对于方案7，按照与方案6(参见表1)类似的方式进行密码子适应，密码子适应的ORF(CAI＞0.9)在基于RSV和EF-1a启动子的表达载体中表达。再一次地，不管启动子如何，当与采用未适应的ORF来编码重组产物的所有之前的方案(在表1中概述)相比时，以更快的时间和用更少的甲氨蝶呤从CAI适应的ORF产生了等同的高产的细胞系。
实施例4，mRNA水平
为了进一步研究这种方法，在从相同的载体、但是从报告了不同的CAI分值的开放阅读框表达相同的产物(方案5的抗体)的类似多克隆细胞群体中，研究了密码子适应对产生的mRNA水平的影响。
CHO细胞用编码相同的蛋白质产物(方案5的抗体)的重链(HC)和轻链(LC)编码表达载体共转染。每个转染的群体作为多克隆库来维持。每个载体对编码相同的但是来自具有不同CAI分值的开放阅读框的抗体重链(HC)和轻链(LC)。
这个实验的结果在附图10中表现，揭示了，当相对于未适应的对照物对重链和轻链信息提高CAI分值时，观察到mRNA水平方面显著的成倍提高。RNA水平方面相等的提高(相对于起始的未适应的序列)在分析的所有适应的序列中发生。类似地，在Western印迹分析的极限内，对所有适应的序列观察到细胞内蛋白质水平的相等的提高。然而，虽然在细胞内蛋白质水平方面观察到这种相等，在分泌的水平方面存在差异。观察到的是，含有非天然的高CAI分值的开放阅读框的细胞产生了更高的多克隆滴度。这进一步支持了以下发现，当在细胞系开发方案中采用非天然地高的CAI分值开放阅读框时，高产克隆的广度被改善了。
附图10
(A)：由RT Q-PCR测量的HC和LC信息的细胞内RNA水平：所有信号针对核糖体RNA来标准化，倍数提高是相对于由非密码子适应的开放阅读框编码的起始HC和LC载体产生的信号。Y轴：值的范围为RNA信号的从0到50倍提高。X轴：a(h)表示从未转染细胞的RNA提取物产生的阴性对照HC信号(一式两份)；b(h)表示从用未密码子适应的HC和LC表达载体转染的细胞得到的RNA提取物产生的HC信号，如对方案5(a)所用的(CAI分值HC为0.809，LC为0.761)；c(h)表示从用密码子适应的HC和LC表达载体转染的细胞得到的RNA提取物产生的HC信号，如对方案5(b)所用的(CAI分值HC为0.847，LC为0.833)；d(h)表示从用另外密码子适应的HC和LC表达载体转染的细胞得到的RNA提取物产生的HC信号，如对方案5(c)所用的(CAI分值HC为0.872，LC为0.894)。从如上所述的相同RNA提取物产生的轻链信号分别显示为a(l)、b(l)、c(l)和d(l)。(B)：Western印迹分析；相等的细胞提取物通过SDS-PAGE分离，印迹，并用抗产物抗体(HRP缀合的)查询。未转染的细胞的对照在泳道1中显示。表达产物重链和轻链开放阅读框的多克隆细胞如下：泳道2和3：具有0.809CAI分值的HC和具有0.761 CAI分值的LC(从上述实验b(h)和b(1)表达的蛋白质，载体与方案5(a)中使用的相同；泳道4和5：具有0.847 CAI分值的HC和具有0.833 CAI分值的LC(从上述实验c(h)和c(l)表达的蛋白质，载体与方案5(b)中使用的相同；泳道6和7：具有0.872CAI分值的HC和具有0.894CAI分值的LC(从上述实验d(h)和d(l)表达的蛋白质，载体与方案5(c)中使用的相同；泳道8和9：具有0.982CAI分值的HC和具有0.976CAI分值的LC(通过与方案5(d)中使用的相同的载体表达的蛋白质)。
(C)；附图10(B)中描述的多克隆细胞的按照ng/ml报告的24小时产物滴度。
实施例5，达到高CAI的不同方法。实施例(a)方案8，实施例(b)方案9。
a)对于方案8，使用Leto软件来设计可变域。这些然后借助标准的限制性内切酶消化和连接方法融合到早先对方案7产生的相同的恒定域。产生的重链和轻链ORF分值分别为0.954和0.919。这些然后在细胞系开发方案中采用，再一次地，与密码子适应之前早先曾经采用的相比，我们以更快的时间期和用更少的甲氨蝶呤产生了高产细胞系(参见表1)。
b)对于方案9，再次使用Leto软件来设计可变域。这些然后借助标准的限制性内切酶消化和连接方法融合到早先对方案6(d)产生的相同的恒定域。产生的重链和轻链ORF分值分别为0.975和0.973。这些然后在细胞系开发方案中采用，再一次地，与密码子适应之前早先曾经采用的相比，我们以更快的时间期和用更少的甲氨蝶呤产生了高产细胞系(参见表1)。
实施例6-对糖基化的影响
注意的是，即使对两种情况下的表达采用相同的宿主、培养基和DHFR选择和扩增系统，相对于当从未适应的开放阅读框表达时产生的水平，当从密码子适应的开放阅读框表达时，非糖基化重链(NGHC)的水平显著更低。再更有趣地，当采用不同的培养条件和不同的载体、选择和扩增方式(谷氨酰胺合成酶/MSX)，而作为替代在不同的宿主细胞中表达相同的未适应的开放阅读框时，我们也观察到NGHC的相似的高水平(参见附图12)。在开放阅读框的密码子适应与非糖基化重链的降低的水平之间的这种相关性揭示了，通过提高开放阅读框的CAI分值，人们也可以改善产物的总体质量。
6.1使用Lonza CHOK1SV和谷氨酰胺合成酶选择系统的细胞系开发(附图12)
根据建议的Lonza(Slough)方案进行载体构建和细胞系开发。在所有情况采用的培养基是CD-CHO(Invitrogen)。含有未适应的开放阅读框的抗体方案5(a)中采用的开放阅读框被首先亚克隆到Lonza载体pEE14.4(用于轻链)和pEE6.4(用于重链)中。这些载体然后根据建议的Lonza方案组合到表达重链和轻链的单个双基因载体中。然后根据Lonza建议的说明利用电穿孔将这个载体递送到名称为CHOK1SV宿主细胞的Lonza悬浮适应的CHOK1菌株中，如也建议的用谷氨酰胺抽出和添加MSX来选择和扩增。产生的克隆在96孔中滴定，最好的扩大到摇瓶中并进一步评估。选择最好的克隆来在大规模生物反应器中制造产物。关于这种方法的进一步的细节，参见de LaCruz Edmonds et al 2006 MolecularBiotechnology 34：179-190。
6.2产物NGHC分析
借助蛋白A柱从培养物上清液中纯化蛋白质。随后在还原条件下并根据厂家的方案，用SDS毛细管电泳Bioanalyzer lab-on-a-chip设备(Agilent Technologies，CheshireUK)分析产物。相对于主要糖基化的重链物质，观察到非糖基化重链是稍微更快迁移的物质(参见附图12B)。
附图12-表(A)显示了来自所有分析的代表性数据。还包括的是，采用不同的宿主细胞、载体、培养基和培养方式(参见上文实施例6.1)在不同的选择和扩增方案(谷氨酰胺合成酶/甲氨蝶呤)中表达未适应的开放阅读框的另外的工作。(B)从起始的未适应ORF对比密码子适应的ORF观察到的实例的NGHC痕迹。对从相同大小(1000升)的生物反应器纯化的产物进行这种分析。在这些代表性的痕迹覆盖中，相对于从适应的ORF(CAI：HC 0.982，LC0.976)产生的、仅含有1.5％非糖基化重链的产物，从未适应的ORF(CAI：HC 0.809，LC0.761)表达产物的生物反应器细胞培养物收获物产生了具有降低的位点占据的重链(10％非糖基化的重链)。
实施例7在最终的细胞系中对选择和扩增试剂的水平的影响
在DHFR选择系统中进行提高数量的MTX选择和扩增试剂的添加或逐步滴加，以通过提高基因拷贝数来增加表达。为了研究密码子适应对转染的质粒DNA的基因拷贝数的影响，采用了两种不同的半定量方法(参见实验的描述的小节1.13和1.14)。
首先使用FACS分析。为此，方案2、3、4、5(d)、6(d)和7(b)的最终的细胞系或其单细胞克隆用荧光甲氨蝶呤染色并通过FACS分析。结果(在附图14A中显示)表明，甲氨蝶呤水平，如平均荧光强度所表明的，并且因此DHFR水平，与细胞系的扩增的水平相关，即在5nMMTX(方案5(d)，6(d)和7(b))中选择的最终细胞系具有最低，在150nM MTX(方案3)中选择的最终细胞系具有最高的DHFR水平。此外，对从方案3、4、5(a)、5(d)、7(b)和9的最终细胞系或其单细胞克隆提取的基因组DNA进行DHFR和Neo的qPCR。结果(在附图14B中显示)表明，与在150nM MTX(方案3、4和5(a))中选择的细胞系相比，在5nM MTX(方案5(d)、7(b)和9)中选择的细胞系具有显著更低的DHFR和Neo的DNA水平，和因而更低的拷贝数。
以上讨论的结果展现了，与得自未适应的ORF(对于这个实施例，方案2、3、4、5(a))的细胞系相比，得自密码子适应的ORF(对于这个实施例，方案5(d)、6(d)、7(b)和9)的细胞系具有更低的基因拷贝数。因而密码子适应的ORF(CAI＞0.90)的使用引起了具有相等或更高滴度、具有更低扩增水平和转染DNA的更低拷贝数的细胞系的产生(当与来自未适应的ORF的细胞系相比时)。从更低的拷贝数、更少扩增的表达载体产生相等的或更高水平的抗体的克隆的产生是高度期望的。例如，已经显示的是，当整合的表达载体的拷贝数被提高时可能诱导重复诱导的基因沉默(repeat-induced genesilencing，RIGS)，这样的RIGS然后可能产生哺乳动物细胞中来自这种载体的降低的表达水平(例如，参见McBurney MW et alExp CellRes 2002 274：1-8)。
附图14(A).对方案2、3、4、5(d)、6(d)和7(b)的每一个的最终细胞系观察到的平均荧光的图。如实施例1、材料和方法中所描述的，进行对DHFR的细胞染色。(B)通过对方案3、4、5(a)、5(d)、7(b)和9的最终细胞系的基因组DNA进行qPCR，DHFR和Neo DNA的水平。qPCR如实施例1、材料和方法中所描述的进行。对观察到的基准点水平，DHFR和Neo的最低值(在方案7(b)中所见的)被设置为1，所有其他的值作为它的相对提高倍数来标绘。在每个值下方还标明的是，所分析的细胞系表达的蛋白质是否来自CAI＞0.9的ORF(Y＝是，N＝否)，以及产生所述细胞系所需的MTX的水平(以nM MTX)。
序列表
SEQ ID NO. 序列的描述
1 18S RNA探针-核苷酸
2 引物1
3 引物2：
4 重链探针：
5 引物1：
6 引物2：
7 轻链探针
8 引物1：
9 引物2：
10 具有0.809的CAI分值、在方案5(a)中采用的，方案5的未适应的重链
11 具有0.761的CAI分值、在方案5(a)中采用的，方案5的未适应的轻链
12 具有提高的CAI分值(0.847)的方案5的重链ORF：参见表5和附图6。这个序列在方案5(b)中采用。
13 具有提高的CAI分值(0.833)的方案5的轻链ORF：参见表5和附图6。这个序列在方案5(b)中采用。
14 具有提高的CAI分值(0.872)的方案5的重链ORF。这个序列在抗体方案5(c)中采用。
15 具有提高的CAI分值(0.894)的方案5的轻链ORF。这个序列在抗体方案5(c)中采用。
16 具有提高的CAI分值(0.982)的方案5的重链ORF。这个序列在抗体方案5(d)中采用。
17 具有提高的CAI分值(0.976)的方案5的轻链ORF。这个序列在抗体方案5(d)中采用。
18 候选的(H2L1)重链
19 候选的(H2L1)轻链
20 引物1：
21 引物2：
22 DHFR探针：
23 引物1：
24 引物2
25 Neo探针：
SEQ ID NO.1
5-VIC-tggctgaacgccacttgtccctcta aa-TAM RA-3’.
SEQ ID NO.2
5’-aggaattgacggaagggcac-3’.
SEQ ID NO.3
5’-ggacatctaagggcatcaca-3’
SEQ ID NO.4
5’-FAM-ctccggctgcccattgctctcc-TAMRA-3’.
SEQ ID NO.5
5’-ggaggcgtggtcttgtagttg-3’.
SEQ ID NO.6
5’-ggcttctatcccagcgacatc-3’.
SEQ ID NO.7
5’-FAM-tctcgtagtctgctttgctcagcgtca-TAMRA-3’.
SEQ ID NO.8
5’-cttcgcaggcgtagactttgt-3’.
SEQ ID NO.9
5’-gccctccaatcgggtaactc-3
SEQ ID NO.10
ATGGAGTTGGGGCTGTGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAGAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGATTCACCTTCAGTGACAACGGAATGGCGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATTCATTAGTAATTTGGCATATAGTATCGACTACGCAGACACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGTCAGCGGGACCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO.11
ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGAGTTAGTCAGAGCCTTTTACACAGTAATGGATACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCTCTCAAACTAGACATGTTCCGTACACGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO.12
ATGGAGCTCGGGCTGTGCTGGGTGTTCCTCGTGGCCATCCTGGAGGGAGTGCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGTGGGGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGCGGCTGTCGTGCGCCGTGAGCGGCTTCACCTTCAGTGACAACGGCATGGCTTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGAAAGGGGCTCGAGTGGGTGAGCTTCATCAGTAACCTGGCCTACAGTATCGACTATGCTGACACCGTGACCGGCCGCTTCACTATCTCTCGGGATAATGCTAAGAACAGCCTGTACCTCCAGATGAACAGCCTGCGCGCTGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGTGTCTGGAACCTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGTACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO.13
ATGCGCCTGCCTGCCCAGCTGCTCGGCCTGCTGATGCTGTGGGTGTCGGGCAGCTCCGGCGACATCGTCATGACCCAGAGCCCCCTGAGTCTCCCCGTCACCCCCGGCGAACCTGCCAGCATCAGCTGCAGGGTGTCCCAGTCGCTGCTCCATTCCAACGGGTACACGTACCTGCATTGGTACCTGCAGAAGCCCGGGCAATCCCCTCAGCTGCTGATCTACAAGGTGAGCAACCGCTTCTCCGGCGTCCCGGACCGGTTCAGTGGCAGCGGCTCTGGAACCGACTTCACCCTGAAAATCAGCCGCGTGGAAGCTGAGGACGTGGGCGTCTACTACTGCAGCCAGACCCGGCATGTGCCCTACACCTTCGGCGGCGGCACAAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO.14
ATGGAGCTGGGCCTGTGCTGGGTGTTCCTGGTGGCCATCCTGGAGGGCGTGCAGTGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCCGTGAGCGGCTTCACCTTCAGCGACAACGGCATGGCCTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCTTCATCAGCAACCTGGCCTACAGCATCGACTACGCCGACACCGTGACCGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGTGAGCGGCACCTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGCAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO.15
ATGCGCCTGCCCGCCCAGCTGCTGGGCCTGCTGATGCTGTGGGTGAGCGGCAGCAGCGGCGACATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCCGGCGAGCCCGCCAGCATCAGCTGCCGCGTGAGCCAGAGCCTGCTGCACAGCAACGGCTACACCTACCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGAGCAACCGCTTCAGCGGCGTGCCCGACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGCGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCAGCCAGACCCGCCACGTGCCCTACACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO.16
ATGGAGCTGGGCCTGTGCTGGGTGTTCCTGGTGGCCATCCTGGAGGGCGTGCAGTGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGTGTCCGGCTTCACCTTCAGCGACAACGGCATGGCCTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCTTCATCAGCAACCTGGCCTACAGCATCGACTACGCCGACACCGTGACCGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGTGAGCGGCACCTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTAGATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGGCCGGAGCCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ ID NO.17
ATGAGACTGCCCGCCCAGCTGCTGGGCCTGCTGATGCTGTGGGTGTCCGGCAGCAGCGGCGACATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCTGGCGAGCCCGCCAGCATCAGCTGTAGAGTGAGCCAGAGCCTGCTGCACAGCAACGGCTACACCTACCTGCACTGGTATCTGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCTCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCTGATAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGATGTGGGCGTGTACTACTGCTCCCAGACCAGACACGTGCCTTACACCTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
SEQ ID NO 18
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFSDNGMAWVRQAPGKGLEWVSFISNLAYSIDYADTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSGTWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO 19
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRVSQSLLHSNGYTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQTRHVPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO 20
GAGGCAGTTCTGTTTACCAGGAA
SEQ ID NO 21
CCTGCATGATCCTTGTCACAA
SEQ ID NO 22
Cy5-CCATGAATCAACCAGGCCACCTCAG-BBq
SEQ ID NO 23
GCCCGGTTCTTTTTGTCAAG
SEQ ID NO 24
CTGCCTCGTCCTGCAGTTC
SEQ ID NO 25
Cy5-CCGACCTGTCCGGTGCCCTG-BBq
<110>UDEN Mark
KOTSOPOULOU，Ekaterina
<120>生产方法
<130>PB62449P
<150>US60/956772
<151>2007-08-20
<160>25
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物/探针
<400>1
tggctgaacg ccacttgtcc ctctaaa 27
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物/探针
<400>2
aggaattgac ggaagggcac 20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物/探针
<400>3
ggacatctaa gggcatcaca 20
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物/探针
<400>4
ctccggctgc ccattgctct cc 22
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物/探针
<400>5
ggaggcgtgg tcttgtagtt g 21
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物/探针
<400>6
ggcttctatc ccagcgacat c 21
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物/探针
<400>7
tctcgtagtc tgctttgctc agcgtca 27
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物/探针
<400>8
cttcgcaggc gtagactttg t 21
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物/探针
<400>9
gccctccaat cgggtaactc 20
<210>10
<211>1392
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链
<400>10
atggagttgg ggctgtgctg ggttttcctt gttgctattt tagaaggtgt ccagtgtgag 60
gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120
tgtgcagtct ctggattcac cttcagtgac aacggaatgg cgtgggtccg ccaggctcca 180
gggaaggggc tggagtgggt ttcattcatt agtaatttgg catatagtat cgactacgca 240
gacactgtga cgggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc actgtatctg 300
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgtcag cgggacctgg 360
tttgcttact ggggccaggg cacactagtc acagtctcct cagcctccac caagggccca 420
tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc 480
tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 540
accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 600
agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat 660
cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact 720
cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcgcggggg caccgtcagt cttcctcttc 780
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 840
gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 960
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020
tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1080
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 1140
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1260
ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1320
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1380
tctccgggta aa 1392
<210>11
<211>717
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>轻链
<400>11
atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct gggtctctgg atccagtggg 60
gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 120
atctcctgca gagttagtca gagcctttta cacagtaatg gatacaccta tttacattgg 180
tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct ataaagtttc caaccgattt 240
tctggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 300
agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgct ctcaaactag acatgttccg 360
tacacgttcg gcggagggac caaggtggaa atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc 420
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggacaa cgccctccaa 540
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 717
<210>12
<211>1392
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>密码子适应的重链
<400>12
atggagctcg ggctgtgctg ggtgttcctc gtggccatcc tggagggagt gcagtgtgag 60
gtgcagctgg tggagagtgg gggcggcctg gtgcagcccg gcggcagcct gcggctgtcg 120
tgcgccgtga gcggcttcac cttcagtgac aacggcatgg cttgggtcag gcaggccccc 180
ggaaaggggc tcgagtgggt gagcttcatc agtaacctgg cctacagtat cgactatgct 240
gacaccgtga ccggccgctt cactatctct cgggataatg ctaagaacag cctgtacctc 300
cagatgaaca gcctgcgcgc tgaggacacc gccgtgtact actgcgtgtc tggaacctgg 360
ttcgcctact ggggccaggg tacactagtc acagtctcct cagcctccac caagggccca 420
tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc 480
tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 540
accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 600
agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat 660
cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact 720
cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcgcggggg caccgtcagt cttcctcttc 780
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 840
gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 960
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020
tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1080
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 1140
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1260
ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1320
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1380
tctccgggta aa 1392
<210>13
<211>717
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>密码子适应的轻链
<400>13
atgcgcctgc ctgcccagct gctcggcctg ctgatgctgt gggtgtcggg cagctccggc 60
gacatcgtca tgacccagag ccccctgagt ctccccgtca cccccggcga acctgccagc 120
atcagctgca gggtgtccca gtcgctgctc cattccaacg ggtacacgta cctgcattgg 180
tacctgcaga agcccgggca atcccctcag ctgctgatct acaaggtgag caaccgcttc 240
tccggcgtcc cggaccggtt cagtggcagc ggctctggaa ccgacttcac cctgaaaatc 300
agccgcgtgg aagctgagga cgtgggcgtc tactactgca gccagacccg gcatgtgccc 360
tacaccttcg gcggcggcac aaaggtggag atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc 420
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggacaa cgccctccaa 540
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 717
<210>14
<211>1392
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>密码子适应的重链
<400>14
atggagctgg gcctgtgctg ggtgttcctg gtggccatcc tggagggcgt gcagtgcgag 60
gtgcagctgg tggagagcgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggcagcct gcgcctgagc 120
tgcgccgtga gcggcttcac cttcagcgac aacggcatgg cctgggtgcg ccaggccccc 180
ggcaagggcc tggagtgggt gagcttcatc agcaacctgg cctacagcat cgactacgcc 240
gacaccgtga ccggccgctt caccatcagc cgcgacaacg ccaagaacag cctgtacctg 300
cagatgaaca gcctgcgcgc cgaggacacc gccgtgtact actgcgtgag cggcacctgg 360
ttcgcctact ggggccaggg cacactagtc acagtctcct cagcctccac caagggccca 420
tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc 480
tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 540
accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 600
agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat 660
cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact 720
cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcgcggggg caccgtcagt cttcctcttc 780
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 840
gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 960
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020
tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1080
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 1140
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1260
ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1320
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1380
tctccgggta aa 1392
<210>15
<211>717
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>密码子适应的轻链
<400>15
atgcgcctgc ccgcccagct gctgggcctg ctgatgctgt gggtgagcgg cagcagcggc 60
gacatcgtga tgacccagag ccccctgagc ctgcccgtga cccccggcga gcccgccagc 120
atcagctgcc gcgtgagcca gagcctgctg cacagcaacg gctacaccta cctgcactgg 180
tacctgcaga agcccggcca gagcccccag ctgctgatct acaaggtgag caaccgcttc 240
agcggcgtgc ccgaccgctt cagcggcagc ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc 300
agccgcgtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgca gccagacccg ccacgtgccc 360
tacaccttcg gcggcggcac caaggtggag atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc 420
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggacaa cgccctccaa 540
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 717
<210>16
<211>1392
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>密码子适应的重链
<400>16
atggagctgg gcctgtgctg ggtgttcctg gtggccatcc tggagggcgt gcagtgcgag 60
gtgcagctgg tggagtctgg cggcggactg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc 120
tgtgccgtgt ccggcttcac cttcagcgac aacggcatgg cctgggtgag gcaggcccct 180
ggcaagggcc tggagtgggt gtccttcatc agcaacctgg cctacagcat cgactacgcc 240
gacaccgtga ccggcagatt caccatcagc cgggacaacg ccaagaacag cctgtacctg 300
cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacc gccgtgtact actgtgtgag cggcacctgg 360
ttcgcctact ggggccaggg caccctggtg accgtgtcca gcgccagcac caagggcccc 420
agcgtgttcc ccctggcccc cagcagcaag agcaccagcg gcggcacagc cgccctgggc 480
tgcctggtga aggactactt ccccgaaccg gtgaccgtgt cctggaacag cggagccctg 540
accagcggcg tgcacacctt ccccgccgtg ctgcagagca gcggcctgta cagcctgagc 600
agcgtggtga ccgtgcccag cagcagcctg ggcacccaga cctacatctg taacgtgaac 660
cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaggtggagc ccaagagctg tgacaagacc 720
cacacctgcc ccccctgccc tgcccccgag ctggccggag cccccagcgt gttcctgttc 780
ccccccaagc ctaaggacac cctgatgatc agcagaaccc ccgaggtgac ctgtgtggtg 840
gtggatgtga gccacgagga ccctgaggtg aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900
gtgcacaatg ccaagaccaa gcccagggag gagcagtaca acagcaccta ccgggtggtg 960
tccgtgctga ccgtgctgca ccaggattgg ctgaacggca aggagtacaa gtgtaaggtg 1020
tccaacaagg ccctgcctgc ccctatcgag aaaaccatca gcaaggccaa gggccagccc 1080
agagagcccc aggtgtacac cctgccccct agcagagatg agctgaccaa gaaccaggtg 1140
tccctgacct gcctggtgaa gggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200
aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc accccccctg tgctggacag cgatggcagc 1260
ttcttcctgt acagcaagct gaccgtggac aagagcagat ggcagcaggg caacgtgttc 1320
agctgctccg tgatgcacga ggccctgcac aatcactaca cccagaagag cctgagcctg 1380
tcccctggca ag 1392
<210>17
<211>717
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>密码子适应的轻链
<400>17
atgagactgc ccgcccagct gctgggcctg ctgatgctgt gggtgtccgg cagcagcggc 60
gacatcgtga tgacccagag ccccctgagc ctgcccgtga cccctggcga gcccgccagc 120
atcagctgta gagtgagcca gagcctgctg cacagcaacg gctacaccta cctgcactgg 180
tatctgcaga agcctggcca gagccctcag ctgctgatct acaaggtgtc caaccggttc 240
agcggcgtgc ctgatagatt cagcggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 300
agcagagtgg aggccgagga tgtgggcgtg tactactgct cccagaccag acacgtgcct 360
tacacctttg gcggcggaac aaaggtggag atcaagcgta cggtggccgc ccccagcgtg 420
ttcatcttcc cccccagcga tgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgtctg 480
ctgaacaact tctacccccg ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa tgccctgcag 540
agcggcaaca gccaggagag cgtgaccgag caggacagca aggactccac ctacagcctg 600
agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgtgag 660
gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagagct tcaaccgggg cgagtgc 717
<210>18
<211>445
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>H2L1重链
<400>18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Ser Ile Asp Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ser Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210>19
<211>219
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>H2L1轻链
<400>19
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Val Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Arg His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210>20
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物/探针
<400>20
gaggcagttc tgtttaccag gaa 23
<210>21
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物/探针
<400>21
cctgcatgat ccttgtcaca a 21
<210>22
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>DHFR探针
<400>22
ccatgaatca accaggccac ctcag 25
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物/探针
<400>23
gcccggttct ttttgtcaag 20
<210>24
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物/探针
<400>24
ctgcctcgtc ctgcagttc 19
<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物/探针
<400>25
ccgacctgtc cggtgccctg 20

Claims (18)

1.一种生产产生至少一种抗体的CHO细胞系的方法，包括步骤：
a)获得具有小于0.9的密码子适应指数且编码所述至少一种抗体的第一多核苷酸序列；
b)改变所述第一多核苷酸序列来获得第二多核苷酸序列，其中所述第二多核苷酸序列的密码子适应指数等于或大于0.9，并且所述第一多核苷酸和第二多核苷酸编码相同的抗体；
c)用步骤(a)的第一多核苷酸序列和编码选择标记物的第三多核苷酸序列转化CHO细胞系的至少一种第一细胞，所述选择标记物能够提供在所述细胞内所述第一多核苷酸序列的扩增；并且
用步骤(b)的所述第二多核苷酸序列和编码选择标记物的所述第三多核苷酸序列转化所述CHO细胞系的至少一种第二细胞，所述选择标记物能够提供在所述细胞内所述第二多核苷酸序列的扩增；
d)在培养基中生长步骤(c)的所述至少一种第一细胞来产生包含复数个细胞的第一细胞系，所述培养基含有一定浓度或逐渐提高的浓度的选择和扩增试剂，所述一定浓度或逐渐提高的浓度的选择和扩增试剂(i)抑制所述细胞系中表达不足水平的由步骤(c)的所述第三多核苷酸编码的选择标记物的细胞的生长，和(ii)提高基因拷贝数；
在培养基中生长步骤(c)的所述至少一种第二细胞来产生包含复数个细胞的第二细胞系，所述培养基含有一定浓度或逐渐提高的浓度的所述选择和扩增试剂，所述一定浓度或逐渐提高的浓度的选择和扩增试剂(i)抑制所述细胞系中表达不足水平的由步骤(c)的所述第三多核苷酸编码的选择标记物的细胞的生长，和(ii)提高基因拷贝数；和
e)一旦达到在所述第二细胞系中第二多核苷酸编码的抗体生产的平台期，选择所述第二细胞系，其中所述选择和扩增试剂的浓度比达到用所述第一多核苷酸转化的所述第一细胞系中产生的所述抗体的相等的生产产量所必需的选择和扩增试剂的浓度低至少50％。
2.权利要求1的方法，其中与达到用所述第一多核苷酸转化的所述第一细胞系中产生的所述抗体生产的相等的平台期所必需的相比，用更少轮数的扩增达到在所述第二细胞系中产生的所述第二多核苷酸编码的抗体生产的平台期。
3.权利要求1或2的方法，其中所述第二细胞系在生物反应器中培养，产生的所述抗体被纯化。
4.权利要求1的方法，其中当与用于利用所述第一多核苷酸序列的相同方法的选择和扩增试剂的浓度相比，选择和扩增试剂的浓度被降低到等于或低于25％。
5.权利要求1的方法，其中当与用于利用所述第一多核苷酸序列的相同方法的选择和扩增试剂的浓度相比，选择和扩增试剂的浓度被降低到等于或低于5％。
6.权利要求1的方法，其中当与用于利用所述第一多核苷酸序列的相同方法的选择和扩增试剂的浓度相比，选择和扩增试剂的浓度被降低到等于或低于3％。
7.权利要求1的方法，其中所述抗体是其抗体衍生物或抗原结合片段。
8.权利要求1的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
9.权利要求1的方法，其中要被转化的所述CHO细胞系由于内源的细胞酶的破坏或抑制是代谢缺陷性的。
10.权利要求1的方法，其中要被转化的所述CHO细胞系是在核苷合成途径方面缺陷性的。
11.权利要求10的方法，其中所述选择标记物是编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的多核苷酸，所述选择和扩增试剂是抗叶酸物。
12.权利要求11的方法，其中所述抗叶酸物是甲氨蝶呤(MTX)。
13.权利要求1的方法，其中所述选择标记物是编码谷氨酰胺合成酶的多核苷酸，所述选择和扩增试剂是甲硫氨酸砜酰亚胺(MSX)。
14.权利要求1的方法，其中实现蛋白质生产的平台期仅需要一轮扩增。
15.权利要求1的方法，其中产生的抗体的细胞生产力范围是10-100pg/细胞/每天。
16.权利要求12的方法，其中使用的MTX的浓度为：(a)等于或低于50nM；或(b)5nM。
17.一种生产产生至少一种抗体的CHO细胞系的方法，包括步骤：
a)用多核苷酸序列转化细胞系，所述多核苷酸序列包含：(i)编码所述抗体并具有等于或大于0.9的密码子适应指数的序列，和(ii)编码能够提供所述多核苷酸序列的扩增的选择标记物的序列；
b)在选择试剂存在的情况下提供至少一轮扩增；和
c)一旦达到所述抗体的生产的平台期则选择所述细胞系；
其中，与编码所述抗体并具有小于0.9的密码子适应指数的序列相比，选择和扩增试剂的浓度是达到相等的生产产量所需的浓度的50％或更少。
18.权利要求17的方法，其中：
a)所述选择和扩增试剂是MSX或MTX；和/或
b)需要一轮扩增来达到相等的生产产量。
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