JP5592258B2 - 製造方法 - Google Patents
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Description
(a)該治療用タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド配列を取得するステップ、
(b)第1のポリヌクレオチド配列を改変して第2のポリヌクレオチド配列を取得するステップであって、第2のポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数が第1のポリヌクレオチド配列のものよりも大きく、第1のポリヌクレオチドと第2のポリヌクレオチドとは同じ治療用タンパク質をコードしているステップ、
(c)ステップ(b)の第2のポリヌクレオチド配列および細胞内で第2のポリヌクレオチド配列の増幅をもたらすことが可能な選択マーカーをコードする第3のポリヌクレオチド配列で少なくとも1つの細胞を形質転換するステップ、
(d)ステップ(c)の第3のポリヌクレオチドによりコードされる選択マーカーの不十分なレベルを発現する細胞株で細胞の増殖を阻害する選択薬剤の濃度を含有する培地中でステップ(c)の該少なくとも1つの細胞を増殖させ、複数の細胞を含む細胞株を作製し、それにより、第1のポリヌクレオチドで形質転換された細胞株で産生される該タンパク質の同等な産生プラトーに達するのに必要とされるであろうよりも、少ない増幅ラウンドで、かつ/または低い選択薬剤濃度で第2のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の産生プラトーに達するステップ
を含む。
(a)治療用タンパク質をコードし、かつ0.9未満のコドン最適化指数を有する第1のポリヌクレオチド配列を取得するステップ、
(b)治療用タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチド配列を取得するステップであって、該ポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数が0.9よりも大きいステップ、
(c)治療用タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチド配列、および第2のポリヌクレオチドの増幅をもたらすことが可能な選択マーカーをコードする第3のポリヌクレオチド配列で細胞株を形質転換するステップ、
(d)ステップ(c)の第3のポリヌクレオチド配列によりコードされる選択マーカーの不十分なレベルを発現する細胞株で細胞の増殖を阻害する選択薬剤の濃度を含有する培地中でステップ(c)の該少なくとも1つの細胞を増殖させて、複数の細胞を含む第1の細胞株を作製し、それにより、第1のポリヌクレオチドで形質転換した細胞株で産生される該タンパク質の同等な産生プラトーに達するのに必要とされるよりも少ない増幅ラウンドで、かつ/または低い選択薬剤濃度で第2のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の産生プラトーに達するステップ
を含む。
(i)機能的スプライシング部位、
(ii)対相似領域(例えば、直接、逆、または回文配列)、これは特に発現レベルを低下させ、かつ/または配列間の組み換え率を上昇させる、
(iii)機能的不安定化配列。
[1]治療用タンパク質を産生する細胞株を作製する方法であって、以下のステップ:
(a)少なくとも1種の治療用タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド配列を取得するステップ、
(b)第1のポリヌクレオチド配列を改変して第2のポリヌクレオチド配列を取得するステップであって、第2のポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数が、第1のポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数より大きく、第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドは同じ治療用タンパク質をコードするステップ、
(c)ステップ(b)の第2のポリヌクレオチド配列および細胞内で第2のポリヌクレオチド配列の増幅をもたらすことが可能な選択マーカーをコードするポリヌクレオチド配列で少なくとも1つの細胞を形質転換するステップ、
(d)ステップ(c)の第3のポリヌクレオチドによりコードされる選択マーカーを不十分なレベルで発現する細胞株で細胞の増殖を阻害する選択薬剤濃度を含有する培地中で、ステップ(c)の少なくとも1つの細胞を増殖させ、複数の細胞を含む第1の細胞株を作製するステップであって、それにより、第1のポリヌクレオチドで形質転換した細胞株で産生される該タンパク質の同等な産生プラトーに達するのに必要とされるであろうよりも、少ない増幅ラウンドで、かつ/または低い選択薬剤濃度で、第2のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の産生プラトーに達するステップ
を含む、上記方法。
[2]第1の細胞株をバイオリアクター中で培養し、産生される前記治療用タンパク質を精製する、[1]に記載の方法。
[3]第2のポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数が0.9より大きい、[1]または[2]に記載の方法。
[4]選択薬剤レベルが、第1のポリヌクレオチド配列を用いる同じ方法のために使用される選択薬剤の量と比較して50%未満まで低下する、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]選択薬剤レベルが、第1のポリヌクレオチド配列を用いる同じ方法のために使用される選択薬剤の量と比較して25%未満まで低下する、[4]に記載の方法。
[6]選択薬剤レベルが、第1のポリヌクレオチド配列を用いる同じ方法のために使用される選択薬剤の量と比較して5%未満まで低下する、[5]に記載の方法。
[7]選択薬剤レベルが、第1のポリヌクレオチド配列を用いる同じ方法のために使用される選択薬剤の量と比較して3%未満まで低下する、[6]に記載の方法。
[8]治療用タンパク質を産生する細胞株を作製する方法であって、以下のステップ:
(a)治療用タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド配列を取得するステップであって、該ポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数が0.9より大きいステップ、
(b)該治療用タンパク質をコードする該ポリヌクレオチド配列および細胞株で該治療用タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド配列の増幅をもたらすことが可能な選択マーカーをコードする第2のポリヌクレオチド配列で細胞株を形質転換するステップ、
(c)ステップ(b)の該ポリヌクレオチドによりコードされる選択マーカーを不十分なレベルで発現する細胞の増殖を阻害する上昇濃度または漸増濃度の選択薬剤を含有する培地中で、形質転換された細胞株を増殖させるステップであって、それにより、治療用タンパク質をコードし、0.9未満のコドン最適化指数スコアを有するポリヌクレオチド配列で形質転換した細胞株からの該治療用タンパク質の同じ収量を達成するのに必要とされる濃度と比較して、培地中の選択薬剤濃度が低下するステップ
を含む、上記方法。
[9]前記治療用タンパク質が、抗体、その誘導体または抗原結合性断片である、[1]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[10]前記治療用タンパク質がモノクローナル抗体である、[9]に記載の方法。
[11]形質転換される細胞株が、内在性細胞性酵素の破壊または阻害により、代謝的に欠陥がある、[1]〜[10]のいずれかに記載の方法。
[12]形質転換される細胞株が、ヌクレオシド合成経路に欠陥がある、[1]〜[11]のいずれかに記載の方法。
[13]前記選択マーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)をコードするポリヌクレオチドであり、前記選択薬剤が抗葉酸剤である、[12]に記載の方法。
[14]前記抗葉酸剤がメトトレキサートである、[13]に記載の方法。
[15]前記選択マーカーがグルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチドであり、前記選択薬剤がメチオニンスルホキシミンである、[1]〜[11]のいずれかに記載の方法。
[16]タンパク質産生プラトーに達するのに1回の増幅ラウンドしか必要とされない、[1]〜[15]のいずれかに記載の方法。
[17]最終的な収量が無血清バッチにおいて0.5g/Lより多い、[1]〜[16]のいずれかに記載の方法。
[18]用いるMTX濃度が50nM未満である、[1]〜[17]のいずれかに記載の方法。
[19]用いるMTX濃度が5nMである、[1]〜[14]および[16]〜[18]のいずれかに記載の方法。
[20]前記細胞株が哺乳動物細胞株である、[1]〜[19]のいずれかに記載の方法。
[21]前記細胞株がCHOまたはNS0である、[20]に記載の方法。
[22]第1のポリヌクレオチド配列よりも大きなコドン最適化指数を有する第2のポリヌクレオチド配列で形質転換された第2の細胞株であって、第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドは同じ治療用タンパク質をコードし、該細胞株は第1のポリヌクレオチド配列の増幅をもたらすことが可能な選択マーカーをコードする第3のポリヌクレオチド配列をさらに含み、該第2の細胞株は、両者を選択培地中で増殖させたときに該治療用タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドで形質転換された第1の細胞株と比較して該治療用タンパク質をより高収量で産生する、上記細胞株。
[請求項23]治療用タンパク質をコードし、0.9より大きなコドン最適化指数を有する第2のポリヌクレオチド配列で形質転換され、第2のポリヌクレオチド配列の増幅をもたらすことが可能な選択マーカーをコードする第3のポリヌクレオチド配列をさらに含む第2の細胞株であって、該第2の細胞株は、該治療用タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドで形質転換された第1の細胞株と比較してより高収量の該治療用タンパク質を産生し、該第1のポリヌクレオチドは0.9未満のコドン最適化指数を有する、上記細胞株。
[24]0.9を超えるCAIスコアを有するオープンリーディングフレームを含む少なくとも1つの発現カセット、および増幅・選択マーカーを含む第2の発現カセットを含むベクター。
[25]宿主細胞に含まれる、0.9を超えるCAIスコアを有するオープンリーディングフレームを含む増幅された発現カセットであって、増幅・選択マーカーを含む第2の発現カセットに機能的に連結されている、上記発現カセット。
[26][24]に記載のベクターまたは[25]に記載の発現カセットを含む細胞株。
[27][1]〜[21]のいずれかに記載の方法により取得可能な細胞株またはその子孫。
[28]0.9より大きなCAIスコアを有する、増幅・選択マーカーに機能的に連結されたオープンリーディングフレームを含む細胞株。
[29][1]〜[21]のいずれかに記載の方法により生成される抗体であって、生成された抗体が少なくとも1つの重鎖を含み、5%以下の非グリコシル化重鎖を有する、上記抗体。
[30][1]〜[21]のいずれかに記載の方法を用いて生成される抗体であって、該抗体の重鎖が95%グリコシル化されている、上記抗体。
[31][16]〜[19]のいずれかに記載の方法を用いて生成される抗体であって、該抗体の重鎖が96%グリコシル化されている、上記抗体。
[32][16]〜[19]のいずれかに記載の方法を用いて生成される抗体であって、該抗体の重鎖が97%グリコシル化されている、上記抗体。
[33][1]〜[21]のいずれかに記載の方法を用いて生成される抗体であって、該抗体の重鎖が98%グリコシル化されている、上記抗体。
[34]モノクローナルである、[29]〜[34]のいずれかに記載の抗体。
[35]抗β−アミロイド抗体である、[33]または[34]に記載の抗体。
[36]配列番号18の重鎖配列および配列番号19の軽鎖配列を有する、[35]に記載の抗体。
本発明を以下の実施例により例証するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
1.1 DNAクローニングおよびベクター構築
すべてのDNAクローニングは、確立された、制限酵素に基づくサブクローニングおよびPCRアッセンブリ法を用いて行なった(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Third Edition:Sambrook et al(CSH Laboratory Press)を参照されたい)。発現および選択ベクターの代表的な模式図を示す(図1を参照されたい)。示したベクターはRSVプロモーターを例示しているが、表1に従い異なるプロモーターを用いた。他の点では、ベクターに変更は加えなかった。
CAI最適化ORF配列を研究した実験計画では、これらの配列は所望のオーバーラップしたオリゴヌクレオチドを組み合わせて用い、標準的な融合ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)とその後のクローニングおよび配列確認により作製した。すべて、標準的な方法により行った(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Third Edition:Sambrook et al(CSH Laboratory Press)およびStemmer et al.,Gene.164(1):49−53,1995を参照されたい)。実験計画5(b)および5(c)のORFの最適化された領域の配列は、ヒト/哺乳動物細胞についてのMassaerコドン使用頻度優勢度を用いて設計した(図11を参照されたい)。
EMBOSSから誘導されたEhum.cutコドン使用頻度表である。A欄:コドン配列;B欄:コードされるアミノ酸;C欄:その重複セットのうちの所与のコドンの割合;D欄:1000コドンあたりのコドン数;E欄:この表を誘導するために用いたデータセットでコドンが観察される回数。
懸濁に適応したCHO DG44細胞は、通常、以前に適応させた動物由来成分不含培地中に播種した。この培地は、アミノ酸、微量元素、ビタミン、グルコース、および酵母加水分解物を含有する基本組成からなっていた。この培地には、組み換えインスリン、脂質およびヌクレオシドも添加した。炭酸水素ナトリウムをバッファーとして培地に添加した。当該技術分野では、多くの同等な動物由来成分不含培地処方が公知である。ベクターで形質転換した細胞の最初の選択は、ヌクレオシド除去(DHFR選択のため)およびG418添加(ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ選択のため)により行なった。力価順位付けに関して、96ウェルアッセイ力価は、細胞増殖、播種数、培地供給容量、およびプレートにわたる蒸発動態によりばらつきやすかった。結果として、振とうフラスコ産生モデルで生成された力価が、高収量増幅細胞株での細胞株順位についてより示唆的であった。そのようなモデルのために、すべての細胞を、同じ当初密度で播種した。そのようなモデルでは、生存率および増殖もモニタリングした。
等量(15μg)の重鎖および軽鎖発現ベクターを、200μL容量エッペンドルフ反応中で完了まで直線化し(NotIを用いて)、続いて、エタノール/酢酸ナトリウム沈殿した。次いでペレットを70%エタノール中で洗浄し、風乾し、50μLの分子生物学グレードの水に再懸濁した。
健康な増殖中の細胞、1.2×107細胞(トランスフェクションあたり)を15mLまたは50mL試験管中で遠心(1000rpm、2〜10分)し、15mLの氷冷PBS/スクロース中で洗浄し、再度遠心し、次いで800μLの氷冷PBSスクロース中に再懸濁した。続いて、この細胞懸濁液を、予め調製したDNAに添加し、15分間氷上に置き、その後、冷却したエレクトロポレーションキュベットに移した。
調製したDNAおよび細胞を含むキュベットを、Gene Pulser(25μF、0.38kVに設定)中でエレクトロポレーションし、続いて10分間氷上に戻した。次いで細胞を取り出し、240mLの非選択培地に添加し、40×96ウェルディッシュに非選択培地中で2〜5×103細胞/ウェルで播種した(すなわち、50μL/ウェル)。続いてプレートをホイルでくるみ、37℃、5%CO2で48時間インキュベートした。
エレクトロポレーションの48時間後、150μLの選択培地を各ウェルに添加した。この選択培地は、G418を含有し、ヌクレオシドを含んでいない。それから1週間後、140μLの培地を、定着した細胞層を崩さないように新鮮な選択培地と交換し、3〜4週間後、すべての増殖中のクローン(典型的にはウェルあたり0.1コロニーの増殖、すなわち、96ウェルプレートあたり10ウェルでの増殖)を、抗体産生について力価測定した。続いて、特定された最上位クローン(典型的には20〜100)を、同じ選択培地中で24ウェルディッシュ〜6ウェルディッシュまでスケールアップした。次いでこれらのクローンを96ウェルディッシュに1000細胞/ウェルで播種し(クローンあたり96ウェル)、次いで200μL/ウェルの容量で5nMのメトトレキサートも含有する選択培地にて選択した。さらなる2〜3週間のインキュベーション後、最良クローンを再度スケールアップし、次いで50nM MTX中に1000細胞/ウェルで再び播種した。これらのクローンを、2〜3週間の増殖後に96ウェルプレート中でスクリーニングし、最良クローンをスケールアップして、続いて150nM MTXを用いて96ウェルディッシュに1000細胞/ウェルで播種した。最終的なクローンを産生能について評価するために、続いて150nM MTXでの最良クローンをスケールアップし、振とうフラスコ産生モデルで、生成される生成物の力価および品質について評価した。実験計画5(a)についての最良クローンは、17−9−6−1と名付けられたクローンであった。これは、無血清産生モデルで0.3g/Lの最終力価を生成した。
留意事項:ステップ1.7で必要とされるメトトレキサートのレベルおよび増幅ラウンドの回数は、実験計画および配列がコドン最適化されているかどうかによって変化した。
96ウェルプレートから得た培地サンプルについて、IGEN MシリーズM8/384アナライザー(Bioveris,MaryLand,米国)での自動化96ウェルサンドイッチELISA法により、製造業者の推奨および標準的な方法を用いて、抗体力価を測定した。当該サンドイッチは、ストレプトアビジンコーティング磁気コーティングビーズ、ビオチン化プロテインAおよびルテニウム標識F(ab)2断片からなっていた。次いで、被験サンプルについて生成されたシグナルを、抗体参照標準の希釈系列と比較した。非常に感度が高いアッセイではあるが、96ウェル培養での細胞増殖のばらつきと併せたアッセイのばらつきにより、高収量、増幅細胞株についてのこのアッセイのアッセイ中間精度および再現性は比較的低い。振とうフラスコおよびバイオリアクター産生モデルで得られる培地サンプルについて、比濁法(このアッセイでは、反応溶液中の不溶性の免疫沈降素により光線シグナルが散乱する)により、ベックマン・コールター・イメージシステム(Buckinghamshire,英国)ならびに製造業者の推奨および標準的な方法を用いて、抗体力価を測定した。被験サンプルについて生成されたシグナルを、再度抗体参照標準の希釈系列と比較した。報告するすべての力価は概算である。
典型的には、動物由来成分不含培地を含む通気孔付きのフタをした標準的な250mL組織培養振とうフラスコ中、800,000細胞/mLで、総容量120mLまで、細胞を播種した。続いて、これらのフラスコを二酸化炭素を富化した空気中で振とうしながら、設定された温度でインキュベートし、細胞増殖を促進し、維持した。各クローンについて種々の条件を試験した(例えば、種々の温度条件)。本明細書中で報告する結果では、各クローンについての最も高い力価(標準的な条件にわたる)を例示している。典型的には、本明細書中で報告する産生モデル終点力価は、Vi−Cell(Beckman)での標準的なVi−Cell CHOパラメータ設定および製造業者の推奨プロトコールを用いたトリパンブルー排除に基づくアッセイにより決定して、細胞生存率が約50%まで落ちた時点で記録した。典型的には、この終点力価は、10〜20日間のインキュベーションの後にもたらされた。
すべての場合で、標準的なバイオリアクター培養法および装置を用いた。一連のシードを作製するために、典型的には、細胞をより大きな容量までスケールアップし、反復する3日〜4日法で1週間に2回継代した。図13に示す実験のために、シード細胞を用いて、以下のプロセス条件で駆動された3リットルApplikon卓上バイオリアクター(実施容量:2L)に播種した:温度34℃、pH設定値6.95、DO設定値30%。振とうフラスコモデルの場合と同様に、細胞生存率が約50%に落ちるまで培養を続けた。これらのバイオリアクターは、振とうフラスコならびに治験材料等を供給するために用いるさらに大きなバイオリアクターの両方の終点力価を大まかに模倣する。
MagNA PureならびにRNA High Performance RNA単離キットおよびプロトコール(Roche)を用いる自動化シリカベース抽出により、CHO RNA抽出およびRT−QPCR反応を行なった。ランダムヘキサマーを用いる逆転写に続いて、ABI−7700(Applied Biosystems)を用いてPCR反応を行い、標準的な方法を用いてΔΔCt相対定量アルゴリズムにより解析した。反応を多重にし(18S+標的遺伝子[重鎖/軽鎖])、ここで最も存在量が多い標的である18Sはプライマーを制限し、標的反応の阻害を妨げた。Q−PCRに用いたプローブおよび隣接プライマー対を、配列番号1〜9に従って用いた。
標準的な方法を用い、これは別の文献に詳細に説明されている(例えば、Sambrookら(上掲)を参照されたい)。簡潔には、ポリクローナルな等価な細胞抽出物を、全細胞溶解およびタンパク質抽出バッファーを用いて作製した。等量の各抽出物を、Laemmliローディングバッファーとともに加熱インキュベートし、次いでSDS−Pageゲルにロードし、Tris−グリシン泳動バッファーを用いて泳動し、タンパク質画分を分離した。分離したら、続いてタンパク質をニトロセルロースメンブレンに電気的トランスファーブロッティングし、全抗ヒトIgG(HRPコンジュゲート化)を用いてプローブ付けした。HRP基質とのインキュベーションによりシグナルを生成させ、X線フィルムに記録した。実験計画5(a)のための抗体軽鎖生成物を検出するためには、追加のさらに長い露出が必要であった。
各クローンをメトトレキサートなしで4〜5日間培養した後、10μMのAlexa−Fluor488−メトトレキサート(Molecular Probes/Invitrogen,Paisley)を、18〜22時間、37℃、5%CO2で、700,000個の生存細胞に添加した。続いて染色した細胞を回収し、培地で洗浄し、37℃、5%CO2で30分間インキュベートした。回収した細胞を培地で再度洗浄し、培地中に再懸濁し、濾過し、生/死排除色素であるヨウ化プロピジウム(Sigma,St Louis)を添加した後、BD FACS ARIAで解析した。図14(A)に示したデータは、ゲートされた生細胞のみのものである。
Qiagenから入手した標準的なキットを用いて、CHOゲノムDNA抽出を行なった。分光光度計測定を用いてDNA定量化および標準化を行なった後、ABI−7700(Applied Biosystems)を用いてPCR反応を行い、標準的な方法を用いてΔCt相対定量アルゴリズムにより解析した。Q−PCRに用いたプローブおよび隣接プライマー対は、配列番号20〜25に従い使用した。結果を図14(B)に示す。
驚くべきことに、高いCAIスコアのORFではあるが、しかし天然のスコア(すなわち、LCE1A;NM1783480の後期角化エンベロープなどの最も高い観察される天然のヒトORFのものよりも低くスコア付けされている)である実験計画5(c)が、実験計画5(d)の天然に存在しない高いCAIスコアのオープンリーディングフレームよりも高い最高力価を生成し、5(d)の高産生細胞の範囲(数)が改善された(表5を参照されたい)。続いて、5(a)、(c)および(d)のうち最良のクローンを増幅し、さらに評価した。このさらなる評価のために、5(a)のクローンを対照として進め、本明細書中に記載される結果以前に観察された典型的な実験計画力価を代表させた。この実験の結果、予想外に早く、少ない増幅レベルで、実験計画5(d)から、高産生で安定なクローン(力価および増幅は40回の継代にわたって観察された)がもたらされた。実際、5(d)からの最終的な細胞株を作製するのに必要とされたメトトレキサートのレベルは、実験計画5(a)の非コドン最適化オープンリーディングフレームからの同じタンパク質生成物を同様かより低いレベルで発現する等価な細胞株を作製するのに必要とされるレベルと比較して、顕著に低かった(97%少ないメトトレキサート)(表1を参照されたい)。さらに詳細な解析を実施した。表2〜4を参照されたい。
各実験計画について、引き続くさらなる開発およびバンク化のために選択した最終的なクローンを示す。細胞株開発の各段階での各最終クローンについて生成された96ウェル力価(ng/mL)も強調してある。本明細書中に記載される結果以前に得られた典型的なデータは、抗体実験計画1、2、3および4として代表される。実験計画2と実験計画4とは、同じ生成物を発現することに留意されたい。実験計画2および4に関して、すべての実験は、同じベクター、宿主細胞およびプロトコールを用いて、しかし異なる実験者および装置を用いて、2つの独立した研究室で実施した。0、5、50および150nM MTXでの、以下に示すすべての力価は、96ウェル段階で得られたものである。より高い力価はバッチ産生モデルで顕著な改善を示さなかったので、より低いMTXのクローンを進めた(表2を参照されたい)。FIO=情報としてのみ、必要ではない。実験計画6(a)は、実験計画6(b)〜6(d)からのよりよい力価によって、プラトーに達する前に中止された。
標準的トランスフェクションにより作製された非増幅細胞と、選択プロトコールにより作製され、続いてヌクレオシド除去およびG418添加により選択された非増幅細胞との比較である。すべての細胞株は、(実験計画5の)同じ抗体を発現する同じベクターであるが、抗体が、異なるCAIスコアを有してこれをコードするオープンリーディングフレームから発現されるベクターを含んでいる。実験計画5(a)(非最適化)のために、3回のさらなるトランスフェクションを実施したが、結果が基本的にバックグラウンドであったため、示していない。図(A)では、「5ngを超える力価の%」とは、スクリーニング後に5ng/mLを超える力価を示したウェルの割合(%)を意味し、「50ng/mLを超える力価の%」とは、スクリーニング後に50ng/mLを超える力価を示したウェルの割合(%)を意味する。「最上位力価」とは、スクリーニングしたすべてのうちで最高スコアの力価を意味する。「50位値」とは、スクリーニングした50番目に高い力価を意味する。「20位値」とは、スクリーニングした20番目に高い力価を意味する。(B)では、(A)で報告した最上位、20位および50位の力価をヒストグラム形式で表している。
表1の実験計画の96ウェルプレートでの詳細な力価分析である。G418添加およびヌクレオシド除去選択後であるが、メトトレキサート添加を用いていない、最良クローンおよび50番目によいクローンの力価を示している。
実験計画5および6で観察された上位20〜100位のクローンを、続いて6ウェルディッシュまでスケールアップし、その後、5nMメトトレキサートを含有する培地中で96ウェルプレートに再度播種した。96ウェルディッシュで、5nM(A1)および50nM(A2)濃度のメトトレキサート抗葉酸剤で選択した、実験5および6で観察された増殖中のクローンの平均力価および最高力価を示す。
産生プラトーの実施例である。実施例(A):実験計画5(d)のために最終的に選択したクローンを、50nMのMTX中でさらに増幅した。親クローン(網かけ)の無血清産生モデル力価および得られた「増幅」娘クローンの最高力価を示す。同様の実施例(B、C、D、E、F、G)も示す。各実施例について、さらなる増幅後の娘クローンの最高力価を記録している。
抗体6のために重鎖および軽鎖の両方のオープンリーディングフレームのコドン最適化を実施し、ORFにわたって0.9を超える最終的なCAIスコアを再びもたらした(表1を参照されたい)。野生型/出発オープンリーディングフレームおよびコドン最適化オープンリーディングフレームを、RSVに基づくプロモーター発現ベクターならびにヒト伸長因子−1α(EF−1a)プロモーターに基づく発現ベクター(cis作用インスレーター、エンハンサーおよびプロモーター発現エレメントを代わりに非ウイルス性プロモーター供給源から供給している)で発現させた。この実験の結果はまた、所望のタンパク質のオープンリーディングフレームを最初にコドン最適化した場合、最終的な高産生細胞株を得るのに、顕著に少ないメトトレキサートが必要であったことを実証した。実際に、抗体6が非最適化ORF(すなわち、0.9未満のCAIスコア)によりコードされていたトランスフェクション6(a)は、産生プラトー付近の細胞の作製前に、5nM MTXの段階で中止された。0.9を超えるORFを用いた細胞株(すなわち、トランスフェクション6(b)および6(d))からすでに得られていた収量と比較して、同等なタンパク質収量を産生することが可能な細胞株を作製するのには、顕著により多くの資源および時間が必要であろうことが明らかであったので、トランスフェクション6(a)では増幅法をさらに行なわなかった。さらに、コドン最適化ありまたはなしの同一条件のベクターを比較した場合、コドン最適化は常に、必要とされる抗葉酸剤レベルを低減させたことが観察された。また、実験計画7のために、実験計画6と同様にしてコドン最適化を実施し(表1を参照されたい)、コドン最適化したORF(0.9を超えるCAI)を、RSVならびにEF−1aプロモーターに基づく発現ベクターで発現させた。またしても、プロモーターに関係なく、CAI最適化ORFからは、組み換え産物をコードするために非最適化ORFを用いたすべての以前の実験計画と比較して、同等の高収量細胞株が、より早い時間で、より少ないメトトレキサートを用いて作製された(表1にまとめてある)。
この方法についてさらに研究するために、生成されるmRNAのレベルに対するコドン最適化の影響を、同じベクターから、しかし異なるCAIスコアを示すオープンリーディングフレームからの同じ生成物(実験計画5の抗体)を発現する同一条件のポリクローナル細胞集団で調べた。
(A):RT−QPCRにより測定したHCおよびLCメッセンジャーの細胞内RNAレベルである:リボソームRNAに対して標準化したすべてのシグナルおよび増加倍率は、非コドン最適化オープンリーディングフレームによりコードされる出発HCおよびLCについて生成されたシグナルに対するものである。Y軸:RNAシグナルの0〜50倍増加にわたる値である。X軸:a(h)は、非トランスフェクション細胞から取得したRNA抽出物から生成された陰性対照HCシグナル(二重)を表す;b(h)は、実験計画5(a)について用いたのと同様の非コドン最適化HCおよびLC発現ベクター(CAIスコアは、HCについて0.809、LCについて0.761)でトランスフェクションした細胞に由来するRNA抽出物から生成されたHCシグナルを表す;c(h)は、実験計画5(b)で用いたのと同様のコドン最適化HCおよびLC発現ベクター(CAIスコアは、HCについて0.847、LCについて0.833)でトランスフェクションした細胞に由来するRNA抽出物から生成されたHCシグナルを表す;d(h)は、実験計画5(c)で用いたのと同様のさらなるコドン最適化HCおよびLC発現ベクター(CAIスコアは、HCについて0.872、LCについて0.894)でトランスフェクションした細胞に由来するRNA抽出物から生成されたHCシグナルを表す。上記のものと同じRNA抽出物から生成された軽鎖シグナルは、a(l)、b(l)、c(l)およびd(l)にそれぞれ示されている。
(a)実験計画8のために、Letoソフトウェアを用いて可変ドメインを設計した。続いて、それらを、実験計画7のために予め作製した同一の定常ドメインと、標準的な制限酵素消化・ライゲーション法を用いて融合させた。得られた重鎖および軽鎖ORFのスコアは、それぞれ0.954および0.919であった。次に、これらを細胞株開発計画に用い、またしても、これまでにコドン最適化前に用いたどれよりも、より早い時間枠で、より少ないメトトレキサートで、高収量細胞株がもたらされた(表1を参照されたい)。
両方の状況で、発現のために同じ宿主、培養培地およびDHFR選択・増幅系を用いたにもかかわらず、非最適化オープンリーディングフレームから発現させた場合に生成されるレベルと比較して、コドン最適化オープンリーディングフレームから発現させた場合に、非グリコシル化重鎖(NGHC)のレベルが顕著に低いことが明らかになった。さらに興味深いことに、同様な高レベルのNGHCは、同じ非最適化オープンリーディングフレームを、異なる培養条件および異なるベクター、選択・増幅法(グルタミン合成酵素/MSX)を用いて異なる宿主細胞で代わりに発現させた場合にも見られた(図12を参照されたい)。オープンリーディングフレームのコドン最適化と非グリコシル化重鎖の低下したレベルとのこの相関は、オープンリーディングフレームのCAIスコアを上昇させることによって、生成物の全体的な品質も向上させられることを明らかにする。
ベクター構築および細胞株開発は、推奨されたLonza(Slough)プロトコールに従い実施した。すべての場合で、用いた培地はCD−CHO(Invitrogen)であった。非最適化オープンリーディングフレームを有する抗体実験計画5(a)で用いたオープンリーディンフレームを、最初にLonzaベクターpEE14.4(軽鎖に対して)およびpEE6.4(重鎖に対して)にサブクローニングした。続いて、これらのベクターを推奨Lozaプロトコールに従って組み合わせて、重鎖及び軽鎖を発現する単一の二遺伝子ベクターにした。次に、このベクターを、Lonza推奨使用説明書に従って、エレクトロポレーションを用いて、CHOK1SV宿主細胞と名付けられたLonza懸濁液適合CHOK1株に送達し、これもまた推奨であるグルタミン除去およびMSXの添加を用いて、選択および増幅した。得られたクローンを96ウェルで力価測定し、最良クローンを振とうフラスコにスケールアップして、さらに評価した。最良クローンを選択し、大規模バイオリアクターで生成物を生成した。このアプローチに関するさらなる一般的な詳細については、de La Cruz Edmondsら、2006 Molecular Biotechnology 34:179−190を参照されたい。
プロテインAカラムを用いて、培養上清からタンパク質を精製した。次に、生成物をSDSキャピラリー電気泳動バイオアナライザーラボチップ(Lab-on-a-chip)装置(Agilent Technologies,Cheshire,英国)を用いて、還元条件下で、製造業者のプロトコールに従って分析した。非グリコシル化重鎖は、主要なグリコシル化重鎖分子種と比較してわずかに速く移動する分子種として観察される(図12Bを参照されたい)。
DHFR選択系での漸増量のMTX選択・増幅薬剤の追加のまたは段階的な力価測定を、遺伝子コピー数の増加により発現を増加させるために行なう。トランスフェクションされたプラスミドDNAの遺伝子コピー数に対するコドン最適化の影響を調べるために、2種類の異なる半定量法を用いた(実験の説明については、1.13節および1.14節を参照されたい)。
Claims (18)
- 少なくとも1種の治療用タンパク質を産生する哺乳動物細胞株を作製する方法であって、以下のステップ:
(a)少なくとも1種の治療用タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド配列を取得するステップ、
(b)第1のポリヌクレオチド配列を改変して第2のポリヌクレオチド配列を取得するステップであって、第2のポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数が、第1のポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数より大きく、第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドは同じ治療用タンパク質をコードする、ステップ、
(c)哺乳動物細胞株の少なくとも1つの第1の細胞を、ステップ(a)の第1のポリヌクレオチド配列、および該細胞内で第1のポリヌクレオチド配列の増幅をもたらすことが可能な選択マーカーをコードする第3のポリヌクレオチド配列で形質転換し、さらに
前記哺乳動物細胞株の少なくとも1つの第2の細胞を、ステップ(b)の第2のポリヌクレオチド配列、および該細胞内で第2のポリヌクレオチド配列の増幅をもたらすことが可能な選択マーカーをコードする前記第3のポリヌクレオチド配列で形質転換するステップ、
(d)ステップ(c)の前記少なくとも1つの第1の細胞を増殖させ、複数の細胞を含む第1の細胞株を作製するステップであって、(i)ステップ(c)の第3のポリヌクレオチドによりコードされる選択マーカーを不十分なレベルで発現する該細胞株の細胞の増殖を阻害し、かつ(ii)遺伝子コピー数を増加させる、選択・増幅薬剤の濃度または漸増濃度を含有する培地中で増殖を行う、ステップ、
ステップ(c)の前記少なくとも1つの第2の細胞を増殖させ、複数の細胞を含む第2の細胞株を作製するステップであって、(i)ステップ(c)の第3のポリヌクレオチドによりコードされる選択マーカーを不十分なレベルで発現する該細胞株の細胞の増殖を阻害し、かつ(ii)遺伝子コピー数を増加させる、選択・増幅薬剤の濃度または漸増濃度を含有する培地中で増殖を行う、ステップ、
(e)前記第2の細胞株において第2のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の産生プラトーに達したら、前記第2の細胞株を選択するステップ
を含み、ここで、選択・増幅薬剤の前記濃度が、第1のポリヌクレオチドで形質転換した前記第1の細胞株において産生される前記タンパク質の同等な産生収量に達するのに必要とされるよりも低い、上記方法。 - 前記第2の細胞株において産生される第2のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の産生プラトーが、第1のポリヌクレオチドで形質転換した前記第1の細胞株において産生される前記タンパク質の同等な産生収量に達するのに必要とされるよりも少ない増幅ラウンドで達成される、請求項1に記載の方法。
- 第2の細胞株をバイオリアクター中で培養し、該細胞株により産生される前記治療用タンパク質を精製する、請求項1または2に記載の方法。
- 第2のポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数が0.9以上である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 選択・増幅薬剤の濃度が、第1のポリヌクレオチド配列を用いる同じ方法のために使用される選択・増幅薬剤の濃度と比較して50%まで、または50%未満まで、または25%未満まで、または5%未満まで、または3%未満まで低下する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞株によって産生される前記治療用タンパク質が、抗体、その誘導体または抗原結合性断片である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞株によって産生される前記治療用タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項6に記載の方法。
- 形質転換される哺乳動物細胞株が、内在性細胞性酵素の破壊または阻害により、代謝的に欠陥がある、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 形質転換される哺乳動物細胞株が、ヌクレオシド合成経路に欠陥がある、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記選択マーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)をコードするポリヌクレオチドであり、前記選択・増幅薬剤が抗葉酸剤である、請求項9に記載の方法。
- 前記抗葉酸剤がメトトレキサート(MTX)である、請求項10に記載の方法。
- 前記選択マーカーがグルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチドであり、前記選択・増幅薬剤がメチオニンスルホキシミン(MSX)である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質産生プラトーに達するのに1回の増幅ラウンドしか必要とされない、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞株によって産生される前記治療用タンパク質の最終的な収量が無血清バッチにおいて0.5g/Lより多い、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 用いるMTX濃度が(a)50nM以下である、または(b)5nMである、請求項1〜11、13および14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞株がCHOまたはNS0である、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1種の治療用タンパク質を産生する哺乳動物細胞株を作製する方法であって、以下のステップ:
(a)細胞株を、(i)治療用タンパク質をコードし、かつ0.9以上のコドン最適化指数を有する配列と、(ii)ポリヌクレオチド配列の増幅をもたらすことが可能な選択マーカーをコードする配列とを含むポリヌクレオチド配列で形質転換するステップ、
(b)選択薬剤の存在下で少なくとも1回の増幅ラウンドを行うステップ、
(c)前記治療用タンパク質の産生プラトーに達したら、前記細胞株を選択するステップ
を含み、ここで、該治療用タンパク質をコードし、かつ0.9未満のコドン最適化指数を有する配列と比較して、50%以下の選択・増幅薬剤が、同等な産生収量に達するのに必要とされる、上記方法。 - (a)選択・増幅薬剤がMSXもしくはMTXである、および/または
(b)同等な産生収量に達するのに1回の増幅ラウンドが必要とされる、
請求項17に記載の方法。
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