KR101637533B1

KR101637533B1 - 제조 방법

Info

Publication number: KR101637533B1
Application number: KR1020107006104A
Authority: KR
Inventors: 마크 유덴; 에카테리니 코트솝오울오우
Original assignee: 글락소 그룹 리미티드
Priority date: 2007-08-20
Filing date: 2008-08-19
Publication date: 2016-07-11
Also published as: US10633673B2; JP2010536358A; KR20100065332A; CN101848936B; CA2695484C; BRPI0815576A2; JP5592258B2; EP2185591A1; US20160010111A1; WO2009024567A1; EP3216802B1; ES2473623T3; CN101848936A; EP3216802A1; AU2008290607A1; JP6029625B2; US9163249B2; EA201000205A1; ES2840725T3; DK3216802T3

Abstract

본 발명은 원하는 오픈 리딩 프레임의 코돈을 변형시킴으로서 단백질 발현 세포주를 생성시키는데 소요되는 시간 및 증폭 사이클의 수, 필요한 적정가능 선택 압의 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 목적을 위한 코돈 변형(codon adaptation)의 이용을 통해 본 발명의 방법은 세포주 개발 활동에서 많은 시간(week)을 절약하면서 빠른 시간 프레임으로 충분한 수율을 일정하게 제공한다. 게다가 본 발명의 방법은 또한 종래 달성가능한 것보다 더 낮은 농도의 선택 및 증폭제를 이용해 세포주를 생성시킨다. 따라서 최종 세포주에서 더 낮은 수준의 선택 및 증폭 마커가 관찰된다.

Description

제조 방법 {PRODUCTION METHOD}

본 발명은 치료용 단백질을 분비할 수 있는 세포주의 생산 방법을 제시한다. 본 방법은 프로토콜 타임라인을 감소시키고, 예를 들어, 선택 및 증폭 시스템을 통해 세포주를 생산하는 항체를 생성할 때 필요한 안티폴레이트(antifolate)의 농도를 감소시키도록 개조된 유전자 서열의 코돈의 용도를 포함한다.

CHO(Chinese Hamster Ovarian cells), NSO 및 PerC6와 같은 포유류 세포는 일반적으로 생물의약품 제조를 위한 생물 의약 산업에 이용된다. 이 세포들은 유전적으로 조작되고, 이후 세포주 결과물이 생물반응기(bioreactor) 안에서 배양될 때 원하는 단백질의 발현이 높은 역가(titre)로 관찰되는 것을 보장하는 방식으로 선택된다.

현재 상기 목적을 위한 최상의 세포를 조작하고 선택하기 위한 수많은 방법들이 존재한다. 종종 이 방법들은 합성된 발현 벡터의 복제 수를 증가시키기 위한 '증폭(amplification)'을 포함하거나 또는 원하는 단백질의 관찰 수율을 증가시키기 위한 벡터를 포함한다. 이 '증폭' 방법은 Bebbington과 Hentschel(DNA Cloning Volume Ⅲ(IRL press, 1987))에 의해 이미 잘 설명되었다. 저자들은 다수의 선택가능한 마커(이것은 종종 신진대사와 관련한 효소를 엔코딩하고 일정한 배양 배지 조건 하에서 숙주 세포의 생존에 필수적인 핵산 서열의 형태를 하고 있다)는 원하는 단백질을 발현하도록 설계된 발현벡터와 작동가능하게 연결될 수 있어서 선택가능 마커에 대한 선택, 또는 원하는 단백질의 발현에 대한 선택을 할 수 있다고 설명한다. 그러나 이와 같은 선택 후에, 원하는 단백질 역가 결과가 일반적으로 충분히 높지 않기 때문에, 선택된 세포는 또한 '증폭' 단계를 거쳐야 한다. 이 단계는 보통은 선택가능한 마커를 억제하는 일정한 독성약물로 세포를 처리하는 것을 포함한다. 이와 같은 억제를 통하여, 상기 마커의 발현 수준이 증가된 세포 집단이 선택될 것이다. 종종 이것은 작동가능하게 연결된 발현 카세트(expression cassettes)의 발현 수준의 증가 또한 야기한다. 이와 같이 증가된 발현 또는 '증폭'은 보통 선택가능한 마커 및 이와 작동가능하게 연결된 발현 카세트의 복제 수 증가를 야기하는 유전체 재배열 때문에 발생한다. 종종 이와 같은 '공동-증폭(co-amplification)'을 통해, 최상의 클론 결과물이 원하는 단백질 또는 단백질을 적절하게 고 수준으로 생산하는데 사용되도록 역가를 충분하게 향상시켰다. 증폭 단계에 있는 각각의 세포의 벡터 복제수를 추가적으로 조사할수록, 단백질 생산의 '안정기(plateau)'에 도달할 때까지는 벡터 복제수가 상승되는 것이 관찰되었고, 관찰된 생산 수준은 일반적으로 유전자 복제 수의 증가에 비례한다(Bebbington 및 Hentshcel ibid).

많은 다양한 선택가능한 마커들이 증폭에 적합하고 이러한 증폭가능한 선택 마커들은 현재까지도 확인되고 있다. 확인된 마커 각각은 또한 선택 및 증폭 단계 동안 세포 배양 배지에 첨가되는 '선택 및 증폭' 시약('selection 및 amplification' agent)과 결합된다. 이 선택가능한 마커/시약 조합물의 예는 아데노신 디아미나아제(adenosine deaminase)/디옥시코폴마이신(deoxycoformycin), 아스파테이트 트랜스카바밀레이즈(aspartate transcarbamylase)/N (포스포아세틸)-L-아스파테이트, 디하이드로폴레이트 환원효소/메토트렉세이트(methotrexate), 글루타민 합성효소/메티오닌 설폭시민(methionine sulphoximine), 메탈로티오네인-1(metallthionein-1)/중금속, 다중-약제 내성(multi-drug resistance)/아드리아마이신(문헌 [Bebbington 및 Hentschel ibid, Kellems 1991; Current Opinion in Biotechnology 2: pp723-729]을 참조)을 포함한다. 추가적으로, 최근에 네오마이신/G418 및 제오신(zeocin)에 대한 저항성을 부여한 것과 같은 항생제 선택 마커는 때때로 복제 수를 증가하는데 사용될 수 있고, 적절한 동종의 선택 및 증폭(항생제-기반한) 선택가능한 시약((e.g. Sauttle 및 Enenkel: Biotech Bioeng 2004 89 pp530-538, 및 Kwaks et al: Nature Biotech 2003; 21; pp553-558))과 조합될 때 때때로 선택 및 증폭 마커로서도 사용될 수 있다고 보고되었다.

상기 목적을 위해 유전적으로 조작된 최상의 세포를 선택하기 위한 수많은 방법들이 존재하며, 가장 일반적으로 사용되는 두 가지 선택압(selection pressure)은 선택 방법에 기초한 글루타민 합성효소(GS) 및 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)이다.

GS 방법은 글루타민 합성효소 발현 카세트와 치료용 단백질 발현 카세트 또는 카세트들의 효과적인 연결을 포함한다. 후속하여 작동가능하게 연결된 벡터는 세포로 전달되고 벡터 염색체 통합체(vector chromosomal integration)는 상기 세포가 배양된 배지로부터 글루타민의 투여 중지 또는 고갈에 의해 선택된다. 내생 숙주 세포 수준 그 이상을 넘어서는 글루타민 합성효소 활성이 선택되어 지도록 보장하기 위해서 메티오닌 설폭시민(MSX)과 같은 글루타민 합성효소 억제제가 종종 배양 배지에 첨가된다. 대안적인 DHFR 선택 방법은 DHFR 선택압과 치료용 단백질 발현 카세트 또는 카세트들의 그것과의 효과적인 연결을 포함한다. 작동가능하게 연결된 벡터는 세포로 전달되고 벡터 염색체 통합체는 누클레오시드(예를 들어, 하이포잔틴(hypoxanthine) 및 티미딘(thymidine))의 투여중지 또는 고갈에 의해 선택된다. 전형적으로 DHFR 방법에서, CHO DG44 또는 CHO DUX-B11과 같은 DHFR-음성 숙주 균주(DHFR-negative host strains)를 사용하는 것이 일반적이다. 또한 메토트렉세이트(MTX)와 같은 선택 및 증폭제가 일반적으로 사용된다.

유전자 복제 수를 증가시킴으로서 발현을 증가시키기 위해 각각의 GS 및 DHFR 선택 시스템에서 MSX 또는 MTX 선택 및 증폭제의 양을 증가시키는 첨가 또는 단계적 적정을 종종 시행한다. 이 방법은 선택 및 증폭제를 세포 배양에 직접적으로 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로 상기 시약을 그 세포 배양 속에서 사용된 배지에 우선하여 성장 배지에 첨가할 수 있다. 이와 같은 시약을 세포 배양을 위해 사용된 배지 또는 세포 배양에 직접적으로 첨가 또는 적정하는 것을 일반적으로 '증폭'이라고 한다. 예를 들어, GS 시스템에서, MSX 수준은 500μM 까지 및 이를 초과하여 증가 되거나 첨가될 수 있는 반면, DHFR 시스템에서는, MTX 안티폴레이트 수준이 1μM 농도 수준까지 및 이를 초과하여 증가 되거나 첨가될 수 있다. 이와 같은 시약을 상기와 같은 방법으로 이용함으로서 배양기간을 거쳐 새로운 선택제 농도 속에서 자라는 세포를 선택할 수 있고, (증폭 "라운드(round)"라 불리는 각각의 농도 단계), 선택압을 가지는 유전체의 범위는 확장될 수 있으며 그에 의해 선택 가능한 마커의 복제 수도 증가한다는 것이 밝혀지고 있다. 따라서 선택 가능한 마커가 작동가능하게 치료용 단백질 발현 카세트에 연결되었을 때, 이 카세트는 또한 증폭될 수 있다. GS 및 DHFR 선택 시스템을 사용할 때, 적절한 선택 및 증폭제를 사용함으로서, 원하는 단백질의 수율을 '생산 안정기(production plateau)'에 도달할 때까지 상당히 증가시킬 수 있다(Bebbington 및 Hentschel (ibid)를 참조). 결과적으로, 이와 같은 선택 및 증폭을 통해 성장한 클론을 역가/수율(titre/yield)로 스크린하고 최상의 클론을 선택하며 뒤이어 평가한다. 상기 클론을 이와 같은 적정 및 스크리닝으로부터 일반적으로 확인하고 후속하여 원하는 단백질 또는 단백질들의 생산을 위해 사용한다.

일반적으로 증폭 '라운드'의 수 및 사용된 선택 및 증폭제의 농도 두 가지는 선택 및 증폭 프로토콜에서 고정되거나 정해지지 않는다. 대신에 그것은 일반적으로 선택 및 증폭 단계 동안 점진적으로 생산 임계값(threshold) 또는 안정기에 도달되는 지점까지 급박하게 증가된다. 특히 항체가 발현되는 때, 본 발명자들 및 다른 연구자들은 이 안정기에 도달한 클론이 전류 연장 비유가식(current extended unfed batch) 배양 모델 및 리터당 0.3g 내지 0.5g 범위의 생산 생물 반응기(production bioreactors) 안에서 최종 역가를 생산하는 것을 관찰하였다. 이것은 일반적으로 이와 같은 비유가식 배양 조건하에서 10-100pg/세포/일당(pg/cell/per day) 범위의 세포 생산성(Qp)으로 변환된다. 그러나 Qp(pg/세포/일당으로 표현되는)가 매우 중요하다는 것은 잘 알려진 반면, 가장 높은 Qp를 가지는 클론이 항상 가장 높은 용적 역가(volumetric titres)를 초래하는 것은 아니기 때문에 이것은 생산성의 독점적인 결정요소는 아니다. 최근 리뷰에 대한 문헌[Wurm 2004; Nature Biotechnology VoI 22; pp1393-1398]을 참조.

선택 및 증폭 방법은 임상 실험에 사용되는 원하는 단백질을 만들기 위한 제조 캠페인(manufacturing campaigns)에 사용되는 세포주를 생성하는데 성공적으로 사용된다. 그러나 선택 및 증폭 방법론에 의해 생성되는 역가는 충분한 반면, 이 방법들은 여전히 시간, 비용 및 안전성을 포함하는 여러 가지 이유에 의해 바람직하지 못하다. 예를 들어, 세포주 '증폭' 프로토콜 하에서 증폭의 적정 및 선택제는 클론 선택 및 콜로니 성장을 지연시키고, 각 증폭 라운드는 완성되기까지 한 달 또는 그 이상이 소요된다. 둘째, 메토트렉세이트 및 메티오닌 설폭시민과 같은 선택 및 증폭제는 독성 화학물질로, 만일 이것이 치료적으로 사용된다면 즉시 제거되어야 한다. 셋째, 포유류 세포에서 선택 및 증폭제 저항성이 발생할 수 있고, 이것은 덜 긴박한 선택압을 유발하고 클론 및 생산 수율의 불안정성을 유발할 수 있다. 넷째, 증폭은 가끔 에피솜(episome)으로 발생할 수 있다. 이 에피솜 및 임의의 효율적으로 연결된 기능적 발현 카세트는 증가된 변이 및 배양의 불안정성을 유발하면서 세포 분열 동안 항상 동등하게 유전되지 않는다. 다섯째, 증폭 프로토콜 동안 일어나는 유전체 재배열은 클론 결과물에 다양한 표현형을 유발하면서 숙주 세포 유전체에 상당한 변화를 가져올 수 있다. 여섯째, 폴리글루타메이티드 메토트렉세이트(polyglutamated methotrexate)와 같은 선택 및 증폭제 부산물은 세포의 추가적인 기능을 억제할 수 있다(예를 들어, Allegra et al 1985 J Biological Chem 260;17 pp9720-9726). 일곱째, 이 선택 및 증폭제의 다수는 또한 세포를 배양하고 생물 반응기를 작동하는데 관여하는 오퍼레이터(operator)가 이 시약에 높은 수준로 노출될 경우 이들에 대해 잠재적으로 독성을 가진다. 여덟째, 포유류 숙주 세포 속에 통합된 발현 벡터의 복제 수의 증가는 통합된 발현 벡터(예를 들어, 문헌[McBurney MW et al Exp Cell Res 2002 274:1-8]을 참조) 각각으로부터 궁극적으로 발현 수준을 감소시킬 수 있는 숙주세포에 의해 반복-유래된-유전자-침묵(repeat-induced-gene-silencing)(RIGS) 활동성의 증가를 야기할 수 있다.

따라서, 치료용 단백질의 동일한 최종 수율을 얻는 동안 선택 및 증폭제의 감소된 수준으로, 증폭의 감소된 라운드 수 안에서 선택 및 증폭 방법론을 사용하는 것이 매우 바람직할 것이고, 이 경우 최종 세포주 생성하는데 소요된 시간은 빨라지고/빨라지거나 최종 라인을 생성하는데 필요로 된 원치 않는 독성 시약의 수준은 세포주 생성, 선택 및 배양되는 동안 감소되거나 전부 제외될 것이다(M. Celina de Ia Cruz Edmonds et al (MoI Biotechnology 2006 34:179-190)).

64개 3중 염기쌍 코돈(triple base-pair codon)의 조합으로 20개 아미노산밖에 만들지 못하는 것과 같이, 유전 암호의 중복성(redundancy)이 있다는 것은 지난 수 십년간 알려진 사실이다. 그러나, 발현을 증가시키기 위한 코돈 편중(codon bias)의 이용은 1980년대까지 실현되지 못했다. 예를 들어, 1982년 Bennetzen 및 Hall (J Biol Chem 257 pp3026-3031)은 원핵생물과 진핵생물 두 가지 모두 강하게 발현된 유전자에서 종의 특정 코돈 편중을 발견하였다. 그들은 또한 이 편중은 분류학적으로 다르다는 점에 주목하였다. 그 결과 오픈 리딩 프레임(open reading frames)의 코돈 사용빈도를 변형시켜 재조합 발현 시스템에서 발현을 증가시킬 수 있음이 곧 밝혀졌다. 예를 들어, Kotula 및 Curtis(Biotechnolgy NY (1991) 9: 1386-9)는 오픈 리딩 프레임의 코돈 변형에 의해 효모 안에서 포유류 항체 경쇄의 발현을 상당히 증가시켰고, 상기 코돈의 사용은 고 발현된 내생 효모 유전자에 의해 선호된 코돈으로 치우치는 경향이 있다. 또 다른 주목할만한 예는 녹색 형광 단백질이 포유류 세포 안에서 발현이 증가하도록 코돈 변형된 것이다(Zolotukhin S J Virol (1996) 70: 4646-54 및 Yang et al Nucleic Acids Res 1996 24:4592-3).

최근 데이타는 항체의 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 오픈 리딩 프레임의 코돈 변형 지수(CAI) 스코어를 증가시킴으로서, 변형된 발현 카세트 결과물이 글루타민 합성효소 선택가능 마커와 작동가능하게 연결되었을 때 및 세포가 MSX 선택 및 증폭제와 함께 배양되었을 때 포유류 숙주 세포 안에서 생산 수율을 한계적으로 증가시킬 수 있음을 시사하였다. 이 데이타(the IBC 2005 Cell Line Development 및 Engineering Conference에 제시됨)는, 평균 발현 수준은 현저하게 증가하지 않은 반면, 군 안에 중간 양성 코돈은 한계적으로 증가(37.8μg/ml에서 51.3μg/ml까지)하였으나 두 중쇄 및 경쇄의 오픈 리딩 프레임이 코돈 변형되었을 때뿐임을 시사하였다. 더욱 최근에 M. Celina de Ia Cruz Edmonds(ibid)등은, 또한 선택 및 증폭제의 도움으로 원하는 단백질을 발현하는 조작된 세포주를 생성시킬 때, 선택 및 증폭제의 수준을 감소시킬 필요성을 인식하였다. 그들은 형질감염된 세포의 시딩 밀도(seeding density)의 변형을 통해, 사용된 MSX 수준을 감소시킬 수 있고, 원하는 단백질을 동등 또는 더 높은 수준으로 발현하도록 유전적으로 조작된 세포주를 생성하고 유지하기 위해 필요한 주(weeks)의 수를 감소시킬 수 있다고 설명하였다.

최근 공표된 연구는 글루타민 합성효소 선택가능 마커의 용도와 연관된 코돈 최적화의 접근법이 조사되었다. 예를 들어, Kawley 등(Molecular Biotechnology 2006 Vol 34; pp151- 156)에 의해 수행된 연구는 코돈 변형이 후속하여 생성된 발현 수준에 미친 영향을 평가하였지만, 보고된 결과는 성취된 발현 수준이 단지 작게 개선되었음을 시사하였다.

훨씬 더 최근에 Carton등(Protein Expression 및 Purification 55 (2007) pp279-286)은 또한 코돈 최적화의 영향을 조사하였다. 그들의 연구는 다양한 접근법에 의한 경쇄 및 중쇄 항체 오픈 리딩 프레임의 부분 코돈 최적화(part 코돈 optimisation)를 포함한다. 이 변형된 코딩 서열은 골수종 세포(myeloma cells) 안에서 gpt 선택 가능 마커와 작동가능하게 연결된 발현 카세트안의 소형 유전자 형태(mini-gene formats)(인트론을 포함함)으로 발현된다. 증폭 접근법은 논의되지 않았다.

당 업계에서는 증폭 가능한 선택 마커와 작동가능하게 연결된 발현 시스템을 사용할 때 필요한 선택 및 증폭제의 수준을 감소시킬 필요가 있다.

발명에 대한 설명

본 발명은 원하는 오픈-리딩-프레임의 코돈을 변형시킴으로서 단백질 발현 세포주를 생성시키는데 소요되는 시간, 증폭 사이클 수, 필요한 적정가능 선택가능 압력 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 목적을 위한 코돈 변형의 이용을 통해, 본 발명의 방법은 세포주 개발 활동에서 많은 시간을(weeks) 절약하면서 더빠른 시간 프레임으로 충분한 수율을 일정하게 제공한다. 게다가 본 발명의 방법은 또한 종래 달성가능한 것보다 더 낮은 농도의 선택 및 증폭제를 이용해 세포주를 생성한다. 따라서 최종 세포 안에서 더 낮은 수준의 선택 및 증폭 마커가 관찰된다.

본 발명은 하기의 단계를 포함하는 치료용 단백질을 생산하는 세포주를 생산하기 위한 방법을 제공한다:

a) 상기 치료용 단백질을 엔코딩하는 제 1 폴리누클레오티드 서열을 획득하는 단계,

b) 상기 제 1 폴리누클레오티드 서열을 변형시켜 제 2 폴리누클레오티드 서열을 획득하는 단계로서, 상기 제 2 폴리누클레오티드 서열의 코돈 변형 지수는 상기 제 1 폴리누클레오티드 서열의 코돈 변형 지수보다 높고 상기 제 1 및 제 2 폴리누클레오티드가 동일한 치료용 단백질을 엔코딩하는 단계,

c) 단계 (b)의 상기 제 2 폴리누클레오티드 서열 및 세포 안에서 상기 제 2 폴리누클레오티드 서열의 증폭을 제공할 수 있는 선택 마커를 엔코딩하는 제 3 폴리누클레오티드 서열로 하나 이상의 세포를 형질전환시키는 단계,

d) 다수의 세포를 포함하는 제 1 세포주를 생성하기 위해 단계 (c)의 하나 이상의 상기 세포주를, 단계 (c)의 상기 제 3 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩되는 선택 마커를 불충분한 수준으로 발현시키는 상기 세포주 내의 세포의 성장을 억제하는 소정 농도의 선택제를 포함하는 배지 안에서 배양하여, 상기 제 2 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩되는 단백질의 생산 안정기가 더 적은 증폭 라운드를 거쳐 도달되고/도달되거나 상기 제 1 누클레오티드로 형질전환된 세포주에서 생산된 상기 단백질의 동등한(equivalent) 안정기에 도달되는데 필요한 것보다 더 낮은 농도의 선택제에서 도달되는 단계.

본원에 기재된 것과 같은 모든 비교 방법에서 다르게 언급되어 있지 않는 한 증폭 프로토콜 또는 선택제의 농도와 같은 기타 모든 파라미터(parameters)는 지속적으로 유지된다.

본 발명의 한 구체예에서 제 1 세포주는 생물반응기 안에서 배양되고, 생산된 치료용 단백질은 정제된다.

본 발명의 한 구체예에서 제 2 폴리누클레오티드 서열의 코돈 변형 지수는 0.9를 초과하고, 추가적인 구체예에서, 제 2 폴리누클레오티드 서열의 코돈 변형 지수는 0.91를 초과하고, 추가적인 구체예에서, 제 2 폴리누클레오티드 서열의 코돈 변형 지수는 0.92를 초과하고, 추가적인 구체예에서, 제 2 폴리누클레오티드 서열의 코돈 변형 지수는 0.95를 초과하는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 치료용 단백질 생산 수율의 산술 등가(arithmetic equivalency)를 이루기 위해 필요한 선택제의 수준이 제 1 폴리누클레오티드 서열을 이용한 동일한 방법에 사용된 선택제의 양과 비교할 때 50％ 미만으로 감소된다. 추가적인 구체예에서, 선택제의 수준이 제 1 폴리누클레오티드 서열을 이용한 동일한 방법에 사용된 선택제의 양과 비교할 때 25％ 미만으로 감소되며, 추가적인 구체예에서, 선택제의 수준이 제 1 폴리누클레오티드 서열을 이용한 동일한 방법에 사용된 선택제의 양과 비교할 때 5％ 미만으로 감소되며, 추가적인 구체예에서, 선택제의 수준이 제 1 폴리누클레오티드 서열을 이용한 동일한 방법에 사용된 선택제의 양과 비교할 때 3％ 미만으로 감소된다.

본 발명의 한 구체예에는 하기의 단계를 포함하는 치료용 단백질을 생산하는 세포주 생산 방법이 제공되어 있다:

a) 치료용 단백질을 엔코딩하며 0.9 미만의 코돈 변형 지수를 지니는 제 1 폴리누클레오티드 서열을 획득하는 단계,

b) 치료용 단백질을 엔코딩하는 제 2 폴리누클레오티드 서열을 획득하는 단계로서, 상기 폴리누클레오티드 서열의 코돈 변형 지수는 0.9를 초과하는 단계,

c) 치료용 단백질을 엔코딩하는 상기 제 2 폴리누클레오티드 서열 및 상기 제 2 폴리누클레오티드의 증폭을 제공할 수 있는 선택 마커를 엔코딩하는 제 3 폴리누클레오티드 서열로 세포주를 형질전환시키는 단계,

d) 다수의 세포를 포함하는 제 1 세포주를 생성하기 위해 단계(c)의 하나 이상의 세포를, 단계 (c)의 제 3 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩되는 선택 마커를 불충분한 수준으로 발현시키는 상기 세포주 내의 세포의 성장을 억제하는 소정 농도의 선택제를 포함하는 배지 안에서 배양하여, 상기 제 2 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩되는 단백질의 생산 안정기가 더 적은 증폭 라운드를 거쳐 도달되고/도달되거나 상기 제 1 누클레오티드로 형질전환된 세포주에서 생산된 상기 단백질의 동등한 안정기에 도달되는데 필요한 것보다 더 낮은 농도의 선택제에서 도달되는 단계.

본 발명의 한 구체예에서 형질전환된 세포주는 내생적 세포 효소의 파괴 또는 억제 때문에 물질대사적으로 결함이 있다.

본 발명의 추가적인 구체예에서 형질전환된 세포주는 누클레오시드 합성 경로에 결함이 있다.

본 발명의 한 구체예에서 치료용 단백질은 항체, 이의 유도체 또는 항원 결합 단편이다.

본 발명의 한 구체예에서 치료용 단백질은 단일클론항체이다.

본 발명의 한 구체예에서 선택 마커는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 엔코딩하는 폴리누클레오티드이고 선택제는 안티폴레이트(antifolate)이다. 추가적인 구체예에서 안티폴레이트는 메토트렉세이트이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서 선택 마커는 글루타민 합성효소를 엔코딩하는 폴리누클레오티드이고 선택제는 메티오닌 설폭시민(methionine sulfoximine)이다.

본 발명의 한 구체예에서 단백질 생산의 안정기에 도달하기 위해 1 라운드의 증폭만이 요구된다.

본 발명의 한 구체예에서 비유가식(unfed batch) 방법의 치료용 단백질 최종 수율은 0.3g/L를 초과하고, 추가적인 구체예에서, 비유가식 방법의 최종 수율은 0.5g/L를 초과하고, 추가적인 구체예에서, 비유가식 배양의 최종 수율은 0.8g/L를 초과하는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서 사용된 MTX의 농도는 5OnM 미만 또는 25nM 미만 또는 10nM 미만이다. 본 발명의 추가적인 구체예에서 사용된 MTX의 농도는 5nM이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상술한 배양 배지 안에서 선택된 세포 속에서 단백질 생산 안정기에 도달하기 위해서는 단 하나의 증폭 단계, 및 하나의 선택 및 증폭제 농도가 세포 배양 배지 안에서 필요하다.

본 발명의 한 구체예에서 상기 발명의 방법에 의해 생산된 항체가 제공된다. 추가적인 구체예에서 이 방법에 의해 생산된 항체가 제공되고 상기 생산된 항체는 하나 이상의 중쇄를 포함하고 그것은 비-글리코실화된(non-glycosylated) 중쇄를 5％ 이하로 가진다. 추가적인 구체예에서 항체의 중쇄는 95％ 글리코실화되거나, 96％ 글리코실화되거나, 97％ 글리코실화되거나, 98％ 글리코실화되거나, 또는 99％ 글리코실화된다. 추가적인 구체예에서 항체는 100％ 글리코실화된다. 본 발명의 한 구체예에서 높게 글리코실화 된 항체는 단일클론항체이다. 추가적인 구체예에서 높게 글리코실화 된 항체는 항-β-아밀로이드 항체이다. 추가적인 구체예에서 항체는 SEQ ID NO 18의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO 19의 경쇄 서열을 가진다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 본 발명에 따른 항원 결합 단편이 제공되며 상기 단편은 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, 이중특이적(bispecific), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 미니항체(miniantibody), 미니바디(minibody), 분리된 가변 중쇄 영역 또는 분리된 가변 경쇄 영역, 혈청 유래 단백질(예를 들어, 성장인자, 사이토킨, 알부민 등) 또는 이들의 조합 융합물(combinatorial fusion)이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본원에서 상술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 및／또는 경쇄를 엔코딩하는 하나 또는 그 이상의 발현 카세트를 포함하는 벡터를 포함하는 안정적으로 형질전환된 숙주 세포가 제공된다. 예를 들어, 이와 같은 숙주 세포는 경쇄를 엔코딩하는 제 1 벡터 및 중쇄를 엔코딩하는 제 2 벡터를 포함할 수 있다. 대안적으로 이와 같은 발현 카세트는 전달에 우선하여 결합 될 것이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서 본원에 상술한 발명에 따라 숙주 세포가 제공되고 상기 세포는 진핵생물, 예를 들어, 포유류 세포이다. 이와 같은 세포주의 예는 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary), BHK, HEK-293, NSO 또는 PerC6을 포함한다(최근 리뷰에 대한 문헌[Wurm 2004: Nature Biotechnology 22; 11 pp 1393-1398]을 참조). 또한 상기 숙주 세포는 유리한 유전자형적 및／또는 표현형적의 변형을 포함할 수 있는데, 예를 들어, CHO-DG44 숙주 계통은 비활성화된 이의 dhfr 유전자의 복제본을 지니며, 반면 기타 숙주는 비활성화된 글루타민 합성효소 유전자를 지닐 수 있다. 대안적인 변형은 단백질 글리코실화와 관련된 효소 장치에 대한 것일 수 있다(예를 들어, Yamane-Ohnuki et al, Biotech Bioeng 2004 87: pp 614-622, Kanda et al, Journal of Biotechnology, 2007 130: pp 300-310, Imai-Nishiya et al BMC Biotechnol, 2007 7:84). 반면 기타 숙주세포는 숙주 아폽토시스, 발현 및 생존 경로에 유리한 유전자형 및／또는 표현형 변형을 가진다(예를 들어, Tey et al Biotechnol Bioeng 2000 68: 31-43, Yallop et al Modern Biopharmaceuticals 2005 Chapter 3 pp 779-807, Nivitchanyang et al Biotechnol Bioeng 2007 98:825-41 , Figueroa et al Biotechnol Bioeng 2007 97:87-92). 단독 또는 조합된 숙주에 대한 상기 변형 및 기타 변형은, 비-숙주(non-host) 또는 숙주 유전자의 과다 발현, 유전자 녹-아웃 방식(gene knock-out approaches), 유전자 침묵 방식(gene silencing approaches)(예를 들어, siRNA), 또는 원하는 표현형을 가진 하위 계통의 진화(evolution) 및 선택 같은 표준 기술에 의해 생성될 수 있다. 이와 같은 기술은 당업계에 잘 확립되어 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서 본원에 상술한 발명에 따른 치료용 단백질의 생산에 대한 방법이 제공되고 상기 방법은, 예를 들어, 무혈청 배양 배지와 같은 배양 배지 안에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서 본원에 상술한 발명에 따른 방법이 제공되고 상기 치료용 단백질은 상기 항체를 함유한 무혈청 배양 배지와 관련하여 95％ 이상(예를 들어, 98％ 이상)으로 더욱 잘 정제된다.

본 발명의 한 구체예에서 0.9 이상의 CAI 스코어를 가지는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 포유류 발현 벡터가 제공되고 상기 발현 벡터는 항체, 폴리펩티드와 관련된 항체, 또는 유도체 또는 이들의 융합을 엔코딩한다.

또 다른 구체예에서 제 1 폴리누클레오티드 서열의 코돈 변형 지수보다 큰 코돈 변형 지수를 가지는 제 2 폴리누클레오티드 서열로 변형되며, 상기 제 1 및 제 2 폴리누클레오티드는 동일한 단백질을 엔코딩하고 상기 제 1 폴리누클레오티드 서열의 증폭을 제공할 수 있는 선택 마커를 엔코딩하는 제 3 폴리누클레오티드를 추가로 포함하는 제 1 세포주가 제공되는데, 상기 제 1 세포주는 선택 가능 배지에서 성장시킬 때 상기 치료용 단백질을 엔코딩하는 상기 제 1 폴리누클레오티드로 형질전환된 상기 제 2 세포주와 비교하여 상기 치료용 단백질을 더 높은 수율로 생산한다.

추가적인 구체예에서 치료용 단백질을 엔코딩하고 0.9를 초과하는 코돈 변형 지수를 가지는 제 2 폴리누클레오티드 서열로 변형되며, 상기 제 2 폴리누클레오티드 서열의 증폭을 제공할 수 있는 선택 마커를 엔코딩하는 제 3 폴리누클레오티드 서열을 추가적으로 포함하는 제 2 세포주가 제공되는데, 상기 제 2 세포주는 선택가능 배지에서 성장시킬 때 상기 치료용 단백질을 엔코딩하는 제 1 폴리누클레오티드로 형질전환된 상기 제 1 세포주와 비교하여 상기 치료용 단백질을 더 높은 수율로 생산하고 상기 제 1 폴리누클레오티드는 0.9 미만의 코돈 변형 지수를 가진다.

본 발명의 한 구체예에서 0.9 이상의 CAI 스코어는 표 6에 상술한 바와 같이 EMBOSS CAI 점수 통계를 이용하여 계산된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서 본원에 상술한 앞의 실시예에 따른 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 세포주가 제공된다.

추가적인 구체예에서 본 발명의 방법에 의해 얻어질 수 있는 세포주 또는 이의 자손이 제공된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 통합되거나 에피솜으로 유지되는 0.9 이상의 CAI 스코어를 가지는(EMBOSS 코돈 사용 빈도표 E. human. cut을 사용하여 유도됨) 오픈 리딩 프레임을 포함하는 유전체를 가진 포유류 세포를 제공하고, 상기 유전체는 항체, 폴리펩티드와 관련된 항체, 또는 이의 유도체를 엔코딩한다.

본 명세서 및 수반된 청구항을 통해, 용어 "포함하는" 및 "포함한다"는 "-으로 구성되는" 및 "-으로 구성된"을 포함한다. 즉, "포함하는" 및 "포함한다"는 문맥이 허용되는 한, 특별히 언급되지 않은 다른 성분 또는 정수를 포함하는 것이 가능한 것을 의미한다.

본 명세서 및 수반된 청구항을 통해, 용어 "생산의 안정기(plateau of production)"는 연장 비유가식 배양 접근법의 발현 수준을 의미하고 그에 의한 추가적 증폭 라운드는 일반적으로 증폭된 모체 클론과 비교해서 2배 미만의 증가를 발생시킨다. 클론이 항체를 생산하도록 특이적으로 개조될 때, 표준 연장 비유가식 배양에서 리터당 0.3g 내지 1.5g 사이를 생산하는 클론은 일반적으로 전류 연장 비유가식 배양 방식 및 배지 레시피(recipes) 사용시, 생산 안정기에 도달하는 것으로 고려될 수 있다.

생산 안정기에 도달한 최종 클론의 단일-세포 서브-클로닝은 흐름 분석(flow sorting)(예를들어, 96-웰 플레이트내 웰 당 세포를 수용(depositing)하는 것), 연질 한천 콜로니 피킹(soft-agar colony picking), 또는 한계 희석 배양을 포함하는 많은 표준 방법으로 수행될 수 있다. 수용 웰에서 단일 세포 성장을 확실히 하기 위해, 때때로 조절 배지 또는 일시 공급 배양이 다른 방법으로 수용된 고립된 세포의 성장을 지속하는 데에 또한 사용될 수 있다. 살아 있는 공급 공동-배양(live feeder co-culture)이 필요한 경우, 이러한 공동배양물은 단일 세포 클론이 건강하게 분열을 시작하면 이에 대하여 숙주세포가 선택될 수 있기 때문에, 통합된 선택가능 벡터 없이 모 숙주 세포를 손쉽게 포함할 수 있다.

본 명세서를 통해 사용된 용어 "오픈 리딩 프레임(ORF)"은 원하는 폴리펩티드 사슬 또는 사슬을 엔코딩하는 핵산 코딩 서열을 나타낸다. 상기 ORF 코딩 서열 안에 포함된 코돈은 연속적이거나 대안적으로 인트론을 포함할 수 있다. 상기 포함된 인트론 또는 간섭서열(intervening sequences)은 일반적으로 성숙 mRNA 안에서의 최종, 연속적인 오픈 리딩 프레임 형성에 앞서, 숙주 세포 안에서 스플라이싱(splicing) 반응에 따라 제거된다.

본 명세서를 통해 사용된 "수율"은 용액(예를 들어, 배양 액체 배지 또는 세포-용해 혼합물 또는 완충용액) 중의 생산물(예를 들어, 이종 발현 폴리펩티드)의 농도를 의미하고 이것은 보통 mg/L 또는 g/L으로 표현된다. 수율의 증가량은 두 가지 제한된 설정 조건하에서 생산된 생산 농도의 절대적 또는 상대적 증가량을 의미한다.

용어 "작동가능하게 연결된"은 원하는 단백질 생산을 발현하는 발현 카세트를 포함하고 있는 숙주세포를 선택하는데 사용되는 선택가능 및 증폭 마커의 이용을 의미한다. 이는 원하는 단백질을 발현하는 발현 카세트를 포함하도록 동일한 플라스미드 또는 벡터 내로 선택 및 증폭 마커를 클로닝함으로서 이뤄지거나 또는 대안적으로 별개의 플라스미드 또는 벡터로 세포로 전달될 수 있다.

도 1: 프로젝트 2, 3, 4, 5, 6(a), 6(b) 및 7(a)에서 사용된 벡터에 기초한 RSV 프로모터 기반 벡터의 개열 지도. (프로젝트 6 및 7의)EF-1 알파 프로모터 기반 평가의 경우, RSV 프로모터는 제 1 인트론을 가진 인간 EF-1 알파 유래 프로모터(문헌 [Kim DW Gene 1990 91 : 217-23]을 참조)로 대체되었다. 이것은 인간 유전체 DNA로부터 PCR에 의해 얻어졌다. 이후 상기 EF-1 알파 프로모터는 RSV 기반 프로모터 대신에 상기 벡터로 클로닝되었다.
도 2: CAI 스코어 0.809를 가지고 프로젝트 5(a) SEQ ID NO 10에서 사용된 프로젝트 5의 비-변형된 중쇄.
도 3: CAI 스코어 0.761을 가지고 프로젝트 5(a) SEQ ID NO 11에서 사용된 프로젝트 5의 비-변형된 경쇄.
도 4: 증가된 CAI 스코어(0.847)을 가지는 프로젝트 5(b)의 중쇄 ORF. 표 5를 참조. SEQ ID NO 12를 참조.
도 5: 증가된 CAI 스코어(0.833)을 가지는 프로젝트 5(b)의 경쇄 ORF. 표 5를 참조. SEQ ID NO 13를 참조.
도 6: 증가된 CAI 스코어(0.872)를 가지는 프로젝트 5의 중쇄 ORF. 이 서열은 항체 프로젝트 5(c)에서 사용되었다. SEQ ID NO 14를 참조.
도 7: 증가된 CAI 스코어(0.894)를 가지는 프로젝트 5의 경쇄 ORF. 이 서열은 항체 프로젝트 5(c)에서 사용되었다. SEQ ID NO 15를 참조.
도 8: 증가된 CAI 스코어(0.982)를 가지는 프로젝트 5의 중쇄 ORF. 이 서열은 항체 프로젝트 5(d)에서 사용되었다. SEQ ID NO 16을 또한 참조.
도 9: 증가된 CAI 스코어(0.976)를 가지는 프로젝트 5의 경쇄 ORF. 이 서열은 항체 프로젝트 5(d)에서 사용되었다. SEQ ID NO 17을 또한 참조.
도 10: 항체 프로젝트 5에 대한 중쇄 및 경쇄 RNA 및 단백질 수준.
도 11: 상세한 코돈 변형 방법론.
도 12: 프로젝트 5의 최종 클론 선택에서 얻어진 생성물 NGHC 데이타의 예.
도 13: 최종 세포주 증폭 및 선택 후 대략 3달의 추가적인 개발 연구에 따른 O97-7(프로젝트 5(d), 5nM MTX 선택된 클론 CAI HC 0.982, LC 0.976)로부터 생성된 역가의 예.
도 14: 다양한 프로젝트에서 조작된 세포에서 관찰된 DHFR 유전자 복제물 및 단백질 및 Neo 유전자 복제물의 상대적 수준.

본 발명에 따라 생산된 치료용 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자의 코돈 사용 빈도는 코돈 변형 지수(CAI)에 의해 측정되고 정의된다.

코돈 변형은 인간/포유류 유전자에서 바람직한 동의적 코돈에 대한 오픈 리딩 프레임의 코돈 변형이고, 이는 오픈 리딩 프레임 결과물의 발현을 방해하는 원치 않는 2차 서열 기능의 도입을 막는다. 본 발명자들은 후속 발현이 비-인간 포유류 세포(예를 들어, 햄스터에서 유래된 세포)에서 계획되어 있을 때에도 바람직한 인간 코돈이 또한 매우 적합하다는 것을 관찰하였다. 그러나, 임의의 주어진 아미노산에 대한 가장 바람직한 코돈이 주어진 포유류 종과 다르다면, 인간 선호 대신에 이것이 또한 사용될 수 있다. 각각의 오픈 리딩 프레임에서 생성된 "CAI 스코어"는 인간/포유류 유전자에서 가장 바람직한 동의적 코돈의 사용에 대해 오픈리딩 프레임의 변형된 정도를 강조한다. 본 발명의 문맥에서, CAI 스코어 1은 최적의 코돈이 각각 코돈 위치에서 각 아미노산에 사용되었음을 의미한다. 본 발명의 방법으로 최상의 결과를 얻기 위해, 치료용 단백질을 엔코딩하는 유전자는 1에 충분히 가까운 CAI를 가져서(예를 들어, 상기 CAI가 0.9 이상, 또는 0.95 이상, 또는 0.975 이상임), 치료용 단백질의 요망되는 수준의 발현이, 자연적으로 발생한 시작서열이 발현될 때 관찰된 것과 대비하여 충분하게 적은 선택 및 증폭제로 및/또는 빠른 시간 안에 달성된다.

하지만 모든 코돈이 가장 바람직한 코돈으로, 또는 모든 최소의 바람직한 코돈이 더욱 바람직한 코돈으로 대체될 필요는 없다. 다만, 서열 결과물이 비자연적으로 높은 CAI 스코어를 가지고 발현 방해 요소를 포함하지 않는 것이 요구된다. Leto 1.0(Entelechon, Regensburg, Germany)과 같은 상업화된 소프트웨어로 적절하게 높은 CAI 스코어의 서열을 디자인할 수 있다. 본 발명 용도를 위한 코돈 변형 서열을 디자인하는데 추가적인 도움을 제공하기 위해, NCBI 게놈 빌드 번호 36에서 유래된 24044 RefSEQ 데이타베이스 인간 전사 생산물을 분석하였다(NM_미리 결정된 기탁번호). CAI 스코어 범위는 계수되고 0.593에서 0.894까지이며 평균 스코어 0.720이다. 상기 데이타베이스에서 공지되고 발현된 유전자(이론상 보다는)에 대한 최고 스코어(0.894)는 케라틴 관련 단백질 5-8(KRTAP5-8;NM_021046) 및 후기 각화 외피(late cornified envelope) 1A(LCE1A;NM_178348)에 의해 생성된다. 추가적으로 21182 인간 IgG cDNA의 데이타베이스는 IgG 스코어의 범위가 0.576 내지 0.878이며 평균값은 0.766이라는 것을 나타내었다. 당업자에게 도움을 제공하기 위해, 본 발명의 용도에 적합한 서열은 후기 각화 외피 1A(LCE1A;NM_178348)와 같이 자연적으로 발생한 가장 높은 인간 유전자의 것을 넘어 그 이상의 CAI 스코어를 가질 수 있다. 더욱 바람직하게 0.9 이상의 CAI 스코어가 사용되어야 한다.

코돈 변형이 더 짧은 서열(예를 들어, 가변 영역)을 통해 수행된다면, 고 생산 클론의 증가된 수준이 관찰되지만, 코돈 변형이 전체 오픈 리딩 프레임을 통해 수행될 때는 생산된 고 생산 클론의 범위(즉, 개수)가 한층 더 증가된다는 것이 관찰되었다(표 5를 참조).

바람직한 코돈의 서열로 인해, 일반적인 변형 접근법은 또한 보통 디폴트로 고-스코어의 ARE(AU Rich Elements 문헌[Akashi et al Blood 1994; VoI 83 pp 3182-3187]을 참조) RNA 불안정 서열의 도입을 막을 것이다. 그러나 때때로 코돈 변형 후, 우연히 도입된 발현 방해 서열 요소가 제거될 필요가 있다. 이것은 (ⅰ) 스플라이스 지점의 기능화(functioning), (ⅱ) 발현 수준을 현저하게 감소시키고/감소시키거나 서열 사이의 재조합 비율을 증가시키는 2분 염색체 대칭 부분(예를 들어, 직접, 역위 또는 회문 서열), (ⅲ) 불안정 서열의 기능화를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

이와 같은 원치 않는 방해 요소가 변형과정 동안 발생하는 드문 경우에, 덜 바람직하지만 최소로 바람직하지는 않은 인간 코돈(선택이 제한되지 않는 한)을 사용하여 국소 서열을 기능 비활성화시키는 것이 권장된다. 최대 스코어에서의 작은 편차는 본 발명의 오픈 리딩 프레임 결과물의 사용에 상당한 영향을 미치지는 않을 것이다.

오픈 리딩 프레임의 작은 지역이 비-변형된 상태를 유지한다면(예를 들어, 유용한 제한 부위를 유지하기 위해), 전반적인 CAI 스코어에 상당한 영향을 미치지는 않을 것이라는 것 또한 인식되어 있다.

오픈 리딩 프레임이 융합체, 하이브리드 또는 키메라 단백질을 엔코딩한다면, CAI 스코어가 본원에 기술된 것과 동일한 방법으로 증가하도록 장려된다. 고 발현된 내생 유전자의 발현을 위해 숙주 세포에 바람직한 동종 코돈에 대한 상기 변형은 유전자 또는 융합되거나 조작된 오픈 리딩 프레임의 동족의 cDNA 각각 및 모든 성분에 대해 착수되어야 한다. 단백질 안에 존재하는 순수하게 합성한 코딩 서열(즉, 종래 존재하지 않는 서열)에 경우, 비자연적으로 높은 인간 유전자 CAI 스코어를 정확하게 동일한 방법으로 도입하는 것을 권장한다. 본 발명에서는 후기 각화 외피 1A 인간 유전자의 CAI 스코어 이상의 CAI 스코어를 가지는 오픈 리딩 프레임을 사용해야 한다.

상기 기술된 본 발명은 단백질을 엔코딩하는 오픈 리딩 프레임의 코돈 변형에 의해 단백질을 원하는 수준으로 발현시키도록 유전적으로 조작된 세포주를 생성하기 위해 필요한 선택 가능 및 증폭제의 수준, 필요한 시간, 및 필요한 증폭 사이클의 수를 감소시키는 방법을 최초로 설명하고 있다. 상기 목적을 위한 코돈 변형의 이용을 통해 더 빨라진 시간 프레임 안에서 충분한 수율이 관찰되고 따라서 세포주 개발 활동에 많은 시간(weeks)이 절약된다. 게다가 본 발명자들은 또한 기존에 수행해왔던 것보다 더 낮은 농도의 선택 및 증폭제를 사용하여 등가 또는 향상된 세포주를 생성하였다. 실제로, 본원에서 상술한 그러한 개선이 표준 세포 배양 및 [Celina de Ia Cruz Edmonds et al (ibid)]에 의해 설명된 것과 같은 시딩 프로토콜 개선과 조합될 때, 유전적으로 조작된 세포주로부터 등가 또는 향상된 수율을 생성하기 위해 필요한 시간의 추가적인 감소 및 선택 및 증폭제 수준의 추가적인 감소가 관찰될 가능성이 있다.

본 발명은 치료용 단백질이 당 단백질인 경우 사용에 적합하다. 기존의 연구는 과정 지속 기간, 온도, pH, 삼투압 및 배지 성분 및 첨가물 등(예를 들어, WO2002076578 및 이의 참고문헌을 참조)의 변형에 의한 단백질 생산물의 글리코실화를 조절할 수 있다는 사실을 개시 한 반면, 본 발명자들은 치료용 폴리펩티드 서열(항체 치료용 폴리펩티드의 경우)을 엔코딩하는 오픈 리딩 프레임의 코돈 변형이 CHO 세포의 서브-타입, 선택 및 증폭 단계 또는 배지 배양 조건과 독립하여 불완전한 글리코실화 수준 및 환원된(reduced) 부위 점유 수준을 감소시킬 수 있음을 발견하였다.

이 놀라운 관찰은 오픈 리딩 프레임 코돈 변형을 통해 단백질 글리코실화 프로파일에 영향을 줄 수 있음을 최초로 입증한다. 본원에 기술된 바와 같이 코돈 변형 접근법을 이용함으로서, 로버스트(robust) 제조 공정은 숙주 세포가 키워진 곳의 조건 보다는 유전자 서열에 의존함을 확인할 수 있다. 차례로 이것은 생산물 글리코프로파일에 영향을 끼치는 결과물에 대한 과도한 우려 없이 전통적인 배지 및 공급 개발 반복을 통해, 배양 조건 및 공급 방식을 향상시키는 더 큰 기회를 제공한다.

코돈 변형의 정도는 Sharp 및 Li(Nucleic Acid Res 1987 15:1281-95)에 의해 최초로 설명된 방법을 이용하여 측정될 수 있다. Sharp 및 Li가 제안한 코돈 변형 지수(CAI) 스코어는 코돈 선호도 통계로부터 본질적으로 유도되지만, 아미노산 조성물에서 다른 유전자 사이에 변이 효과를 제외하도록 각 아미노산에 대해 표준화된다. 이 CAI 측정기준은 쉽게 이용 가능하다(예를 들어, EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite (문헌[Rice et al 2000: Trends in Genetics 16; pp276-277]을 참조)).

본 발명의 이용을 위해 의도된 오픈 리딩 프레임을 평가하기 위해, 우선 적절한 참조 데이타베이스를 사용해야 한다. 첫째로 사용될 세포 숙주를 고려해야 하고, 상기 세포 숙주에서 발현된 유전자에 대한 상대적인 동의적 코돈 사용빈도(RSCU)의 참조표를 확인해야 한다. 일반적으로 인간 RSCU 데이타베이스는 임의의 포유류 세포 유형의 오픈 리딩 프레임 결과물이 발현할 때 참조로서 적합하다. 데이타베이스의 한가지 예는 EMBOSS에 의해 제공되는데 상기 인간 세포에서 코돈 사용빈도 선호도를 결정하기 위해 참조로서 Ehum.cut 코돈 사용빈도표(Ehum.cut codon usage table)를 사용한다. 대안적인 참조 코돈 사용빈도표는 Massaer등(ibid)에 의해 설명된 것으로, 이것은 더 적은 수의 고 발현된 인간 유전자를 사용하여 코돈 선호도를 결정짓는다. 이러한 두 참조표는 대략적으로 가장 바람직한 코돈에 대해서는 폭넓게 일치하지만, 한 아미노산(아르기닌)에 대해 한가지 주목할만한 차이가 있다. 그러므로 본 발명의 사용을 위한 오픈 리딩 프레임을 디자인할 때, (i) 오픈 리딩 프레임 안에 포함시키기 위한 가장 바람직한 코돈을 결정하고 이후, (ii) CAI 스코어가 본 발명에 사용하기에 적합하도록 충분히 높음을 보장하기 위해 후속하여 생성된 오픈 리딩 프레임의 CAI 스코어를 결정하기 위해 동일한 코돈 사용빈도표를 교차 참조하는 것이 논리적이다. 예를 들어, Massaer등 데이타베이스가 인간 및 포유류 세포의 발현에 대한 오픈 리딩 프레임을 디자인하는데에 정기적으로 사용되고 CGC 코돈이 아르기닌을 엔코딩하는데 가장 바람직한 코돈으로 고려된다면, 생성된 결과적으로 획득한 오픈 리딩 프레임의 CAI 스코어를 결정지을 때 이 선호도 참조 데이타를 또한 사용하는 것이 논리적이다.

본원에 기술된 방법론은 항체 또는 이의 유도체를 발현시킬 때 특히 적합하고, 프로모터에서 유래된 발현카세트와 EF-1 알파 유전자에서 유래된 발현 요소를 결합시킬 때 특히 효과적이다. 기타 프로모터 및 발현요소(예를 들어, RSV LTR에서 유래된 것들) 또한 적합하다. 발현 카세트 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 매트릭스 부착 영역(MARS), 인슐레이터, 비번역 영역, 인트론 및 폴리아데닐화 부위과 같은 간섭 서열)는 다양한 조합으로 결합하여 적합한 발현 카세트를 형성하고, 원하는 오픈 리딩 프레임의 발현을 유도하고, 본 발명에 사용된 선택 및 증폭 마커의 발현을 유도할 수 있다는 것은 당업계에 공지된 사실이다.

임의의 주어진 세포주 개발 프로토콜에서 클론이 비유가식 연장 배양 생산에서 생산 안정기에 도달하면, 추가적인 실험 활동이 (ⅰ) 최상의 클론의 단일 세포 클로닝, (ⅱ) 유가식 배양 공정 개발, (ⅲ) 관류형 공정 개발, (ⅳ) 맞춤 배지 및 공급 레시피 및 방식, (ⅴ) 추가적 배양 변형과 같은 방법론에 가장 초점을 맞춘다는 사실이 관찰된다. 예를 들어, 각 클론이 생산 역치에 도달되면, 유래된 단일-세포 서브-클론은 더욱 엄격한 수준의 선택 및 증폭제를 이용한 추가적인 선택 및 증폭 과정에 의해 생성된 증폭된 딸 클론(daughter clone)보다, 일반적으로 더 안정하고 수율이 높다. 실제로, 이미 생산 안정기에 도달한 최종 클론의 선택 및 증폭의 증가는 종종 불안정성을 야기하고, 초기 개선 후, 종종 궁극적으로 연장 비유가식 생산 모델 배양에서 증폭된 모 클론보다 동일하거나 심지어 더 낮은 역가를 야기할 수 있다. 그러므로 때때로 드물고 뜻밖의 추가적 증폭 사건이 일부 경우에서 역가를 2배 이상 증가시킬 수 있다고 인지되어 있지만, 발현 역치에 도달하면, 더 신뢰할 수 있는 기술이 안정한 역가를 한층 더 증가시키는데 대신 사용될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예를 예시하지만 이에 제한되지는 않는다.

실시예

과거에는, DHFR 선택 방법론이 15개 이상의 항체 프로젝트에 사용되었다. 본 발명을 사용하는 모든 경우에 있어서, 세포주를 적절한 수율로 생성하기 위해서 2 라운드 이상의 증폭 및 선택제로서 최소 5OnM MTX 및 유지 압력이 필수적이었다. 이 방법론에 의해 시간을 거쳐 생성된 일반적인 결과를 표 1의 항체 1,2,3 및 4에 도시하였다. 항체 프로젝트 1은 그 시점에서 가능한 표준 방법론을 이용하여 수행하였다. 항체 프로젝트 2-9는 하기 재료 및 방법에 따라 수행하였다. 오픈 리딩 프레임의 코돈 변형 지수(CAI) 개선이 미치는 영향을 연구하였다. 연구를 위해 우선 항체 5를 선택하였다. 상기 연구는 야생형(즉, 비 코돈-변형된) 중쇄 및 경쇄 항체 오픈 리딩 프레임(항체 5(a)로 기록된), 가변 도메인 코딩 서열만이 넓게 코돈 변형된 중쇄 및 경쇄 오픈 리딩 프레임(항체 5(b) 또는 5(c)로 기록된) 또는 전체가 코돈 변형된 중쇄 및 경쇄 오픈 리딩 프레임(항체 5(d)로 기록된)로부터의 항체 생산물의 발현을 포함한다. 상기 연구의 결과는 표 1-5에 도시하였다.

실시예 1. 재료 및 방법

1.1 DNA 클로닝 및 벡터 작제

모든 DNA 클로닝은 확립된 제한효소 기반 서브-클로닝 및 PCR 조립 방법론에 의해 수행되었다(문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Third Edition: Sambrook et al (CSH Laboratory Press)]을 참조). 발현 및 선택 벡터의 개열 지도를 도시하였다(도 1을 참조). 도시된 벡터는 RSV 프로모터를 예시하나, 표1에 따라 다른 프로모터를 사용하였다. 기타 모든 관점에서 나머지 벡터는 변하지 않았다.

1.2 코돈 변형

CAI 변형된 ORF 서열을 조사한 프로젝트에서, 클로닝 및 서열 확정에 앞서 표준 융합 중합효소 연쇄 반응(PCR)의 도움으로 결합된 원하는 중복 올리고누클레오티드를 이용하여 모든 표준 방법론에 의해(문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Third Edition: Sambrook et al (CSH Laboratory Press) 및 Stemmer et al., Gene. 164(1 ):49-53, 1995]을 참조) 상기 서열을 생성하였다. 프로젝트 5(b) 및 5(c)의 ORF의 변형된 영역의 서열을 인간/포유류 세포에 대한 Massaer 코돈 사용빈도 선호도(Massaer codon Usage preference)를 이용하여 디자인하였다(도 11을 참조).

항체 프로젝트 5(d)의 경우, 계약 서비스 공급자 1에 의해 코돈 변형된 ORF 서열을 디자인하고 생성하였다. 결과적으로 얻은 ORF는 0.9를 초과하는 CAI 스코어를 지녔다. 항체 프로젝트 6에서, 항체 가변 도메인을 엔코딩하는 코돈 변형된 서열은 계약 서비스 공급자 2가 디자인하고 생성하였다. 그 다음 불변 및 가변 영역 사이에 위치한 특이한 클로닝 부위의 도움으로 표준 서브-클로닝에 의해 가변 도메인을 프로젝트 5(d)의 서열을 엔코딩하는 코돈 변형된 불변 도메인과 결합시켰다(중쇄로 Spel, 경쇄로 BsiWl를 이용하여)(프로젝트 6(b) 및 6(d)). 프로젝트 6(b) 및 6(d) 각각에서 전장(full length) 항체를 엔코딩하는 결과적으로 얻은 ORF는 0.9를 초과하는 CAI 스코어를 지녔다. 항체 프로젝트 7의 전체 코돈 변형된 ORF는 계약 서비스 공급자 2가 디자인하고 만들었으며, 그 결과 얻어진 ORF는 0.9를 초과하는 CAI 스코어를 가졌다. 프로젝트 8 및 9의 ORF는 Leto 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 가변 도메인 서열을 디자인하였다. 이후 이 서열을 적절한 불변 도메인 엔코딩 서열과 결합함으로서 인 프레임 전장 오픈 리딩 프레임을 생성하였다(상기 Spel, BsiWI 영역을 다시 사용함): 항체 8에서, 가변 도메인을 엔코딩하는 서열을 프로젝트 7의 불변 도메인 엔코딩 서열 각각과 융합시켰다. 항체 9에서, 생성된 가변 도메인 엔코딩 서열을 프로젝트 6(d)의 불변 도메인 엔코딩 서열과 각각 융합시켰다. 프로젝트 8 및 9 각각에서 전장 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 결과적으로 얻은 ORF는 또다시 0.9를 초과하는 CAI 스코어를 가졌다.

도 11(A)에서, 항체 프로젝트 5의 CDR1을 엔코딩하는 경쇄 서열을 대표 샘플 서열로서 도시하였다. 상기 CDR의 아미노산 서열을 도시하였다. 잠재적인 auuua 불안정성 AU 풍부 인자(AU rich element, ARE)를 박스 안에 볼드체로 도시하였다(Akashi et al Blood 83:pp3182-3187를 참조). 아르기닌 코돈 역시 강조하였다. 첫째, 증가된 코돈 변형 방법은 ORF을 통해 증가된 CAI 스코어를 유발하였다. 이 항체를 프로젝트 5(b)에서 사용하였다. 나타낸 것과 같이 상기 방법은 가장 바람직한 코돈(예를 들어, Tyr)을 포함했지만 모든 경우에 그런 것은 아니다(예를 들어, Leu). 둘째, 최대 CAI 스코어는 Massaer등에 따른 가장 바람직한 코돈을 사용하였다. 상기 서열을 항체 프로젝트 5(c)에서 사용하였다. 최종 서열은 코돈 사용빈도 데이타베이스 웹사이트에서 사용가능한 것과 같은 거대한 데이타베이스에 따라 가장 바람직한 코돈을 제공하고, 사용하였다. 이 항체 서열은 프로젝트 5(d)에서 사용하였다. 도 11(B)에서, 인간에서 고 발현된 유전자의 코돈 선호도 표는 Massaer등으로부터 변형하였다. 도 11(C)에서, 인간 유전자에 대한 코돈 선호도 표는 호모 사피엔스(89533 CD(38691091 코돈)을 포함하는)의 코돈 사용빈도 데이타베이스(www.kazusa.orq.ip/codon)를 변형하였다.

중쇄 ORF 및 경쇄 ORF 두 가지 모두에서, 오픈 리딩 프레임을 발현 벡터 안으로 전달하기 위해 특이한 HindⅢ(5') 및 EcoR1 사이트(3')를 통상적으로 사용하였다는 것을 주의하라. 형질감염에 사용하기 앞서 모든 서열을 확인하였다. 예를 들어, 도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9에서 보이는 서열은 프로젝트 5의 본래 및 변형된 오픈 리딩 프레임 서열을 기록하고 있다. 프로젝트 5에서 오직 5(d)만이 오픈 리딩 프레임 영역에서 결과적으로 얻은 CAI 스코어가 0.9를 넘도록 충분하게 코돈 변형되었다.

본 원에 기록된 모든 CAI 스코어에서, Ehum.cut 코돈 사용빈도표를 참조로 사용하였다(EMBOSS를 통해 사용가능함).

상기 스코어는 Sharp 및 Li(ibid)에 의해 최초로 설명된 방법론을 사용하는 코돈 변형 지수 응용을 이용하여 계산하였다. 이 응용은 EMBOSS 계통의 한 부분이다. 상기 서열의 CAI 스코어를 결정하기 위해 버전 2.8.0 Ehum.cut 코돈 사용빈도 파일 및 디폴트 파라미터 세팅을 사용하였다.

표 6

EMBOSS에서 유래된 Ehum.cut 코돈 사용빈도표. 컬럼 A:코돈 서열; 컬럼 B:엔코딩된 아미노산; 컬럼 C:중복 세트 중에서 주어진 코돈 사용빈도 비율; 컬럼 D:1000 코돈 당 코돈의 수; 컬럼 E:표를 얻기 위해 사용된 데이타 안에서 관찰된 코돈의 횟수.

1.3 세포 배양

일반적으로 현탁-변형된 CHO DG44 세포를 미리 변형시킨 동물-유래-성분-결여-배지(animal-derived-component-free-media)에서 계대배양(passage)하였다. 이 배지는 아미노산, 미량 원소, 비타민, 글루코스, 및 효모 가수분해물을 포함하는 기본 제형으로 구성되어 있다. 또한 이 배지에 재조합 인슐린, 리피드 및 누클레오시드를 추가로 보충하였다. 중탄산나트륨을 완충용액으로서 이 배지에 첨가하였다. 많은 등가 동물 유래 성분 결여 배지 레시피가 당업계에 잘 공지되어 있다. 형질전환 세포 벡터의 초기 선택을 누클레오시드의 투여중지(DHFR 선택을 위해) 및 G418 첨가(네오마이신 인산전달효소(phosphotransferase) 선택을 위해)으로 수행하였다. 역가 순위에서, 96-웰 분석 역가는 플레이트에 걸쳐 세포 성장, 시딩 수, 배지 분산 부피 및 증발 속도론에 의해 유래된 변화에 따르는 경향이 있다. 그 결과 진탕 플라스크(shake flask) 생산 모델로 생성된 역가는 세포주 순위를 고 수율의, 증폭된 세포주 순서로 더욱 잘 나타내었다. 상기 모델에서 모든 세포를 동일한 최초 밀도로 파종하였다. 상기 모델에서, 생존력 및 성장을 또한 측정하였다.

1.4 형질감염 전의 DNA 제조

중쇄 및 경쇄 발현 벡터의 동일한 양(15μg)을 200μl 부피 에펜돌프 반응으로(NotI와 함께) 완성을 위해 선형화시키고 에탄올/소듐 아세테이트를 침전시켰다. 이후 상기 펠렛을 70％ 에탄올로 세척하고, 공기 건조시키고 분자-생물학 등급 물 50μl에 재현탁시켰다.

1.5 형질감염 전의 CHO DG44 세포 제조

건강하게 키운 세포 1.2 × 10⁷개세포(형질감염 당)를 15 또는 50ml 튜브속에서 회전시키고(2-10분 동안 1000rpm), 얼음처럼 차가운 PBS/수크로스 15ml로 세척하고, 다시 회전시킨 후 얼음처럼 차가운 PBS 수크로스 800μl로 재현탁시켰다. 그런 다음 상기 세포 현탁액을 미리 준비한 DNA에 첨가하고 15분 동안 얼음에 놓아둔 후, 냉각시킨 전기천공 큐벳으로 옮겼다.

1.6 전기천공법

준비한 DNA 및 세포를 포함한 큐벳을 25μF 및 0.38kV로 설정한 진 펄서(Gene Pulser)로 전기전공하고, 다시 10분 동안 얼음에 다시 놓아두었다. 그 다음 상기 세포를 제거하고 비-선택 배지 240-ml에 첨가하고 웰 당 2-5×10³개 세포(즉, 웰 당 50μl)로 40×96-웰 접시의 비-선택 배지에서 평판 배양하였다. 상기 플레이트를 포일로 감싸고, 48시간 동안 5％ CO₂ 및 37℃에서 인큐베이션하였다.

1.7 선택, 증폭 및 클론 식별

전기천공 48시간 후, 150μL의 선택 배지를 각 웰에 첨가하였다. 이 선택 배지는 G418을 포함하지만 뉴클레오시드는 포함하지 않는다. 그로부터 1주일 뒤, 140μl의 배지를 정착된 세포층을 손상시키지 않고 새로운 선택 배지로 조심스럽게 교환하였고, 3-4주 후 키운 모든 세포(일반적으로 웰 당 0.1 콜로니 성장; 즉, 96-웰 플레이트당 10 웰에서 성장)를 항체 생산을 위해 적정하였다. 가장 높은 순위의 식별된 클론(일반적으로 20-100개)을 24-웰 접시를 통해 최대 6-웰 접시까지 동일한 선택배지 안에서 확장시켰다. 상기 클론을 96-웰 접시(클론당 96-웰) 속에서 1000셀/웰 당으로 평판 배양하고 웰 당 200μl 부피로 5nM 메토트렉세이트를 포함하고 있는 선택 배지 하에서 선택하였다. 2주 내지 3주의 추가적인 인큐베이션 후, 최상의 클론을 다시 확장시키고, 웰 당 1000셀로 50nM MTX없이 재-평판 배양하였다. 상기 클론을 2-3주 성장시킨 후 96-웰 플레이트에서 스크리닝하고 최대로 확장시킨 후 150nM MTX없이 96-웰 접시 안에서 웰당 1000셀로 평판 배양하였다. 최종 클론의 잠재적 생산을 평가하기 위해, 150nM MTX에서 최상의 클론을 확장시키고 역가 및 생성된 생산물의 양에 대해 진탕 플라스크 생산 모델로 평가하였다. 프로젝트 5(a)에서 최상의 클론은 17-9-6-1로 표지된 클론이었다. 이것은 비유가식 생산 모델에서 리터 최종 역가(end-titre)당 0.3g을 생산하였다.

NB. 메토트렉세이트 수준 및 스텝 1.7에서 필요한 증폭 라운드수는 해당 프로젝트와 그 서열이 변형된 코돈인지 여부에 따라 변했다.

1.8 역가 분석

96-웰 플레이트에서 얻은 배지 샘플에서, 제조자의 권장사항 및 표준 방법론으로 IGEN M-시리즈 M8/384 분석기(Bioveris, MaryLand, USA)를 이용하여 자동화된 96-웰 샌드위치 ELISA 스타일 방법으로 항체 역가를 결정하였다. 이 샌드위치는 스트렙타비딘 코팅된 자석 코팅 구슬, 비오티닐화된 단백질 A 및 루테늄 표지 된 F(ab)2 단편으로 구성되었다. 테스트 샘플에서 발생 된 신호를 항체 참조 표준의 단계적 희석과 비교하였다. 고 민감 분석 동안, 96-웰 배양에서 변하기 쉬운 세포 성장과 결합된 분석 변동 때문에, 분석 중간의 정확성 및 재현성은 고 수율, 증폭된 세포주에 대한 본 분석에 대해 상대적으로 낮다. 진탕 플라스크 및 생물 반응기 생산 모델에서 얻은 배지 샘플에서, 제조자의 권장사항 및 표준 방법론 및 Beckman Coulter 이미지 시스템(Buckinghamshire, England)을 이용하여 반응 용액 속의 불용성 면역 침전반응에 의해 광신호가 흩어지는 네펠로 측정법( nephelometric method)의 도움으로 항체 역가를 측정하였다. 테스트 샘플에서 생성된 신호를 재차 항체 참조 표준의 단계적 희석물과 비교하였다. 기록된 모든 역가를 근사치로 계산하였다.

1.9 생물 반응 장치 진탕 플라스크 모델(연장 비유가식 생산 모델)

일반적으로 세포를 동물-유래-성분-결여 배지를 포함한 구멍난 덮개를 가진 표준 250ml 조직-배양 진탕-플라스크에서 ml당 800,000개 세포로 전체 부피 120ml로 배양하였다. 그 다음 상기 플라스크를 이산화탄소가 풍부한 공기하에서 흔들면서 인큐베이션하고 온도를 설정하여 세포 성장을 촉진 및 유지시켰다. 각 클론을 다양한 조건으로 테스트하였다 - 예를 들어, 다양한 온도 조건에서. 본원에 기록된 결과에서, 테스트 된 각 클론의 가장 높은 역가를 예시하였다. 일반적으로 본원에 기록된 생산 모델 및 종결점 역가(end-point titre)는 표준 Vi-세포 CHO 파라미터 세팅 및 제조자의 권장 프로토콜을 이용하여 Vi-Cell(Beckman)에서의 트리판 블루 배제에 기반한 분석에 의해 측정할 때, 세포 생존력이 대략 50％까지 떨어지는 지점에서 기록되었다. 일반적으로 상기 종결점 역가는 10-20일 인큐베이션 후에 생성된다.

1.10 생물 반응기 배양 방법론

표준 생물 반응기 배양 방법론 및 장비를 내내 사용하였다. 일반적으로 시드 종자(seed train)를 생성하기 위해, 세포를 거대한 부피로 확대하고 3일 그리고 4일 반복된 섭생(regime)으로 한 주에 두 번 계대시켰다. 도 13에서 도시된 연구에서, 시드 셀을 하기 공정 조건 하에서 3-리터 아플리콘 벤치 탑(Applikon bench top) 생물 반응기(2-리터 작동부피) 운행에 접목하는데 사용하였다. 온도 34℃, pH 설정 포인트 6.95, DO 설정 포인트 30％. 진탕 플라스크 모델과 마찬가지로, 세포 생존력이 대략 50％로 떨어질 때까지 배양을 확대하였다. 상기 생물반응기는 임상 시험용 물질 등을 공급하는데 사용되는 거대 생물반응기와 마찬가지로 상기 두 진탕 플라스크의 종결점 역가를 광범위하게 모방하였다.

1.11 RT-QPCR 분석(결과는 도 10을 참조).

CHO RNA 추출 및 RT-QPCR 반응을 MagNA Pure 및 RNA 고성능 RNA 분리 키트(RNA High Performance RNA Isolation kit) 및 프로토콜(Roche)을 이용한 자동화된 실리카 기초 추출로 수행하였다. 랜덤 헥사머를 이용한 역전사 후에, ABI-7700(Applied Biosystems)을 이용하여 PCR 반응을 수행하고, 표준 방법론을 이용하여 ΔΔCt 상대 정량 알고리즘에 따라 분석하였다. 상기 반응을 다중화하고(18S+ 표적 유전자[중쇄/경쇄]), 가장 풍부한 표적인 18S는 표적 반응의 억제를 막기 위해 제한한 프라이머였다. Q-PCR에 사용된 프로브 및 플랭킹(flanking) 프라이머쌍을 SEQ ID NO 1-9에 따라 사용하였다. 상기 중쇄 및 경쇄 프로브/프라이머는 이 프로젝트에서 수행된 증가된 ORF 코돈 변형 때문에 프로젝트 5(d)의 사용에 적합하지 않았고 따라서 도 10(A)에서 제외하였음을 주목하라.

1.12 웨스턴 블롯 분석 (결과는 도 10을 참조)

표준 방법론을 사용하였고 다른 곳에서 상세히 설명되었다(예를 들어, Sambrook et al IBID을 참조). 간략히 말해서, 전체 세포 용해 및 단백질 추출 완충용액을 이용하여 폴리클로날 등가 세포 추출물을 제조하였다. 각 추출물의 동일한 양을 Laemmli 로딩 완충용액과 함께 뜨겁게 인큐베이션하고 그 다음 로딩하고 단백질 절편을 분리하기 위해 트리스-글리신 러닝 완충용액과 함께 SDS-Page gel을 진행하였다. 분리된 경우, 상기 단백질을 니트로셀룰로오스 세포막에 전자 전달 블롯팅(blotting)시키고 전체 항-인간 IgG(HRP 연결된)로 탐침화하였다. HRP 기질과 함께 인큐베이션하여 신호를 발생시키고 X-레이 필름에 기록하였다. 프로젝트 5(a)의 항체 경쇄 생산물을 감지하기 위해 추가적인 더 장시간의 노출이 필요하였다.

1.13 원하는 재조합 단백질을 생산하는 클론에서 DHFR 수준을 결정하기 위한 형광성 메토트렉세이트 염색

4-5일 동안 메토트렉세이트 없이 각 클론을 배양한 후, 700,000개의 살아있는 세포에 37℃ 5％ CO₂로 18-22시간 동안 10μM 알렉사-플루오르 488-메토트렉세이트(Alexa-Fluor488-Methotrexate)(분자프로브/인비트로겐, 페이즐리)를 첨가하였다. 그 후 염색된 세포를 배지 안에서 수확하고 세척하고 37℃, 5％ CO₂로 30분 동안 인큐베이션하였다. 수확된 세포를 배지 안에서 다시 세척하고 배지 안에서 재현탁하고, 필터링하고 라이브/대드 배제 염료 프로피디움 요오드화물(live/dead exclusion dye Propidium Iodide)(Sigma, St Louis)을 첨가한 후, BD FACS ARIA로 분석하였다. 도 14(A)에 도시한 데이타는 개폐 살아있는 세포(gated live cells)에 대한 것이다.

1.14 DHFR 및 Neo 수준에 대한 유전체 DNA의 qPCR 분석

퀴아젠의 표준키트를 사용하여 CHO 유전체 DNA 추출을 행하였다. 분광 광도계 판독을 이용한 DNA 정량화 및 정상화 후에, ABI-7700(바이오시스템을 적용한)을 이용하여 PCR 반응을 수행하고 표준 방법론을 사용한 ΔCt 상대 정량 알고리즘에 따라 분석하였다. Q-PCR에 사용된 프로브 및 이웃한 프라이머쌍을 SEQ ID NO 20-25에 따라 사용하고 그 결과를 도 14(B)에 도시하였다.

실시예 2, CHO 세포에서 모노클로날 항체 중쇄 및 경쇄의 발현

놀랍게도 높은 CAI 스코어를 지니나, 여전히 프로젝트 5(c)의 본래의 스코어(즉, 후기 각화 외피a! LCE1A; NM 1783480과 같은 가장 높게 관찰된 본래 인간 ORF보다 적은 스코어)의 ORF는, 프로젝트 5(d)의 매우 높은 CAI 스코어링 오픈 리딩 프레임보다 더 높은 최고 역가(top titre)를 생성하였고, 한편 5(d)에서 고 생산자의 범위(수)는 개선되었다(표 5를 참조). 5(a), (c), (d)의 최상의 클론을 증폭하고 추가로 평가하였다. 이 추가적 평가에서, 5(a) 클론을 컨트롤로서 진보시키고, 일반적 프로젝트를 대표하기 위해 본원에 상술 된 결과에 앞서 역가를 관찰하였다. 본 연구의 결과는 프로젝트 5(d)에서 예상외로 빠른 시간 및 증폭의 감소된 수준으로 고 생산성, 안정한 클론(40회 계대(passages)에서 관찰된 역가 및 성장)을 생성하였다. 5(d)에서 최종 세포주를 생성하는데 필요한 메토트렉세이트의 수준은, 프로젝트 5(a)의 비 코돈-변형된 오픈-리딩-프레임에서 생성된 동일한 단백질을 동일 또는 더 낮은 수준으로 발현하는 등가 세포주를 생성하는데 필요한 것에 비교하여 상당히 낮다(97％보다 적은 메토트렉세이트)(표1을 참조). 추가적으로 상세한 분석을 수행하였다 - 표 2-4를 참조.

변형된 CAI 스코어 ORF에 의해 생성된 재조합 단백질 결과물의 결합 특성이 코돈 변형에 영향을 받는지 조사하기 위해, 결합 특성을 ORF의 CAI 스코어 0.809(HC)/0.761(LC) 또는 ORF의 CAI 스코어 0.982(HC)/0.976(LC)에 의해 엔코딩되는 프로젝트 5의 항체와 비교하고 분석하였다. 두 물질을 생물반응기에서 생성하고 등가 정제 단계에 의해 정제하였다. 상기 비교를 통해 항체의 결합 특성은 이 항체를 엔코딩하는 ORF에 대한 CAI 변형에 영향을 받지 않음을 보였다.

프로젝트 5(d)에서 097-7, 표 1에 도시한 최고(top) 생산 클론은 세포주의 클론성을 보장하기 위해 복제된 단일세포이고, 비유가식 연장 배양에서 비-클론된 모체에 비교하여 거의 2배 증가량을 생성하는 최상의 서브-클론의 역가 결과를 가진다. 도 13에 도시한 역가는 1.10에서 상술한 두 개의 독립한 3-리터 아플리콘 벤치 탑 생물반응기 안에서 비유가식 배양으로 생성하였다.

표 1.

각각의 프로젝트에서, 후속 추가적 개발 및 뱅킹(banking)을 위해 선택된 최종 클론이 존재한다. 또한 각 세포주 개발의 각 단계에서 각각의 최종 클론을 위해 생성된 96-웰 역가(ng/ml)를 강조하였다. 본원에 기술된 결과에 앞서 생성된 일반적인 데이타는 항체 프로젝트 1,2,3 및 4로 표현한다. 프로젝트 2 및 프로젝트 4는 동일한 생성물을 발현함에 주목하라. 프로젝트 2 및 4에서 모든 활성은 동일한 벡터, 숙주세포 및 프로토콜 그러나 서로 다른 실험실 오퍼레이터 및 장비를 이용하여 독립된 실험실에서 수행하였다. 하기 0, 5, 50 및 150nM MTX에 도시된 모든 역가는 96-웰 단계에서 생성한다. 더 높은 역가는 배치 생산 모델에서 유의미한 개선을 보이지 않았고 그래서 더 낮은 MTX 클론을 진행하였다(표 2를 참조). FIO = 필요한 정보는 아닌 단순한 정보. 프로젝트 6(b)-6(d)에서 얻은 더 좋은 역가 때문에 프로젝트 6(a)을 안정기에 도달하기 전에 중단하였다.

표 1.

표 5.

표준 형질감염 및 선택 프로토콜에 의해 비-증폭된 클론의 역가비교를 생성하고 뉴클레오시드 투여중지 및 G418 첨가하에 선택하였다. 모든 세포주(프로젝트 5의)는 동일한 항체를 발현하는 동일한 벡터를 포함하지만 서로 다른 CAI 스코어를 지니는 항체를 엔코딩하는 오픈 리딩 프레임으로부터이다. 프로젝트 5(a)(최적화되지 않은)에서 세 개의 추가적인 형질감염을 수행하였으나 결과를 본질적으로 백그라운드로서 도시하지 않았다. 도 (A)에서 "％ 역가＞5ng"는 5ng/ml 이상을 기록하는 스크리닝 후의 웰 ％를 의미한다. "％ 역가＞50ng"는 50ng/ml 이상을 기록하는 스크리닝 후의 웰 ％를 의미한다. "최고(top) 역가"는 스크리닝된 모든 역가 중 가장 높은 스코어의 역가를 의미한다. "50^th 값"은 스크리닝된 50회째 최상의 역가를 의미한다. "20^th 값"은 스크리닝된 20회째 최상의 역가를 의미한다. (B)에서는, (A)에 기록된 최고, 20^th 및50^th 역가에 대한 평균결과를 막대 그래프 형으로 도시하였다.

표 3.

프로젝트의 96-웰 플레이트에서의 자세한 역가 분석을 표 1에 도시하였다. 메토트렉세이트 첨가 없이 G418 첨가 및 누클레오시드 투여중지 선택 후 최상 및 50회째 최상의 클론 역가를 도시하였다.

표 4.

프로젝트 5 및 6에서 관찰된 최상위 20-100개 클론을 5nM 메토트렉세이트를 포함하는 배지에서 96-웰로 재-평판 배양하기 전에 6-웰 접시로 비율을 맞추었다. 96-웰 접시에서 메토트렉세이트 안티폴레이트 5nM(A1) 및 5OnM(A2) 농도에서 선택된 실험 5 및 6에서 관찰된 성장중인 클론의 평균 및 고 역가를 도시하였다.

표 2.

생산 안정기의 예: 예(A) 프로젝트 5(d)에 대해 최종 선택된 클론을 50nM MTX에서 추가적으로 증폭시켰다. 모 클론(음영처리)의 비유가 생산 모델 역가 및 '증폭된' 딸 클론의 결과적으로 얻어진 최고 역가를 도시하였다. 유사한 예(B, C, D, E, F, G) 또한 도시하였다. 추가적 증폭 후 딸 클론의 최상 역가의 예를 각각 기록하였다. 이것은 추가적인 증폭 라운드를 통해 더 높은 역가에 도달하는 것을 시도하는 것보다 초기에 더 높은 역가에 도달하는 것이 더 유익함을 입증한다.

실시예 3, 항체 6 및 7 및 EF -1a 프로모터

항체 6의 경우, 중쇄 및 경쇄 두 가지 모두의 오픈 리딩 프레임의 코돈 변형을 재차 수행하여, 0.9를 초과하는 ORF 전반에 거쳐 최종 CAI 스코어를 생성하였다(표 1을 참조). RSV 기초 프로모터 발현 벡터를 비롯한 인간 신장-인자-1 알파(EF-1a) 프로모터 기초 발현 벡터에서 야생형/시작 및 코돈 변형된 오픈 리딩 프레임을 발현시켰는데, 상기 발현 벡터 내에 시스 작동 인슐레이터, 인핸서 및 프로모터 발현 요소는 비-바이러스성 프로모터 소스로부터 대신 제공된다. 이 연구 결과는 원하는 단백질이 최초 코돈 변형되는 때 최종 고 생산 세포주 생성하기 위해 상당히 적은 메토트렉세이트가 필요함을 설명하였다. 실제로, 항체 6을 비-변형된 ORF에 의해 엔코딩한(즉 CAI 스코어＜0.9) 형질감염 6(a)은 생산 안정기에 근접한 세포 생성 이전에 5nM MTX단계에서 중단되었다. 0.9를 초과하는 ORF를 사용한(즉 형질감염 6(b) 및 6(d)) 세포주로부터 이미 획득한 수율과 상대적으로 동일한 수율로 단백질을 생산할 수 있는 세포주 생성하기 위해 상당히 더 많은 자원 및 시간이 필요함은 분명하기 때문에 형질감염 6(a)에서 증폭 섭생을 추가적으로 수행하지 않았다. 게다가, 벡터에 코돈 변형을 더하거나 빼서 동일한 대상에 대해 비교하는 경우, 코돈 변형은 필요한 안티폴레이트 수준을 감소시킴을 관찰하였다. 프로젝트 7에 대해, 코돈 변형을 프로젝트 6과 동일한 방법으로 다시 수행하였고(표1을 참조) 코돈 변형된 ORF(CAI＞0.9)을 EF-1a 프로모터 기초 발현 벡터와 마찬가지로 RSV에서 발현시켰다. 다시 한번, 프로모터와 상관없이, 등가 고 수율의 세포주는 비-변형된 ORF가 재조합 생성물을 엔코딩하는데 사용된 모든 기존의 프로젝트와 비교하였을 때 빠른 시간 안에 적은 메토트렉세이트를 사용하여 CAI 변형된 ORF로부터 생성되었다(표 1에 요약됨).

실시예 4, mRNA 수준

본 방법론을 추가적으로 연구하기 위해, 생성된 mRNA 수준에 미치는 코돈 변형의 영향을, 동일한 벡터로부터 그러나 서로 다른 CAI 스코어를 보고하는 오픈 리딩 프레임으로부터 동일한 생산물(프로젝트 5의 항체)을 발현하는 동일한 대상의 폴리클로날 세포 집단에서, 조사하였다. CHO 세포를 동일한 단백질 생산물(프로젝트 5의 항체)을 엔코딩하는 발현 벡터를 엔코딩하는 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)로 공동-형질감염시켰다. 각각 형질감염된 집단을 폴리클로날 풀로서 유지하였다. 각 벡터 쌍을 동일한 항체 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)이나 서로 다른 CAI 스코어를 가진 오픈 리딩 프레임으로부터 엔코딩하였다.

이 실험의 결과를 도 10에 도시하였고, CAI 스코어가 중쇄 및 경쇄 두 가지에 대해 비-변형된 컨트롤과 비교하여 증가한 경우 mRNA 수준에서 상당한 증가배수가 관찰되는 것으로 드러났다. 모든 변형된 서열 분석시 mRNA 수준에서 동등한 증가(시작 비 변형된 서열과 비교하여)가 발생하였다. 유사하게, 웨스턴 블롯 분석의 제한 내에서, 세포내 단백질 수준에서 모든 변형된 서열에 대해 동등한 증가가 관찰되었다. 그러나 세포내 단백질 수준에서 동등한 증가가 관찰되었다 할지라도, 분비된 수준에서 차이가 있었다. 매우 높은 CAI 스코어 오픈 리딩 프레임을 포함하는 세포가 더 높은 폴리클로날 역가를 생성함을 관찰하였다. 이것은 매우 높은 CAI 스코어 오픈 리딩 프레임이 세포주 개발 프로토콜에 사용될 경우 고 생산 클론의 범위가 향상된다는 결과를 추가적으로 지지한다.

도 10

(A): HC 및 LC 메시지의 세포내 RNA 수준을 RT Q-PCR에 의해 측정하였다: 모든 신호는 리보솜 RNA로 표준화되고 증가 배수는 비-코돈 변형된 오픈 리딩 프레임에 의해 엔코딩되는 시작 HC 및 LC 벡터에 의해 생성된 신호에 비례한다. Y축: RNA 신호의 0에서 50까지의 증가 배수값. X축:a(h)는 비-형질전환 세포(복제함)에서 얻은 RNA 추출물로부터 생성된 음성 대조군 HC 신호를 나타낸다; b(h)는 프로젝트 5(a)에서 사용된 것처럼(CAI 스코어가 HC는 0.809, LC는 0.761), 비-코돈 변형된 HC 및 LC 발현 벡터로 형질감염된 세포에서 유래된 RNA 추출물로부터 생성된 HC 신호를 나타낸다; c(h)는 프로젝트 5(b)에서 사용된 것처럼(CAI 스코어가 HC는 0.847, LC는 0.833), 코돈 변형된 HC 및 LC 발현 벡터로 형질감염된 세포에서 유래된 RNA 추출물로부터 생성된 HC 신호를 나타낸다; d(h)는 프로젝트 5(c)에서 사용된 것처럼(CAI 스코어가 HC는 0.872, LC는 0.894), 추가적으로 코돈 변형된 HC 및 LC 발현 벡터로 형질감염된 세포에서 유래된 RNA 추출물로부터 생성된 HC 신호를 나타낸다. 상기 상술한 동일한 RNA 추출물로부터 생성된 경쇄 신호를 a(l), b(l), c(l) 및 d(l)에 각각 도시하였다.

(B): 웨스턴 블롯 분석; 등가 세포 추출물을 SDS-Page로 분리하고, 블롯팅시키고 항-생산 항체(HRP 연결된)로 조사하였다. 비-형질감염 세포 대조군을 레인 1에 도시하였다. 하기와 같이 중쇄 및 경쇄 오픈 리딩 프레임 생산물을 발현하는 폴리클로날 세포; 레인 2 및 3; 0.809 CAI 스코어를 가지는 HC 및 0.761 CAI 스코어를 가지는 LC(상기 실험 b(h) 및 b(l)에서 발현된 단백질, 프로젝트 5(a)에서 사용된 것과 동일한 벡터); 레인 4 및 5; 0.847 CAI 스코어를 가지는 HC 및 0.833 CAI 스코어를 가지는 LC(상기 실험 c(h) 및 c(l)에서 발현된 단백질, 프로젝트 5(a)에서 사용된 것과 동일한 벡터); 레인 6 및 7; 0.872 CAI 스코어를 가지는 HC 및 0.894 CAI 스코어를 가지는 LC(상기 실험 d(h) 및 d(l)에서 발현된 단백질, 프로젝트 5(c)에서 사용된 것과 동일한 벡터); 레인 8 및 9; 0.982 CAI 스코어를 가지는 HC 및 0.976 CAI 스코어를 가지는 LC(프로젝트 5(d)에서 사용된 것과 동일한 벡터에 의해 발현된 단백질).

(C); 도 10(B)에 기술된 폴리클로날 세포에 대한 24시간 생성물 역가를 ng/ml로 기록하였다.

실시예 5, 높은 CAI 달성을 위한 또 다른 방법. 예(a) 프로젝트 8 및 예(b) 프로젝트 9.

a) 프로젝트 8에서 가변 도메인을 디자인하기 위해 레토(Leto) 소프트웨어를 사용하였다. 그 후 이것을 표준 제한 효소 절단 및 라이게이션 방법론의 도움으로 프로젝트 7에서 이미 생성한 동일한 불변 도메인과 융합하였다. 그 결과 얻은 중쇄 및 경쇄 ORF는 각각 0.954 및 0.919를 기록하였다. 그 후 이것을 세포주 개발 프로젝트에 사용하였고 코돈 변형에 앞서 다시 한번 본 발명자들은 빠른 시간 프레임 안에 이전에 이미 사용한 것보다 더 적은 메토트렉세이트를 사용하여 고 수율의 세포주를 생성하였다(표 1을 참조).

b) 프로젝트 9에서 가변 도메인을 디자인하기 위해 재차 레토 소프트웨어를 사용하였다. 이것을 표준 제한 효소 소화 및 라이게이션 방법론의 도움으로 프로젝트 6(d)에서 이미 생성한 동일한 불변 도메인과 융합하였다. 그 결과 얻은 중쇄 및 경쇄 ORF는 각각 0.975 및 0.973을 기록하였다. 그 후 이것을 세포주 개발 프로젝트에 사용하였고 코돈 변형에 앞서 다시 한번 본 발명자들은 빠른 시간 프레임 안에 이전에 이미 사용한 것보다 더 적은 메토트렉세이트를 사용하여 고 수율의 세포주를 생성하였다(표 1을 참조).

실시예 6 . 글리코실화에 따른 영향

비-글리코실화 중쇄(NGHC)의 수준은 코돈-변형된 오픈 리딩 프레임에서 발현되는 경우, 비-변형된 오픈 리딩 프레임에서 발현될 때 생성된 수준에 비교하여, 상기 두 경우에서 발현을 위해 동일한 숙주, 배양 배지 및 DHFR 선택 및 증폭 시스템을 사용하였다 할지라도, 상당히 낮다는 것에 주의하였다. 더욱 흥미롭게도 동일한 비-변형된 오픈 리딩 프레임이 서로 다른 숙주 사용하여 서로 다른 배양 조건 및 다른 벡터, 선택 및 증폭 단계(글루타민 합성효소/MSX)에서 대신 발현될 때 유사한 고 수준의 NGHC를 또한 관찰하였다(도 12를 참조). 오픈 리딩 프레임의 코돈 변형 및 비-글리코실화된 중쇄의 감소된 수준 사이의 상관관계는, 오픈 리딩 프레임의 CAI 스코어를 증가시킴으로서 전반적인 생산물의 질도 또한 향상시킬 수 있음을 나타낸다.

6.1 론자(Lonza) CHOK1SV를 이용한 세포주 개발 및 글루타민 합성효소 선택 시스템(도 12)

벡터 작제 및 세포주 개발은 권장된 론자(Slough) 프로토콜에 따라 착수하였다. 모든 경우에 사용된 배지는 CD-CHO(인비트로겐)이다. 비-변형된 오픈 리딩 프레임을 포함한 항체 프로젝트 5(a)에서 사용된 오픈 리딩 프레임을 론자 벡터 pEE14.4(경쇄에 대해) 및 pEE6.4(중쇄에 대해)속에서 최초로 서브-클론하였다. 상기 벡터를 권장된 론자 프로토콜에 따라 중쇄 및 경쇄를 발현하는 싱글 더블 유전자 벡터 속에 결합시켰다. 그 다음 론자 권장된 지시에 따라 이 벡터를 전기천공법을 이용하여 CHOK1SV 숙주세포로 명명된 론자 현탁액에 적응된 CHOK1 계통으로 옮기고, 역시 권장된 방법인 글루타민 투여 중지 및 MSX 첨가에 의해 선택하고 증폭시켰다. 클론 결과물을 96-웰에서 적정하고 진탕 플라스크 안에서 최대로 확장시키고 추가적으로 평가하였다. 거대 스케일의 생물반응기 안에서 생산물을 만들기 위한 최상의 클론을 선택하였다. 이 접근법에 대한 추가적인 일반적 상세한 설명을 위해 문헌[de La Cruz Edmonds et al 2006 Molecular Biotechnology 34:179-190]을 참조하라.

6.2 생산물 NGHC 분석

단백질을 단백질 A 컬럼을 이용하여 배양 상등액으로부터 정제하였다. 그 후 환원(reducing) 조건하에서 제조자의 프로토콜에 따라 생산물을 SDS 모세 전기천공법 생물분석기(Bioanalyzer) 랩-온-어-칩(lab-on-a-chip) 장비(Agilent Technologies, Cheshire UK)를 사용하여 분석하였다. 주 글리코실화된 중쇄 종과 비교하여 약간 더 빠르게 이동하는 종에서 비-글리코실화된 중쇄를 관찰하였다(도 12B를 참조).

도 12 - 표(A) 모든 분석의 대표 데이타 도시. 서로 다른 선택 및 증폭 프로토콜(글루타민 합성효소/메토트렉세이트)에서 서로 다른 숙주 세포, 벡터, 배지 및 배양 단계를 사용하여 비-변형된 오픈 리딩 프레임을 발현시키기 위해 수행한 추가적인 연구를 포함한다(상기 예 6.1을 참조). (B) 시작 비 변형된 ORF로부터 관찰된 예시 NGHC 트레이스 대 코돈 변형된 ORF. 이 분석은 동일한 크기(1000-리터) 생물반응기로부터 정제된 생산물에서 수행하였다. 상기 대표적인 트레이스 오버레이에서, 비 변형된 ORF(CAI: HC 0.809, LC 0.761)로부터의 생성물을 발현시키는 생물반응기 세포 배양 수확물은 1.5％ 비-글리코실화된 중쇄만을 함유하는 변형된 ORF(CAI:HC 0.982, LC 0.976)로부터 생산된 생산물과 비교하여 위치점유가 감소된 중쇄(10％ 비-글리코실화된 중쇄)를 생성시켰다.

실시예 7 . 최종 세포주에서 선택 및 증폭제 수준의 영향

유전자 복제수를 증가시켜 발현을 증가시키기 위해 DHFR 선택 시스템에서 MTX 선택 및 증폭제의 양을 증가하는 첨가 또는 단계적 적정을 수행하였다. 형질감염된 플라스미드 DNA의 유전자 복제 수에 미치는 코돈 변형의 영향을 조사하기 위해, 두 개의 상이한 반-정량적 방법론을 사용하였다(실험에 대한 설명을 위해 섹션 1.13 및 1.14를 참조)

첫째로, FACS 분석을 사용하였다. 상기 목적을 위해 프로젝트 2, 3, 4, 5(d), 6(d) 및 7(b)의 최종 세포주 또는 이의 단일 세포 클론을 형광성 메토트렉세이트로 염색하고 FACS로 분석하였다. 결과는(도 14A에 도시됨) 평균 형광 강도로 표시된 메토트렉세이트의 수준을 설명하고, 따라서 DHFR 수준은 세포주의 증폭 수준과 서로 관련이 있는바, 즉 5nM MTX(프로젝트 5(d), 6(d) 및 7(b))에서 선택된 최종 세포주는 가장 낮은 DHFR 수준을, 150nM MTX(프로젝트 3)에서 선택된 최종 세포주는 가장 높은 DHFR 수준을 가진다. 게다가 DHFR 및 Neo에 대한 qPCR을 프로젝트 3, 4, 5(a), 5(d), 7(b) 및 9의 최종 세포주 또는 이의 단일 세포 클론으로부터 추출한 유전체 DNA에 수행하였다. 결과(도 14B에 도시됨)는 5nM MTX에서 선택된 라인(프로젝트 5(d), 7(b) 및 9)은 15OnM MTX(프로젝트 3, 4 및 5(a))에서 선택된 라인보다 상당히 낮은 DHFR 및 Neo의 DNA 수준- 및 이에 따른 낮은 복제 수- 을 가짐을 입증한다.

상기 상술한 결과는 코돈 변형된 ORF(프로젝트 5(d), 6(d), 7(b) 및 9의 예)에서 유래된 세포주가 비 변형된 ORF(프로젝트 2, 3, 4, 5(a)의 예)에서 유래된 라인과 비교하여 더 적은 복제 수를 가짐을 설명한다. 따라서 코돈 변형된 ORF(CAI＞0.9)의 이용은(비-변형된 ORF에서 유래된 세포주와 비교한 경우) 동일 또는 더 높은 역가로, 형질감염된 DNA의 낮은 수준의 증폭 및 낮은 복제 수로 세포주의 생성을 야기한다. 더 낮은 복제 수, 더 낮은 증폭 발현 벡터를 이용하여 동등 또는 더 높은 수준의 항체를 만드는 클론의 생성은 매우 바람직하다. 예를 들어, 통합 발현 벡터의 복제 수가 증가될 때 반복-유래된 유전자 침묵(RIGS)이 유도될 수 있고 이와 같은 RIGS는 이후 포유류 세포내에서 그러한 벡터로부터 감소된 발현 수준을 야기할 수 있다는 것이 드러났다(예를 들어, 문헌[McBurney MW et al Exp Cell Res 2002 274:1-8]을 참조).

도 14. (A) 프로젝트 2, 3, 4, 5(d), 6(d) 및 7(b) 각각의 최종 세포주에서 관찰된 평균 형광 플롯. 상술한 재료 및 방법으로 DHFR에 세포 염색을 수행하였다, 예1. (B) 프로젝트 3, 4, 5(a), 5(d), 7(b) 및 9에 대한 최종 세포주로부터 얻은 유전체 DNA에 qPCR에 의한 DHFR 및 Neo DNA의 수준. qPCR을 상술한 재료 및 방법으로 수행하였다, 예 1. 관찰된 수준의 기준을 정하기 위해, DHFR 및 Neo에 대한 가장 낮은 값(프로젝트 7(b)에서 보여짐)을 1로 설정하고 모든 다른 값을 이에 상대적인 증가 배수로서 구성하였다. 또한 이하 각 값은 분석된 세포주에 의해 발현된 단백질이 CAI > 0.9를 가진 ORF로부터인지 여부(Y= Yes 및 N=No) 및 세포주를 생성하기 위해 필요한 MTX 수준(nM MTX로)을 표시한다.

서열 목록

SEQUENCE LISTING <110> UDEN Mark KOTSOPOULOU, Ekaterina <120> Production Method <130> PB62449P <150> US60/956772 <151> 2007-08-20 <160> 25 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/Probe <400> 1 tggctgaacg ccacttgtcc ctctaaa 27 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/Probe <400> 2 aggaattgac ggaagggcac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/Probe <400> 3 ggacatctaa gggcatcaca 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/Probe <400> 4 ctccggctgc ccattgctct cc 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/Probe <400> 5 ggaggcgtgg tcttgtagtt g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/Probe <400> 6 ggcttctatc ccagcgacat c 21 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/Probe <400> 7 tctcgtagtc tgctttgctc agcgtca 27 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/Probe <400> 8 cttcgcaggc gtagactttg t 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/Probe <400> 9 gccctccaat cgggtaactc 20 <210> 10 <211> 1392 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain <400> 10 atggagttgg ggctgtgctg ggttttcctt gttgctattt tagaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120 tgtgcagtct ctggattcac cttcagtgac aacggaatgg cgtgggtccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtgggt ttcattcatt agtaatttgg catatagtat cgactacgca 240 gacactgtga cgggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc actgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgtcag cgggacctgg 360 tttgcttact ggggccaggg cacactagtc acagtctcct cagcctccac caagggccca 420 tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc 480 tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 540 accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 600 agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat 660 cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact 720 cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcgcggggg caccgtcagt cttcctcttc 780 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 840 gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 960 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020 tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1080 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 1140 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1260 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1320 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1380 tctccgggta aa 1392 <210> 11 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain <400> 11 atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct gggtctctgg atccagtggg 60 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 120 atctcctgca gagttagtca gagcctttta cacagtaatg gatacaccta tttacattgg 180 tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct ataaagtttc caaccgattt 240 tctggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 300 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgct ctcaaactag acatgttccg 360 tacacgttcg gcggagggac caaggtggaa atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc 420 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggacaa cgccctccaa 540 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 717 <210> 12 <211> 1392 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon adapted Heavy chain <400> 12 atggagctcg ggctgtgctg ggtgttcctc gtggccatcc tggagggagt gcagtgtgag 60 gtgcagctgg tggagagtgg gggcggcctg gtgcagcccg gcggcagcct gcggctgtcg 120 tgcgccgtga gcggcttcac cttcagtgac aacggcatgg cttgggtcag gcaggccccc 180 ggaaaggggc tcgagtgggt gagcttcatc agtaacctgg cctacagtat cgactatgct 240 gacaccgtga ccggccgctt cactatctct cgggataatg ctaagaacag cctgtacctc 300 cagatgaaca gcctgcgcgc tgaggacacc gccgtgtact actgcgtgtc tggaacctgg 360 ttcgcctact ggggccaggg tacactagtc acagtctcct cagcctccac caagggccca 420 tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc 480 tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 540 accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 600 agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat 660 cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact 720 cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcgcggggg caccgtcagt cttcctcttc 780 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 840 gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 960 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020 tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1080 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 1140 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1260 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1320 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1380 tctccgggta aa 1392 <210> 13 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon adapted Light chain <400> 13 atgcgcctgc ctgcccagct gctcggcctg ctgatgctgt gggtgtcggg cagctccggc 60 gacatcgtca tgacccagag ccccctgagt ctccccgtca cccccggcga acctgccagc 120 atcagctgca gggtgtccca gtcgctgctc cattccaacg ggtacacgta cctgcattgg 180 tacctgcaga agcccgggca atcccctcag ctgctgatct acaaggtgag caaccgcttc 240 tccggcgtcc cggaccggtt cagtggcagc ggctctggaa ccgacttcac cctgaaaatc 300 agccgcgtgg aagctgagga cgtgggcgtc tactactgca gccagacccg gcatgtgccc 360 tacaccttcg gcggcggcac aaaggtggag atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc 420 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggacaa cgccctccaa 540 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 717 <210> 14 <211> 1392 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon adapted Heavy chain <400> 14 atggagctgg gcctgtgctg ggtgttcctg gtggccatcc tggagggcgt gcagtgcgag 60 gtgcagctgg tggagagcgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggcagcct gcgcctgagc 120 tgcgccgtga gcggcttcac cttcagcgac aacggcatgg cctgggtgcg ccaggccccc 180 ggcaagggcc tggagtgggt gagcttcatc agcaacctgg cctacagcat cgactacgcc 240 gacaccgtga ccggccgctt caccatcagc cgcgacaacg ccaagaacag cctgtacctg 300 cagatgaaca gcctgcgcgc cgaggacacc gccgtgtact actgcgtgag cggcacctgg 360 ttcgcctact ggggccaggg cacactagtc acagtctcct cagcctccac caagggccca 420 tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc 480 tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 540 accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 600 agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat 660 cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact 720 cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcgcggggg caccgtcagt cttcctcttc 780 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 840 gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 960 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020 tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1080 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 1140 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1260 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1320 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1380 tctccgggta aa 1392 <210> 15 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon adapted Light chain <400> 15 atgcgcctgc ccgcccagct gctgggcctg ctgatgctgt gggtgagcgg cagcagcggc 60 gacatcgtga tgacccagag ccccctgagc ctgcccgtga cccccggcga gcccgccagc 120 atcagctgcc gcgtgagcca gagcctgctg cacagcaacg gctacaccta cctgcactgg 180 tacctgcaga agcccggcca gagcccccag ctgctgatct acaaggtgag caaccgcttc 240 agcggcgtgc ccgaccgctt cagcggcagc ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc 300 agccgcgtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgca gccagacccg ccacgtgccc 360 tacaccttcg gcggcggcac caaggtggag atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc 420 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggacaa cgccctccaa 540 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 717 <210> 16 <211> 1392 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon adapted Heavy chain <400> 16 atggagctgg gcctgtgctg ggtgttcctg gtggccatcc tggagggcgt gcagtgcgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg cggcggactg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc 120 tgtgccgtgt ccggcttcac cttcagcgac aacggcatgg cctgggtgag gcaggcccct 180 ggcaagggcc tggagtgggt gtccttcatc agcaacctgg cctacagcat cgactacgcc 240 gacaccgtga ccggcagatt caccatcagc cgggacaacg ccaagaacag cctgtacctg 300 cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacc gccgtgtact actgtgtgag cggcacctgg 360 ttcgcctact ggggccaggg caccctggtg accgtgtcca gcgccagcac caagggcccc 420 agcgtgttcc ccctggcccc cagcagcaag agcaccagcg gcggcacagc cgccctgggc 480 tgcctggtga aggactactt ccccgaaccg gtgaccgtgt cctggaacag cggagccctg 540 accagcggcg tgcacacctt ccccgccgtg ctgcagagca gcggcctgta cagcctgagc 600 agcgtggtga ccgtgcccag cagcagcctg ggcacccaga cctacatctg taacgtgaac 660 cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaggtggagc ccaagagctg tgacaagacc 720 cacacctgcc ccccctgccc tgcccccgag ctggccggag cccccagcgt gttcctgttc 780 ccccccaagc ctaaggacac cctgatgatc agcagaaccc ccgaggtgac ctgtgtggtg 840 gtggatgtga gccacgagga ccctgaggtg aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900 gtgcacaatg ccaagaccaa gcccagggag gagcagtaca acagcaccta ccgggtggtg 960 tccgtgctga ccgtgctgca ccaggattgg ctgaacggca aggagtacaa gtgtaaggtg 1020 tccaacaagg ccctgcctgc ccctatcgag aaaaccatca gcaaggccaa gggccagccc 1080 agagagcccc aggtgtacac cctgccccct agcagagatg agctgaccaa gaaccaggtg 1140 tccctgacct gcctggtgaa gggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200 aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc accccccctg tgctggacag cgatggcagc 1260 ttcttcctgt acagcaagct gaccgtggac aagagcagat ggcagcaggg caacgtgttc 1320 agctgctccg tgatgcacga ggccctgcac aatcactaca cccagaagag cctgagcctg 1380 tcccctggca ag 1392 <210> 17 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon adapted Light chain <400> 17 atgagactgc ccgcccagct gctgggcctg ctgatgctgt gggtgtccgg cagcagcggc 60 gacatcgtga tgacccagag ccccctgagc ctgcccgtga cccctggcga gcccgccagc 120 atcagctgta gagtgagcca gagcctgctg cacagcaacg gctacaccta cctgcactgg 180 tatctgcaga agcctggcca gagccctcag ctgctgatct acaaggtgtc caaccggttc 240 agcggcgtgc ctgatagatt cagcggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 300 agcagagtgg aggccgagga tgtgggcgtg tactactgct cccagaccag acacgtgcct 360 tacacctttg gcggcggaac aaaggtggag atcaagcgta cggtggccgc ccccagcgtg 420 ttcatcttcc cccccagcga tgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgtctg 480 ctgaacaact tctacccccg ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa tgccctgcag 540 agcggcaaca gccaggagag cgtgaccgag caggacagca aggactccac ctacagcctg 600 agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgtgag 660 gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagagct tcaaccgggg cgagtgc 717 <210> 18 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H2L1 Heavy chain <400> 18 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Ser Ile Asp Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 19 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H2L1 light chain <400> 19 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Val Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Thr 85 90 95 Arg His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/probe <400> 20 gaggcagttc tgtttaccag gaa 23 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/probe <400> 21 cctgcatgat ccttgtcaca a 21 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DHFR probe <400> 22 ccatgaatca accaggccac ctcag 25 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/probe <400> 23 gcccggttct ttttgtcaag 20 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/probe <400> 24 ctgcctcgtc ctgcagttc 19 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/probe <400> 25 ccgacctgtc cggtgccctg 20

Claims

하기 단계를 포함하는 하나 이상의 치료용 단백질을 생산하는 포유동물 세포주의 생산 방법:
a) 하나 이상의 치료용 단백질을 엔코딩하는 제 1 폴리누클레오티드 서열을 획득하는 단계,
b) 상기 제 1 폴리누클레오티드 서열을 변형시켜 제 2 폴리누클레오티드 서열을 획득하는 단계로서, 상기 제 2 폴리누클레오티드 서열의 코돈 변형 지수(codon adaptation index)가 상기 제 1 폴리누클레오티드 서열의 코돈 변형 지수보다 높고 상기 제 1 및 제 2 폴리누클레오티드는 동일한 치료용 단백질을 엔코딩하는, 단계,
c) 단계 (a)의 상기 제 1 폴리누클레오티드 서열 및 포유동물 세포주의 제 1 세포 안에서 상기 제 1 폴리누클레오티드 서열의 증폭을 제공할 수 있는 선택 마커(selection marker)를 엔코딩하는 제 3 폴리누클레오티드 서열로 포유동물 세포주의 하나 이상의 제 1 세포를 형질전환시키고,
단계 (b)의 상기 제 2 폴리누클레오티드 서열 및 포유동물 세포주의 제 2 세포 안에서 상기 제 2 폴리누클레오티드 서열의 증폭을 제공할 수 있는 선택 마커를 엔코딩하는 상기 제 3 폴리누클레오티드 서열로 포유동물 세포주의 하나 이상의 제 2 세포를 형질전환시키는 단계,
d) 다수의 세포를 포함하는 제 1 세포주를 생성하기 위해 단계 (c)의 상기 하나 이상의 제 1 세포를, 소정 농도 또는 점증 농도의 (i) 단계 (c)의 상기 제 3 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩되는 선택 마커를 불충분한 수준으로 발현시키는 상기 세포주 내의 세포의 성장을 억제하는 선택제 및 (ii) 유전자 복제수를 증가시키는 증폭제를 포함하는 배지에서 배양하고,
다수의 세포를 포함하는 제 2 세포주를 생성하기 위해 단계 (c)의 상기 하나 이상의 제 2 세포를, 소정 농도 또는 점증 농도의 (i) 단계 (c)의 상기 제 3 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩되는 선택 마커를 불충분한 수준으로 발현시키는 상기 세포주 내의 세포의 성장을 억제하는 선택제 및 (ii) 유전자 복제수를 증가시키는 증폭제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
e) 상기 제 2 세포주 안에서 상기 제 2 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩되는 단백질의 생산의 최대 수준에 도달되면 상기 제 2 세포주를 선택하는 단계로서, 선택제 및 증폭제의 농도는 상기 제 1 폴리누클레오티드로 형질전환된 상기 제 1 세포주 안에서 생산된 상기 단백질의 동일한 생산 수율에 도달되는데 필요한 것보다 더 낮은 단계.
제 1항에 있어서, 상기 제 2 세포주 안에서 생산된 제 2 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩되는 단백질의 생산의 최대 수준에 상기 제 1 폴리누클레오티드로 형질전환된 상기 제 1 세포주 안에서 생산된 단백질의 동일한 생산 수율에 도달되는데 필요한 것보다 더 적은 증폭 횟수를 거쳐 도달되는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 제 2 세포주가 생물반응기(bioreactors) 안에서 배양되고 생산된 치료용 단백질이 정제되는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 제 2 폴리누클레오티드 서열의 코돈 변형 지수가 0.9를 초과하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 선택제 및 증폭제의 수준이 제 1 폴리누클레오티드 서열을 이용한 동일한 방법에 사용된 선택제 및 증폭제의 양과 비교할 때 50％ 미만으로 감소되는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 치료용 단백질이 항체, 이의 유도체 또는 항원 결합 단편인 방법.
제 4항에 있어서, 치료용 단백질이 항체, 이의 유도체 또는 항원 결합 단편인 방법.
제 6항에 있어서, 상기 치료용 단백질이 단일클론항체인 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 형질전환되는 포유동물 세포주의 제 1 세포 및 포유동물 세포주의 제 2 세포가 내생성 세포 효소의 파괴 또는 억제 때문에 물질대사적으로 결함있는 방법.
제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, 형질전환되는 포유동물 세포주의 제 1 세포 및 포유동물 세포주의 제 2 세포가 누클레오시드 합성 경로에서 결함있는 방법.
제 10항에 있어서, 선택 마커가 디하이드로폴레이트 환원효소(Dihydrofolate reductase)(DHFR)를 엔코딩하는 폴리누클레오티드이고 상기 선택제 및 증폭제가 안티폴레이트(antifolate)인 방법.
제 11항에 있어서, 상기 안티폴레이트가 메토트렉세이트(methotrexate, MTX)인 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 선택 마커가 글루타민 합성효소(Glutamine synthetase)를 엔코딩하는 폴리누클레오티드이고 선택제 및 증폭제가 메티오닌 설폭시민(methionine sulfoximine, MSX)인 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단백질 생산의 최대 수준에 도달하기 위해 1회의 증폭만이 필요한 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 최종 수율이 비유가식 배치(unfed batch)에서 0.5g/L를 초과하는 방법.
제 12항에 있어서, 사용된 MTX의 농도가 50nM과 동일 또는 그 미만인 방법.
제 12항에 있어서, 사용된 MTX의 농도가 5nM인 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 세포주가 CHO 또는 NSO인 방법.
하기 단계를 포함하는 하나 이상의 치료용 단백질을 생산하는 포유동물 세포주의 생산 방법:
a) (i) 상기 치료용 단백질을 엔코딩하고 0.9와 동일 또는 0.9를 초과하는 코돈 변형 지수를 갖는 서열, 및 (ii) 폴리누클레오티드 서열의 증폭을 제공할 수 있는 선택 마커를 엔코딩하는 서열을 포함하는 폴리누클레오티드 서열로 세포주를 형질전환하는 단계;
b) (i) 선택 마커를 불충분한 수준으로 발현시키는 상기 세포주 내의 세포의 성장을 억제하는 선택제 및 (ii) 유전자 복제수를 증가시키는 증폭제의 존재 하에서 하나 이상의 증폭 횟수를 제공하는 단계; 및
c) 상기 치료용 단백질이 생산의 최대 수준에 도달되면 상기 세포주를 선택하는 단계로서, 여기서 (i) 선택 마커를 불충분한 수준으로 발현시키는 상기 세포주 내의 세포의 성장을 억제하는 선택제 및 (ii) 유전자 복제수를 증가시키는 증폭제의 농도가 0.9 미만의 코돈 변형 지수를 갖는 치료용 단백질을 엔코딩하는 서열과 비교하여, 동일한 생산 수율에 도달하는데 필요한 농도의 50% 이하인 단계.
제 19항에 있어서, 상기 선택제 및 증폭제가 MSX 또는 MTX이거나; 동일한 생산 수율에 도달하는데 1회의 증폭이 요구되거나; 또는 상기 선택제 및 증폭제가 MSX 또는 MTX이고 동일한 생산 수율에 도달하는데 1회의 증폭이 요구되는 방법.
제 19항 또는 제 20항에 있어서, 상기 치료용 단백질이 항체, 이의 유도체 또는 항원 결합 단편인 방법.
치료용 단백질을 엔코딩하고 0.9와 동일하거나 0.9를 초과하는 코돈 변형 지수를 가지는 이종 폴리누클레오티드 서열을 포함하고, 상기 폴리누클레오티드 서열의 증폭을 제공하는 선택마커를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열을 추가로 포함하는 치료용 단백질을 생산하는 포유동물 세포주로서, 상기 세포주는 상기 선택 마커를 엔코딩하는 이종 폴리누클레오티드 서열 및 상기 치료용 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하고 0.9 미만인 코돈 변형 지수를 갖는 세포주와 비교하여 더 높은 수율로 상기 치료용 단백질을 생산하고, 더 낮은 수준의 선택 마커 및 형질감염된 DNA의 낮은 복제 수를 갖고, 상기 포유동물 세포주는 50nM 또는 50nM 미만의 메톡트렉세이트(MTX)를 선택제 및 증폭제로서 포함하는 배지에서 선택되는 포유동물 세포주.
제 22항에 있어서, 0.9 이상의 CAI 스코어를 갖는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 하나 이상의 발현 카세트 및 증폭 가능한 선택가능 마커를 포함하는 제 2 발현 카세트를 포함하는 벡터를 포함하는 포유동물 세포주.
제 22항에 있어서, 증폭가능한 선택가능 마커를 포함하는 제 2 발현카세트와 작동가능하게 연결된, 상기 세포주 내부에 포함된 0.9 이상의 CAI 스코어를 갖는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 증폭된 발현 카세트를 포함하는 포유동물 세포주.
제 1항, 제 2항 또는 제 19항의 방법에 의해 얻어질 수 있는 포유동물 세포주.
제21항에 있어서, 생산된 항체 조성물이 하나 이상의 중쇄를 포함하고 비 글리코실화된 중쇄를 5％ 또는 그 미만으로 가지는 방법.
제 21항에 있어서, 생산된 항체 조성물이 95％ 이상의 글리코실화된 중쇄를 포함하는 방법.
제 21항에 있어서, 생산된 항체 조성물이 96％ 글리코실화된 중쇄를 포함하는 방법.
제 21항에 있어서, 생산된 항체 조성물이 97％의 글리코실화된 중쇄를 포함하는 방법.
제 21항에 있어서, 생산된 항체 조성물이 98％ 글리코실화된 중쇄를 포함하는 방법.
제 26항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 방법.
제 31항에 있어서, 모노클로날 항체가 항-β-아밀로이드 항체인 방법.
제 32항에 있어서, 상기 항-β-아밀로이드 항체가 SEQ ID NO 18의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO 19의 경쇄 서열을 지니는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 선택제의 수준이 제 1 폴리누클레오티드 서열을 이용한 동일한 방법에 사용된 선택제의 양과 비교할 때 25％ 미만으로 감소된 방법.
제 5항에 있어서, 상기 선택제의 수준이 제 1 폴리누클레오티드 서열을 이용한 동일한 방법에 사용된 선택제의 양과 비교할 때 5％ 미만으로 감소된 방법.
제 5항에 있어서, 상기 선택제의 수준이 제 1 폴리누클레오티드 서열을 이용한 동일한 방법에 사용된 선택제의 양과 비교할 때 3％ 미만으로 감소된 방법.
제 7항에 있어서, 상기 치료용 단백질이 단일클론항체인 방법.