KR20120091251A - Ｓｏｒｆ 작제물 및 다중 유전자 발현 - Google Patents

Abstract

본 발명의 양태들은 치료용 항체와 같은 다합체성 생성물을 포함하는 폴리펩타이드의 발현을 위한 벡터 작제물 및 방법에 관한 것이다. 특수한 작제물은 단일 전사 해독 프레임(sORF)으로부터 발현 생성물의 생성을 허용한다. 하나의 양태는 단일 전사 해독 프레임 삽입체를 포함하는 하나 이상의 재조합체 단백질 생성물을 생성하기 위한 분리되거나 정제된 발현 벡터를 제공하며; 상기 삽입체는 시그날 펩타이드를 암호화하는 시그날 펩타이드 핵산 서열; 제1의 폴리펩타이드를 암호화하는 제1의 핵산 서열; 제1의 단백질 절단 부위를 암호화하는 제1의 개재 핵산 서열을 포함하며, 여기서 상기 제1의 단백질 절단 부위는 파이로코쿠스의 lon 프로테아제 유전자 또는 파이로코쿠스 또는 메타노코쿠스의 klbA 유전자의 인테인 분절, 또는 이들로부터 기원한 변형된 인테인 분절에 의해 제공되며; 제2의 폴리펩타이드를 암호화하는 제2의 핵산 서열을 포함한다. 작제물 및 방법의 특정 양태는 파이로코쿠스 아비씨, 파이로코쿠스 푸리오수스 또는 파이로코쿠스 호리코시이 OT3의 lon 프로테아제 유전자의 인테인 분절; 또는 파이로코쿠스 아비씨, 파이로코쿠스 푸리오수스 또는 메타노코쿠스 잔나스키이의 klbA 유전자의 인테인 분절; 또는 다른 인테인 분절을 사용한다.

Description

ＳＯＲＦ 작제물 및 다중 유전자 발현{SORF CONSTRUCTS AND MULTIPLE GENE EXPRESSION}

관련 출원의 전후 참조

본원은, 이의 전문이 본원에 참조로 혼입된, 제랄드 알, 카슨(Gerald R. Carson) 등에 의해 2009년 10월 30일자로 출원된, 미국 가특허원 제61/256,544호의 이익을 청구한다.

연방 정부에서 지원하는 연구 또는 개발에 대한 설명

해당사항 없음

서열 목록, 표 또는 컴퓨터 프로그램 목록 컴팩트 디스크 부록에 대한 참조

해당사항 없음(서열 목록은 제공되나 컴팩트 디스크 부록으로는 제공되지 않음)

재조합체 발현 기술의 분야에서, 바람직한 단백질 생성물의 고 생산 수준의 달성 및 바람직한 순도의 생성물을 생성하는 능력은 진행중인 챌린지(challenge)를 나타낸다. 이러한 챌린지는 항체인 생물학적 치료제를 포함하는 단백질 생성물에 특히 관련되어 있지만, 당해 분야에서의 진전은 또한 다른 생물제에도 관련성이 있다. 본 발명의 특정 양태는 적어도 부분적으로 이러한 챌린지의 하나 이상의 국면에 초점이 맞추어져 있다.

다음 약어들이 적용가능하다: ORF, 전사 해독 프레임(open reading frame); sORF, 단일 전사 해독 프레임; MW, 분자량; HC 또는 H, 면역글로불린 중쇄; LC 또는 L, 면역글로불린 경쇄; pab, 파이로코쿠스 아비씨(Pyrococcus abyssi); pfu, 파이로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus); pho, 파이로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii) OT3; aa 또는 AA, 아미노산(들); SP, 단일 펩타이드; LCSP, 경쇄 시그날 펩타이드; MTX, 메토트렉세이트.

본 발명의 양태는 일반적으로 재조합체 발현 및, 재조합체 폴리프로테인(polyprotein) 및 전-단백질(pre-protein)의 해독-후 프로세싱(post-translational processing)을 포함하는 프로세싱을 위한 발현 카세트(expression cassette), 벡터 작제물, 재조합체 숙주 세포 및 방법에 관한 것이다. 양태들에서, 하나 이상의 발현된 생성물은 면역글로불린이다.

양태들에서, 발현 벡터는 하나 이상의 인테인 분절(intein segment)을 포함한다. 양태들에서, 인테인 분절들은 유기체 파이로코쿠스 아비씨, 파이로코쿠스 푸리오수스, 및 파이로코쿠스 호리코시이 OT3 중 하나 이상의 lon 인테인(lon intein)으로부터 기원한다.

양태들에서, 작제물의 구조(architecture)는 특정한 성분의 순서 및 존재 또는 부재의 관점에서 구성된다. 하나의 양태에서, 특정 벡터 유전자 분절의 순서는 HL이고, 여기서 H 및 L은 각각 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 나타낸다. 다른 양태에서, 순서는 LH이다. 특수 양태에서, 작제물은 (-)로 표지된 설계를 갖고, 여기서 마이너스 신호는 ORF의 개시부에서 1개의 시그날 펩타이드 및 인테인의 마지막 아미노산과 제2 단백질 소단위의 제1 아미노산, 예를 들면, 인테인 다음의 성숙한 항체 쇄 사이에 삽입된 메티오닌을 가짐을 나타낸다. 특수 양태에서, 작제물은 (+)로 표지된 설계를 가지고, 여기서 플러스 신호는 ORF의 개시부에서 제1의 시그날 펩타이드 및 인테인의 제2 단백질 소단위 하부의 개시부에서 제2의 시그날 펩타이드의 존재를 나타낸다. 특수 양태에서, 구조는 HL(-)이다.

양태들에서, 본 발명은 일시적인 발현 조건하에서 실험들로부터 배양 상층액 속에서 측정하는 경우 분비된 생성물 ml당 2, 5, 10, 20, 30, 40, 또는 50 마이크로그람 초과인 단백질 발현 수준을 생산할 수 있는 sORF(단일 전사 해독 프레임) 작제물 설계를 제공한다. 양태들에서, 본 발명은 안정한 CHO(차이니즈 햄스터 난소) 세포 발현 시스템을 사용하는 조건을 사용한 실험으로부터 배양 상층액에서 측정시 1일당 ml당 20마이크로그람 초과인 단백질 발현 수준을 생산할 수 있는 sORF 작제물을 제공한다. 하나의 양태에서, 발현 수준(㎍/ml/일)은 1 내지 24, 10 초과 또는 20 초과의 범위이다. 특수 양태에서, 발현 수준은 24㎍/ml/일이다. 양태들에서, 단백질 발현은 중쇄 및 경쇄의 다합체성 단위로 자가-조립되는 분비된 항체이다. 양태들에서, 항체는 IgG 동형이다.

하나의 양태에서, 본 발명은

(a) 시그날 펩타이드를 암호화하는 시그날 펩타이드 핵산 서열;

(b) 제1의 폴리펩타이드를 암호화하는 제1의 핵산 서열;

(c) 제1의 단백질 절단 부위를 암호화하는 제1의 개재(intervening) 핵산 서열(여기서 상기 제1의 단백질 절단 부위는 파이로코쿠스의 lon 프로테아제 유전자 또는 파이로코쿠스 또는 메타노코쿠스의 klbA 유전자 또는, 이로부터 기원한 변형된 인테인 분절이다); 및

(d) 제2의 폴리펩타이드를 암호화하는 제2의 핵산 서열을 포함하는 단일 전사 해독 프레임 삽입체를 포함하는 하나 이상의 재조합체 단백질 생성물을 생성하기 위한 분리되거나 정제된 발현 벡터를 제공하며, 여기서 상기 제1의 단백질 절단 부위를 암호화하는 제1의 개재 핵산 서열은 상기 제1의 핵산 서열과 상기 제2의 핵산 서열 사이에 작동적으로 위치하고; 여기서 상기 시그날 펩타이드를 암호화하는 상기 시그날 펩타이드 핵산 서열은 상기 제1의 핵산 서열 앞에 작동적으로 위치하며; 여기서 상기 발현 벡터는 상기 제1의 단백질 절단 부위에서 절단가능한 단일 전사 해독 프레임 폴리펩타이드를 발현할 수 있다.

각종 개재 분절 및 방법을 포함하는 양태들의 내용에서 명확성을 위해, 단백질 절단 부위를 암호화하는 개재 핵산 서열은, 개재 핵산 서열이 적어도 제1의 단백질 절단 부위를 암호화하도록 존재할 수 있다. 원형 인테인에서, 예를 들면, 절단 반응은 일반적으로 자가과정이며 신속한 방식으로 진행된다. 추가의 설명은 부분적으로 잠재하는 메카니즘(underlying mechanism)의 이해에 의존한다. 엑스테인(extein) 성분을 보는 프로세싱 후 관점으로부터, 인테인 분절의 N-말단 및 C-말단 각각을 향해 제1의 단백질 절단 부위 및 제2의 단백질 절단 부위가 존재함을 이해할 수 있다. 절단 부위의 설계는, 절단 반응이 발생할 수 있는 순서에 필수적으로 상응하는 것으로 의도되지 않으며, 제공된 메카니즘에 있어서 역학적으로 명백한 단계들의 인식이 존재하는 경우에서 조차 하나의 절단 반응 부위에서 단일이고 비교적 조화된 현상인 것으로 절단 반응의 인식이 존재할 수 있다는 것이 인식된다. 이러한 기술은 또한 당해 분야에서 이해될 수 있는 것으로서 하나 이상의 절단 부위를 포함하는 개재 분절을 사용한 조성물 및 방법의 양태들을 제공한다. 다시 프로세싱 메카니즘의 이해에 따라서, 1개의 절단 부위 또는 2개의 분열 부위를 포함하는 분절은 각각 개재 분절의 부분적이거나 완전한 절제를 허용할 수 있다.

하나의 양태에서, 개재 핵산 서열은 또한 제2의 단백질 절단 부위를 암호화한다.

발현 벡터의 하나의 양태에서, 제1의 단백질 절단 부위는 파이로코쿠스 아비씨, 파이로코쿠스 푸리오수스 또는 파이로코쿠스 호리코시이 OT3의 이온 프로테아제 유전자의 인테인 분절; 또는 파이로코쿠스 아비씨, 파이로코쿠스 푸리오수스 또는 메타노코쿠스 잔나스키이(Methanococcus jannaschii)의 klbA 유전자의 인테인 분절; 또는 이로부터 각각 기원한 변형된 인테인 분절에 의해 제공된다.

하나의 양태에서, 인테인 분절 또는 변형된 인테인 분절은 리신, 세린이지만 히스티딘이 아닌 끝에서 두번째 잔기(penultimate residue)를 암호화한다. 하나의 양태에서, 인테인 분절 또는 변형된 인테인 분절은 상기 제1의 폴리펩타이드를 절단할 수는 있지만 이를 상기 제2의 폴리펩타이드에 완전히 연결하는 것은 아니다.

하나의 양태에서, 제1의 단백질 절단 부위는 서열 번호: 1, 3, 4, 6, 7, 55, 35, 37, 및 39로 이루어진 그룹에서 선택된 서열을 포함하는 인테인 분절 및 이로부터 기원한 변형된 인테인 분절에 의해 제공된다.

하나의 양태에서, 제1의 폴리펩타이드 및 제2의 폴리펩타이드는 다합체성 조립이 가능하다. 하나의 양태에서, 상기 제1의 폴리펩타이드 및 제2의 폴리펩타이드 중 적어도 하나는 세포외 분비할 수 있다. 하나의 양태에서, 상기 제1의 폴리펩타이드 및 제2의 폴리펩타이드 중 적어도 하나는 포유동물 기원이다. 하나의 양태에서, 제1의 폴리펩타이드는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 기능성 단편을 포함하고, 상기 제2의 폴리펩타이드는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 기능성 단편을 포함하며, 상기 제1의 폴리펩타이드는 상기 제2의 폴리펩타이드의 상부(제2의 폴리펩타이드에 대해 5')에 존재한다.

발현 벡터의 양태에서, 벡터는 단지 하나의 시그날 펩타이드 핵산 서열을 포함한다.

하나의 양태에서, 발현 벡터는 제3의 폴리펩타이드를 암호화하는 제3의 핵산 서열, 및 제2의 단백질 절단 부위를 암호화하는 제2의 개재 핵산 서열을 추가로 포함하며; 여기서, 제2의 개재 핵산 서열 및 제3의 핵산 서열은, 이러한 순서로 상기 제2의 핵산 서열 이후에 작동적으로 위치한다.

발현 벡터의 양태에서, 제1 및 상기 제2의 폴리펩타이드는 종양 괴사 인자-α, 에리트로포이에틴 수용체, RSV, EL/셀렉틴, 인터루킨-1, 인터루킨-12, 인터루킨-13, 인터루킨-17, 인터루킨-18, 인터루킨-23, 인터루킨-33, CD81, CD19, IGF1, IGF2, EGFR, CXCL-13, GLP-1R, 프로스타글란딘 E2 및 아밀로이드 베타로 이루어진 그룹에서 선택된 항원에 결합하는 것에 대해 지시된 항원 특이성을 지닌, 기능적 항원 또는 다른 항원 인식 분자를 포함한다.

본 발명의 양태에서, 발현 벡터의 경우 제1 및 제2의 폴리펩타이드는 D2E7, EL246, ABT-007, ABT-325, 또는 ABT-874의 항체로부터의 면역글로불린 쇄의 쌍을 포함한다. 하나의 양태에서, 제1 및 제2의 폴리펩타이드는 D2E7, EL246, ABT-007, ABT-325, ABT-874, 또는 다른 항체의 유사 분절로부터의 면역글로불린 중쇄 또는 면역글로불린 경쇄 분절로부터 각각 독립적으로 선택된다.

하나의 양태에서, 발현 벡터는 상기 삽입체에 대한 프로모터 조절 성분을 추가로 포함한다. 하나의 양태에서, 프로모터 조절 성분은 유도성 또는 구성적이다. 하나의 양태에서, 프로모터 조절 성분은 조직 특이적이다. 하나의 양태에서, 프로모터는 아데노바이러스 주요 레이트 프로모터(adenovirus major late 프로모터)를 포함한다.

하나의 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 하나의 양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포이다. 하나의 양태에서, 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이이다. 하나의 양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 하나의 양태에서, 진핵 세포는 원생생물 세포, 동물 세포, 식물 세포 및 진균 세포로 이루어진 그룹에서 선택된다. 하나의 양태에서, 진핵 세포는 포유동물 세포, 조류 세포 및 곤충 세포로 이루어진 그룹에서 선택된 동물 세포이다. 하나의 양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포주이다. 하나의 양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포 또는 디하이드로폴레이트 리덕타제-결핍성 CHO 세포이다. 하나의 양태에서, 숙주 세포는 HEK(사람 배아 신장) 세포 또는 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포, 예를 들면, COS 세포이다. 하나의 양태에서, 숙주 세포는 효모 세포이다. 하나의 양태에서, 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)이다. 하나의 양태에서, 숙주 세포는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) Sf9 곤충 세포이다.

하나의 양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 벡터 단백질의 발현을 허용하기에 충분한 조건하에서 배양 배지 속에서 배양함을 포함하여, 재조합체 폴리프로테인 또는 다수의 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 당해 방법은 상기 벡터 단백질을 회수하고/하거나 정제함을 추가로 포함한다. 생산 방법의 양태에서, 다수의 단백질은 다합체성 조립이 가능하다. 하나의 양태에서, 재조합체 폴리프로테인 또는 다수의 단백질은 생물학적으로 기능성이고/이거나 치료제이다.

하나의 양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 배양 배지 속에서 재조합체 생성물을 생산하기에 충분한 조건하에 배양함을 포함하여, 재조합체 생성물을 생산하는 방법을 제공하며, 여기서, 생성물은 면역글로불린 단백질 또는 이의 기능성 단편, 조립된 항체, 또는 다른 항원 인식 분자이다. 하나의 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 방법에 따라 생산된 단백질 또는 폴리프로테인을 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 본원의 방법에 따라 조립된 면역글로불린; 조립된 다른 항원 인식 분자; 또는 개개의 면역글로불린 쇄 또는 생산된 이의 기능성 단편을 제공한다. 하나의 양태에서, 면역글로불린; 다른 항원 인식 분자; 또는 개개의 면역글로불린 쇄 또는 이의 기능성 단편과 관련하여, 종양 괴사 인자-α, 에리트로포이에틴 수용체, RSV, EL/셀렉틴, 인터루킨-1 , 인터루킨-12, 인터루킨-13, 인터루킨 17, 인터루킨-18, 인터루킨-23, 인터루킨-33, CD81 , CD19, IGF1, IGF2, EGFR, CXCL-13, GLP-1R, 프로스타글란딘 E2 또는 아밀로이드 베타에 결합하는 특이적인 항원(여기서, 항원은 리간드 또는 역수용체 등일 수 있다)에 영향을 미치거나 기여하는 능력이 존재한다. 하나의 양태에서, 면역글로불린 또는 이의 기능성 단편은 면역글로불린 D2E7 또는 ABT-874이거나 기능성 단편은 각각 이의 단편이다.

하나의 양태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

하나의 양태에서, 본 발명은 태그(tag)를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 본원에 기술된 발현 벡터를 제공한다. 벡터 작제물의 양태에서, 개재 핵산 서열은 태그를 추가로 암호화한다.

하나의 양태에서, 제1 및 상기 제2의 폴리펩타이드는 종양 괴사 인자-α, 에리트로포이에틴 수용체, RSV, EL/셀렉틴, 인터루킨-1 , 인터루킨-12, 인터루킨-13, 인터루킨 17, 인터루킨-18, 인터루킨-23, 인터루킨-33, CD81 , CD19, IGF1, IGF2, EGFR, CXCL-13, GLP-1R, 프로스타글란딘 E2 및 아밀로이드 베타로 이루어진 그룹에서 선택된 항원에 결합하는 것에 대해 지시된 항원 특이성을 갖는 기능성 항체 또는 다른 항원 인식 분자를 포함한다. 하나의 양태에서, 제1 및 제2의 폴리펩타이드는 D2E7, EL246, ABT-007, ABT-325, 또는 ABT-874의 항체로부터의 면역글로불린 쇄의 쌍을 포함한다. 하나의 양태에서, 제1 및 제2의 폴리펩타이드는 D2E7, EL246, ABT-007, ABT-325, ABT-874, 또는 다른 항체의 유사 분절로부터의 면역글로불린 중쇄 또는 면역글로불린 경쇄 분절로부터 각각 독립적으로 선택된다.

하나의 양태에서, 벡터는 상기 sORF 삽입체에 대한 프로모터 조절 성분을 추가로 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 프로모터 조절 성분은 유도성 또는 구성적이다. 하나의 양태에서, 상기 프로모터 조절 성분은 조직 특이적이다. 하나의 양태에서, 상기 프로모터는 아데노바이러스 주요 레이트 프로모터(adenovirus major late promoter)를 포함한다.

하나의 양태에서, 벡터는 상기 제1의 단백질 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. 하나의 양태에서, 프로테아제를 암호화하는 상기 핵산은 상기 sORF 삽입체내에 작동적으로 위치하며; 상기 발현 벡터는 프로테아제를 암호화하는 상기 핵산과 상기 제1의 핵산 및 상기 제2의 핵산 중 적어도 하나 사이에 위치한 제2의 절단 부위를 암호화하는 추가의 핵산을 추가로 포함한다.

하나의 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 하나의 양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포이다. 하나의 양태에서, 상기 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)이다. 하나의 양태에서, 상기 숙주 세포는 진핵 세포이다. 하나의 양태에서, 상기 진핵 세포는 원생생물 세포, 동물 세포, 식물 세포 및 진균 세포로 이루어진 그룹에서 선택된다. 하나의 양태에서, 상기 진핵 세포는 포유동물 세포, 조류 세포 및 곤충 세포로 이루어진 그룹에서 선택된 동물 세포이다. 바람직한 양태에서, 상기 숙주 세포는 CHO 세포 또는 디하이드로폴레이트 리덕타제-결핍성 CHO 세포이다. 하나의 양태에서, 상기 숙주 세포는 COS 세포이다. 하나의 양태에서, 상기 숙주 세포는 효모 세포이다. 하나의 양태에서, 상기 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)이다. 하나의 양태에서, 상기 숙주 세포는 곤충 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) Sf9 세포이다. 하나의 양태에서, 상기 숙주 세포는 사람 배아 신장 세포이다.

하나의 양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 배양 배지 속에서 벡터 단백질의 발현을 허용하기에 충분한 조건하에 배양함을 포함하여, 재조합체 폴리프로테인 또는 다수의 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 당해 방법은 상기 벡터 단백질을 회수하고/하거나 정제함을 추가로 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 다수의 단백질은 다합체성 조립이 가능하다. 하나의 양태에서, 재조합체 폴리프로테인 또는 다수의 단백질은 생물학적으로 기능성이고/이거나 치료제이다.

하나의 양태에서, 본 발명은 특허청구범위 제38항에 따른 숙주 세포를 배양 배지 속에서 면역글로불린 단백질 또는 이의 기능성 단편, 조립된 항체, 또는 다른 항원 인식 분자를 생산하기에 충분한 조건하에서 배양함을 포함하여, 면역글로불린 단백질 또는 이의 기능성 단편, 조립된 항체, 또는 다른 항원 인식 분자를 생산하는 방법을 제공한다.

하나의 양태에서, 본 발명은 본원의 방법에 따라 생산된 단백질 또는 폴리프로테인을 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 본원의 방법에 따라 생산된 조립된 면역글로불린; 조립된 다른 항원 인식 분자; 또는 개개의 면역글로불린 쇄 또는 이의 기능성 단편을 제공한다. 하나의 양태에서, 면역글로불린; 다른 항원 인식 분자; 또는 개개의 면역글로불린 쇄 또는 이의 기능성 단편은 종양 괴사 인자-α, 에리트로포이에틴 수용체, 인터루킨-18, EL/셀렉틴 또는 인터루킨-12에 결합하는 특이적인 항원 결합에 영향을 미치거나 기여하는 능력을 가진다. 하나의 양태에서, 면역글로불린은 D2E7이거나 여기서 기능성 단편은 D2E7의 단편이다.

하나의 양태에서, 본 발명은 발현 벡터, 벡터를 지닌 숙주 세포, 벡터 발현 생성물, 약제학적 조성물 및/또는 앞서의 것들 중 어느 것을 제조하거나 사용하는 방법을 제공하며, 여기서 벡터는 특허청구범위의 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따른 벡터이고 경쇄 시그날 펩타이드를 암호화하는 분절을 추가로 포함한다. 하나의 양태에서, 암호화된 경쇄 시그날 펩타이드는 A17, A18, A19, A26, 및 H2G로 이루어진 그룹에서 선택된 카파 경쇄 시그날 펩타이드이다. 하나의 양태에서, 암호화된 경쇄 시그날 펩타이드는 VKII 카파 경쇄 시그날 펩타이드 A18, 서열 번호 82(아미노산 서열 MRLPAQLLGLLMLWIPGSSA)이다.

하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 분리되거나 정제된다.

하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 펩타이드 화합물이다. 하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 핵산 화합물이다. 하나의 양태에서, 본 발명의 펩타이드 화합물은 펩타이드 또는 하나 이상의 다른 펩타이드와의 다합체성 복합체로 조립된다.

하나의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 조성물 또는 이의 약제학적 제형을 합성하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 약제학적 제형은 당해 분야에서 이해될 수 있는 것으로서 하나 이상의 부형제, 담체 및/또는 다른 성분들을 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 조성물의 유효량은 치료학적 유효량일 수 있다.

하나의 양태에서, 본 발명의 펩타이드 조성물은 재조합체 방법론 또는 합성 기술을 사용하여 제조된다. 하나의 양태에서, 본 발명의 핵산 조성물은 재조합체 방법론 또는 합성 기술을 사용하여 제조된다.

양태들에서, 본 발명은 의약을 제조하는데 있어 사용 방법을 제공한다.

본 발명의 양태의 다른 국면, 특징 및 장점은 첨부된 도면 및 당해 분야의 내용과 함께 고려하는 경우 하기 설명으로부터 명백하다.

일반적으로, 본원에 사용된 용어들 및 어구들은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 표준 교재, 학술지 참조 문헌 및 내용들을 참조로 하여 밝혀질 수 있는 이들의 당해 분야에서 인식된 의미를 갖는다. 본원에 제공된 정의들은 본 발명의 양태들의 내용에서 이들의 특수한 용도를 명확히하기 위한 의도이다.

어떠한 특수 이론에 얽메이지 않고, 본 발명과 관련된 잠재하는 원리 또는 메카니즘의 이해 또는 확신이 본원의 논의일 수 있다. 어떠한 설명 또는 가설의 궁극적인 정확성에 상관없이, 본 발명의 양태는 그렇더라도 작동적이고 유용할 수 있다.

도 1은 sORF 발현 작제물, pTT3 pab lon HL(-)의 개략도를 나타낸다.
도 2는 D2E7 항체에 대한 발현 작제물에 있어서 sORF 성분들의 구조를 나타낸다.
도 3은 sORF 발현 생성물의 단백질 분석을 위한 SDS-PAGE의 결과를 나타낸다. 분비된 IgG 분자는 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하고 SDS-PAGE에 의해 비-환원 (A) 및 환원 (B) 조건하에서 분리한다. 좌측으로부터 우측까지의 레인(lane) 및 시료는 다음과 같다: (레인 1 ) MW 참조 마커; (2) 대조군 작제물 생성물; (3) Pab-lon mut A1; (4) Pab-lon mut A2; (5) pTT3 pfu lon YP, 및 (6) pTT3 pfu lon MA.
도 4는 추가의 sORF 발현 생성물의 단백질 분석을 위한 SDS-PAGE의 결과를 나타낸다. 분비된 IgG는 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되고 비-환원 (A) 및 환원 (B) 조건하에 SDS-PAGE에 의해 분리했다. 좌측으로부터 우측까지의 레인 및 시료는 다음과 같다: (레인 1) MW 마커; (2) 대조군; (3) pTT3 pfu lon HL(-); 및 (4) pTT3 pfu lon MutA.
도 5는 klbA 인테인을 사용하여 sORF 작제물로부터 생산된 분비된 항체의 분석을 나타낸다. Pab-klbA HL(-) 및 Mja-klbA HL(-) 작제물로부터 분비된 IgG 생성물을 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하고 환원(패널 A, B, 및 C) 및 비-환원(패널 D) 조건하에 SDS-PAGE로 분리하였다. 패널 A 및 D는 염색된 겔의 영상을 나타내고; 패널 B는 사람 IgG1 Fc에 대한 항체를 사용한 면역블롯이며; 패널 C는 사람 카파 경쇄에 대한 항체를 사용한 면역블롯이다. 좌측으로부터 우측까지의 레인 및 시료는 다음과 같다: (레인 1) 대조군; (2) Pab-klbA HL(-); 및 (3) Mja-klbA HL(-). 대조군은 2개의 별개의 전사 해독 프레임의 발현으로부터 생산된 동일한 항체이다.
도 6은 N-말단 스플라이싱 연결부에서 아미노산 잔기에 대한 변형을 지닌 Pab klbA 인테인을 사용한 단일의 전사 해독 프레임 작제물의 발현 결과를 나타낸다. 분비된 IgG 단백질은 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하고 SDS-PAGE에 의해 비-환원 및 환원 조건하에서 분리하였다. 좌측으로부터 우측까지의 레인 및 시료는 다음과 같다: (레인 1) MW 마커; (2) 통상의 벡터(대조군)를 사용하여 생산된 동일한 항체; (3) pTT3 Pab klba HL(-)wt; (4) pTT3 Pab klba HL(-)GC; 및 (5) pTT3 Pab klba HL(-)KC.
도 7은 CHO 세포주 시스템에서 안정한 발현 벡터로 사용하기 위해 조정된, sORF 발현 작제물, pA190-Pab-lon HL(-)의 개략도를 나타낸다.
도 8은 sORF 작제물 형질감염 클론(sORF Pab lon 작제물)의 안정한 발현 시스템에 대한 배양 합치성(confluency)에 도달하는 시간 및 빈도의 결과를 나타낸다.
도 9는 경쇄 연결부 돌연변이를 갖는 일시적인 발현 작제물의 sORF 성분들에 대한 구조의 개략도를 나타낸다. 일련의 작제물은 "M1-X"(제1 주(first line)) 및 D2-X"(제2 주)로 지정하며 여기서, X는 임의의 아미노산을 나타낸다.
도 10는 Met1 잔기의 변이를 기준으로 한 경쇄 연결부 돌연변이를 갖는 일련의 sORF 작제물에 대한 IgG 분비 결과를 나타낸다.
도 11은 Asp2 잔기의 변이를 기준으로 한 경쇄 연결부 돌연변이를 갖는 일련의 sORF 작제물에 대한 IgG 분비 결과를 나타낸다.
도 12는 경쇄 연결부 돌연변이를 갖는 Met1 및 Asp2 일련의 작제물 각각의 예로부터의 단백질 생성물에 대한 SDS-PAGE 분석의 결과를 나타낸다.
도 13은 ABT-874 항체를 발현할 수 있는 일시적인 발현 작제물의 sORF 성분들에 대한 구조의 개략도를 나타낸다.
도 14는 태그(tag)를 포함하는 삽입체의 도입을 위한 용매가 접근가능한 루프(loop)의 바람직한 위치(DOD 엔도뉴클레아제 도메인의 말단에 대해, 분절 H 및 F의 인근 연결부를 지적하는 빗금 화살표)의 위치와 관련하여 인테인의 특정 구조 모티프를 나타낸다.
도 15는 HEK293 세포의 일시적인 형질감염 시스템에서 사용하기 위한 경쇄 시그날 펩타이드 A18을 지닌 발현 작제물의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 16은 항체 발현 작제물의 생성물의 SDS-PAGE 분석의 결과를 나타낸다.
도 17은 일시적으로 감염된 HEK293 세포 및 안정하게 형질감염된 CHO 세포를 포함하는 형질감염된 세포주로부터 항체 발현 작제물의 생성물의 웨스턴 블롯 분석의 결과를 나타낸다.
도 18은 CHO 세포의 안정한 형질감염 시스템에서 사용하기 위한 경쇄 시그날 펩타이드 A18을 사용한 발현 작제물의 플라스미드 맵을 나타낸다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 다음의 비-제한적 실시예에 의해 추가로 이해될 수 있다.

특정 정보는 2007년 3월 22일자로 카슨(Carson) 등에 의해 제US 20070065912호에 따른 것을 포함하는, 당해 분야에서의 기재에 의해 인식될 것이다.

본 발명은 효소, 호르몬(예를 들면, 인슐린), 사이토킨, 케모킨, 수용체, 항체 또는 다른 분자와 같은 생물학적으로 활성인 단백질 또는 화합물 구조의 발현을 위한 시스템, 예를 들면, 작제물 및 방법을 제공한다. 바람직하게는, 단백질은 인터루킨, 완전한 길이의 면역글로불린과 같은 면역조절 단백질, 이의 단편, 당해 분야에서 이해되는 바와 같은 다른 항원 인식 분자, 또는 다른 생물치료학적 분자이다. 이러한 시스템의 개관은 면역글로불린 분자의 특이적인 내용에 있으며, 여기서, 재조합체 생산은 단일 프로모터의 전사 제어하에서 경쇄 및 중쇄 암호화 서열의 발현을 기초로 하고, 여기서, 단일의 해독 생성물(폴리프로테인)의 별개의 중쇄 및 경쇄로의 전환은 인테인 성분에 의해 매개된다.

하나의 양태에서, 면역글로불린 폴리프로테인 분자의 제1 또는 제2의 쇄는 중쇄 또는 경쇄일 수 있다. 재조합체 면역글로불린 분절을 암호화하는 서열은 완전한 길이의 암호화 서열 또는 이의 단편일 수 있다. 구체적인 양태에서, 제2의 경쇄 암호화 서열은 본 발명의 실시에서 프로세싱될 폴리프로테인을 암호화하는 서열의 일부이어야 하며, 즉, 2개의 경쇄 및 1개의 중쇄를 어떠한 순서로 포함하는 3개의 분절이 존재함을 고려하여야 한다. 특수 양태에서, 작제물은 이들 성분들로 및 다음 순서: a) IgH-IgL; b) IgL-IgH; c) IgH-IgL-IgL; d) IgL-IgH-IgL; e) IgL-IgL-IgH; f) IgH-IgH-IgL; g) IgH-IgL-IgH; 및/또는 h) IgL-IgH-IgH로 구성된다. 하나의 양태에서, 상기 하이픈은 절단 부위 서열이 위치하는 위치를 나타낼 수 있다.

또한, 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 암호화 서열이 이들 사이의 인테인 암호화 서열에 대해 프레임 내로(in frame) 융합되며, 여기서 인테인은 설계된 중쇄 및 경쇄의 말단 또는 스플라이싱 활성(splicing activity)을 결여하도록 변형되거나 천연적으로 이것이 가능하여 스플라이싱이 바람직하게는 발생하지 않거나 또는 스플라이싱이 불량한 효율로 발생하여 스플라이싱되지 않은 항체 분자가 우세해지도록 할 수 있다. 또한, 변형된 인테인은 여전히 추가로 변형됨으로써 엔도뉴클레아제 영역(여기서 엔도뉴클레아제 영역은 이미 존재한다)이 존재하지 않을 수 있으며, 단, 부위 특이적인 단백질분해 절단 활성은 잔존하여 경쇄 및 중쇄 항체 폴리펩타이드가 주요 해독 생성물의 개재 인테인 부분으로부터 유리된다. 경쇄 또는 중쇄 항체 폴리펩타이드 중의 어느 하나는 N-엑스테인일 수 있으며, C-엑스테인일 수 있다.

벡터는 완전한 길이의 폴리프로테인을 발현할 수 있는 어떠한 재조합체 벡터, 예를 들면, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 복제 상보체 아데노바이러스 벡터, 복제 결핍성 아데노바이러스 벡터 및 무기력한(gutless) 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터(플라스미드) 또는 당해 분야에 공지된 어떠한 다른 벡터일 수 있으며, 여기서 면역글로불린 또는 다른 단백질(들)이 발현된 숙주 세포에 대해 적절한 벡터를 선택한다. 바큘로바이러스 벡터는 곤충 세포내 유전자의 발현에 사용가능하다. 다수의 벡터가 당해 분야에 공지되어 있으며, 많은 것이 시판되거나 달리는 당해 분야에 용이하게 접근가능하다.

프로모터를 포함하는 조절 서열; 숙주 세포

재조합체 면역글로불린 또는 다른 단백질 발현을 위한 벡터는 당해 분야에 공지된 다수의 프로모터 중 어느 것도 포함할 수 있으며, 여기서, 프로모터는 구성적이거나, 조절가능하거나 유도성이거나, 세포 유형 특이적이거나, 조직-특이적이거나 또는 종 특이적이다. 추가의 구체적인 예는 예를 들면, 테트라사이클린-반응성 프로모터[참조: Gossen M, Bujard H, Proc Natl Acad Sci U S A. 1992, 15;89(12):5547-51]를 포함한다. 벡터는 숙주 세포에 대해 조정된 레플리콘(replicon)이며, 여기서 키메라 유전자가 발현되어야 하며, 이는 또한 세균 세포, 및 유리하게는, 분자 생물학적 조작에 편리한 세포인, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)내에서 레플리콘 기능을 포함하는 것이 바람직하다.

유전자 발현을 위한 숙주 세포는 이에 한정되지 않는 동물 세포, 특히, 포유동물 세포일 수 있거나, 이는 미생물 세포(세균, 효모, 진균, 그러나 바람직하게는 진핵세포) 또는 식물 세포일 수 있다. 특히 적합한 숙주 세포는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포와 같은 곤충 배양된 세포, 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 효모 세포, 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei), 아스퍼길러스(Aspergillus), 아우레오바시둠(Aureobasidum) 및 페니실리움(Penicillium) 종과 같은 진균, 및 CHO(차이니즈 햄스터 난소), BHK(햄스터 새끼 신장), COS, 293, 3T3(마우스), Vero(아프리카 녹색 원숭이) 세포와 같은 포유동물 세포를 포함하며, 돼지, 마우스, 랫트, 양, 염소, 소를 포함하나 이에 한정되지 않는 각종의 유전자이식 동물 시스템 또한 사용될 수 있다. 난백 및 유전자이식 양, 염소 및 소 시스템에서 발현을 위한 닭 시스템은 다른 것들 중에서도 우유에서 발현을 위해 공지되어 있다. 바큘로바이러스, 특히 AcNPV 벡터는 예를 들면, 곤충 세포주에서 폴리헤드린 프로모터 또는 다른 강력한 프로모터의 조절성 제어하에 sORF의 발현을 사용하여 단일의 ORF 항체 발현 및 본 발명의 절단에 사용될 수 있으며, 이런 벡터 및 세포주는 당해 분야에 익히 공지되어 있고 시판되고 있다. 포유동물 세포에서 사용된 프로모터는 구성적(헤르페스 바이러스 TK 프로모터, 참조: McKnight, 세포 31 :355, 1982; SV40 얼리 프로모터(early promoter), 참조: Benoist et al. Nature 290:304, 1981, 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus) 프로모터, 참조: Gorman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777, 1982; 사이토메갈로바이러스 프로모터, 참조: Foecking et al. Gene 45:101, 1980; 마우스 유방 종양 바이러스 프로모터, 일반적으로 참조: Etcheverry in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al ., eds, pp.162-181 , Wiley & Sons, 1996)일 수 있거나 또는 조절된다(메탈로티오네인 프로모터, 예를 들면, 참조: Hamer et al. J. Molec. Appl. Genet. 1:273, 1982). 벡터는 특수한 포유동물 세포를 감염시키는 바이러스, 특히 레트로바이러스, 박시니아(vaccinia) 및 아데노바이러스를 기초로 할 수 있으며 이들의 유도체는 당해 분야에 공지되어 있고 시판된다. 프로모터는 사이토메갈로바이러스, 아데노바이러스 레이트, 및 박시니아 7.5K 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 효모 및 진균 벡터[참조: 예를 들면, Van den Handel, C. et al. (1991) In: Bennett, J.W. and Lasure, L.L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academy Press, Inc., New York, 397-428] 및 프로모터는 또한 잘 공지되어 있으며 광범위하게 사용가능하다. 에놀라제는 잘 공지된 구성적 효모 프로모터이며, 알코올 데하이드로게나제는 잘 공지된 조절된 프로모터이다.

특이적인 프로모터, 전사 종결 서열 및 다른 임의의 서열, 예를 들면, 조직 특이적인 서열을 암호화하는 서열의 선택은, 발현이 바람직한 세포의 유형에 의해 대부분 결정될 것이다. 이는 세균, 효모, 진균, 포유동물, 곤충, 닭 또는 다른 동물 세포일 수 있다.

시그날 서열

벡터내로 혼입된, 절단되거나, 단백질분해적으로 프로세싱되거나 자가 프로세싱될 단백질의 암호화 서열은 또한 하나 이상의 시그날 서열을 암호화하는 하나 이상의 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이들 암호화된 시그날 서열은 폴리프로테인내 성숙한 분절 하나 이상과 연합될 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 중쇄 리더 서열을 암호화하는 서열은 폴리프로테인 암호화 서열의 나머지와 프레임(frame)내에서 및 작동적으로 연결된, 중쇄에 대한 암호화 서열의 앞에 있을 수 있다. 유사하게, 경쇄 리더 펩타이드 암호화 서열 또는 다른 리더 펩타이드 암호화 서열은 면역글로불린 경쇄 암호화 서열 중 하나 또는 둘다와, 자가-프로세싱 부위(예를 들어, 2A)로부터 인접한 쇄에 의해 또는 프로테아제 인식 서열을 암호화하는 서열에 의해 분리되는 리더 서열-쇄와 함께, 적절한 판독 프레임이 유지되면서 프레임내에서 연합될 수 있다.

면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 화학량론

본원의 많은 양태들에서, 면역글로불린/항체 경쇄(IgL) 및 중쇄(IgH)는 벡터 수준에서 또는 숙주 세포내에서 발현된 세포내 수준에서 약 1:1 비(IgL:IgH)로 존재한다. 한편, 본원 및 다른 문헌의 재조합체 시도는 중쇄 및 경쇄의 등몰 발현(equimolar expression)에 의존하며(참조: 예를 들면, 미국 특허 공보 제2005/0003482A1호 또는 국제 공보 제WO2004/113493호), 다른 양태에서, 본 발명은, 주요 해독 생성물이 폴리프로테인인 경우 쇄의 자가-프로세싱 또는 단백질분해 프로세싱으로 공-발현되고 2:1 비의 경쇄 및 중쇄 암호화 서열을 사용하는 방법 및 발현 카세트 및 벡터를 제공한다. 양태들에서, 당해 비는 약 2:1 또는 2:1 초과와 같은 1:1 초과이다. 특수 양태에서, 경쇄 암호화 서열은 1:1(IgL:IgH) 초과의 비로 사용된다. 구체적인 양태에서, IgL:IgH의 비는 2:1이다. 따라서, 양태들에서, sORF 항체 발현 기술에 의해 제공된 장점은 중쇄 및 경쇄에 대한 유전자 용량비를 조작하는 능력, ER내에서 다중-소단위 조립을 위한 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 근접성, 및 고 효율 단백질 분비를 위한 잠재성을 포함한다.

본 발명은 면역글로불린(즉, 항체)의 중쇄 및 하나 또는 적어도 2개의 경쇄를 암호화하는 서열; 이들 사이에 존재하는 자가-프로세싱, 프로테아제 인식 부위 또는 시그날 펩타이드와 같은 절단 부위를 암호화하는 서열을 포함하는 벡터로 형질전환되거나 감염된 숙주 세포 또는 숙주 세포의 안정한 클론을 추가로 제공하며; 추가의 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 서열 또는 서열들을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 다중 소단위(예를 들면, 2-쇄 또는 다중-쇄 분자 또는 전구-단백질로서 천연적으로 생산되고 전구체-기원한 단백질 및 활성 부분을 방출하도록 절단되거나 프로세싱되는 것들)로 구성된 완전한 길이의 재조합체 면역글로불린 또는 이의 단편 또는 다른 생물학적으로 활성인 단백질을 생성하는데 있어서 이러한 세포 또는 클론의 용도가 본 발명의 범위에 포함된다. 비-제한적 예는 인슐린, 인터루킨-18, 인터루킨-1 , 골 형태발생 단백질 4, 골 형태발생 단백질 2, 어떠한 다른 2 쇄 골 형태발생 단백질, 신경 성장 인자, 레닌, 키모트립신, 형질전환 성장 인자 β, 및 인터루킨 1β를 포함한다.

관련 국면에서, 본 발명은 재조합체 면역글로불린 분자 또는 이의 단편, 또는 이러한 세포 또는 클론에 의해 생산된 다른 단백질을 제공하며, 여기서 면역글로불린은 자가 프로세싱 절단 부위[예를 들면, 인테인 또는 헷지훅(hedgehog) 도메인], 절단 부위 또는 시그날 펩타이드 절단 및 이를 생산하는 방법, 벡터 및 숙주 세포로부터 기원한 아미노산을 포함한다. 양태들에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 작제물을 함유하는 숙주 세포를 제공한다.

본 발명은 면역글로불린 분자 또는 이의 단편의 발현을 위한 단일 벡터 작제물 및 이의 시험관내 또는 생체내 사용 방법을 제공한다. 벡터는 제1과 제2 면역글로불린 암호화 서열 사이 및 제2와 제3 면역글로불린 암호화 서열 사이의 자가-프로세싱 또는 다른 프로테아제 인식 서열들을 가짐으로써 단일 프로모터 및 전사체를 사용한 기능성 항체 분자의 발현을 허용한다. 예시적인 벡터 작제물은 전사 해독 프레임들 사이의 자가-프로세싱 절단 부위를 암호화하는 서열을 포함하며 또한 절단 다음의 자가-프로세싱 절단 부위를 포함하는 아미노산의 제거를 위한 자가-프로세싱 절단 부위에 근접한 추가의 단백질 분해 절단 부위를 포함할 수 있다. 벡터 작제물은 시험관내 및 생체내에서 완전한 길이의 생물학적으로 활성인 면역글로불린 또는 이의 단편의 향상된 생산과 관련된 방법에서의 유용성이 밝혀져 있다. 적어도 2개의 상이한 쇄를 갖는 다른 생물학적으로 활성인 단백질은, 비록 쇄의 암호화 서열이 다른 쇄의 암호화 서열에 대해 1 초과의 비로 존재하는 것이 요구되지 않을 수 있음이 이해된다고 해도, 동일한 전략을 사용하여 제조할 수 있다.

비록 특수 조성물 및 방법이 본원에 예시되어 있다고 해도, 다수의 대안적인 조성물 및 방법 중 어느 것도 적용가능하며 본 발명을 실시하는데 사용하기에 적합함이 이해된다. 본 발명의 폴리프로테인 발현 카세트 및 벡터, 숙주 세포 및 방법의 평가가 당해 분야의 과정 표준을 사용하여 수행될 수 있음이 또한 이해될 것이다. 본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 당해 분야의 숙련가의 영역내에 있는, 세포 생물학, 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 생화학 및 면역학의 통상의 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은, 이들 각각 본원에 참조로 표현하여 인용된 문헌[참조: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1993); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); and Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991]과 같은 문헌에 충분히 설명되어 있다.

달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 모든 용어들은 당해 분야의 숙련가에 게 이해되는 바와 동일한 의미를 가지며, 본 발명의 실시는 당해 분야의 숙련가의 지식내에 있는, 미생물학 및 재조합 DNA 기술의 통상의 기술을 사용할 것이다.

단백질과 관련하여 본원에 일반적으로 사용된 용어 "변형된"은, 적어도 하나의 아미노산 잔기가 참조된 분자내에서 치환되거나, 이로부터 결실되거나 이에 첨가된 분절(segment)을 말한다. 유사하게, 핵산과 관련하여, 용어는, 적어도 하나의 핵산 소단위가 참조된 분자내에서 치환되거나, 이로부터 결실되거나, 이에 첨가된 분절을 말한다.

본원에 사용된 것으로서 용어 "인테인"은 전형적으로 이의 자체의 제거를 촉진하고 엑스테인(extein)으로 공지된 플랭킹 분절(flanking segment)의 연결에 영향을 미치는 단백질의 내부 분절을 말한다. 인테인의 많은 예가 일부 경우에 공유된 구조적 및/또는 기능적 특징과 함께, 각종 유형의 유기체내에서 인식된다. 본 발명은 존재하는 것으로 인정되고 추가로 인식되거나 발견되는, 인테인, 및 이의 변이체를 광범위하게 사용할 수 있다[참조: 예를 들면, Gogarten JP et al., 2002, Annu Rev Microbiol. 2002;56:263-87; Perler, F. B. (2002), InBase, the Intein Database. Nucleic Acids Res. 30, 383-384(또한 인터넷을 통해 매사추세츠주 입스위치(Ipswich) 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드(New England Biolabs, Inc.)의 웹사이트에서; http://www.neb.com/neb/inteins.html; Amitai G, et al., Mol Microbiol. 2003, 47(1):61-73; Gorbalenya AE, Nucleic Acids Res. 1998; 26(7): 1741 -1748. Non-canonical inteins]. 단백질에서 인테인-함유 단위 또는 인테인 스플라이싱 단위는 플랭킹 엑스테인의 일부를 포함하는 것으로 이해될 수 있으며, 여기서 구조적 국면은 절단, 연결 등의 반응에 기여할 수 있다. 용어는 또한 "변형된 인테인" 성분을 지닌 인테인-계 시스템을 언급하는데 있어서 범주로 이해될 수 있다.

본원에 사용된 것으로서 용어 "변형된 인테인"은, 적어도 하나의 아미노산 잔기가 인테인 스플라이싱 단위내에서 치환되거나, 이로부터 결실되거나, 이에 첨가됨으로써 절단되거나 절개된 엑스테인이 인테인에 의해 완전히 연결되지 않는 합성 인테인 또는 천연 인테인을 말할 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "벡터"는 하나 이상의 이종 또는 재조합 DNA 서열을 함유하고 상이한 숙주 세포들 사이에서 전달을 위해 설계된 플라스미드, 바이러스 또는 다른 비히클과 같은 DNA 또는 RNA 분자를 말한다. 용어 "발현 벡터" 및 "유전자 치료요법 벡터"는 세포내에서 이종 DNA 단편을 혼입하고 발현시키는데 효과적인 임의의 벡터를 말한다. 클로닝 또는 발현 벡터는 추가의 성분을 포함할 수 있는데, 예를 들면, 발현 벡터는 2개의 복제 시스템을 가질 수 있으므로 이것이 2개의 유기체, 예를 들면, 발현용 사람 세포 및 클로닝 및 증폭용 원핵세포 숙주내에 유지되도록 할 수 있다. 핵산을 세포내로 도입시키는데 효과적인 어떠한 적합한 벡터를 사용할 수 있음으로써 단백질 또는 폴리펩타이드 발현이 예를 들면, 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 플라스미드 벡터를 생성하도록 할 수 있다. 발현에 효과적인 어떠한 세포, 예를 들면, 곤충 세포 및 효모 또는 포유동물 세포와 같은 진핵 세포도 본 발명을 실시하는데 유용하다.

용어 "이종 DNA" 및 "이종 RNA"는, 이들이 존재하는 게놈 또는 벡터의 일부 또는 세포에 대해 내인성(천연)이 아닌 뉴클레오타이드를 말한다. 일반적으로 이종 DNA 또는 RNA는 형질유도, 감염, 형질감염, 형질전환, 전기천공(electroporation), 바이오리스틱 형질전환(biolistic transformation) 등에 의해 세포에 첨가된다. 이러한 뉴클레오타이드는 일반적으로 적어도 하나의 암호화 서열을 포함하지만, 암호화 서열은 발현될 필요가 없다. 용어 "이종 DNA"는 "이종 암호화 서열" 또는 "이식 유전자(transgene)"를 의미할 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 상호교환적으로 사용될 수 있으며 전형적으로 본 발명의 자가 프로세싱 절단 부위-함유 벡터를 사용하여 발현되는 목적한 "단백질" 및 "폴리펩타이드"를 말한다. 이러한 "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 하기에 추가로 기술된 바와 같이 조사, 진단 또는 치료학적 목적을 위해 유용한 어떠한 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, 폴리프로테인은 2개 이상의 폴리펩타이드 생성물을 생산하기 위해 프로세싱하도록 예정된 단백질이다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "다합체"는 기능 단백질을 형성하도록 조립될 수 있는 2개 이상의 폴리펩타이드 쇄(때때로 "소단위"로 언급됨)로 구성된 단백질을 말한다. 다합체는 2개(이합체), 3개(삼합체), 4개(사합체) 또는 이상(예를 들어, 오합체 등) 펩타이드 쇄로 구성될 수 있다. 다합체는 자가-조립(self-assembly)으로 생성될 수 있거나, 조립을 보조하기 위한 촉매와 같은 성분을 필요로 할 수 있다. 다합체는 동일한 펩타이드 쇄(단독-다합체) 또는 2개 이상의 상이한 펩타이드 쇄(헤테로-다합체) 만으로 구성될 수 있다. 이러한 다합체는 구조적으로 또는 화학적으로 기능성일 수 있다. 효소, 호르몬, 항체, 사이토킨, 케모킨 및 수용체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 많은 다합체가 당해 분야에 공지되어 있고 사용된다. 따라서, 다합체는 생물학적(예를 들어, 약제) 및 산업적(예를 들어, 생물가공/생물생산) 용도 둘 다를 가질 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "태그(tag)"는 벡터 삽입체의 하나 이상의 발현 생성물의 검출 및/또는 정제를 허용하도록 기능할 수 있는 발현 벡터로 혼입될 수 있는 펩타이드를 말한다. 이러한 태그는 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 표시된 아비딘에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 잔기(예를 들어, 광학적 또는 비색계 방법(colorimetric method)에 의해 검출될 수 있는 형광성 마커 또는 효소 활성을 함유하는 스트렙타비딘)의 폴리펩타이드에 대한 부착 또는 방사선표지된 아미노산을 포함할 수 있다. FLAG, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 말토즈 결합 단백질, 셀룰로즈-결합 도메인, 티오레독신, NusA, 미스틴, 키틴-결합 도메인, 큐티나제, AGT, GFP 및 기타와 같은 친화성 태그가 단백질 발현 및 정제 시스템에서와 같이 광범위하게 사용된다. 폴리펩타이드에 대한 태그의 추가의 비제한적 예는 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 히스티딘 태그, 방사선동위원소 또는 방사성 핵종(예를 들어, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹ In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ¹⁶⁶Ho, 또는 ¹⁵³Sm); 형광성 태그(예를 들어, FITC, 로다민, 란타나이드 포스포르), 효소 태그(예를 들어, 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 루시페라제, 알칼린 포스파타제); 화학발광성 태그; 비오티닐 그룹; 제2의 리포터[예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열(leucine zipper pair sequence), 제2 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그]에 의해 인식되는 소정의 폴리펩타이드 에피토프; 및 가돌리늄 킬레이트.

본 발명의 바이러스 유전자 치료요법 벡터와 관련하여 본원에 사용된 것으로서 용어 "복제 결핍성"은, 바이러스 벡터가 독립적으로 추가로 복제하여 이의 게놈을 패키징할 수 없음을 의미한다. 예를 들면, 대상체의 세포가 rAAV 비리온(virion)으로 감염된 경우, 이종 유전자가 감염된 세포내에서 발현되나, 감염된 세포가 AAV rep 및 cap 유전자와 보조 기능 유전자(accessory function gene)를 결여하고 있다는 사실로 인하여, rAAV는 복제할 수 없다.

본원에 사용된 것으로서, "레트로바이러스 전이 벡터"는 이식유전자를 암호화하고 벡터의 패키징에 필수적인 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터를 말한다. 바람직하게는, 레트로바이러스 전달 벡터는 또한 세포내에서 이식유전자 발현을 위해 필수적인 서열을 포함한다.

본원에 사용된 것으로서, "패키징 시스템"은 재조합 바이러스를 패키징하는데 포함된 바이러스 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 바이러스 작제물 세트를 의미한다. 전형적으로, 패키징 시스템의 작제물은 궁극적으로 패키징 세포내로 혼입된다.

본원에 사용된 것으로서, "제2 세대" 렌티바이러스 벡터 시스템은, 이로부터 보조 유전자, vif, vpr, vpu 및 nef가 결실되거나 불활성화되는 것과 같은 기능성 보조 유전자를 결여한 렌티바이러스 패키징 시스템을 말한다(참조: 예를 들면, Zufferey et al. 1997. Nat. Biotechnol. 15:871-875).

본원에 사용된 것으로서, "제3 세대" 렌티바이러스 벡터 시스템은 제2 세대 벡터 시스템의 특성을 가지며, 이로부터 tat 유전자가 결실되거나 불활성화된 것과 같은 기능성 tat 유전자를 추가로 결여한 렌티바이러스 패키징 시스템을 말한다. 전형적으로, rev를 암호화하는 유전자는 별개의 발현 작제물 상에 제공된다(참조: 예를 들면, Dull et al. 1998. J. Virol. 72:8463-8471).

바이러스 또는 바이러스 벡터와 관련하여 본원에 사용된 것으로서, "슈도타입화된(pseudotyped)"은 천연의 바이러스 엔벨로프 단백질을 이종 또는 기능적으로 변형된 바이러스 엔벨로프 단백질로 교체시키는 것을 말한다.

재조합체 DNA 작제물 또는 벡터와 관련하여 본원에 사용된 것으로서 용어 "작동적으로 연결된"은 재조합체 DNA 작제물 또는 벡터의 뉴클레오타이드 성분들이 일반적으로 서로에 대해 공유결합으로 연결되어 있음을 의미한다. 일반적으로, "작동적으로 연결된" DNA 서열은 연속적이며, 분비성 리더의 경우에, 연속적이고 동일한 판독 프레임내에 있다. 그러나, 인핸서(enhancer)는, 이의 발현이 상향조절된 서열과 연속적일 필요가 없다. 당해 용어는 '작동적으로 위치된'과 일치한다.

인핸서 서열은 프로모터-의존성 유전자 발현에 영향을 미치며 천연 유전자의 5' 또는 3' 영역내에 위치할 수 있다. "인핸서"는 근접한 유전자의 전사를 자극하거나 억제하는 시스-작용 성분이다. 전사를 억제하는 인핸서는 또한 "사일런서(silencer)"로 명명된다. 인핸서는 암호화 서열로부터 및 전사된 영역의 하부 위치로부터 몇개의 킬로염기(kilobase) 쌍(kb)까지의 거리에 걸쳐 한 배향으로 기능할 수 있다(즉, 암호화 서열과 관련될 수 있다). 또한, 매트릭스 부착 영역과 같은 인슐레이터(insulator) 또는 크로마틴 개방 서열[참조: Chung, Cell, 1993, Aug 13;74(3):505-14, Frisch et al, Genome Research, 2001, 12:349-354, Kim et al, J. Biotech 107, 2004, 95-105]을 사용하여 안정하게 통합된 유전자 카세트의 전사를 향상시킬 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "유전자" 또는 '암호화 유전자"는, 적절한 조절 서열에 작동적으로 연결되는 경우 시험관내에서 또는 생체내에서 폴리펩타이드내로 전사(DNA)되고 해독(mRNA)되는 핵산 서열을 의미한다. 상기 유전자는 암호화 영역을 선행하는 및 후속하는 영역, 예를 들면, 5' 해독되지 않은(5' UTR) 또는 "리더" 서열 및 3' UTR 또는 "트레일러(trailer)" 서열, 및 개개의 암호화 분절(엑손)들 사이의 개재 서열(인트론)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

"프로모터"는 RNA 폴리머라제의 결합을 지시함으로써 RNA 합성을 촉진하는 DNA 서열, 즉, 전사를 지시하는데 충분한 최소 서열이다. 프로모터 및 상응하는 단백질 또는 폴리펩타이드 발현은 세포-유형 특이적, 조직-특이적 또는 종 특이적일 수 있다. 또한, 본 발명의 핵산 작제물 또는 벡터에 포함된 것은 프로모터 서열과 연속적이거나 연속적이지 않을 수 있는 인핸서 서열이다.

본원에 광범위하게 사용된 것으로서, "전사 조절 서열" 또는 발현 제어 서열은 흔히 영양 또는 환경 시그날에 대한 반응시, 관련된 암호화 서열의 전사를 조정하거나 조절하는 프로모터 서열 및 물리적으로 관련된 서열을 포함한다. 서열과 관련된 것들은 조직 또는 세포 특이적인 발현, 환경 시그날에 대한 반응, 전사를 증가시키거나 감소시키는 단백질의 결합 등을 측정할 수 있다. "조절가능한 프로모터"는, 이의 활성이 시스 또는 트랜스 작용하는 인자(예를 들어, 외부 시그날 또는 제제에 의해 활성화되는 유도성 프로모터)에 의해 영향받는 어떠한 프로모터이다.

"구성적 프로모터"는 대부분의 경우 많은 또는 모든 조직/세포 유형에서 RNA 생산을 지시하는 임의의 프로모터, 예를 들면, 포유동물 세포내에서 클로닝된 DNA 삽입체의 구성적 발현을 촉진하는 사람 CMV 이미디에이트 얼리 인핸서(immediate early enhancer)/프로모터 영역이다.

용어 "전사 조절 단백질", "전사 조절 인자" 및 "전사 인자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, DNA 반응 성분에 결합함으로써 관련된 유전자 또는 유전자들의 발현을 전사적으로 조절하는 핵 단백질을 말한다. 전사 조절 단백질은 일반적으로 DNA 반응 성분에 직접 결합하나, 일부 경우에 DNA에 대한 결합은 최종적으로 DNA 반응 성분에 결합하거나, 결합된 다른 단백질에 대한 결합의 수단으로 간접적으로 될 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, "면역글로불린" 및 "항체"는 완전한 분자 및 이의 단편, 예를 들면, 목적한 항원 결정인자에 결합할 수 있는 Fa, F(ab')₂, 및 Fv를 말한다. 이러한 "면역글로불린" 및 "항체"는, 분자량이 대략 23,000 달톤인 2개의 동일한 경쇄 폴리펩타이드 쇄, 및 분자량이 53,000 내지 70,000인 2개의 동일한 중쇄로 구성된다. 4개의 쇄는 "Y" 구조내에서 이황화물 결합에 의해 연결된다. 중쇄는 감마(IgG), 뮤(IgM), 알파(IgA), 델타(IgD) 또는 엡실론(IgE)으로 분류되며 제공된 항체의 효과기 기능을 결정하는 면역글로불린의 부류 지정을 위한 기준이다. 경쇄는 카파 또는 람다로서 분류된다. 본원에서 "면역글로불린 또는 이의 단편"에 대한 참조가 이루어진 경우, 이러한 "이의 단편"은 면역학적으로 기능성인 면역글로불린 단편, 특히 완전한 면역글로불린의 적어도 10%의 결합 친화성을 갖는 이의 인지체 리간드에 결합하는 것임이 이해될 것이다.

항체의 Fab 단편은 항체 분자의 1가 항원-결합 단편이다. Fv 단편은 2개 쇄로서 발현된 중쇄의 가변 영역 및 경쇄의 가변 영역을 함유하는 유전적으로 가공된 단편이다.

용어 "사람화된 항체"는, 하나 이상의 아미노산이 비-항원 결합 영역내에서 교체됨으로써 사람 항체와 보다 더 비슷한 한편, 항체의 원래의 결합 활성을 여전히 보유한 항체 분자를 말한다(참조: 미국 특허 제6,602,503호).

본원에 사용된 것으로서, 용어 "항원성 결정인자"는 특수 항체와 접촉하는 분자의 단편(즉, 에피토프)을 말한다. 단백질의 다수의 영역 또는, 단백질 또는 당단백질의 펩타이드 또는 당펩타이드는 단백질에서 제공된 영역 또는 3차원 구조에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도할 수 있다. 이들 영역 또는 구조는 항원성 결정인자 또는 에피토프로 언급된다. 항원성 결정인자는 항체에 대한 결합을 위해 완전한 항원(즉, 면역 반응을 유발시키는데 사용된 면역원)과 경쟁할 수 있다.

용어 "단편"은, 본 발명의 재조합체 단백질 또는 폴리펩타이드를 언급하는 경우, 상응하는 완전한 길이의 단백질 또는 폴리펩타이드의 기능 또는 활성 중 적어도 하나를 보유하는 상응하는 완전한 길이의 단백질 또는 폴리펩타이드의 아미노산 서열 중 전부가 아닌, 일부와 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 단편은 바람직하게는 완전한 길이의 단백질 또는 폴리펩타이드의 적어도 20 내지 100개의 연속적인 아미노산 잔기를 포함한다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "투여하는" 또는 "도입하는"은 당해 분야에 공지된 어떠한 경로에 의해서도 이를 필요로 하는 사람 또는 동물에게 단백질(면역글로불린 포함)을 전달함을 의미한다. 약제학적 담체 및 제형 또는 조성물은 또한 당해 분야에 공지되어 있다. 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피내, 피하, 경피, 점막, 종양내 또는 점막을 포함할 수 있다. 또한, 당해 용어들은 배양물내 세포 또는 세포들 및 대상체의 세포 또는 기관에 재조합체 단백질 발현용 벡터를 전달함을 의미할 수 있다. 이러한 투여 또는 도입은 생체내, 시험관내 또는 생체외에서 일어날 수 있다. 재조합체 단백질 또는 폴리펩타이드 발현용 벡터는, 통상적으로 물리적 수단(예를 들면, 인산칼슘 형질감염, 전기영동, 미세주입 또는 지질감염)에 의한 이종 DNA의 세포내로의 삽입; 통상적으로 감염성 제제, 즉, 바이러스를 사용한 도입을 말하는 감염; 또는 전형적으로 바이러스제(예를 들어, 박테리오파지)를 사용한 하나의 미생물로부터 다른 미생물로 유전 물질의 전달 또는 바이러스를 사용한 세포의 안정한 형질감염을 의미하는 형질도입을 의미하는, 형질감염에 의해 세포내로 도입될 수 있다.

"형질전환"은 통상적으로 종양유전자를 발현하고 이에 따라 연속 성장 방식, 예를 들면, 종양 세포로 전환되어진 이종 DNA 또는 세포를 포함하는 세균을 의미하기 위해 사용된다. 세포를 "형질전환"시키기 위해 사용된 벡터는 플라스미드, 바이러스 또는 다른 비히클일 수 있다.

전형적으로, 세포는 이종 DNA(즉, 벡터)의 세포내로의 투여, 도입 또는 삽입에 사용된 수단에 의존적인 "형질도입된", "감염된", "형질감염된" 또는 "형질전환된" 것을 의미한다. 용어 "형질도입된", "형질감염된" 및 "형질전환된"은 이종 DNA의 도입 방법과 상관없이 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "안정하게 형질전환된", "안정하게 형질감염된' 및 "유전자이식"은 게놈내로 통합된 비-천연(이종) 핵산 서열을 갖는 세포를 말한다. 안정한 형질감염은 이들의 게놈내로 통합의 수단에 의해 또는 에피솜 성분으로서 안정하게 복제하는 형질감염된 DNA를 함유하는 딸 세포(daughter cell)의 집단으로 구성된 세포주 또는 클론의 확립으로 입증된다. 일부 경우에, "형질감염"은 안정하지 않은데, 즉, 일시적이다. 일시적인 형질감염의 경우, 외인성 또는 이종 DNA가 발현되나, 도입된 서열은 게놈내로 통합되지 않거나 숙주 세포는 복제할 수 없다.

본원에 사용된 것으로서, "생체외 투여"는, 주요 세포가 대상체로부터 수집되고, 벡터가 세포로 투여되어 형질도입되거나, 감염되거나 형질감염된 재조합체 세포가 생산되고 재조합체 세포가 동일하거나 상이한 대상체에게 재투여되는 공정을 말한다.

"멀티시스트론성 전사체(multicistronic transcript)"는 1개 이상의 단백질 암호화 영역, 또는 시스트론을 함유하는 mRNA 분자를 말한다. 2개의 암호화 영역을 포함하는 mRNA는 "비시스트론성 전사체"로 나타낸다. "5'-인접한" 암호화 영역 또는 시스트론은, 이의 전사 개시 코돈(일반적으로 AUG)가 멀티시스트론성 mRNA 분자의 5' 말단에 대해 최대로 근접한 암호화 영역이다. "5'-원위(distal)" 암호화 영역 또는 시스트론은, 이의 해독 개시 코돈(일반적으로 AUG)이 mRNA의 5' 말단에 대해 가장 가까운 개시 코돈이 아닌 것이다.

용어 "5'-원위" 및 "하부"는 mRNA 분자의 5' 말단에 근접하지 않은 암호화 영역을 말하기 위해 동의어로 사용된다.

본원에 사용된 것으로서, "공-전사된"은, 2개의(또는 이상의) 전사 해독 프레임 또는 암호화 영역 또는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터를 포함하는 단일 전사 제어 또는 조절 성분의 전사 제어하에 있음을 의미한다.

본원에 사용된 것으로서 용어 "숙주 세포"는 벡터를 사용하여 형질도입되거나, 감염되거나, 형질감염되거나 형질전환된 세포를 말한다. 벡터는 플라스미드, 바이러스 입자, 파아지 등일 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이미 사용된 것들이며 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 용어 "숙주 세포"는 원래의 형질도입되거나, 감염되거나, 형질감염되거나 형질전환된 세포 및 이의 후대세포를 의미하는 것이 인지될 것이다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "생물학적 활성" 및 "생물학적으로 활성인"은 ELISA 플레이트내 리간드-수용체 분석과 같이, 배양물내에서 세포주 또는 세포-유리된 시스템에서 특수 단백질에 기여한 활성을 말한다. "면역글로불린", "항체" 또는 이의 단편의 "생물학적 활성"은 항원 결정인자에 결합함으로써 면역학적 기능을 촉진하는 능력을 말한다. 호르몬 또는 인터루킨의 "생물학적 활성'은 당해 분야에 공지되어 있다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "종양" 및 "암"은 정상적인 성장 및/또는 발달에 걸쳐 제어의 적어도 부분적인 손실을 나타내는 세포를 말한다. 예를 들면, 흔히 종양 또는 암 세포는 일반적으로 손실 접촉 억제를 가지며 침입성일 수 있고/있거나 전이하는 능력을 가진다.

항체는 중쇄 및 경쇄의 이종이합체인 면역글로불린 단백질이다. 일반적인 항체는 함께 연합되는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄(또는 이의 기능성 단편)를 지닌 다합체이다. 항체는 흔히 동형에 의존성인 이합체성, 삼합체성, 사합체성, 오합체성 등인 구조의 추가의 중합체 차수를 가질 수 있다. 이들은 포유동물 배양 발현 시스템에서 단일 벡터 또는 2개의 벡터로부터 완전한 길이의 형태로 발현시키기에 극도로 어려운 것으로 입증되어 있다. 다음의 몇가지 방법이 항체의 생산을 위해 현재 사용되고 있다: "폴리클로날" 항체를 생산하기 위한 동물의 생체내 면역화, 단클론 항체를 생산하기 위한 B-세포 하이브리도마의 시험관내 세포 배양(참조: 본원에 참조로 인용된, Kohler, et al. 1988. Eur. J. Immunol. 6:511 ; Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988); 및 재조합 DNA 기술(본원에 참조로 인용된, 예를 들면, 카빌리(Cabilly) 등의 미국 특허 제6331415호에 기술됨).

면역글로불린 폴리펩타이드의 기본 분자 구조는, 분자량이 대략 23,000 달톤인 2개의 동일한 경쇄, 및 분자량이 53,000 내지 70,000인 2개의 동일한 중쇄를 포함하는 것으로 잘 공지되어 있으며, 여기서 4개의 쇄는 "Y" 구조로 이황화 결합에 의해 연결되어 있다. 아미노산 서열은 Y의 상부의 N-말단 끝으로부터 각각의 쇄의 하부의 C-말단 끝에 이른다. N-말단 끝에 항원 결합의 특이성을 제공하는 가변 영역(길이가 약 100개 아미노산)이 존재한다.

본 발명은 천연 서열(즉, 항원에 의한 자극에 대한 반응시 생산된 서열)을 갖는 완전한 길이의 항체 및 항체 단편, 단일의 안정하게 폴딩된 폴리펩타이드 쇄내 중쇄 및 경쇄 둘다의 항원 결합 가변 영역을 결합한 일본쇄 항체; 1가 항체(이는 제2 중쇄의 Fc 영역에 결합하는 중쇄/경쇄 이합체를 포함한다); 면역글로불린 분자의 완전한 "Y" 영역, 즉, 경쇄 또는 중쇄 단독의 "Y"의 측쇄, 또는 이의 일부(즉, 일반적으로 Fab'로 공지된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄의 응집체)를 포함하는 "Fab 단편"; 2개 이상의 상이한 항원에 대해 특이성을 갖는 "하이브리드 면역글로불린"(예를 들어, 미국 특허 제6,623,940호에 기술된 바와 같은 쿼드로마(quadroma) 또는 이특이적 항체); 중쇄 및 경쇄가 상이한 종 또는 특이성으로부터의 것을 모사하는 "복합체 면역글로불린"; 및 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 각각 중 일부가 하나 이상의 종으로부터 기원하는(즉, 가변 영역은 뮤린(murine) 항체와 같은 하나의 공급원으로부터 기원한 반면, 고정 영역은 사람 항체와 같이 다른 것으로부터 기원하는) "키메라 항체"를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 모든 유형의 면역글로불린의 생산을 위한 개선된 방법에 관한 것이다.

본 발명의 조성물 및 방법은 면역글로불린 또는 이의 단편의 생산시 유용성이 밝혀졌으며, 여기서 중쇄 또는 경쇄는 "포유동물", "키메라"이거나 이의 효능을 향상시키는 방식으로 변형된다. 변형된 항체는 변형되지 않은 형태의 동일한 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 및 핵산 서열 변이체 둘 다 및 활성이 변경되도록 변형된, 즉 상보체 고정, 막과의 상호작용, 및 기타 효과기 기능을 개선시키는 고정 영역내 변화, 또는 항원 결합 특성을 개선시키는 가변 영역내 변화를 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 촉매적 면역글로불린 또는 이의 단편을 추가로 포함할 수 있다.

"변이체" 면역글로불린-암호화 폴리뉴클레오타이드 서열은 참조 폴리펩타이드 서열로부터 하나 이상의 아미노산에 의해 변경된 "변이체" 면역글로불린 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 수반되는 이러한 동일한 논의는 목적한 다른 생물학적으로 활성인 단백질 서열(및 이들의 암호화 서열)에 적용가능하다. 변이체 폴리뉴클레오타이드 서열은 "보존적" 치환을 함유하는 변이체 아미노산 서열을 암호화할 수 있으며, 여기서 치환된 아미노산은 이것이 교체되는 아미노산과 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 가진다. 목적한 단백질의 변이체는 천연적으로 존재하는 서열의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한(적어도 약 80 내지 99% 동일하고, 이 사이의 모든 정수) 아미노산 서열을 사용하여 제조할 수 있으며, 이는 기능적으로 동등한, 3차원 구조를 형성하고 천연적으로 존재하는 단백질의 생물학적 활성을 보유한다. 특정 아미노산 치환이 단백질의 기능에 영향을 미치지 않고 단백질 서열내에서 이루어질 수 있음은 생물학 분야에 잘 공지되어 있다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환 또는 유사한 아미노산의 치환은 단백질 기능에 영향을 미치지 않고 용인된다. 유사한 아미노산은 크기 및/또는 하전 특성에 있어서 유사한 것들일 수 있는데, 예를 들면, 아스파르테이트와 글루타메이트 및 이소류신과 발린은 둘다 유사한 아미노산의 쌍이다. 하나의 다른 것으로의 치환은, 쳔연의 2차 및 3차 구조 형성이 의도된 것을 제외하고는 파괴되지 않을 경우 허용된다. 아미노산 쌍들 사이의 유사성은 다수의 방법으로 당해 분야에서 평가되어 왔다. 예를 들면, 본원에 참조로 인용된 문헌(참조: Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, 1978. Volume 5, Supplement 3, Chapter 22, pages 345-352)은 아미노산 유사성의 척도로서 사용될 수 있는 아미노산 치환에 대한 빈도 표(frequency table)를 제공한다. 다이호프(Dayhoff) 등의 빈도 표는 진화적으로 상이한 공급원의 다양성으로부터 동일한 기능을 갖는 단백질에 대한 아미노산 서열의 비교를 기초로 한다.

기재된 뉴클레오타이드(및 아미노산) 서열의 치환 돌연변이, 삽입 및 결실 변이체는 당해 분야에 잘 공지된 방법에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 이들 변이체는, 변이체가 본 발명의 구체적으로 예시된 서열과 실질적인 서열 동일성을 가지고 바람직한 기능성이 보존되는 한 구체적으로 예시된 서열과 동일한 방식으로 사용될 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, 실질적인 서열 동일성은, 변이체 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질이, 이로부터 변이체가 기원하는 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질과 동일한 능력으로 기능하도록 하기에 충분한 상동성(또는 동일성)을 말한다. 바람직하게는, 이러한 서열 동일성은 70% 또는 80% 초과이며, 보다 바람직하게는, 이러한 동일성은 85% 초과이거나, 이러한 동일성은 90% 초과이고/이거나, 또는, 이는 95% 초과이고, 70 내지 100% 사이의 모든 정수이다. 기능에 있어 동등하거나 서열 또는 기타의 기능을 개선시키도록 설계된 치환 돌연변이, 삽입 돌연변이 및 결실 돌연변이를 제조하는 것이 방법론적 장점을 제공한다는 것은 당해 분야에서 숙련된 기술자의 기술내에 있다. 어떠한 천연적으로 존재하는 단백질을 판독할 수 있거나 정량화하는 선행분야 항목을 판독하는 양태/변이체도 특허청구된 바와 같은 본 발명의 영역내에 있는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열이 트렁케이트(truncate)되고/되거나 달리는 돌연변이됨으로써 원래의 완전한 길이의 서열의 특정의 수득되는 단편 및/또는 돌연변이체가 완전한 길이의 서열의 바람직한 특징을 보유할 수 있는 것은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 보다 큰 핵산 분자로부터 단편을 생성하는데 적합한 광범위한 제한 효소는 잘 공지되어 있다. 또한, Bal31 엑소뉴클레아제가 DNA의 시간-제어된 제한된 분해에 편리하게 사용될 수 있음은 잘 공지되어 있다[참조: 예를 들면, 본원에 참조로 인용된, Maniatis et al. 1982. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pages 135-139). 또한, 문헌(참조: Wei et al. 1983. J. Biol. Chem. 258:13006-13512)을 참조한다. Bal31 엑소뉴클레아제(일반적으로 "erase-a-base" 과정으로 언급됨)의 사용에 의해, 당해 분야의 통상의 기술자는 대상체 핵산의 한쪽 끝 또는 양쪽 끝으로부터 뉴클레오타이드를 제거함으로써 대상체 뉴클레오타이드 서열에 대해 기능적으로 동등한 광범위한 스펙트럼의 단편을 생성할 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자는 이러한 방식으로 원래의 암호화 서열을 따라 위치로부터 제어된 변화하는 길이의 단편을 수백개 생성할 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자는 생성된 단편을 이들의 특징에 대해 통상적으로 시험하거나 스크리닝하고 본원에 교시된 바와 같은 단편의 유용성을 측정할 수 있다. 완전한 길이의 서열 또는 이의 단편의 돌연변이체 서열은 부위 지시된 돌연변이유발에 의해 용이하게 생산될 수 있음이 또한 잘 알려져 있다[참조: 예를 들면, 둘다 본원에 참조로 인용된, Larionov, O.A. and Nikiforov, V.G. 1982. Genetika 18:349-59; Shortle et al. (1981) Annu. Rev. Genet. 15:265-94]. 당해 분야의 통상의 기술자는 결실-, 삽입-, 또는 치환-유형 돌연변이를 통상적으로 생산하고 완전한 길이의 야생형 서열, 또는 이의 단편의 바람직한 특징을 함유하는 수득되는 돌연변이체, 예를 들면, 호르몬, 사이토킨, 항원-결합 또는 기타 생물학적 활성을 보유한 것들을 확인할 수 있다.

또한, 또는 대안적으로, 변이체 폴리뉴클레오타이드 서열은 "비-보존적" 치환을 함유하는 변이체 아미노산 서열을 암호화할 수 있으며, 여기서 치환된 아미노산은, 이것이 교체되는 아미노산에 대해 상이한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는다. 변이체 면역글로불린-암호화 폴리뉴클레오타이드는 또한 아미노산 삽입 또는 결실, 또는 둘다를 함유하는 변이체 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 또한, 변이체 "면역글로불린-암호화 폴리뉴클레오타이드"는 참조 폴리뉴클레오타이드 서열과 동일한 폴리펩타이드를 암호화할 수 있지만, 유전 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인해, 참조 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 하나 이상의 염기가 변경된 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

용어 "단편"은 본 발명의 재조합체 면역글로불린을 언급하는 경우, 상응하는 완전한 길이의 면역글로불린 단백질의 아미노산 서열 전부는 아니지만 이의 일부와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미하며, 이는 상응하는 완전한 길이의 단백질과 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 필수적으로 보유하거나, 상응하는 완전한 길이의 단백질의 기능 또는 활성 중 적어도 하나를 보유한다. 단편은 바람직하게는 완전한 길이의 면역글로불린의 적어도 20 내지 100개의 연속된 아미노산 잔기를 포함하며, 바람직하게는 완전한 길이의 항체와 동일한 항원에 결합하는 능력을 보유한다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "서열 동일성"은 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬하는 경우 2개 이상의 정렬된 서열에 있어서 핵산 또는 아미노산 서열 동일성을 의미한다. 용어 "상동성 %"는, 본원에서의 용어 "동일성 %"와 본원에서 상호교환적으로 사용되며 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬하는 경우, 2개 이상의 정렬된 서열 사이의 핵산 또는 아미노산 서열 동일성의 수준을 말한다. 예를 들면, 본원에서 사용된 것으로서, 80% 상동성은 당해 분야에서 이해되는 바와 같이 정의된 알고리즘에 의해 측정된 80% 서열 동일성과 동일한 것을 의미하며, 따라서, 제공된 서열의 상동성은 제공된 서열의 길이에 걸쳐 80% 초과의 서열 동일성을 갖는다.

비교용 서열의 최적 정렬은 예를 들면, 문헌(참조: Smith and Waterman. 1981. Adv. Appl. Math. 2:482)의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌(참조: Needleman and Wunsch. 1970. J Mol. Biol. 48:443)의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌(참조: Pearson and Lipman. 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444)의 유사성 방법에 대한 조사에 의해, 이들 알고리즘[위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics software Package)내 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA]의 컴퓨터처리된 시행에 의해, 생명공학 정보를 위한 국립 센터 웹사이트(참조: nlm.nih.gov/)를 통해 공공 사용가능한 소프트웨어를 사용한 BLAST 알고리즘(참조: Altschul et al. 1990. J Mol. Biol. 215:403-410)에 의해, 또는 가시적 관측(참조: 일반적으로, Ausubel et al., 상기 참조)에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 비교용 서열의 최적 정렬은 문헌[참조: Smith and Waterman. 1981. Adv. Appl. Math. 2:482. 또한, Altschul et al. 1990 및 Altschul et al. 1997]의 국소 상동성 알고리즘에 의해 가장 바람직하게 수행된다.

2개 이상의 핵산 또는 단백질 서열과 관련하여 용어 "동일한" 또는 "동일성" 퍼센트는 본원에 기술된 서열 비교 알고리즘, 예를 들면, 스미쓰-워터맨 알고리즘(Smith-Waterman algorithm), 당해 분야에 공지된 다른 것들, 예를 들면, BLAST, 또는 가시적 관측을 사용하여 측정된 것으로서, 최대 상응성에 대해 비교하고 정렬하는 경우, 동일하거나, 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 규정된 퍼센트를 갖는 2개 이상의 서열 또는 소서열(subsequence)을 말한다.

본 발명에 따라서, 천연 또는 참조 서열에 대해 80, 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%(및 퍼센트 값에 대해 80 내지 100 사이의 모든 정수) 이상의 서열 동일성을 갖는 자가-프로세싱 절단 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드 자체를 암호화하는 서열 변이체가 또한 포함된다. 또한, 적어도 5, 적어도 10, 또는 적어도 15 단위의 연속된 신장을 나타내는 폴리펩타이드의 아미노산 단편; 및 기재된 동일성 조건에 따른 이들의 상동 단편; 및 적어도 15, 적어도 30, 또는 적어도 45 단위의 연속된 신장을 나타내는 핵산 서열의 단편이 포함된다. 특수 양태에서, 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 본원에 기술된 각각의 서열에 대해 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일하다.

핵산 서열은, 2개의 서열이 중간 내지 고 스트링전시(stringency) 하이브리드화 및 세척 조건하에서 다른 것에 대해 특이적으로 하이브리드화하는 경우 참조 핵산 서열에 대해 "선택적으로 하이브리드화할 수 있는" 것으로 고려된다. 하이브리드화 조건은 핵산 결합 복합체 또는 프로브의 용융 온도(Tm)를 기초로 한다. 예를 들면, "최대 스트링전시"는 전형적으로 약 Tm-5℃(프로브의 Tm의 5℃ 미만)에서 발생하며; "고 스트링전시"는 Tm 미만의 약 5 내지 10℃ 미만에서 발생하고; "중간 스트링전시"는 프로브의 Tm 미만의 약 10 내지 20℃ 미만에서 발생하며; "저 스트링전시"는 Tm 미만의 약 20 내지 25℃ 미만에서 발생한다. 기능적으로, 최대 스트링전시 조건을 사용하여 하이브리드화 프로브와 엄격한(strict) 동일성 또는 거의 엄격한 동일성을 갖는 서열을 확인할 수 있는 반면; 고 스트링전시 조건을 사용하여 프로브와 약 80% 이상 서열 동일성을 갖는 서열을 확인한다.

중간 및 고 스트링전시 하이브리드화 조건은 당해 분야에 잘 공지되어 있다(참조: 예를 들면, Sambrook, et al, 1989, Chapters 9 and 11, 및 Ausubel, F. M., et al., 1993). 고 스트링전시 조건의 예는 50% 포름아미드, 5X SSC, 5X 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 0.5% SDS 및 100 ㎍/ml 변성된 담체 DNA 중의 약 42℃에서의 하이브리드화에 이은 2X SSC 및 0.5% SDS 중의 실온으로 2회의 세척 및 42℃에서 0.1 X SSC 및 0.5% SDS 중의 추가로 2회 세척을 포함한다. 목적한 천연적으로 존재하는 단백질과 동일한 생물학적 활성을 가진 폴리펩타이드를 암호화하고 중간 내지 고 스트링전시 하이브리드화 조건하에서 하이브리드화하는 2A 서열 변이체가 본 발명의 영역내에 있는 것으로 고려된다.

유전 코드의 축퇴성의 결과로서, 이러한 구조적 성분, 자가-프로세싱 성분, 예를 들면, 인테인, 조절 성분들, 예를 들면, 시그날 펩티다제 절단 서열, 또는 다른 성분들을 포함하는, 동일한 펩타이드 서열을 암호화하는 다수의 암호화 서열이 생산될 수 있다. 예를 들면, 삼중자(triplet) CGT는 아미노산 아르기닌을 암호화한다. 아르기닌은 대안적으로 삼중자 뉴클레오타이드 서열 CGA, CGC, CGG, AGA, 및 AGG에 의해 암호화된다. 따라서, 암호화 영역내 동의어 코돈의 이러한 치환은 본 발명에 의해 포함되는 서열 변이체내에 속하는 것으로 인식된다.

이러한 서열 변이체가 고 스트링전시 조건하에서 모 서열(parent sequence)에 하이브리드화될 수 있거나 될수 없음은 또한 인식된다. 이는 예를 들면, 서열 변이체가 모 뉴클레오타이드(parent nucleotide)에 의해 암호화된 아미노산 각각에 대한 상이한 코돈을 포함하는 경우 가능할 수 있다. 이러한 변이체는 그럼에도 불구하고, 본 발명에 의해 구체적으로 고려되고 포함된다.

치료제 양식으로서 항체의 잠재성은 생산 능력 및 현재의 기술의 비용에 의해 현재 제한된다. 면역글로불린(또는 다른 단백질) 생산을 위한 개선된 바이러스 또는 비-바이러스 단일 발현 벡터는 2개 이상의 암호화 서열, 즉, 단일 벡터로부터 이중- 또는 다중-특이성을 갖는 다른 단백질 또는 면역글로불린의 발현 및 전달을 용이하게 한다. 본 발명은 일본쇄 항체, 완전한 길이의 항체 또는 항체 단편, 2개 쇄 호르몬, 2개 쇄 사이토킨, 2개 쇄 케모킨, 2개 쇄 수용체 등과 같은 가공된 항체를 포함하는, 본원에 추가로 상세히 설명된 바와 같은 어떠한 면역글로불린(즉, 항체) 또는 이의 단편 또는 다른 다중부분 단백질 또는 결합 단백질 쌍에 적용가능하다.

인테인

본원에 사용된 것으로서, 인테인(Intein)은 N-엑스테인에 의해 주요 발현 생성물의 N-말단을 향해 결합되고 C-엑스테인에 의해 주요 발현 생성물의 C-말단을 향해 결합된, 발현된 단백질내 분절이다. 천연적으로 존재하는 인테인은 인테인의 절제 및 N- 및 C-엑스테인의 재결합(단백질 연결)을 매개한다. 그러나, 본 발현 생성물과 관련하여, 인테인 또는 플랭킹 엑스테인 아미노산 서열의 주요 서열은, 단백질 골격의 절단이 엑스테인의 연결의 부재 또는 이의 감소되거나 최소량에서 발생하도록 함으로써 엑스테인 단백질이 이들이 연결되어 융합 단백질을 형성하지 않고 주요 해독 생성물(폴리프로테인)로부터 방출되도록 하는 것이다. 주요 발현 생성물(어떠한 단백질 분해적 절단 전에, mRNA에 의해 합성된 단백질)의 인테인 부위는 N-엑스테인/인테인에서 단백질분해적 절단 및 인테인/C-엑스테인 연결을 매개한다. 일반적으로, 천연적으로 존재하는 인테인은 또한 N-엑스테인 및 C-엑스테인(의 펩타이드 결합의 형성에 의한 연결)과 함께 스플라이싱을 매개한다. 그러나, 본 발명에서 2개의 폴리펩타이드를 발현시키는 목표에 적용되는 바와 같이(항체 분자의 중쇄 및 경쇄에 의해 구체적으로 예시되는 바와 같이), 단백질 연결이 발생하지 않는 것이 바람직하다. 이는 연결 활성을 갖지 않는 돌연변이를 통해 또는 천연적으로 인테인을 혼입시킴에 의해 달성될 수 있다. 또는, 스플라이싱은 방출된 단백질의 연결을 예방하기 위한 스플라이싱 부위에서 또는 당해 부위 다음에 아미노산(들)을 변화시키기 위한 돌연변이에 의해 방지될 수 있다(참조: Xu and Perler, 1996, EMBO J. 15:5146-5153). 예를 들면, Ser, Thr 또는 Cys는 C-엑스테인의 개시부에서 정상적으로 발생하며 스플라이싱을 수정하거나 차단하도록 변화될 수 없다. 특수한 인테인에서, 스플라이싱에 대한 효과는 발현된 단백질의 연결을 방지하거나 감소시킨다.

인테인은, 이의 유전자들이 다른 단백질의 유전자내에서만 발견되는 단백질의 부류이다. 엑스테인으로 명명된 플랭킹된 숙주 유전자와 함께, 인테인은 단일 mRNA로 전사되고, 단일 폴리펩타이드로서 해독된다. 후-해독적으로, 인테인은 자가촉매적 현상을 개시함으로써 자체를 제거하고 플랭킹된 숙주 단백질 분절을, 새로운 폴리펩타이드 결합을 사용하여 연결시킨다. 당해 반응은 인테인에 의해서 단독으로 촉매되며 다른 세포 단백질, 보조-인자 또는 ATP를 필요로 하지 않는다. 인테인은 다양한 단세포 유기체내에서 발견되며 이들은 크기가 상이하다. 많은 인테인은 게놈내 이들의 이동성을 위해 계수되는 엔도뉴클레아제 도메인을 함유한다.

인테인 매개된 반응은 생물공학에서, 특히 정제 및 단백질 칩 작제와 같은 시험관내 셋팅에서, 및 식물 균주 개선에서 사용되어 왔다[참조: Perler, F.B. 2005. IUBMB Life 57(7):469-76]. 돌연변이는 천연의 인테인 뉴클레오타이드 서열내로 도입되며, 이들 돌연변이체중 일부는 변경된 특성을 가진 것으로 보고되어 있다[참조: Xu and Perler, 1996. EMBO J. 15(9), 5146-5153]. 인테인, 즉, 세균 인테인-유사(BIL) 도메인 및 헷지훅(hedgehog)(Hog) 자가-프로세싱 도메인 외에, Hog/인테인(HINT) 상과의 다른 2개의 구성원들은 또한 유사한 메카니즘을 통해 해독후 자가-프로세싱을 촉매하는 것으로 알려져 있다[참조: Dassa et.al. 2004. J. Biol. Chem. 279(31):32001-32007].

인테인은 특이적인 숙주 단백질내에서 프레임내 삽입으로 발생한다. 자가-스플라이싱 반응에서, 인테인은 전구체 단백질로부터 자체 절제되는 반면, 플랭킹 영역, 엑스테인은 연결되어 숙주 유전자 기능을 회복한다. 이들 성분들은 또한 게놈내에서 이들의 이동성을 위해 계수되는 엔도뉴클레아제 기능을 함유한다. 인테인은 다양한 크기(134 내지 1650개 아미노산)에서 발생하며, 이들은 유박테리아(eubacteria), 유카리오타(eukaryota) 및 아르카에아(archaea)의 게놈내에서 확인되어 왔다. 모델 스플라이싱/리포터 시스템을 사용한 실험은, 엔도뉴클레아제, 단백질 절단, 및 단백질 스플라이싱 기능이 분리될 수 있음을 밝혔다(참조: Xu and Perler. 1996. EMBO J. 15:5146-5153). 하기 기술된 실시예는 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii) Pho Pol I, 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) VMA, 및 시네초시스티스 아종(Synechocystis spp .)으로부터의 인테인을 사용하여 항체 중쇄 및 경쇄로부터의 서열과 함께 융합 단백질을 생성한다. 인테인의 스플라이싱 능력을 제거하도록 설계된 인테인의 돌연변이는, 자가-절단하여 정확하게 암호화된 항체 중쇄 및 경쇄를 생산하는 일본쇄 폴리펩타이드를 생성한다. 이러한 전략은 다른 다중쇄 단백질, 호르몬 또는 사이토킨의 발현에 유사하게 사용될 수 있으며, 이는 또한 이들의 성숙한, 생물학적으로 활성인 형태에 대한 전구체 단백질(프로단백질)의 프로세싱을 위해 조정될 수 있다. 피로코쿠스 호리코시이 Pho Pol I, 에스. 세레비지아에 VMA, 및 시네초시스티스 아종 인테인의 사용은 본원에 구체적으로 예시되어 있으나, 당해 분야에 공지된 다른 인테인을 본 발명의 폴리프로테인 발현 벡터 및 방법에 사용할 수 있다.

파이로코쿠스 호리코시이 Pho Pol I, 에스. 세레비지아에 VMA, 및 시네초시스티스 아종 인테인 외에 많은 다른 인테인이 당해 분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Perler, F.B. 2002, InBase, the Intein Database, Nucl. Acids Res. 30(1):383-384 and the Intein Database and Registry, available via the New England Biolabs website, e.g., at http://tools.neb.com/inbase/]. 인테인은 효모, 마이코박테리아 및 극도의 호열성 아르카에박테리아(thermophilic archaebacteria)와 같은 광범위한 유기체에서 확인되어 왔다. 특정의 인테인은 엔도뉴크레아제 활성 및 부위-특이적인 단백질 절단 및 스플라이싱 활성을 갖는다. 엔도뉴클레아제 활성은 본 발명의 실시에 필수적이지 않으며; 엔도뉴클레아제 암호화 영역은 결실될 수 있고, 단, 단백질 분해 활성은 유지되도록 제공된다.

단백질 스플라이싱 공정의 메카니즘은 매우 상세히 연구되어 왔으며(참조: Chong et al. 1996. J. Biol. Chem. 271 : 22159-22168; Xu and Perler. 1996. EMBO J 15: 5146-5153), 보존된 아미노산은 인테인 및 엑스테인 스플라이싱 지점에서 발견되어 왔다(참조: Xu et al. 1994. EMBO J 13:5517-5522). 본원에 기술된 특정의 작제물은 제1의 암호화 서열의 3'-말단에 융합된 인테인 서열과, 인테인의 C-말단에서 프레임내 융합된 제2의 암호화 서열을 함유한다. 적합한 인테인 서열은 단백질 스플라이싱 성분을 함유하는 것으로 공지된 단백질 중 어느 것으로부터도 선택될 수 있다. 모든 공지된 인테인을 함유하는 데이타베이스는 월드 와이드 웹(World Wide Web)(참조: Perler, F. B. 1999. Nucl. Acids Res. 27: 346-347)으로부터 찾을 수 있다. 인테인 암호화 서열은 제2의 암호화 서열의 5' 말단에 대해 3' 말단에서 융합(프레임내)된다. 특정 기관에 대한 당해 단백질의 표적화를 위해, 적절한 펩타이드 시그날을 단백질의 암호화 서열에 융합시킬 수 있다.

제2의 엑스테인 암호화 서열 후에, 인테인 암호화 서열-엑스테인 암호화 서열은 동일한 세포내에서 다수의 단백질의 발현에 바람직한 경우와 같이 흔히 반복될 수 있다. 다중-인테인 함유 작제물을 위해, 상이한 공급원으로부터 인테인 성분들을 사용하는 것이 유용할 수 있다. 최종 유전자의 서열이 발현된 후, 전사 말단 서열 및 유리하게는 폴리아데닐화 서열을 포함하는 것을 바람직하게 삽입한다. 폴리아데닐화 서열 및 말단 서열의 순서는 당해 분야에 이해된 바와 같을 수 있다. 양태에서, 폴리아데닐화 서열은 말단 서열을 선행할 수 있다.

변형된 인테인 스플라이싱 단위는, 이러한 목적하는 변형된 인테인이 인테인으로부터 엑스테인의 절제를 촉매할 수 있지만 엑스테인의 연결을 촉매할 수 없도록 설계되어 있다(참조: 예를 들면, 미국 특허 제7026526호 및 미국 특허 공보 제20020129400호). 파이로코쿠스 종 GB-D DNA 폴리머라제에서 C-말단 엑스테인 연결부의 돌연변이유발은 엑스테인의 절단을 유도하지만 엑스테인의 후속적인 연결을 방지하는 변경된 스플라이싱 성분을 생산하였다(참조: Xu and Perler. 1996. EMBO J 15: 5146-5153). 세린 538의 알라닌 또는 글리신으로의 돌연변이(Ser에서 Ala 또는 Gly으로)는 절단을 유도하였지만 연결을 방지하였다. 이러한 위치에서 Ser에서 Met으로 또는 Ser에서 Thr으로를 또한 사용하여 별도의 분절로 절단되고 적어도 부분적으로 재-연결되지 않는 폴리프로테인의 발현을 달성한다. 다른 인테인 스플라이싱 단위에서 동등한 잔기의 돌연변이는 또한 인테인에 대한 C-말단 엑스테인 연결부에서 아미노산의 상대적인 보존으로 인하여 엑스테인 분절의 연결을 방지할 수 있다. 저 보존/상동성의 예에서, 예를 들면, 제1의 몇개, 예를 들면, 약 5개의 C-엑스테인의 잔기 및/또는 인테인 분절의 마지막 몇개의 잔기가 전신적으로 변화되어 제공된 엑스테인 분절, 특히 본원에 기재되고 당해 분야에 이해되는 바와 같은 엑스테인 분절의 스플라이싱이 아닌 절단을 지지하는 능력에 대해 스크리닝된다. 엔도뉴클레아제 도메인을 함유하지 않는 인테인이 존재하며; 이들은 시네초시스티스 아종(Synechocystis spp) dnaE 인테인 및 마이코박테리움 제노피(Mycobacterium xenopi) GyrA 단백질(참조: Magnasco et al, Biochemistry, 2004, 43, 10265-10276; Telenti et al. 1997. J. Bacteriol. 179: 6378-6382)를 포함한다. 다른 것들은 천연적으로 발견되어 왔거나 엔도뉴클레아제-함유 인테인을 암호화하는 서열로부터 엔도뉴클레아제 암호화 도메인을 제거함에 의해 인공적으로 생성하여 왔다(참조: Chong et al. 1997. J. Biol. Chem. 272: 15587-15590). 바람직한 경우, 인테인은 마이코박테리움 제노피 GyrA 단백질로부터의 인테인과 같은 스플라이싱 기능을 수행하는데 요구된 최소 수의 아미노산으로 이루어지도록 하기 위해 원래 선택된다(참조: Telenti et al. 1997. 상기 참조). 대안적 양태에서, 엔도뉴클레아제 도메인을 제거하도록 변형된 마이코박테리움 제노피 GyrA 단백질로부터의 인테인 또는 사카로마이세스 세레비지아에 VMA 인테인과 같이, 엔도뉴클레아제 활성이 없는 인테인이 선택된다(참조: Chong et al. 1997. 상기 참조).

인테인 스플라이싱 단위의 추가의 변형은, 절단 반응의 반응 속도가 변경되도록 함으로써, 단백질 용량이 스플라이싱 단위의 유전자 서열을 단순히 변형시킴에 의해 제어되도록 할 수 있다.

하나의 양태에서, C-말단 엑스테인의 제1 잔기는 파이로코쿠스 종 GB-D DNA폴리머라제를 사용한 엑스테인 연결을 방지하는 것으로 밝혀진 변형인, 글리신 또는 알라닌을 함유하도록 가공된다(참조: Xu and Perler. 1996. EMBO J 15: 5146-5153). 당해 양태에서, 바람직한 C-말단 엑스테인 단백질은 글리신 또는 알라닌 잔기에 이어서 천연의 아미노산 서열내에 N-말단 메티오닌을 천연적으로 함유한다. 엑스테인의 글리신 또는 알라닌의 인테인의 C-말단에 대한 융합은 폴리프로테인의 프로세싱 후 천연 아미노산 서열을 제공한다. 다른 양태에서, 인공 글리신 또는 알라닌은 천연 서열을 변경시키거나 추가의 아미노산 잔기를 천연 서열의 N-말단에 가함에 의해 C-말단 엑스테인에 위치시킨다. 당해 양태에서, 단백질의 천연 아미노산 서열은 폴리프로테인 프로세싱 후 하나의 아미노산에 의해 변경될 것이다. 추가의 양태에서, 본 발명에 유용한 다른 변형이 제US 7026526호에 기술되어 있다.

하나의 양태에서, 인테인은 미국 특허 제7,026,526호에서와 같은 것에 따른다. 특수 양태에서, 인테인은 파이로코쿠스 종 GB-D DNA 폴라머라제 인테인이다. 하나의 양태에서, C-말단 엑스테인 세린의 알라닌 또는 글리신으로의 돌연변이는 폴리프로테인의 절제를 촉진할 수 있지만 엑스테인 단위의 연결을 촉진하지 않는 변형된 인테인 스플라이싱 성분을 형성한다. 하나의 양태에서, 인테인은 미국 특허 제7,026,526호의 마이코박테리움 제노피 GyrA 최소 인테인이다. 하나의 양태에서, C-말단 엑스테인 트레오닌의 알라닌 또는 글리신으로의 돌연변이는 폴리프로테인의 절제를 촉진하지만 엑스테인 단위를 연결시키지 않는 변형된 인테인 스플라이싱 성분을 형성한다.

본원에 기술된 바와 같은 특정의 인테인의 경우, 작제 및 방법의 양태들이 특히 항체를 포함하는 다합체성 단백질에 대해 분비된 단백질 생성물의 개선된 발현을 생성할 수 있음은 인식될 것이다.

시그날 펩타이드 및 시그날 펩티다제

단백질이 막에 대한 단백질 표적화에 대해 이들의 아미노산 서열내 정보를 함유하는 시그날 가설은 30년 이상 동안 알려져왔다. 밀슈타인(Milstein)과 공동-연구자들은, 흑색종 세포로부터 IgG의 경쇄가 고 분자량 형태로 합성되어 세포질세망 소낭(미세소체)가 해독 시스템에 가해지는 경우 이의 성숙한 형태로 전환되었음을 발견하였고, 미세소체가 전구체 단백질 형태를 아미노-말단 연장 펩타이드를 제거함으로써 성숙한 형태로 전환시키는 프로테아제를 함유하는 당해 결과를 기초로 하는 모델을 제안하였다. 시그날 가설은 곧 미토콘드리아 및 엽록체와 같은 상이한 세포내 막에 국재화된 단백질내 명백한 표적화 시그날을 함유하도록 확장되었다. 이들 명백한 표적화 서열은 특이적인 시그날 펩티다제(SPase)에 의해 유출된 단백질로부터 절단됨이 후에 밝혀졌다.

세균에서 시그날 펩타이드를 절단시키는데 관여하는 적어도 3개의 명백한 SPase가 존재한다. SPase I은 SecYEG 경로 또는 트윈 아르기닌 전좌(Tat) 경로에 의해 유출된 비지단백질 기질을 프로세싱할 수 있다. Sec 경로에 의해 유출된 지단백질은 SPase II에 의해 절단된다. SPase IV는 제IV형 프레필린 및 제II형 분비 장치의 성분인 프레필린-유사 단백질을 절단시킨다.

진핵세포에서, 세망세포질(ER) 막에 대해 표적화된 단백질은 Sec61 전좌 기구에 대해 동시해독적으로 또는 후-해독적으로 단백질을 표적화하는 시그날 펩타이드에 의해 매개된다. ER 시그날 펩타이드는 이들의 세균 대응물의 것과 유사한 특징을 갖는다. ER 시그날 펩타이드는 시그날 펩티다제 복합체(SPC)에 의해 ER 관강(lumen)내로 유출된 후 유출된 단백질로부터 절단된다.

진핵 세포내에서 상이한 위치로 단백질을 분류하는 시그날 펩타이드는, 이들 세포가 많은 상이한 막과 수성 구획을 함유하므로 구별되어야 한다. ER로 표적화되는 단백질은 종종 절단가능한 시그날 서열을 함유한다. 놀랍게도, 많은 인공 펩타이드는 전좌 시그날로서 기능할 수 있다. 가장 중요한 주요 특징은 상기 특정의 한계를 초과하는 소수성인 것으로 여겨진다. ER 시그날 펩타이드는 세균 시그날 펩타이드보다 더 많은 함량의 류신 잔기를 가진다. 시그날 인식 입자(SRP)는, 절단가능한 시그날 펩타이드가 리보솜으로부터 생성된 후 이들에 결합한다. SRP는 ER 막에 대해 인접한 단백질을 표적화하는데 요구된다. ER 관강으로 단백질의 전좌 후, 유출된 단백질은 SPC에 의해 프로세싱된다. 다른 양태는 진핵 세포내에서 천연적으로 발생하는 시그날(리더) 펩타이드 프로세싱 효소의 장점을 취한다.

대부분의 공지된 ER 시그날 펩타이드는 N-말단 절단가능하거나 내부적으로 절단가능하지 않다. 최근에, C형 간염 바이러스, 한타바이러스(hantavirus), 플라비바이러스(flavivirus), 루벨라 바이러스(rubella virus) 및 인플루엔자 C형 바이러스내에서 발견된 것들과 같은 다수의 바이러스 폴리프로테인은 ER SPC에 의해 가장 흔히 절단되는 내부 시그날 펩타이드를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 폴리프로테인의 성숙에 있어서 이들 연구는, SPC가 아미노-말단적으로 위치한 시그날 펩타이드 뿐만 아니라, 내부 시그날 펩타이드 후에도 절단할 수 있음을 나타낸다. 따라서, 예측된 시그날 펩티다제 기질 특이성 성분의 돌연변이유발은 바이러스 감염성을 차단할 수 있다.

프레세닐린-유형 아스파르틱 프로테아제 시그날 펩타이드 펩티다제(SPP)는 이들의 막관통 영역내에서 시그날 펩타이드를 절단한다. SPP는 사람에서 시그날 펩타이드-기원한 HLA-E 에피토프의 생성에 필수적이다.

시그날 펩티다제는 당해 분야에 잘 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Paetzel M. 2002. Chem. Rev. 102(12): 4549; Pekosz A. 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:13233-13238; Marius K. 2002. Molecular Cell 10:735-744; Okamoto K. 2004. J. Virol. 78:6370-6380, Vol. 78; Martoglio B. 2003. Human Molecular Genetics 12: R201 -R206; 및 Xia W. 2003. J. Cell Sci. 116:2839-2844].

본 발명의 양태들은 단일 전사체에서 폴리펩타이드의 발현을 위한 내부 절단가능한 시그날 펩타이드를 사용한다. 단일의 전사된 폴리펩타이드는 이후에 SPC에 의해 절단되어, 개개 펩타이드를 별도로 남게 하거나 개개의 펩타이드를 단백질로 조립시킨다. 본 발명의 방법은 단일의 전사된 폴리펩타이드내에서 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 발현에 적용가능하며, 절단 후 성숙한 면역글로불린으로 조립된다. 당해 기술은 폴리펩타이드 사이토킨, 성장 인자, 또는 다양한 다른 단백질, 예를 들면, 단일의 전사된 폴리펩타이드내 IL-12p40 및 IL-12p35에 적용가능하며, 이후에 IL-12, 또는 단일의 전사된 폴리펩타이드내에서 IL-12p40 및 IL-23p19로 조립된 후 IL-23으로 조립된다.

시그날 펩티다제 시도는 전구체 또는 폴리프로테인로부터 기능성 항체 또는 다른 프로세싱된 생성물의 발현을 생성하는 포유동물 발현 벡터에 적용가능하다. 항체의 경우에, 이는 내부 절단가능한 시그날 펩타이드인 중쇄와 경쇄 사이의 개재 서열(intervening sequence)과 함께 중쇄 및 경쇄 둘다를 함유한 폴리프로테인로서 벡터로부터 생산된다. 당해 내부 절단가능한 시그날 펩타이드는 ER-잔류 프로테아제, 주로 시그날 펩티다제, 프레세닐린 또는 프레세닐린-유사 프로테아제에 의해 절단되어, 중쇄와 경쇄가 남아서 폴딩되어 조립됨으로써 기능성 분자를 생성할 수 있고, 바람직하게는 이것은 분비된다. C형 간염 바이러스로부터 기원한 내부 절단가능한 시그날 펩타이드 외에, ER-잔류 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 다른 내부 절단가능한 서열도 치환될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 실시는, 시그날 펩티다제가 절단에 영향을 미치는 숙주 세포에 한정될 필요가 없으며, 또한 프레세닐린, 프레세닐린-유사 프로테아제, 및 폴리펩타이드를 프로세싱하기 위한 다른 프로테아제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 프로테아제를 포함한다. 이들 프로테아제는 다른 것들 중에서 인용된 문헌에서 고찰되어 왔다.

또한, 본 발명은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 발현에 한정되지 않으나, 이는 또한 단일 전사체로 발현된 후 내부 시그날 펩타이드 절단에 의해 각각의 개개 펩타이드 또는 단백질을 방출하는 다른 폴리펩타이드 및 폴리프로테인을 포함한다. 이들 단백질은 성숙한 생성물에서 함께 조립될 수 있거나 조립될 수 없다.

또한, 개개의 폴리펩타이드가 대안의 순서, 즉, "펩타이드 1-내부 절단가능한 시그날 펩타이드-펩타이드 2" 또는 "펩타이드 2-내부 절단가능한 시그날 펩타이드-펩타이드 1"으로 존재하는 발현 작제물이다. 본 발명은 또한 "펩타이드 1-내부 절단가능한 시그날 펩타이드-펩타이드 2-내부 절단가능한 시그날 펩타이드-펩타이드 3" 등과 같은 내부 절단가능한 시그날 펩타이드에 의해 연결된 2개 이상의 펩타이드의 발현을 포함한다.

또한, 본 발명은 제I 형 및 제II 형 막통과 단백질 둘 다의 발현 및 발현 작제물과 관련하여 다른 프로테아제 절단 부위에 적용된다.

본 발명은 또한 단일 전사체내에서 암호화된 폴리프로테인내 하나 이상의 폴리펩타이드의 성숙을 위한 내부 절단가능한 시그날 펩타이드를 사용할 수 있다. 이후에, 단일의 전사된 폴리펩타이드는 SPC에 의해 절단되어 별도의 개개 펩타이드 또는 단백질로 조립되는 개개의 펩타이드가 남는다. 본 발명의 양태들은 궁극적으로 성숙한 면역글로불린으로의 조립과 함께 단일의 전사된 폴리펩타이드내에 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 발현시키기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 본 발명은 폴리펩타이드 사이토킨, 성장 인자, 또는 각종의 다른 단백질을 발현시키기 위해, 예를 들면, 단일의 전사된 폴리펩타이드내에서 IL-12p40 및 IL-12p35를 발현시킨 후 IL-12, 또는 단일의 전사된 폴리펩타이드내 IL-12p40 및 IL-23p19로 조립시킨 후 IL-23으로 조립시키기 위해 적용가능하다.

시그날 펩타이드의 변형

sORF 작제물의 양태에서, 변형된 시그날 펩타이드가 사용된다. 예를 들면, 중쇄-int-경쇄의 작제에 있어서, 항체 분비 농도는, 경쇄 시그날 펩타이드 서열의 소수성이 부위-지시된 돌연변이유발을 통해 감소된 경우 약 10배 증가되었다. 시그날 펩타이드는 2007년 3월 22일 카슨(Carson) 등에 의해 미국 특허 출원 공보 제US 20070065912호에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다.

태그

본 발명의 sORF 작제물 설계의 양태는 태그, 바람직하게는 내부 태그를 함유하는 변형된 인테인의 용도를 포함한다. 각종의 태그가 당해 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 태그들은 형광성 태그 및 화학발광성 태그를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 작제물을 사용하여, 발현된 폴리프로테인의 양을 개개의 세포내에서 형광성 검출을 사용하여 모니터링할 수 있다. 또한, 이들 세포는 형광성 활성화된 세포 분류(FACS)를 사용하여 단백질 발현 수준에 따라 분류할 수 있다. 이러한 태그의 용도는, 이것이 FACS 분석을 통해 고 생산 세포 또는 세포주의 선택을 가능하도록 하므로 안정한 세포주 생성에 있어 특히 유용하다. 본 발명에 교시된 바와 같이, 완전한 길이의 인테인은 플랭킹 항체 중쇄 및 경쇄로부터 이들의 자가-절단 후 세포 분해물 속에서 관측되어 왔다. 이는 형광성 표지된 인테인의 검출 및 안정한 세포주 생성에 있어서 이들의 용도를 위한 염기들을 제공한다. 태그는 또한 단백질의 정제시 사용될 수 있다.

미니- 인테인

피. 호리코시이 PolI 인테인 및 Sce. VMA 인테인을 포함하는 많은 인테인에 존재하는 엔도뉴클레아제 영역이 유전자 발현 시스템의 경우 특히 유리하지 않기 때문에, 엔도뉴클레아제 도메인은 임의로 결실되어 소 링커로 교체됨으로써 "미니-인테인"을 생성할 수 있다. 이들 가공된 미니-인테인은 또한 기술된 작제물 설계에 유용하며, 이들은, 인테인 암호화 영역이 현저히 작아서, 목적한 폴리펩타이드를 암호화하는 보다 큰 서열을 허용하고/하거나 재조합체 DNA 분자의 보다 큰 취급 용이성을 허용하는 장점을 제공한다.

양태들에서, 완전한 사람 특성을 갖는 항체 또는 이의 유사체를 사용하는 것이 유리하다. 이들 시약은 비-사람 종으로부터 기원하는 항체 또는 유사체에 의해 유도된 바람직하지 않은 면역 반응을 피한다. 자가-프로세싱되는 펩타이드로부터 기원한 아미노산 잔기에 가능한 숙주 면역 반응에 초점을 맞추기 위해, 단백질분해 절단 부위에 대한 암호화 서열을 제1 단백질에 대한 암호화 서열과 자가-프로세싱되는 펩타이드에 대한 암호화 서열 사이에 삽입(당해 분야에 공지된 표준 방법론을 사용하여)삽입시켜 발현된 폴리펩타이드, 즉, 항체로부터 자가-프로세싱 펩타이드 서열을 제거할 수 있다. 이는 생체내에서 사용하기 위한 치료용 또는 진단용 항체에 있어 특별한 유용성을 발견한다.

유전자 전달 및 바이러스 벡터를 포함하는 벡터

본 발명은 2개 이상의 폴리펩타이드 또는 단백질에 대한 암호화 서열 및 세포내로 자가 프로세싱되는 절단 서열을 포함하는 작제물의 도입을 위한 각종 벡터들 중 어느 것의 사용을 고려한다. 유전자 발현 벡터의 다수의 예가 당해 분야에 공지되어 있으며 바이러스 또는 비-바이러스 기원일 수 있다. 본 발명의 실시에서 사용될 수 있는 비-바이러스 유전자 전달 방법은 플라스미드, 리포솜, 핵산/리포솜 복합체, 양이온성 지질 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

바이러스 및 다른 벡터는 세포를 효율적으로 형질도입하여 이들 자체의 DNA를 숙주 세포내로 도입시킬 수 있다. 재조합체 바이러스 벡터를 생성하는데 있어서, 비-필수적인 유전자를 목적한 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 발현가능한 서열로 교체한다. 예시적인 벡터는 바이러스 및 비-바이러스 벡터, 예를 들면, 레트로바이러스 벡터(렌티바이러스 벡터 포함), 복제 상보체, 복제 결여 및 이의 무기력한 형태(gutless form)를 포함하는 아데노바이러스(Ad) 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 시미안 바이러스 40(SV-40) 벡터, 소 파필로마 벡터, 엡슈타인-바르(Epstein-Barr) 벡터, 헤르페스 벡터, 박시니아 벡터, 몰로니 뮤린 백혈병 벡터, 하비 뮤린(Harvey murine) 육종 바이러스 벡터, 뮤린 유방 종양 바이러스 벡터, 라우스 육종(Rous sarcoma) 바이러스 벡터 및 비바이러스 플라스미드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바쿨로바이러스 벡터는 잘 공지되어 있으며 곤충 세포내에서 발현시키기에 적합하다. 포유동물 또는 다른 진핵 세포내에서 발현에 적합한 다수의 벡터는 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 많은 것이 시판되고 있다. 시판되는 공급원은, 스트라타젠(Stratagene, 캘리포니아주 라 졸라 소재); 인비트로겐(Invitrogen, 캘리포니아주 칼스바드 소재); 프로메가(Promega, 위스콘신주 매디슨 소재) 및 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, 미주리주 세인트 루이스 소재)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 많은 벡터 서열이 진뱅크(GenBank)를 통해 사용가능하며, 벡터에 관한 추가의 정보는 라이켄 바이오소스 센서(Riken BioSource Center)를 통한 인터넷 상에서 사용가능하다.

하나의 양태에서, 벡터는 통상적으로 복제 오리진을 포함하며 벡터는 또한, 이에 의해 벡터가 확인되어 선택될 수 있는 "마커" 또는 "선택가능한 마커" 기능을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 어떠한 선택가능한 마커도 사용가능하지만, 재조합체 벡터에서 사용하기 위한 선택가능한 마커는 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있고, 적절한 선택가능한 마커의 선택은 숙주 세포에 의존할 것이다. 항생제 또는 다른 독소에 대해 내성을 부여하는 단백질을 암호화하는 선택가능한 마커 유전자의 예는 암피실린, 메토트렉세이트, 테트라사이클린, 네오마이신(참조: Southern et al. 1982. J Mol Appl Genet. 1:327-41), 마이코페놀산(참조: Mulligan et al. 1980. Science 209:1422-7), 푸로마이신, 제오마이신, 하이그로마이신(참조: Sugden et al. 1985. Mol Cell Biol. 5:410-3), 디하이드로폴레이트 리덕타제, 글루타민 합성효소 및 G418을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 당해 분야의 숙련가에게 이해될 바와 같이, 발현 벡터는 통상적으로 발현될 암호화 서열(들)에 적절한 것으로서, 복제 오리진, 발현될 암호화 서열 또는 서열들에 작동적으로 연결된 프로모터, 및 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이싱 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결인자 서열을 포함한다.

"재조합체"로서 벡터 또는 다른 DNA 서열에 대한 참조 문헌들은 단지 천연으로부터 분리되거나 발견된 것으로서 전형적으로 작동적으로 연결되지 않는 DNA 서열의 작동가능한 연결을 단순히 인지하고 있다. 조절성(발현 및/또는 제어) 서열은, 발현 및/또는 제어 서열이 전사를 조절하고, 경우에 따라 핵산 서열의 해독을 조절하는 경우 핵산 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 따라서, 발현 및/또는 제어 서열은 프로모터, 인핸서, 전사 종결인자, 암호화 서열에 대한 출발 코돈(즉, ATG) 5', 인트론에 대한 스플라이싱 시그날 및 정지 코돈을 포함할 수 있다.

아데노바이러스 유전자 치료요법 벡터는 강력한 일시적인 발현, 탁월한 역가, 및 생체내에서 분열하는 세포 및 분열하지 않는 세포를 형질도입하는 능력을 나타내는 것으로 알려져 있다(참조: Hitt et al. 2000. Adv in Virus Res 55:479-505). 재조합체 Ad 벡터는, 벡터가 복제-결여성 Ad 비리온내로 도입되도록 할 수 있는 패키징 부위(packaging site); 목적한 2개 이상의 폴리펩타이드 또는 단백질에 대한 암호화 서열, 예를 들면, 목적한 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄; 및 단독으로나 추가의 단백질분해 절단 부위와 함께 자가-프로세싱되는 절단 부위를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 감염성 비리온내로 도입하는데 필수적이거나 도움이 되는 다른 성분들은 5' 및 3' Ad ITR, E2 유전자, E4 유전자의 부위 및 임의로 E3 유전자를 포함한다.

재조합체 Ad 벡터를 봉입하는 복제-결여성 Ad 비리온은 당해 분야에 공지된 표준 기술에 의해 Ad 패키징 세포 및 패키징 기술을 사용하여 제조된다. 이들 방법의 예는 예를 들면, 미국 특허 제5,872,005호에서 찾을 수 있다. 2개 이상의 목적한 폴리펩타이드 또는 단백질에 대한 암호화 서열은 바이러스 게놈의 결실된 E3 영역내에서 아데노바이러스내로 일반적으로 삽입된다. 본 발명을 실시하는데 사용하기 위한 바람직한 아데노바이러스 벡터는 하나 이상의 야생형 Ad 유전자 생성물, 예를 들면, E1a, E1b, E2, E3, 및 E4를 발현하지 않는다. 바람직한 양태는 E1, E2A, E4 및 임의로 E3 유전자 영역의 기능을 보충하는 패키징 세포주와 함께 전형적으로 사용되는 비리온이다(참조: 예를 들면, 미국 특허 제5,872,005호, 제5,994,106호, 제6,133,028호 및 제6,127,175호).

본원에 사용된 것으로서, "아데노바이러스" 및 "아데노바이러스 입자"는 바이러스 자체 또는 이의 유도체이며 달리 나타낸 것을 제외한, 모든 혈청형 및 아형, 및 천연적으로 존재하는 형태 및 재조합체 형태 둘다를 포함한다. 이러한 아데노바이러스는 야생형이거나 당해 분야에 공지되거나 본원에 토의된 바와 같은 각종 방식으로 변형시킬 수 있다. 이러한 변형은 감염성 바이러스를 제조하기 위하여 입자내로 패키징되는 아데노바이러스 게놈에 대한 변형을 포함한다. 이러한 변형은 하나 이상의 E1a, E1b, E2a, E2b, E3, 또는 E4 암호화 영역 중의 하나 이상과 같이, 당해 분야에 공지된 결실을 포함한다. 예시적인 패키징 및 생산자 세포는 293, A549 또는 HeLa 세포로부터 기원한다. 아데노바이러스 벡터는 당해 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 정제하고 제형화된다.

아데노-관련 바이러스(AAV)는 염색체 통합에 의해 잠재적으로 세포를 감염시킬 수 있는 헬퍼-의존성 사람 파르보바이러스이다. 염색체적으로 통합되는 이의 능력 및 이의 비병원성 특성으로 인하여, AAV는 사람 유전자 치료요법 벡터로서 유의적으로 유효하다. 본 발명을 실시하는데 사용하기 위해, rAAV 비리온을 당해 분야의 숙련가에게 공지된 표준 방법론을 사용하여 생산할 수 있으며 이들은 전사 방향으로 작동적으로 연결된 성분으로서, 전사 개시 및 종결 서열, 및 목적한 암호화 서열(들)을 포함하는 제어 서열을 포함하도록 작제된다. 보다 구체적으로, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는, 벡터가 복제-결여성 AAV 비리온내로 혼입될 수 있도록 하는 패키징 부위; 목적한 2개 이상의 폴리펩타이드 또는 단백질에 대한 암호화 서열, 예를 들면, 목적한 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄; 단독 또는 하나 이상의 추가의 단백질분해 절단 부위와 함께 자가-프로세싱되는 절단 부위를 암호화하는 서열을 포함한다. 본 발명을 실시하는데 사용하기 위한 AAV 벡터는, 이들이 또한 전사 방향으로 작동적으로 연결된 성분으로서 전사 개시 및 종결 서열을 포함하는 제어 서열을 포함한다. 이들 성분들은 기능성 AAV ITR 서열에 의해 5' 및 3' 말단에서 플랭킹된다. "기능성 AAV ITR 서열"은, ITR 서열이 AAV 비리온의 구조(rescue), 복제 및 패키징을 위해 의도되는 바와 같이 기능함을 의미한다.

재조합체 AAV 벡터는 또한, 이들이 표적 세포내에서 선택된 재조합체 폴리펩타이드 또는 단백질 생성물의 발현 및 생산을 지시할 수 있다는 점을 특징으로 한다. 따라서, 재조합체 벡터는 캡시드화(encapsidation)에 필수적인 AAV의 서열 및 재조합체 AAV(rAAV) 비리온의 감염을 위한 물리적인 구조 중 적어도 모두를 포함한다. 따라서, 발현 벡터에서 사용하기 위한 AAV ITR은 야생형 뉴클레오타이드 서열을 가질 필요가 없으며(참조: 예를 들면, Kotin. 1994. Hum. Gene Ther. 5:793-801), 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있거나 AAV ITR은 몇가지 AAV 혈청형 중 어느 것으로부터 기원할 수 있다. 일반적으로, AAV 벡터는 당해 분야에 공지된 아데노-관련 바이러스 혈청형으로부터 기원한 어떠한 벡터일 수 있다.

전형적으로, AAV 발현 벡터는 생산자 세포내로 도입된 후 AAV 헬퍼 작제물이 도입되며, 여기서, 헬퍼 작제물은 생산자 세포내에서 발현될 수 있고 AAV 벡터내에 부재하는 AAV 헬퍼 기능을 보충하는 AAV 암호화 영역을 포함한다. 헬퍼 작제물은 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제6,548,286호에 기술된 바와 같이 전형적으로 ATG로부터 ACG로 p5를 수반한 출발 코돈을 돌연변이시킴에 의해, 거대한 Rep 단백질(Rep78 및 Rep68)의 발현을 하향 조절하도록 설계될 수 있다. 이는 헬퍼 바이러스 및/또는 추가의 벡터의 생산자 세포로의 도입을 수반하며, 여기서, 헬퍼 바이러스 및/또는 추가의 벡터는 효율적인 rAAV 바이러스 생산을 지지할 수 있는 보조 기능을 제공한다. 이후에, 생산자 세포를 배양하여 rAAV를 생산한다. 이들 단계는 표준 방법론으로 수행한다. 본 발명의 재조합체 AAV 벡터를 봉입할 수 있는 복제-결여성 AAV 비리온은 당해 분야에 공지된 표준 기술에 의해 AAV 패키징 세포 및 패키징 기술을 사용하여 제조한다. 이들 방법의 예는 본원에 이의 전문이 참조로 인용된 미국 특허 제5,436,146호; 제5,753,500호, 제6,040,183호, 제6,093,570호 및 제6,548,286호에서 찾을 수 있다. 패키징을 위한 추가의 조성물 및 방법은 또한 본원에 이의 전문이 참조로 인용된 왕(Wang) 등의 미국 특허 공보 제2002/0168342호에 기술되어 있으며, 당해 분야의 숙련가의 지식내에 있는 기술들을 포함한다.

본 발명을 실시하는데 있어서, rAAV 또는 다른 벡터 발현 벡터 비리온을 생산하기 위한 숙주 세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 미생물 및 효모를 포함한다. 숙주 세포는 또한, AAV 벡터 게놈이 안정하게 유지되고 패키징되는 숙주 세포 또는 생산자 세포에서 AAV(또는 다른) rep 및 cap 유전자가 안정하게 유지되는 패키징 세포일 수 있다. 예시적인 패키징 및 생산자 세포는 293, A549 또는 HeLa 세포로부터 기원한다. AAV 벡터는 당해 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 정제하고 제형화된다. 추가의 적합한 숙주 세포(벡터에 의존)는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, CHO 디하이드로폴레이트 리덕타제 결여성 변이체, 예를 들면, CHO DX B11 또는 CHO DG44 세포(참조: 예를 들면, Urlaub and Chasin. 1980. Proc. Natl. Acad. Sci. 77:4216-4220), PerC.6 세포(참조: Jones et al. 2003. Biotechnol. Prog. 19:163-168) 또는 Sp/20 마우스 흑색종 세포(참조: Coney et al. 1994. Cancer Res. 54:2448-2455)를 포함한다.

레트로바이러스 벡터

레트로바이러스 벡터는 유전자 전달을 위해 사용될 수 있다(참조: Miller. 1992. Nature 357: 455-460). 레트로바이러스 벡터 및 보다 특히 렌티바이러스 벡터는 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 것으로서 용어 "레트로바이러스" 또는 "레트로바이러스 벡터"는 "렌티바이러스" 및 "렌티바이러스 벡터" 각각을 포함함을 의미한다. 레트로바이러스 벡터는 시험되어 광범위한 표적 세포의 게놈내로 목적한 유전자를 안정하게 도입시키기에 적합한 전달 비히클임이 밝혀졌다. 재정렬되지 않은 단일 카피의 이식유전자를 세포내로 전달하기 위한 레트로바이러스 벡터의 능력은, 레트로바이러스 벡터가 유전자를 세포내로 형질전달하기에 매우 적합하도록 한다. 또한, 레트로바이러스는 레트로바이러스 엔벨로프 당단백질의 숙주 세포상의 특이적인 세포 표면 수용체에 대한 결합에 의해 숙주 세포로 도입한다. 결과적으로, 암호화된 천연 엔벨로프 단백질이 천연 엔벨로프 단백질보다 상이한 세포 특이성을 갖는 이종 엔벨로프 단백질에 의해 교체되는(예를 들면, 천연의 엔벨로프 단백질과 비교하여 상이한 세포-표면 수용체에 결합하는) 슈도타입(pseudotyped) 레트로바이러스 벡터는 또한 본 발명을 실시하는데 있어서의 유용성을 찾을 수 있다. 하나 이상의 표적 단백질 암호화 서열을 암호화하는 레트로바이러스 벡터의 특이적인 표적 세포로의 전달을 지시하는 능력이 본 발명을 실시하는데 바람직하다.

본 발명은 예를 들면, 하나 이상의 이식유전자 서열을 포함하는 레트로바이러스 전달 벡터 및 하나 이상의 패키징 성분들을 포함하는 레트로바이러스 패키징 벡터를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 제공한다. 특히, 본 발명은 슈도타입 레트로바이러스를 생산하기 위한 이종 또는 기능적으로 변형된 엔벨로프 단백질을 암호화하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터를 제공한다.

본 발명의 레트로바이러스 벡터의 코어 서열은 예를 들면, B, C, 및 D 유형 레트로바이러스를 포함하는 광범위한 레트로바이러스 및, 스푸마바이러스(spumavirus) 및 렌티바이러스로부터 용이하게 기원할 수 있다(참조: RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985). 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 레트로바이러스의 예는 렌티바이러스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 다른 레트로바이러스는 조류 백혈증 바이러스(Avian Leukosis Virus), 소 백별병 바이러스(Bovine Leukemia Virus), 뮤린 백혈병 바이러스(Murine Leukemia Virus), 민크-세포 유도 바이러스(Mink-Cell Focus-Inducing Virus), 뮤린 육종 바이러스(Murine Sarcoma Virus), 그물내피증 바이러스(Reticuloendotheliosis virus) 및 라우스 육종 바이러스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특히 바람직한 뮤린 백혈병 바이러스는 4070A 및 1504A(참조: Hartley and Rowe. 1976. J. Virol. 19:19-25), 아벨슨(Abelson)(ATCC No. VR-999), 프렌드(Friend)(ATCC No. VR-245), 그라피(Graffi), 그로쓰(Gross)(ATCC No. VR-590), 키르슈타인 하르비 육종 바이러스(Kirsteni Harvey Sarcoma Virus) 및 라우셔(Rauscher)(ATCC No. VR-998), 및 몰로니 뮤린 육종 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus)(ATCC No. VR-190)를 포함한다. 이러한 레트로바이러스는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC; 버지니아주 마나사스 소재)과 같은 기탁기관 또는 수집기관으로부터 용이하게 입수할 수 있거나 상업적으로 사용가능한 기술을 사용하여 공지된 공급원으로부터 분리할 수 있다. 다른 것들은 상업적으로 사용가능하다.

하나의 양태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터 서열은 렌티바이러스로부터 기원할 수 있다. 바람직한 렌티바이러스는 사람 면역결핍성 바이러스, 예를 들면, 제1 형 또는 제2 형(즉, HIV-1 또는 HIV-2, 여기서, HIV-1는 이미 림프절병 관련 바이러스 3(HTLV-III) 및 후천성 면역결핍증(AIDS)-관련 바이러스(ARV)로 불렸다), 또는 AIDS 또는 ADIS-유사 질환으로 확인되고 이와 관련된 HIV-1 또는 HIV-2와 관련된 다른 바이러스이다. 다른 렌티바이러스는 양 비스나(Visna)/매디(maedi) 바이러스, 고양이 면역결핍증 바이러스(FIV), 소 렌티바이러스, 시미안 면역결핍성 바이러스(SIV), 말 감염성 백혈병 바이러스(EIAV), 및 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV)를 포함한다.

레트로바이러스의 적합한 유전자 및 균주는 당해 분야에 잘 공지되어 있다(참조: 예를 들면, 본원에 참조로 인용된 Fields Virology, Third Edition, edited by B. N. Fields et al. 1996. Lippincott-Raven Publishers, 참조: 예를 들면, Chapter 58, Retroviridae: The Viruses and Their Replication, Classification, pages 1768-1771, 이의 표 1 포함). 생산자 세포를 생성하기 위한 레트로바이러스 패키징 시스템 및 레트로바이러스를 생산하는 생산자 세포주, 및 이러한 패키징 시스템을 제조하는 방법 또한 당해 분야에 공지되어 있다.

일반적인 패키징 시스템은 적어도 2개의 패키징 벡터: gag, pol, 또는 gag 및 pol 유전자를 포함하는 제1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1의 패키징 벡터; 및 이종 또는 기능적으로 변형된 엔벨로프 유전자를 포함하는 제2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2의 패키징 벡터를 포함한다. 레트로바이러스 성분은 HIV와 같은 렌티바이러스로부터 기원할 수 있다. 벡터는 기능적인 tat 유전자 및/또는 기능적인 보조 유전자(vif, vpr, vpu, vpx, nef)를 결여할 수 있다. 시스템은 rev 유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 지닌 제3의 패키징 벡터를 추가로 포함할 수 있다. 패키징 시스템은 제1, 제2, 및 임의로 제3의 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 패키징 세포의 형태로 제공될 수 있다.

양태들에서, 각종 발현 시스템, 특히 진핵 세포 및 유리하게는 포유동물 세포를 사용하는 것들에 대한 적용성이 존재한다. 천연 단백질이 당화되는 경우, 바람직한 양태는 발현된 단백질에 대해 천연-유사 당화를 제공할 발현 시스템을 포함할 수 있다.

렌티바이러스는 일반적으로 env 유전자에 의해 암호화된 엔벨로프 당단백질 SU (gp120) 및 TM (gp41); gag 유전자에 의해 암호화된 CA(p24), MA(p17) 및 NC(p7-11); pol 유전자에 의해 암호화된 RT, PR 및 IN을 포함하는 몇개의 구조적 비리온 단백질을 공유한다. HIV-1 및 HIV-2는 바이러스 RNA 및 다른 복제성 기능의 합성 및 프로세싱의 조절에 관여된 보조 및 다른 단백질을 함유한다. vif, vpr, vpu/vpx, 및 nef 유전자에 의해 암호화된 보조 단백질은 재조합체 시스템으로부터 제외(또는 불활성화)될 수 있다. 또한, tat 및 rev는 예를 들면, 돌연변이 또는 결실에 의해 제외되거나 불활성화될 수 있다.

제1 세대 렌티바이러스 벡터 패키징 시스템은 gag/pol 및 env에 대한 별개의 패키징 작제물을 제공하며, 전형적으로 안전성 이유로 이종의 또는 기능적으로 변형된 엔벨로프 단백질을 사용한다. 제2 세대 렌티바이러스 벡터 시스템에서, 보조 유전자, vif, vpr, vpu 및 nef는 결실되거나 불활성화된다. 제3 세대 렌티바이러스 벡터 시스템은, 이로부터 tat 유전자가 결실되거나 또는 기타의 경우 불활성화되는(예를 들면, 돌연변이를 통해) 것들이다.

tat에 의해 일반적으로 제공된 전사 조절용 보상은 사람 사이토메갈로바이러스 이미디어트 얼리(immediate early)(HCAAV-IE) 인핸서/프로모터와 같은 강력한 구성적 프로모터의 사용에 의해 제공될 수 있다. 다른 프로모터/인핸서는 구성적 프로모터 활성의 강도, 표적 조직에 대한 특이성(예를 들면, 간-특이적인 프로모터), 또는 당해 분야에서 이해되는 바와 같이, 발현에 걸쳐 바람직한 제어와 관련된 다른 인자들을 기준으로 선택될 수 있다. 예를 들면, 일부 양태에서, 제어된 발현을 달성하기 위해 tet와 같은 유도성 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. rev를 암호화하는 유전자는 별개의 발현 작제물에서 제공되어, 대표적인 제3 세대 렌티바이러스 벡터 시스템이 4개의 플라스미드: gagpol, rev, envelope에 대해 각각 1개 및 전달 벡터를 포함할 수 있다. 사용된 패키징 시스템의 세대에 상관없이, gag 및 pol은 단일 작제물 상에 또는 별개의 작제물 상에 제공될 수 있다.

전형적으로, 패키징 벡터는 패키징 세포내에 포함되며, 형질감염, 형질유도 또는 감염을 통해 세포내로 도입된다. 형질감염, 형질도입 또는 감염을 위한 방법은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다. 본 발명의 레트로바이러스 전달 벡터는 패키징 세포주내로, 형질감염, 형질도입 또는 감염에 의해 도입되어, 생산자 세포 또는 세포주를 생성할 수 있다. 본 발명의 패키징 벡터는 사람 세포 또는 세포주내로 예를 들면, 인산칼슘 형질감염, 지질감염 또는 전기천공을 포함하는 표준 방법에 의해 도입될 수 있다. 일부 양태에서, 패키징 벡터는 세포내로 우세한 선택가능한 마커, 예를 들면, neo, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR), 글루타민 합성효소 또는 ADA를 사용하여 함께 도입시킨 후, 적절한 약물의 존재하에서 선택 및 클론의 분리를 수반한다. 선택가능한 마커 유전자는 패키징 벡터에 의해 암호화된 유전자에 물리적으로 연결될 수 있다.

패기징 기능이 적합한 패키징 세포에 의해 발현되도록 구조화된 적합한 세포주가 공지되어 있다. 예를 들면, 패키징 세포를 기술하고 있는 미국 특허 제5,686,279호; 및 문헌(참조: Ory et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. 93:11400-11406)을 참조한다. 안정한 세포주 생산의 추가의 기술은 문헌[참조: Dull et al. 1998. J. Virol. 72(11):8463-8471; 및 Zufferey et al. 1998. J. Virol. 72:9873-9880]에서 찾을 수 있다.

문헌(참조: Zufferey et al. 1997. Nat. Biotechnol. 15:871-75)은 렌티바이러스 패키징 플라스미드를 교시하고 있으며, 여기서 HIV-1 엔벨로프 유전자를 포함하는 pol의 3' 서열은 결실되어 있다. 작제물은 tat 및 rev 서열을 함유하며 3' LTR은 폴리 A 서열로 대체된다. 5' LTR 및 psi 서열은 유도성인 것과 같은 다른 프로모터로 교체된다. 예를 들면, CMV 프로모터 또는 이의 유도체가 사용될 수 있다.

패키징 벡터는 패키징 기능에 대한 추가의 변화를 함유함으로써 렌티바이러스 단백질 발현을 향상시키고 안전성을 향상시킬 수 있다. 예를 들면, gag의 상부의 HIV 서열 모두는 제거될 수 있다. 또한, 엔벨로프의 하부 서열은 제거될 수 있다. 또한, 단계들을 수행하여 벡터를 변형시킴으로써 RNA의 스플라이싱 및 해독을 향상시킬 수 있다.

임의로, 문헌(참조: Dull et al. 1998. 상기 참조)에 기술된 것과 같은, 조건화된 패키징 시스템을 사용한다. 또한, 예를 들면 문헌(Zufferey et al. 1998. J. Virol. 72:9873-9880)에 기술된 것으로서 HIV-1 긴 말단 반복체(LTR)의 결실에 의해 벡터의 생물안전성을 개선시키는 자가-불활성화 벡터(SIN)의 사용이 바람직하다. 유도성 벡터를 또한 예를 들면, 테트라사이클린-유도성 LTR을 통해 사용할 수 있다.

프로모터

양태들에서, 본 발명의 벡터는 전형적으로 이종 제어 서열을 포함하며, 이는 사이토메갈로바이러스(CMV) 이미디에이트 얼리 프로모터, RSV LTR, MOMLV LTR, 및 PGK 프로모터; mTTR, TK, HBV, hAAT, 조절가능하거나 유도성인 프로모터를 포함하는 조직 또는 세포 유형 특이적인 프로모터, 인핸서 등과 같은 구성적 프로모터를 포함하나 이에 한정되지 않는 이종 제어 서열을 포함한다.

특정의 유용한 프로모터는 LSP 프로모터(참조: III et al. 1997. Blood Coagul. Fibrinolysis 8S2:23-30), EF1-알파 프로모터[참조: Kim et al. 1990. Gene 91 (2):217-23) 및 Guo et al. 1996. Gene Ther. 3(9):802-10]를 포함한다. 가장 바람직한 프로모터는 연장 인자 1-알파(EF1a) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, 사이토메갈로바이러스 이미디에이트 얼리 유전자(CMV) 프로모터, 키메라 간-특이적인 프로모터(LSP), 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴(CAG) 프로모터, 테트라사이클린 반응성 프로모터(TRE), 트랜스티레틴 프로모터(TTR), 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터 및 CK6 프로모터를 포함한다. 본 발명의 실시에 유용한 유리한 프로모터는 아데노바이러스 주요 레이트 프로모터(참조: Berkner and Sharp. 1985. Nucl. Acids Res. 13:841-857)이다. 관련 프로모터의 구조적 및 기능적 정보는 당해 분야에 공지되어 있다. 관련 서열은 공공의 데이타베이스로부터 용이하게 수득될 수 있으며 본 발명의 국면을 실시하는데 사용하기 위해 벡터내로 혼입될 수 있다.

본 발명의 실시에 특히 바람직한 프로모터는 아데노바이러스 주요 레이트 프로모터이다. 발현 카세트는 5'에서 3' 방향으로, 아데노바이러스 주요 레이트 프로모터, 목적한 단백질 또는 목적한 단백질 쇄에 대한 제1 암호화 서열에 대해 작동적인 3부(tripartite) 리더 서열, 자가 프로세싱 서열 또는 프로테아제 절단 서열을 암호화하는 서열, 목적한 단백질 또는 단백질 쇄에 대한 제2의 암호화 서열, 및 임의로 자가 프로세싱 서열 또는 프로테아제 절단 서열을 암호화하는 서열에 이어, 목적한 단백질 또는 단백질 쇄의 제3의 암호화 서열을 포함할 수 있다. 이들 암호화 서열들 모두는 공유결합적으로 연결되며 동일한 판독 프레임내에 존재함으로써 해독이 폴리프로테인 암호화 서열내에서 종결되지 않도록 한다. 단백질 합성 동안 또는 다중펩타이드의 합성의 완결 후 자가 프로세싱 또는 단백질분해 프로세싱은 폴리프로테인을 적절한 단백질 쇄 또는 단백질들로 절단한다. 면역글로불린 합성의 경우에, 경쇄에 대한 암호화 서열은 폴리프로테인 암호화 서열내에 2회로 존재한다. 유리하게는, 리더 서열 암호화 영역은 단백질 또는 단백질 쇄 서열과 관련될 수 있으며; 시그날 펩티다제에 의한 프로세싱은 프로세싱 부위의 하부의 단백질의 N-말단에서 특정의 잔류 아미노산 잔기를 제거하는 추가의 이점을 가질 수 있다. 면역글로불린 중쇄에 대한 성분은 Met, 단백질 개시 메티오닌; HC, 중쇄; LC, 경쇄, SPPC, 자가-프로세싱 또는 프로테아제 절단 부위이다. 면역글로불린 합성을 위한 발현 작제물은 다음을 포함할 수 있다: Met-프로테아제-SPPC- HC 리더 서열-HC-SPPC-LC 리더 서열-LC-SPPC-LC 리더 서열-LC; Met-프로테아제-SPPC-LC 리더 서열-LC-SPPC-LC 리더 서열-LC-SPPC-HC 리더 서열-HC; Met-프로테아제-SPPC- LC 리더 서열-LC-SPPC-HC 리더 서열-HC-SPPC-LC 리더 서열-LC; HC 리더 서열-HC-SPPC-LC 리더 서열-LC-SPPC-LC 리더 서열-LC; LC 리더 서열-LC-SPPC-HC 리더 서열-HC-SPPC-LC 리더 서열-LC; LC 리더 서열-LC-SPPC-LC 리더 서열-LC-SPPC-HC 리더 서열-HC; Met-프로테아제-SPPC-HC 리더-HC-SPPC-LC 리더-LC.

항체를 포함하는 생물치료제 분자

본 발명의 영역내에서, 특수하게 발현된 항체(면역글로불린)은 특히 종양 괴사 인자[HUMIRA/D2E7(애보트 바이오테크놀로지 리미티드(Abbott Biotechnology Ltd., 버뮤다 해밀톤 소재)에 상응하고/하거나 기원한 가공된 항체]; 인터루킨-12(ABT-874로부터 기원한 가공된 항체); 인터루킨-18(ABT-325로부터 기원한 가공된 항체); 재조합체 에리트로포이에틴 수용체(ABT-007로부터 기원한 가공된 항체); 또는 E/L 셀렉틴(EL246-GG로부터 기원한 가공된 항체)를 포함할 수 있다. 가공된 폴리프로테인의 암호화 및 아미노산 서열은 본원에 기재되어 있거나 당해 분야에서 사용가능하다. 본 발명에 적합한 추가의 항체는 예를 들면, 레미케이드(인플릭시마브); 리툭산/마브테라(리툭시마브); 헤르셉틴(트라스투주마브); 아바스틴(베바키주마브); 시나기스(팔리비주마브); 에르비툭스(세툭시마브); 레오프로(아브킥시마브); 오르토클론 OKT3(무로모나브-CD3); 제나팍스(다클리주마브); 시물렉트(바실릭시마브); 마일로타르그(겜투주마브); 캄패쓰(알렘투주마브); 제발린(이브리투모마브); 크솔라이르(오말리주마브); 벡사르(토시투모마브); 및 라프티바(에팔리주마브)를 포함하며; 여기서 일반적으로 상표-제품명은 괄호안의 각각의 일반명으로 이어온다. 추가의 적합한 단백질은 예를 들면, 하나 이상의 에포에틴 알파, 에포에틴 베타, 에타네르셉트, 다르베포에틴 알파, 필그라스팀, 인터페론 베타 1a, 인터페론 베타 1b, 인터페론 알파-2b, 인슐린 글라르긴, 소마트로핀, 테리파라티드, 폴리트로핀 알파, 도르나제, 인자 VIII, 인자 VII, 인자 IX, 이미글루세라제, 네시리티드, 레노그라스팀 및 폰 빌레브란트 인자(Von Willebrand factor)를 포함하며; 여기서 하나 이상의 일반 지명은 각각 제품의 하나 이상의 상표-제품 명에 상응할 수 있다. 다른 항체 및 단백질도 당해 분야에서 이해되는 바와 같이 본 발명에 적합하다.

본 발명은 또한 2개 이상의 목적하는 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 프로단백질에 대한 암호화 서열의 제어된 발현을 고려한다. 유전자 조절 시스템은 특수 유전자 또는 유전자들의 조절된 발현에 유용하다. 하나의 예시적인 시도에서, 유전자 조절 시스템 또는 스위치(switch)는 리간드 결합 도메인, 전사 활성화 도메인 및 DNA 결합 도메인을 갖는 키메라 전사 인자를 포함한다. 도메인은 사실상 어떠한 공급원으로부터 수득될 수 있고 신규 단백질을 수득하기 위한 다수의 방식들 중 어느 것을 결합시킬 수 있다. 조절가능한 유전자 시스템은 또한 키메라 전사 인자와 상호작용하는 DNA 반응 성분을 포함한다. 이러한 전사 조절 성분은 조절될 유전자에 인접하게 위치한다.

본 발명을 실시하는데 사용될 수 있는 예시적인 전사 조절 시스템은 예를 들면, 드로소필라 엑다이손 시스템(Drosophila ecdysone system)(참조: Yao et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. 93:3346), 봄빅스 엑다이손 시스템(Bombyx ecdysone system)(참조: Suhr et al. 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:7999), 유도인자로서 RU486을 사용하는 진스위치(GeneSwitch)[텍사스주 우드랜드 소재의 발렌티스(Valentis)의 상표명] 합성 프로게스테론 수용체 시스템(참조: Osterwalder et al. 2001 . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98(22):12596-601); 테트라사이클린(Tc) 또는 유사체, 예를 들면 독시사이클린과 같은 소 분자를 사용하여 표적의 전사를 조절[작동(turn on) 또는 비작동(turn off)]시키는 Tet 및 RevTet 시스템[테트라사이클린 조절된 발현 시스템, 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 비디 바이오사이언시즈 클론테크(BD Biosciences Clontech)][참조: Knott et al. 2002. Biotechniques 32(4):796, 798, 800]; 이들 각각이 전사 활성인자 또는 DNA 결합 단백질에 연결된, 2개의 세포내 분자와 함께 오는 소 분자의 사용을 기초로 하는 ARIAD 조절 기술[아리아드(Ariad), 매사추세츠주 캠브릿지 소재]을 포함한다. 이들 성분들이 함께 오는 경우, 목적하는 유전자의 전사가 활성화된다. 아리아드는 단독이합체를 기준으로 하는 시스템 및 이종이합체를 기준으로 하는 시스템을 갖는다[참조: Rivera et al. 1996. Nature Med. 2(9):1028-1032; Ye et al. 2000. Science 283:88-91].

항체 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 서열 또는 자가-프로세싱 또는 프로테아제-절단된 재조합체 다중펩타이드의 형태의 다른 이종 단백질 또는 프로-단백질을 포함하는 본 발명의 발현 벡터 작제물의 양태를 외부의 치료제 또는 이식유전자의 세포내, 예를 들면, 체세포내 전달을 위한 시험관내, 생체외 또는 생체내, 또는 벡터-형질도입된 세포에 의한 재조합체 폴리펩타이드의 생산시 세포내로 도입시킬 수 있다.

숙주 세포 및 벡터의 전달

본 발명의 벡터 작제물은 당해 분야에 공지된 표준 방법론을 사용하여 시험관내 또는 생체외에서 적합한 세포내로 도입시킬 수 있다. 이러한 기술은 예를 들면, 인산칼슘을 사용한 형질감염, 배양된 세포내로의 미세주입(참조: Capecchi. 1980. Cell 22:479-488), 전기천공(참조: Shigekawa et al. 1988. BioTechnology 6:742-751), 리포솜-매개된 유전자 전달(참조: Mannino et al. 1988. BioTechnology 6:682-690), 지질-매개된 형질도입(참조: Feigner et al. 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417), 및 고-속 미세 발사체(high-velocity microprojectile)를 사용한 핵산 전달(참조: Klein et al. 1987. Nature 327:70-73)을 포함한다.

시험관내 또는 생체외 발현을 위해, 기능성 단백질 생성물을 발현시키는데 효과적인 어떠한 세포도 사용할 수 있다. 단백질 발현을 위해 사용된 세포 및 세포주의 다수의 예가 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 원핵 세포 및 곤충 세포를 발현에 사용할 수 있다. 또한, 효모와 같은 진핵 미생물도 사용할 수 있다. 원핵, 곤충 및 효모 시스템에서 재조합체 단백질의 발현은 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있으며 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 항체 또는 다른 단백질 발현을 위해 조정할 수 있다.

발현에 유용한 세포의 예는 또한 포유동물 세포, 예를 들면, 섬유모세포, 비-사람 포유동물로부터의 세포, 예를 들면, 조류, 돼지, 뮤린 및 소 세포, 곤충세포 등으로부터의 세포를 포함한다. 포유동물 세포의 특이적인 예는 COS 세포, VERO 세포, HeLa 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, CHO DX B11 세포, CHO DG44 세포, PerC.6 세포, Sp2/0 세포, 293 세포, NSO 세포, 3T3 섬유모세포, W138 세포, BHK 세포, HEPG2 세포, 및 MDCK 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

숙주 세포는 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상의 영양 배지 속에서 배양된다. 포유동물 숙주 세포는 각종 배지 속에서 배양될 수 있다. 시판되는 배지, 예를 들면, Ham's F10[제조원: 시그마(Sigma)], 최소 필수 배지(MEM)(제조원: 시그마), RPMI 1640(제조원: 시그마), 최소 필수 배지(MEM) 알파 배지, 및 둘베코 변형된 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM)(제조원: 시그마)가 전형적으로 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 제공된 배지는 일반적으로 경우에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예를 들면, 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장 인자), 염(예를 들면, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충액(예를 들면, HEPES), 뉴클레오사이드(예를 들면, 아데노신 및 티미딘), 항생제, 미량 성분, 및 글루코즈 또는 동등한 에너지원으로 보충된다. 어떠한 다른 필수 보충물도 또한 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 특수 세포주에 대한 적절한 배양 조건, 예를 들면, 온도, pH 등은 예를 들면, ATCC 카탈로그("atcc.org/SearchCatalogs/AIICollections.cfm"에서 인터넷으로 사용가능하거나 시판 공급업자에 의해 지시된 바와 같음)에서, 다수의 세포주의 배양을 위한 제안된 배양물 조건과 함께, 당해 분야에 일반적으로 공지되어 있다.

발현 벡터를 생체내에서 각종 경로(예를 들면, 피내, 정맥내, 종양내, 뇌내로, 문맥내, 복강내, 근육내, 방광내 등)를 통해 투여하여 자가 프로세싱 절단 서열을 통해 연결된 다수의 유전자를 전달함으로써 동물 모델 또는 사람 대상체에서 2개 이상의 단백질 또는 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 투여 경로에 의존하여, 치료용 단백질은 국소적으로(뇌 또는 방광내에서) 또는 전신계적으로(다른 투여 경로) 이들의 효과를 발휘한다. 전사 해독 프레임(들)에 대한 조직 특이적인 프로모터 5'의 사용은 전체 전사 해독 프레임에 의해 암호화된 단백질 또는 폴리펩타이드의 조직 특이적인 발현을 생성한다.

시험관내, 생체외 또는 생체내에서 표적 세포내로 이식유전자를 운반하는 재조합체 발현 벡터를 도입하는 각종 방법이 이미 기재되어 있고 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 본 발명은 표적화된 세포를 2개 이상의 목적한 단백질 또는 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열을 함유하는 재조합체 벡터로 감염시키고, 표적화된 세포내에서 단백질 또는 폴리펩타이드를 발현시킴에 의한 치료학적 방법, 백신 및 암 치료요법을 제공한다.

예를 들면, 본 발명의 재조합체 벡터의 생체내 전달은 뇌, 간, 혈관, 근육, 심장, 폐 및 피부를 포함하나, 이에 한정되지 않는 광범위한 기관 유형에 표적화될 수 있다.

생체외 유전자 전달의 경우에, 표적 세포를 숙주로부터 제거하고 본 발명의 재조합체 벡터 및 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 실험실에서 유전적으로 변형시킨다.

본 발명의 재조합체 벡터는 위에서 기술한 양식을 포함하나 이에 한정되지 않는 통상적인 방식을 사용하여 투여할 수 있다. 본 발명의 재조합체 벡터는 액체 용액 및 현탁액, 미세소낭, 리포솜 및 주사가능하거나 주입가능한 용액을 포함하나, 이에 한정되지 않는 각종 제형일 수 있다. 바람직한 형태는 투여 방식 및 치료학적 적용에 의존한다.

양태들에서, 생체내에서 면역글로불린 또는 다른 생물학적으로 활성인 단백질 생산에 있어서 발현 벡터 작제물의 장점은 단일 벡터의 장기간 투여 및 환자에서 지속적인 항체 발현; 충분한 생물학적 활성을 가진 항체 또는 이의 단편(또는 다른 생물학적으로 활성인 단백질)의 생체내 발현; 및 사람 세포에서 생성된 항체의 천연의 후해독적 변형을 포함한다. 바람직하게는, 발현된 단백질은 천연적으로 존재하는 단백질과 동일하거나 또는 충분히 동일하여 면역학적 반응이 감소되거나 개시(trigger)되지 않으며 여기서 발현된 단백질은 상기 단백질을 필요로 하는 환자에서 다수 경우에 투여되거나 지속적으로 발현된다.

본 발명의 재조합체 벡터 작제물의 양태는 치료요법 또는 연구에서 사용하기 위한 재조합체 항체 및 다른 생물학적으로 활성인 단백질의 시험관내 생산에서 추가의 유용성을 발견한다. 재조합체 단백질 생산 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 본원에 기술된 자가 프로세싱 절단 부위 또는 다른 프로테아제 절단 부위-함유 벡터 작제물을 사용하여 재조합체 항체의 발현에 사용할 수 있다.

하나의 국면에서, 본 발명은 위에서 기술한 바와 같은 발현 벡터를 세포내로 도입시켜 형질감염된 세포를 수득함으로써 재조합체 면역글로불린 또는 이의 단편을 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 벡터는 5' 내지 3' 방향으로: 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 또는 이의 단편에 대한 암호화 서열에 작동적으로 연결된 프로모터, 상기 쇄들 각각 사이의 자가 프로세싱 서열을 포함한다. 면역글로불린 중쇄에 대한 암호화 서열 또는 면역글로불린 경쇄에 대한 암호화 서열은 제공된 벡터 작제물에서 자가 프로세싱 서열에 대해 5'(즉, 제1)일 수 있다.

항체를 위한 작제물의 양태에서, 항체 또는 면역글로불린 또는 이의 단편에 대한 제1 또는 제2 쇄를 암호화하는 서열은 IgG, IgM, IgD, IgE 또는 IgA로부터 기원한 중쇄 또는 이의 단편을 포함한다. 광범위하게 기술된 바와 같이, 항체 또는 면역글로불린 또는 이의 단편에 대한 쇄를 암호화하는 서열은 또한 IgG, IgM, IgD, IgE 또는 IgA로부터의 경쇄 또는 이의 단편을 포함한다. 본 발명의 양태들은 전체 항체 분자들 및 예를 들면 Fab, 일본쇄 Fv (scFv) 및 F(ab')₂와 같은 다른 항원 인식 분자 단편을 포함하는, 이의 변형되거나 기원된 형태에 대한 단백질에 상응하는 유전자에 관한 것이다. 항체 및 단편은 동물-기원하거나, 사람-마우스 키메라이거나, 사람화되거나, Deimmunisation™[제조원: 바이오베이션 리미티드(Biovation Ltd)]에 의해 변경되거나, Fc 수용체에 대한 친화성이 변화하도록 변경되거나, 완전한 사람일 수 있다. 리간드-결합 분자의 양태는 당해 분야에서 이해되는 바와 같이 친화성이 성숙될 수 있다. 바람직한 양태들에서, 항체 또는 다른 재조합체 단백질은 이것이 투여되는 사람 또는 동물에서 면역 반응을 끌어내지 않거나 최소한으로 유발한다.

항체는 이특이적일 수 있으며 디안티보디(diantibody), 콰드로마(quadroma), 미니-항체, ScBs 항체 및 놉-인투-홀(knobs-into-holes) 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

항체 자체의 생산 및 회수는 당해 분야에 잘 공지된 각종 방식으로 달성할 수 있다(참조: Harlow et al. 1988. Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory). 다른 목적 단백질을 수집하고/하거나 정제하고/하거나 당해 분야에 잘 공지된 방법에 따라 사용한다.

본 발명의 양태를 실시하는데 있어서, 재조합체 DNA 기술을 사용한 항체 또는 이의 변이체(유사체)의 생산은 숙주 세포의 성장 및 암호화 서열의 발현에 적절한 배양 조건하에서 변형된 재조합체 숙주 세포를 배양함으로써 달성될 수 있다. 발현의 성공을 모니터링하기 위하여, ELISA, RIA 등과 같은 표준 기술을 사용하여 항원와 관련하여 항체의 농도를 모니터링할 수 있다. 항체는 당해 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 배양 상층액으로부터 회수한다. 이들 항체의 정제된 형태는 물론 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L 컬럼을 통한, 또는 특수 항원과 관련하거나, 심지어 특이성이 요구되는 항원의 특수 에피토프도 관련한 친화성 크로마토그래피를 포함하나, 이에 한정되지 않는 표준 정제 기술에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 항체는 또한 이온 교환, 소수성 상호작용, 친화성 또는 크기 배제 컬럼과 같은 통상의 크로마토그래피를 사용하여 당해 분야에서 이해되는 바와 같이 정제할 수 있다[참조: 정제 기술을 기재하고 있는 "Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification"이라는 명칭의 1997년 6월 24일 린데르크네흐(Rinderknecht) 등에 의한 미국 특허 제5,641,870호 및 "Process for purifying proteins in a hydrophobic interaction chromatography flow-through fraction"이라는 명칭의 2008년 9월 23일자의 슈클라(Shukla) 등에 의한 미국 특허 제7,427,659호]. 정제 기술은 황산암모늄 침전 및 크기-제한된 막 여과와 같은 다른 기술과 함께 또는 다양한 조합으로 수행할 수 있다. 발현 시스템이 시그날 펩타이드를 포함하도록 설계되는 경우, 수득되는 항체는 배양 배지 또는 상층액내로 분비되나; 세포내 생산이 또한 가능하다. 세포내 내용물은 회수하여 정제에 적용시킬 수 있다.

폴리프로테인의 프로세싱의 목적하는 수준, 예를 들면, 가장 완전한 프로세싱을 촉진하는 세포 배양 조건이 선택될 수 있다. 이러한 프로세싱은 세포내적으로 발생하지만, 또한 세포외적으로, 세포 배양 공정 동안 또는 후에 발생할 수 있다.

사람 Ig 유전자좌로 가공된 마우스로부터의 항원-특이적인, 완전한 사람 단클론 항체의 생산 및 선택은 이미 기술되어 왔다(참조: Jakobovits et al. 1998. Advanced Drug Delivery Reviews 31 :33-42; Mendez et al. 1997. Nature Genetics 15: 146-156; Jakobovits et al. 1995. Curr Opin Biotechnol 6: 561 -566; Green et al. 1994. Nature Genetics Vol. 7:13-21).

치료용 단클론 항체의 고농도 발현은 유전자이식 염소의 젖에서 달성되어 왔으며, 항원 결합 수준이 통상의 세포 배양 기술을 사용하여 생산된 단클론 항체의 것과 동등함이 밝혀져 있다. 당해 방법은 유전 정보를 수반하여 자체의 젖에서 사람 치료용 단백질을 발현하도록 하는 유전자이식된 동물의 젖에서 사람 치료용 단백질의 개발에 기초한다. 일단 이들이 생산되면, 이들 재조합체 단백질은 표준 기술을 사용하여 젖으로부터 효과적으로 정제할 수 있다[참조: 예를 들면, Pollock et al. 1999. J. Immunol. Meth. 231 :147-157 및 Young et al. 1998. Res Immunol. 149(6): 609-610]. 유전자이식 동물로부터의 동물 젖, 달걀 흰자, 혈액, 뇨, 정액 혈장 및 누에 꼬치는 산업 규모에서 재조합체 단백질의 생산을 위한 공급원으로서 잠재성이 입증되어 왔다[참조: Houdebine L M. 2002. Curr Opin Biotechnol 13:625-629; Little et al. 2000. Immunol Today, 21(8):364-70; 및 Gura T. 2002. Nature, 417:584-5860]. 본 발명은 본 발명의 자가-프로세싱 절단 부위-암호화 및/또는 프로테아제 인식 부위 벡터를 사용하여 재조합체 항체 또는 변이체(유사체) 또는 이의 목적한 다른 단백질(들)의 발현을 위한 유전자이식 동물 발현 시스템의 사용을 고려한다.

아그로박테리움 감염, 바이오리스틱(biolistic) 형질전환, 원형질체 형질전환 등에 의해 형질전환된 감자, 토마토, 담배, 벼 및 다른 식물을 포함하나, 이에 한정되지 않는 식물에서 재조합체 단백질의 생산이 성공적으로 입증되어 왔다. 유전자이식 담배 식물의 종자에서 재조합체 사람 GM-CSF 발현, 및 식물에서 일본쇄 항체를 포함하는 항체의 발현이 입증되어 왔다[참조: 예를 들면, Streaffield and Howard. 2003. Int. J. Parasitol. 33:479-93; Schillberg et al. 2003. Cell Mol Life Sci. 60:433A5; Pogue et al. 2002. Annu. Rev. Phytopathol. 40:45-74; 및 McCormick et al. 2003. J Immunological Methods, 278:95-104]. 본 발명은 본 발명의 프로테아제 절단 부위 또는 자가-프로세싱 절단 부위-암호화 벡터를 사용하여 재조합체 면역글로불린 또는 이의 단편 또는 목적한 다른 단백질(들)의 발현을 위한 유전자이식 식물 발현 시스템의 사용을 고려한다.

곤충 세포와 관련하여 바큘로바이러스 벡터 발현 시스템이 또한 재조합체 단백질 생산을 위해 실행가능한 플랫폼(platform)으로서 시도되고 있다. 바큘로바이러스 벡터 발현 시스템은 배양 용이성 및 보다 높은 발현 수준과 같은 포유동물 세포 배양과 관련한 장점을 제공하는 것으로 보고되어 왔다(참조: 예를 들면, Ghosh et al. 2002. Mol Ther. 6:5-11, 및 Ikonomou et al. 2003. Appl Microbiol Biotechnol. 62:1-20). 본 발명은 또한 본 발명의 자가-프로세싱 절단 부위-암호화 벡터를 사용한 재조합체 면역글로불린 또는 이의 단편의 발현을 위한 바큘로바이러스 벡터 발현 시스템의 용도를 고려한다. 바큘로바이러스 벡터 및 적합한 숙주 세포는 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 시판되고 있다.

효모-계 시스템 또한 본 발명의 자가-프로세싱 절단 부위-암호화 벡터를 사용하여 2개- 또는 3개-하이브리드 시스템을 포함하는, 재조합체 면역글로불린 또는 이의 단편 또는 목적한 다른 단백질(들)의 발현을 위해 사용될 수 있다(참조: 예를 들면, 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,643,745호).

자가-프로세싱 펩타이드에 대한 암호화 서열을 단독으로 또는 단백질분해 절단 부위에 대한 추가의 암호화 서열과 함께 포함하는 본 발명의 발현 카세트 및 벡터 및 재조합체 숙주 세포는, 이의 다수가 당해 분야에 공지되어 있고 이의 예들이 본원에 기술되어 있는, 어떠한 단백질 발현 시스템에서 2개- 및 3개-하이브리드 시스템의 단백질 성분, 생물학적으로 활성인 단백질, 프로단백질 및 재조합체 면역글로불린 또는 이의 단편의 발현에 있어서의 유용성이 발견된다. 당해 분야의 숙련가는 어떠한 단백질 발현 시스템에서도 사용하기 위한 본 발명의 벡터, 숙주 세포 및 방법의 양태들을 용이하게 조정할 수 있다.

실시예 1. Lon 프로테아제 인테인 및 발현 작제물

3개의 ATP-의존성 Lon 프로테아제 인테인은 뉴 잉글란드 바이오랩스(New England Biolabs)(NEB, 미국 매사추세츠주 입스위치 소재) 인테인 데이타베이스(InBase, The Intein Database and Registry; at http://www.neb.com/neb/Inteins.html)에 보고되어 있다[참조: Perler, F. B. (2002). InBase, the Intein Database. Nucleic Acids Res. 30, 383-384]. 이들 인테인은 유기체 파리로코쿠스 아비씨(Pab Lon Intein), 파이로코쿠스 푸리오수스(Pfu Lon Intein) 및 파이로코쿠스 호리코시이 OT3(Pho Lon Intein)으로부터 기원했다. 이들 Lon 인테인은 제안된 엔도뉴클레아제 도메인, 인테인의 끝에서 두번째 잔기로서 히스티딘 대신 리신, 및 상이한 길이(각각 333, 401, 및 474개 아미노산)을 갖는다. NEB 데이타베이스에서, 모든 3개의 lon 인테인은 이론적 인테인으로 나타나 있으며, 이는, 데이타 베이스에 따라서 목록 기여자가 스플라이싱된 생성물의 존재가 제공된 인테인 도입에 대해 입증되지 않았음을 나타낸다. Pab Lon 인테인의 엔도뉴클레아제 도메인은 실험적으로 활성을 갖지 않는 것으로 밝혀졌다[참조: Saves I, Morlot C, Thion L, Rolland JL, Dietrich J, Masson JM. Investigating the endonuclease activity of four Pyrococcus abyssi Inteins. Nucleic Acids Res. 2002 Oct 1 ;30(19):4158-65].

본 발명자들은, 유전자들의 ATP-의존성 프로테아제 lon 계열에 함유된 인테인이 각종의 단일의 전사 해독 프레임 작제물 설계에 있어서 항체 중쇄 및 경쇄의 절단을 매개하는데 있어 매우 효과적임을 발견하였다. 이들 인테인과 관련된 서열 정보는 본원에서 제공된다.

Lon 인테인 서열 및 벡터 작제물 설계

표 1은 -1 및 +1 엑스테인 잔기를 포함하는, NCBI/단백질, PAB1313 Pab Lon 인테인에서 Pab Lon 인테인, 수탁 번호 제CAB50486.1호에 대한 단백질 서열 정보를 제공한다(서열 번호 1).

표 2는 코돈 용도를 위해 최적화된 Pab Lon 인테인에 대한 뉴클레오타이드 서열을 기술한다.

표 3은 서열 번호 2에 의해 암호화된 단백질 서열, 서열 번호 3을 기술한다.

표 4는 -1 및 +1 엑스테인 잔기를 포함하는, NCBI/단백질, PF0467내 Pfu Lon 인테인, 수탁 번호 제AAL80591.1호에 대한 단백질 서열 정보를 제공한다(서열 번호 4).

표 5는 천연의 Pfu Lon 인테인에 대한 뉴클레오타이드 서열 정보를 제공한다(서열 번호 5).

표 6은 서열 번호 5에 의해 암호화된 단백질 서열, 서열 번호 6을 기술한다.

Pfu Lon 인테인을 PCR 기술을 사용하여 클로닝하였다. Pab Lon 인테인 뉴클레오타이드 서열을 포유동물 코돈 용도에 따라 설계하여 합성하였다. 파이로코쿠스 아비시이 lon 프로테아제 인테인의 단백질 서열은 매사추세츠주 입스위치 소재의 뉴 잉글란드 바이오랩스(http://www.neb.com/neb/Inteins.html)에 의해 후원된 공공에게 맡겨진 인테인의 데이타베이스인, Inbase로부터 수득되었다. 수득된 단백질 서열은 EMBL 수탁 번호 CAB50486.1, gi5459000로서 나열되어 있으나; 웹 사이트에 나열된 단백질 서열을 사용하였다. Pab-lon 인테인 단백질 서열은 표 7에 나타낸다.

당해 Pab-lon 단백질 서열을 GeneArt[제조원: 겐아트 아게(GeneArt AG), 독일 레겐스부르크 소재]에 의해 포유동물 발현을 위해 최적화된 DNA 서열로 등록된 방법을 사용하여 역-해독하였다. 수득되는 Pab-lon 인테인 DNA 서열은 표 8에 나타낸다. DNA 작제물은 특수한 클로닝 및 발현 벡터의 선택 및 통상의 기술을 사용한 상응하는 분자 생물학 시도에 의존하여 추가의 플랭킹 조정인자를 임의로 제공할 수 있다. DNA 서열을 999bp 단편으로서 합성하고(참조: GeneArt Synthesis Number 0611467) GeneArt 벡터 플라스미드, pGA4내로 전달하였다(참조: Part:BBa_J70003을 포함하는, the Registry of Biological Standard Parts at http://partsregistry.org). 제공받은 DNA 물질을 재서열분석하고 설계된 서열에 상응하는지를 측정하였다. 당해 DNA 물질을 후속적인 Pab-lon 인테인 함유 플라스미드 작제물에 대한 공급원/주형으로서 직접 사용하였으며; 플라스미드는 재증식되지 않았다.

다음 포유동물 발현 벡터를 작제하였다: pTT3-pfu lon HL(+), pTT3-pfu lon HL(-), pTT3-pfu lon LH(+), pTT3-pfu lon LH(-), pTT3-pfu lon LKH(+), pTT3-pfu lon LKH(-), pTT3-pab lon HL(+), pTT3 pab lon HL (-), pTT3- pab lon LH (+), pTT3- pab lon LH(-), pTT3- pab lon LKH(+), pTT3- pab lon LKH(-). 여기서, H 및 L 성분들은 D2E7로 설계된 항체에 대한 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 나타낸다. pTT3 pab lon HL(-) 작제물을 개략적으로 나타내기 위해, 도 1을 참조한다. 도 2는 D2E7 항체를 발현할 수 있는 이들 일시적인 발현 벡터의 sORF 성분들에 대한 구조들의 국면을 도시한다.

비록 pTT3 벡터가 특수 양태를 나타낸다고 해도, 추가의 양태들은 본원에 기재된 하나 이상의 단백질을 암호화하는 분리된 핵산에 관한 국면을 포함할 수 있다. 추가의 양태는 분리된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공하며, 여기서 상기 벡터는 pcDNA; pTT(참조: Durocher et al., Nucleic Acids Research 2002, Vol 30, No.2:E9); pTT3; pEFBOS (Mizushima, S. and Nagata, S., 1990, Nucleic Acids Research Vol 18, No. 17:5322); pBV; pJV; 및 pBJ로 이루어진 그룹에서 선택된다. 상기 주목한 바와 같이, 각종의 작제물이 pTT3 벡터 골격에서 이루어졌다. 당해 벡터는 EBV 복제 오리진을 가지며, 이는 현탁 배양물 속에서 형질감염된 293E 세포(이는 엡슈타인-바르 바이러스 핵 항원 1을 발현한다)에서 이의 에피솜 증폭을 허용한다(참조: 벡터 pTT를 기술하는 Durocher et al.). pTT와 관련하여, pTT3은 2005년 7월 7일자의 가유르(Ghayur), 타리크(Tariq) 등에 의한 미국 특허원 공보 제20050147610호에 나타낸 바와 같은 추가의 다수 클로닝 부위를 갖는다.

각각의 pTT3-계 벡터는 CMV 프로모터에 의해 조절된 1개의 ORF를 가졌다. ORF에서, 인테인 서열은 HC-인테인-LC 또는 LC-인테인-HC의 순서로 항체 중쇄와 경쇄(각각 HC 및 LC, 또는 단순히 H 및 L) 사이의 프레임내에 삽입되었다. "HL" 명칭을 갖는 작제물은 항체 HC 암호화 서열에 이어 인테인 및 이후 LC 암호화 서열을 가지며; "LH" 명칭을 가진 작제물은 LC 암호화 서열에 이어 인테인 및 이후 HC 암호화 서열을 갖는다. "LKH" 명칭을 가진 작제물은 LC와 인테인 사이에 삽입된 리신(K)을 갖는다. "(-)" 명칭을 갖는 작제물은 ORF의 개시부에서 1개의 시그날 펩타이드 및 인테인의 마지막 아미노산과 인테인을 따라가는 성숙한 항체 중쇄 또는 경쇄의 첫번째 아미노산 사이에 삽입된 메티오닌을 갖는다. "(+)" 명칭을 갖는 작제물은 ORF의 개시부에서 1개의 시그날 펩타이드 및 인테인의 하부의 항체 소단위의 개시부에서 제2의 시그날 펩타이드를 갖는다.

작제물은 일시적인 형질감염을 통해 293E 세포내로 도입되었다. 요약하면, 복합체를 ORF 작제물 및 폴리에틸렌이민(PEI)을 암호화하는 pTT3 벡터를 사용하여 제조하였다. PEI-DNA 복합체를 사용하여 HEK293E 세포를 형질감염시켰다(참조: Durocher et al., 2002, Nucl. Acids Res. 30:E9). 세포 및 배양 상층액을 분석을 위한 형질감염 후 4 내지 7일째에 수집하였다.

작제물에 의한 단백질 발현. 다수의 일시적인 발현 실험에서, 배양 상층액 시료를 형질감염 후 7일 또는 8일째에 수집하였다. 시료를 ELISA로 평가했고 하기 나타낸 바와 같이 IgG의 측정으로부터 분비된 항체의 농도 또는 범위를 함유하였다.

상기 기술한 작제물 시리즈와 동일한 항체를 발현하고, 동일한 조절 성분들을 사용하는 통상의 2개-벡터 시스템을 대조군으로서 당해 실험에 포함시켰다(참조: 표, 하부 열). 따라서, 대조군 벡터는 2개의 별개의 pTT3 벡터내에 운반된 2개의 별개의 ORF로부터의 항체 중쇄 및 경쇄를 도입하는 통상의 시도를 사용하여 D2E7 항체를 발현하였다. 당해 대조군 벡터 시스템으로부터 생산된 항체 분비 농도는 표에 나타낸 바와 같이 10 내지 60 μg/ml의 범위이었다.

Lon 인테인을 사용하는 수개의 sORF 작제물 설계에 의해 생산된 IgG 분비 농도는 통상의 대조군 벡터를 사용하여 생산된 것과 비교하여 동일한 범위, 또는 그 이상의 범위이다. 당해 농도는 포유동물 세포내에서 1.6㎍/ml인 것으로 보고된 "2A" 기술을 사용하여 생산된 것들보다 유의적으로 더 높다(참조: Fang et al., 2005, Nature Biotechnology 23:584-590). 비록 Pab Lon 및 Pfu Lon 인테인 둘다가 작제물 설계에 사용되어 바람직한 농도의 항체 생산을 수득한다고 해도, 기술된 pTT3 작제물내 Pab Lon 인테인은 보다 높은 농도의 항체 분비를 허용하였다. 이들 데이타는 또한, 항체 분비 농도가 일반적으로, LH 작제물 설계가 사용된 경우보다 HL 작제물 설계가 사용된 경우 더 높음을 제안한다. 면역글로불린 쇄의 순서의 특징 및 시그날 서열의 국면을 결합함으로써, HL(-) 작제물은 연구된 것들 중에서 분비된 항체 생성물의 최대 농도를 생성할 수 있었다.

발현 생성물의 추가의 특성화

표 9에 나열된 특정의 sORF 작제물을 발현 생성물의 분석을 포함하는 발현 국면에 관하여 추가로 특성화하였다. 이들 작제물은 비교적 높은 수준의 분비된 항체를 생산한 4개의 예들을 포함하였다: pTT3 pfu lon HL (-), pTT3 pfu lon HL (+), pTT3 pfu lon LKH (-), 및 pTT3 pab lon HL (-). 이들 작제물로부터 생산된 분비된 항체는 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하고 환원 및 비-환원 SDS-PAGE 겔 둘다에서 분석하고, 이들의 HL 및 LC에 대한 N-말단 아미노산 서열들을 측정하였다.

pTT3 pfu lon HL (-)를 사용하여 생산된 시료는, 상기 기술한 대조군 D2E7 벡터와 같은 통상의 벡터를 사용한 전통적인 방법에 의해 생산된 항체로부터 구별가능한 이동과 함께, 항체 HC, 항체 LC, 및 완전히 조립된 항체(비-환원 겔 상에서)에 상응하는 겔 이동 밴드를 함유하였다. 환원 겔 상에서, 항체 HC 및 LC에 상응하는 밴드 외에, 프로세싱되지 않은 3부 단백질(HC-인테인-LC) 및 부분적으로 프로세싱된 HC-인테인 융합체에 상응하는 것으로 나타난 2개의 고 분자량(MW) 밴드가 또한 존재한다. 당해 평가는 웨스턴 블롯 분석(western blot analysis) 및 질량 분광법 분석을 기초로 했다. 이들 2개 밴드의 풍부성은 배양 조건을 변형시킴으로써 감소시킬 수 있고 배양 조건에 의존적인 것으로 여겨졌다. 이들 고 MW 생성물은 본원에 제공되고/되거나 당해 분야에서 이해되는 바와 같은 다른 설명에 따른 방법을 사용하여 완전히 프로세싱된 항체 약물 물질로부터 편리하게 제거될 수 있다.

pTT3 pfu lon HL (+)를 사용하여 생산된 시료는 전통적인 방법에 의해 생산된 항체로부터 구별할 수 없는 이동과 함께, 항체 HC, 항체 LC, 및 완전한 항체(비-환원 겔 상에서)에 상응하는 밴드를 함유하였다. 또한, 3부 폴리프로테인에 상응하는 하나의 더 큰 MW 밴드가 존재하였다. pTT3 pfu lon LKH(-)을 사용하여 생산된 시료는 또한 통상의 벡터를 사용하여 생산된 항체로부터 구별할 수 없는 이동과 함께 HC, LC, 및 완전한 항체(비-환원 겔 상에서)에 상응하는 밴드를 함유하였다. 환원 겔 상에서, HC 및 LC에 상응하는 밴드 외에, 2개의 더 높은 MW 밴드가 또한 존재하였다. 이들 중 처음 1개는 다른 벡터 설계에 대해 위에서 기술한 바와 같이, 3부 다중 단백질에 상응하였고; 제2 밴드는 LC-인테인 융합 생성물에 상응하였으며 당해 연결부에서 불완전한 절단으로 생성되었다. 생성물의 상대적인 풍부성 측면에서, 절단된 LC와 같이 많은 LC-인테인 융합체가 존재하는 것으로 여겨졌다.

pTT3 pab lon HL (-)를 사용하여 생산된 시료는 전통적인 방법에 의해 생산된 항체로부터 구별할 수 없는 이동과 함께 HC, LC, 및 완전한 항체(비-환원 겔 상에서)에 상응하는 밴드를 함유하였다. 환원 겔상에서, HC 및 LC에 상응하는 밴드외에, 웨스턴 블롯 분석을 기초로 프로세싱되지 않은 3부 단백질에 상응하는 것으로 여겨지는 1개의 주요 더 높은 MW 밴드가 존재하였다. pTT3 pfu lon HL(-)을 사용하여 생산된 시료와 비교하여, 비교적 보다 적은 양의 당해 3부 더 높은 MW 밴드가 존재하였다. 당해 결과는, 심지어 Pfu lon 인테인 및 Pab lon 인테인이 동종이고 본 연구자의 벡터 설계에서 기능적으로 유사하다고 해도, Pab lon 매개된 N-말단 절단은 Pab lon 작제물로부터의 발현 이후 관측된 HC-인테인 융합체가 거의 존재하지 않으므로, Pfu lon에 의해 매개된 것 보다 더 완전함을 제안한다. 그러나, 작제물 둘다는 완전히 조립된 항체 생성물을 수득할 수 있음에 주목한다.

한편, 프로세싱되지 않은 단백질 및 부분적으로 프로세싱된 단백질과 같은 특정 단백질 생산량은 완전히 프로세싱된 및 완전히 자가-조립된 항체 생성물과 같은 다른 작제물 생산량과 비교하여 오염된 생성물인 것으로 고려될 수 있다. 다른 한편, 이러한 특정의 단백질 생산량은, 예를 들면, 아직 완전한 항체 생성물을 생성할 수 없는 추가의 프로세싱 반응 및/또는 지향된 조립용 물질에 유용할 수 있다. 이들 단백질 생성량이 오염된 부산물로서 관찰되는 경우, 주목한 바와 같이 제거가 용이하게 하여 완전한 항체와 같은 목적하는 성분을 농축시키거나 정제하기 위한 선택 및 시도들이 존재한다.

각종 작제물 발현 시스템으로부터 배양물 상층액의 세포외 시료 외에, 세포내 시료를 또한 수득하고 HC 및 LC 둘다에 대해 특이성을 갖는 검출 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석으로 분석하였다. 유사한 단백질 종을 배양된 상층액 시료 속에서 이들 종에 대해 기술된 바와 같이 관측하였다.

각종의 작제물의 중쇄 및 경쇄 둘다의 N-말단 아미노산 서열을 측정하였다(참조: 하기 표). 당해 결과는, 인테인-매개된 단백질 절단이 2개의 스플라이싱 연결부, 즉, HC와 인테인 성분들의 연결부 및 LC와 인테인 성분들의 연결부에서 정밀하게 일어남을 나타내었다.

Lon 인테인 작제물로부터 IgG1 항체의 기능적 특성

표 9의 sORF 작제물 설계로부터 분비된 D2E7 항체 생성물을 또한 항원-특이적인 ELISA로 분석하였다. 분석 결과는, 작제물 항체 생성물이 D2E7 항체의 리간드인, 사람 TNF알파에 결합함을 입증하였다. 따라서, 인테인-계 작제물 및 발현 시스템은 기능적이고 항원-특이적인 완전한 자가-조립된 다합체성 항체를 수득하는 sORF 생성물을 발현하고 생성할 수 있다.

pTT3 pfu lon HL(-) 작제물을 사용하여 생산된 항체를 단백질 A 친화성 정제에 이은 SEC, 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 항체를 BiaCore™ 시스템을 사용하는 표면 플라스몬 공명 기술로 분석하였다. sORF 작제물 생성량의 특징은 관련 리간드, TNFα에 대한 이의 결합 국면을 포함하였다. 표 11에서, 값들의 결과는 결합 속도 상수(ka, 1/Ms의 단위); 해리 속도 상수(kd, 1/s의 단위), 및 평형 해리 상수(KD, M의 단위)의 역학적 매개변수에 관한 BiaCore 분석으로부터 나타낸다. 해리 상수 값(KD)은 편리한 벡터(2개의 명백한 면역글로불린 쇄 sORF를 지닌)를 사용하여 생산된 아달리무마브(adalimumab)(D2E7) 항체의 것과 유사한 것으로 이해된다.

실시예 2. 경쇄 서열의 변형된 항체를 생산하는 sORF 작제물

수개의 sORF 작제물을 D2E7의 면역글로불린 경쇄로부터의 변이인 경쇄 서열로 생성시켰다. 이들 sORF 작제물을 D2E7에서와 같이 또한 중쇄로 가공함으로써 IgG1 항체 물질을 생성할 수 있었다. 골격으로서 작제물 pTT3 pfu lon HL (-) 및 pTT3 pab lon HL (-)을 사용하여, 본 발명자들은 C-말단 스플라이싱 연결부, 즉, 인테인과 하부 면역글로불린 경쇄 성분 사이의 연결부에서 서열 변이를 갖는 작제물을 생성시키고 시험하였다(참조: 표 12). 특정 작제물의 분비된 면역글로불린을 단백질 A 친화성 정제로 정제하고 환원 및 비-환원 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다. 세포내 시료를 또한 HC 및 LC 둘다에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석으로 분석하였다(참조: 예를 들면, 도 3 및 도 4).

도 3은 sORF 발현 생성물의 단백질 분석을 위한 SDS-PAGE 겔의 결과를 도시한다. 분비된 IgG 분자를 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하고 SDS-PAGE 겔 상에서 비-환원(A) 및 환원 조건(B) 하에 분리하였다. 좌측으로부터 우측까지의 레인 및 시료는 다음과 같다: (레인 1) MW 마커; (2) 대조군 작제물 생성물, 비-sORF 발현 시스템으로부터의 D2E7 항체; (3) Pab-lon mut A1; (4) Pab-lon mut A2; (5) pTT3 pfu lon YP, 및 (6) pTT3 pfu lon MA.

도 4는 추가의 sORF 발현 생성물의 단백질 분석을 위한 SDS-PAGE 겔의 결과를 도시한다. 분비된 IgG를 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하고 SDS-PAGE 겔 상에서 비-환원(A) 및 환원(B) 조건하에 분리하였다. 좌측으로부터 우측까지의 레인 및 시료는 다음과 같다: (레인 1) MW 마커; (2) 대조군 D2E7 생성물; (3) pTT3 pfu lon HL (-); 및 (4) pTT3 pfu lon MutA.

표 12의 작제물에 의해 생산된 면역글로불린 분비 농도는 표 13에 나타낸다. 성숙한 경쇄의 N-말단에서 아미노산을 측정하고 특성화된 부분 서열의 결과를 나타낸다.

결과

이들 작제물의 경우, +1 위치에서 상이한 AA 잔기의 용도(인테인 직후)는 분비된 항체의 수율에 있어서 인자로 여겨졌다. 당해 위치에서 아미노산 잔기 H, Y, R, V, Q, A, N, 및 M의 용도는 비교적 보다 높은 수준의 항체 발현을 수득하였다. 이들의 N-말단 아미노산에 대한 경쇄의 분석(표 13)은 인테인의 C-말단에서 완전하고 정밀한 절단을 제안하였다. 작제물 pTT3 pfu lon HL(-) 및 pTT3 pab lon HL(-)에 의해 생산된 항체와 유사하게, 프로세싱된 HC 및 LC 또한 분비된 단백질 종의 대부분을 나타낸 완전한 항체를 조립하였다. 그러나, 아미노산 아스파르테이트(Asp; D)가 작제물 pTT3 pfu lon MutB에서와 같이 인테인 다음에 직접 사용된 경우, 항체 분비는 거의 없었다. 당해 작제물에 의해 생산된 세포내 단백질을 분석하였다. D가 인테인 다음의 제1 아미노산인 경우, C-말단 스플라이싱 연결부에서 절단은 거의 일어나지 않고, 소량의 항체 LC 및 비교적 다량의 인테인-LC 융합 단백질이 수득되었다.

카파 동형 가변 영역(V_kappa)의 성숙한 배선(germ line) 경쇄의 아미노산 서열은 일반적으로 D, E, N, A, 또는 V로 개시하고; 람다 동형(V_lambda)의 것은 일반적으로 Q, S, L, 또는 N으로 개시한다. 본 발명자들의 결과로부터, 항체 생산을 위해 Pab lon 또는 Pfu lon 인테인을 사용하는 sORF 벡터의 양태는 어떠한 아미노산으로도 개시하는 LC를 갖는 것들을 포함한다. 바람직한 양태에서, 전체적인 완전한 프로세싱의 보다 높은 효율을 달성하기 위한 목적을 위해, 비록 이러한 아미노산이 작동적 선택으로 제공될 수 있다고 해도 LC는 D 또는 E 이외의 아미노산으로 개시한다.

본 발명자들은, 인테인과 인테인으로부터의 하부의 성숙한 항체 LC 사이의 영역이 N-말단 스플라이싱 연결부에서 절단 효율에 기여하는 것으로 나타남을 발견하였다. 예를 들면, 본 발명자들은 작제물 pTT3 pfu lon HL (-) 및 pTT3 pfu lon MutA의 결과와 비교하였다. pTT3 pfu lon HL (-)이 사용된 경우 N-말단 스플라이싱 연결부에서 절단이 완전하지는 않지만, 일부 부분적으로 프로세싱된 HC-인테인 융합 단백질이 수득되며, 당해 단백질 종의 양은 작제물 pTT3 pfu lon MutA가 대신 사용된 경우에 유의적으로 감소한다(참조: 도 2). 따라서, 각종 작제물이 바람직한 생성물을 생성하는데 유용할 수 있지만, 특정 작제물이 특히 바람직한 생성물, 예를 들면, 완전히 프로세싱되고 자가-조립된 다합체성 분비된 항체의 비교적 보다 높은 수율을 생성하는 능력과 같이 기여할 수 있다.

실시예 3. sORF 작제물의 인테인 성분에 대한 추가의 선택

메타노코쿠스 잔나스키이 및 파이로코쿠스 아비씨로부터의 klbA 유전자의 인테인

본 발명자들은 메타노코쿠스 및 파이로코쿠스 종으로부터와 같은 klbA 유전자의 인테인을 포함하는 sORF 작제물에 대한 인테인 선택을 추가로 실험하였다. 본 발명자들은, klbA 유전자내에 함유된 인테인이 또한 각종의 단일 전사 해독 프레임 작제물 설계시 항체 중쇄 및 경쇄의 절단의 문맥에서를 포함하는 단백질 발현 및 프로세싱을 매개하기에 효율적인 선택임을 발견하였다.

특히, 본 발명자들은 메타노코쿠스 잔나스키이(Mja klbA 인테인), 파이로코쿠스 아비씨(Pab klbA 인테인), 및 파이로코쿠스 푸리오수스(Pfu klbA 인테인)으로부터의 klbA 인테인을 시험하였다. 처음 2개의 유기체로부터의 인테인은 엔도뉴클레아데 도메인을 결여한 미니-인테인인 반면, Pfu klbA는 완전한 크기의 인테인이다. 천연의 인테인 단백질 분절의 서열 길이는 각각 168, 333, 및 522개 아미노산이다. 이들 인테인과 관련하여 서열 정보는 하기 표에 제공된다. 따라서, 인테인, 변형된 인테인, 및 작제물이 발현 시스템용으로 개발된다.

KlbA 인테인 서열 및 벡터 작제물 설계

Mja klbA의 뉴클레오타이드 서열을 변형시켜 포유동물 코돈 용도의 상대적인 최적화를 허용하였다. 표 14는 이렇게 변형된 메타노코쿠스 잔나스키이의 Mja klbA 인테인 유전자에 대한 핵산 서열 정보를 제공한다(서열 번호 34). 표 15는 Mja KlbA 인테인 분절에 대한 단백질 서열 정보를 제공한다(또한 참조: NCBI/단백질, MJ0781내 수탁 번호 제Q58191호). 표 16은 천연 서열과 관련된 코돈 용도 국면에서 변형된 Pab klbA 인테인 유전자에 대한 핵산 서열 정보를 제공한다. 천연 서열의 경우, Pab KlbA 인테인에 대한 NEB Inbase 정보의 수탁 번호[NCBI/단백질, PAB1457내 B75050]를 또한 참조한다. 당해 공급원에 따라서, 나타낸 단백질 아미노산 서열은 각각 G 및 C인 것으로 나타나는 -1 및 +1 엑스테인 잔기를 포함하는 것으로 나타나 있다. 표 17은 Pab KlbA 인테인 단백질 분절에 대한 아미노산 서열 정보를 제공한다. 표 18은 Pfu klbA 인테인 유전자(천연)에 대한 핵산 서열 정보를 제공한다. 표 19는 Pfu KlbA 인테인 단백질 분절에 대한 아미노산 서열 정보를 제공한다(NCBI에서 수탁 번호 제AE010211호를 또한 참조).

본 발명자들은 포유동물 코돈 용도를 사용하는 서열을 사용하여 Mja klbA 인테인 및 Pab klbA 인테인의 뉴클레오타이드 서열을 합성하였다. 다음의 포유동물 발현 벡터를 작제한다: pTT3- Pab klbA HL(-); pTT3- Pab klbA HL(+); pTT3- Pab klbA LH(-); pTT3- Mja klbA HL(-); pTT3- Mja klbA HL(+); pTT3- Mja klbA LH(-). 이들 작제물은 본원에 또한 기술된 바와 같이, PTT3 벡터 골격에서 제조하였다. Pfu klbA 인테인 뉴클레오타이드 서열은 천연 서열이며, pTT3-Pfu-klbA-HL(+)를 또한 작제하였다.

Lon 프로테아제 인테인을 사용하는 작제물에 대해 나타낸 바와 같이, "HL" 명칭을 갖는 모든 작제물은 항체 면역글로불린 중쇄(HC) 암호화 서열에 이어 인테인 분절 및 이후 경쇄 (LC) 암호화 서열을 갖는다. 유사하게, "LH" 명칭을 갖는 모든 작제물은 항체 LC 암호화 서열에 이어 인테인 분절 및 이후 HC 암호화 서열을 갖는다. "(-)" 명칭을 사용한 작제물은 ORF의 개시부에 1개의 시그날 펩타이드 및 인테인 분절의 마지막 아미노산과 하부 엑스테인 분절, 예를 들면, 인테인 다음의 성숙한 항체 중쇄 또는 경쇄의 처음 아미노산 사이에 삽입된 메티오닌을 갖는다. "(+)" 명칭을 갖는 작제물은 ORF의 개시부에 1개의 시그날 펩타이드 및 인테인의 하부에 있는 항체 소단위의 개시부에서 제2의 시그날 펩타이드를 갖는다.

각종 KlbA 인테인 분절 및 구조를 갖는 작제물을 일시적인 형질감염 기술을 통해 293E 세포내로 도입하였다. 형질감염 후 7 내지 8일 째에, 배양 상층액을 분비된 항체에 대해 ELISA를 사용하여 IgG 농도를 측정함으로써 분석하였다. 각각의 작제물 발현 시스템에 대해 시료의 ml당 미생물 단위의 값을 갖는 이들 결과에 대해서는 표 20을 참조한다.

본 발명자들은 작제물, pTT3- Pab klbA HL(-) 및 pTT3- Mja klbA HL(-)에 의해 발현된 분비된 항체 생성물을 정제하고 분석하였다. 항체 생성물을 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하고 SDS-PAGE의 전기영동 기술에 의해 환원 및 비-환원 둘 다의 조건 하에서 특성화하였다(참조: 도 5). 비-환원 조건하에서, 이들 2개의 벡터로부터의 배양 상층액 시료는 단일 밴드로서 그러나, 대조군 항체와 비교하여 명백하게 보다 높은 분자량을 갖는 단일 밴드로서 주로 이동하였다. 환원 조건하에서, 본 발명자들은 이들 2개의 벡터로부터의 배양 상층액 시료가 항체 LC 및 HC-인테인 융합 성분에 대해 크기에 있어 상응하는 검출가능한 밴드를 함유하였음을 발견하였다. IgG1 Fc 또는 카파 경쇄에 대한 어느 항체를 사용한 상응하는 면역블롯은 이들 밴드의 특성화와 일치한다. 이들 결과는, C-말단 스플라이싱 연결부에서 비교적 효율적인 절단이 존재하지만 N-말단 스플라이싱 연결부에서 전체적으로 절단은 효율적이지 않거나 심지어 거의 없음을 말한다. 그러나, 심지어 완전한 절단 효율보다 적게 달성되는 작제물 및 발현 시스템에 대해서조차, 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 소단위는 완전한 IgG 항체 분자로서 조립되어 분비될 수 있었다.

N-말단 인테인 스플라이싱 연결부에서 Klb 인테인의 변형

N-말단 스플라이싱 연결부에서 절단을 위한 상기에서 기술한 결과의 관점에서, 본 발명자들은 추가의 노력을 기울여 향상된 절단 효능을 제공하였다. 본 발명자들은, 이들 2개의 인테인, Pab klbA 및 Mja klbA 각각의 제1 아미노산이 시스테인(Cys; C) 대신 알라닌(Ala; A)임을 주목하였다. 본 발명자들은, 시스테인이 다른 인테인 시스템에서 친핵체로서 기능할 수 있는 잔기임을 이해한다. 본 발명자들은, 당해 위치에서 친핵성 아미노산, 시스테인의 재도입의 효과를, 면역글로불린 HC 분절의 끝에서, 인테인의 klbA 엑스테인 상부에 대해 천연적인, 하나의 아미노산, 글리신을 도입함과 함께, 시험하였다. 이들 추가의 작제물에 대한 단백질 분절에 대해 서열 정보를 제공하는 표 21을 참조한다. 당해 표는 천연의 Pab klba 인테인, Pab klba HL(-) 작제물(이는 당해 문맥에서 WT로 언급됨), 및 N-말단 스플라이싱 연결부에서 돌연변이를 갖는 3개의 작제물: Pab klba HL(-)GC; Pab klba HL(-)GA; 및 Pab klba HL(-)KC에 대한 2개의 스플라이싱 연결부에서 아미노산 잔기를 제공한다. 별표(^*)는, 변이체 아미노산 잔기가 돌연변이체 작제물내에 도입된 위치를 나타낸다. 이들 작제물 중에서, Pab-klbA HL(-)GC는 N-말단 인테인 연결부에서 효율적인 절단과 함께 단백질을 발현하고 프로세싱하기 위한 능력이 입증되었다. 특정 작제물로부터 IgG 단백질의 발현 및 SDS-PAGE 분석의 결과를 도시하는 도 6을 또한 참조한다.

벡터의 생성을 위한 물질 및 방법: Pab - klbA HL (-) 변이체 GA , GC , 및 KC 의 작제

특정의 벡터 작제물의 몇가지 변이체 형태를 생성하였다. Pab-klbA HL(-) 돌연변이체 GA, GC, 및 KC를 PCR로 작제하였다. 전방(forward) 프라이머 HC-F 및 역(reverse) 프라이머 Hint-R을 사용하여 중쇄의 3' 말단에서 PCR 증폭시켜 PCR 생성물 #1을 생성하였다. 전방 프라이머 GA-F, GC-F, 및 KC-F는 바람직한 돌연변이 및 중쇄의 3' 말단에서 상보성 서열을 함유하였다. 프라이머 GA-F, GC-F, 또는 KC-F 및 역 프라이머 인테인-R-2를 사용하여 Pab-klbA 인테인의 5' 말단에서 증폭시켜 PCR 생성물 #2를 생산하였다. 이후에, PCR 생성물 #1 및 #2를 키아겐 겔 추출 키트(Qiagen Gel Extraction kit)를 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR 생성물을 함께 어닐링하고 외부 프라이머 HC-F 및 인테인-R-2를 사용하여 증폭시켜 PCR 생성물 #3을 생성하였다. 벡터 Pab-klbA HL(-)를 제한 효소 Sacll 및 Rssll을 사용하여 분해한 후 키아겐 겔 추출 키트를 사용하여 정제하였다. PCR 생성물 #3을 Pab-klbA-HL(-)(Sacll 및 Rssll로 절단)내로 최대 효율 DH5α 세포[제조원: 인비트로겐(Invitrogen)] 내에서 동종 재조합에 의해 아클로닝(subcloning)하였다. 정확한 돌연변이를 수반하는 형질전환체를 콜로니 PCR에 이은 서열 분석을 사용하여 측정하였다. 정확한 클론으로부터의 DNA를 증폭시키고 키아겐 맥시 키트(Qiagen Maxi kit)를 사용하여 정제하였다. 프라이머 서열을 하기 표에 나타낸다.

실시예 4. sORF 작제물을 발현하는 안정한 벡터 및 세포주의 생성

안정한 발현 벡터 및 이러한 벡터를 발현하는 세포주를 sORF 작제물의 양태를 사용하여 개발할 수 있다. 예로서, Pab Lon 인테인을 지닌 sORF를 함유하는 안정한 발현 벡터를 CHO(챠이니즈 햄스터 난소) 세포주내로 안정하게 형질감염시켰다. 본 발명자들은 CMV 인핸서, 아데노바이러스 주요 레이트 프로모터, SV40 폴리A 서열, 가스트린 전사 터미네이터, SV40 프로모터에 의해 구동된 DHFR 암호화 서열, 및 일시적인 발현 시스템에서 사용된 pTT3 pab lon HL(-)내의 것과 동일한 ORF를 포함하는 성분들을 지닌 안정한 sORF 발현 벡터를 설계하고 제조하였다. 따라서, sORF 작제물 pA190-Pab-lon HL(-)를 제조하여 안정한 발현 벡터로서 사용할 수 있다; 도 7을 참조한다. 추가의 작제물을 유사하게 제조한다.

인산칼슘 형질감염 기술을 사용하여, pA190 작제물을 CHO 세포(CHO B3.2로 지명)내로 도입시키고 당해 세포를 48개의 96-웰 플레이트에 200개 세포/웰의 밀도로 MEM 및 5% FBS를 함유하는 선택 배지 속에 플레이팅하였다. 형질감염 플레이트를 세포/콜로니의 성장 및 IgG 분비에 대해 모니터링하였다.

sORF 안정한 발현 벡터 pA190-Pab-lon HL(-)로부터의 30개 클론 및 대조군 안정한 발현 벡터 pA190 형질감염 반응물로부터의 32개 클론의 시료채취물을 선택하여 성장시켰다. 당해 단계에서, IgG 분비 농도를 증폭없이 선택된 클론에 대해 평가하고, 농도를 또한 20 nM 메토트렉세이트(MTX)를 사용하여 증폭 후 평가하였다. 안정한 발현 시스템의 경우, sORF 벡터는 적절한 수(2304개 중 443개) 및 비율, 즉 IgG 분비에 대해 양성인 시료 중 19%를 갖는 성장 양성 웰(4608개의 총 웰 중 2304개가 양성임)의 유의적인 빈도를 생성하였다. 12-웰 플레이트 속에서 0 nM MTX의 조건하에 IgG 분비 농도는 ~29개의 선택된 클론의 경우 배양 상층액 ml당 약 0.3 내지 약 2.5 ㎍의 범위이었다. 20 nM MTX를 사용한 조건하에서, ~24개의 선택된 클론의 경우 IgG 분비 농도는 2㎍/ml보다 높은 분비 농도를 입증하는 골라낸 클론의 약 1/2의 사용시 ml당 약 0.1 내지 약 6㎍의 범위이었다. sORF 작제물 클론은 부착성 배양물 용기 속에서 상대적으로 신속한 합치성을 입증하였음이 주목되었다. 예를 들면, 20 nM MTX를 사용한 부착성 배양물 속에서, SORF 클론은 보다 신속하게 성장하여 통상의 벡터 클론보다 더 신속하게 합치성에 이르렀다. 20 nM MTX 속에서 1회 계대배양시, 통상의 벡터로부터의 클론의 28%가 6일내에 합치성에 도달하였으며(4일, 5일 또는 6일); 여기서, sORF pab lon 벡터로부터의 클론의 77%가 6일내에 합치성에 도달하였다(참조: 도 8). 이들 데이타는, CHO 세포주 발달을 포함하는 안정한 발현 시스템의 개발시, 통상의 벡터와 비교하여 sORF 발현 벡터를 사용하는 강력한 장점을 제안한다. sORF 클론은 또한 100 nM MTX를 사용한 직접적인 증폭 조건하에서 유리한 수준의 항체 분비를 입증하였다. 실험에서, 100 nM MTX에 노출된 16개 클론은 평균 6 ㎍/ml의 IgG 분비 농도를 수득하였고, 상부 5개 클론은 평균 12㎍/ml이었으며 상부 클론의 생산 농도는 24㎍/ml였다. 하기 표는 각각의 증폭 단계에서 최대 발현 수준의 MTX 증폭을 사용한 결과를 나타낸다. 값들은 pA190-Pab-lon-HL(-) 작제물을 갖는 각종 클론에 대해 IgG의 ml당 ㎍이다.

안정한 발현 시스템을 위한 물질 및 방법

H/T 및 10% 투석된 FBS가 보충된 알파 MEM 속에서 배양된 차이니즈 햄스터 난소 세포를 인산칼슘 공-침전 과정을 사용하여 발현 벡터로 형질감염시켰다[참조: Kingston, R.E., et al. (1993), Unit 16.23: Amplification Using CHO Cell Expression vectors, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M., Brent, R., Moore, D.M., Kingston, R.E., Seidman, J.G., Smith, J.A., and Struhl, K., eds; Wiley Interscience, New York), 2:16.23.1]. 다음날, 세포를 트립신/EDTA를 사용하여 실온에서 형질감염시키고 5% 투석된 FBS(α-MEM + 5% dFBS), 발현 벡터로부터 DHFR을 발현하는 형질감염된 세포에 대해 선택적인 성장 배지가 보충된 알파 MEM 속에 재현탁시켰다. 선택에서 생존한 배양 상층액을 사람 IgG 감마 쇄에 대해 특이적인 ELISA를 사용하여 스크리닝하였다. 최대 ELISA 시그날을 제공하는 세포주를 α-MEM + 5% dFBS 함유 MTX 속에서 배양하였다. MTX는 벡터의 증폭으로 인하여 보다 높은 농도의 효소를 생산하는 세포에 대해 선택한 DHFR의 억제제이다. 세포주를 각종 농도의 MTX 속에서 배양하고 항체의 발현에 대해 모니터링하였다.

양태들에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 예를 들면, 2008년 10월 2일자로 출원된 기온(Gion) 등의 제US 20080241883호에 기술된 바와 같이, pA205 벡터 작제물, 또는 이의 유도체를 사용할 수 있다.

따라서, 안정한 세포 발현 시스템을 다양한 sORF 설계 및 작제물을 사용하여 생성한다. 특히, sORF 시스템은 항체 분자와 같은 생물학적 치료제의 발현을 위한 CHO 플랫폼을 사용한 통합에 매우 적합하다.

실시예 5. sORF 작제물에서 인테인 C-말단 스플라이싱 연결에 대한 국면의 특성화

본 발명자들은 sORF 작제물과 관련하여 인테인 C-말단 스플라이싱 연결의 국면을 시험하였다. 본 발명자들은 부분적으로 약 40개의 새로운 작제물을 생성하여 인테인의 하부의 제1 아미노산 및 C-말단 스플라이싱 연결부에서 절단 효율에 영향을 미칠 수 있는 스프라이싱 연결 길이와 관련된 국면을 특성화하였다. 이들 추가의 작제물은 경쇄 연결 돌연변이의 변이를 가졌다. 개괄적으로, 본 발명자들은 경쇄의 N-말단 끝에서 또는 근처의 잔기에 초점을 맞추었으며; 1번 위치에서의 메티오닌(Met1) 및 2번 위치에서의 아스파르테이트(Asp2) 각각을 20개의 가능한 천연 아미노산 잔기 모두로 교체하였다(참조: 도 9). 이들 2개의 일련의 경쇄 연결 돌연변이 작제물은 D2E7 항체 암호화 서열 및 HC-인테인-LC 구조에서 Pab Lon 인테인 분절을 사용하였다.

작제물을 293 세포내로 형질감염시켰다. 일시적인 발현은 Met 치환 작제물중 대부분을 사용하여 높은 IgG 역가를 수득하였으며, 이들 작제물 다수는 당해 위치에 Met를 갖는 대조군 작제물보다 더 높은 발현 수준을 수득하였다(참조: 도 10). Asp 치환 작제물은 일반적으로 보다 낮은 수준의 항체 발현을 수득하였다(참조: 도 11).

폴리프로테인 프로세싱의 효율을 시험하였다(예를 들면, 참조: 도 12). Met의 변이를 기초로 한 작제물의 라이브러리는 앞서 기술된 Pab Lon HL(-) 작제물과 유사하게, 폴리프로테인로부터 HC 및 LC 둘다의 효율적인 프로세싱을 생산하였다. Asp의 변이를 기초로 한 작제물의 라이브러리는 비교적 손상된 C-말단 프로세싱을 갖는 것으로 나타나며 아주 적은 양의 LC 및 유의적인 양의 인테인-LC 융합 단백질 종을 생성하였다. 불완전한 절단의 당해 결과는 스플라이싱 연결부에서 아미노산 특성에 대해 비의존성인 것으로 해석되므로 하나의 아미노산 단위의 전체 길이 차이와 관련된 것으로 나타난다. 그러나, 비교적 비효율적인 작제물도 여전히 일부 IgG 생성물을 생산할 수 있음에 주목한다.

실험에서, 메티오닌-변이 라이브러리에서 20개 작제물 중 10개로부터의 IgG 항체 생성물을 추가로 분석하였다. 시료는 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제된 뱃치였고, 경쇄 성분들을 분자량의 평가를 포함하는 질량 분광법으로 분석하였다. 질량 분석법의 결과는, 특정 작제물(Pab lon M1 A, Pab lon M1 D, Pab lon M1 E, Pab lon M1 F, Pab lon M1 G, Pab lon M1 H, Pab lon M1 I, Pab lon M1 K, Pab lon M1 L, 및 Pab lon M1 C)로부터의 항체 경쇄가 인테인-매개된 반응을 통해 발생하는 정밀한 절단으로 작제물 설계시 가공된 바와 같이 형성시켰음을 나타내었다. Cys가 사용되어 Met로 교체된 작제물은 거의 프로세싱되지 않은 HC 및 LC 성분을 생산하였으며 스플라이싱 생성물일 수 있는 1개의 단백질 종을 함유하였고, 이는, 항체 경쇄의 +1 위치에서 Cys가 어느 정도 단백질 스플라이싱을 지지함을 제안한다. 생산된 모든 항체 경쇄에서, LC의 제1 아미노산의 존재는, 이들 벡터를 사용하여 생산된 항체 생성물이 LC N-말단 영역내 동종일 것이며 LC가 내인성일 수 있는 아미노 펩티다제 활성에 의해 프로세싱에 민감함을 입증한다.

실시예 6. sORF 작제물을 사용한 항체 ABT -847의 발현

본 발명자들은 사람 람다 경쇄를 포함하는 항체를 발현하도록 조정된 sORF 작제물을 개발하였다. 본 발명자들은, 항원, 인터루킨-12에 대해 특이성을 갖는 완전한 사람 항체인 ABT-847을 사용하여 작업하였다. 당해 항체는 사람 IgG1 동형의 중쇄 및 람다 동형의 경쇄를 갖는다(참조: 사람 IL-12에 결합하는 사람 항체 및 생산 방법에 대해서는 2005년 7월 5일자 출원된 살펠트(Salfeld) 등의 미국 특허 제6,914,128호 참조).

ABT-874를 발현할 수 있는 5개의 sORF 작제물을 동종 재조합을 사용하여 제조하였다. 도 13은 이들 작제물의 SORF 성분의 구조를 도시한다. 작제물 중 3개는 HC-인테인-LC의 구조를 가졌으며, 2개의 작제물은 LC-인테인-HC의 구조를 가졌다. 이들 벡터를 HEK293 세포내로 일시적인 형질감염을 통해 도입시키고, 이들의 항체 발현 수준을 IgG ELISA로 평가하였다. 3개의 HC-인테인-LC 작제물은 유사한 구조(HC-인테인-LC)를 가지지만 D2E7 항체 분절을 갖는 작제물의 것과 유사한 배양물 상층액의 시료 속에서 항체의 역가를 수득하였다. 이들 경우들 둘다에서, ABT-874 및 D2E7 sORF 발현 시스템은 Pab Lon HL(-) 국면을 사용하였다. LC-인테인-HC 구조에 있어서 ABT-874 항체 분절을 갖는 2개의 작제물은 보다 낮은 수준의 IgG 역가를 수득하였다.

상층액에서 생산된 IgG의 시료는 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되고 SDS-PAGE 전기영동에 의해 분석된 뱃치이었다. 이들 분석물은, LC 성분이 모든 3개의 HC-인테인-LC 작제물에서 폴리프로테인로부터 완전히 프로세싱되었음을 나타내었다.

IgG 시료를 또한 질량 분광법을 사용하여 특성화하였다. 당해 분석은, 3개의 HC-인테인-LC 작제물로부터 생산된 LC가 작제물 설계에 따라 적절한 아미노산으로 개시하였음을 확인하였다. 당해 결과는 구조에 사용된 인테인에 의해 매개되는 정밀한 절단과 일치한다. 추가의 메티오닌 잔기를 가지지 않는 2개의 작제물로부터 생산된 LC 성분은 ABT-874 항체의 대조군 시료로부터의 물질과 동일했다. 따라서, 변형이 D2E7 항체의 경우에 수행된 바와 같이 달성될 수 있다고 해도, 이러한 변형은 기술된 작제물로부터 발현 생성물에서 목적하는 N-말단 LC 아미노산 서열의 달성 관점에서 임의적이다. 질량 분석법 분석을 또한 사용하여 작제물 설계에 따라 예측된 MW를 입증한, HC의 분자량을 평가하였다.

실시예 7. 인테인 -계 정제 태그를 사용한 sORF 작제물

본 발명의 양태들에서, 작제물을 삽입체를 사용하여 설계한다. 삽입체를 지닌 작제물의 양태들에서, 삽입체는 검출가능한 시그날을 제공할 수 있거나 결합 또는 인식 성분을 제공하는데 유용하다. 본 발명의 양태들에서, 작제물을 설계하여 이러한 생성물중 하나 이상으로부터 특정의 작제물-관련된 발현 생성물의 분리를 촉진한다. 예를 들면, 벡터 설계를 생성하여 인테인 스플라이싱 반응으로부터 부분적으로 프로세싱된 단백질을 포함하는 성분들의 혼합물로부터 완전히 프로세싱되고, 조립된 다합체성 항체 생성물의 정제를 허용한다. HL 작제물의 발현과 관련하여, H-인테인-L의 구조는 H-인테인 또는 인테인-L 연결 중 하나 또는 둘다에서 불완전한 절단 반응을 초래함으로써 H, 인테인 및 L 성분을 생성할 수 있는 완전한 효율적인 절단의 달성과는 대치되는 것으로서, H-인테인, 인테인-L, 또는 3중 H-인테인-L의 단백질 부산물을 생성한다. 그러나, 후자의 상황에서 조차, 인테인 성분을 제거하는 것이 유용할 수 있다. 따라서, 전략을 개발하여 인테인에 태그, 바람직하게는 내부 태그를 갖춤으로써 인테인 절단 및/또는 연결 반응의 적어도 부분적인 효율을 허용하였다.

본원의 어디엔가 기술된 바와 같이, sORF 작제물로부터의 배양 상층액의 시료 속에서, 본 발명자들은 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 중 어느 것에 부착된 인테인 단백질을 함유하는 몇가지 부분적으로 프로세싱된 중간체를 관측하였다. 본 발명자들은 Pfu lon 및 Pab lon 인테인이 내부 다중히스티딘 태그(IHT)를 함유하는 sORF 작제물을 설계하여 왔다. 이는 프로세싱되지 않은 오염물의 신속하고 효율적인 분리를 허용하는 조성물 및 방법을 제공한다.

본 발명자들은, 인테인이 펩타이드 또는 거대한 단백질을 삽입시킴에 의해 변형될 수 있음을 발견하였다. 바람직하게는, 삽입은 용매 접근가능한 루프내로 이루어진다. 구조적 모델화와 함께 몇가지 인테인의 서열 정렬의 분석에 의해, 본 발명자들은 파이로코쿠스 아비씨(PAB) LON 인테인 및 파이로코쿠스 푸리오수스(PFU) LON 인테인 둘다 내에서 용매 접근가능한 루프를 확인하였다. 당해 루프는 엔도뉴클레아제(H) 도메인 모티프와 인테인의 F/G 블록 사이에 위치하였다(참조: 도 14). 도 14는, 태그를 포함하는 삽입체의 도입을 위한 H와 F/G 블록사이의 용매 접근가능한 루프의 바람직한 위치(점선 화살표)의 위치과 관련하여 인테인의 특정의 구조적 모티프를 도시한다(참조: 인터넷 웹사이트에서 사용가능한 정보, http://tools.neb.com/inbase/motifs_endo .php (InBase, The Intein Database:DOD Homing Endonuclease Motifs; InBase Reference: Perler, F. B., 2002, InBase, the Intein Database, Nucleic Acids Res. 30, 383-384)(모티프를 포함하는 특정의 인테인 구조적 특징을 나타내는 개략도 공급원). 본 발명자들은, 나타낸 도메인들 사이의 영역이 당해 용매 접근가능한 루프내에서 사용될 수 있는 많은 가능한 삽입 부위에 허용성인지를 측정하였다. 상기 공급원에 따라서, 도 14에서 보존된 잔기의 특정의 특징은 다음과 같이 나타난다: 박스쳐진 아미노산, 표준 스플라이싱 반응에서 친핵체; 상부경우 문자, 표준 인테인에서 보존된 아미노산; 하부경우 문자, 변형된 메카니즘에 의해 스플라이싱될 수 있는 다합체성 인테인내 아미노산.

부위 지시된 돌연변이유발을 사용하여, 본 발명자들은 당해 루프내 폴리히스티딘 친화성 태그를 삽입하고 이들 인테인이 기능하는 능력을 시험하였다. IHT는 자가-프로세싱하기 위한 PAB-LON 또는 PFU-LON 인테인 능력을 파괴하지 않으며, 폴리히스티딘 태그를 사용하여 단백질을 정제할 수 있으므로, 루프가 용매 접근가능함을 입증한다. 또한, PFU-RIR1-1 구조의 결정 구조의 실험은, 어떠한 단백질도, 이들이 실질적으로 또는 완전히 아미노 말단 및 카복실 말단 자가-촉매 반응을 파괴하지 않는 한, 당해 영역내에 삽입될 수 있음을 제안한다. 예를 들면, 아미노 및 카복시 말단 잔기를 매우 근접하게 갖는 폴리펩타이드 태그 또는 단백질은 인테인의 자가촉매분해적 활성을 실질적으로 파괴하지 않아야 한다. 바람직한 양태에서, 태그와 같은 삽입체를 갖는 작제물이 제공되며, 여기서, 작제물은 하나 이상의 목적하는 인테인 활성(예를 들면, 절단 및/또는 연결)을 나타낼 수 있다. 따라서, 인테인의 당해 용매 접근가능한 루프를 포함하는 작제물 성분들을 변형시켜 많은 상이한 기능성 분자를 생성할 수 있다.

Pfu lon 인테인의 경우, 태그 서열을 삽입하였다. 삽입을 위한 바람직한 위치는, 삽입 부위의 상부의 아미노산 서열이 IEFIP(AA 323-327)이고 삽입 부위의 하부가 ISFSP(AA 328-332)인 경우이다. Pab lon 인테인의 경우, 태그 서열이 삽입되었다. 삽입을 위한 바람직한 위치는, 삽입 위치의 하부의 아미노산 서열이 IIFDA (AA 291-295)이고 삽입 부위의 하부가 GRLDV(AA 296-300)인 경우이다. Pfu lon 및 Pab lon 인테인 작제물 각각에서, 삽입된 태그 서열은 다음을 포함하였다: HHHHHH (서열 번호 56), HHHHHHHHHH (서열 번호 57), 및 HQHQHQ (서열 번호 58). 후자의 태그 서열(여기서 H는 히스티딘이고 Q는 글루타민이다)에 의해 입증되는 바와 같이, 삽입체는 폴리히스티딘 태그 이외의 것일 수 있다. 추가의 삽입체 서열을 당해 분야에서 이해되는 바와 같이 사용할 수 있다.

IHT-변형된 인테인 sORF 작제물은 IHT 변형없이 이들과 유사한 항체 분비 농도를 수득하였다. 당해 결과는, IHT 변형이 sORF 생성물의 이의 자가-프로세싱에 있어서 기능하기 위한 인테인의 능력을 파괴하지 않을 뿐 아니라, IHT가 배지내로 분비되는 것으로부터 정확하게 프로세싱된 항체를 방지하지 않음을 말한다.

본 발명자들은, 고정된 금속 친화성 크로마토그래피를 사용하여, 오염물을 함유하는 인테인이 IHT를 통해 단백질 A 정제된 항체 제제로부터 신속하고 효율적으로 제거될 수 있음을 입증하였다. 이들 IHT 작제물은, 본 발명자들이 정확하게 프로세싱된 항체를 분리할 수 있도록 하며 치료용 항체를 포함하는 sORF-기원한 생물제의 생산을 위한 보충 방법을 나타낸다.

내부적으로 His-태그된 sORF 작제물을 사용하여, D2E7 항체 분자를 니켈 컬럼 크로마토그래피의 기술을 사용한 방식을 통한 유동중 인테인-함유 단백질 종으로부터 효율적으로 분리하였다. 유사하게, Pab lon HL(-) 작제물을 사용하여 생산된 D2E7 항체를 또한 Q-컬럼을 사용하여 인테인-함유 단백질 종으로부터 효율적으로 분리하였다. 단백질 A 기술에 의해 정제된 Pab lon HL(-)로부터 생산한 IgG 시료, 및 Pab lon HL(-)/10 His 작제물로부터 생산하고 proA 및 Ni-수지 둘다로 정제한 IgG 시료를 또한 SEC 분획화로 분석하였다. 정제 후 시료는 단량체성 IgG 종의 개선된 순도를 나타내었다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 추가로 잔류하는 약간의 오염물을 제거하였다. 정제된 IgG 시료를 BiaCore에 의해 특이적인 항원, TNFα에 대한 결합 친화성에 대해 분석하였다. 이들 시료의 친화성은 통상의 벡터를 사용하여 생산한 D2E7 항체와 구별가능하지 않았다.

실시예 8. Pho lon 인테인

파이로코쿠스 호리코시이 OT3의 Pho lon 인테인에 대한 아미노산 서열을 하기 나타낸다. 또한 Inbase, NEB 인테인 데이타베이스에 따른 NCBI/단백질, PH0452내 수탁번호 제BAA29538.1호를 참조한다.

실시예 9. 벡터 및 경쇄 시그날 펩타이드 .

단백질의 발현을 위한 단일의 전사 해독 프레임 벡터와 관련하여 추가의 진전이 이루어졌다. 양태들에서, 벡터들은 포유동물 세포내에서 발현을 위한 면역글로불린의 단백질을 사용한다. 이러한 벡터에서, 경쇄 시그날 펩타이드를 포함하는 경쇄 성분들의 성분들의 구조를 설계하고 생성한다.

단일의 전사 해독 프레임 작제물의 양태에서, 천연의 사람 항체 경쇄 공급원으로부터의 시그날 펩타이드를 사용한다. 예를 들면, 사람 경쇄 시그날 펩타이드가 V BASE에서 보고되어 있으며, 이는 진 뱅크(Genbank) 및 EMBL 데이타 라이브러리와 같은 공급원으로부터 사람 배선 가변 영역 서열에 있어서의 정보의 데이타베이스를 포함한다. V BASE 데이타베이스는 영국 캠브릿지 소재의 단백질 가공을 위한 MRC 센터(MRC Centre for Protein Engineering)(인터넷 주소로 사용가능, http://vbase. mrc-cpe. cam. ac. uk/)와 제휴되어 있다[또한, 참조: Giudicelli V et al., Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, Database issue D781-D784; Retter I et al., Nucleic Acids Res. 2005 January 1 ; 33(Database Issue): D671 -D674]. 특수 양태에서, 천연의 아미노산을 포함하는 각종 아미노산을 지닌 IgG1항체를 생산하는데 사용될 수 있는 다수의 벡터 설계를 제공한다.

일반적으로 19 내지 23개 아미노산 길이의 범위인 특정 사람 경쇄 시그날 펩타이드가 제공되며 하기 표(들)에 나타낸 서열을 갖는다(Hu Vk, 사람 카파 가변 영역; LCSP, 경쇄 시그날 펩타이드). 이러한 사람 기원을 포함하는 천연의 펩타이드와 관련하여 아미노산 서열 및/또는 길이가 변할 수 있는 변이체 펩타이드가 또한 제공된다. 제공된 아미노산 서열의 경우, 갭을 하나 이상의 다른 서열과의 정렬과 관련한 비교 목적을 위해 나타낼 수 있다. 양태에서, 제공된 경쇄 시그날 펩타이드 또는 이에 대해 암호화하는 핵산 서열이 제공된다. 하나의 양태에서, 아미노산 또는 핵산 서열이 발현 벡터, 합성된(천연적으로 합성된 바와 같은) 분자, 또는 재조합체 발현 생성물과 같은 서열 또는 이의 분절의 합성 작제물로서 제공된다.

특정의 V카파 시그날 펩타이드를 E7으로 지명된 면역글로불린 경쇄(종양 괴사 인자 알파에 대해 항원 특이성을 갖는 항체 분자 D2E7의 경쇄에 상응)에 대한 시그날 펩타이드인, L5로 치환하였다. 또한, L5의 특정의 돌연변이체의 돌연변이 라이브러리를 작제하고, 돌연변이체 L5 펩타이드를 천연의 L5 펩타이드에 대해 치환하였다. 포유동물 발현 벡터를 파이로코쿠스 아비씨 lon 인테인을 사용하여 HL 오리엔테이션(orientation)으로 작제하였다. 다음 벡터를 생성하였다: pTT3-A14-E7-PablonHL, pTT3-A17-E7-PablonHL, pTT3-A18-E7-PablonHL, pTT3-A19-E7-PablonHL, pTT3-A23-E7-PablonHL, pTT3-A26-E7-PablonHL, pTT3-A27-E7-PablonHL, pTT3-B2-E7-PablonHL, pTT3-B3-E7-PablonHL, pTT3-L2-E7-PablonHL, pTT3-L20-E7-PablonHL, pTT3-L25-E7-PablonHL, pTT3-mut-1R-E7-PablonHL, pTT3-mut-1R2G-E7-PablonHL, pTT3-mut-2R-E7-PablonHL, pTT3-mut-2G-E7-PablonHL, pTT3-mut-2R2G-E7-PablonHL, pTT3-mut-3G-E7-PablonHL, pTT3-mut-3R2G-E7-PablonHL, pTT3-mut-4G-E7-PablonHL, pTT3-mut-H+2G-E7-PablonHL. 이들 작제물은 PTT3 벡터 골격상에서 제조하였다. 당해 벡터는 현탁액 배양물 속에서 형질감염된 293E 세포(엡슈타인-바르 바이러스 핵 항원 1을 발현하는 세포) 내에서 이의 에피솜 증폭을 허용하는 EBV 복제 오리진을 갖는다. 각각의 벡터는 CMV 프로모터에 의해 구동된, 1개의 ORF를 가졌다. ORF에서, 인테인 서열을 항체 중쇄 및 경쇄 사이의 프레임내에, HC-인테인-LC의 순서로 삽입하였다. pTT3-A18-E7-PablonHL에 대한 작제물 구조의 개략도는 도 15에 도시한다.

작제물을 일시적인 형질감염을 통해 293E 세포내로 도입시키고, 다수의 일시적인 발현 실험을 수행하였다. 제공된 실험에서, 시료를 형질감염 후 8일째에 형질감염된 세포의 배양물의 상층액으로부터 수집하고 분석하였다. IgG ELISA에 의해 평가한 것으로서 분비된 항체의 농도를 함유한 시료는 시료 ml당 항체의 마이크로그람으로 하기 표에 나타낸다. 천연의 대조군은 L5 LCSP 서열에 사용된 벡터였다. 다른 대조군(표에는 나타내지 않음)으로서, 동일한 항체를 발현하고, 동일한 조절 성분을 사용하는 통상의 2개의 벡터 시스템은 이들 실험으로 포함되었으며; 당해 대조군 벡터 시스템으로부터 생산된 항체 분비 농도는 80 내지 206㎍/ml이었다. 이들 경쇄 시그날 펩타이드를 사용한 sORF 작제물 설계 중 몇개에 의해 생산된 IgG 분비 농도는 통상의 벡터를 사용하여 생산된 범위의 순서로 비교가능하다. 이들 발현 수준은 천연의 L5 E7 시그날 펩타이드를 사용한 것보다 유의적으로 더 높다(Pablon HL(+) 작제물을 사용하여 2.0㎍/ml). 이들 항체 분비 농도는 또한 포유동물 세포에서 1.6㎍/ml인 것으로 보고된 "2A" 기술을 사용하여 생산된 것보다 유의적으로 더 높다(참조: Fang et al., 2005, Nature Biotechnology 23:584-590).

항체 생성물 농도를 측정한 명시된 작제물들 중에서, 최대 농도로 분비된 항체를 생산한 작제물 중 5개로부터의 생성물을 추가의 분석을 위해 선택하였다. 생성물은 다음 5개 작제물에 상응하였다: pTT3-A17-E7-PablonHL, pTT3-A18-E7-PablonHL, pTT3-A19-E7-PablonHL, pTT3-A26-E7-PablonHL, 및 pTT3-mutH+2G-E7-PablonHL. 이들 작제물로부터 생산된 분비된 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하고 환원 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하고, 이들의 HC 및 LC에 대한 N-말단 아미노산 서열을 측정하였다. pTT3-A18-E7-PablonHL을 사용하여 생산한 시료는 전통적인 방법에 의해 생산한 유사한 항체와는 구별되지 않는 이동으로 항체 중쇄 및 경쇄에 상응하는 단백질 이동 밴드를 함유하였다. 환원 겔 상에서, 항체 HC 및 LC에 상응하는 밴드 외에, 프로세싱되지 않은 3부 단백질(HC-인테인-LC)에 상응하는 것으로 나타나는 2개의 고 분자량 밴드가 또한 존재하였다. 프로세싱되지 않거나 부분적으로 프로세싱된 단백질과 같은 이러한 작제물-관련 오염물은 본원에 기술된 바와 통상의 기술에 따라 편리하게 제거할 수 있다. SDS-PAGE 분석으로부터의 결과의 예를 도시하는 도 16을 참조한다. 분비된 IgG 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하고 환원 조건하에서 겔 속에서 SDS-PAGE의 기술을 사용하여 분리하였다. 좌측으로부터 우측까지 레인내 시료는 다음과 같다: 레인 (1) SeeBlue Plus2 단백질 표준물[제조원; 인비트로겐(Invitrogen)] 단백질 분자량 마커; (2) 대조군, 전통적인 비-sORF 발현 벡터 시스템으로 생산된 D2E7 항체; (3) Pab-lon HL(-); (4) pTT3-A18-E7-PablonHL.

발현 작제물의 생성물의 세포내 시료를 또한 HC 및 LC 둘다에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석으로 분석하였다. 유사한 단백질 종을 배양된 상층액 에서와 같이 관찰하였다. 중쇄 및 경쇄 둘다의 N-말단 아미노산 서열은 질량 분광법 분석에 의해 천연적인 것으로 측정되었다. A18 시그날 펩타이드 절단이 경쇄의 발현에 바람직한 정확한 지점에서 정밀하게 일어났음을 상기 분석으로 확인하였다. 또한, 전체 표면 전하를 기준으로 단백질을 분리하며 D2E7의 변이체 및 분순물을 검출할 수 있는 양이온 교환 크로마토그래피 (CIEX)를 사용하여 전통적으로 발현된 D2E7에 대한 유사성을 입증하였다. 따라서, A18 시그날 펩타이드를 항체 발현을 위한 sORF 벡터에 사용할 수 있으며 완전하게 프로세싱되고 조립된 항체 생성물을 효율적으로 발현시킬 수 있다.

상기에서 기술한 일시적인 발현 시스템 외에, 안정한 세포주를 또한 항체 생성물의 발현을 위해 생성시켰다. 안정한 CHO 세포주를 A18 경쇄 시그날 펩타이드 성분을 갖는 벡터를 사용하여 sORF 발현 작제물로 제조하였다. sORF 작제물 A18-E7-PablonHL을 플라스미드 pA190내로 재조합체 기술을 사용하여 클로닝하였다. pBJ-A18-LC-Pablon-HL(또한 pA190-A18-E7-PablonHL로서 언급됨)에 대한 작제물 구조의 개략도를 제공하는 도 18을 참조한다. 당해 작제물을 인산칼슘 방법에 의해 CHO B3.2 세포내로 형질감염시키고 5% FBS가 들어있는 최소 필수 배지(MEM) 알파 배지 속에서 48개의 96-웰 플레이트내로 플레이팅하였다. 형질감염 시료를 스크리닝하고 100 nM 이하의 MTX를 사용한 증폭 방법에 적용시켰다. 배양물 중 작제물의 발현 결과를 특성화하였다. 100 nM MTX에서, 작제물 pA190-A18-E7-PablonHL을 가진 세포는 배양물 상층액의 시료 속에서 1.1 내지 16.9 ㎍/ml 범위의 항체를 발현하였다. 4개의 최대 발현하는 클론을 제한 희석으로 아클로닝하였다. 아클론(subclone)을 시험하여 항체를 2.9 내지 31.8 ㎍/ml의 양으로 발현함을 발견하였다. 최대 발현 수준을 갖는 아클로닝된 세포 주 중 4개를 현탁액 속에서 성장하도록 적응시켰고 배양 4일 째에 수집한 시료로부터 측정된 것으로서 평균 31 내지 44 ㎍/ml의 양을 생산시켰다.

성숙한 경쇄 생성물을 생성하기 위한 작제물의 능력을 평가하였다. 웨스턴 블롯 실험으로부터의 결과를 제공하는 도 17을 참조한다. 세포내 항체 생성물의 시료를 특성화하였다. 전체 세포 분해물을 환원 조건하에서 겔 속에서 SDS-PAGE에 따라 분리하고, 니트로셀룰로즈 막으로 이전시키고, 차단 용액(TTBS중 탈지 분유, 트윈 20이 들어있는 트리스-완충된 염수)으로 차단하고, 중쇄 또는 경쇄에 대한 서양 고추냉이 퍼옥시다제-접합된 항체와 함께 항온처리하고 ECL(향상된 화학발광성) 시약을 사용하여 현상하였다. 블롯내 좌측으로부터 우측까지 레인내 작제물 지명에 따른 시료는 다음과 같다: 좌측에서 수를 세지않은 레인, 분자량 마커; (레인 1) 대조군, CHO 세포로부터 D2E7; (2) HEK293 세포을 사용한 일시적 형질감염시 대조군, pTT3-A18-E7-PablonHL; 각각 클론 번호 1, 3, 7, 9, 12, 14, 18, 15, 및 13에 상응하는 pA190-A18-E7-PablonHL로부터 (3-11) 각종 클론. 문자 "a" 및 "b"로 표지한 화살표는 다음과 같이 발현 생성물을 나타낸다: (a) 상부 밴드, 시그날 펩타이드를 지닌 경쇄, 및 (b) 하부 밴드, 성숙한 경쇄. 성숙한 경쇄 생성물에서, 시그날 펩타이드는 절단되어, 전구체와 관련된 보다 적은 분자량을 지닌 생성물을 생성하였다. 당해 결과는, A18 경쇄 시그날 펩타이드 성분이 D2E7 항체의 것과 비교가능한 완전히 성숙한 경쇄 생성물을 발현하고 생산할 수 있음을 입증한다.

참조문헌 및 변이에 의한 혼입에 관한 설명

어떠한 서열 목록 정보도 본 명세서의 일부로 고려된다.

본 명세서 전체에서 언급된 모든 참조문헌들, 예를 들면, 허여되거나 등록된 특허 또는 등가물; 특허원 공보; 공개되지 않은 특허원을 포함하는 특허 서류; 및 비-특허 문헌 서류 또는 다른 공급 자료는, 참조에 의한 개별적인 혼입을 통해, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다. 인용된 문헌들 및 본원의 기재내용 사이의 어떠한 불일치가 존재하는 경우, 본원의 기재내용이 우선한다. 본원에 제공된 일부 참조 문헌은 정보, 예를 들면, 출발 물질의 공급원, 추가의 출발 물질, 추가의 시약, 추가의 합성 방법, 추가의 분석 방법, 추가의 생물학적 물질, 추가의 세포 및 본 발명의 추가의 용도에 관한 세부사항을 제공하기 위해 참조로 인용되어 있다.

본원에 언급된 모든 특허 및 공보는 본 발명이 속한 당해 분야의 숙련가의 수준의 지표이다. 본원에 인용된 참조 문헌들은 이들의 공개일 또는 출원일로서 당해 분야의 기술을 나타내며, 당해 정보는 필요할 경우, 선행 기술에 속하는 특수 양태들을 배제하기 위해 사용될 수 있음을 의도한다. 예를 들면, 물질의 조성이 본원에 청구되어 있는 경우, 출원인의 발명 전에 당해 분야에 공지되고 사용가능한 화합물, 예를 들면 가능한 기재내용이 본원에 인용된 참조 문헌에 제공된 화합물들은 본원에 청구된 물질의 조성내 포함되는 것으로 의도되지 않는다.

본원에 대한 모든 첨부 또는 첨부들은 명세서 및/또는 도면의 일부로서 참조에 의해 인용된다.

화합물, 작제물 또는 조성물이 청구된 경우, 본원에 기재된 참조 문헌에 교시된 것들을 포함하는 당해 분야에 공지된 화합물, 작제물 및 조성물은 포함되지 않는 것으로 의도됨을 이해하여야 한다. 마르쿠쉬 그룹 또는 다른 그룹이 본원에 사용된 경우, 그룹의 모든 개개 구성원들 및 그룹내로부터 가능한 모든 조합 및 소조합은 또한 개별적으로 설정되어 있으며 기재내용에 포함된 것으로 의도된다.

용어 "포함하다(comprise, comprises)", "포함된", 또는 "포함하는"이 본원에 사용된 경우, 이들은 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 성분 또는 이들의 그룹의 존재 또는 첨가를 언급하나, 이를 배제하지 않는 기술된 특징, 정수, 단계 또는 성분들의 존재를 명시하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서 본원에 사용된 것으로서, '포함하는'은 '포괄하는', '함유하는', '갖는' 또는 '에 의해 특징화되는'과 동의어이며 포괄적이거나 확장가능하고 추가의, 열거되지 않은 성분들 또는 방법 단계들을 배제하지 않는다. 본원에 사용된 것으로서, "로 이루어진"은 특허청구범위 기술에서 명시되지 않은 어떠한 성분, 단계 또는 성분 등도 배제한다. 본원에 사용된 것으로서, "으로 필수적으로 이루어진"은 특허청구의 범위의 기본적이고 신규한 특징(예를 들어, 활성 성분에 관련된)에 실질적으로 영향을 주지 않는 물질 또는 단계들을 배제하지 않는다. 본원의 각각의 예에서 용어 "포함하는", "으로 필수적으로 이루어진" 및 "로 이루어진" 중 어느 것도 적어도 다른 2개의 용어로 대체됨으로써 필수적으로 공존하지 않는 별개의 양태들 및/또는 영역들을 기재할 수 있다. 본원에 설명적으로 기술된 본 발명의 양태는 본원에 구체적으로 기재된 어떠한 성분 또는 성분들 또는 제한 또는 제한들의 부재시 적합하게 실시될 수 있다.

범위, 예를 들어, 온도 범위, 시간 범위, 조성물 또는 농도 범위, 또는 다른 값 범위 등이 본원에 기재되어 있는 경우에는 언제나, 모든 중간 범위 및 부범위 뿐만 아니라 제공된 범위에 포함된 모든 개개의 값들이 기재내용에 포함되는 것으로 의도된다. 본 발명은 실시예 또는 설명의 방식으로 제한하지 않으며 제공되는, 도면에 나타낸 또는 명세서에 예시된 어느 것도 포함하는, 기재된 양태들에 의해 한정되지 않는다. 본원의 기술내용에 포함된 범위 또는 소범위에서 어떠한 소범위 또는 개개 값도 본원의 특허청구범위로부터 배제될 수 있음은 이해될 것이다.

본 발명은 각종 특이적이고/이거나 바람직한 양태 및 기술에 대한 참조 문헌과 함게 기술되어 있다. 그러나, 많은 변화 및 변형이 본 발명의 취지 및 영역내에서 이루어질 수 있음을 이해하여야 한다. 당해 분야의 통상의 기술자에게는, 본원에 구체적으로 기술된 것들 이외의 조성물들, 방법들, 장치들, 장치 성분들, 물질들, 과정들 및 기술들이 과도한 실험에 대한 의존없이도 본원에 광범위하게 기재된 것으로서 본 발명의 실시에 사용될 수 있으며; 이는 예를 들면, 출발 물질, 생물학적 물질, 시약, 합성 방법, 정제 방법, 분석 방법, 검사 방법 및 구체적으로 예시된 것들 외의 생물학적 방법에 확장될 수 있음이 명백할 것이다. 본원에 기술된 앞서의 모든 당해 분야에 공지된 기능적 등량체(예를 들어, 조성물, 방법, 장치, 장치 성분, 물질, 과정 및 기술 등)는 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. 사용된 용어들 및 표현들은 기술의 측면에서 사용되며 제한하지 않고, 나타내고 기술된 특징들의 어떠한 등가물 또는 이의 부분을 제외한 이러한 용어들 및 표현들의 사용을 의도하지 않지만, 각종 변형이 특허청구된 본 발명의 영역내에서 가능함이 인식된다. 따라서, 비록 본 발명이 양태들, 바람직한 양태들에 의해 구체적으로 기재되어 있다고 해도, 본원에 기재된 개념의 임의의 특징, 변형 및 변화는 당해 분야의 숙련가에 의해 재분류될 수 있으며, 이러한 변형 및 변화는 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 영역내에 있는 것으로 고려됨을 이해하여야 한다.

참조 문헌

본원은 특히 다음 항목들 각각의 전문을 참조로 인용한다:

SEQUENCE LISTING <110> ABBOTT LABORATORIES <120> SORF CONSTRUCTS AND MULTIPLE GENE EXPRESSION <130> 54-08 WO <150> US 61/256,544 <151> 2009-10-30 <160> 108 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 335 <212> PRT <213> Pyrococcus abyssi <400> 1 Gln Cys Phe Ser Gly Glu Glu Thr Val Val Ile Arg Glu Asn Gly Glu 1 5 10 15 Val Lys Val Leu Arg Leu Lys Asp Phe Val Glu Lys Ala Leu Glu Lys 20 25 30 Pro Ser Gly Glu Gly Leu Asp Gly Asp Val Lys Val Val Tyr His Asp 35 40 45 Phe Arg Asn Glu Asn Val Glu Val Leu Thr Lys Asp Gly Phe Thr Lys 50 55 60 Leu Leu Tyr Ala Asn Lys Arg Ile Gly Lys Gln Lys Leu Arg Arg Val 65 70 75 80 Val Asn Leu Glu Lys Asp Tyr Trp Phe Ala Leu Thr Pro Asp His Lys 85 90 95 Val Tyr Thr Thr Asp Gly Leu Lys Glu Ala Gly Glu Ile Thr Glu Lys 100 105 110 Asp Glu Leu Ile Ser Val Pro Ile Thr Val Phe Asp Cys Glu Asp Glu 115 120 125 Asp Leu Lys Lys Ile Gly Leu Leu Pro Leu Thr Ser Asp Asp Glu Arg 130 135 140 Leu Arg Lys Ile Ala Thr Leu Met Gly Ile Leu Phe Asn Gly Gly Ser 145 150 155 160 Ile Asp Glu Gly Leu Gly Val Leu Thr Leu Lys Ser Glu Arg Ser Val 165 170 175 Ile Glu Lys Phe Val Ile Thr Leu Lys Glu Leu Phe Gly Lys Phe Glu 180 185 190 Tyr Glu Ile Ile Lys Glu Glu Asn Thr Ile Leu Lys Thr Arg Asp Pro 195 200 205 Arg Ile Ile Lys Phe Leu Val Gly Leu Gly Ala Pro Ile Glu Gly Lys 210 215 220 Asp Leu Lys Met Pro Trp Trp Val Lys Leu Lys Pro Ser Leu Phe Leu 225 230 235 240 Ala Phe Leu Glu Gly Phe Arg Ala His Ile Val Glu Gln Leu Val Asp 245 250 255 Asp Pro Asn Lys Asn Leu Pro Phe Phe Gln Glu Leu Ser Trp Tyr Leu 260 265 270 Gly Leu Phe Gly Ile Lys Ala Asp Ile Lys Val Glu Glu Val Gly Asp 275 280 285 Lys His Lys Ile Ile Phe Asp Ala Gly Arg Leu Asp Val Asp Lys Gln 290 295 300 Phe Ile Glu Thr Trp Glu Asp Val Glu Val Thr Tyr Asn Leu Thr Thr 305 310 315 320 Glu Lys Gly Asn Leu Leu Ala Asn Gly Leu Phe Val Lys Asn Ser 325 330 335 <210> 2 <211> 999 <212> DNA <213> Pyrococcus abyssi <400> 2 tgcttcagcg gcgaggaaac cgtggtgatc cgggagaacg gcgaggtgaa ggtgctgcgg 60 ctgaaggact tcgtggagaa ggccctggaa aagccctccg gcgagggcct ggacggcgac 120 gtgaaagtgg tgtaccacga cttccggaac gagaacgtgg aggtgctgac caaggacggc 180 ttcaccaagc tgctgtacgc caacaagcgg atcggcaagc agaaactgcg gcgggtggtg 240 aacctggaaa aggactactg gttcgccctg acccccgacc acaaggtgta caccaccgac 300 ggcctgaaag aggccggcga gatcaccgag aaggacgagc tgatcagcgt gcccatcacc 360 gtgttcgact gcgaggacga ggacctgaag aagatcggcc tgctgcccct gaccagcgac 420 gacgagcggc tgcggaagat cgccaccctg atgggcatcc tgttcaacgg cggcagcatc 480 gatgagggcc tgggcgtgct gaccctgaag agcgagcgga gcgtgatcga gaagttcgtg 540 atcaccctga aagagctgtt cggcaagttc gagtacgaga tcatcaaaga ggaaaacacc 600 atcctgaaaa cccgggaccc ccggatcatc aagtttctgg tgggcctggg agcccccatc 660 gagggcaagg atctgaagat gccttggtgg gtgaagctga agcccagcct gttcctggcc 720 ttcctggaag gcttccgggc ccacatcgtg gagcagctgg tcgacgaccc caacaagaat 780 ctgcccttct ttcaggaact gagctggtat ctgggcctgt tcggcatcaa ggccgacatc 840 aaggtggagg aagtgggcga caagcacaag atcatcttcg acgccggcag gctggacgtg 900 gacaagcagt tcatcgagac ctgggaggat gtggaggtga cctacaacct gaccacagag 960 aagggcaatc tgctggccaa cggcctgttc gtgaagaac 999 <210> 3 <211> 333 <212> PRT <213> Pyrococcus abyssi <400> 3 Cys Phe Ser Gly Glu Glu Thr Val Val Ile Arg Glu Asn Gly Glu Val 1 5 10 15 Lys Val Leu Arg Leu Lys Asp Phe Val Glu Lys Ala Leu Glu Lys Pro 20 25 30 Ser Gly Glu Gly Leu Asp Gly Asp Val Lys Val Val Tyr His Asp Phe 35 40 45 Arg Asn Glu Asn Val Glu Val Leu Thr Lys Asp Gly Phe Thr Lys Leu 50 55 60 Leu Tyr Ala Asn Lys Arg Ile Gly Lys Gln Lys Leu Arg Arg Val Val 65 70 75 80 Asn Leu Glu Lys Asp Tyr Trp Phe Ala Leu Thr Pro Asp His Lys Val 85 90 95 Tyr Thr Thr Asp Gly Leu Lys Glu Ala Gly Glu Ile Thr Glu Lys Asp 100 105 110 Glu Leu Ile Ser Val Pro Ile Thr Val Phe Asp Cys Glu Asp Glu Asp 115 120 125 Leu Lys Lys Ile Gly Leu Leu Pro Leu Thr Ser Asp Asp Glu Arg Leu 130 135 140 Arg Lys Ile Ala Thr Leu Met Gly Ile Leu Phe Asn Gly Gly Ser Ile 145 150 155 160 Asp Glu Gly Leu Gly Val Leu Thr Leu Lys Ser Glu Arg Ser Val Ile 165 170 175 Glu Lys Phe Val Ile Thr Leu Lys Glu Leu Phe Gly Lys Phe Glu Tyr 180 185 190 Glu Ile Ile Lys Glu Glu Asn Thr Ile Leu Lys Thr Arg Asp Pro Arg 195 200 205 Ile Ile Lys Phe Leu Val Gly Leu Gly Ala Pro Ile Glu Gly Lys Asp 210 215 220 Leu Lys Met Pro Trp Trp Val Lys Leu Lys Pro Ser Leu Phe Leu Ala 225 230 235 240 Phe Leu Glu Gly Phe Arg Ala His Ile Val Glu Gln Leu Val Asp Asp 245 250 255 Pro Asn Lys Asn Leu Pro Phe Phe Gln Glu Leu Ser Trp Tyr Leu Gly 260 265 270 Leu Phe Gly Ile Lys Ala Asp Ile Lys Val Glu Glu Val Gly Asp Lys 275 280 285 His Lys Ile Ile Phe Asp Ala Gly Arg Leu Asp Val Asp Lys Gln Phe 290 295 300 Ile Glu Thr Trp Glu Asp Val Glu Val Thr Tyr Asn Leu Thr Thr Glu 305 310 315 320 Lys Gly Asn Leu Leu Ala Asn Gly Leu Phe Val Lys Asn 325 330 <210> 4 <211> 403 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 4 Gln Cys Phe Ser Gly Glu Glu Val Ile Leu Ile Glu Lys Asp Gly Glu 1 5 10 15 Lys Lys Val Phe Lys Leu Arg Glu Phe Val Asp Gly Leu Leu Lys Glu 20 25 30 Ala Ser Gly Glu Gly Met Asp Gly Ser Ile Arg Val Val Tyr Lys Asp 35 40 45 Leu Gln Gly Glu Asn Ile Lys Ile Leu Thr Lys Asp Gly Leu Val Lys 50 55 60 Leu Leu Tyr Val Asn Arg Arg Glu Gly Lys Gln Lys Leu Arg Lys Ile 65 70 75 80 Val Asn Leu Glu Lys Asp Tyr Trp Leu Ala Leu Thr Pro Glu His Lys 85 90 95 Val Tyr Thr Ile Lys Gly Leu Lys Glu Ala Gly Glu Ile Thr Lys Asp 100 105 110 Asp Glu Ile Ile Arg Val Pro Leu Thr Ile Leu Asp Gly Phe Asp Val 115 120 125 Ala Glu Lys Ser Ile Arg Glu Glu Leu Glu Arg Leu Ser Leu Leu Pro 130 135 140 Leu Asn Ser Glu Asp Ser Arg Leu Glu Lys Ile Ala Gly Ile Met Gly 145 150 155 160 Ala Leu Phe Gly Ser Gly Gly Ile Asp Glu Asn Leu Asn Thr Leu Ser 165 170 175 Phe Val Ser Ser Glu Lys Lys Thr Ile Glu Gln Phe Val Lys Ala Leu 180 185 190 Ser Glu Leu Phe Gly Glu Phe Asp Tyr Lys Ile Glu Glu Lys Glu Asn 195 200 205 Ser Ile Ile Phe Arg Thr Cys Asp Lys Arg Ile Val Thr Phe Phe Ala 210 215 220 Thr Leu Gly Ala Pro Val Gly Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Lys Leu 225 230 235 240 Pro Trp Trp Val Lys Leu Lys Pro Ser Leu Phe Leu Ala Phe Met Asp 245 250 255 Gly Leu Tyr Ser Ser Asn Arg Asn Asp Lys Glu Ile Leu Glu Ile Thr 260 265 270 Gln Leu Thr Asp Asn Val Glu Thr Phe Phe Glu Glu Ile Ser Trp Tyr 275 280 285 Leu Ser Phe Phe Gly Ile Lys Ala Glu Ala Glu Glu Asp Glu Glu Lys 290 295 300 Asp Lys Tyr Arg Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Ser Ile Asp Asn Met 305 310 315 320 Leu Asn Phe Ile Glu Phe Ile Pro Ile Ser Phe Ser Pro Ala Lys Arg 325 330 335 Glu Lys Phe Phe Lys Glu Ile Glu Lys Tyr Leu Glu Tyr Ser Ile Pro 340 345 350 Glu Lys Thr Glu Asp Leu Lys Lys Arg Val Lys Arg Val Lys Lys Gly 355 360 365 Glu Arg Arg Asn Phe Leu Glu Ser Trp Glu Glu Val Glu Val Thr Tyr 370 375 380 Asn Val Thr Thr Glu Thr Gly Asn Leu Leu Ala Asn Gly Leu Phe Val 385 390 395 400 Lys Asn Ser <210> 5 <211> 1203 <212> DNA <213> Pyrococcus furiosus <400> 5 tgttttagcg gtgaagaagt tatcttaatt gaaaaggacg gagagaaaaa agtcttcaaa 60 cttagggagt tcgttgacgg tctccttaag gaggcgtctg gagaagggat ggacggaagt 120 attagagtag tttataaaga tcttcaaggg gaaaacataa aaatactcac aaaagacgga 180 cttgtaaagc tcctttatgt caatagaaga gaagggaagc aaaagcttag aaaaatagta 240 aatcttgaaa aggattattg gcttgcatta acacctgaac ataaagtgta cacaataaag 300 ggccttaaag aagctggaga gataactaaa gatgatgaga taataagagt gcctctcaca 360 attcttgacg gctttgacgt agccgagaag agtataagag aggaacttga aaggcttagc 420 ctacttccac taaatagtga agacagtaga ctagaaaaga tagcaggaat catgggcgca 480 ctctttggta gtggaggtat cgatgagaat ctcaataccc ttagctttgt ttctagcgag 540 aagaaaacaa ttgaacagtt tgttaaagca ctcagcgagc tcttcgggga atttgactat 600 aaaattgaag aaaaagaaaa cagcattatt ttcagaacat gtgataaaag aatagtgacc 660 ttctttgcta cacttggtgc accagttgga gacaaaagca aagttaagct taagcttcca 720 tggtgggtca agcttaagcc gtcacttttc ctcgccttca tggatggtct ctacagtagc 780 aataggaatg acaaagaaat cctcgaaata actcaactta ctgacaacgt cgaaacgttc 840 ttcgaggaaa tatcttggta tctgagcttc tttggaatta aggcagaagc tgaagaggat 900 gaagaaaaag ataaatacag ggctagactt acgctatcct catcaataga caacatgctt 960 aatttcattg agttcattcc aataagcttt tctccagcaa agagagaaaa attctttaag 1020 gaaattgaaa aatatctgga atatagcatt cccgaaaaga ctgaggatct taagaaacga 1080 gttaagagag ttaagaaggg agagagaagg aatttcctcg aaagctggga ggaagttgaa 1140 gttacttaca acgtaactac agagacagga aatctacttg ctaacggtct atttgttaag 1200 aac 1203 <210> 6 <211> 401 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 6 Cys Phe Ser Gly Glu Glu Val Ile Leu Ile Glu Lys Asp Gly Glu Lys 1 5 10 15 Lys Val Phe Lys Leu Arg Glu Phe Val Asp Gly Leu Leu Lys Glu Ala 20 25 30 Ser Gly Glu Gly Met Asp Gly Ser Ile Arg Val Val Tyr Lys Asp Leu 35 40 45 Gln Gly Glu Asn Ile Lys Ile Leu Thr Lys Asp Gly Leu Val Lys Leu 50 55 60 Leu Tyr Val Asn Arg Arg Glu Gly Lys Gln Lys Leu Arg Lys Ile Val 65 70 75 80 Asn Leu Glu Lys Asp Tyr Trp Leu Ala Leu Thr Pro Glu His Lys Val 85 90 95 Tyr Thr Ile Lys Gly Leu Lys Glu Ala Gly Glu Ile Thr Lys Asp Asp 100 105 110 Glu Ile Ile Arg Val Pro Leu Thr Ile Leu Asp Gly Phe Asp Val Ala 115 120 125 Glu Lys Ser Ile Arg Glu Glu Leu Glu Arg Leu Ser Leu Leu Pro Leu 130 135 140 Asn Ser Glu Asp Ser Arg Leu Glu Lys Ile Ala Gly Ile Met Gly Ala 145 150 155 160 Leu Phe Gly Ser Gly Gly Ile Asp Glu Asn Leu Asn Thr Leu Ser Phe 165 170 175 Val Ser Ser Glu Lys Lys Thr Ile Glu Gln Phe Val Lys Ala Leu Ser 180 185 190 Glu Leu Phe Gly Glu Phe Asp Tyr Lys Ile Glu Glu Lys Glu Asn Ser 195 200 205 Ile Ile Phe Arg Thr Cys Asp Lys Arg Ile Val Thr Phe Phe Ala Thr 210 215 220 Leu Gly Ala Pro Val Gly Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Lys Leu Pro 225 230 235 240 Trp Trp Val Lys Leu Lys Pro Ser Leu Phe Leu Ala Phe Met Asp Gly 245 250 255 Leu Tyr Ser Ser Asn Arg Asn Asp Lys Glu Ile Leu Glu Ile Thr Gln 260 265 270 Leu Thr Asp Asn Val Glu Thr Phe Phe Glu Glu Ile Ser Trp Tyr Leu 275 280 285 Ser Phe Phe Gly Ile Lys Ala Glu Ala Glu Glu Asp Glu Glu Lys Asp 290 295 300 Lys Tyr Arg Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Ser Ile Asp Asn Met Leu 305 310 315 320 Asn Phe Ile Glu Phe Ile Pro Ile Ser Phe Ser Pro Ala Lys Arg Glu 325 330 335 Lys Phe Phe Lys Glu Ile Glu Lys Tyr Leu Glu Tyr Ser Ile Pro Glu 340 345 350 Lys Thr Glu Asp Leu Lys Lys Arg Val Lys Arg Val Lys Lys Gly Glu 355 360 365 Arg Arg Asn Phe Leu Glu Ser Trp Glu Glu Val Glu Val Thr Tyr Asn 370 375 380 Val Thr Thr Glu Thr Gly Asn Leu Leu Ala Asn Gly Leu Phe Val Lys 385 390 395 400 Asn <210> 7 <211> 333 <212> PRT <213> Pyrococcus abyssi <400> 7 Cys Phe Ser Gly Glu Glu Thr Val Val Ile Arg Glu Asn Gly Glu Val 1 5 10 15 Lys Val Leu Arg Leu Lys Asp Phe Val Glu Lys Ala Leu Glu Lys Pro 20 25 30 Ser Gly Glu Gly Leu Asp Gly Asp Val Lys Val Val Tyr His Asp Phe 35 40 45 Arg Asn Glu Asn Val Glu Val Leu Thr Lys Asp Gly Phe Thr Lys Leu 50 55 60 Leu Tyr Ala Asn Lys Arg Ile Gly Lys Gln Lys Leu Arg Arg Val Val 65 70 75 80 Asn Leu Glu Lys Asp Tyr Trp Phe Ala Leu Thr Pro Asp His Lys Val 85 90 95 Tyr Thr Thr Asp Gly Leu Lys Glu Ala Gly Glu Ile Thr Glu Lys Asp 100 105 110 Glu Leu Ile Ser Val Pro Ile Thr Val Phe Asp Cys Glu Asp Glu Asp 115 120 125 Leu Lys Lys Ile Gly Leu Leu Pro Leu Thr Ser Asp Asp Glu Arg Leu 130 135 140 Arg Lys Ile Ala Thr Leu Met Gly Ile Leu Phe Asn Gly Gly Ser Ile 145 150 155 160 Asp Glu Gly Leu Gly Val Leu Thr Leu Lys Ser Glu Arg Ser Val Ile 165 170 175 Glu Lys Phe Val Ile Thr Leu Lys Glu Leu Phe Gly Lys Phe Glu Tyr 180 185 190 Glu Ile Ile Lys Glu Glu Asn Thr Ile Leu Lys Thr Arg Asp Pro Arg 195 200 205 Ile Ile Lys Phe Leu Val Gly Leu Gly Ala Pro Ile Glu Gly Lys Asp 210 215 220 Leu Lys Met Pro Trp Trp Val Lys Leu Lys Pro Ser Leu Phe Leu Ala 225 230 235 240 Phe Leu Glu Gly Phe Arg Ala His Ile Val Glu Gln Leu Val Asp Asp 245 250 255 Pro Asn Lys Asn Leu Pro Phe Phe Gln Glu Leu Ser Trp Tyr Leu Gly 260 265 270 Leu Phe Gly Ile Lys Ala Asp Ile Lys Val Glu Glu Val Gly Asp Lys 275 280 285 His Lys Ile Ile Phe Asp Ala Gly Arg Leu Asp Val Asp Lys Gln Phe 290 295 300 Ile Glu Thr Trp Glu Asp Val Glu Val Thr Tyr Asn Leu Thr Thr Glu 305 310 315 320 Lys Gly Asn Leu Leu Ala Asn Gly Leu Phe Val Lys Asn 325 330 <210> 8 <211> 999 <212> DNA <213> Pyrococcus abyssi <400> 8 tgcttcagcg gcgaggaaac cgtggtgatc cgggagaacg gcgaggtgaa ggtgctgcgg 60 ctgaaggact tcgtggagaa ggccctggaa aagccctccg gcgagggcct ggacggcgac 120 gtgaaagtgg tgtaccacga cttccggaac gagaacgtgg aggtgctgac caaggacggc 180 ttcaccaagc tgctgtacgc caacaagcgg atcggcaagc agaaactgcg gcgggtggtg 240 aacctggaaa aggactactg gttcgccctg acccccgacc acaaggtgta caccaccgac 300 ggcctgaaag aggccggcga gatcaccgag aaggacgagc tgatcagcgt gcccatcacc 360 gtgttcgact gcgaggacga ggacctgaag aagatcggcc tgctgcccct gaccagcgac 420 gacgagcggc tgcggaagat cgccaccctg atgggcatcc tgttcaacgg cggcagcatc 480 gatgagggcc tgggcgtgct gaccctgaag agcgagcgga gcgtgatcga gaagttcgtg 540 atcaccctga aagagctgtt cggcaagttc gagtacgaga tcatcaaaga ggaaaacacc 600 atcctgaaaa cccgggaccc ccggatcatc aagtttctgg tgggcctggg agcccccatc 660 gagggcaagg atctgaagat gccttggtgg gtgaagctga agcccagcct gttcctggcc 720 ttcctggaag gcttccgggc ccacatcgtg gagcagctgg tcgacgaccc caacaagaat 780 ctgcccttct ttcaggaact gagctggtat ctgggcctgt tcggcatcaa ggccgacatc 840 aaggtggagg aagtgggcga caagcacaag atcatcttcg acgccggcag gctggacgtg 900 gacaagcagt tcatcgagac ctgggaggat gtggaggtga cctacaacct gaccacagag 960 aagggcaatc tgctggccaa cggcctgttc gtgaagaac 999 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 10 Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 11 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 12 Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 1 5 10 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 13 Ala Asn Gly Leu Phe Val Lys Asn 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 14 Met Arg Ala Lys Arg 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 15 His Ala Arg Gly Val Phe Arg Arg 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 16 Met Asp Arg Gly Val Phe Arg Arg 1 5 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 17 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 18 Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 19 Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser 1 5 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 20 Asn Phe Gln Met Thr Gln Ser 1 5 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 21 Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 1 5 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 22 Met Arg Ala Lys Arg Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 1 5 10 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 23 Tyr Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 24 Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 25 Val Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 26 Gln Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 27 Ala Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 28 His Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 29 Tyr Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 30 Met Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 31 Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 1 5 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 32 His Ala Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 1 5 10 15 <210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 33 Met Asp Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 1 5 10 15 <210> 34 <211> 504 <212> DNA <213> Methanococcus jannaschii <400> 34 gctctggcct acgacgagcc catctacctg agcgacggca acatcatcaa catcggcgag 60 ttcgtggaca agttcttcaa gaagtacaag aacagcatca agaaagagga caacggcttc 120 ggctggatcg acatcggcaa cgagaacatc tacatcaaga gcttcaacaa gctgtccctg 180 atcatcgagg acaagcggat cctgagagtg tggcggaaga agtacagcgg caagctgatc 240 aagatcacca ccaagaaccg gcgggagatc accctgaccc acgaccaccc cgtgtacatc 300 agcaagaccg gcgaggtgct ggaaatcaac gccgagatgg tgaaagtggg cgactacatc 360 tatatcccca agaacaacac catcaacctg gacgaggtga tcaaggtgga gaccgtggac 420 tacaacggcc acatctacga cctgaccgtg gaggacaacc acacctacat cgccggcaag 480 aacgagggct tcgccgtgag caac 504 <210> 35 <211> 168 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 35 Ala Leu Ala Tyr Asp Glu Pro Ile Tyr Leu Ser Asp Gly Asn Ile Ile 1 5 10 15 Asn Ile Gly Glu Phe Val Asp Lys Phe Phe Lys Lys Tyr Lys Asn Ser 20 25 30 Ile Lys Lys Glu Asp Asn Gly Phe Gly Trp Ile Asp Ile Gly Asn Glu 35 40 45 Asn Ile Tyr Ile Lys Ser Phe Asn Lys Leu Ser Leu Ile Ile Glu Asp 50 55 60 Lys Arg Ile Leu Arg Val Trp Arg Lys Lys Tyr Ser Gly Lys Leu Ile 65 70 75 80 Lys Ile Thr Thr Lys Asn Arg Arg Glu Ile Thr Leu Thr His Asp His 85 90 95 Pro Val Tyr Ile Ser Lys Thr Gly Glu Val Leu Glu Ile Asn Ala Glu 100 105 110 Met Val Lys Val Gly Asp Tyr Ile Tyr Ile Pro Lys Asn Asn Thr Ile 115 120 125 Asn Leu Asp Glu Val Ile Lys Val Glu Thr Val Asp Tyr Asn Gly His 130 135 140 Ile Tyr Asp Leu Thr Val Glu Asp Asn His Thr Tyr Ile Ala Gly Lys 145 150 155 160 Asn Glu Gly Phe Ala Val Ser Asn 165 <210> 36 <211> 588 <212> DNA <213> Pyrococcus abyssi <400> 36 gctctgtact acttcagcga gatccagctg cccaacggca aagagttcat cggcaaactg 60 gtggacgagc tgttcgagaa gtaccacgac aagatcggca agtacaagga catggaatac 120 gtggagctga acgaagagga caccttcgag gtgatcagca tcggccccga cctgagcgcc 180 aggcggcaca aggtgaccca cgtgtggcgg cggaaggtga aagacggcga gaagctggtg 240 aagatccgga ccgccagcgg caaagaactg gtgctgaccc aggaccaccc cgtgttcgtg 300 ctgctgggcc gggacgtggc cagacgggac gccggcaacg tgaaagtggg cgacgagatc 360 gccgtgctga acaccaggcc cgacttcagc gtgctgtccc cccctgccat gcccgagctg 420 ctgtccgagc ccttcaacta cgagctgtcc agcatcggcg acgtggcctg ggacgaggtg 480 gtggaggtgg acgagatcga cgccaagggc ctgggcgtgg agtacctgta cgacctgacc 540 gtggacatca accacaacta cgtggccaac ggcatcgtgg tgtccaac 588 <210> 37 <400> 37 000 <210> 38 <211> 1566 <212> DNA <213> Pyrococcus furiosus <400> 38 gcactttacg atttctctgt catccaacta tctaatggta gatttgtact tataggagat 60 ttagtcgagg aattattcaa gaagtatgcc gagaaaatta aaacatacaa agaccttgag 120 tacatagagc ttaacgagga agaccgtttt gaagttgtta gtgttagtcc agatttgaag 180 gctaataaac atgttgtctc aagagtttgg agaagaaagg tcagagaggg ggaaaagcta 240 atacgcataa agacgagaac tggcaacgaa ataatcctca ctagaaatca tccgctattt 300 gccttctcca atggagacgt agtcagaaaa gaggccgaga agctcaaagt tggggataga 360 gttgcagtga tgatgagacc tccttcacct cctcaaacta aagctgtagt tgaccctgca 420 atttacgtga aaataagtga ttactacctt gttccgaacg gaaaaggtat gataaaagtt 480 cctaacgatg gtattcctcc agaaaaggcc caatatcttc tttcagtaaa ttcatatcct 540 gtaaaattag tcagagaagt tgatgagaag ttatcctatc tcgctggagt tatactcggt 600 gatgggtata tatcatcgaa tggatactac atctcagcta catttgacga cgaagcttac 660 atggatgcct ttgtctctgt agtctcggac tttatcccta actatgtccc cagtataagg 720 aagaacggag attacacaat tgtaactgtt ggctcgaaga tttttgctga aatgctctca 780 aggatatttg gaataccaag gggcagaaaa tctatgtggg atattccaga cgtagtactt 840 tcaaatgacg atcttatgag atacttcata gctggacttt tcgacgctga tgggtacgta 900 gatgaaaatg ggccctccat agtcctagta acaaagagtg aaaccgtggc aaggaagatt 960 tggtacgttc ttcagaggtt ggggatcata agtacagttt cccgtgtaaa gagcagaggg 1020 tttaaagaag gcgagctgtt cagggtaatt attagtggtg ttgaagatct tgctaaattt 1080 gcaaaattca tacccctacg tcactcaaga aagagggcca aacttatgga gatattaagg 1140 actaagaagc catatcgggg aagaagaact taccgcgtgc cgatatccag tgatatgata 1200 gctcctctcc gtcaaatgtt gggattaact gttgcagagc tgtctaagtt agcgtcttat 1260 tatgcagggg aaaaagtttc tgaaagccta attaggcata tagaaaaggg aagggtcaaa 1320 gagataagac gctctacgct caaggggatt gcccttgctc tccagcagat agctaaagat 1380 gtgggtaacg aagaagcttg ggtgagagcc aagaggcttc aattgatagc tgagggagat 1440 gtttactggg atgaagtcgt aagtgttgag gaagttgatc cgaaggagct tggcattgag 1500 tacgtctatg acctcacggt tgaggacgac cacaattatg tggcaaatgg catactagtc 1560 tcaaac 1566 <210> 39 <211> 522 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 39 Ala Leu Tyr Asp Phe Ser Val Ile Gln Leu Ser Asn Gly Arg Phe Val 1 5 10 15 Leu Ile Gly Asp Leu Val Glu Glu Leu Phe Lys Lys Tyr Ala Glu Lys 20 25 30 Ile Lys Thr Tyr Lys Asp Leu Glu Tyr Ile Glu Leu Asn Glu Glu Asp 35 40 45 Arg Phe Glu Val Val Ser Val Ser Pro Asp Leu Lys Ala Asn Lys His 50 55 60 Val Val Ser Arg Val Trp Arg Arg Lys Val Arg Glu Gly Glu Lys Leu 65 70 75 80 Ile Arg Ile Lys Thr Arg Thr Gly Asn Glu Ile Ile Leu Thr Arg Asn 85 90 95 His Pro Leu Phe Ala Phe Ser Asn Gly Asp Val Val Arg Lys Glu Ala 100 105 110 Glu Lys Leu Lys Val Gly Asp Arg Val Ala Val Met Met Arg Pro Pro 115 120 125 Ser Pro Pro Gln Thr Lys Ala Val Val Asp Pro Ala Ile Tyr Val Lys 130 135 140 Ile Ser Asp Tyr Tyr Leu Val Pro Asn Gly Lys Gly Met Ile Lys Val 145 150 155 160 Pro Asn Asp Gly Ile Pro Pro Glu Lys Ala Gln Tyr Leu Leu Ser Val 165 170 175 Asn Ser Tyr Pro Val Lys Leu Val Arg Glu Val Asp Glu Lys Leu Ser 180 185 190 Tyr Leu Ala Gly Val Ile Leu Gly Asp Gly Tyr Ile Ser Ser Asn Gly 195 200 205 Tyr Tyr Ile Ser Ala Thr Phe Asp Asp Glu Ala Tyr Met Asp Ala Phe 210 215 220 Val Ser Val Val Ser Asp Phe Ile Pro Asn Tyr Val Pro Ser Ile Arg 225 230 235 240 Lys Asn Gly Asp Tyr Thr Ile Val Thr Val Gly Ser Lys Ile Phe Ala 245 250 255 Glu Met Leu Ser Arg Ile Phe Gly Ile Pro Arg Gly Arg Lys Ser Met 260 265 270 Trp Asp Ile Pro Asp Val Val Leu Ser Asn Asp 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Gly Gly 20 <210> 102 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 102 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly 20 25 <210> 103 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 103 Met Arg Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ser Arg Cys 20 <210> 104 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 104 Met Arg Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ser Gly Gly 20 <210> 105 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 105 Met Arg Arg Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Trp Phe Pro Gly Ser Arg Cys 20 <210> 106 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 106 Met Arg Arg Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Trp Phe Pro Gly Ser Gly Gly 20 <210> 107 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 107 Met Arg Arg Arg Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Trp Phe Pro Gly Ser Gly Gly 20 <210> 108 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 108 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Asp Glu Trp Phe Pro 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly 20

Claims (46)

1. 단일 전사 해독 프레임 삽입체(single open reading frame insert)를 포함하는 하나 이상의 재조합체 단백질 생성물을 생성하기 위한 분리되거나 정제된 발현 벡터로서, 상기 삽입체는
   (a) 시그날 펩타이드를 암호화하는 시그날 펩타이드 핵산 서열;
   (b) 제1의 폴리펩타이드를 암호화하는 제1의 핵산 서열;
   (c) 제1의 단백질 절단 부위를 암호화하는 제1의 개재(intervening) 핵산 서열(여기서 제1의 단백질 절단 부위는 파이로코쿠스(Pyrococcus)의 lon 프로테아제 유전자 또는 파이로코쿠스 또는 메타노코쿠스(Methanococcus)의 klbA 유전자의 인테인 분절, 또는 이들로부터 기원한 변형된 인테인 분절에 의해 제공된다); 및
   (d) 제2의 폴리펩타이드를 암호화하는 제2의 핵산 서열을 포함하고, 여기서 상기 제1의 단백질 절단 부위를 암호화하는 상기 제1의 개재 핵산 서열은 상기 제1의 핵산 서열과 상기 제2의 핵산 서열 사이에 작동적으로 위치하고; 여기서 상기 시그날 펩타이드를 암호화하는 상기 시그날 펩타이드 핵산 서열은 제1의 핵산 서열 앞에 작동적으로 위치하며; 여기서 상기 발현 벡터는 상기 제1의 단백질 절단 부위에서 절단가능한 단일 전사 해독 프레임 폴리펩타이드를 발현할 수 있는,
   단일 전사 해독 프레임 삽입체를 포함하는 하나 이상의 재조합체 단백질 생성물을 생성하기 위한 분리되거나 정제된 발현 벡터.
2. 제1항에 있어서, 상기 제1의 단백질 절단 부위가 파이로코쿠스 아비씨(Pyrococcus abyssi), 파이로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 또는 파이로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii) OT3의 lon 프로테아제 유전자의 인테인 분절; 또는 파이로코쿠스 아비씨, 파이로코쿠스 푸리오수스 또는 메타노코쿠스 잔나스키이(Methanococcus jannaschii)의 klbA 유전자의 인테인 분절; 또는 이들로부터 각각 기원한 변형된 인테인 분절에 의해 제공되는, 발현 벡터.
3. 제1항에 있어서, 상기 인테인 분절 또는 변형된 인테인 분절이, 리신, 세린이지만 히스티딘이 아닌 끝에서 두번째 잔기(penultimate residue)를 암호화하는, 발현 벡터.
4. 제1항에 있어서, 상기 인테인 분절 또는 변형된 인테인 분절이 상기 제1의 폴리펩타이드를 절단할 수는 있지만 이를 상기 제2의 폴리펩타이드에 완전히 연결하는 것은 아닌, 발현 벡터.
5. 제1항에 있어서, 상기 제1의 단백질 절단 부위가 서열 번호 1, 3, 4, 6, 7, 55, 35, 37, 및 39로 이루어진 그룹에서 선택된 서열을 포함하는 인테인 분절 및 이들로부터 기원한 변형된 인테인 분절에 의해 제공되는, 발현 벡터.
6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1의 폴리펩타이드 및 제2의 폴리펩타이드가 다합체성 조립할 수 있는, 발현 벡터.
7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1의 폴리펩타이드 및 제2의 폴리펩타이드 중 적어도 하나가 세포외 분비할 수 있는, 발현 벡터.
8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 제1의 폴리펩타이드 및 제2의 폴리펩타이드 중 적어도 하나가 포유동물 기원인, 발현 벡터.
9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 제1의 폴리펩타이드가 면역글로불린 중쇄 또는 이의 기능성 단편을 포함하고, 상기 제2의 폴리펩타이드가 면역글로불린 경쇄 또는 이의 기능성 단편을 포함하며, 상기 제1의 폴리펩타이드는 상기 제2의 폴리펩타이드의 상부에 존재하는, 발현 벡터.
10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 시그날 펩타이드 핵산 서열 중 하나만을 포함하는, 발현 벡터.
11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 제3의 폴리펩타이드를 암호화하는 제3의 핵산 서열, 및 제2의 단백질 절단 부위를 암호화하는 제2의 개재 핵산 서열을 추가로 포함하며; 여기서, 제2의 개재 핵산 서열 및 제3의 핵산 서열은, 이러한 순서로 상기 제2의 핵산 서열 이후에 작동적으로 위치하는, 발현 벡터.
12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2의 폴리펩타이드가 TNF-α(종양 괴사 인자-알파), 에리트로포이에틴 수용체, RSV, EL/셀렉틴, 인터루킨-1, 인터루킨-12, 인터루킨-13, 인터루킨-18, 인터루킨-23, 인터루킨-33, CD81, CD19, IGF1, IGF2, EGFR, CXCL-13, GLP-1R, 프로스타글란딘 E2 및 아밀로이드 베타로 이루어진 그룹에서 선택된 항원에 결합하는 것에 대해 지시된 항원 특이성을 지닌, 기능적 항체 또는 다른 항원 인식 분자를 포함하는, 발현 벡터.
13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2의 폴리펩타이드가 D2E7, EL246, ABT-007, ABT-325, 또는 ABT-874의 항체로부터의 면역글로불린 쇄의 쌍을 포함하는, 발현 벡터.
14. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2의 폴리펩타이드가 D2E7, EL246, ABT-007, ABT-325, ABT-874, 또는 다른 항체의 유사 분절로부터의 면역글로불린 중쇄 또는 면역글로불린 경쇄 분절로부터 각각 독립적으로 선택되는, 발현 벡터.
15. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 상기 삽입체에 대한 프로모터 조절 성분을 추가로 포함하는, 발현 벡터.
16. 제15항에 있어서, 상기 프로모터 조절 성분이 유도성 또는 구성적인, 발현 벡터.
17. 제15항에 있어서, 상기 프로모터 조절 성분이 조직 특이적인, 발현 벡터.
18. 제15항에 있어서, 상기 프로모터가 아데노바이러스 주요 레이트 프로모터(adenovirus major late promoter)를 포함하는, 발현 벡터.
19. 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
20. 제19항에 있어서, 상기 숙주 세포가 원핵 세포인, 숙주 세포.
21. 제20항에 있어서, 상기 숙주 세포가 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)인, 숙주 세포.
22. 제19항에 있어서, 상기 숙주 세포가 진핵 세포인, 숙주 세포.
23. 제22항에 있어서, 상기 진핵 세포가 원생생물 세포, 동물 세포, 식물 세포 및 진균 세포로 이루어진 그룹에서 선택되는, 숙주세포.
24. 제23항에 있어서, 상기 진핵 세포가 포유동물 세포, 조류 세포 및 곤충 세포로 이루어진 그룹에서 선택된 동물 세포인, 숙주 세포.
25. 제24항에 있어서, 상기 숙주 세포가 포유동물 세포주인, 숙주 세포.
26. 제24항에 있어서, 상기 숙주 세포가 CHO 세포 또는 디하이드로폴레이트 리덕타제-결핍성 CHO 세포인, 숙주 세포.
27. 제24항에 있어서, 상기 숙주 세포가 COS 세포 또는 HEK 세포인, 숙주 세포.
28. 제23항에 있어서, 상기 숙주 세포가 효모 세포인, 숙주 세포.
29. 제28항에 있어서, 효모 세포가 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)인, 숙주 세포.
30. 제24항에 있어서, 상기 숙주 세포가 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) Sf9 곤충 세포인, 숙주 세포.
31. 제19항에 따른 숙주 세포를 벡터 단백질의 발현을 허용하기에 충분한 조건하에서 배양 배지 속에서 배양함을 포함하여, 재조합체 폴리프로테인(polyprotein) 또는 다수의 단백질을 생산하는 방법.
32. 제31항에 있어서, 상기 벡터 단백질을 회수하고/하거나 정제함을 추가로 포함하는 방법.
33. 제31항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 단백질이 다합체성 조립할 수 있는, 방법.
34. 제31항 내지 제33항 중의 어느 한 항에 있어서, 재조합체 폴리프로테인 또는 다수의 단백질이 생물학적으로 기능성이고/이거나 치료제인, 방법.
35. 제19항에 따른 숙주 세포를 배양 배지 속에서 재조합체 생성물을 생산하기에 충분한 조건하에 배양함을 포함하여, 면역글로불린 단백질 또는 이의 기능성 단편, 조립된 항체, 또는 다른 항원 인식 분자인 재조합체 생성물을 생산하는 방법.
36. 제31항 내지 제35항 중의 어느 한 항에 따른 방법에 따라 생산된 단백질.
37. 제31항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 따른 방법에 따라 생산된 폴리프로테인.
38. 제31항 내지 제37항 중의 어느 한 항에 따른 방법에 따라 생산된, 조립된 면역글로불린; 조립된 다른 항원 인식 분자; 또는 개개의 면역글로불린 쇄 또는 이의 기능성 단편.
39. 제38항에 있어서, 종양 괴사 인자-α, 에리트로포이에틴 수용체, RSV, EL/셀렉틴, 인터루킨-1 , 인터루킨-12, 인터루킨-13, 인터루킨-18, 인터루킨-23, 인터루킨-33, CD81 , CD19, IGF1, IGF2, EGFR, 프로스타글란딘 E2, CXCL-13, GLP-1R, 또는 아밀로이드 베타에 대한 특이적인 항원 결합에 영향을 미치거나 기여하는 능력이 존재하는, 면역글로불린; 다른 항원 인식 분자; 또는 개개의 면역글로불린 쇄 또는 이의 기능성 단편.
40. 제39항에 있어서, 면역글로불린이 D2E7 또는 ABT-874이거나 기능성 단편이 각각 이의 단편인, 면역글로불린 또는 이의 기능성 단편.
41. 제36항 내지 제40항 중의 어느 한 항에 따른 치료학적 유효량의 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
42. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 태그(tag)를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 발현 벡터.
43. 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 개재 핵산 서열이 태그를 추가로 암호화하는, 발현 벡터.
44. 발현 벡터, 당해 벡터를 갖는 숙주 세포, 벡터 발현 생성물, 약제학적 조성물 및/또는, 상기한 것들 중의 어느 하나의 제조 방법 또는 사용 방법으로서, 상기 벡터가 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 따른 벡터이고, 경쇄 시그날 펩타이드를 암호화하는 분절을 추가로 포함하는, 발현 벡터, 당해 벡터를 갖는 숙주 세포, 벡터 발현 생성물, 약제학적 조성물 및/또는, 상기한 것들 중의 어느 하나의 제조 방법 또는 사용 방법.
45. 제44항에 있어서, 암호화된 경쇄 시그날 펩타이드가 A17, A18, A19, A26 및 H2G로 이루어진 그룹에서 선택된 카파 경쇄 시그날 펩타이드인, 벡터, 숙주 세포, 벡터 발현 생성물, 약제학적 조성물 및/또는, 제조 방법 또는 사용 방법.
46. 제44항에 있어서, 암호화된 경쇄 시그날 펩타이드가 VKII 카파 경쇄 시그날 펩타이드 A18, 서열 번호 82(아미노산 서열 MRLPAQLLGLLMLWIPGSSA)인, 벡터, 숙주 세포, 벡터 발현 생성물, 약제학적 조성물 및/또는, 제조 방법 또는 사용 방법.

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