MX2012005117A

MX2012005117A - Construcciones de sorf y expresion de gen multiple.

Info

Publication number: MX2012005117A
Application number: MX2012005117A
Authority: MX
Inventors: Emma Fung; Gerald R Carson; Wendy R Gion; Yune Z Kunes; Walter F Leise Iii; Rachel A Davis-Taber
Original assignee: Abbott Lab
Priority date: 2009-10-30
Filing date: 2010-10-28
Publication date: 2012-06-14
Also published as: AU2010313395A1; IN2012DN03281A; CN102812040A; EP2493923A1; US20110150861A1; JP2013509188A; IL219022A0; CA2776990A1; KR20120091251A; WO2011053699A1; RU2012122240A; TW201124535A

Abstract

Las modalidades de la invención se refieren a construcciones de vector y a métodos para expresión de polipéptidos incluyendo productos multiméricos tales como anticuerpos terapéuticos. Las construcciones particulares permiten la generación de productos de expresión a partir de un marco de lectura abierto individual (sORF). Una modalidad provee un vector de expresión aislado o purificado para generar uno o más productos de proteína recombinante que comprenden un inserto de marco de lectura abierto individual; dicho inserto comprende una secuencia de ácido nucleico de péptido de señal que codifica para un péptido de señal; una primera secuencia de ácido nucleico que codifica para un primer polipéptido; una primera secuencia de ácido nucleico de intercalado que codifica para un primer sitio de corte de proteína, en la cual dicho primer sitio de corte de proteína es provisto por un segmento de inteína de un gen de proteasa Ion de Pyrococcus o un gen klbA de Pyrococcus o Methanococcus, o un segmento de inteína modificada derivado a partir de los mismos; y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica para un segundo polipéptido. Ciertas modalidades de construcciones y métodos emplean un segmento de inteína de un gen de proteasa Ion de Pyrococcus abyssi, Pyrococcus furiosus, o Pyrococcus horikoshii 0T3; o un segmento de inteína de un gen klbA de Pyrococcus abyssi, Pyrococcus furiosus, o Methanococcus jannaschii; u otro segmento de inteína.

Description

CONSTRUCCIONES DE SORF Y EXPRESION DE GEN MULTIPLE Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud de patente provisional E.U.A. No. de serie 61/256,544 presentada el 30 de octubre de 2009 por Gerald R. Carson et al., la cual se incorpora en la presente solicitud para referencia en su totalidad.

Declaración sobre investigación o desarrollo efectuado con fondos federales No aplicable Referencia a un apéndice en disco compacto de listado de secuencia, una tabla, o listado de programa de computadora No aplicable (se provee el listado de secuencias pero no como un apéndice en disco compacto) ANTECEDENTES DE LA INVENCION En el campo de tecnología de expresión recombinante, el logro de niveles de producción altos de los productos de proteína deseados y la capacidad para generar productos de pureza deseada representan desafíos continuos. Dichos desafíos son particularmente relevantes para productos de proteína incluyendo agentes terapéuticos biológicos los cuales son anticuerpos, pero los avances en este campo también tienen relevancia para otros productos biológicos. Ciertas modalidades de la presente invención por lo menos en parte se dirigen a uno o más aspectos de estos desafíos.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Las siguientes abreviaturas son aplicables: ORF, marco de lectura abierto; sORF, marco de lectura abierto individual; PM, peso molecular; HC o H, cadena pesada de inmunoglobulina; LC o L, cadena ligera de inmunoglobulina; pab, Pyrococcus abyssi; pfu, Pyrococcus furiosus; pho, Pyrococcus horikoshii OT3; aa o AA, aminoácido(s); SP, péptido de señal; LCSP, péptido de señal de la cadena ligera; MTX, metotrexato.

Las modalidades de la invención generalmente se refieren a cassettes de expresión, vectores de expresión, células hospederas recombinantes y a métodos para la expresión recombinante y procesamiento, incluyendo procesamiento post-traducción, de poli-proteínas y pre-proteínas recombinantes. En las modalidades, uno o más de los productos expresados son inmunoglobulinas.

En las modalidades, los vectores de expresión comprenden uno o más segmentos de inteína. En las modalidades, los segmentos de inteína se obtienen a partir de una o más inteínas Ion de los organismos Pyrococcus abyssi, Pyrococcus furiosus, y Pyrococcus horikoshii OT3.

En las modalidades, la arquitectura de una construcción está configu rada con respecto al orden y presencia o ausencia de ciertos elementos. En una modalidad , el orden de ciertos seg mentos de gen de vector es H L, en el cual H y L indican una cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobulina respectivamente. En otra modalidad , el orden es LH . En u na modalidad particular, la construcción tiene un diseño marcado como (-) en el cual el signo "menos" indica que la construcción tiene un péptido de señal al inicio del ORF y una metionina insertada entre el último aminoácido de la inteína y el primer aminoácido de la segu nda subunidad de la proteína, por ejemplo, una cadena de anticuerpo mad uro después de la inteína . En una modalidad particu lar, la construcción tiene u n diseño ma rcado como (+) en el cual el signo "más" indica la presencia de u n primer péptido de señal al inicio del ORF y u n segundo péptido de señal al inicio de la segunda subu nidad de la prote ína corriente abajo de la inteína . En una modalidad particular la config uración es H L(-).

En las modalidades, la invención provee diseños de construcción de sORF (marco de lectura abierto individual) que pueden producir niveles de expresión de proteína q ue son mayores de 2 , 5, 1 0, 20 , 30, 40, o 50 microg ramos por mi de producto secretado cuando se mide en sobrenadantes de cultivo de experimentos bajo condiciones de expresión transitoria. En las modalidades, la invención provee construcciones de sORF que pueden producir n iveles de expresión de proteína q ue son mayores de 20 microg ramos por mililitro por d ía cuando se miden en sobrenadantes de cultivo de experimentos con condiciones que utilizan un sistema de expresión de célula CHO (ovario de hámster chino) estable. En una modalidad, el nivel de expresión (pg/ml/día) está en el intervalo de 1 a 24, mayor de 10, o mayor de 20. En una modalidad particular, el nivel de expresión es 24 pg/ml/día. En modalidades, la expresión de proteína es de anticuerpo secretado el cual se ha auto-ensamblado como una unidad multimérica de cadenas pesadas y ligeras. En modalidades, el anticuerpo es de un isotipo de IgG.

En una modalidad, la invención provee un vector de expresión aislado o purificado para generar uno o más productos de proteína recombinante que comprende un inserto de marco de lectura abierto individual; dicho inserto comprende: (a) una secuencia de ácido nucleico de péptido de señal que codifica para un péptido de señal; (b) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica para un primer polipéptido; (c) una primera secuencia de ácido nucleico de intercalado que codifica para un primer sitio de corte de proteína, en la cual dicho primer sitio de corte de proteína es provisto por un segmento de inteína de un gen de Ion proteasa de Pyrococcus o un gen klbA de Pyrococcus o Methanococcus, o una segmento de inteína modificado obtenido a partir de los mismos; y (d) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica para un segundo polipéptido; en el cual dicha primera secuencia de ácido n ucleico de intercalado que codifica para dicho primer sitio de corte de proteína está posicionada de manera operable entre d icha primera secuencia de ácido nucleico y dicha segu nda secuencia de ácido nucleico; en la cual dicha secuencia de ácido nucleico de péptido de señal que codifica para dicho péptido de señal está posicionado de manera operable antes de dicha primera secuencia de ácido nucleico; y en la cual d icho vector de expresión puede expresar u n poMpéptido de marco de lectu ra abierto individ ual que puede ser cortado en dicho primer sitio de corte de proteína .

Para claridad en el contexto de modalidades que comprenden varios segmentos y métodos de intercalado, una secuencia de ácido nucleico de intercalado que codifica para un sitio de corte de proteína puede ser tal que la secuencia de ácido n ucleico de i ntercalado cod ifica para por lo menos u n primer sitio de corte de proteína . En las inteínas canón icas, por ejemplo, la reacción de corte generalmente procede en una manera auto-procesadora y rápida . Una explicación adicional depende en parte del entendimiento de los mecanismos subyacentes. Desde la perspectiva de postprocesamiento mirando los componentes de exteína , se puede entender q ue existe un primer sitio de corte de proteína y un segundo sitio de corte de proteína hacia el extremo N-terminal y C-terminal del segmento de inteína , respectivamente . No se pretende q ue la designación de los sitios de corte corresponda necesa riamente al orden en el cual pueden ocurrir las reacciones de corte, y se reconoce que podría existir la percepción de que la reacción de corte es un evento individual y relativamente coordinado en un sitio de anexión de corte incluso si existiera una apreciación de pasos cinéticamente distintos en un mecanismo dado. Esta descripción también provee modalidades de composiciones y métodos, como se podría entender en la técnica, con segmentos de intercalado que comprenden uno o más sitios de corte. De nuevo dependiendo del entendimiento de los mecanismos de procesamiento, un segmento que comprende un sitio de corte o dos sitios de corte puede permitir cada uno la escisión parcial o completa de un segmento de intercalado.

En una modalidad, una secuencia de ácido nucleico de intercalado también codifica para un segundo sitio de corte de proteína.

En una modalidad de un vector de expresión, el primer sitio de corte de proteína es provisto por un segmento de inteína de un gen de Ion proteasa de Pyrococcus abyssi, Pyrococcus furiosus, o Pyrococcus hori oshii OT3; o un segmento de inteína de un gen klbA de Pyrococcus abyssi, Pyrococcus furiosus, o Methanococcus jannaschii; o un segmento de inteína modificada obtenido respectivamente a partir de los mismos.

En una modalidad, el segmento de inteína o segmento de inteína modificado codifica para un penúltimo residuo el cual es una Usina, serina o no una histidina. En una modalidad, el segmento de inteína o segmento de inteína modificado es capaz de corte pero no de ligación completa de dicho primer polipéptido a dicho segundo polipéptido.

En una modalidad, el primer sitio de corte de proteína es provisto por un segmento de inteína que comprende una secuencia que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 55, 35, 37, y 39 y segmentos de inteína modificada obtenidos a partir de los mismos.

En una modalidad, el primer polipéptido y el segundo polipéptido son capaces de ensamblado multimérico. En una modalidad, por lo menos uno de dichos primer polipéptido y segundo polipéptido son capaces de secreción extracelular. En una modalidad, por lo menos uno de dichos primer polipéptido y segundo polipéptido son de origen mamífero. En una modalidad, el primer polipéptido comprende una cadena pesada de inmunoglobulina o fragmento funcional de la misma, y dicho segundo polipéptido comprende una cadena ligera de inmunoglobulina o fragmento funcional de la misma, y dicho primer polipéptido está hacia el extremo 5' de dicho segundo polipéptido.

En una modalidad de un vector de expresión, el vector comprende sólo una secuencia de ácido nucleico de péptido de señal.

En una modalidad, un vector de expresión también comprende una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica para un tercer polipéptido, y una segunda secuencia de ácido nucleico de intercalado que codifica para un segundo sitio de corte de proteína; en la cual la segunda secuencia de ácido nucleico de intercalado y la tercera secuencia de ácido nucleico, en ese orden, están posicionadas de manera operable después de dicha segunda secuencia de ácido nucleico.

En una modalidad de un vector de expresión, el primero y dicho segundo polipéptido comprenden un anticuerpo funcional u otra molécula de reconocimiento de antígeno; con una especificidad de antígeno dirigida a la unión de un antígeno que se selecciona a partir del grupo que consiste de: factor a de necrosis tumoral, receptor de eritropoyetina, RSV, EL/selectina, interleucina-1 , interleucina-12, interleucina-13, interleucina-17, interleucina-18, interleucina-23, interleucina-33, CD81, CD19, IGF1, IGF2, EGFR, CXCL-13, GLP-1R, prostaglandina E2, y amiloide beta.

En una modalidad de la invención, para un vector de expresión el primero y segundo polipéptidos comprenden un par de cadenas de inmunoglobulina provenientes de un anticuerpo D2E7, EL246, ABT-007, ABT-325, o ABT-874. En una modalidad, el primero y segundo polipéptidos se seleccionan cada uno de manera independiente a partir de un segmento de la cadena pesada de inmunoglobulina o un segmento de la cadena ligera de inmunoglobulina proveniente de un segmento análogo de D2E7, EL246, ABT-007, ABT-325, ABT-874, u otro anticuerpo.

En una modalidad, un vector de expresión también comprende un elemento regulador de promotor para dicho inserto. En una modalidad, el elemento regulador del promotor es inducible o constitutivo. En una modalidad, el elemento regulador del promotor es específico de tejido. En una modalidad, el promotor comprende un promotor tardío mayor de adenovirus.

En una modalidad, la invención provee una célula hospedera que comprende un vector descrito en la presente solicitud. En una modalidad, la célula hospedera es una célula procariota. En una modalidad, la célula hospedera es Escherichia coli. En una modalidad, la célula hospedera es una célula eucariota. En una modalidad, la célula eucariota se selecciona a partir del grupo que consiste de una célula protista, célula animal, célula vegetal, y célula fúngica. En una modalidad, la célula eucariota es una célula animal que se selecciona a partir del grupo que consiste de una célula de mamífero, una célula aviar, y una célula de insecto. En una modalidad, la célula hospedera es una línea de célula de mamífero. En una modalidad, la célula hospedera es una célula CHO o una célula CHO deficiente en dihidrofolato reductasa. En una modalidad, la célula hospedera es una célula HEK (riñon embrionario de humano) o una célula de riñon de mono verde africano, por ejemplo, una célula COS. En una modalidad, la célula hospedera es una célula de levadura. En una modalidad, la célula de levadura es Saccharomyces cerevisiae. En una modalidad, la célula hospedera es una célula de insecto Spodoptera frugiperda Sf9.

En una modalidad, la invención provee un método para producir una poli-proteína recombinante o una pluralidad de proteínas, que comprende cultivar una célula hospedera en un medio de cultivo bajo condiciones suficientes para permitir la expresión de una proteína de vector. En una modalidad, el método comprende también recuperar y/o purificar dicha proteína de vector. En una modalidad de un método de producción, la pluralidad de proteínas son capaces de ensamblado multimérico. En una modalidad, la poli-proteína recombinante o pluralidad de proteínas son biológicamente funcionales y/o terapéuticas.

En una modalidad, la invención provee un método para producir un producto recombinante, en la cual el producto es una proteína de inmunoglobulina o fragmento funcional de la misma, anticuerpo ensamblado, u otra molécula de reconocimiento de antígeno, que comprende cultivar una célula hospedera en un medio de cultivo bajo condiciones suficientes para producir el producto recombinante. En una modalidad, la invención provee una proteína o poliproteína que se produce de conformidad con un método descrito en la presente solicitud. En modalidad, la invención provee una inmunoglobulina ensamblada; otra molécula de reconocimiento de antígeno ensamblada; o cadena de inmunoglobulina individual o fragmento funcional de la misma que se produce de conformidad con un método en la presente solicitud. En una modalidad, con respecto a la inmunoglobulina; otra molécula de reconocimiento de antígeno; o cadena de inmunoglobulina individual o fragmento funcional de la misma, existe una capacidad para efectuar o contribuir a que el antígeno específico (en el cual un antígeno puede ser un ligando o contra-receptor, etc.) se una al factor a de necrosis tumoral, receptor de eritropoyetina, RSV, ELJselectina, interleucina-1 , interleucina-12, ¡nterleucina-13, ¡nterleucina 17, interleucina-18, interleucina-23, interleucina-33, CD81, CD19, IGF1, IGF2, EGFR, CXCL-13, GLP-1 R, prostaglandina E2 o amiloide beta. En una modalidad, la inmunoglobulina o fragmento funcional de la misma es la inmunoglobulina D2E7 o ABT-874 o el fragmento funcional es un fragmento respectivamente de las mismas.

En una modalidad, la invención provee una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad, la invención provee un vector de expresión como el descrito en la presente solicitud que comprende también una secuencia de ácido nucleico que codifica para una marca. En una modalidad de una construcción de vector, la secuencia de ácido nucleico de intercalado adicionalmente codifica para una marca.

En una modalidad, el primero y dicho segundo polipéptidos comprenden un anticuerpo funcional u otra molécula de reconocimiento de antígeno; con una especificidad de antígeno dirigida a la unión de un antígeno que se selecciona a partir del grupo que consiste de: factor a de necrosis tumoral, receptor de eritropoyetina, RSV, EL/selectina, interleucina-1, interleucina-12, interleucina-13, interleucina-17, interleucina-18, interleucina-23, interleucina-33, CD81, CD19, IGF1, IGF2, EGFR, CXCL-13, GLP-1 R, prostaglandina E2, y amiloide beta. En una modalidad, el primero y segundo polipéptidos comprenden un par de cadenas de inmunoglobulina provenientes de un anticuerpo D2E7, EL246, ABT-007, ABT-325, o ABT-874. En una modalidad, el primero y segundo polipéptidos se seleccionan cada uno de manera independiente a partir de un segmento de la cadena pesada de inmunoglobulina o un segmento de la cadena ligera de inmunoglobulina proveniente de un segmento análogo de D2E7, EL246, ABT-007, ABT-325, ABT-874, u otro anticuerpo.

En una modalidad, un vector también comprende un elemento regulador de promotor para dicho inserto de sORF. En una modalidad, dicho elemento regulador de promotor es inducible o constitutivo. En una modalidad, dicho elemento regulador de promotor es específico de tejido. En una modalidad, dicho promotor comprende un promotor tardío mayor de adenovirus.

En una modalidad, un vector también comprende un ácido nucleico que codifica para una proteasa que puede cortar dicho primer sitio de corte de proteína. En una modalidad, dicho ácido nucleico que codifica para una proteasa está posicionado de manera operable dentro de dicho inserto de sORF; dicho vector de expresión comprende también un ácido nucleico adicional que codifica para un segundo sitio de corte localizado entre dicho ácido nucleico que codifica para una proteasa y por lo menos uno de dicho primer ácido nucleico y dicho segundo ácido nucleico.

En una modalidad, la invención provee una célula hospedera que comprende un vector descrito en la presente solicitud.

En una modalidad, la célula hospedera es una célula procariota. En una modalidad, dicha célula hospedera es Escherichia coli. En una modalidad, dicha célula hospedera es una célula eucariota. En una modalidad, dicha célula eucariota se selecciona a partir del grupo que consiste de una célula protista, célula animal, célula vegetal y célula fúngica. En una modalidad, dicha célula eucariota es una célula animal que se selecciona a partir del grupo que consiste de una célula de mamífero, una célula aviar, y una célula de insecto. En una modalidad preferida, dicha célula hospedera es una célula CHO o una célula CHO deficiente en dihidrofolato reductasa. En una modalidad, dicha célula hospedera es una célula COS. En una modalidad, dicha célula hospedera es una célula de levadura. En una modalidad, dicha célula de levadura es Saccharomyces cerevisiae. En una modalidad, dicha célula hospedera es una célula Sf9 del insecto Spodoptera frugiperda. En una modalidad, dicha célula hospedera es una célula de riñón embrionario de humano.

En una modalidad, la invención provee un método para producir una poli-proteína recombinante o una pluralidad de proteínas, que comprende cultivar una célula hospedera en un medio de cultivo bajo condiciones suficientes para permitir la expresión de una proteína de vector. En una modalidad, el método comprende también recuperar y/o purificar dicha proteína de vector. En una modalidad, dicha pluralidad de proteínas son capaces de ensamblado multimérico. En una modalidad, la poli-proteína recombinante o pluralidad de proteínas son biológicamente funcionales y/o terapéuticas.

En una modalidad, la invención provee un método para producir una proteína de inmunoglobulina o fragmento funcional de la misma, anticuerpo ensamblado, u otra molécula de reconocimiento de antígeno, que comprende cultivar una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 38 en un medio de cultivo bajo condiciones suficientes para producir una proteína de inmunoglobulina o fragmento funcional de la misma, anticuerpo ensamblado, u otra molécula de reconocimiento de antígeno.

En una modalidad, la invención provee una proteína o poliproteína que se produce de conformidad con un método en la presente solicitud. En una modalidad, la invención provee una inmunoglobulina ensamblada; otra molécula de reconocimiento de antígeno ensamblada; o cadena de inmunoglobulina individual o fragmento funcional de la misma que se produce de conformidad con los métodos en la presente solicitud. En una modalidad, la inmunoglobulina; otra molécula de reconocimiento de antígeno; o cadena de inmunoglobulina individual o fragmento funcional de la misma tiene una capacidad para efectuar o para contribuir para la unión a antígeno específica al factor a de necrosis tumoral, receptor de eritropoyetina, interleucina-18, EL/selectina o interleucina-12. En una modalidad, la inmunoglobulina es D2E7 o en la cual el fragmento funcional es un fragmento de D2E7.

En una modalidad, la invención provee un vector de expresión, célula hospedera con el vector, producto de expresión del vector, composición farmacéutica, y/o método para elaborar o utilizar cualquiera de los anteriores, en la cual el vector es el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y comprende además un segmento que codifica para un péptido de señal de la cadena ligera. En una modalidad, el péptido de señal de la cadena ligera codificado es un péptido de señal de la cadena ligera kappa que se selecciona a partir del grupo que consiste de A17, A18, A19, A26, y H2G. En una modalidad, el péptido de señal de la cadena ligera codificado es el péptido de señal de la cadena ligera kappa VKII, A18, SEQ ID NO:82 (secuencia de aminoácido MRLPAQLLGLLMLWIPGSSA).

En una modalidad, se aisla o purifica una composición de la invención.

En una modalidad, una composición de la invención es un compuesto de péptido. En una modalidad, una composición de la invención es un compuesto de ácido nucleico. En una modalidad, un compuesto de péptido de la invención se ensambla en un complejo multimérico con el péptido o por lo menos algún otro péptido.

En una modalidad, la invención provee una formulación farmacéutica que comprende una composición de la invención. En una modalidad, la invención provee un método para sintetizar una composición de la invención o una formulación farmacéutica de la misma. En una modalidad, una formulación farmacéutica comprende uno o más excipientes, vehículos, y/u otros componentes como se podría entender en la técnica. En una modalidad, una cantidad efectiva de u na composición de la invención puede ser u na cantidad terapéuticamente efectiva .

En una modalidad , una composición de péptido de la invención se prepara utilizando metodolog ía recombinante o técnicas de s íntesis. En una modalidad , u na composición de ácido nucleico de la invención se prepara utilizando metodolog ía recombinante o técnicas de síntesis .

En modalidades, la invención provee métodos de uso en la fabricación de un medicamento.

Otros aspectos, características y ventajas de modalidades de la invención son evidentes a partir de la siguiente descripción cuando se toma en conj u nto con la figura de acompañantes y en el contexto del campo de la técnica .

En general los términos y frases utilizados en la presente solicitud tienen sus sig nificados reconocidos en la técn ica , los cuales se pueden encontrar mediante referencia a textos normales, referencia en publicaciones periód icas y contextos conocidos por los expertos en la técnica . Las definiciones provistas en la presente solicitud pretenden clarificar su uso específico en el contexto de las modalidades de la invención.

Sin estar limitado a n ingu na teoría particular, en la presente invención puede haber discusión de creencias o entend imiento de los principios o mecanismos subyacentes referentes a la invención . Se reconoce que independientemente de la precisión final de cualq uier explicación o hipótesis , u na modalidad puede no obstante ser operativa y útil.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 ilustra un diagrama esquemático de una construcción de expresión de sORF, pTT3 pab Ion HL (-).

La Figura 2 ilustra estructuras de los componentes de sORF en construcciones de expresión para el anticuerpo D2E7.

Las Figuras 3A y 3B ilustran los resultados de una SDS-PAGE para análisis de proteína de productos de expresión de sORF. Las moléculas de IgG secretadas se purifican mediante cromatografía de afinidad de Proteína A y se separan mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras (Figura 3A) y reductoras (Figura 3B). Los carriles y muestras de izquierda a derecha son: (Carril 1) marcadores de referencia de PM; (2) producto de construcción de control; (3) Pab-lon mut A1; (4) Pab-lon mut A2; (5) pTT3 pfu Ion YP, y (6) pTT3 pfu Ion MA.

Las Figuras 4A y 4B ilustran los resultados de una SDS-PAGE para análisis de proteína de productos de expresión de sORF adicionales. Las IgGs secretadas se purifican mediante cromatografía de afinidad de Proteína A y se separan mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras (Figura 4A) y reductoras (Figura 4B). Los carriles y muestras de izquierda a derecha son: (Carril 1) marcadores de PM; (2) control; (3) pTT3 pfu Ion HL(-); y (4) pTT3 pfu Ion MutA.

Las Figuras 5A-5D ilustran el análisis de anticuerpo secretado producido a partir de construcciones de sORF utilizando las inteínas klbA. Los productos de IgG secretados a partir de las construcciones Pab-klbA HL(-) y Mja-klbA HL(-) se purifican mediante cromatografía de afinidad de Proteína A y se separan mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras (Figueas 5A, 5B, y 5C) y condiciones no reductoras (figura 5D). Las figuras 5A y 5D representan imágenes de geles teñidos; la Figura 5B es un inmunoblot utilizando un anticuerpo contra Fe de lgG1 de humano; y la Figura 5C es un inmunoblot utilizando un anticuerpo contra la cadena ligera kappa de humano. Los carriles y muestras de izquierda a derecha son: (Carril 1) control; (2) Pab-klbA HL(-); y (3) Mja-klbA HL(-). El control es el mismo anticuerpo que se produce a partir de la expresión de dos marcos de lectura abiertos separados.

Las Figuras 6A y 6B ilustran los resultados de la expresión de construcciones de marco de lectura abierto individual utilizando la inteína Pab klbA con modificaciones a los residuos de aminoácido en la unión de empalme N-terminal. Las proteínas de IgG secretadas se purifican mediante cromatografía de afinidad de Proteína A y se separan mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras (Figura 6A) y reductoras (Figura 6B). Los carriles y muestras de izquierda a derecha son: (Carril 1) marcadores de PM; (2) el mismo anticuerpo que se produce utilizando vector convencional (control); (3) pTT3 Pab klba HL(-)wt; (4) pTT3 Pab klba HL(-)GC; y (5) pTT3 Pab klba HL(-)KC.

La Figura 7 ilustra un diagrama esquemático de una construcción de expresión de sORF, pA1 90-Pab-lon H L(-), la cual está adaptada pa ra uso como un vector de expresión estable en u n sistema de l ínea celular C HO .

La Figura 8 ilustra los resultados del tiempo y frecuencia de alcanza r la confluencia de cultivo para sistemas de expresión estables de clones de transfección de construcción de sORF (construcciones Pab Ion de sORF).

La Figura 9 ilustra diagramas esquemáticos de estructuras para componentes de sO RF de construcciones de expresión transitoria con mutaciones de la unión de la cadena ligera. Las series de construcciones se designan "M 1 -X" (primera línea) y D2-X" (seg unda l ínea) en las cuales X indica cualq uier aminoácido.

La Fig ura 1 0 ilustra los resultados de la secreción de I g G para u na serie de construcciones de sORF con mutaciones de la unión de la cadena ligera basados en la variación del residuo Metí .

La Figura 1 1 ilustra los resu ltados de la secreción de IgG para una serie de construcciones de sO RF con mutaciones de la unión de la cadena ligera basados en la variación del resid uo Asp2.

La Figura 1 2 ilustra los resultados del análisis SDS-PAGE para productos de proteína provenientes de los ejemplos de cada u na de las series de construcciones de Metí y Asp2 con mutaciones de la unión de cadena ligera .

La Fig ura 1 3 ilustra diagramas esq uemáticos de estructu ras para componentes de sORF de construcciones de expresión transitoria que son capaces de expresar el anticuerpo ABT- 874.

La Figura 14 ilustra ciertos motivos estructurales de inteínas en el contexto de la ubicación de una ubicación preferida (la flecha punteada apuntando cerca de la unión de los segmentos H y F, hacia el final del dominio de endonucleasa) de un asa accesible a solvente para la introducción de injertos incluyendo marcas.

La Figura 15 ¡lustra un mapa de plásmido de una construcción de expresión con el péptido de señal A18 de la cadena ligera para uso en un sistema de transfección transitoria de células HEK293.

La Figura 16 ilustra los resultados del análisis SDS-PAGE de productos de construcciones de expresión de anticuerpo.

La Figura 17 ilustra los resultados del análisis Western blot de productos de construcciones de expresión de anticuerpo a partir de líneas de célula transfectada incluyendo células HEK293 transfectadas de manera transitoria y células CHO transfectadas de manera estable.

La Figura 18 ilustra un mapa de plásmido de una construcción de expresión con el péptido de señal A18 de la cadena ligera para uso en un sistema de transfección estable de células CHO.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se puede entender adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

Cierta información será apreciada mediante descripción en la técnica, incluyendo aquella de conformidad con el documento US 20070065912 de Carson et al., 22 de marzo de 2007.

La presente invención provee sistemas, por ejemplo, construcciones y métodos, para expresión de una estructura de compuesto o una proteína biológicamente activa tal como una enzima, hormona (por ejemplo, insulina), citocina, quimiocina, receptor, anticuerpo, u otra molécula. De preferencia, la proteína es una proteína inmunomoduladora tal como una interleucina, una inmunoglobulina de longitud completa, fragmento de la misma, otra molécula de reconocimiento de antígeno como se entiende en la técnica, u otra molécula bioterapéutica. Una vista general de dichos sistemas está en el contexto específico de una molécula de inmunoglobulina en el cual la producción recombinante se basa en la expresión de secuencias que codifican para la cadena pesada y la cadena ligera bajo el control de transcripción de un promotor individual, en la cual la conversión de un producto de traducción individual (poli-proteína) a las cadenas pesada y ligera separadas es mediada por un componente de inteína.

En una modalidad, cualquiera de la primera o la segunda cadena de la molécula de poli-proteína de inmunoglobulina puede ser una cadena pesada o una cadena ligera. Una secuencia que codifica para un segmento de inmunoglobulina recombinante puede ser una secuencia codificadora de longitud completa o un fragmento de la misma. En una modalidad específica, una segunda secuencia que codifica para la cadena ligera debe ser parte de la secuencia que codifica para la poli-proteina que será procesada en la práctica de la presente invención; es decir, tomados juntos hay tres segmentos que comprenden dos cadenas ligeras y una cadena pesada, en cualquier orden. En modalidades particulares, las construcciones están configuradas con estos componentes y en este orden: a) IgH-lgL; b) IgL-lgH; c) IgH-IgL-lgL; d) IgL-IgH-lgL; e) IgL-IgL-lgH; f) IgH-IgH-lgL; g) IgH-IgL-lgH; y/o h) IgL-IgH-IgH. En una modalidad, el guión puede indicar la ubicación en donde está localizada una secuencia de sitio de corte.

De manera alternativa, las secuencias que codifican para la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina están fusionadas en marco a una secuencia que codifica para inteína entre las mismas, en el que la inteína puede ser capaz de manera natural o modificada de modo tal que carezca de actividad de empalme o los extremos terminales de las cadenas pesada y ligera están diseñadas de modo tal que no ocurra el empalme son de modo tal que el empalme ocurra con muy poca eficiencia de modo tal que predominen las moléculas de anticuerpo no empalmadas. Además, una inteína modificada se puede modificar adicionalmente todavía más de modo tal que no exista región de endonucleasa (en donde previamente existió una región de endonucleasa), con la condición que permanezca la actividad de corte proteolítico específico de sitio de modo tal que los polipéptidos de anticuerpo pesado y ligero se liberen de la porción de inteína de intercalado del producto de traducción primario. Cualquiera del polipéptido de anticuerpo ligero o el polipéptido de anticuerpo pesado puede ser la N-exteína, y cualquiera puede ser la C-exteína .

El vector puede ser cualq u ier vector recombinante con capacidad de expresión de una poli-proteína de longitud completa , por ejemplo, un vector de virus adeno-asociado (AAV) , u n vector de lentivirus, u n vector de retrovirus, un vector de adenovirus competente en cuanto a replicación, un vector de adenovirus deficiente en cuanto a replicación y u n vector de adenovirus carente de todos los genes virales (g utless) , un vector de virus del herpes o u n vector no viral (plásmido) o cualq uier otro vector conocido en la técnica, con la elección del vector apropiado para la célula hospedera en la cual se expresan la inmunoglobulina u otra(s) proteína(s) . Los vectores de baculovirus están disponibles para expresión de genes en células de insecto. En la técnica se conocen numerosos vectores, y muchos se pueden conseg u ir comercialmente o de alg una otra manera son fácilmente accesibles en la técn ica .

Secuencias reguladoras incluyendo promotores: células hospederas Un vector para la expresión de inmunoglobu lina u otra proteína recombinante puede inclu ir cualquiera de un número de promotores conocidos en la técnica , en el cual el promotor es constitutivo, reg ulable o inducible , específico del tipo celular, específico de tejido, o específico de especie. Ejemplos específicos adicionales incluyen, por ejemplo, promotores que respondan a tetraciclina (Gossen M, Bujard H, Proc Nati Acad Sci U S A. 1992, 15;89(12):5547-51 ). El vector es un replicón adaptado a la célula hospedera en la cual se va a expresar el gen quimérico, y éste también, de manera deseable, comprende además un replicón funcional en una célula bacteriana, de manera conveniente, Escherichia coli, una célula conveniente para manipulaciones biológicas moleculares.

La célula hospedera para expresión de gen puede ser, sin limitación, una célula animal, especialmente una célula de mamífero, o ésta puede ser una célula microbiana (bacteria, levadura, hongo, pero de preferencia eucariota) o una célula vegetal. Las células hospederas particularmente apropiadas incluyen células cultivadas de insecto tales como las células de Spodoptera frugiperda, células de levadura tales como Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris, hongos tales como Trichoderma reesei, Aspergillus, Aureobasidum y especies de Penicillium así como células de mamífero tales como las células CHO (ovario de hámster chino), BHK (riñón de hámster bebé), COS, 293, 3T3 (ratón), Vera (mono verde africano) y también se pueden utilizar varios sistemas de animal transgénico, incluyendo sin limitación, cerdos, ratones, ratas, ovejas, cabra, vacas. Son conocidos los sistemas de pollo para expresión en clara de huevo y los sistemas de ovejas, cabras y vacas transgénicas para expresión en leche, entre otros. Los vectores de baculovirus, especialmente AcNPV, se pueden utilizar para la expresión y corte del anticuerpo de ORF individual de la presente invención, por ejemplo con expresión del sORF bajo el control regulador de un promotor de polihedrina u otro promotor fuerte en una línea de célula de insecto; dichos vectores y líneas celulares son bien conocidas en la técnica y se pueden conseguir comercialmente. Los promotores utilizados en células de mamífero pueden ser constitutivos (promotor TK del virus del Herpes, McKnight, Cell 31:355, 1982; promotor temprano de SV40, Benoist et al. Nature 290:304, 1981 promotor del virus de sarcoma de Rous, Gorman et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79:6777, 1982; promotor de citomegalovirus, Foecking et al. Gene 45:101, 1980; promotor del virus de tumor mamario de ratón, véase en general Etcheverry en Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland et al., eds, pp.162-181, Wiley & Sons, 1996) o regulados (promotor de metalotioneína, Hamer et al. J. Molec. Appl. Genet. 1:273, 1982, por ejemplo). Los vectores se pueden basar en virus que infectan células de mamífero particulares, en especial retrovirus, vaccinia y adenoviruses y sus derivados son conocidos en la técnica y se pueden conseguir comercialmente. Los promotores incluyen sin limitación, los promotores de citomegalovirus, tardío de adenovirus, y el 7.5K de vaccinia. Los vectores de levadura y fúngicos (véase, por ejemplo, Van den Handel, C. et al. (1991) en: Bennett, J.W. y Lasure, L.L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academy Press, Inc., New York, 397-428) y promotores también son bien conocidos y ampliamente disponibles. La enolasa es un promotor de levadura constitutivo bien conocido, y la alcohol deshidrogenasa es un promotor regulado bien conocido.

La selección de los promotores específicos , secuencias de terminación de transcripción y otras secuencias opcionales, tales como las secuencias que codifican para secuencias específicas de tejido , será determinada en g ran parte por el tipo de célula en la cual se desea la expresión . Las pueden ser células bacterianas, de levad ura , fúngicas , de mamífero, de i nsecto, de pollo o otras células animales.

Secuencias de señal La secuencia codificadora de la proteína que se va a cortar, procesar proteolíticamente o auto-procesar, la cual está incorporada en el vector, puede comprender adicionalmente u na o más secuencias q ue codifican para una o más secuencias de señal. Estas secuencias de señal codificadas pueden estar asociadas con uno o más de los segmentos madu ros dentro de la poli-proteína . Por ejemplo, la secuencia q ue codifica para la secuencia l íder de la cadena pesada de inmunoglobulina puede preceder a la secuencia que codifica para la cadena pesada, ligada en forma operable y en marco con el resto de la secuencia cod ificadora de la poli-proteína. De manera similar, una secuencia que cod ifica para el péptido líder de la cadena ligera u otra secuencia cod ificadora del péptido líder puede estar asociada en marco con u na o ambas de las secuencias que cod ifican para la cadena ligera de inmu noglobulina, en la que la cadena-secuencia l íder está separada por la cadena adyacente de cualquiera de un sitio de auto-procesamiento (tal como 2A) o por una secuencia que codifica para una secuencia de reconocimiento de proteasa, manteniéndose el marco de lectura apropiado.

Estequiometria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina En muchas modalidades en la presente solicitud, las cadenas ligeras, ( I g L) y las cadenas pesadas (IgH) de la inmunoglobulina/anticuerpo están presentes a un nivel de vector o a un nivel intracelular expresado dentro de una célula hospedera a una relación de aproximadamente 1:1 (IgL: IgH) . Mientras que las estrategias recombinantes en la presente solicitud y en cualquier otra parte se han basado en la expresión equimolar de las cadenas pesada y ligera (véase, por ejemplo, Publicación de patente E.U.A. 2005/0003482A1 o la Publicación Internacional WO2004/1 13493), en otras modalidades la presente invención provee métodos y cassettes de expresión y vectores con secuencias que codifican para la cadena ligera y pesada en una relación de 2:1 y co-expresadas con auto-procesamiento o procesamiento proteolítico de las cadenas cuando el producto de traducción primario es una poli-proteína. En modalidades, la relación es mayor de 1:1, tal como aproximadamente 2:1 o mayor de 2:1. En una modalidad particular, se utiliza una secuencia que codifica para la cadena ligera a una relación mayor de 1:1 (IgL: IgH) . En una modalidad específica, la relación de lgl_:lgH es 2:1. Por lo tanto en modalidades, las ventajas ofrecidas por una tecnolog ía de expresión de anticuerpos de sO RF incluyen la capacidad para manipular las relaciones de dosificación de gen para las cadenas pesada y ligera , la proximidad de los polipéptidos de la cadena pesada y ligera para ensamblado de subu nidades múltiples en el ER , y el potencial para la secreción de proteínas con alta eficiencia .

La invención también provee células hospederas o clones estables de células hospederas transformadas o infectadas con u n vector que comprende u na secuencia que cod ifica para u na cadena pesada y ya sea u na o por lo menos dos cadenas ligeras de u na inmunoglobulina (es decir, un anticuerpo); secuencias que codifican para sitios de corte , tales como sitios de reconocimiento de proteasa , autoprocesadores o péptidos de señal entre los mismos; y también puede comprender una secuencia o secuencias que codifican para un sitio de corte proteolítico adicional . En el alcance de la invención también está i nclu ido el uso de dichas células o clones en la generación de inmunoglobulinas recombinantes de longitud completa o fragmentos de las mismas u otras proteínas biológicamente activas las cuales están constituidas por subu nidades múltiples (por ejemplo, moléculas de dos cadenas o de cadenas múltiples o a aquellas q ue en la Natu raleza se producen como u na pro-proteína y se cortan o procesan para liberar u na proteína derivada de precursor y la porción activa) . Los ejemplos no limitativos incluyen insulina , interleucina-1 8, interleucina-1 , proteína 4 morfogén ica de h ueso, proteína 2 morfogénica de hueso, cualesquiera otras dos proteínas morfogénicas de hueso de dos cadenas, factor de crecimiento de nervio, renina , quimiotripsina , factor de crecimiento transformante ß, e interleucina 1 ß.

En u n aspecto relacionado , la invención provee u na molécu la de in munoglobulina recombi nante o fragmento de la misma u otra proteína prod ucida por d icha célula o clones, en el cual la inmunoglobu lina comprende aminoácidos derivados a partir de un sitio de corte auto-procesador (tal como un dominio de inte ína o dominio hedgehog) , sitio de corte o corte de péptido de señal y métodos, vectores y célu las hospederas para producirlos . En modalidades, la invención provee célu las hospederas que contienen una o más construcciones como las descritas en la presente solicitud .

La presente invención provee construcciones de vector individual para la expresión de una molécula de inmunog lobulina o fragmento de la misma y métodos para uso in vitro o in vivo de la misma . Los vectores tienen secuencias auto-procesadoras u otras secuencias de reconocimiento de proteasa entre una primera y u na segunda y entre u na segu nda y una tercera secuencia codificadora de inmunoglobulina, lo que permite la expresión de una molécula de anticuerpo funcional utilizando un promotor y transcrito individ uales. Los ejemplos de construcciones de vector comprenden u na secuencia que codifica para un sitio de corte auto-procesador entre ma rcos de lectu ra abiertos y también pueden comprender un sitio de corte proteol ítico adicional adyacente al sitio de corte auto-procesador para remoción de los aminoácidos que constituyen el sitio de corte auto- procesador después del corte. Las construcciones de vector encuentran utilidad en métodos relacionados con la producción incrementada de inmunoglobulinas de longitud completa biológicamente activas o fragmentos de las mismas in vitro e in vivo. Se pueden elaborar otras proteínas biológicamente activas con por lo menos dos cadenas diferentes utilizando la misma estrategia, aunque se entiende que podría no ser necesario que cualquier secuencia codificadora de la cadena esté presente en una relación mayor de 1 con relación a la otra secuencia codificadora de la cadena.

Aunque en la presente solicitud se ejemplifican composiciones y métodos particulares, se entiende que cualquiera de un número de composiciones y métodos alternativos son aplicables y apropiados para uso en la práctica de la invención. También se entenderá que se puede efectuar una evaluación del cassette de expresión de poliproteína y los vectores, células hospederas y métodos de la invención utilizando procedimientos estándar en la técnica. La práctica de la presente invención utiliza, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, bioquímica e inmunología, las cuales están dentro del alcance de los expertos en la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura, tales como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1993); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullís et al., eds., 1994); y Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991), cada una de las cuales se incorpora expresamente para referencia en la presente solicitud.

A menos que se indique de otra manera, todos los términos utilizados en la presente solicitud tienen los mismos significados que los que tendrían para el experto en la técnica y la práctica de la presente invención emplea técnicas convencionales de microbiología y tecnología de ADN recombinante, las cuales están dentro del conocimiento de los expertos en la técnica.

El término "modificado" como se utiliza generalmente en la presente solicitud en el contexto de una proteína se refiere a un segmento en el cual por lo menos un residuo de aminoácido está sustituido en, suprimido de, o adicionado a, la molécula referida. De manera similar, en el contexto de un ácido nucleico el término se refiere a un segmento en el cual por lo menos una subunidad de ácido nucleico está sustituido en, suprimida de, o adicionado a, la molécula a la que se hace referencia.

El término "inteína" tal como se utiliza en la presente solicitud típicamente se refiere a un segmento interno de una proteína que facilita su propia remoción y efectúa la unión de los segmentos de flanqueo conocidos como exteínas. Muchos ejemplos de inteínas están reconocidos en una variedad de tipos de organismos, en algunos casos con características estructurales y/o funcionales compartidas. La invención es ampliamente capaz de utilizar inteínas, y variantes de las mismas, como las apreciadas que existen y que posteriormente serán reconocidas o descubiertas. Véase, por ejemplo, Gogarten JP et al., 2002, Annu Rev Microbiol. 2002;56:263-87; Perler, F. B. (2002), InBase, the Intein Datábase. Nucleic Acids Res. 30, 383-384 (además a través de la Internet en el sitio en la red de New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA; http://www.neb.com/neb/inteins.html; Amitai G, et al., Mol Microbiol. 2003, 47(1):61-73; Gorbalenya AE, Nucleic Acids Res. 1998; 26(7): 1741-1748. Non-canonical inteins). Se entenderá que en una proteína una unidad que contiene inteína o unidad de empalme de inteína abarca porciones de las exteínas de flanqueo en las cuales los aspectos estructurales pueden contribuir a reacciones de corte, ligación, etc. El término también se puede entender como una categoría al referirse a un sistema basado en inteína con un componente de "inteína modificada".

El término "inteína modificada" tal como se utiliza en la presente solicitud se puede referir a una inteína sintética o una inteína natural en las cuales por lo menos un residuo de aminoácido está sustituido en, suprimido de, o adicionado a, la unidad de empalme de inteína de modo tal que las exteínas cortadas o escindidas no son completamente ligadas por la inteína.

El término "vector", tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a u na molécula de ADN o AR N tal como u n plásmido, virus u otro veh ículo, el cual contiene u na o más secuencias de ADN heterólogo o recombinante y está diseñado para transferencia entre diferentes células hospederas. Los términos "vector de expresión" y "vector para terapia de gen" se refieren a cualquier vector q ue es efectivo para incorporar y expresar fragmentos de ADN heterólogo en u na célula . U n vector de clonación o expresión puede comprender elementos adicionales , por ejemplo, el vector de expresión puede tener dos sistemas de replicación , permitiendo de esta manera q ue éste se mantenga en dos organismos, por ejemplo en células de h umano para expresión y en un hospedero procariota para clonación y amplificación . Se puede utilizar cualq u ier vector apropiado que sea efectivo para la introd ucción de ácidos nucleicos al interior de las células de modo tal que resulte la expresión de la proteína o polipéptido, por ejemplo u n vector viral o un vector de plásmido no viral . En la práctica de la invención son útiles cualesquiera células efectivas para expresión , por ejemplo, células de insecto y célu las eucariotas tales como células de levadu ra o mam ífero.

Los términos "ADN heterólogo" y "ARN heterólogo" se refieren a n ucleótidos que no son endógenos (originales) para la célula o parte del genoma o vector en el cual éstos están presentes. En términos generales el ADN o ARN heterólogo se agrega a u na célula mediante transducción , infección , transfección , transformación , electroporación , transformación biol ística o similares. Dichos nucleótidos generalmente incluyen por lo menos una secuencia codificadora , pero la secuencia codificadora no necesita ser expresada. El término "ADN heterólogo" se puede referir a u na "secuencia codificadora heteróloga" o un "transgen".

Tal como se utiliza en la presente solicitud , los términos "proteína" y "polipéptido" se pueden uti lizar de manera intercambiable y típicamente se refieren a "proteínas" y "polipéptidos" de interés q ue son expresados utilizando los vectores q ue contienen sitio de corte auto-procesador de la presente i nvención . Dichas "proteínas" y "polipéptidos" pueden ser cualquier proteína o polipéptido útil para propósitos de investigación , de diagnósticos o terapéuticos, como se describe con más detalle más adelante . Tal como se utiliza en la presente solicitud , una poli-proteína es u na proteína que está destinada para procesamiento para producir dos o más productos de polipéptido.

Tal como se utiliza en la presente solicitud , el término "multímero" se refiere a una proteína constituida por dos o más cadenas de polipéptido (algu nas veces referidas como "subunidades") , las cuales se ensamblan para formar una proteína de función . Los multímeros pueden estar constituidos por dos (d ímeros), tres (trímeros) , cuatro (tetrámeros) , o más (por ejemplo, pentámeros, etc. ) cadenas de péptido . Los multímeros pueden resultar del auto-ensamblado, o podrían requerir u n componente tal como un catalizador para ayudar en el ensamblado . Los mu ltímeros pueden estar constitu idos únicamente por cadenas peptídicas idénticas (homo-multímeros) o dos o más cadenas de péptidos diferentes (hetero-multímeros). Dichos multímeros pueden ser estructuralmente o químicamente funcionales. Muchos multímeros son conocidos y utilizados en la técnica, incluyendo pero sin limitarse, a enzimas, hormonas, anticuerpos, citocinas, quimiocinas, y receptores. Por lo tanto, los multímeros pueden tener utilidad tanto biológica (por ejemplo farmacéutica) como industrial (por ejemplo, bioprocesamiento/bioproducción).

Tal como se utiliza en la presente solicitud, el término "marca" se refiere a un péptido, el cual puede estar incorporado en un vector de expresión que puede funcionar para permitir la detección y/o purificación de uno o más productos de expresión de los insertos de vector. Dichas marcas son bien conocidas en la técnica y pueden incluir un aminoácido radiomarcado o un enlazamiento de porciones biotinilo a un polipéptido las cuales se pueden detectar utilizando avidina marcada (por ejemplo estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede ser detectada utilizando métodos ópticos o colorimétricos). Marcas de afinidad tales como FLAG, glutatión-S-transferasa, protelna de unión a maltosa, dominio de unión a celulosa, tiorredoxina, NusA, mistina, dominio de unión a quitina, cutinasa, AGT, GFP y otras son ampliamente utilizadas tal como en sistemas de expresión y purificación de proteína. Ejemplos adicionales no limitativos de marcas para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: marca de histidina, radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo 3H, 14C, 35S 90Y, "Te, 11 ?, 125l, 131l, 177Lu, 166Ho, o 153Sm); marcas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fluoróforos a base de lantánido), marcas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano, luciferasa, fosfatasa alcalina); marcas quimioluminiscentes; grupos biotinilo; epítopes de polipéptido predeterminados reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias de par de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, marcas de epítope); y agentes magnéticos, tales como quelatos de gadolinio.

El término "defectuoso en la replicación" tal como se utiliza en la presente solicitud con relación a un vector de terapia de gen viral de la invención significa que el vector viral no puede replicar y empacar de manera adicional y en forma independiente su genoma. Por ejemplo, cuando una célula de un individuo se infecta con viriones de rAAV, el gen heterologo es expresado en las células infectadas, sin embargo, debido al hecho de que las células infectadas carecen de los genes rep y cap de AAV y los genes de función accesoria, el rAAV no puede replicarse.

Tal como se utiliza en la presente solicitud, un "vector de transferencia retroviral" se refiere a un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótido que codifica para un transgen y que comprende también secuencias de nucleótido necesarias para el empaquetamiento del vector. De preferencia, el vector de transferencia retroviral también comprende las secuencias necesarias para expresar el transgen en las células.

Tal como se utiliza en la presente solicitud, "sistema de empaquetamiento" se refiere a un conjunto de construcciones virales que comprenden genes que codifican para proteínas virales implicadas en el empaquetamiento de un virus recombinante. Típicamente, las construcciones del sistema de empaquetamiento finalmente se incorporan en una célula de empaquetamiento.

Tal como se utiliza en la presente solicitud, un sistema de vector lentiviral de "segunda generación" se refiere a un sistema de empaquetamiento lentiviral que carece de los genes accesorios funcionales, tales como uno a partir del cual los genes accesorios vif, vpr, vpu y nef, han sido suprimidos o inactivados. Véase, por ejemplo, Zufferey et al. 1997. Nat. Biotechnol. 15:871-875.

Tal como se utiliza en la presente solicitud, un sistema de vector lentiviral de "tercera generación" se refiere a un sistema de empaquetamiento lentiviral que tiene las características de un sistema de vector de segunda generación, y que carece además de un gen tat funcional, tal como uno a partir del cual el gen tat se ha suprimido o inactivado. Típicamente el gen que codifica para rev se provee en una construcción de expresión separada. Véase, por ejemplo, Dull et al. 1998. J. Virol.72:8463-8471.

Tal como se utiliza en la presente solicitud con respecto a un virus o vector viral, "seudotipificado" se refiere al reemplazo de una proteína original de la envoltura del virus con una proteína heteróloga o funcionalmente modificada de la envoltura viral.

El término "ligado en forma operable" tal como se utiliza en la presente solicitud con relación a una construcción o vector de ADN recombinante significa que los componentes de nucleótido de la construcción o vector de ADN recombinante por lo general están unidos covalentemente entre sí. En términos generales, las secuencias de ADN "ligadas en forma operable" son contiguas, y, en el caso de una secuencia líder secretora, contigua y en el mismo marco de lectura. Sin embargo, los incrementadores no tienen que ser contiguos con las secuencias cuya expresión está regulada en forma positiva. El término es consistente con posicionado en forma operable.

Las secuencias de incrementador influyen en la expresión de gen dependiente de promotor y pueden estar localizadas en las regiones 5' o 3' del gen original. Los "incrementadores" son elementos que actúan en cis que estimulan o inhiben la transcripción de los genes adyacentes. Un incrementador que inhibe la transcripción también se denomina un "silenciador". Los incrementadores pueden funcionar (es decir, pueden estar asociados con una secuencia codificadora) en cualquier orientación, a través de distancias de hasta varios pares de kilobases (kb) desde la secuencia codificadora y desde una posición hacia el extremo 3' de una región transcrita. Además, las secuencias de abertura de aislador o cromatina, tales como las regiones de unión a matriz (Chung, Cell, 1993, Agosto 13;74(3):505-14, Frisch et al, Genome Research, 2001, 12:349-354, Kim et al, J. Biotech 107, 2004, 95-105) se pueden utilizar para incrementar la transcripción de cassettes de gen integ rado en forma estable.

Tal como se utiliza en la presente solicitud , el término "gen" o "secuencia codificadora" sign ifica la secuencia de ácido nucleico q ue es transcrita (ADN) y traducida (ARN m) como u n polipéptido in vitro o in vivo cuando está ligada en forma operable a secuencias reguladoras apropiadas. El gen puede o no incluir reg iones que precedan y q ue sigan a la región codificadora , por ejemplo secuencias 5' no trad ucidas (5' UTR) o secuencias "líder" y secuencias 3' UTR o "de cola" así como secuencias de intercalado (intrones) entre segmentos codificadores individuales (exones) .

U n "promotor" es una secuencia de ADN que dirige la unión de ARN polimerasa y de esta manera prom ueve la síntesis de ARN , es decir, una secuencia mínima suficiente pa ra dirigir la tra nscripción . Los promotores y la expresión de la proteína o polipéptido correspondiente pueden ser específicos del tipo celular, específicos de tejido, o específicos de especie. En las construcciones o vectores de ácido nucleico de la invención también están incluidas secuencias de incrementador las cueles pueden o no ser contiguas con la secuencia de promotor.

"Secuencias regu ladoras de transcripción", o secuencias de control de expresión , tal como se utilizan ampliamente en la presente solicitud incluyen u na secuencia de promotor y secuencias físicamente asociadas las cuales mod ulan o regulan la transcripción de una secuencia codificadora asociada, con frecuencia en respuesta a señales n utricionales o ambientales . Dichas secuencias asociadas pueden determinar la expresión específica de tejido o específica de célula, la respuesta a una señal ambiental, la unión de una proteína que incremente o disminuya la transcripción y similares. Un "promotor regulable" es cualquier promotor cuya actividad es afectada por un factor que actué en cis o en trans (por ejemplo, un promotor inducible, el cual es activado por una señal o agente externo).

Un "promotor constitutivo" es cualquier promotor que dirige la producción de ARN en muchos o en todos los tipos de tejidos/células en la mayoría de las veces, por ejemplo, la región de incrementador/promotor temprano inmediato de CMV de humano que promueve la expresión constitutiva de insertos de ADN clonados en células de mamífero.

Los términos "proteína reguladora de la transcripción", "factor regulador de la transcripción" y "factor de transcripción" se utilizan de manera intercambiable en la presente solicitud, y se refieren a una proteína del núcleo que se une a un elemento de respuesta al ADN y de esta manera regula desde el punto de vista de transcripción la expresión de un gen o genes asociados. Las proteínas reguladoras de la transcripción generalmente se unen directamente a un elemento de respuesta al ADN, sin embargo en algunos casos la unión al ADN puede ser indirecta por medio de la unión a otra proteína que a su vez se une a, o está unida a un elemento de respuesta al ADN.

Tal como se utilizan en la presente solicitud, los términos "inmunoglobulina" y "anticuerpos" se refieren a moléculas intactas así como a fragmentos de las mismas, tales como Fa, F(ab')2, y Fv, las cuales se pueden unir a un determinante antigénico de interés. Dicha "inmunoglobulina" y "anticuerpo" está constituido por dos cadenas de polipéptido ligeras idénticas de peso molecular de aproximadamente 23,000 daltons, y dos cadenas pesadas idénticas de peso molecular 53,000-70,000. Las cuatro cadenas están ligadas mediante puentes de disulfuro en una configuración de "Y". Las cadenas pesadas se clasifican como gamma (IgG), mu (IgM), alfa (IgA), delta (IgD) o épsilon (IgE) y son la base para las designaciones de clase de las inmunoglobulinas, lo cual determina la función efectora de un anticuerpo dado. Las cadenas ligeras se clasifican ya sea como kappa o lambda. Cuando en la presente solicitud se hace referencia a una "inmunoglobulina o fragmento de la misma", se entenderá que dicho "fragmento de la misma" es un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional, especialmente uno que se une a su ligando cognado con afinidad de por lo menos 10% de la de la inmunoglobulina intacta.

Un fragmento Fab de un anticuerpo es un fragmento de unión a antígeno monovalente de una molécula de anticuerpo. Un fragmento Fv es un fragmento genéticamente diseñado que contiene la región variable de una cadena ligera y las regiones variables de una cadena pesada expresadas como dos cadenas.

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a una molécula de anticuerpo en la cual uno o más aminoácidos han sido reemplazados en las regiones de no unión a antígeno con el fin de que se parezcan más cercanamente a un anticuerpo de humano, aunque aún siguen conservando la actividad de unión original del anticuerpo. Véase, por ejemplo, patente E.U.A. No.6,602,503.

El término "determinante antigénico", tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a aquel fragmento de una molécula (es decir, un epítope) que hace contacto con un anticuerpo particular. Numerosas regiones de una proteína o péptido o glucopéptido de una proteína o glucoproteína pueden inducir la producción de anticuerpos que se unan específicamente a una región o estructura tridimensional dada en la proteína. Estas regiones o estructuras son referidas como determinantes antigénicos o epítopes. Un determinante antigénico puede competir con el antígeno intacto (es decir el ¡nmunógeno utilizado para provocar la respuesta inmune) por la unión a un anticuerpo.

El término "fragmento" cuando se refiere a una proteína o polipéptido recombinante de la invención significa un péptido o polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que es la misma que una porción de, pero no de toda, la secuencia de aminoácido de la proteína o polipéptido de longitud completa correspondiente, que retiene por lo menos una de las funciones o actividades de la proteína o polipéptido de longitud completa correspondiente. El fragmento de preferencia incluye por lo menos 20-100 residuos de aminoácido contiguos del polipéptido o proteína de longitud completa.

Los términos "administrar" o "introducir", tal como se utilizan en la presente solicitud, significan suministrar la proteína (incluyendo inmunoglobulina) a un humano o animal en necesidad de lo mismo mediante cualquier vía conocida en la técnica. Los vehículos y formulaciones o composiciones farmacéuticas también son bien conocidos en la técnica. Las vías de administración pueden incluir intravenosa, intramuscular, intradérmica, subcutánea, transdérmica, en las mucosas, intratumoral o en las mucosas. De manera alternativa, estos términos se pueden referir al suministro de un vector para expresión de proteína recombinante a una célula o a células en cultivo y o a células u órganos de un individuo. Dicha administración o introducción puede tomar lugar, in vivo, in vitro o ex vivo. Un vector para expresión de proteína o polipéptido recombinante se puede introducir en una célula mediante transfección, lo cual típicamente significa la inserción de ADN heterólogo al interior de una célula mediante medios físicos (por ejemplo, transfección con fosfato de calcio, electroporación, microinyección o lipofección); infección, la cual típicamente se refiere a la introducción por medio de un agente infeccioso, es decir un virus; o transducción, lo cual típicamente significa la infección estable de una célula con un virus o la transferencia de material genético de un microorganismo a otro por medio de un agente viral (por ejemplo, un bacteriófago).

"Transformación" típicamente se utiliza para hacer referencia a bacterias que comprenden ADN heterólogo o células que expresan un oncogen y que por lo tanto han sido convertidas hacia un modo de crecimiento continuo, por ejemplo, células de tumor. Un vector utilizado para "transformar" una célula puede ser un plásmido virus u otro veh ículo.

Típicamente, u na célula es referida como "transducida", "infectada" , "transfectada" o "transformada" dependiendo de los medios utilizados para administración , introducción o inserción de ADN heterólogo (es decir, el vector) al interior de la célula. Los términos "transducido" , "transfectado", y "transformado" se pueden utilizar de manera intercambiable en la presente solicitud independientemente del método de introd ucción del ADN heterólogo.

Tal como se utilizan en la presente solicitud , los términos "transformado de manera estable" , "transfectado de manera estable" y "transgénico" se refieren a células que tienen una secuencia de ácido nucleico no original (heteróloga) integ rada dentro del genoma. La transfección estable se demuestra mediante el establecimiento de l íneas celu lares o clones constituidas por una población de células hija que contienen al ADN transfectado que se replica de ma nera estable por medio de integración en sus genomas o como un elemento episómico. En alg unos casos, la "transfección" no es estable, es decir, ésta es transitoria . En el caso de transfección transitoria, se expresa el ADN exógeno o heterólogo, sin embargo, la secuencia introducida no está integ rada en el genoma o la célula hospedera no se puede replicar.

Tal como se utiliza en la presente solicitud, "administración ex vivo" se refiere a un proced imiento en el cual se toman células primarias a pa rti r de u n individuo, se ad ministra un vector a las células para producir células transducidas, infectadas o transfectadas recombinantes y las células recombinantes se vuelven a administrar al mismo individuo o a un individuo diferente.

Un "transcrito multicistrónico" se refiere a una molécula de ARNm que contiene más de una región codificadora de proteína, o cistrón. Un ARNm que comprende dos regiones codificadoras se denomina un "transcrito bicistrónico". La región codificadora o cistrón "5'-proximal" es la región codificadora, cuyo codón de inicio de traducción (usualmente AUG) está muy cerca del extremo 5' de una molécula de ARNm multicistrónica. Una región codificadora o cistrón "5'-distal" es una cuyo codón de inicio de traducción (normalmente AUG) no es el codón de inicio más cercano al extremo 5' del ARNm.

Los términos "5'-distal" y "hacia el extremo 3'" se utilizan en forma sinónima para hacer referencia a regiones codificadoras que no están adyacentes al extremo 5' de una molécula de ARNm.

Tal como se utiliza en la presente solicitud, "cotranscrito" significa que dos (o más) marcos de lectura abiertos o regiones codificadoras o polinucleótidos están bajo control de transcripción de un elemento de control o regulador de transcripción individual que comprende un promotor.

El término "célula hospedera", tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a una célula que ha sido transducida, infectada, transfectada, o transformada con un vector. El vector puede ser un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son aquellas previamente utilizadas con la célu la hospedera seleccionada para expresión , y serán evidentes para los expertos en la técnica. Se apreciará que el término "célula hospedera" se refiere a la célu la original transd ucida , infectada, transfectada o transformada y a la progen ie de la misma .

Tal como se utiliza n en la presente solicitud , los términos "actividad biológica" y "biológicamente activo", se refieren a la actividad atribuida a una proteína particular en una línea celular en cultivo o en un sistema sin células , tal como una prueba de ligándoreceptor en placas ELI SA. La "actividad biológica" de una "inmunog lobulina" , "anticuerpo" o frag mento de los mismos se refiere a la capacidad pa ra liga r un determinante antigénico y de esta manera facilitar la función inmu nológica . La "actividad biológica" de una hormona o interleucina es como se conoce en la técnica.

Tal como se utilizan en la presente solicitud , los términos "tumor" y "cáncer" se refieren a una célula que exhibe por lo menos una pérdida parcial del control sobre el crecimiento y/o desarrollo normales . Por ejemplo, con frecuencia las célu las del tumor o cáncer generalmente tienen inhibición de contacto perd ida y podrían ser invasivas y/o tener la capacidad de presentar metástasis.

Los anticuerpos son proteínas de inmunoglobulina q ue son heterod ímeros de u na cadena pesada y una cadena ligera. U n anticuerpo típico es multimérico con dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras (o fragmentos funcionales de las mismas) q ue se asocian entre sí. Los anticuerpos pueden tener un orden polimérico adicional de estructura al ser diméricos, triméricos, tetraméricos, pentaméricos, etc., con frecuencia dependiente del isotipo. Estos han demostrado ser extremadamente difíciles de expresar en una forma de longitud completa a partir de un vector individual o a partir de dos vectores en sistemas de expresión de cultivo de mamífero. Actualmente se utilizan varios métodos para la producción de anticuerpos: inmunización in vivo de animales para producir anticuerpos "policlonales", cultivo celular in vitro de hibridomas de célula B para producir anticuerpos monoclonales (Kohler, et al. 1988. Eur. J. Immunol. 6:511; Antibidies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; incorporados para referencia en la presente solicitud) y tecnología de ADN recombinante (descrita por ejemplo en Cabilly et al., Patente E.U.A. No. 6331415, incorporada para referencia en la presente solicitud).

Es bien sabido que la estructura molecular básica de los polipéptidos de inmunoglobulina incluye dos cadenas ligeras idénticas con un peso molecular de aproximadamente 23,000 daltons, y dos cadenas pesadas idénticas con un peso molecular de 53,000-70,000, en la cual las cuatro cadenas están unidas mediante puentes de disulfuro en una configuración de "Y". La secuencia de aminoácido corre desde el extremo N-terminal en la parte alta de la "Y" hacia el extremo C-terminal en la parte baja de cada cadena. En el extremo N-terminal está una región variable (de aproximadamente 100 aminoácidos de longitud) la cual provee la especificidad de unión al antígeno.

La presente invención está dirigida a métodos mejorados para producción de inmunoglobulinas de todos los tipos, incluyendo, pero sin limitarse a , anticuerpos de longitud completa y fragmentos de anticuerpo que tienen una secuencia orig inal (es decir la secuencia que se produce en respuesta a la estimu lación por parte de u n antígeno), anticuerpos de cadena individual q ue combinan la región variable de unión al antígeno tanto de las cadenas pesadas como de las cadenas ligeras en una cadena de polipéptido plegada de manera estable individ ual ; anticuerpos un ivalentes (los cuales comprenden u n d ímero de cadena pesada/cadena ligera unido a la región Fe de una segunda cadena pesada) ; "fragmentos Fab" los cuales incluyen la reg ión "Y" completa de la molécula de inmunog lobulina, es decir, las ramas de la "Y" , ya sea la cadena pesada o la cadena ligera sola , o porciones de las mismas (es decir, agregados de una cadena pesada y una cadena ligera, comúnmente conocidos como Fab'); "inmunoglobuli nas h íbridas" las cuales tienen especificidad para dos o más antígenos diferentes (por ejemplo, cuadromas o anticuerpos biespecíficos como los descritos por ejemplo en la patente E. U .A. No. 6,623,940) ; "inmunoglobu linas mixtas" en las cuales las cadenas pesada y ligera imitan aquellas de especies d iferentes o especificidades d iferentes ; y "anticuerpos quiméricos" en los cuales las porciones de cada una de las secuencias de aminoácido de la cadena pesada y la cadena ligera se obtienen a partir de más de una especie (es decir, la región variable se obtiene a parti r de una fuente tal como un anticuerpo de mú rido, mientras que la reg ión constante se obtiene a pa rtir de otra , tal como un anticuerpo de humano) .

Las composiciones y métodos de la invención encuentran utilidad en la producción de inmu nog lobulinas o fragmentos de las mismas en las cuales la cadena pesada o la cadena ligera es "de mamífero", "quimérica" o modificada de manera tal que incremente su eficacia . Los anticuerpos modificados incluyen variantes de secuencia tanto de aminoácido como de ácido nucleico las cuales retienen la misma actividad biológ ica de la forma no modificada y aquellas que se modifican de manera tal q ue se altera la actividad , es decir, cambios en la región constante que mejoran la fijación al complemento, interacción con membranas , y otras funciones efectoras , o cambios en la reg ión variable q ue mejoran las características de unión al antígeno . Las composiciones y métodos de la invención también pueden incluir inmunoglobulinas catal íticas o fragmentos de las mismas.

Una secuencia de polinucleótido q ue codifica para inmunoglobulina "variante" puede cod ificar para u na secuencia de aminoácido de inm unog lobulina "variante" la cual está alterada en uno o más aminoácidos con respecto a la secuencia de polipéptido de referencia . La misma discusión q ue sigue se puede aplicar a otras secuencias de proteína biológicamente activa (y sus secuencias cod ificadoras) de interés . La secuencia de polinucleótido variante puede codificar para u na secuencia de aminoácido variante que contiene sustituciones "conservadoras", en la cual el aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares a las del aminoácido que éste reemplaza. Se entiende que una variante de una proteína de interés se puede elaborar con una secuencia de aminoácido que sea sustancialmente idéntica (por lo menos aproximadamente 80 a 99% idéntica, y todos los números enteros entre estos valores) a la secuencia de aminoácido de la secuencia que ocurre de manera natural, y ésta forma una estructura tridimensional, funcionalmente equivalente y retiene la actividad biológica de la proteína que ocurre de manera natural. Es bien sabido en las artes biológicas que se pueden hacer algunas sustituciones de aminoácido en secuencias de proteína sin afectar la función de la proteína. En términos generales, las sustituciones de aminoácido conservadoras o sustituciones de aminoácidos similares se toleran sin afectar la función de la proteína. Los aminoácidos similares pueden ser aquellos que sean similares en tamaño y/o propiedades de carga, por ejemplo, aspartato y glutamato e isoleucina y valina son ambos pares de aminoácidos similares. Están permitidas las sustituciones de uno por otro cuando la formación de la estructura secundaria y terciaria original no se ve alterada excepto en la forma pretendida. La similitud entre pares de aminoácido ha sido evaluada en la técnica en un número de maneras. Por ejemplo, Dayhoff et al., en Atlas of Protein Sequence and Structure, 1978. Volumen 5, Suplemento 3, Capítulo 22, páginas 345-352, la cual se incorpora para referencia en la presente solicitud, provee tablas de frecuencia para sustituciones de aminoácido que se pueden utilizar como una medida de la similitud de aminoácido. Las tablas de frecuencia de Dayhoff et al . se basan en comparaciones de secuencias de aminoácido para proteínas que tienen la misma fu nción provenientes de una variedad de fuentes evolutivamente diferentes .

Las variantes de mutación por sustitución , por inserción , y por deleción de las secuencias de nucleótido (y de aminoácido) descritas se pueden preparar fácilmente utilizando métodos que son bien conocidos en la técnica . Estas va riantes se pueden utilizar en la misma manera q ue las secuencias ejemplificadas específicamente en tanto que las variantes tengan identidad de secuencia sustancial con una secuencia específicamente ejemplificada de la presente invención y se conserve la funcionalidad deseada .

Tal como se utiliza en la presente solicitud , identidad de secuencia sustancial se refiere a la homolog ía (o identidad) q ue es suficiente para permiti r q ue el polin ucleótido o proteína variante fu ncione en la misma capacidad que la del polinucleótido o proteína a partir del cual se obtiene la variante . De preferencia , esta identidad de secuencia es mayor de 70% u 80% , de manera más preferida , esta identidad es mayor de 85% o esta identidad es mayor de 90% , y/o de manera alternativa, ésta es mayor de 95% , y todos los n úmeros enteros entre 70% y 1 00% . Está dentro de la habilidad de una persona entrenada en este arte hacer mutación por sustitución , por inserción , y mutaciones por deleción que sean equivalentes en función o que estén diseñadas para mejorar la función de la secuencia o de algu na otra manera proveer una ventaja metodológica. No se pretende que las modalidades/variantes que se puedan leer en cualesquiera proteínas que ocurren de manera natural o que se puedan leer en un ítem de la técnica antecedente que califique estén dentro del alcance de la presente invención como se reclama. Es bien sabido en la técnica que las secuencias de polinucleótido de la presente invención se pueden truncar y/o de alguna otra manera mutar de modo tal que algunos de los fragmentos y/o mutantes resultantes de la secuencia de longitud completa original puedan retener las características deseadas de la secuencia de longitud completa. Son bien conocidas una amplia variedad de enzimas de restricción que son apropiadas para generar fragmentos a partir de moléculas de ácido nucleico más grandes. Además, es bien sabido que la exonucleasa Sa/31 se puede utilizar de manera conveniente para digestión de ADN limitada controlada por tiempo. Véase, por ejemplo, Maniatis et al. 1982. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, páginas 135-139, incorporada en la presente solicitud para referencia. Véase también Wei et al. 1983. J. Biol. Chem. 258:13006-13512. Mediante el uso de la exonucleasa fía/31 (comúnmente referido como procedimientos "de borrar una base"), el experto en la técnica puede eliminar nucleótidos de cualquiera o de ambos extremos de los ácidos nucleicos de la presente solicitud para generar un amplio espectro de fragmentos que sean funcionalmente equivalentes a las secuencias de nucleótido de la presente solicitud. Un experto en la técnica puede, de esta manera, generar cientos de fragmentos de longitudes controladas, variables a partir de ubicaciones a todo lo largo de la secuencia cod ificadora original. El experto en la técn ica puede de manera rutinaria analiza r o seleccionar los fragmentos generados por sus características y determinar la utilidad de los fragmentos como se enseña en la presente solicitud . También es bien sabido que las secuencias mutantes de la secuencia de longitud completa, o fragmentos de la misma , se pueden producir fácilmente con mutagénesis dirig ida a sitio. Véase, por ejemplo, Larionov, O . A. y N ikiforov, V.G . 1 982. Genetika 1 8:349-59; Shortle et al. (1 981 ) Annu. Rev. Genet. 1 5:256-94; ambas incorporadas en la presente solicitud pa ra referencia. El experto en la técnica puede producir en forma rutinaria mutaciones tipo deleción , inserción , o sustitución e identificar a los mutantes resultantes que contienen las características deseadas de la secuencia de tipo silvestre de longitud original, o fragmentos de la misma , por ejemplo , aquellos que retienen actividad de hormona , de citocina, de unión a antígeno u otra actividad biológica.

Además, o de manera alternativa , la secuencia de polinucleótido variante puede codificar para u na secuencia de aminoácido variante que contiene sustituciones "no conservadoras", en la cual el aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o qu ímicas diferentes a las del aminoácido que éste reemplaza . Los polinucleótidos que codifican para inm unoglobulina variante también pueden codificar para secuencias de aminoácido variantes que contienen inserciones o deleciones de aminoácido, o ambas . Así mismo, u n polinucleótido que codifica para inmu nog lobu lina variante puede codificar para el mismo polipéptido que el de la secuencia de polinucleótido de referencia pero, debido a la degeneración del código genético, tiene u na secuencia de polinucleótido que está alterada en u na o más bases con respecto a la secuencia de polin ucleótido de referencia .

El término "fragmento" cua ndo se refiere a u na inmu noglobulina recombinante de la invención significa u n polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que es la misma que u na parte de pero no toda la secuencia de aminoácido de la proteína de inmu noglobulina de longitud completa correspondiente, la cual retiene esencialmente la misma actividad o fu nción biológ ica que la de la proteína de longitud completa correspondiente , o retiene por lo menos u na de las funciones o actividades de la proteína de longitud completa correspondiente. El fragmento de preferencia incluye por lo menos 20-1 00 residuos de aminoácido contig uos de la inmunog lobulina de longitud completa , y de preferencia , retiene la capacidad para unirse al mismo antígeno que la del anticuerpo de longitud completa .

Tal como se utiliza en la presente solicitud , el término "identidad de secuencia" sig nifica una secuencia de ácido nucleico o de ami noácido idéntica en dos o más secuencias alineadas, cuando se alinean utilizando un programa de alineación de secuencia . El término "% de homolog ía" se utiliza de ma nera intercambiable en la presente solicitud con el término "% de identidad" en la presente solicitud y se refiere al nivel de identidad de secuencia de ácido nucleico o de aminoácido entre dos o más secuencias alineadas, cuando se alinean utilizando un programa para alineación de secuencia. Por ejemplo, tal como se utiliza en la presente solicitud, 80% de homología significa lo mismo que 80% de identidad de secuencia determinado mediante un algoritmo definido como será entendido en la técnica, y por consiguiente un homólogo de una secuencia dada tiene más de 80% de identidad de secuencia a lo largo de una longitud de la secuencia dada.

La alineación óptima de secuencias para comparación puede ser efectuada, por ejemplo, utilizando el algoritmo de homología local de Smith y Waterman. 1981. Adv. Appl. Math. 2:482, utilizando el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch. 1970. J Mol. Biol. 48:443, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman. 1988. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, Madison, Wis.), utilizando el algoritmo BLAST, Altschul et al. 1990. J Mol. Biol. 215:403-410, con software que está públicamente disponible a través del sitio en la red del Centro Nacional para Información sobre Biotecnología (véase nim.nih.gov/), o mediante inspección visual (véase en general, Ausubel et al., infra). Para los propósitos de la presente invención, la alineación óptima de secuencias para comparación se efectúa de manera más preferida utilizando el algoritmo de homolog ía local de Smith y Waterman. 1 981 . Adv. Appl. Math . 2 :482. Véase, también , Altschu l et al . 1 990 y Altschul et al. 1 997.

Los términos "idéntico" o por ciento de "identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o proteína, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácido o nucleótidos que son los mismos, cuando se comparan y alinean para correspondencia máxima , según se mide utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencia descritos en la presente solicitud , por ejemplo, el algoritmo de Smith-Waterman , otros conocido en la técn ica , por ejemplo, BLAST, o mediante inspección visual .

De conformidad con la presente invención , también se abarcan variantes de secuencia que cod ifican para polipéptidos de corte auto-procesadores y los polipéptidos mismos que tienen 80, 85, 88, 89, 90, 91 , 92 , 93, 94, 95, 96, 97, 98 , 99% (y todos los números enteros entre 80 y 1 00 para los valores de porcentaje) o más de identidad de secuencia con la secuencia orig inal o de referencia. También se abarcan frag mentos de aminoácido de los polipéptidos que representan u n tramo continuo de por lo menos 5, por lo menos 1 0, o por lo menos 1 5 unidades; y fragmentos homólogos a los mismos de conformidad con las condiciones de identidad descritas; y fragmentos de secuencias de ácido nucleico q ue representan un tramo continuo de por lo menos 15 , por lo menos 30, o por lo menos 45 unidades. En una modalidad particular, una secuencia de ácido nucleico o secuencia de aminoácido es 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 99.5% idéntica a una secuencia respectiva descrita con la presente invención.

Se considera que una secuencia de ácido nucleico se puede "hibridar selectivamente" a una secuencia de ácido nucleico de referencia si las dos secuencias se hibridan específicamente entre sí bajo condiciones de lavado y de hibridación de astringencia moderada a alta. Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (Tm) del complejo o sonda de unión al ácido nucleico. Por ejemplo, la "astringencia máxima" típicamente ocurre a una Tm de aproximadamente -5°C (5°C por debajo de la Tm de la sonda); la "astringencia alta" aproximadamente a 5-10°C por debajo de la Tm; "astringencia intermedia" aproximadamente a 10-20°C debajo de la Tm de la sonda; y "astringencia baja" aproximadamente a 20-25°C debajo de la Tm. Funcionalmente, se pueden utilizar condiciones de astringencia máxima para identificar secuencias que tienen identidad estricta o identidad casi estricta con la sonda de hibridación; mientras que las condiciones de astringencia alta se utilizan para identificar secuencias que tienen aproximadamente 80% o más de identidad de secuencia con la sonda.

Las condiciones de hibridación de astringencia moderada y alta son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook, et al, 1989, capítulos 9 y 11, y en Ausubel, F.M., et al., 1993). Un ejemplo de condiciones de astringencia alta incluye hibridación aproximadamente a 42°C en formamida al 50% , SSC 5X, solución de Denhardt 5X, SDS al 0.5% y 1 00 pg/ml de ADN portador desnaturalizado segu ido por lavado dos veces en SSC 2X y SDS al 0.5% a temperatu ra ambiente y dos veces adicionales en SSC 0.1 X y SDS al 0.5% a 42°C . 2A variantes de secuencia que codifican para u n polipéptido con la misma actividad biológ ica que la de la proteína de interés q ue ocu rre de manera natu ral y se híbrida bajo cond iciones de hibridación de astringencia moderada a alta se consideran que están dentro del campo de la presente invención .

Como resultado de la degeneración del código genético, se puede prod ucir u n n úmero de secuencias cod ificadoras las cuales codifican para la misma secuencia de polipéptido , incluyendo tal para componentes estructu rales, componentes auto-procesadores, por ejemplo, inteínas, componentes reguladores por ejemplo, secuencias de corte de peptidasa de señal, u otros componentes. Por ejemplo, el triplete CGT codifica para el aminoácido arg inina . La argi nina es codificada de manera alternativa por secuencias de nucleótido de triplete CGA, CGC , CGG , AGA, y AGG. Por lo tanto se aprecia que dichas sustituciones de codones sinón imos en la reg ión codificadora caen dentro de las variantes de secuencia que son cubiertas por la presente invención .

También se apreciará q ue dichas variantes de secuencia pueden o no h ibridarse a la secuencia progenitora bajo condiciones de astringencia alta . Esto puede ser posible, por ejemplo, cuando la varia nte de secuencia incluye un codón diferente para cada uno de los aminoácidos codificados por el nucleótido progenitor. Sin embargo, dichas variantes están específicamente contempladas y abarcadas por la presente invención .

El potencial de los anticuerpos como modalidades terapéuticas actualmente está limitado por la capacidad y costos de producción de la tecnolog ía actual . Un vector de expresión individ ual viral o no viral mejorado para prod ucción de inmunoglobulina (u otra proteína) facilita la expresión y suministro de dos más secuencias codificadoras, es decir, inmunoglobu linas u otras proteínas con especificidades dobles o múltiples a partir de un vector individual. La presente invención soluciona estas lim itaciones y se puede aplicar a cualq uier inmunoglobulina (es decir u n anticuerpo) o fragmento de la misma u otra prote ína multi-partes o par de proteína de unión como se detalla más adela nte en la presente solicitud , incluyendo anticuerpos d iseñados tales como anticuerpos de cadena individual, anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo, hormonas de dos cadenas, citocinas de dos cadenas, quimiocinas de dos cadenas, receptores de dos cadenas, y similares .

I nteínas Tal como se utiliza en la presente solicitud, una inteína es un segmento dentro de una proteína expresada, u nido hacia el extremo N-terminal del producto de expresión primario mediante u na N-exteína y unido hacia el extremo C-terminal del prod ucto de expresión primario media nte una C-exteína . Las inteínas q ue ocurren de manera natural median la escisión de las inteínas y la re-unión (ligación de proteína) de las N-exteínas y C-exteínas. Sin embargo, en el contexto de los productos de expresión de la presente invención , la secuencia primaria de la inteína o la secuencia de aminoácido de la exteína de flanqueo es tal q ue el corte de la estructu ra base de la proteína ocu rre en ausencia de o con una cantidad red ucida o u na cantidad m ínima de ligación de las exteínas, de modo tal q ue las proteínas de exte ína son liberadas del producto de traducción primario (poliproteína) sin q ue se unan para formar una proteína de fusión . La porción de inte ína del producto de expresión primario (la proteína sintetizada por ARNm , antes de cualquier corte proteol ítico) med ia el corte proteolítico en las uniones N-exteína/inteína y de inteína/C-exteína . En general, las inteínas que ocu rren de manera natural también median el empalme entre sí (unión mediante formación de u n enlace peptídico) de la N-exteína y la C-exte ína . Sin embargo, en la presente invención tal como se aplica al objetivo de expresar dos polipéptidos (como se ejemplifica específicamente por las cadenas pesada y ligera de una molécu la de anticuerpo) , se prefiere que no ocu rra la ligación de proteína . Esto se puede lograr mediante incorporación de una inteína que ya sea de manera natu ral o a través de mutación no tenga actividad de ligación. De manera alternativa , el empalme se puede evitar mediante mutación para cambiar el o los aminoácidos en o cerca del sitio de empalme para evitar la ligación de las proteínas liberadas . Véase, Xu y Perler, 1 996, EM BO J . 1 5: 5146-5153. Por ejemplo, Ser, Th r o Cys normalmente ocurren en el inicio de la C-exteína y se pueden cambiar para modificar o interrumpir el empalme. En una inteína particular, el efecto sobre el empalme evita o reduce la ligación de las proteínas expresadas.

Las inteínas son una clase de proteínas cuyos genes se encuentran solamente dentro de los genes de otras proteínas. Junto con los genes hospederos de flanqueo denominados exteínas, las inteínas son transcritas como un ARNm individual, y se traducen como un polipéptido individual. Desde el punto de vista pos-traducción, las inteínas inician un evento auto-catalítico para eliminarse a sí mismas y unir los segmentos de proteína hospedera de flanqueo con un nuevo enlace de polipéptido. Esta reacción es catalizada únicamente por la ¡nteína, no requiere de otras proteínas celulares, cofactores, o ATP. Las inteínas se encuentran en una variedad de organismos unicelulares y éstas tienen tamaños diferentes. Muchas inteínas contienen un dominio de endonucleasa, el cual explica su movilidad dentro de los genomas.

Las reacciones mediadas por inteína han sido utilizadas en biotecnología, especialmente para escenarios in vitro tales como para purificaciones y para construcción de chip de proteína, y en la mejora de cepa vegetal (Perler, F.B.2005. IUBMB Life 57(7):469-76). Se han introducido mutaciones en las secuencia de nucleótido de inteína original, y se reporta que algunos de estos mutantes tienen propiedades alteradas (Xu y Perler, 1996. EMBO J. 15(9), 5146-5153). Además de las inteínas, los dominios tipo inteína bacterianos (BIL) y los dominios auto-procesadores hedgehog (Hog), también se sabe que los otros 2 miembros de la súper-familia Hog/inteína (HINT) catalizan el auto-procesamiento post-traducción a través de mecanismos similares (Dassa et al. 2004. J. Biol. Chem. 279(31):32001-32007).

Las inteínas se presentan como inserciones en cuadro en proteínas hospederas específicas. En una reacción de auto-empalme, las inteínas se cortan a sí mismas a partir de una proteína precursora, mientras que las regiones de flanqueo, las exteínas, se unen para restaurar la función de gen hospedero. Estos elementos también contienen una función de endonucleasa que explica su movilidad dentro de los genomas. Las inteínas se presentan en un intervalo de tamaños (134 a 1650 aminoácidos), y éstas han sido identificadas en los genomas de eubacterias, eucariotas y archaea. Los experimentos que utilizan sistemas modelo de empalme/reportero han demostrado que se pueden separar las funciones de endonucleasa, corte de proteína, y de empalme de proteína (Xu y Perler. 1996. EMBO J. 15:5146-5153). El ejemplo descrito a continuación utiliza una inteína proveniente de Pyrococcus horikoshii Pho Pol I, Saccharomyces cerevisiae VMA, y Synechocystis spp. para crear una proteína de fusión con secuencias provenientes de la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo. La mutación de la inteína designada para suprimir la capacidad de empalme de la inteína da como resultado un polipéptido individual que experimenta un auto-corte para producir las cadenas pesada y ligera de anticuerpo codificadas correctamente. Esta estrategia puede ser utilizada de manera similar en la expresión de otras proteínas de cadenas múltiples, hormonas o citocinas, y ésta también se puede adaptar para el procesamiento de proteínas precursoras (proproteínas) hasta sus formas mad uras , biológicamente activas. Aunq ue el uso de las inteínas de Pyrococcus horikoshii Pho Pol I , S. cerevisiae VMA, y Synechocystis spp. se ejemplifican específicamente en la presente solicitud, se pueden utilizar otras inteínas conocidas en la técnica en los vectores y métodos de expresión de la poliproteína de la presente invención .

Muchas otras inteínas además de las inteínas de Pyrococcus horikoshii Pho Pol I , S. cerevisiae VMA, y Synechocystis spp. se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Perler, F . B . 2002 , . I n Base , the I ntein Datábase, Nucí . Acids Res. 30( 1 ) :383-384 y la Base de Datos y Registro de I nteína (I ntein Datábase and Registry), disponible a través del sitio en la red de New England Biolabs, por ejemplo, en http://tools . neb.com/inbase/) . Las inte ínas se han identificado en una amplia gama de organ ismos tales como levadu ras, micobacterias y archaebacterias termofílicas extremas. Algunas inteínas tienen actividad de endon ucleasa así como las actividades de corte y empalme de proteína específico de sitio. La actividad de endon ucleasa no es necesaria para la práctica de la presente invención ; se puede eliminar una región codificadora de endonucleasa , con la condición que se mantenga la actividad de corte de proteína .

El mecanismo del proceso de empalme de proteína ha sido estudiado con gran detalle (Chong et al. 1996. J. Biol. Chem. 271: 22159-22168; Xu y Perler. 1996. EMBO J 15: 5146-5153) y se han descubierto aminoácidos conservados en los puntos de empalme de inteina y exteína (Xu et al. 1994. EMBO J 13:5517-5522). Algunas de las construcciones descritas en la presente solicitud contienen una secuencia de inteina fusionada al extremo 3'-terminal de la primera secuencia codificadora, con una segunda secuencia codificadora fusionada en marco en el extremo C-terminal de la inteina. Las secuencias de inteina apropiadas se pueden seleccionar a partir de cualquiera de las proteínas que se sabe contienen elementos de empalme de proteína. Una base de datos que contiene todas las ¡nteínas conocidas se puede encontrar en la World Wide Web (Perler, F.B. 1999. Nucí. Acids Res. 27:346-347). La secuencia codificadora de inteina está fusionada (en cuadro) en el extremo 3' hacía el extremo 5' de una segunda secuencia codificadora. Para direccionamiento de esta proteína hacía un cierto organelo, se puede fusionar una señal de péptido apropiada a la secuencia codificadora de la proteína.

Después de la segunda secuencia codificadora de exteína, la secuencia codificadora de exteína-secuencia codificadora de inteina se puede repetir tan frecuentemente como se desee para expresión de proteínas múltiples en la misma célula. Para construcciones que contienen inteínas múltiples, podría ser útil utilizar elementos de inteina provenientes de fuentes diferentes.

Después de la secuencia del último gen a ser expresado, se insertan de manera deseable una secuencia de terminación de transcripción, e incluyendo de manera conveniente una secuencia de poliadenilación. El orden de una secuencia de poliadenilación y una secuencia de terminación puede ser como se entiende en la técnica. En una modalidad, una secuencia de poliadenilación puede preceder a una secuencia de terminación.

Las unidades de empalme de inteína modificada han sido diseñadas de modo tal que dicha inteína modificada de interés pueda catalizar la escisión de las exteínas a partir de las inteínas pero no pueda catalizar la ligación de las exteínas (véase, por ejemplo, patente E.U.A. 7026526 y Publicación de patente E.U.A. 20020129400). La mutagénesis de la unión de la exteína C-terminal en la ADN polimerasa GB-D de la especie Pyrococcus produce un elemento de empalme alterado que induce el corte de las exteínas e inteínas pero evita la ligación subsiguiente de las exteínas (Xu y Perler. 1996. EMBO J 15: 5146-5153). La mutación de serina 538 a cualquiera de una alanina o glicina (Ser a Ala o Gly) induce el corte pero evita la ligación. En dicha posición, también se utilizan Ser a et o Ser a Thr para lograr la expresión de una poliproteína que se corta en segmentos separados y por lo menos no se vuelve a ligar parcialmente. La mutación de residuos equivalentes en otras unidades de empalme de inteína también puede evitar la ligación de los segmentos de exteína debido a la conservación relativa de aminoácidos en la unión de exteína C-terminal a la inteína. En casos de conservación/homología bajas, por ejemplo, los primeros varios, por ejemplo, aproximadamente cinco, residuos de la C-exteína y/o los últimos varios residuos del segmento de inteína se varían sistemáticamente y se someten a tamizaje respecto a la capacidad para apoyar el corte pero no el empalme de segmentos de exteína dados, en particular segmentos de exteína descritos en la presente solicitud y como se entiende en la técnica. Existen inteínas que no contienen un dominio de endonucleasa; éstas incluyen la inteína dnaE de Synechocystis spp. y la proteína GyrA de Mycobacterium xenopi (Magnasco et al, Biochemistry, 2004, 43, 10265-10276; Telenti et al. 1997. J. Bacteriol. 179: 6378-6382). Otras han sido encontradas en la Naturaleza o han sido creadas artificialmente eliminando los dominios codificadores de endonucleasa de la secuencias que codifican para inteínas que contienen endonucleasa (Chong et al. 1997. J. Biol. Chem. 272:15587-15590). En donde se desee, la inteína se selecciona originalmente de modo tal que ésta consista del número mínimo de aminoácidos necesarios para efectuar la función de empalme, tal como la inteína proveniente de la proteína GyrA de Mycobacterium xenopi (Telenti et al. 1997. supra). En una modalidad alternativa, se selecciona una inteína sin actividad de endonucleasa, tal como la inteína proveniente de la protelna GyrA de Mycobacterium xenopi o la inteína VMA de Saccharomyces cerevisiae que ha sido modificada para eliminar los dominios de endonucleasa (Chong et al. 1997. supra).

La modificación adicional de la unidad de empalme de inteína puede permitir que se altere la velocidad de reacción de la reacción de corte, permitiendo que se pueda controlar la dosificación de proteína simplemente modificando la secuencia de gen de la unidad de empalme.

En una modalidad, el primer residuo de la exteína C-terminal se diseña de modo tal que contenga una glicina o alanina, una modificación que se ha demostrado evita la ligación de exteína con la ADN polimerasa GB-D de la especie Pyrococcus (Xu y Perler. 1996. EMBO J 15: 5146-5153). En esta modalidad, las proteínas de exteína C-terminal preferidas contienen de manera natural un residuo glicina o un residuo alanina después de la metionina N-terminal en la secuencia de aminoácido original. La fusión de la glicina o alanina de la exteína al extremo C-terminal de la inteína provee la secuencia de aminoácido original después del procesamiento de la poliproteína. En otra modalidad, una glicina o alanina artificial se posiciona en la exteína C-terminal ya sea alterando la secuencia original o mediante adición de un residuo de aminoácido adicional en el extremo N-terminal de la secuencia original. En esta modalidad, la secuencia de aminoácido original de la proteína estará alterada por un aminoácido después del procesamiento de la poliproteína. En modalidades adicionales, otras modificaciones útiles en la presente invención se describen en el documento US 7026526.

En una modalidad, una inteína está de conformidad con la misma en la patente E.U.A. 7,026,526. En una modalidad particular, una inteína es la inteína de ADN polimerasa GB-D de la especie Pyrococcus. En una modalidad , la mutación de la serina de la exteína C-terminal a u na alanina o glicina forma un elemento de empalme de inteína mod ificada que puede promover la escisión de la poliproteína pero no la ligación de las u nidades de exteína . En una modalidad , una inteína es la inteína m ínima GyrA de Mycobacterium xenopi de la patente E. U .A. 7 ,026, 526. En u na modalidad , la mutación de la treon ina de la exteína C-terminal a una alan ina o glicina forma u n elemento de empalme de inteína modificada q ue promueve la escisión de la poliproteína pero que no liga las unidades de exteína.

Se apreciará que para algu nas inteínas como las descritas en la presente solicitud , las modalidades de construcciones y métodos pueden generar la expresión mejorada del producto de proteína secretada , particularmente para proteínas m ultiméricas incluyendo anticuerpos .

Péptidos de señal y peptidasas de señal La hipótesis de la señal, en la cual las proteínas contienen información dentro de sus secuencias de aminoácido para direccionamiento de la proteína hacía la membrana, ha sido conocida por más de treinta años. M ilstein y colaboradores descubrieron q ue la cadena ligera de IgG proveniente de células de mieloma es sintetizada en una forma de peso molecular más alto y es convertida en su forma mad u ra cuando las vesículas del retículo endoplasmático (microsomas) se ag regan al sistema de traducción , y propusieron u n modelo basado en estos resultados en el cual los microsomas contienen una proteasa que convierte la forma de proteína precu rsora a la forma mad ura mediante remoción del péptido de extensión amino terminal . La hipótesis de la señal pronto se expand ió para inclu ir distintas secuencias de direccionamiento dentro de proteínas localizadas hacía diferentes membra nas intracelulares, tales como las mitocondrias y los cloroplastos. Posteriormente se encontró que estas secuencias de direccionamiento d isti ntas son cortadas de la proteína exportada por peptidasas de señal específicas (SPasas) .

Existen por lo menos tres SPasas d istintas implicadas en el corte de los péptidos de señal en las bacterias . La SPasa I puede procesar substratos de tipo no lipoproteína q ue son exportados por la ruta SecYEG o la ruta de translocación de arg inina gemela (Tat) . Las lipoproteínas que son exportadas por la ruta Sec son cortadas por la SPasa I I . La Spasa IV corta las prepilinas tipo IV y proteínas tipo prepilina que son componentes del aparato de secreción tipo I I .

En los euca riotas, las proteínas q ue son dirigidas hacía la membra na del retículo endoplasmático (ER) son mediadas por péptidos de señal que d irigen la proteína ya sea en forma co-trad ucción o pos-traducción hacía la maq uina ria de translocación Sec61 . Los péptidos de señal del ER tienen características similares a aquellas de sus contrapartes bacterianas. Los péptidos de señal del ER son cortados de la proteína exportada después que se exportan hacia el lumen del ER por el complejo de peptidasa de señal (SPC) .

Los péptidos de señal que envían las proteínas a diferentes ubicaciones dentro de la célula eucariota tienen que ser distintos debido a q ue estas células contienen muchos compartimentos membranosos y acuosos diferentes . Las prote ínas que son dirigidas hacía el ER con frecuencia contienen secuencias de señal escindibles. De manera sorprendente, muchos péptidos artificiales pueden fu ncionar como señales de translocación . Se cree que la característica clave más importante es el carácter h idrofóbico por encima de un cierto valor umbral . Los péptidos de señal del ER tienen un contenido más alto de residuos leuci na que los péptidos de señal bacterianos. La partícula de reconocimiento de señal (SRP) se une a los péptidos de señal escindibles después de que éstos emergen del ribosoma. La S RP es requerida para direccionamiento de la proteína naciente hacía la membrana del ER . Después de la translocación de la proteína hacia el lumen del ER , la proteína exportada es procesada por la S PC . Otra modalidad toma ventaja de las enzimas procesadoras de péptido de señal (l íder) lo cual ocu rre de manera natu ral en las células eucariotas.

La mayoría de los péptidos de señal de ER pueden ser escindibles en el extremo N-terminal o pueden ser no escindibles internamente. Recientemente, se encontró q ue un número de poliproteínas virales tales como aquellas encontradas en el virus de hepatitis C , hantavirus, flavivirus , virus rubela , y virus de la influenza C contienen péptidos de señal internos que muy probablemente son cortados por el SPC del ER. Dichos estudios sobre la maduración de poliproteínas muestran q ue el SPC puede cortar no solamente los péptidos de señal localizados en el extremo amino-terminal , sino también después de los péptidos de señal internos. La mutagénesis de los elementos de especificidad de substrato de peptidasa de señal pronosticados puede por lo tanto bloquear la capacidad infecciosa viral.

La peptidasa de péptido de señal de proteasa aspártica tipo presenilina (SPP) corta los péptidos de señal dentro de su región de transmembrana. La SPP es esencial para la generación de epítopes E de HLA derivados de péptido de señal en humanos.

Las peptidasas de señal son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo Paetzel M. 2002. Chem. Rev. 102(12): 4549; Pekosz A. 1998. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 95:13233-13238; Marius K. 2002. Molecular Cell 10:735-744; Okamoto K. 2004. . J. Virol. 78:6370-6380, Vol. 78; Martoglio B. 2003. Human Molecular Genetics 12:R201-R206; y Xia W.2003. J. Cell Sci. 116:2839-2844.

Las modalidades de esta invención utilizan péptidos de señal escindibles internos para expresión de un polipéptido en un transcrito individual. El polipéptido transcrito individual es cortado después por el SPC, dejando péptidos individuales por separado o péptidos individuales que son ensamblados como una proteína. Los métodos de la presente invención se pueden aplicar a la expresión de la cadena pesada y la cadena ligera de inmunoglobulina en un solo polipéptido transcrito, seguido por corte, después ensamblado como una inmunoglobulina madura. Esta tecnología se puede aplicar a citocinas polipeptídicas, factores de crecimiento, o a una variedad de otras proteínas, por ejemplo, IL-12p40 e IL-12p35 en un polipéptido transcrito individ ual y después se ensamblan como I L-1 2 , o I L-1 2p40 e I L-23p 1 9 en un polipéptido individual transcrito y después se ensamblan como I L-23.

La estrategia de peptidasa de señal se puede aplicar a vectores de expresión mamíferos que dan como resultado la expresión de anticuerpo funcional u otro producto procesado a parti r de u n precursor o poliproteína . En el caso del anticuerpo, éste se produce a parti r del vector como una poliproteína q ue contiene tanto cadenas pesadas como cadenas ligeras , con una secuencia de intercalado entre la cadena pesada y la cadena ligera que es u n péptido de señal escindible interno. Este péptido de señal escindible interno puede ser cortado por proteasas que residen en el ER, principalmente las peptidasas de señal, presenilina o proteasas tipo presenilina , dejando las cadenas pesada y ligera para que se plieguen y ensamblen para producir u na molécu la fu ncional, y de manera deseable ésta es secretada . Además del péptido de señal escindible interno derivado del virus de hepatitis C, otras secuencias escindibles internas que pueden ser cortadas por las proteasas que residen en el ER pueden ser sustituidas de las mismas . De manera similar, la práctica de la invención no necesita estar limitada a células hospederas en las cuales la peptidasa de señal efectúa el corte, sino ésta también incluye proteasas q ue incluyen , pero no se limitan a , presenilina , proteasa tipo presenilina, y otras proteasas para procesamiento de polipéptidos. Dichas proteasas han sido revisadas en los artículos citados , entre otros.

Además, la presente invención no está limitada a la expresión de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina , sino que también ésta incluye otros polipéptidos y poliproteínas expresadas en transcritos individuales seg u ido por el corte del péptido de señal interno para liberar cada péptido o proteína individ ual . Estas proteínas pueden o no ensamblarse entre sí en el producto madu ro .

También dentro del alcance de la presente invención están las construcciones de expresión en las cuales los polipéptidos individuales están presentes en órdenes alternados, es decir, "péptido 1 -péptido de señal escindible interno-péptido 2" o "péptido 2-péptido de seña l escindible interno-péptido 1 ". Esta invención también incluye la expresión de más de dos péptidos ligados por péptidos de señal escindibles internos , tales como "péptido 1 -péptido de señal escindible interno-péptido 2-péptido de señal escindible interno-péptido 3" etc.

Además, esta invención se aplica a la expresión de proteínas de transmembrana tanto de tipo I como de tipo I I y a otros sitios de corte de proteasa en conexión con las construcciones de expresión .

Esta invención también utiliza de manera adicional péptidos de señal escindibles internos para maduración de uno o más polipéptidos dentro de una poliprote ína codificada dentro de u n transcrito individual . El polipéptido transcrito individual después es cortado por el S PC , dejando péptidos individuales por separado o péptidos individuales que son ensamblados como una proteína. Las modalidades de esta invención incluyen composiciones y métodos para expresar la cadena pesada y la cadena ligera de inmunoglobulina en un polipéptido transcrito individual con el ensamblado final como una inmunoglobulina madura. Esta invención se puede aplicar para expresar citocinas de polipéptido, factores de crecimiento, o una variedad de otras proteínas por ejemplo para expresar IL-12p40 e IL-12p35 en un polipéptido transcrito individual y después y después ensamblado como IL-12, o IL-12p40 e I L-23p 19 en un polipéptido transcrito individual y después ensamblado como IL-23.

Modificación del péptido de señal En modalidades de construcciones de sORF, se utilizan péptidos de señal modificados. Por ejemplo, en una construcción de cadena pesada-int-cadena ligera, el nivel de secreción del anticuerpo se incrementa en aproximadamente 10 veces cuando el carácter hidrofóbico de la secuencia de péptido de señal de la cadena ligera se reduce a través de mutagénesis dirigida a sitio. Los péptidos de señal se pueden utilizar como se describe en el documento US 20070065912 de Carson et al., Marzo 22, 2007, Marcas Las modalidades de diseños de construcción de sROF de presente invención incluyen el uso de inteínas modificadas que contienen u na marca , de preferencia una marca interna. Se conoce una variedad de marcas en la técnica. Las marcas de la presente invención incluyen pero no se limitan a ma rcas fluorescentes y marcas q uimioluminiscentes . Utilizando dichas construcciones, se puede monitorear la cantidad de poliproteína expresada utilizando detección fluorescente en células ind ivid uales. Además, estas células se pueden clasificar de conformidad con el nivel de expresión de proteína utilizando clasificación de cél ula activada por fluorescencia (FACS). El uso de dichas marcas son particula rmente útiles en generaciones de línea de célula estable ya que esto permite la selección de células o l íneas celulares altamente productoras mediante el análisis FACS. Como se enseña en la presente invención , se han observado inteínas de long itud completa en el Usado de las células después que éstas son auto-cortadas de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo de flanqueo. Esto provee la base para las detecciones de inte ínas marcadas con fluorescencia y su uso en la generación de lí nea celular estable. También se pueden utilizar marcas en la pu rificación de proteínas.

Mini-inteínas Debido a que las regiones de endonucleasa q ue están presentes en muchas inteínas, incluyendo la inteína Pol I de P. horikoshii y la inteína Sce. VMA no son particularmente convenientes para sistemas de expresión de gen , el dominio de endon ucleasa se puede suprimi r opcionalmente y reemplazar con u n enlazador peq ueño para crear "mini-inteínas" . Estas mini-inte ínas diseñadas también son útiles en los diseños de construcción descritos, y éstas presentan la ventaja de q ue la región codificadora de inteína es significativamente más pequeña , permitiendo por lo tanto que una secuencia más grande codifique para los polipéptidos de interés y/o mayor facilidad de manejo de las moléculas de ADN recombinante .

En modalidades es conveniente utilizar anticuerpos o análogos de los mismos con características completamente h umanas. Estos reactivos evitan las respuestas inmunes indeseadas inducidas por anticuerpos o análogos que se originan a partir de especies no humanas. Para solucionar las posibles respuestas inmunes del hospedero hacía residuos de aminoácido derivados de péptidos auto-procesadores, la secuencia codificadora para un sitio de corte proteol ítico puede ser insertada (utilizando metodolog ía estándar conocida en la técnica) entre la secuencia codificadora para la primera proteína y la secuencia codificadora para el péptido auto-procesador para remover la secuencia de péptido auto-procesador del polipéptido expresado, es decir el anticuerpo. Esto encuentra utilidad particular en anticuerpos terapéuticos o de diag nóstico para uso in vivo.

Suministro de genes y vectores i ncluyendo vectores virales La presente invención contempla el uso de cualquiera de una variedad de vectores para introducción de construcciones que comprenden la secuencia codificadora para dos o más polipéptidos o proteí nas y u na secuencia de corte auto-procesadora al interior de las célu las . En la técnica se conocen numerosos ejemplos de vectores de expresión de gen y pueden ser de origen viral o no viral. Los métodos de suministro de gen no viral que se pueden utilizar en la práctica de la invención incluyen pero no se limitan a plásmidos, liposomas , complejos de ácido nucleico/liposoma , lipidos catión icos y similares.

Los vectores virales y otros vectores pueden transducir de manera eficiente las células e introducir su propio ADN dentro de una célula hospedera . Durante la generación de vectores recombinantes, los genes no esenciales son reemplazados con secuencias susceptibles de expresión que codifican para proteínas o polipéptidos de interés. Los ejemplos de vectores incluyen pero no se limitan a vectores virales y vectores no vi rales , tales como u n vector retroviral (incluyendo vectores lentivirales) , vectores adenovirales (Ad) incluyendo las formas competentes en cua nto a replicación, deficientes en cuanto a replicación y carentes de todos los genes virales (g utless) de los mismos, vectores de virus adenoasociado (AAV) , vectores de virus 40 de simio (SV-40) , vectores de papiloma bovino , vectores de Eipstein-Barr, vectores de herpes, vectores de vaccinia , vectores de leucemia de múrido de Moloney, vectores de virus de sarcoma de múrido de Ha rvey, vectores de virus de tu mor mamario de mú rido , vectores de virus de sarcoma de Rous y plásmidos no virales . Los vectores de baculovi rus son bien conocidos y son apropiados para expresión en células de insecto. En la técnica es bien conocida una plétora de vectores apropiados para expresión en mamíferos u otras células eucariotas, y muchos se pueden conseguir comercialmente. Las fuentes comerciales incluyen, sin limitación, Stratagene, La Jolla, CA; Invitrogen, Carlsbad, CA; Promega, Madison, Wl y Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. Muchas secuencias de vectores se pueden conseguir a través de GenBank, y la información adicional concerniente a los vectores está disponible en la Internet a través de Riken BioSource Center.

En una modalidad, el vector típicamente comprende un origen de replicación y el vector puede o no además comprender una función de "marcador" o "marcador seleccionable" mediante la cual el vector se puede identificar y seleccionar. Aunque se puede utilizar cualquier marcador seleccionable, los marcadores seleccionables para uso en vectores recombinantes son generalmente conocidos en la técnica y la elección del marcador seleccionable apropiado dependerá de la célula hospedera. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables que codifican para proteínas que confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas incluyen, pero no se limitan a ampicilina, metotrexato, tetraciclina, neomicina (Southern et al. 1982. J Mol Appl Genet. 1:327-41), ácido micofenólico (Mulligan et al. 1980. Science 209:1422-7), puromicina, zeomicina, higromicina (Sugden et al. 1985. Mol Cell Biol. 5:410-3), dihidrofolato reductasa, glutamina sintetasa, y G418. Como será entendido por los expertos en la técnica, los vectores de expresión típicamente incluyen un origen de replicación, un promotor ligado en forma operable a la secuencia o secuencias codificadoras que se van a expresar, así como sitios de u nión a ribosoma, sitios de empalme de ARN , un sitio de poliadenilación, y secuencias terminadoras de transcripción , según sea apropiado para la secuencia o secuencias codificadoras que están siendo expresadas .

La referencia a u n vector u otras secuencias de AD N como "recombina ntes" simplemente reconocen el enlazamiento operable de secuencias de ADN que típicamente no están ligadas en forma operable tal como se aislan o se encuentran en la Naturaleza. Las secuencias reguladoras (de expresión y/o control) están ligadas de manera operativa a una secuencia codificadora de ácido nucleico cuando las secuencias de expresión y/o control reg ulan la transcripción y, según sea apropiado, la traducción de la secuencia de ácido nucleico. Por lo tanto las secuencias de expresión y/o control pueden incluir promotores, incrementadores, terminadores de transcripción , un codón de inicio (es decir ATG) 5' a la secuencia codificadora , señales de empalme para intrones y codones de terminación .

Se sabe q ue los vectores para terapia de gen de adenovirus exh iben expresión transitoria intensa, título excelente , y la capacidad de transd uci r células en división y q ue no presenta n división in vivo (Hitt et al . 2000. Adv in Virus Res 55:479-505) . Los vectores de Ad recombinantes pueden comprender un sitio de empaquetamiento que permite q ue el vector se pueda i ncorporar en viriones de Ad defectuosos en cuanto a replicación; la secuencia codificadora para dos o más polipéptidos o proteínas de interés, por ejemplo, las cadenas pesada y ligera de una inmunoglobulina de interés; y una secuencia que codifica para un sitio de corte auto-procesador solo o en combinación con un sitio de corte proteolítico adicional. Otros elementos necesarios o útiles para incorporación en viriones infecciosos, incluyen las ITRs de Ad 5' y 3', los genes E2, porciones del gen E4 y opcionalmente el gen E3.

Los viriones de Ad defectuosos en cuanto a replicación que encapsulan los vectores de Ad recombinantes se elaboran utilizando técnicas estándar conocidas en el arte utilizando células para empaquetamiento de Ad y tecnología de empaquetamiento. Los ejemplos de estos métodos se pueden encontrar, por ejemplo en la patente E.U.A. No. 5,872,005. La secuencia que codifica para dos o más polipéptidos o proteínas de interés comúnmente se inserta en el adenovirus en la región E3 suprimida del genoma del virus. Los vectores adenovirales preferidos para uso en la práctica de la invención no expresan uno o más productos del gen Ad de tipo silvestre, por ejemplo, E1a, E1b, E2, E3, y E4. Las modalidades preferidas son viriones que típicamente se utilizan junto con líneas de célula de empaquetamiento que complementan las funciones de las regiones de los genes E1, E2A, E4 y opcionalmente el gen E3. Véase, por ejemplo, patentes E.U.A. Nos. 5,872,005, 5,994,106, 6,133,028 y 6,127,175.

Tal como se utilizan en la presente solicitud, "adenovirus" y "partícula de adenovirus" se refieren al virus mismo o a derivados del mismo y cubre todos los serotipos y subtipos y las formas tanto presentes natu ralmente como recombinantes, excepto en donde se indiq ue lo contrario. Dichos adenovirus pueden ser de tipo silvestre o pueden estar modificados en varias formas en la técnica o como se describe en la presente solicitud . Dichas modificaciones incluyen modificaciones al genoma del adenovi rus q ue está empacado en la partícu la con el fin de elaborar un virus infeccioso. Dichas modificaciones incluyen deleciones conocidas en el arte, tales como deleciones en una o más de las regiones codificadoras de E 1 a , E 1 b, E2a, E2b , E3 o E4. Los ejemplos de células para empaquetamiento y productoras se obtienen a partir de célu las 293, A549 o HeLa. Los vectores de adenovirus se purifican y formulan utiliza ndo técnicas estándar conocidas en el campo .

El virus adeno-asociado (AAV) es un parvovirus de humano depend iente del auxiliar el cual puede infectar las células de manera latente mediante integración cromosómica . Debido a su capacidad para integrarse en el cromosoma y a su natu raleza no patogén ica , el AAV tiene potencial sig nificativo como un vector para terapia de gen en humanos. Para uso en la práctica de la presente invención se pueden produci r viriones de rAAV utilizando metodolog ía estándar, conocida por los expertos en la técnica , y se construyen de manera tal q ue éstos incluyan , como componentes ligados en forma operativa en la dirección de transcripción , secuencias de control incluyendo secuencias de inicio y terminación de la transcripción , y la secuencia o secuencias codificadoras de interés. De manera más específica, los vectores de AAV recombinantes de la presente invención comprenden u n sitio de empaquetamiento que permite que el vector se pueda incorporar en viriones de AAV con replicación defectuosa ; la secuencia cod ificadora para dos o más polipéptidos o proteínas de interés , por ejemplo, las cadenas pesada y ligera de u na inmunoglobulina de interés; una secuencia que codifica para un sitio de corte auto-procesador solo o en combinación con uno o más sitios de corte proteol ítico adicionales . Los vectores de AAV para uso en la práctica de la invención se construyen de modo tal que éstos también incluyan , como componentes ligados de manera operativa en la d irección de la transcripción secuencias de control incluyendo secuencias de i n icio y terminación de tra nscripción . Estos componentes están flanqueados en los extremos 5' y 3' por secuencias de ITR de AAV funcionales . Con "secuencias de ITR de AAV funcionales" se quiere decir q ue las secuencias de ITR funcionan como se pretende para el rescate , replicación y empaquetamiento del virión de AAV.

Los vectores de AAV recombinantes también se caracterizan porque éstos pueden dirigir la expresión y producción de productos de polipéptido o proteína recombinante seleccionados en las células objetivo. Por lo tanto, los vectores recombinantes comprenden por lo menos todas las secuencias de AAV esenciales para la formación de la cápside y las estructu ras físicas para infección de los viriones de AAV recombinantes (rAAV) . Por lo tanto, las ITRs de AAV para uso en los vectores de expresión no necesitan tener una secuencia de nucleótido de tipo silvestre (por ejemplo, como se describe en Kotin. 1994. Hum. Gene Ther. 5:793-801) y se pueden alterar mediante la inserción, deleción o sustitución de nucleótidos o las ITRs de AAV se pueden obtener a partir de cualquiera de varios serotipos de AAV. En términos generales, un vector de AAV puede ser cualquier vector obtenido a partir de un serotipo de virus adeno-asociado conocido en la técnica.

Típicamente, se introduce un vector de expresión de AAV en una célula productora, seguido por introducción de una construcción auxiliar de AAV, en la cual la construcción auxiliar incluye regiones codificadoras de AAV que pueden ser expresadas en la célula productora y que complementan las funciones auxiliares de AAV ausentes en el vector de AAV. La construcción auxiliar puede estar diseñada para regular en forma negativa la expresión de las proteínas Rep grandes (Rep78 y Rep68), típicamente mutando el codón de inicio después de p5 de ATG a ACG como se describe en la patente E.U.A. No. 6,548,286, incorporada para referencia en la presente solicitud. Esto es seguido por introducción del virus auxiliar y/o vectores adicionales dentro de la célula productora, en la cual el virus auxiliar y/o vectores adicionales proveen funciones accesorias capaces de soportar la producción eficiente del virus de rAAV. Las células productoras se cultivan después para producir rAAV. Estos pasos se efectúan utilizando metodología estándar. Los viriones de AAV con replicación defectuosa que encapsulan los vectores de AAV recombinantes de la presente invención se elaboran utilizando técnicas estándar conocidas en el campo empleando células para empaquetamiento de AAV y tecnolog ía de empaquetamiento. Los ejemplos de estos métodos se pueden encontrar, por ejemplo, en las patentes E . U .A. Nos . 5 ,436, 1 46; 5, 753,500, 6, 040, 1 83, 6,093,570 y 6,548 ,286 , incorporadas para referencia en la presente solicitud en sus totalidades. Composiciones y métodos adicionales para empaquetamiento se describen en Wang et al . (Publicación de patente E. U .A 2002/01 68342) , también incorporada para referencia en la presente solicitud en su totalidad, e incluyen aquellas técnicas dentro del conocimiento de los expertos en el campo.

En la práctica de la invención , las células hospederas para producir rAAV u otro vector para expresión de vector de expresión incluyen células de mamífero, células de insecto, microorganismos y levadu ras . Las células hospederas también pueden ser células para empaq uetamiento en las cuales los genes rep y cap de AAV (u otro) se mantienen establemente en la célula hospedera o células productoras en las cuales el genoma del vector de AAV se mantiene y empaca de ma nera estable. Los ejemplos de células para empaq uetamiento y productoras se obtienen a partir de las célu las 293, A549 o HeLa. Los vectores de AAV se pu rifican y formulan utilizando técnicas estándar conocidas en el campo. Las células hospederas apropiadas adicionales (dependiendo del vector) incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) , variantes de CHO deficientes en dih idrofolato reductasa tales como las célu las C HO DX B11 o CHO DG44,(véase, por ejemplo, Urlaub y Chasin. 1980. Proc. Nati. Acad. Sci. 77:4216-4220), células PerC.6 (Jones et al. 2003. Biotechnol. Prog. 19:163-168) o células Sp/20 de mieloma de ratón (Coney et al. 1994. Cáncer Res.54:2448-2455).

Vectores retrovirales Se pueden utilizar vectores retrovirales para suministro de genes (Miller. 1992. Nature 357:455-460). Los vectores retrovirales y de manera más particular los vectores lentivirales se pueden utilizar en la práctica de la presente invención. Por consiguiente, el término "retrovirus" o "vector retroviral", tal como se utiliza en la presente solicitud pretende incluir "lentivirus" y "vectores lentivirales" respectivamente. Los vectores retrovirales han sido analizados y se encontró que son vehículos de suministro apropiados para la introducción estable de los genes de interés dentro del genoma de una amplia gama de células objetivo. La capacidad de los vectores retrovirales para suministrar transgenes de copia individual, no reacomodados dentro de las células hace que los vectores retrovirales sean adecuados para transferir genes al interior de las células. Además, los retrovirus entran a las células hospederas mediante la unión de las glucoproteínas de la envoltura retroviral a receptores de superficie de célula específicos en las células hospederas. Por consiguiente, los vectores retrovirales seudotipificados en los cuales la proteína de envoltura original codificada es reemplazada por una proteína de envoltura heteróloga que tiene una especificidad celular diferente que la de la proteína de envoltura origi nal (por ejemplo, se u ne a un receptor de superficie celular diferente en comparación con la proteína de envoltura original) también pueden encontrar utilidad en la práctica de la presente invención . La capacidad para dirigir el suministro de vectores retrovirales que codifican para u na o más secuencias codificadoras de proteína objetivo a célu las objetivo específicas es deseable en la práctica de la presente invención .

La presente invención provee vectores retrovirales los cuales incluyen por ejemplo, vectores de transferencia retrovirales q ue comprenden una o más secuencias de transgen y vectores de empaq uetamiento retroviral que comprenden uno o más elementos de empaquetamiento. En pa rticular la presente invención provee vectores retrovirales seudotipificados que codifican para una proteína de envoltu ra heteróloga o funcionalmente mod ificada para producir retrovirus seudotipificados.

La secuencia central de los vectores retrovirales de la presente invención se pueden obtener fácilmente a pa rtir de u na amplia variedad de retrovirus, incluyendo por ejemplo los retrovirus de tipo B, C , y D así como de espumavirus y lentivirus (véase RNA Tumor Viruses , Segunda Edición , Cold Spring Harbor Laboratory, 1 985) . U n ejemplo de un retrovirus apropiado para uso en las composiciones y métodos de la presente invención incluye, pero no se limita a , lentivirus. Otros retrovirus apropiados para uso en las composiciones y métodos de la presente invención incluyen , pero no se limitan a, virus de leucosis aviar, virus de leucemia bovina, virus de leucemia de múrido, virus inductor de foco en célula de Mink, virus de sarcoma de múrido, virus de reticuloendoteliosis y virus de sarcoma de Rous. Los virus de leucemia de múrido particularmente preferidos incluyen 4070A y 1504A (Hartley y Rowe. 1976. J. Virol. 19:19-25), virus de sarcoma de Abelson (ATCC No.VR-999), de Friend (ATCC No.VR-245), de Graffi, Gross (ATCC No.VR-590), de Kirsteni Harvey y virus de leucemia de múrido de Rauscher (ATCC No. VR-998), y de Moloney (ATCC No. VR-190). Dichos retrovirus pueden obtenerse fácilmente a partir de depósitos o colecciones tales como el Depósito Americano de Cultivos Tipo (ATCC; Manassas, VA), o aislar a partir de fuentes conocidas utilizando técnicas comúnmente disponibles. Otros se pueden conseguir comercialmente.

En una modalidad, una secuencia de vector retroviral de la presente invención se puede obtener a partir de un lentivirus. Un lentivirus preferido es un virus de inmunodeficiencia humana, por ejemplo, virus de tipo 1 ó 2 (es decir, VIH-1 o VIH-2, en los cuales VIH-1 se denominó anteriormente virus 3 asociado a linfoadenopatía (HTLV-III) y virus relacionado con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) (ARV)), u otros virus relacionados con VIH-1 o VIH-2 que han sido identificados y asociados con SIDA o enfermedad tipo SIDA. Otros lentivirus incluyen un virus Visna/maedi de oveja, un virus de inmunodeficiencia de felinos (VIF), un lentivirus de bovino, un virus de inmunodeficiencia de simio (VIS), un virus de anemia infecciosa de equino (VAIE), y un virus de artritis-encefalitis caprina (VAEC).

Los géneros y cepas apropiados de retrovirus son bien conocidos en la técnica (Véase, por ejemplo Fields Virology, Tercera Edición, editado por B.N. Fields et al. 1996. Lippincott-Raven Publishers, véase por ejemplo, capitulo 58, Retroviridae: The Viruses and Their Replication, Classification, páginas 1768-1771, incluyendo la Tabla 1 en el mismo, incorporado en la presente invención para referencia). Los sistemas de empaquetamiento retroviral para generar células productoras y líneas celulares productoras que produzcan retrovirus, y los métodos para elaborar dichos sistemas de empaquetamiento también son conocidos en la técnica.

Los sistemas de empaquetamiento típicos comprenden por lo menos dos vectores de empaquetamiento: un primer vector de empaquetamiento que comprende una primera secuencia de nucleótido que comprende un gen gag, un gen pol o los genes gag y pol; y un segundo vector de empaquetamiento que comprende una segunda secuencia de nucleótido que comprende un gen de envoltura heterólogo o funcionalmente modificado. Los elementos retrovirales se pueden obtener a partir de un lentivirus, tal como VIH. Los vectores pueden carecer de un gen tat funcional y/o genes accesorios funcionales (vif, vpr, vpu, vpx, nef). El sistema también puede comprender adicionalmente un tercer vector de empaquetamiento con una secuencia de nucleótido que comprende un gen rev. El sistema de empaquetamiento se puede proveer en forma de una célula de empaquetamiento que contiene la primera, segunda, y, opcionalmente, la tercera secuencia de nucleótido.

En modalidades, existe aplicabilidad a una variedad de sistemas de expresión, especialmente aquellos con células eucariotas, y de manera conveniente células de mamífero. En casos en los que las proteínas originales estén glucosiladas, las modalidades preferibles pueden implicar un sistema de expresión que provea glucosilación tipo original a las proteínas expresadas.

Los lentivirus comparten varias proteínas estructurales de virión en común, incluyendo las glucoproteínas de envoltura SU (gp120) y TM (gp41), las cuales son codificadas por el gen env; CA (p24), MA (p17) y NC (p7-11), las cuales son codificadas por el gen gag; y RT, PR e IN codificadas por el gen pol. VIH-1 y VIH-2 contienen proteínas accesorias y otras proteínas implicadas en la regulación de la síntesis y procesamiento del ARN del virus y otras funciones de replicación. Las proteínas accesorias, codificadas por los genes vif, vpr, vpu/vpx, y nef, pueden estar omitidas (o inactivadas) del sistema recombinante. Además, tat y rev pueden omitirse o inactivarse, por ejemplo, mediante mutación o deleción.

Los sistemas de empaquetamiento de vector lentiviral de primera generación proveen construcciones de empaquetamiento separadas para gag/pol y env, y típicamente utilizan una proteína de envoltura heteróloga o funcionalmente modificada por razones de seguridad. En los sistemas de vector lentiviral de segunda generación, los genes accesorios vif, vpr, vpu, y nef, están suprimidos o inactivados. Los sistemas de vector lentiviral de tercera generación son aquellos a partir de los cuales el gen tat ha sido eliminado o de alg una otra manera inactivado (por ejemplo, mediante mutación) .

La compensación para la reg ulación de la transcripción normalmente provista por tat puede ser provista mediante el uso de un promotor constitutivo fuerte, tal como el incrementador/promotor tempra no inmediato de citomegalovirus (HCAAV-I E) de humano. Se pueden seleccionar otros promotores/incrementadores tomando como base la fuerza de la actividad del promotor constitutivo , especificidad para tejido objetivo (por ejemplo, un promotor específico de h ígado), u otros factores referentes al control deseado sobre la expresión, como se entiende en la técnica . Por ejemplo, en algunas modalidades, sería deseable utilizar un promotor ¡nducible tal como tet para log rar expresión controlada. El gen que codifica para rev puede ser provisto en una construcción de expresión separada , de modo tal q ue un sistema de vector lentiviral de tercera generación típico implique cuatro plásmidos: uno de cada uno para gagpol, rev, envoltura y el vector de transferencia . I ndependientemente de la generación del sistema de empaquetamiento utilizado, gag y pol pueden ser provistos en una construcción ind ividual o en construcciones separadas.

Típicamente, los vectores de empaquetamiento están incluidos en una célula de empaquetamiento y se introducen en la célula mediante tra nsfección , transducción o infección . Los métodos pa ra tra nsfección , transd ucción o infección son bie n con ocidos por los expertos en la técnica. Un vector de transferencia retroviral de la presente invención se puede introducir dentro de una línea de célula de empaquetamiento, mediante transfección, transducción o infección, para generar una célula productora o línea celular productora. Los vectores de empaquetamiento de la presente invención se pueden introducir dentro de células o líneas de células de humano utilizando métodos estándar incluyendo, por ejemplo, transfección con fosfato de calcio, lipofección o electroporación. En algunas modalidades, los vectores de empaquetamiento se introducen dentro de las células junto con un marcador seleccionable dominante, tal como neo, dihidrofolato reductasa (DHFR), glutamina síntetasa o ADA, seguido por selección en presencia del fármaco apropiado y aislamiento de los clones. Un gen marcador seleccionable puede estar ligado físicamente a los genes codificados por el vector de empaquetamiento.

Son conocidas líneas celulares estables, en las cuales las funciones de empaquetamiento están configuradas para que se expresen utilizando una célula de empaquetamiento apropiada. Por ejemplo, véase patente E.U.A. No. 5,686,279; y Ory et al. 1996. Proc. Nati. Acad. Sci. 93:11400-11406, las cuales describen células de empaquetamiento. La descripción adicional de la producción de línea de célula estable se puede encontrar en Dull et al. 1998. J. Virol. 72(11):8463-8471; y en Zufferey et al. 1998. J. Virol. 72:9873-9880.

Zufferey et al. 1997. Nat. Biotechnol. 15:871-75, enseñan un plásmido de empaquetamiento lentiviral en el cual las secuencias 3' de pol incluyendo el gen de la envoltura de VIH-1 están suprimidas. La construcción contiene las secuencias de tat y rev y la LTR 3' está reemplazada con secuencias de poli A. Las secuencias de 5' LTR y psi están remplazadas con otro promotor, tal como uno que sea inducible. Por ejemplo, se pueden utilizar un promotor de CMV o derivado del mismo.

Los vectores de empaquetamiento pueden contener cambios adicionales a las funciones de empaquetamiento para incrementar la expresión de proteína lentiviral y para incrementar la seguridad. Por ejemplo, se pueden eliminar todas las secuencias de VIH hacia el extremo 5' de gag. Además, se pueden eliminar las secuencias hacia el extremo 3' de la envoltura. Asimismo, se pueden tomar pasos para modificar el vector para incrementar el empalme y traducción del ARN.

De manera opcional, se utiliza un sistema de empaquetamiento condicional, tal como el descrito por Dull et al. 1998. supra. También se prefiere el uso de un vector de auto-inactivación (SIN), el cual mejora la bioseguridad del vector mediante deleción de la repetición terminal larga (LTR) de VIH-1 como se describe, por ejemplo, en Zufferey et al. 1998. J. Virol. 72:9873-9880. También se pueden utilizar vectores inducibles, tales como a través de una LTR inducible con tetraciclina.

Promotores En modalidades, los vectores de la invención típicamente incluyen secuencias de control heterólogas, las cuales incluyen, pero no se limitan a, promotores constitutivos, tales como el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), la LTR de RSV, la LTR de MOMLV, y el promotor PGK; promotores específicos de tejido o de tipo celular incluyendo mTTR, TK, HBV, hAAT, promotores susceptibles de regulación o inducción, incrementadores, etc.

Algunos promotores útiles incluyen al promotor LSP (III et al. 1997. Blood Coagul. Fibrinolysis 8S2:23-30), el promotor EF1-alfa (Kim et al. 1990. Gene 91 (2):217-23) y Guo et al. 1996. Gene Ther. 3(9):802-10). Los promotores más preferidos incluyen el promotor del factor de elongación 1 -alfa (EF1a), un promotor de fosfoglicerato cinasa-1 (PGK), un promotor del gen temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), promotores específicos de hígado (LSPs) quiméricos, un promotor de incrementador de citomegalovirus/beta-actina de pollo (CAG), un promotor que responda a tetraciclina (TRE), un promotor de transtiretina (TTR), un promotor de virus 40 de simio (SV40) y un promotor CK6. Un promotor conveniente útil en la práctica de la presente invención es el promotor tardío mayor de adenovirus (Berkner y Sharp. 1985. Nucí. Acids Res. 13:841-857). La información estructural y funcional de promotores relevantes son conocidas en la técnica. Las secuencias relevantes se pueden obtener fácilmente a partir de bases de datos públicas e incorporar en vectores para uso durante la práctica de aspectos de la presente invención.

Un promotor particularmente preferido en la práctica de la presente invención es el promotor tard ío mayor de Adenovirus. U n cassette de expresión puede comprender, en la di rección 5' a 3' , u n promotor tard ío mayor de adenovirus, u na secuencia líder tripartita de manera operable a una primera secuencia cod ificadora para una proteína de interés o cadena de proteína de interés , una secuencia que codifica para u na secuencia auto-procesadora todo secuencia de corte de proteasa , una segunda secuencia codificadora para una proteína o cadena de proteína de interés, y opcionalmente una secuencia que codifica para una secuencia auto-procesadora o secuencia de corte de proteasa, seg uido por una tercera secuencia codificadora para una proteína o cadena de proteína de interés. Todas estas secuencias codificadoras están u'nidas covalentemente y en el mismo marco de lectu ra de modo tal que la traducción no es concluida dentro de la secuencia codificadora de la poli-proteína. Du rante la síntesis de proteína o después que finaliza la síntesis del polipéptido el auto procesamiento o procesamiento proteol ítico corta la poli-proteína como cadenas de proteína o proteínas apropiadas. En el caso de la s íntesis de inmunoglobu lina , la secuencia codificadora para la cadena ligera está presente dos veces dentro de la secuencia codificadora de poli-proteína. De manera conveniente, las reg iones que codifican para la secuencia l íder pueden estar asociadas con las secuencias de proteína o cadena de proteína; el procesamiento med iante peptidasas de señal fue detener el beneficio ag regado de eliminar ciertos residuos de ami noácido resid uales en los extremos N-terminales de las proteínas hacia el extremo 3' de los sitios de procesamiento. Los componentes para la cadena pesada de inmunoglobulinas son Met, metionina de inicio de la protelna; HC, cadena pesada; LC, cadena ligera, SPPC, sitio auto-procesador o de corte de proteasa. Las construcciones de expresión para la síntesis de inmunoglobulina pueden incluir las siguientes: Met-proteasa-SPPC-secuencia líder de HC-HC-SPPC-secuencia líder de LC-LC-SPPC-secuencia líder de LC-LC; Met-proteasa-SPPC-secuencia líder de LC-LC-SPPC-secuencia líder de LC-LC-SPPC-secuencia líder de HC-HC; Met-proteasa-SPPC-secuencia líder de LC-LC-SPPC-secuencia líder de HC-HC-SPPC-secuencia líder de LC-LC; secuencia líder de HC-HC-SPPC-secuencia líder de LC-LC-SPPC-secuencia líder de LC-LC; secuencia líder de LC-LC-SPPC-secuencia líder de HC-HC-SPPC-secuencia líder de LC-LC; secuencia líder de LC-LC-SPPC-secuencia líder de LC-LC-SPPC-secuencia líder de HC-HC; Met-proteasa-SPPC-líder de HC-HC-SPPC-líder de LC-LC.

Moléculas bioterapéuticas incluyendo anticuerpos Dentro del alcance de la presente invención, los anticuerpos particulares expresados (inmunoglobulinas) pueden incluir, entre otros, aquellos que se unen específicamente al factor de necrosis tumoral (anticuerpo diseñado correspondiente a y/o derivado de HUMIRA/D2E7; marca comercial para adalimumab de Abbott Biotechnology Ltd., Hamilton, Bermuda); interleucina-12 (anticuerpo diseñado derivado de ABT-874); interleucina-18 (anticuerpo diseñado derivado de ABT-325); receptor de eritropoyetina recombinante (anticuerpo diseñado derivado de ABT-007); o E/L selectina (anticuerpo diseñado derivado de EL246-GG). Las secuencias codificadoras y de aminoácido de las poli-proteínas diseñadas se describen con la presente solicitud o están disponibles en la técnica. Anticuerpos adicionales que son apropiados para la presente invención incluyen, por ejemplo, Remicade (infliximab); Rituxan/Mabthera (rituximab); Herceptina (trastuzumab); Avastina (bevacizumab);Synagis (palivizumab); Erbitux (cetuximab); Reopro (abciximab); Ortoclon OKT3 (muromonab-CD3); Zenapax (dadizumab); Simulect (basiliximab); Mylotarg (gemtuzumab); Campath (alemtuzumab); Zevalin (ibritumomab); Xolair (omalizumab); Bexxar (tositumomab); y Raptiva (efalizumab); en los cuales generalmente un nombre de marca comercial es seguido por un nombre genérico respectivo entre paréntesis. Las proteínas apropiadas adicionales incluyen, por ejemplo, una o más de epoetin alfa, epoetin beta, etanercept, darbepoetin alfa, filgrastim, interferón beta 1a, interferón beta 1b, interferón alfa-2b, insulina glargina, somatropina, teriparatida, folitropina alfa, domasa, Factor VIII, Factor VII, Factor IX, imiglucerasa, nesiritida, lenograstim, y Factor de Von Willebrand; en las cuales una o más designaciones genéricas puede corresponder cada una a uno o más nombres de marca comercial de los productos. Otros anticuerpos y proteínas son apropiadas para la presente invención como se podría entender en la técnica.

La presente invención también contempla la expresión controlada de la secuencia codificadora para dos o más polipéptidos o proteínas o proproteínas de interés. Los sistemas de regulación de gen son útiles en la expresión modulada de un gen o genes particulares. En un método de ejemplo, un sistema de regulación de gen o interruptor incluye un factor de transcripción quimérico que tiene un dominio de unión a ligando, un dominio de activación de transcripción y un dominio de unión a ADN. Los dominios se pueden obtener a partir de virtualmente cualquier fuente y se pueden combinar en cualquiera de un número de maneras para obtener una proteína novedosa. Un sistema de gen regulable también incluye un elemento de respuesta a ADN el cual interactúa con el factor de transcripción quimérico. Este elemento regulador de la transcripción está localizado adyacente al gen que va a ser regulado.

Los ejemplos de sistemas de regulación de transcripción que se pueden utilizar en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, el sistema ecdysone de Drosophila (Yao et al. 1996. Proc. Nati. Acad. Sci. 93:3346), el sistema ecdysone de Bombyx (Suhr et al. 1998. Proc. Nati. Acad. Sci. 95:7999), el sistema de receptor de progesterona sintético GeneSwitch (marca registrada de Valentis, The Woodlands, TX) el cual utiliza RU486 como el inductor (Osterwalder et al. 2001. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98(22):12596-601 ); los sistemas Tet y RevTet (sistemas de expresión regulados con tetraciclina, marcas registradas de BD Biosciences Clontech, Mountain View, CA), los cuales utilizan moléculas pequeñas, tales como tetraciclina (Te) o análogos, por ejemplo doxiciclina, para regular (encender o apagar) la transcripción del objetivo (Knott et al. 2002. Biotechniques 32(4):796, 798, 800); Tecnología de Regulación de ARIAD (Ariad, Cambridge, MA) el cual se basa en el uso de una molécula pequeña para poner juntas dos moléculas intracelulares, cada una de las cuales está ligada a ya sea un activador de transcripción o una proteína de unión a ADN. Cuando estos componentes se juntan, se activa la transcripción del gen de interés. Ariad tiene un sistema basado en homodimerización y un sistema basado en heterodimerización (Rivera et al. 1996. Nature Med. 2(9):1028-1032; Ye et al. 2000. Science 283:88-91).

Las modalidades de las construcciones de vector de expresión de la invención que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican para anticuerpos o fragmentos de los mismos u otras proteínas heterólogas o pro-proteínas en forma de polipéptidos recombinantes auto-procesadores o cortados con proteasa se pueden introducir en las células in vitro, ex vivo o in vivo para el suministro de exógeno, terapéutico o transgenes a las células, por ejemplo, células somáticas, o en la producción de polipéptidos recombinantes utilizando células transducidas con vector.

Células hospederas v suministro de vectores Las construcciones de vector de la presente invención se pueden introducir al interior de células apropiadas in vitro o ex vivo utilizando metodología estándar conocida en la técnica. Dichas técnicas incluyen, por ejemplo, transfección utilizando fosfato de calcio, micro-inyección en células cultivadas (Capecchi. 1980. Cell 22:479-488), electroporación (Shigekawa et al. 1988. BioTechnology 6:742-751), transferencia de gen mediada por liposoma (Mannino et al. 1988. BioTechnology 6:682-690), transducción mediada por lípido (Feigner et al. 1987. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:7413-7417), y suministro de ácido nucleico utilizando microproyectiles a alta velocidad (Klein et al. 1987. Nature 327:70-73).

Para la expresión in vitro o ex vivo, se puede utilizar cualquier célula efectiva para expresar un producto de proteína funcional. En la técnica se conocen numerosos ejemplos de células y líneas celulares utilizadas para expresión de proteína. Por ejemplo, se pueden utilizar células procariotas y células de insecto para la expresión. Además, se pueden utilizar microorganismos eucariotas, tales como levaduras. La expresión de proteínas recombinantes en sistemas procariotas, de insecto y de levadura son conocidas en términos generales en la técnica y se pueden adaptar para la expresión de anticuerpo u otra proteína utilizando las composiciones y métodos de la presente invención.

Los ejemplos de células útiles para expresión también incluyen células de mamífero, tales como células de fibroblasto, células provenientes de mamíferos no humanos tales como células de ovino, de porcino, de múrido y de bovino, células de insecto y similares. Los ejemplos específicos de células de mamífero incluyen, sin limitación, células COS, células VERO, células HeLa, células de ovario de hámster Chino (CHO), células CHO DX B11, células CHO DG44, células PerC.6, células Sp2/0, células 293, células NSO, células de fibroblasto 3T3, células W138, células BHK, células HEPG2, y células MDCK.

Las células hospederas se cultivan en medios nutritivos convencionales, modificados según sea apropiado para inducir los promotores, seleccionar los transformantes, o amplificar los genes que codifican para las secuencias deseadas. Las células hospederas de mamífero se pueden cultivar en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tales como Ham's F10 (Sigma), Medio Esencial Mínimo (MEM) (Sigma), RPMI 1640 (Sigma), Medio Esencial Mínimo (MEM) Medio Alfa, y Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) (Sigma), típicamente son apropiados para cultivar las células hospederas. Un medio dado generalmente es complementado según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato), amortiguadores (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos, elementos traza, y glucosa o una fuente de energía equivalente. También se pueden incluir cualesquiera otros complementos necesarios a las concentraciones apropiadas como es bien sabido por los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo apropiadas para una línea celular particular, tal como temperatura, pH y similares, generalmente son conocidas en la técnica, con condiciones de cultivo para el cultivo de numerosas líneas celulares siendo sugeridas , por ejemplo, en el Catálogo del ATCC (dispon ible en la I nternet en la página "atcc.org/SearchCatalogs/AIICollections.cfm" o como sea indicado por los proveedores comerciales.

Los vectores de expresión se pueden administra r in vivo a través de diversas vías (por ejemplo, intradérmica , intravenosa, intra-tumoral , dentro del cerebro, intra-orificios, intraperitoneal, intramuscular, dentro de la vejiga u rinaria, etc. ) , para suministrar genes múltiples conectados mediante una secuencia de corte auto-procesadora para expresar dos o más proteínas o poiipéptidos en modelos animales o individuos humanos. Dependiendo de la vía de administración , las proteínas terapéuticas inducen su efecto localmente (en el cerebro o vejiga u rinaria) o sistémicamente (otras vías de admin istración) . El uso de promotores específicos de tejido 5' con respecto al marco o marcos de lectura abiertos da como resultado la expresión específica de tejido de las proteínas o poiipéptidos codificados por el marco de lectura abierto completo.

Varios métodos que introducen un vector de expresión recombinante que porta un transgen al interior de las cél ulas, in vitro, ex vivo o in vivo, han sido previamente descritos y son bien conocidos en la técnica . La presente invención provee métodos terapéuticos, vacu nas, y terapias contra cáncer infectando las células elegidas como blanco con los vectores recombinantes que contienen la secuencia codificadora para dos o más proteínas o poiipéptidos de interés, y expresando las proteínas o poiipéptidos en la célula elegida como blanco.

Por ejemplo , el suministro in vivo de los vectores recombinantes de la invención se puede dirigir a una amplia variedad de tipos de órganos incluyendo, pero sin limitarse a cerebro , h ígado, vasos sangu íneos, músculo, corazón , pulmón y piel .

En el caso de transferencia de genes ex vivo, las células objetivo se retiran del hospedero y se modifican genéticamente en el laboratorio utilizando vectores recombinantes de la presente invención y métodos bien conocidos en la técnica.

Los vectores recombinantes de la invención se pueden admin istrar utilizando modos convencionales de ad ministración incluyendo pero sin limitarse a los modos descritos anteriormente. Los vectores recombina ntes de la invención pueden estar en u na variedad de formulaciones las cuales incluyen pero no se limitan a soluciones líquidas y suspensiones, microvesículas, liposomas y soluciones inyectables o para infusión . La forma preferida depende del modo de administración y de la aplicación terapéutica.

En modalidades, las ventajas de las construcciones de vector de expresión en la producción de inmu noglobulina u otra proteína biológicamente activa in vivo incluyen la admi nistración de un vector individual para expresión de anticuerpo a largo plazo y sostenida en los pacientes; expresión in vivo de un anticuerpo o fragmento del mismo (u otra proteína biológicamente activa) q ue tenga actividades biológ icas completas; y las modificaciones naturales post-trad ucción del anticuerpo generado en células de huma no. De manera deseable, la proteína expresada es idéntica a o lo suficientemente idéntica a una proteína que ocurre de manera natural de modo que se reduzcan las respuestas inmunológicas o no sean provocadas en caso en que la proteína expresada se admin istre en ocasiones múltiples o se exprese continuamente en un paciente en necesidad de dicha proteína.

Las modalidades de las construcciones de vector recombinante de la presente invención encuentran utilidad adicional en la prod ucción in vitro de anticuerpos recombinantes y otras proteínas biológicamente activas para uso en terapia o en investigación . Los métodos para la producción de proteína recombinante son bien conocidos en la técnica y se pueden utilizar para la expresión de anticuerpos recombinantes utilizando el sitio de corte auto-procesador u otras construcciones de vector q ue contengan sitio de corte de proteasa descritos en la presente solicitud .

En un aspecto, la invención provee métodos para producir una inm u noglobulina recombinante o fragmento de la misma, media nte i ntroducción de u n vector de expresión tal como los descritos anteriormente dentro de u na célula para obtener una célula transfectada , en el cual el vector comprende en la dirección 5' a 3': un promotor ligado en forma operable a las secuencias codificadoras para las cadenas pesada y dos cadenas ligeras de i nmu noglobulina o fragmentos de las mismas, una secuencia auto-procesadora entre cada una de d ichas cadenas. Se apreciará q ue la secuencia codificadora para cualquiera de la cadena pesada de inmunoglobulina o la secuencia codificadora para la cadena ligera de inmunoglobulina puede ser 5' (es decir, primera) con relación a la secuencia auto-procesadora en una construcción de vector dada.

En una modalidad de una construcción para un anticuerpo, la secuencia que codifica para la primera o la segunda cadena para un anticuerpo o inmunoglobulina o un fragmento de la misma incluye una cadena pesada o un fragmento de la misma derivada de una IgG, IgM, IgD, IgE o IgA. Como se indicó ampliamente, la secuencia que codifica para la cadena para un anticuerpo o inmunoglobulina o un fragmento de la misma también incluye la cadena ligera o un fragmento de la misma proveniente de una IgG, IgM, IgD, IgE o IgA. Las modalidades de la invención se refieren a genes que corresponden a proteínas para moléculas de anticuerpo completo así como formas modificadas o derivadas a partir de los mismos, las cuales incluyen, por ejemplo, otros fragmentos de moléculas de reconocimiento de antígeno tales como Fab, Fv de cadena individual (scFv) y F(ab')2. Los anticuerpos y fragmentos pueden ser derivados de animales, quiméricos de humano-ratón, humanizados, alterados utilizando Deimmunisation™ (Biovation Ltd), alterados para cambiar la afinidad para los receptores de Fe, o completamente humanos. Las modalidades de moléculas de unión a ligando se pueden madurar por afinidad como se entiende en la técnica. En modalidades preferidas, el anticuerpo u otra proteína recombinante no induce o provoca mínimamente una respuesta inmune en un humano o animal al cual éste se administra.

Los anticuerpos pueden ser biespecíficos e incluir, pero no se limitan a, dianticuerpos, cuadroma , mini-anticuerpos, anticuerpos de ScBs y anticuerpos de tipo botones en ojales.

La producción y recuperación de los anticuerpos como tal se puede log rar en varias ma neras bien conocidas en la técnica (Harlow et al . 1 988. Antibodies, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory) . Otras proteínas de interés se recolecta n y/o purifican y/o utilizan de conformidad con métodos bien conocidos en la técnica .

En la práctica de las modalidades de la i nvención , la producción de un anticuerpo o variante (análogo) del mismo utilizando tecnolog ía de AD N recombinante se puede lograr cultivando una célula hospedera modificada recombi nante bajo cond iciones de cultivo apropiadas para el crecimiento de la célula hospedera y la expresión de las secuencias codificadoras. Con el fi n de mon itorear el éxito de la expresión , se pueden mon itorear los niveles de anticuerpo con respecto al antígeno utiliza ndo técnicas estándar tales como ELI SA, R IA y similares. Los anticuerpos se recuperan del sobrenadante de cultivo utilizando técn icas estándar conocidas en el campo. Desde l uego, las formas pu rificadas de estos anticuerpos se pueden preparar fácilmente utilizando técnicas estándar de purificación i ncluyendo pero si n limitarse a, cromatografía por afinidad a través de columnas de protef na A, proteína G o proteína L, o con respecto al antígeno particular, o incluso con respecto al epítope particu lar del antígeno para el cual se desea la especificidad . Los anticuerpos también se pueden purificar como se entiende en la técnica con cromatografía convencional , tal como colum na de intercambio iónico , de i nteracción hidrofóbica, de afinidad , o de exclusión de tamaño. Véase también los documentos US 5,641 ,870 de Rinderknecht, et al . , 24 de junio de 1997, para "Low pH hydrophobic interaction ch romatography for antibody purification" y US 7,427,659 de Shukla , et al. , 23 de septiembre de 2008 para "Process for pu rifying proteins i n a hydrophobic interaction chromatography flow-th rough fraction" , que describen técn icas de pu rificación . Las técnicas de purificación se pueden efectuar en varias combinaciones o en conju nto con otras tecnologías, tales como precipitación con sulfato de amoniaco y filtración en membrana limitada por tamaño. En casos en los que los sistemas de expresión están d iseñados para incluir péptidos de señal, los a nticuerpos resultantes se secretan hacía el medio o sobrenadante del cultivo ; sin embargo, también es posible la producción ¡ntracelu lar. Los contenidos intracelulares se pueden recupera r y someter a purificación .

Se pueden seleccionar condiciones de cultivo celular q ue promuevan u n nivel deseado de procesamiento de la poliproteína , por ejemplo , el procesamiento más completo. Dicho procesamiento puede tomar lugar intracelu larmente, pero también podría tomar lugar extracelularmente, durante o después del procedimiento de cultivo celula r.

La producción y selección de anticuerpos monoclonales completamente humanos, específicos de antígeno a partir de ratones diseñados genéticamente con loci de Ig de humano, ha sido previamente descrita (Jakobovits et al. 1998. Advanced Drug Delivery Reviews 31:33-42; Méndez et al. 1997. Nature Genetics 15:146-156; Jakobovits et al. 1995. Curr Opin Biotechnol 6:561-566; Green et al. 1994. Nature Genetics Vol.7:13-21).

Se ha logrado nivel alto de expresión de anticuerpos monoclonales terapéuticos en la leche de cabras transgénicas, y se ha demostrado que los niveles de unión a antígeno son equivalentes a los de los anticuerpos monoclonales que se producen utilizando tecnología de cultivo celular convencional. Este método se basa en el desarrollo de proteínas terapéuticas humanas en la leche de animales transgénicos, los cuales portan información genética que permite que éstos expresen proteínas terapéuticas de humano en su leche. Una vez que éstas se producen, dichas proteínas recombinantes se pueden purificar de manera eficiente a partir de la leche utilizando tecnología estándar. Véase, por ejemplo, Pollock et al. 1999. J. Immunol. Meth. 231:147-157 y Young et al. 1998. Res Immunol. 149(6): 609-610. La leche animal, clara de huevo, sangre, orina, plasma seminal y capullos de gusano de seda provenientes de animales transgénicos han demostrado potencial como fuentes para la producción de proteínas recombinantes a una escala industrial (Houdebine L M. 2002. Curr Opin Biotechnol 13:652-629; Little et al. 2000. Immunol Today, 21 (8):364-70; y Gura T. 2002. Nature, 417:584-5860). La invención contempla el uso de sistemas de expresión en animales transgénicos para expresión de un anticuerpo recombinante o variante (análogo) u otra proteína o proteínas de interés del mismo utilizando los vectores de sitio de reconocimiento de proteasa y/o que codifican para sitio de corte auto-procesador de la invención .

También se ha demostrado satisfactoriamente la producción de proteínas recombinantes en plantas incluyendo, pero sin limitarse a , papas, jitomates , tabaco , arroz, y otras plantas tra nsformadas mediante infección con Agrobacterium , transformación biolística , transformación de protoplasto, y similares. La expresión de GM-CSF recombinante de humano en las semillas de plantas de tabaco transgénicas y la expresión de anticuerpos incluyendo anticuerpos de cadena individual en plantas ha sido demostrada. Véase , por ejemplo, Streaffield y Howard . 2003. I nt. J . Parasitol. 33:479-93; Sch illberg et al . 2003. Cell Mol Life Sci . 60:433A5; Pog ue et al . 2002. Ann u . Rev. Phytopathol . 40:45-74 ; y McCormick et al. 2003. J Immu nological Methods , 278: 95-1 04. La invención contempla el uso de sistemas de expresión en planta transgénica para la expresión de una inmunoglobulina recombinante o fragmento de la misma u otra(s) proteína(s) de interés utilizando vectores que codifican para sitio de corte de proteasa o para sitio de corte auto-procesador de la invención .

Los sistemas de expresión de vector de baculovirus en conjunto con células de insecto también están ganando terreno como u na plataforma viable para la prod ucción de proteína recombinante.

Se ha reportado que los sistemas de expresión de vector de baculovi rus proveen ventajas con relación al cultivo de células de mamífero tales como facilidad de cultivo y niveles de expresión más altos . Véase, por ejemplo, Ghosh et al . 2002. Mol Ther. 6: 5-1 1 , e Ikonomou et al . 2003. Appl Microbio! Biotechnol . 62 : 1 -20. La invención también contempla el uso de sistemas de expresión de vector de baculovirus para expresión de u na inmu noglobulina recombinante o fragmento de la misma utilizando los vectores q ue codifican para sitio de corte auto-procesador de la invención . Los vectores de baculovirus y células hospederas apropiadas son bien conocidas en la técnica y se pueden conseg u ir comercialmente .

Los sistemas basados en levad u ra también se pueden utilizar para expresión de una inmunoglobulina recombinante o fragmento de la misma u otra(s) proteína(s) de interés, incluyendo sistemas de dos híbridos o tres híbridos, utilizando los vectores que codifican para sitio de corte auto-procesador de la invención . Véase, por ejemplo, patente E . U .A. No. 5,643 ,745 , incorporada para referencia en la presente solicitud.

Se entiende que los cassettes y vectores de expresión y células hospederas recombi nantes de la presente invención q ue comprenden las secuencias codificadoras para u n péptido auto-procesador sólo o en combinación con secuencias codificadoras adicionales para un sitio de corte proteol ítico encuentran utilidad en la expresión de inmunoglobulinas recombinantes o fragmentos de las mismas, pro-proteínas , proteínas biológicamente activas y componentes de proteína de sistemas de dos y tres híbridos, en cualquier sistema de expresión de proteína, un número de los cuales se conocen en la técnica y cuyos ejemplos de los mismos se describen en la presente solicitud. El experto en la técnica puede adaptar fácilmente modalidades de los vectores, células hospederas, y métodos de la invención para uso en cualquier sistema de expresión de protelna.

EJEMPLO 1 Inteínas de la proteasa Lon y construcciones de expresión Tres inteínas de proteasa Lon dependientes de ATP se reportan en la base de datos de inteína de New England Biolabs (NEB, Ipswich, Massachusetts, E.U.A) (InBase, The Intein Datábase and Registry; at http://www.neb.com/neb/inteins.html). Véase Perler, F. B. (2002). InBase, the Intein Datábase. Nucleic Acids Res. 30, 383-384. Estas inteínas provienen de los organismos Pyrococcus abyssi (inteína Pab Lon), Pyrococcus furiosus (inteína Pfu Lon), y Pyrococcus horikoshii OT3 (inteína Pho Lon). Estas inteínas Lon tienen dominios de endonucleasa propuestos, lisinas en lugar de histidinas como el penúltimo residuo de la inteína, y diferentes longitudes (333, 401, y 474 aminoácidos, respectivamente). En la base de datos de NEB todas las tres inteínas lon están indicadas como inteínas teóricas, lo cual de conformidad con la base de datos indican que el contribuyente del listado no indica que se ha demostrado la presencia de producto empalmado para una entrada de inteína dada. Se indica que se ha descubierto que el dominio de endonucleasa de la inteína Pab Lon no tiene actividad experimentalmente (Saves I, Morlot C, Thion L, Rolland JL, Dietrich J, Masson JM. Investigating the endonuclease activity of four Pyrococcus abyssi inteins. Nucleic Acids Res. 2002 Octubre 1;30(19):4158-65).

Los inventores han descubierto que las inteínas que están contenidas en la familia de genes lon de proteasa dependiente de ATP son muy eficientes para mediar los cortes de la cadena pesada y las cadenas ligeras del anticuerpo en varios diseños de construcción de marco de lectura abierto individual. La información de secuencia relacionada con estas inteínas se provee con la presente solicitud.

Secuencias de inteína Lon v diseños de construcción de vector La Tabla 1 provee información de secuencia de proteína para la inteína Pab Lon, No de acceso CAB50486.1 en NCBI/proteína, inteína Pab Lon PAB1313, incluyendo los residuos -1 y +1 de exteína (SEQ ID NO:1).

TABLA 1 Inteína Pab Lon, secuencia de aminoácido (SEQ ID NO:1) QCFSGEETVVIRENGEVKVLRLKDFVE ALE PSGEGLDGDVKVVYHDFRNENVEVLT DGFTKLLYA NK TABLA 1 (con RIGKQKLRRVVNLEKDYWFALTPDHKVYTTDGLKEAGEITEKDELISVPITVFDCEDEDLKKIGLLPL TS DDERLR IATLMGILFNGGSIDEGLGVLTL SERSVIE FVITL ELFGKFEYEIIKEENTIL TRDP RI IKFLVGLGAPIEGKDLKMPWWVKLKPSLFLAFLEGFRAHIVEQLVDDPNKNLPFFQELSWYLGLFGIK AD IKVEEVGDKHKIIFDAGRLDVDKOFIETWEDVEVTYNLTTEKGNLLANGLFVKNS 220 La Tabla 2 describe una secuencia de nucleótido para la inteína Pab Lon la cual ha sido optimizada para utilización de codón . 10 TABLA 2 inteína Pab Lon. secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 2) tgcttcagcggcgaggaaaccgtggtgatccgggagaacggcgaggtgaaggtgctgcggct gaaggacttcgtggagaaggccctggaaaagccctccggcgagggcctggacggcgacgtga aagtggtgtaccacgacttccggaacgagaacgtggaggtgctgaccaaggacggcttcacc aagctgctgtacgccaacaagcggatcggcaagcagaaactgcggcgggtggtgaacctgga aaaggactactggttcgccctgacccccgaccacaaggtgtacaccaccgacggcctgaaag ,j g aggccggcgagatcaccgagaaggacgagctgatcagcgtgcccatcaccgtgttcgactgc gaggacgaggacctgaagaagatcggcctgctgcccctgaccagcgacgacgagcggctgcg gaagatcgccaccctgatgggcatcctgttcaacggcggcagcatcgatgagggcctgggcg tgetgaccctgaagagcgagcggagcgtgatcgagaagttcgtgatcaceetgaaagagctg ttcggcaagttcgagtacgagatcatcaaagaggaaaacaccatcctgaaaacccgggaccc ccggatcatcaagtttctggtgggcctgggagcccccatcgagggcaaggatctgaagatgc cttggtgggtgaagctgaagcccagcctgttcctggccttcctggaaggcttccgggcccac atcgtggagcagctggtcgacgaccccaacaagaatctgcccttctttcaggaactgagctg gtatctgggcctgttcggcatcaaggccgacatcaaggtggaggaagtgggcgacaagcaca agatcatcttcgacgccggcaggctggacgtggacaagcagttcatcgagacctgggaggat 20 gtggaggtgacctacaacctgaccacagagaagggcaatctgctggccaacggcctgttcgt gaagaac La Tabla 3 describe la secuencia de proteína , SEQ I D NO : 3, codificada por SEQ I D NO :2. 25 TABLA 3 Inteína Pab Lon, secuencia de am inoácido (SEQ I D NO : 3) CFSGEETVVIRENGEV VLRLKDFVEKALEKPSGEGLDGDVKVVYHDFRNENVEVLTKDGFT KLLYANKRIGKQKLRRVVNLEKDYWFALTPDHKVYTTDGLKEAGEITEKDELISVPITVFDC EDEDLKKIGLLPLTSDDERLRKIATLMGILFNGGSIDEGLGVLTLKSERSVIEKFVITLKEL FG FEYEI IKEENTILKTRDPRI IKFLVGLGAPIEGKDLKMPW VKLKPSLFLAFLEGFRAH IVEQLVDDPNKNLPFFQELSWYLGLFGIKADIKVEEVGDKHKI I FDAGRLDVDKQFIETWED VEVTYNLTTE GNLLANGLFVKN La Tabla 4 provee información de secuencia de proteína para la inteína Pfu Lon , No. de Acceso AAL80591 .1 en NC BI/proteína, PF0467 , incluyendo los residuos -1 y + 1 de exteína (SEQ I D NO :4).

TABLA 4 I nteína Pfu Lon. secuencia de am i noácido (SEQ ID NO:4) QCFSGEEVILIEKDGEKKVFKLREFVDGLLKEASGEGMDGSIRVVYKDLQGENIKILTKDGLV LLYV NRREG QKLRKIVNLEKDYWLALTPEHKVYTIKGLKEAGEITKDDEIIRVPLTILDGFDVAEKSIREE LERLSLLPLNSEDSRLEKIAGIMGALFGSGGIDENLNTLSFVSSEKKTIEQFVKALSELFGEFDYKIE EKENSIIFRTCDKRIVTFFATLGAPVGDKS VKLKLPWWVKLKPSLFLAFMDGLYSSNRNDKEILEIT QLTDNVETFFEEISWYLSFFGIKAEAEEDEEKDKYRARLTLSSSIDNMLNFIEFIPISFSPÁKREKFF KEIEKYLEYSI PEKTEDLKKRVKRVKKGERRNFLESWEEVEVTYNVTTETGNLLANGLFVKNS La Tabla 5 provee información de secuencia de nucleótido para la inteína original Pfu Lon (SEQ I D NO :5) .

TABLA 5 I nteína Pfu Lon, secuencia de n ucleótido (SEQ ID NO: 5) tgttttagcggtgaagaagttatcttaattgaaaaggacggagagaaaaaagtcttcaaact tagggagttcgttgacggtctccttaaggaggcgtctggagaagggatggacggaagtatta gagtagtttataaagatcttcaaggggaaaacataaaaatactcacaaaagacggacttgta aagctcctttatgtcaatagaagagaagggaagcaaaagcttagaaaaatagtaaatcttga aaaggattattggcttgcattaacacctgaacataaagtgtacacaataaagggccttaaag aagctggagagataactaaagatgatgagataataagagtgcctctcacaattcttgacggc tttgacgtagccgagaagagtataagagaggaacttgaaaggcttagcctacttccactaaa TABLA 5 (cont.) tagtgaagacagtagactagaaaagatagcaggaatcatgggcgcactctttggtagtggag gtatcgatgagaatctcaatacccttagctttgtttctagcgagaagaaaacaattgaacag tttgttaaagcactcagcgagctcttcggggaatttgactataaaattgaagaaaaagaaaa cagcattattttcagaacatgtgataaaagaatagtgaccttctttgctacacttggtgcac cagttggagacaaaagcaaagttaagcttaagcttccatggtgggtcaagcttaagccgtca cttttcctcgccttcatggatggtctctacagtagcaataggaatgacaaagaaatcctcga aataactcaacttactgacaacgtcgaaacgttcttcgaggaaatatcttggtatctgagct tctttggaattaaggcagaagctgaagaggatgaagaaaaagataaatacagggctagactt acgctatcctcatcaatagacaacatgcttaatttcattgagttcattccaataagcttttc tccagcaaagagagaaaaattctttaaggaaattgaaaaatatctggaatatagcattcccg aaaagactgaggatcttaagaaacgagttaagagagttaagaagggagagagaaggaatttc ctcgaaagctgggaggaagttgaagttacttacaacgtaactacagagacaggaaatctact tgctaacggtctatttgttaagaac La Tabla 6 describe la secuencia de proteína, SEQ NO:6, codificada por SEQ ID NO:5.

TABLA 6 Inteína Pfu Lon, secuencia de aminoácido CFSGEEVILIEKDGEKKVFKLREFVDGLLKEASGEGMDGSIRVVYKDLQGENIKILT DGLV KLLYVNRREGKQKLRKIVNLEKDYWLALTPEH VYTIKGLKEAGEI KDDEI IRVPLTILDG FDVAEKSIREELERLSLLPLNSEDSRLEKIAGIMGALFGSGGIDENLNTLSFVSSEKKTIEQ FVKALSELFGEFDYKIEEKENSI I FRTCDKRIVTFFATLGAPVGDKSKVKLKLP WVKLKPS LFLAFMDGLYSSNRNDKEILEITQLTDNVETFFEEISWYLSFFGIKAEAEEDEEKD YRARL TLSSSIDNMLNFIEFIPISFSPAKREKFFKEIEKYLEYSI PEKTEDLKKRV RVKKGERRNF LESWEEVEVTYNVTTETGNLLANGLFVKN La inteína Pfu Lon se clona utilizando técnicas de PCR.

La secuencia de nucleótido de la inteína Pab Lon se sintetiza mediante un diseño de conformidad con la utilización de codón de mamífero. La secuencia de proteína de la inteína de proteasa lon de Pyrococcus abysii se obtiene a partir de Inbase, una base de datos públicamente curada de inteínas patrocinada por New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts (http://www.neb.com/neb/inteins.html). La secuencia de proteína obtenida está listada como número de acceso E BL CAB50486.1, gi5459000; sin embargo, se utiliza la secuencia de proteína listada en el sitio en la red. La secuencia de proteína de la inteína Pab-lon se indica en la Tabla 7.

TABLA 7 Secuencia de aminoácido de la inteína Pab-lon, (SEQ ID NO:7) CFSGEETVVIRENGEV VLRL DFVE ALEKPSGEGLDGDVKVVYHDFRNENVEVLTKDGFTKLLYAN RIGKQKLRRVVNLEKDY FALTPDHKVYTTDGLKEAGEITEKDELISVPITVFDCEDEDLKKIGLLPLTS DDERLRKIATLMGILFNGGSIDEGLGVLTLKSERSVIEKFVITLKELFG FEYEII EENTILKTRDPRI IKFLVGLGAPIEGKDLK PWWV LKPSLFLAFLEGFRAHIVEQLVDDPNKNLPFFQELSWYLGLFGI AD IKVEEVGDKH I IFDAGRLDVDKQFIETWEDVEVTYNLTTEKGNLLANGLFVKN Esta secuencia de proteína Pab-lon es retro-traducida hasta una secuencia de ADN optimizada para expresión en mamífero por GeneArt (GeneArt AG, Regensburg, Alemania) utilizando un método patentado. La secuencia de ADN de inteína Pab-lon resultante se indica en la Tabla 8. Se apreciará que las construcciones de ADN pueden proveer opcionalmente adaptadores de flanqueo adicionales dependiendo de la selección de los vectores particulares para clonación y expresión y los métodos de biología molecular correspondientes utilizando técnicas convencionales. La secuencia de ADN es sintetizada (Número de Síntesis GeneArt 0611467) como un fragmento de 999 pb y se suministra en el vector de plásmido GeneArt, pGA4. Véase el Registro de Partes Patrón Biológicas (Registry of Biological Standard Parts) en la página http://partsregistry.org , incluyendo Part: B Ba_J70003. El material de ADN recibido se vuelve a someter a determinación de secuencia y se determina que corresponde a la secuencia diseñada . Este material de ADN se utiliza directamente como una fuente/plantilla para construcciones su bsiguientes de plásmido que contiene la inteína Pab-lon ; el plásmido no se vuelve a propagar.

TABLA 8 Secuencia de ácido nucleico de la i nteína Pab-lon (S EQ ID NO: 8) TGCTTCAGCGGCGAGGAAACCGTGGTGATCCGGGAGAACGGCGAGGTGAAGGTGCTGCGGCT GAAGGACTTCGTGGAGAAGGCCCTGGAAAAGCCCTCCGGCGAGGGCCTGGACGGCGACGTGA AAGTGGTGTACCACGACTTCCGGAACGAGAACGTGGAGGTGCTGACCAAGGACGGCTTCACC AAGCTGCTGTACGCCAACAAGCGGATCGGCAAGCAGAAACTGCGGCGGGTGGTGAACCTGGA AAAGGACTACTGGTTCGCCCTGACCCCCGACCACAAGGTGTACACCACCGACGGCCTGAAAG AGGCCGGCGAGATCACCGAGAAGGACGAGCTGATCAGCGTGCCCATCACCGTGTTCGACTGC GAGGACGAGGACCTGAAGAAGATCGGCCTGCTGCCCCTGACCAGCGACGACGAGCGGCTGCG GAAGATCGCCACCCTGATGGGCATCCTGTTCAACGGCGGCAGCATCGATGAGGGCCTGGGCG TGCTGACCCTGAAGAGCGAGCGGAGCGTGATCGAGAAGTTCGTGATCACCCTGAAAGAGCTG TTCGGCAAGTTCGAGTACGAGATCATCAAAGAGGAAAACACCATCCTGAAAACCCGGGACCC CCGGATCATCAAGTTTCTGGTGGGCCTGGGAGCCCCCATCGAGGGCAAGGATCTGAAGATGC CTTGGTGGGTGAAGCTGAAGCCCAGCCTGTTCCTGGCCTTCCTGGAAGGCTTCCGGGCCCAC ATCGTGGAGCAGCTGGTCGACGACCCCAACAAGAATCTGCCCTTCTTTCAGGAACTGAGCTG GTATCTGGGCCTGTTCGGCATCAAGGCCGACATCAAGGTGGAGGAAGTGGGCGACAAGCACA AGATCATCTTCGACGCCGGCAGGCTGGACGTGGACAAGCAGTTCATCGAGACCTGGGAGGAT GTGGAGGTGACCTACAACCTGACCACAGAGAAGGGCAATCTGCTGGCCAACGGCCTGTTCGT GAAGAAC Se construyen los siguientes vectores de expresión mamíferos: pTT3-pfu Ion H L( + ) , pTT3-pfu Ion H L(-), pTT3-pfu Ion LH ( + ) , pTT3-pfu Ion LH (-) , pTT3-pfu Ion LKH (+) , pTT3-pfu Ion LKH (-), pTT3-pab Ion H L( + ) , pTT3 pab Ion H L (-) , pTT3- pab I on LH (+) , pTT3- pab I on LH (-) , pTT3- pab Ion LKH( + ) , pTT3- pab Ion LKH(-) . En este caso, los componentes H y L representan las cadenas pesada y ligera de ¡nmunoglobulina para el anticuerpo designado D2E7. Para una representación esquemática de la construcción pTT3 pab Ion HL (-), véase la Figura 1. La Figura 2 ilustra aspectos de las estructuras para los componentes de sORF de estos vectores de expresión transitoria que son capaces de expresar al anticuerpo D2E7.

Aunque el vector pTT3 representa una modalidad particular, las modalidades adicionales pueden incluir aspectos que pertenecen a un ácido nucleico aislado que codifica para una o más proteínas descritas en la presente solicitud. Una modalidad adicional provee un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico aislado en el cual dicho vector se selecciona a partir del grupo que consiste de pcDNA; pTT (Durocher et al., Nucleic Acids Research 2002, Vol 30, No.2:E9); pTT3; pEFBOS (Mizushima, S. y Nagata, S., 1990, Nucleic Acids Research Vol 18, No. 17:5322); pBV; pJV; y pBJ. Como se indicó anteriormente, se elaboran varias construcciones en la estructura base del vector pTT3. Este vector tiene origen de replicación de EBV, el cual permite su amplificación episómica en células 293E transfectadas (las cuales expresan el antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr) en cultivo en suspensión. Véase Durocher et al., que describen al vector pTT. Con relación a pTT, pTT3 tiene un sitio de clonación múltiple adicional como se indica en la Publicación de Solicitud de Patente E.U.A. 20050147610 de Ghayur, Tariq et al., 7 de julio de 2005.

Cada vector basado en pTT3 tiene un ORF el cual es reg ulado por u n promotor de CMV. En el OR F , la secuencia de inteína se inserta en marco entre las cadenas pesada y ligera del anticuerpo (HC y LC , o simplemente H y L, respectivamente) , ya sea en el orden de HC-inteína-LC o LC-inteína-HC . Las construcciones con la designación "HL" tienen la secuencia codificadora de HC del anticuerpo seguida por inteína y después por la secuencia codificadora de LC ; las construcciones con la designación "LH" tienen la secuencia codificadora de LC seg u ida por la inte ína y después por la secuencia cod ificadora de H C . Las construcciones con la desig nación "LKH" tienen una lisina (K) insertada entre la LC y la inteína . Las construcciones con la designación "(-)" tienen un péptido de señal al inicio del O RF y una metionina insertada entre el ú ltimo aminoácido de la inteína y el primer aminoácido de la cadena pesada o la cadena ligera del anticuerpo maduro que sig ue a la inteína. Las construcciones con la designación "(+)" tienen un péptido de señal al inicio del OR F y un segu ndo péptido de señal al inicio de la subunidad del anticuerpo que está hacia el extremo 3' de la inteína .

Las construcciones se introducen en células 293E a través de transfección transitoria. Brevemente, se preparan complejos utilizando vectores pTT3 que codifican para las construcciones del ORF y polietilenimina (PEI) . Los complejos de PEI-ADN se utilizan para transfectar células H EK293E ; véase Du rocher et al . , 2002 , N ucí . Acids Res. 30: E9. Las células y los sobrenadantes del cultivo se recolectan cuatro a siete d ías después de la transfección para análisis.

Expresión de proteína utilizando construcciones En los experimentos de expresión transitoria múltiple, las muestras de sobrenadante de cultivo se recolectan en el séptimo u octavo día después de la transfección. Las muestras se evalúan mediante ELISA y contienen los niveles o intervalos de anticuerpo secretado a partir de las mediciones de IgG como se muestra a continuación.

TABLA 9 Construcciones de sORF de inmunoglobulina de inteína Lon y producción de anticuerpo U n sistema de dos vectores convencional q ue expresa el mismo anticuerpo que el de las series de construcciones descritas anteriormente, y utilizando los mismos elementos reg uladores, se incluye en estos experimentos como u n control (véase tabla , fila del fondo) . Por lo tanto el vector de control expresa el anticuerpo D2E7 utilizando un método convencional para introd ucir la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo provenientes de dos OR Fs separados portados en dos vectores pTT3 separados. El nivel de secreción de anticuerpo producido a partir de este sistema de vector de control varía desde 10 hasta 60 Mg/ml como se indica en la Tabla.

El n ivel de secreción de IgG producido por varios de los diseños de construcción de sO RF utilizando las inteínas Lon están en el mismo intervalo, o más alto, en comparación con el prod ucido utilizando el vector de control convencional . Estos niveles son sig nificativamente más altos que los prod ucidos utilizando la tecnolog ía "2A" , los cuales se reportan q ue están a 1 .6 pg/ml en células de mam ífero (Fang et al . , 2005 , Natu re Biotech nology 23: 584-590). Aunque tanto las inteínas Pab Lon como Pfu Lon se pueden utilizar en diseños de construcción para producir niveles deseables de producción de anticuerpo , la inteína Pab Lon en las construcciones pTT3 descritas permiten un nivel más alto de un nivel más alto de secreción de anticuerpo. Estos datos también sugieren que los niveles de secreción de anticuerpo generalmente son mayores cuando se utiliza u n diseño de construcción H L que cuando se utiliza u n diseño de construcción LH . Combinando la característica del orden de las cadenas de inmunoglobulina y los aspectos de las secuencias de señal, las construcciones HL(-) pueden generar los niveles más altos de producto de anticuerpo secretado entre los estudiados.

Caracterización adicional de los productos de expresión Algunas construcciones de sORF listadas en la Tabla 9 se caracterizan adicionalmente con respecto a los aspectos de expresión incluyendo análisis de los productos de expresión. Estas construcciones incluyen cuatro ejemplos que producen niveles relativamente más altos de anticuerpo secretado: pTT3 pfu Ion HL (-), pTT3 pfu Ion HL ( + ), pTT3 pfu Ion LKH (-), y pTT3 pab Ion HL (-). El anticuerpo secretado producido a partir de estas construcciones se purifica mediante cromatografía de afinidad con proteína A y se analizan en geles de SDS-PAGE tanto reductores como no reductores, y se determinan las secuencias de aminoácidos N-terminales para sus HL y LC.

Las muestras que se producen utilizando pTT3 pfu Ion HL (-) contienen bandas de migración en gel correspondientes a la HC del anticuerpo, LC del anticuerpo, y anticuerpo completamente ensamblado (en geles no reductores), con migraciones indistinguibles del anticuerpo que se produce utilizando métodos tradicionales con vector convencional tal como el vector de control D2E7 descrito anteriormente. En los geles reductores, además de las bandas correspondientes a la HC y LC del anticuerpo, también hay dos bandas de peso molecular (PM) más alto que pa recen corresponder a la proteína tripartita no procesada (HC-inteína-LC) y la fusión H C-inteína parcialmente procesada. Esta evaluación se basa en análisis Western blot y análisis de espectrometría de masas. La abu nda ncia de estas dos bandas parece ser dependiente de las condiciones de cultivo y se puede reducir modificando las co ndiciones de cultivo. Estos productos de peso molecular más alto se pueden remover de manera conveniente de la sustancia de fármaco de anticuerpo completamente procesado utilizando métodos de conformidad con otra descripción provista en la presente solicitud y/o como sería entendido en la técn ica .

Las muestras q ue se producen utiliza ndo pTT3 pfu Ion H L ( + ) contienen bandas q ue corresponden a la H C del anticuerpo, LC del anticuerpo, y anticuerpo completo (en geles no red uctores) , con mig raciones indistinguibles del anticuerpo que se prod uce utilizando métodos tradicionales. Además hay una banda de peso molecular más grande correspondiente a la poli-proteína tripartita . Las muestras que se prod ucen utilizando pTT3 pfu Ion LKH (-) también contienen bandas correspondientes a HC , LC , y anticuerpo completo (en geles no red uctores) con migraciones indistinguibles del anticuerpo que se produce utilizando vectores convencionales. En los geles red uctores, además de las bandas correspondientes a la H C y LC , también hay dos ba ndas de peso molecular más alto. La primera de éstas corresponde a la poli-proteína tripartita, como se describió anteriormente para otros diseños de vector; la segu nda banda corresponde al producto de fusión LC-inteína, q ue resulta del corte incompleto en esta u nión . En térmi nos de abundancia relativa de productos, parece haber tanta fusión de LC-inteína como LC cortada .

Las muestras q ue se producen utilizando pTT3 pab Ion H L (-) contienen bandas que corresponden a HC , LC, y anticuerpo completo (en geles no reductores) con migraciones indistingu ibles del anticuerpo que se produce utilizando métodos tradicionales. En los geles reductores , además de las bandas correspond ientes a la HC y LC , hay una banda mayor de peso molecular más alto que parece corresponder a la proteína tripartita no procesada tomando como base el análisis Western blot. En comparación con las muestras q ue se producen utilizando pTT3 pfu Ion H L(-) , hay u na cantidad relativamente más pequeña de esta banda de peso molecular más alto tripartita. Este resultado sugiere que aún cuando la inte ína Pfu Ion y la inteína Pab Ion son homólogas y funcionalmente similares en los presentes diseños de vector, el corte N-terminal mediado por Pab Ion es más completo q ue el mediado por Pfu Ion , ya q ue se observa poca fusión H C-inteína después de la expresión a partir de la construcción Pab Ion . Sin embargo, se observa q ue ambas construcciones pueden producir producto de anticuerpo completamente ensamblado.

Por un lado, alg unos productos de proteína como las proteínas no procesadas y parcialmente procesadas pueden ser considerados productos contaminantes con relación a otros productos de construcción tales como el producto de anticuerpo completamente procesado y completamente auto-ensamblado. Por otro lado, dichos ciertos prod uctos de proteína pueden ser útiles , por ejemplo como materiales pa ra reacciones de procesamiento adicional y/o ensamblado dirigido lo cual puede no obstante generar producto de anticuerpo completo. Si estos prod uctos de proteína se consideran como subproductos contaminantes, entonces, como se indicó, hay opciones y métodos para facilitar la remoción y de esta ma nera en riquecer o pu rificar un componente deseado tal como el anticuerpo completo.

Además de las muestras extracelulares del sobrenadante de cultivo proveniente de varios sistemas de expresión de construcción , también se obtienen muestras intracelu lares y se analizan mediante análisis Western blot utilizando anticuerpos de detección con especificidades tanto contra HC como contra LC . Se observan especies de proteínas similares como se describe para aquellas especies en las muestras del sobrenadante cultivado.

Se determinan las secuencias de aminoácido N-terminal de los prod uctos tanto de la cadena pesada como de la cadena ligera de va rias construcciones (véase sig uiente Tabla) . Los resultados sig nifican que los cortes de proteína med iados por inteína toman lugar precisamente en las dos uniones de empalme, específicamente en la u nión de los componentes H C e inte ína y en la u nión de los componentes LC e inteína .

TABLA 10 Secuencias de am i noácido N-term i nal de la cadena pesada y la cadena l igera de las especies princi pales de los productos de expresión de las construcciones de sORF Propiedades funcionales de anticuerpo de lgG 1 de la construcción de inteína Lon Los productos del anticuerpo D2E7 secretados provenientes de los diseños de construcción de sO RF de la Tabla 9 también se analizan mediante ELI SA específica de antígeno . Los resultados del análisis demuestran q ue los prod uctos de anticuerpo de la construcción se unen a TN Falfa de h umano, el ligando del anticuerpo D2 E7. Por lo tanto las construcciones basadas en inteína y los sistemas de expresión son capaces de expresar y generar productos de sO RF los cuales producen anticuerpo multimérico completamente auto-ensamblado el cual es fu ncional y específico de antígeno.

El anticuerpo q ue se produce utilizando la construcción pTT3 pfu Ion HL(-) se purifica mediante purificación de afinidad con proteína A seguido por SEC, cromatografía por exclusión de tamaño. El anticuerpo purificado se analiza mediante tecnología de resonancia de plasmón de superficie utilizando un sistema BiaCore™. La caracterización del producto de la construcción de sORF incluye aspectos de su unión al ligando relevante, TNFa. En la Tabla 11 se indican los resultados de los valores provenientes del análisis BiaCore con respecto a los parámetros cinéticos de la constante de velocidad de asociación (ka, unidades de 1/Ms); constante de velocidad de disociación (kd, unidades de 1/s), y la constante de disociación en equilibrio (KD, unidades de ). Se entiende que el valor de la constante de disociación (KD) es similar a aquel para el anticuerpo adalimumab (D2E7) que se produce utilizando un vector convencional (con dos ORFs de la cadena de inmunoglobulina distintos).

TABLA 11 Parámetros cinéticos del anticuerpo producido a partir de la construcción de sORF EJEMPLO 2 Construcciones de sORF que producen anticuerpo con variaciones de las secuencias de la cadena ligera Se generan varias construcciones de sORF con secuencias de la cadena ligera que son variaciones de la cadena ligera de inmunoglobulina del D2E7. Estas construcciones de sORF se diseñan con la cadena pesada también como en D2E7 y por lo tanto son capaces de producir material de anticuerpo de lgG1. Utilizando las construcciones pTT3 pfu Ion HL (-) y pTT3 pab Ion HL (-) como estructuras base, los inventores generan y analizan construcciones con variaciones de secuencia en la unión de empalme C-terminal, es decir, la unión entre la inteína y el componente de cadena ligera de inmunoglobulina hacia el extremo 3' (véase Tabla 12). Las inmunoglobulinas secretadas de ciertas construcciones se purifican mediante purificación de afinidad con proteína A y se analizan en geles de SDS-PAGE reductores y no reductores. Las muestras intracelulares también se analizan mediante análisis Western blot utilizando anticuerpos tanto contra HC como contra LC. Véase, por ejemplo, Figuras 3A y 3B y Figuras 4A y 4B.

Las Figuras 3A y 3B ilustran los resultados de un gel de SDS-PAGE para análisis de proteína de productos de expresión de sORF. Las moléculas de IgG secretadas se purifican mediante cromatografía de afinidad de Proteína A y se separan en geles de SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras (Figura 3A) y reductoras (Figura 3B). Los carriles y muestras de izquierda a derecha son: (Carril 1) marcadores de PM; (2) producto de construcción de control, anticuerpo D2E7 proveniente de un sistema de expresión de tipo no sORF; (3) Pab-lon mut A1; (4) Pab-lon mut A2; (5) pTT3 pfu Ion YP, y (6) pTT3 pfu Ion MA.

Las Figuras 4A y 4B ilustran los resultados de un gel de SDS-PAGE para análisis de proteína de productos de expresión de sORF adicionales. Las IgGs secretadas se purifican mediante cromatografía de afinidad de Proteína A y se separan en geles de SDS-PAGE bajo condiciones no reductores (Figura 4A) y reductores (Figura 4B). Los carriles y muestras de izquierda a derecha son: (Carril 1) marcadores de PM; (2) producto D2E7 de control; (3) pTT3 pfu Ion HL (-); y (4) pTT3 pfu Ion MutA.

TABLA 12 Secuencias de aminoácido en construcciones de sORF en las uniones de empalme C-terminales de inteína-LC TABLA 12 fcont.) Los niveles de secreción de inmunoglobulina producidos por las construcciones de la Tabla 12 se indican en la Tabla 13. Se determinan los aminoácidos en los extremos N-terminales de las cadenas ligeras maduras y se muestran los resultados de la caracterización de las secuencias parciales.

TABLA 13 Niveles de IgG y secuencia de proteína N-terminal de las cadenas ligeras en los anticuerpos de las construcciones de sORF TABLA 13 (cont.) Resultados Para estas construcciones, el uso de diferentes residuos de aminoácido en la posición +1 (inmediatamente después de la inteína) parece ser un factor en el rendimiento de anticuerpo secretado. El uso de los residuos de aminoácido H, Y, R, V, Q, A, N, y M en esta posición produce niveles relativamente más altos de expresión de anticuerpo. El análisis de las cadenas ligeras respecto a sus aminoácidos N-terminales (Tabla 13) sugiere el corte completo y preciso en el extremo C-terminal de la inteína. Similar a los anticuerpos producidos por las construcciones pTT3 pfu Ion HL(-) y pTT3 pab Ion HL(-), la HC y LC procesadas, así como también el anticuerpo completo ensamblado representan la mayoría de especies de proteínas secretadas. Sin embargo, cuando el aminoácido aspartato (Asp; D) se utiliza directamente después de la inteína como en la construcción pTT3 pfu Ion MutB, hay poca secreción de anticuerpo. Se analizan las proteínas intracelulares producidas por esta construcción. Se determinó que cuando D es el primer aminoácido después de la inteína, hay poco corte en la unión de empalme C-terminal, lo que produce poca LC de anticuerpo, y una cantidad relativamente grande de proteína de fusión inteína-LC.

Las secuencias de aminoácido de la cadena ligera de línea germinal madura de la región variable del isotipo kappa (Vkappa) generalmente empiezan con, D, E, N, A, o V; las del isotipo lambda ( iambda) generalmente empiezan con Q, S, L, o N. A partir de los presentes resultados, las modalidades de vectores de sORF utilizando las inteínas Pab Ion o Pfu Ion para producción de anticuerpos incluyen aquellas en las que la LC comienza con cualquiera de los aminoácidos. En las modalidades preferidas, para los propósitos de lograr eficiencia más alta de procesamiento general completo, la LC comienza con un aminoácido diferente de D o E aunque dichos aminoácidos pueden servir como opciones operativas.

Los inventores descubrieron que la región entre la inteína y la LC de anticuerpo maduro hacia el extremo 3' desde la inteína parece contribuir a la eficiencia del corte en la unión de empalme N-terminal. Por ejemplo, los inventores compararon el producto de las construcciones pTT3 pfu Ion H L (-) y pTT3 pfu Ion MutA. Au nque el corte en la unión de empalme N-terminal no es completo cuando se utiliza pTT3 pfu Ion H L (-) , lo q ue produce algo de proteína de fusión HC-inteína parcialmente procesada , la cantidad de este especie de proteína se reduce sig nificativamente cuando se utiliza la construcción pTT3 pfu Ion M utA (véase Figu ra 2). Por lo tanto au nque varias construcciones pueden ser útiles para generar productos deseables, ciertas construcciones pueden tener atributos tales como la capacidad de generar rend imientos relativamente altos de productos particularmente deseados , por ejemplo, anticuerpos secretados multiméricos completamente procesados y auto-ensamblados.

EJ EM PLO 3 Opciones adicionales para componentes de inteína de las construcciones de sORF I nteínas de los genes klbA de Methanococcus iannaschii y Pyrococcus abvssi Los inventores exploraron opciones ad icionales de inte ína para construcciones de sORF incluyendo las inteínas de los genes klbA tales como los provenientes de las especies Methanococcus y Pyrococcus. Los inventores descu brieron q ue las inteínas que están contenidas en el gen klbA también son opciones eficientes para mediar la expresión y procesamiento de proteína , incluyendo en el contexto de cortes de la cadena pesada y las cadenas ligeras del anticuerpo en varios diseños de construcción de marco de lectura abierto individ ual.

En particular los inventores examinaron las inteínas de klbA de Methanococcus jannaschii (inteína Mja klbA) , Pyrococcus abyssi (inteí na Pab klbA) , y Pyrococcus furiosus (inteína Pfu klbA). Las inteínas de los primeros dos organismos son mini-inteínas , que carecen de dominios de endonucleasa , mientras q ue Pfu klbA es una inteína de tamaño completo. Las longitudes de secuencia de los segmentos de proteína de inteína original son 1 68, 333, y 522 aminoácidos, respectivamente. La i nformación de secuencia con relación a estas inteínas se provee en las tablas más adelante. Por lo tanto se desarrollan inteínas, inteínas mod ificadas, y construcciones para sistemas de expresión .

Secuencias de inteína de klbA y diseños de construcción de vector La secuencia de n ucleótido de Mja klbA se modifica para permitir la optimización relativa a la utilización de codón mamífero. La Tabla 14 provee la información de secuencia de ácido nucleico para el gen de inteína Mja klbA de Methanococcus jannaschii el cual ha sido modificado de esta manera (SEQ I D NO:34) . La Tabla 1 5 provee información de secuencia de proteína para el segmento de la inteína Mja KlbA. Véase también No. de Acceso Q581 91 en NCBI/proteína , MJ0781 . La Tabla 1 6 provee información de secuencia de ácido nucleico para el gen de la inteína Pab klbA la cual se modificó en el aspecto de utilización de codón con relación a la secuencia orig inal . Para la secuencia original, véase No. de Acceso [B75050 en NCBI/proteína , PAB 1457] de la información de N EB I nbase para la inteína Pab KlbA. De conformidad con esta fuente, se indica que la secuencia de aminoácido de la proteína indicada incluye los residuos - 1 y + 1 de exteína los cuales parecen ser G y C, respectivamente. La Tabla 1 7 provee la información de secuencia de aminoácido para el segmento de proteína de la inteína Pab KlbA. La Tabla 18 provee i nformación de secuencia de ácido n ucleico para el gen e la inteí na Pfu klbA (original) . La Tabla 1 9 provee información de la secuencia de aminoácido para el segmento de proteína de la inteína Pfu KlbA; véase también No. de Acceso AE01 021 1 en NCBI .

TABLA 14 Gen de la inteína M i a klbA, secuencia de nucleótido (S EQ ID NO: 34). modificado en cuanto autil ización de codón gctctggcctacgacgagcccatctacctgagcgacggcaacatcatcaacatcggcgagtt cgtggacaagttcttcaagaagtacaagaacagcatcaagaaagaggacaacggcttcggct ggatcgacatcggcaacgagaacatctacatcaagagcttcaacaagctgtccctgatéate gaggacaagcggatcctgagagtgtggcggaagaagtacagcggcaagctgatcaagatcac caccaagaaccggcgggagatcaccctgacccacgaccaccccgtgtacatcagcaagaccg gcgaggtgctggaaatcaacgccgagatggtgaaagtgggcgactacatctatatccccaag aacaacaccatcaacctggacgaggtgatcaaggtggagaccgtggactacaacggccacat ctacgacctgaccgtggaggacaaccacacctacatcgccggcaagaacgagggcttcgccg tgagcaac TABLA 1 5 Proteína de la inteína Mi a Kl bA, secuencia de ami noácido (SEQ I D NO : 35) ALAYDEPIYLSDGNI INIGEFVDKFF KYKNSIKKEDNGFGWIDIGNENIYIKSFNKLSLI I EDKRILRV RKKYSGKLIKITTKNRREITLTHDHPVYISKTGEVLEINAEMVKVGDYIYIP NNTINLDEVIKVETVDYNGHIYDLTVEDNHTYIAGKNEGFAVSN TABLA 1 6 Gen de la inteína Pab kl ba. secuencia de nucleótido (S EQ I D NO: 36), modificado en cuanto a la utilización de codón gctctgtactacttcagcgagatccagctgcccaacggcaaagagttcatcggcaaactggt ggacgagctgttcgagaagtaccacgacaagatcggcaagtacaaggacatggaatacgtgg agctgaacgaagaggacaccttcgaggtgatcagcatcggccccgacctgagcgccaggcgg cacaaggtgacccacgtgtggcggcggaaggtgaaagacggcgagaagctggtgaagatccg gaccgccagcggcaaagaactggtgctgacccaggaccaccccgtgttcgtgctgctgggcc gggacgtggccagacgggacgccggcaacgtgaaagtgggcgacgagatcgccgtgctgaac accaggcccgacttcagcgtgctgtccccccctgccatgcccgagctgctgtccgagccctt caactacgagctgtccagcatcggcgacgtggcctgggacgaggtggtggaggtggacgaga tcgacgccaagggcctgggcgtggagtacctgtacgacctgaccgtggacatcaaccacaac tacgtggccaacggcatcgtggtgtccaac TABLA 1 7 Proteína de la inteína Pab Klba, secuencia de am i noácido (SEQ I D NO: 37) ALYYFSEIQLPNGKEFIGKLVDELFEKYHDKIGKYKDMEYVELNEEDTFEVISIGPDLSARR HKVTHVWRRKVKDGEKLVKIRTASGKELVLTQDHPVFVLLGRDVARRDAGNVKVGDEIAVLN TRPDFSVLSPPAMPELLSEPFNYELSSIGDVAWDEVVEVDEIDAKGLGVEYLYDLTVDINHN YVANGIVVSN TABLA 1 8 Gen de la inteína Pfu klba, secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 38), original gcactttacgatttctctgtcatccaactatctaatggtagatttgtacttataggagattt agtcgaggaattattcaagaagtatgccgagaaaattaaaacatacaaagaccttgagtaca tagagcttaacgaggaagaccgttttgaagttgttagtgttagtccagatttgaaggctaat aaacatgttgtctcaagagtttggagaagaaaggtcagagagggggaaaagctaatacgcat aaagacgagaactggcaacgaaataatcctcactagaaatcatccgctatttgccttctcca atggagacgtagtcagaaaagaggccgagaagctcaaagttggggatagagttgcagtgatg atgagacctccttcacctcctcaaactaaagctgtagttgaccctgcaatttacgtgaaaat aagtgattactaccttgttccgaacggaaaaggtatgataaaagttcctaacgatggtattc ctccagaaaaggcccaatatcttctttcagtaaattcatatcctgtaaaattagtcagagaa gttgatgagaagttatcctatctcgctggagttatactcggtgatgggtatatatcatcgaa tggatactacatctcagctacatttgacgacgaagcttacatggatgcctttgtctctgtag tctcggactttatccctaactatgtccccagtataaggaagaacggagattacacaattgta actgttggctcgaagatttttgctgaaatgctctcaaggatatttggaataccaaggggcag aaaatctatgtgggatattccagacgtagtactttcaaatgacgatcttatgagatacttca tagctggacttttcgacgctgatgggtacgtagatgaaaatgggccctccatagtcctagta acaaagagtgaaaccgtggcaaggaagatttggtacgttcttcagaggttggggatcataag tacagtttcccgtgtaaagagcagagggtttaaagaaggcgagctgttcagggtaattatta gtggtgttgaagatcttgctaaatttgcaaaattcatacccctacgtcactcaagaaagagg gccaaacttatggagatattaaggactaagaagccatatcggggaagaagaacttaccgcgt gccgatatccagtgatatgatagctcctctccgtcaaatgttgggattaactgttgcagagc tgtctaagttagcgtcttattatgcaggggaaaaagtttctgaaagcctaattaggcatata gaaaagggaagggtcaaagagataagacgctctacgctcaaggggattgcccttgctctcca gcagatagctaaagatgtgggtaacgaagaagcttgggtgagagccaagaggcttcaattga tagctgagggagatgtttactgggatgaagtcgtaagtgttgaggaagttgatccgaaggag cttggcattgagtacgtctatgacctcacggttgaggacgaccacaattatgtggcaaatgg catactagtctcaaac TABLA 1 9 Proteína de la inteína pfu Klba. secuencia de aminoácido (SEQ I D NO: 39) ALYDFSVIQLSNGRFVLIGDLVEELFKKYAEKIKTYKDLEYIELNEEDRFEVVSVSPDLKAN HVVSRVWRRKVREGEKLIRIKTRTGNEI ILTRNHPLFAFSNGDVVRKEAEKL VGDRVAVM MRPPSPPQTKAVVDPAIYVKISDYYLVPNGKGMIKVPNDGIPPEKAQYLLSVNSYPV LVRE VDEKLSYLAGVILGDGYISSNGYYISATFDDEAYMDAFVSVVSDFI PNYVPSIRKNGDYTIV TVGSKI FAEMLSRI FGI PRGR SMWDI PDVVLSNDDLMRYFI GLFDADGYVDENGPSIVLV TKSETVAR IWYVLQRLGI ISTVSRVKSRGFKEGELFRVI I SGVEDLAKFAKFI PLRHSRKR AKLMEILRTKKPYRGRRTYRVPISSDMIAPLRQMLGLTVAELSKLASYYAGEKVSESLIRHI EKGRVKEIRRSTL GIALALQQIAKDVGNEEAWVRAKRLQLIAEGDVYWDEVVSVEEVDPKE LGIEYVYDLTVEDDHNYVANGILVSN Se sintetiza la secuencia de nucleótido de la inteína Mja klbA y de la inteína Pab klbA con secuencias que emplean utilizaciones de codón mamífero . Se construyen los siguientes vectores de expresión mamíferos: pTT3- Pab klbA H L(-); pTT3- Pab klbA H L( + ) ; pTT3- Pab klbA LH(-) ; pTT3- Mja klbA HL(-) ; pTT3- Mja klbA H L( + ) ; pTT3- Mja klbA LH(-). Estas construcciones se elaboran en la estructura base del vector PTT3, como se describe en algu na otra parte en la presente solicitud . La secuencia de nucleótido de la inteína Pfu klbA es la secuencia original , y también se construye pTT3-Pfu-klbA-H L(+) .

Como se ind icó para las construcciones que utilizan las inteínas de la proteasa Lon , todas las construcciones con la designación "H L" tienen la secuencia codificadora para la cadena pesada (HC) de la inmunog lobulina del anticuerpo seg uida por el segmento de inteína y después por la secuencia cod ificadora de la cadena ligera (LC) . De ig ual manera, todas las construcciones con la desig nación "LH" tienen la secuencia q ue codifica para LC del anticuerpo seg uida por el segmento de inteína y después por la secuencia codificadora para HC . Las construcciones con la designación "(-)" tienen u n péptido de señal al inicio del ORF y u na metion ina insertada entre el último aminoácido del segmento de inteína y el primer aminoácido del segmento de exteína hacia el extremo 3' , por ejemplo, la cadena pesada o ligera del anticuerpo q ue sig ue a la inteína. Las construcciones con la designación "(+)" tienen un péptido de seña l al inicio del ORF y un segundo péptido de señal al inicio de la subu nidad de anticuerpo que está hacia el extremo 3' de la inteína .

Las construcciones q ue tienen va rios segmentos y configuraciones de inteína KlbA se introducen en células 293E mediante técnicas de transfección transitoria . A los siete a ocho d ías después de la transfixión , se analizan los sobrenadantes de cultivo respecto a anticuerpo secretado media nte medición de los n iveles de IgG utilizando ELISA. Véase Tabla 20 para estos resultados con los valores en unidades de microg ramos por mi de muestra para cada sistema de expresión de construcción .

TABLA 20 Construcciones de sORF de la i nteína Kl bA y producción de anticuerpo secretado Se purifican y analizan los prod uctos de anticuerpo secretado expresados por las construcciones , pTT3- Pab klbA H L(-) y pTT3-Mja klbA H L(-). Los prod uctos de anticuerpo se pu rifican media nte cromatografía de afinidad con proteína A y se caracterizan mediante la técnica electroforética de SDS-PAG E bajo condiciones tanto reductores como no red uctoras. Véase Figuras 5A-5D. Bajo condiciones no reductoras, las muestras de sobrenadante del cu ltivo de estos dos vectores mig ran principalmente como una sola banda, sin embargo, con pesos moleculares aparentemente más grandes en comparación con el anticuerpo de control. Bajo condiciones reductoras , se encontró que las muestras del sobrenadante del cultivo de estos dos vectores contienen bandas detectables q ue corresponden en tamaño a los componentes LC del anticuerpo y fusión HC-inte ína . Los inmu noblots correspondientes utilizando anticuerpo ya sea Fe de I g G 1 o la cadena ligera kappa son consistentes con la caracterización de estas ba ndas. Estos resultados sugieren que hay corte relativamente eficiente en la unión de empalme C-terminal pero corte menos eficiente o incluso poco corte general en la unión de empalme N-terminal . Sin embargo, incluso para construcciones y sistemas de expresión en los cuales se logra eficiencia de corte menos que completa , las subunidades de la cadena pesada y la cadena ligera de inmunog lobulina fueron capaces de ensamblarse y ser secretadas como moléculas de anticuerpo de IgG completas.

Mod ificación de las inteinas Klb en la unión de empalme de inteína N-terminal En vista de los resultados descritos anteriormente para el corte en la unión de empalme N-terminal, se efectúan esfuerzos adicionales para proveer eficiencia de corte mejorada . Se observa que el primer aminoácido de cada una de estas dos inteinas , Pab klbA y Mja klbA, es ala n ina (Ala ; A) en lugar de cisteína (Cys; C). Se entiende q ue la cisteína es un residuo capaz de fu ncionar como un nucleófilo en otros sistemas de inteína . Se analiza el efecto de volver a introduci r un aminoácido nucleofílico , cisteína , en esta posición , en combinación con la introducción de un aminoácido, glicina , el cual es original para la exteína klbA hacia el extremo 5' de la inteína , al final del segmento de HC de la inmunoglobulina. Véase la Tabla 21 la cual provee información de secuencia para segmentos de proteína para estas construcciones adicionales. La tabla provee los residuos de aminoácido en las dos uniones de empalme para la inteína original Pab klba, la construcción Pab klba HL(-) (la cual es referida como WT en este contexto), y tres construcciones con mutaciones en la unión de empalme N-terminal: Pab klba HL(-)GC¡ Pab klba HL(-)GA¡ y Pab klba HL(-)KC. Los asteriscos (*) indican posiciones en las cuales se han introducido residuos de aminoácido variantes en las construcciones mutantes. Entre estas construcciones, Pab-klbA HL(-)GC demuestra la capacidad de expresar y procesar proteínas con corte eficiente en la unión de inteína N-terminal. Véanse también las Figuras 6A y 6B las cuales ilustran los resultados de la expresión y análisis SDS-PAGE de proteínas de IgG de ciertas construcciones.

TABLA 21 Secuencias de proteína para segmentos de las construcciones de Pab-klbA con modificaciones en la unión de inteína N-terminal el asterisco índica una posición en la cual se ha introducido la variación TABLA 22 Información adicional para segmentos de secuencias de proteína en las construcciones Pab-kl bA Materiales y métodos para generación de vectores: Construcción de las variantes GA, GC . y KC de Pab-klbA H L(-) Se generan varias formas variantes de ciertas construcciones de vector. Los mutantes GA, GC , y KC de Pab- klbA HL(-) se construyen utilizando PCR. Se utilizan e iniciador sentido HC-F y el iniciador anti-sentido Hint-R para amplificar med iante PC R el extremo 3' de la cadena pesada para genera r el prod ucto de PC R #1 . Los iniciadores sentido GA-F, GC-F , y KC-F, contienen las mutaciones deseadas así como la secuencia complementaria para el extremo 3' de la cadena pesada. Se utilizan los i n iciadores GA-F, GC-F, o KC-F y el iniciador anti-sentido lnteína-R-2 para amplificar el extremo 5' de la inteína Pab-klbA para produci r el prod ucto de PC R #2. Los productos de PC R #1 y #2 se purifican después utilizando un estuche para extracción en gel Qiagen . Los productos de PC R purificados se fijan j untos y se amplifican utilizando los in iciadores externos HC-F e lnteína-R-2 para generar el producto de PCR #3. El vector Pab-klbA HL(-) se digiere utilizando las enzimas de restricción Sacll y Rssil y después se purifica utilizando un estuche para extracción en gel Qiagen. El producto de PCR #3 se subclona en Pab-klbA-HL(-) (cortado con Sacll y Rssil) mediante recombinación homóloga en células DH5a de máxima eficiencia (Invitrogen). Los transformantes que portan las mutaciones correctas se determinan utilizando PCR de colonia seguido por determinación de secuencia. El ADN de los clones correctos se amplifica y purifica utilizando un estuche Qiagen Maxi. Las secuencias de iniciador se indican en la siguiente tabla.

TABLA 23 Secuencias de iniciador para los mutantes GA. GC, KC EJEMPLO 4 Generación de vectores estables v líneas celulares que expresan construcciones de sORF Los vectores de expresión estable y líneas celulares que expresan dichos vectores se pueden desarrollar con las modalidades de las construcciones de sORF. Como un ejemplo, un vector de expresión estable que contiene un sORF con una inteína Pab Lon se transfecta establemente en una línea de células CHO (ovario de hámster chino). Se diseña y prepara un vector de expresión de sORF estable con elementos que incluyen un incrementador de C V, un promotor tardío mayor de adenovirus, una secuencia de poliA de SV40, terminador de transcripción de gastrina, secuencia codificadora de DHFR controlada por un promotor de SV40, y un ORF a cuál es el mismo que el de pTT3 pab lon HL(-) la cual se utiliza en sistemas de expresión transitoria. La construcción de sORF pA190-Pab-lon HL(-) se prepara de esta manera y es capaz de uso como un vector de expresión estable; véase Figura 7. Las construcciones adicionales se preparan en forma similar.

Utilizando la técnica de transfección con fosfato de calcio, la construcción pA190 se introduce en células CHO (designadas CHO B3.2) las cuales se siembran en placas de 48 96 cavidades a una densidad de 200 células por cavidad en un medio de selección que contiene EM y FBS al 5%. Las placas de transfección se monitorean respecto al crecimiento de células/colonias y secreción de IgG.

Se selecciona un muestreo de 30 clones del vector de expresión estable de sORF pA190-Pab- Ion HL(-) y 32 clones de las reacciones de transfección del vector de expresión estable de control pA190 y se cultiva. En esta etapa, se evalúan los niveles de secreción de IgG para los clones seleccionados sin amplificación, y los niveles también se evalúan después de la amplificación con metotrexato (MTX) 20 nM. Para un sistema de expresión estable, el vector de sORF genera una frecuencia significativa de cavidades con crecimiento positivo (2304 positivas de 4608 cavidades totales) las cuales tienen un número (443 de 2304) y velocidad apreciables, 19%, de muestras positivas para secreción de IgG. Los niveles de secreción de IgG bajo condiciones de MTX 0 nM en placas de 12 cavidades para aproximadamente 29 clones seleccionados varía desde aproximadamente 0.3 hasta aproximadamente 2.5 microgramos por mi de sobrenadante de cultivo. Bajo condiciones con MTX 20 nM, para aproximadamente 24 clones seleccionados los niveles de secreción de IgG varían desde aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 6 microgramos por mi, en la cual aproximadamente la mitad de los clones elegidos demuestran niveles de secreción mayores de 2 pg/ml. También se observa que los clones de la construcción de sORF demuestran confluencia en el contenedor de cultivo adherente relativamente rápida. Por ejemplo, en cultivo adherente con MTX 20 nM, los clones de SORF crecen más rápido y alcanzan la confluencia más pronto que los clones del vector convencional. En el primer pase en MTX 20 nM, 28% de los clones del vector convencional alcanzan la confluencia dentro de 6 días (en cualquiera de 4 días, 5 días, o 6 días); mientras que 77% de los clones del vector pab Ion de sORF llegan a confluencia dentro de 6 días (véase Figura 8). Estos datos sugieren una fuerte ventaja de utilizar vectores de expresión de sORF, en comparación con los vectores convencionales, en el desarrollo de sistemas de expresión estables incluyendo el desarrollo de la línea de células CHO. Los clones de sORF también demuestran niveles convenientes de secreción de anticuerpo bajo condiciones de amplificación directa con MTX 100 nM. En un experimento, 16 clones expuestos a MTX 100 nM producen niveles de secreción de IgG que promedian 6 ug/ml, con los primeros cinco clones promediando 12 ug/ml y el primer clon tiene un nivel de producción de 24 ug/ml. La siguiente tabla muestra los resultados de utilizar amplificación con MTX con los niveles de expresión más altos en cada etapa de la amplificación. Los valores están en microgramos por mi de IgG para varios clones que tienen la construcción pA190-Pab-lon-HL(-).

TABLA 24 Niveles de expresión de IgG con amplificación con MTX TABLA 24 (cont.) Materiales v métodos para sistemas de expresión estable Se transfectan células de ovario de hámster chino, cultivadas en MEM Alfa complementado con H/T y 10% de FBS dializado, con el vector de expresión utilizando un procedimiento de co-precipitación con fosfato de calcio. Véase Kingston, R.E., et al. (1993), Unit 16.23: Amplification Using CHO Cell Expression Vectors, Current Protocols en Molecular Biology (Ausubel, F.M., Brent, R., Moore, D.M., Kingston, R.E., Seidman, J.G., Smith, J.A., y Struhl, K., eds; Wiley Interscience, New York), 2:16.23.1. Al día siguiente, las células se transfieren utilizando Tripsina/EDTA a temperatura ambiente y se vuelven a suspender en MEM Alfa~ complementado con 5% de dializado (a-MEM + 5% de dFBS), un medio de crecimiento selectivo para células transfectadas que expresan DHFR a partir del vector de expresión. Los sobrenadantes de cultivo que sobreviven a la selección se tamizan utilizando una ELISA específica para la cadena gamma de IgG de humano. Las líneas celulares que dan la señal más alta de ELISA se cultivan en a-MEM + 5% de dFBS que contiene MTX. MTX es un inhibidor de DHFR que selecciona para células que producen niveles más altos de la enzima debido a la amplificación del vector. Las líneas celulares se cultivan en varias concentraciones de MTX y se monitorean respecto a la expresión del anticuerpo.

En modalidades, las composiciones y métodos de la presente invención pueden emplear una construcción del vector pA205, o derivado del mismo, por ejemplo como se describe en el documento US 20080241 883 de Gion et al . , 2 de octubre de 2008.

Por lo tanto, los sistemas de expresión de célula estable se generan utilizando varios diseños y construcciones de sOR F. En particu lar, los sistemas de sO RF son bien apropiados para integ ración con la plataforma CHO para expresión de agentes terapéuticos biológicos tales como moléculas de anticuerpo.

EJ EM PLO 5 Caracterización de aspectos para las uniones de em palme C- terminal de inteína en las construcciones de sORF Se investigan aspectos de la unión de empalme C-terminal de inteína en el contexto de construcciones de sORF. Se generan aproximadamente 40 n uevas construcciones en pa rte para caracterizar aspectos relacionados con el primer aminoácido hacia el extremo 3' de la inteína y con la longitud de la unión de empalme que pud ieran influenciar la eficiencia de corte en la u nión de empalme C-terminal . Estas construcciones adicionales tienen variaciones de mutaciones de la unión de la cadena ligera . Como una vista general, los inventores se enfocan en residuos en o cerca del extremo N-terminal de la cadena ligera ; cada una de la metionina en la posición 1 (Metí ) y el aspa rtato en la posición 2 (Asp2) se reemplaza n con todos de los veinte posibles residuos de aminoácidos natu rales. Véase Figu ra 9. Estas dos series de construcciones de mutación de la un ión de la cadena ligera utilizan la secuencia codificadora del anticuerpo D2E7 y el segmento de la inte ína Pab Lon en la configuración HC-inteína-LC .

Las construcciones se transfectan en células 293. La expresión transitoria produce títulos altos de IgG utilizando la mayoría de las construcciones con substitución de Met, en el que un número de estas construcciones prod ucen niveles de expresión más altos que los de la construcción de control que tiene Met en esta posición . Véase figura 10. Las construcciones de sustitución de Asp generalmente producen nivel más bajo de expresión de anticuerpo; véase fig ura 1 1 .

Se investigan las eficiencias del procesamiento de poli-proteína . Véase, por ejemplo , la Figu ra 1 2. La genoteca de construcciones basada en la variación de Met produce procesamiento eficiente tanto de la HC como de la LC a partir de la poli-proteína, similar a la construcción Pab Lon H L(-) previamente descrita . La genoteca de construcciones basadas en la variación de Asp parece tener procesamiento C-terminal relativamente disminuido , generando poca LC y cantidades sig nificativas de especies de proteina de fusión de inteína-LC . Este resultado de corte incompleto se interpreta q ue es independiente de la naturaleza del aminoácido en la u nión de empalme y por lo tanto parece estar asociado con la diferencia en longitud total de una u nidad de aminoácido. Sin embargo, se observa que incluso las construcciones q ue son relativamente ineficientes pueden aún producir algo de producto de IgG .

En un experimento, se analizan ad icionalmente los productos de anticuerpo de IgG provenientes de 10 de las 20 construcciones en la genoteca de variación de metionina. Las muestras se purifican por lotes utilizando cromatografía de afinidad con proteína A, y los componentes de la cadena ligera se analizan utilizando espectrometría de masas incluyendo la evaluación del peso molecular. Los resultados de espectrometría de masas indican que las cadenas ligeras del anticuerpo de ciertas construcciones (Pab Ion M1 A, Pab Ion M1 D, Pab Ion M1 E, Pab Ion M1 F, Pab Ion M1 G, Pab Ion M1 H, Pab Ion M1 I, Pab Ion M1 K, Pab Ion M1 L, y Pab Ion M1 C) se forman como se diseñaron en el diseño de la construcción en las que el corte preciso ocurre a través de reacciones mediadas por inteína. La construcción en la cual se utiliza una Cys para reemplazar la Met produce componentes de HC y LC menos procesados y contiene una especie de proteína que pudiera ser un producto de empalme, lo que sugiere que una Cys en la posición +1 de la cadena ligera del anticuerpo podría dar soporte al empalme de proteína hasta cierto grado. En todas las cadenas ligeras de anticuerpo producidas, la presencia del primer aminoácido de la LC demuestra que el producto de anticuerpo que se produce utilizando estos vectores será homogéneo en la región N-terminal de la LC y que las LC son susceptibles de procesamiento por actividad de amino peptidasa la cual puede ser endógena.

EJEMPLO 6 Expresión del anticuerpo ABT-847 utilizando construcciones de sORF Se desarrollan construcciones de sORF las cuales están adaptadas para expresar anticuerpos que implican una cadena ligera lambda de humano. Se trabaja con ABT-847, un anticuerpo completamente humano con especificidad para el antígeno, interleucina-12. Este anticuerpo tiene una cadena pesada de isotipo I g G 1 de humano y una cadena ligera del isotipo lambda. Véase patente E.U.A. 6,914,128 de Salfeld, et al., 5 de julio de 2005 para Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing.

Se elaboran cinco construcciones de sORF que pueden expresar ABT-874 utilizando recombinación homóloga. La Figura 13 ilustra estructuras del componente SORF de estas construcciones. Tres de las construcciones tienen configuraciones de HC-inteína-LC, y dos construcciones tienen configuraciones de LC-inteína-HC. Estos vectores se introducen en células HEK293 mediante transfección transitoria, y sus niveles de expresiones de anticuerpo se evalúan mediante ELISA para IgG. Las tres construcciones HC-inteína-LC producen títulos de anticuerpo en muestras de sobrenadantes de cultivo que son similares a los de la construcción con una configuración similar (HC-inteína-LC) pero que tiene los segmentos del anticuerpo D2E7. En ambos casos, los sistemas de expresión de sORF de ABT-874 y D2E7 emplean los aspectos de Pab Lon HL(-).

Las dos construcciones que tienen los segmentos del anticuerpo ABT-874 en las config uraciones LC-inteína-HC producen niveles más bajos de títulos de IgG .

Las muestras de IgG producida en el sobrenada nte se purifican por lotes med iante cromatog rafía de afinidad de Proteína A y se analizan mediante electroforesis SDS-PAGE. Estos análisis revelan que los componentes de la LC fueron completamente procesados a partir de la poli-proteína en todas las tres construcciones de HC-inteína-LC .

Las muestras de IgG también se caracterizan utilizando espectrometría de masas. Este análisis confirma que la LC producida a partir de las tres construcciones HC-inteína-LC comienza con el aminoácido apropiado de conformidad con el d iseño de la construcción . Este resultado es consistente con el hecho de q ue el corte preciso es mediado por la inteína utilizada en la config u ración. Los componentes de la LC prod ucida a partir de las dos construcciones que no tienen u n resid uo metionina adicional son los mismos que en el material proveniente de u na muestra de control del anticuerpo ABT-874. Por lo tanto, au nque la modificación se puede lograr como se hizo para el anticuerpo D2 E7 , dicha mod ificación es opcional en vista del log ro de una secuencia de aminoácido de LC N-terminal deseado en el producto de expresión de las construcciones descritas. El análisis de espectrometría de masas también se utiliza para evalua r el peso molecular de la HC , la cual dem uestra el peso molecula r esperado de conformidad con el diseño de la construcción .

EJEMPLO 7 Construcciones de sORF con marcas para pu rificación basadas en i nteína En modalidades de la invención , las construcciones están diseñadas con insertos. En las modalidades de construcciones con insertos, un inserto es capaz de proveer u na señal detectable o es útil pa ra proveer u n elemento de u nión o de reconocimiento. En modalidades de la invención , las construcciones se diseñan para facilitar la separación de ciertos productos de expresión relacionados con la construcción a partir de u no o más de dichos productos. Por ejemplo, los diseños de vector se generan para permitir la purificación del producto de anticuerpo m ultimérico, ensamblado, completamente procesado a partir de una mezcla de componentes que incluye proteí nas parcialmente procesadas provenientes de reacciones de empalme de inteína. En el contexto de expresión de una construcción de H L, la estructu ra de H-inteína-L puede conducir a reacciones de corte i ncompletas en una o en ambas de las uniones H-inteína o inteína-L, genera ndo de esta manera subprod uctos de proteína de H-inteína , inteína-L, o la H-inteína-L tripartita en oposición al log ro de corte completamente eficiente el cual podría generar los componentes H , inteína, y L. I ncluso en esta última situación , sin embargo, pod ría ser útil remover el componente de inteína . Por lo tanto, se desarrolló u na estrateg ia para eq u ipar u na inteína con u na marca, de preferencia una ma rca interna para permitir la eficiencia por lo menos parcial de las reacciones de corte y/o ligación de inteína.

Como se describe en alg u na otra parte en la presente solicitud , en las muestras de sobrenadantes de cultivo proven ientes de construcciones de sORF se han observado varios intermediarios parcialmente procesados q ue contienen la proteína de inteína u nida a cualquiera de las cadenas pesadas y/o las cadenas ligeras de inmunoglobu lina. Se diseñaron construcciones de sORF en las cuales las inteínas Pfu I on y Pab Ion contienen marcas de polihistidina internas (I HT) . Esto provee que las composiciones y métodos permitan la sepa ración rápida y eficiente de contaminantes no procesados.

Los inventores descubrieron que las inteínas se pueden modificar insertando un péptido o una proteína g rande. De preferencia , la inserción se efectúa en un asa accesible a solvente. Mediante análisis de alineación de secuencia de va rias inteínas en conjunto con modelado estructu ral, los inventores identificaron u n asa accesible a solvente dentro de tanto la i nteína LON de Pyrococcus abyssi (PAB) como de la inteína LON de Pyrococcus furiosus (PFU). Esta asa está localizada entre el motivo del dominio de endon ucleasa (H) y los bloq ues F/G de una inte ína (véase Figura 14) . La Figu ra 14 ilustra ciertos motivos estructu rales de las inteínas en el contexto de la ubicación de una localización preferida (flecha punteada) de un asa accesible al solvente entre el H y los bloques F/G para introd ucción de insertos incluyendo marcas. Véase también la información disponible en la página de Internet, http:// tools.neb.com/inbase/motifs_endo.php (InBase, The Intein Database:DOD Homing Endonuclease Motifs; InBase Reference: Perler, F. B., 2002, InBase, the Intein Datábase, Nucleic Acids Res. 30, 383-384) (fuente del diagrama esquemático que ilustra ciertas características estructurales de la inteína incluyendo motivos). Los inventores han determinado que la región entre los dominios indicados es permisiva para muchos posibles sitios de inserción que se pueden utilizar dentro de esta asa accesible a solvente. De conformidad con la fuente anterior, en la Figura 14 ciertas características de los residuos conservados se indican de la siguiente manera: aminoácidos encuadrados, nucleófilos en reacción estándar de empalme; letras en mayúsculas, aminoácidos conservados en las inteínas estándar; letras en minúsculas, aminoácidos en inteínas polimórficas que se pueden empalmar utilizando mecanismos modificados.

Utilizando mutagénesis dirigida a sitio, se inserta una marca de afinidad de polihistidina dentro de esta asa y se evalúa la capacidad de estas inteínas para funcionar. La IHT no altera la capacidad de la inteína PAB-LON o PFU-LON de auto-proceso, y la marca de polihistidina se puede utilizar para purificar la proteína, demostrando por lo tanto que el asa es accesible al solvente. Además, el examen de la estructura del cristal de la estructura PFU-RIR1-1 sugiere que se puede insertar cualquier proteína en esta región en tanto que ésta no altere substancial o completamente la reacción auto-catalítica amino terminal y carboxilo terminal. Por ejemplo, las marcas polipeptídicas o proteínas que tienen residuos amino terminales y carboxilo terminales dentro de proximidad cercana no deben alterar sustancialmente la actividad autocatalítica de una inteína. En modalidades preferidas, se proveen construcciones con insertos tales como marcas en las cuales las construcciones son capaces de exhibir una o más de las actividades de inteína deseadas (por ejemplo, corte y/o ligación). Por lo tanto, los componentes de la construcción incluyendo esta asa accesible al solvente de la inteína se pueden modificar para crear muchas moléculas funcionales diferentes.

Para la inteína Pfu Ion, se insertan secuencias de marca. Una ubicación preferida para inserción es en donde la secuencia de aminoácidos hacia el extremo 5' del sitio de inserción es IEFIP (AA 323-327) y hacia el extremo 3" del sitio de inserción es ISFSP (AA 328-332). Para la inteína Pab Ion, se insertan secuencias de marca. Una ubicación preferida para inserción es en donde la secuencia de aminoácidos hacia el extremo 5' del sitio de inserción es IIFDA (AA 291-295) y hacia el extremo 3' del sitio de inserción es GRLDV (AA 296-300). En cada una de las construcciones de inteína Pfu Ion y Pab Ion, las secuencias de marca que se insertan incluyen las siguientes: HHHHHH (SEQ ID NO:56), HHHHHHHHHH (SEQ ID NO:57), y HQHQHQ (SEQ ID NO:58). Como se demuestra mediante la última secuencia de marca (en la cual H = histidina y Q = glutamina), los insertos pueden ser diferentes a marcas de polihistidina. Se pueden utilizar secuencias de inserto adicionales como se entenderá en la técnica.

Las construcciones sOR F de inteína modificada con I HT producen niveles de secreción de anticuerpo similares a aquellos sin la modificación I HT. Este resultado sug iere q ue la modificación I HT no altera la capacidad de la inteína para funcionar en su auto-procesamiento del prod ucto de sO RF, n i la I HT evita que los anticuerpos correctamente procesados sean secretados en el medio.

Utilizando cromatografía de afinidad de metal inmovilizado, se demuestra que la inteína que contiene contaminantes se puede retirar de manera rápida y eficiente de las prepa raciones de a nticuerpo pu rificadas con proteína A mediante la I HT. Estas construcciones de I HT han permitido separa r anticuerpos procesados correctamente y representan un método complementario para la producción de productos biológicos derivados de sORF incluyendo anticuerpos terapéuticos .

Utilizando construcciones de sO RF marcadas internamente con H is, las molécu las del anticuerpo D2 E7 se sepa ran de manera eficiente de las especies de proteína q ue contienen inteína en modo de flujo pasante con la técnica de cromatografía con columna de n íquel. De manera similar, el anticuerpo D2 E7 que se produce utilizando la construcción Pab I on H L(-) también se separa de manera eficiente a las especies de proteína q ue contienen inteína utilizando columna Q . Las muestras de IgG producida a partir de la Pab Ion HL(-) se pu rifica mediante tecnolog ía con proteína A, y las muestras de IgG que se producen a partir de las construcciones Pab Ion HL(-)/10 His y que se purifica utilizando resinas tanto de proA como de Ni también se analizan mediante fraccionamiento con SEC. Las muestras post-purificación muestran pureza mejorada de las especies de IgG monoméricas. La cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) también remueve los contaminantes menores residuales. Las muestras de IgG purificadas IgG se analizan mediante BiaCore respecto a la afinidad de unión al antígeno especifico, TNFa. Las afinidades de estas muestras son indistinguibles del anticuerpo D2E7 que se produce utilizando vector convencional.

EJEMPLO 8 Inteína Pho Ion La secuencia de aminoácido para la inteína Pho Ion de Pyrococcus horikoshii OT3 se indica a continuación. Véase también No. de Acceso BAA29538.1 en NCBI/proteína, PH0452, de conformidad con Inbase, la Base de Datos de Inteína de NEB.

TABLA 25 Pho Ion, secuencia de aminoácido (SEQ ID NO:55) QCFSGEEVI IVEKGKDRKVVKLREFVEDALKEPSGEGMDGDIKVTYKDLRGEDVRILTKDGFVKLLYVNK REGKQKLRKIVNLDKDYWLAVTPDHKVFTSEGLKEAGEITEKDEIIRVPLVILDGPKIASTYGEDGKFDD YIRWKKYYEKTGNGYKRAAKELNIKESTLRW TQGAKPNSLKMIEELE LNLLPLTSEDSRLEKVAIILG ALFSDGNIDRNFNTLSFISSERKAIERFVETLKELFGEFNYEIRDNHESLGKSILFRTWDRRIIRFFVAL TABLA 25 (cortU GAPVGN T VKLELPWWIKLKPSLFLAFMDGLYSGDGSVPRFARYEEGI FNGTFEIAQLTDDVE KLPF FEEIAWYLSFFGIKAKVRVDKTGDKYKVRLIFSQSIDNVLNFLEFIPISLSPA REKFLREVESYLAAVP ESSLAGRIEELREHFNRI KGERRSFIET EVVNVTYNVTTETGNLLANGLFVKNS EJEMPLO 9 Vectores y péptidos de señal de la cadena ligera Se han hecho avances adicionales en el contexto de vectores de marco de lectura abierto individual para expresión de proteínas. En modalidades, los vectores emplean proteínas de inmunoglobulinas para expresión en células de mamífero. En dichos vectores, se diseñan y generan las configuraciones de componentes de los componentes de la cadena ligera incluyendo péptidos de señal de la cadena ligera.

En las modalidades de construcciones de marco de lectura abierto individual, se emplean péptidos de señales provenientes de fuentes de cadena ligera de anticuerpo original de humano. Por ejemplo, los péptidos de señal de la cadena ligera de humano se reportan en V BASE, la cual incluye una base de datos de información sobre secuencias de la región variable de línea germinal de humano proveniente de fuentes tales como Genbank y las bibliotecas de datos de EMBL. La base de datos V BASE está afiliada con el Centro MRC para Diseño de Proteínas (MRC Centre for Protein Engineering), Cambridge, Reino Unido (disponible en la dirección de la Internet, http: // vbase. mrc-cpe. cam. ac. uk/). Véase también Giudicelli V et al., Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, Ejemplar de la Base de Datos D781-D784; Retter I et al., Nucleic Acids Res. 2005 enero 1; 33 (Ejemplar de la Base de Datos): D671-D674. En modalidades particulares, se proveen diseños de vector múltiple los cuales se pueden utilizar para producir un anticuerpo de IgG 1 con varios aminoácidos incluyendo los aminoácidos naturales.

Se proveen ciertos péptidos de señal de la cadena ligera de humano los cuales generalmente varían en longitud de 19 a 23 aminoácidos y tienen secuencias como las indicadas en la(s) siguiente(s) tabla(s) (Hu Vk, región variable kappa de humano; LCSP, péptido de señal de la cadena ligera). También se proveen péptidos variantes los cuales pueden variar en la secuencia de aminoácidos y/o longitud con relación a los péptidos originales incluyendo aquellos de origen humano. Para una secuencia de aminoácidos dada, un espacio puede estar indicado con el propósito de comparación con relación a una alineación con una o más de otras secuencias. En una modalidad, se provee un péptido de señal de la cadena ligera dado o la secuencia de ácido nucleico que codifica para el mismo. En una modalidad, se provee una secuencia de aminoácido o de ácido nucleico como una construcción sintética de la secuencia o segmento del mismo tal como en un vector de expresión, una molécula sintetizada (tal como químicamente sintetizada), o un producto de expresión recombinante.

TABLA 26 Secuencias líder de Vk. Parte 1 TABLA 27 Secuencias l íder de Vk. Parte 2 Ciertos péptidos de señal Vkappa son sustituidos por L5, el cual es el péptido de señal para la cadena ligera de inmunoglobulina designada E7 (correspondiente a la cadena ligera de la molécula de anticuerpo D2E7 el cual tiene especificidad de antígeno para el factor alfa de necrosis tumoral) . Además, se construye una genoteca de mutación de ciertos mutantes de L5 , y los péptidos L5 mutantes son sustituidos por el péptido L5 original. Se construyen vectores de expresión de mamíferos en la orientación H L utilizando la inteína Ion de Pyrococcus abyssy. Se generan los siguientes vectores: pTT3-A 4-E7-Pablon H L, pTT3-A1 7-E7-PablonH L, pTT3-A1 8-E7-Pablon HL, pTT3-A1 9-E7-PablonH L, pTT3-A23-E7-PablonH L, pTT3-A26-E7-Pablon H L, pTT3-A27-E7-Pablon H L, pTT3-B2-E7-PablonH L, pTT3-E33-E7-PablonH L, pTT3-L2-E7-PablonH L, pTT3-L20-E7-PablonHL, pTT3-L25-E7-PablonHL, pTT3-mut-1 R-E7-PablonHL, pTT3-mut-1 R2G-E7-PablonHL, pTT3-mut-2R-E7-PablonHL, pTT3-mut-2G-E7-PablonHL, pTT3-mut-2R2G-E7-PablonHL, pTT3-mut-3G-E7-PablonHL, pTT3-mut-3R2G-E7-PablonHL, pTT3-mut-4G-E7-PablonHL, pTT3-mut-H+2G-E7-PablonHL. Estas construcciones se elaboran sobre la estructura base del vector PTT3. Este vector tiene origen de replicación de EBV, el cual permite su amplificación episómica en células 293E transfectadas (células que expresan el antígeno 1 nuclear del virus de Epstein-Barr) en cultivo en suspensión. Cada vector tiene un ORF, controlado por un promotor de CMV. En el ORF, la secuencia de inteína se inserta en marco entre las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, en el orden de HC-inteína-LC. Un diagrama esquemático de la estructura de la construcción para pTT3-A18-E7-PablonHL se muestra en la Figura 15.

Las construcciones se introducen en células 293E mediante transfección transitoria, y se efectúan experimentos de expresión transitoria múltiple. En un experimento dado, las muestras se recolectan del sobrenadante de los cultivos de las células transfectadas en el día ocho después de la transfección y se analizan. Las muestras contienen niveles de anticuerpo secretado según se evalúa mediante ELISA para IgG, para la cual los datos se muestran en la siguiente tabla en términos de microgramos de anticuerpo por mililitro de muestra. El control original es un vector que utiliza la secuencia de LCSP de L5. Como otro control (no mostrado en la tabla), un sistema de dos vectores convencional que expresa al mismo anticuerpo, y que utiliza los mismos elementos reguladores, se incluye con estos experimentos; el nivel de secreción de anticuerpo producido a partir de este sistema de vector de control varía de 80 a 206 pg/ml. El nivel de secreción de IgG producido por varios de los diseños de construcción de sORF utilizando estos péptidos de señal de la cadena ligera son comparables al orden del intervalo producido utilizando el vector convencional. Estos niveles de expresión son significativamente más altos que los que se obtienen utilizando el péptido de señal original E7 de L5 (2.0 pg/ml utilizando la construcción Pablon HL(+)). Estos niveles de secreción de anticuerpo también son significativamente más altos que los producidos utilizando la tecnología "2A", los cuales se reporta que están en 1.6 ug/ml en células de mamífero (Fang et al., 2005, Nature Biotechnology 23:584-590).

TABLA 28 Niveles de anticuerpo a partir de las construcciones de LCSP TABLA 28 De las construcciones indicadas para las cuales se miden los niveles de producto de anticuerpo, se seleccionan para análisis adicional los productos provenientes de cinco de las construcciones que producen los niveles más altos de anticuerpo secretado. Los productos corresponden a las sig uientes cinco construcciones: pTT3-A1 7-E7-Pablon H L, pTT3-A1 8-E7-Pablon H L, pTT3-A1 9-E7-PablonH L, pTT3-A26-E7-Pablon HL, Y pTT3-mutH + 2G-E7-PablonH L. El anticuerpo secretado que se prod uce a parti r de estas construcciones se pu rifica mediante cromatografía de afinidad con proteína A y se analiza en geles reductores de SDS-PAGE , y se determinan las secuencias de aminoácido N-terminales para sus H C y LC . Las muestras que se producen utilizando pTT3-A1 8-E7-Pablon H L contienen bandas de mig ración de proteína correspondientes a las cadenas pesada y ligera del anticuerpo con mig raciones indisting uibles de un anticuerpo similar producido mediante métodos tradicionales. En los geles reductores, además de las bandas correspondientes a la HC y LC del anticuerpo, también hay dos bandas de peso molecular más alto que parecen corresponder a la proteína tripartita (HC-inteína-LC) no procesada. Dichos contaminantes relacionados con la construcción como proteínas no procesadas o parcialmente procesadas se pueden remover de manera conven iente como se describe en la presente solicitud y de conformidad con técnicas convencionales. Véase Figura 16 la cual muestra un ejemplo de los resultados de un análisis SDS-PAGE . Los anticuerpos de IgG secretados se purifican mediante cromatografía de afin idad de Proteína A y se separan utilizando la técnica de S DS-PAGE en un gel bajo condiciones reductoras. Las muestras en los carriles de izquierda a derecha son : carril (1 ) marcadores de peso molecula r de proteína SeeBlue Plus2 Protei n Standard (I nvitrogen) ; (2) control, anticuerpo D2 E7 producido con un sistema de vector de expresión de tipo no sORF trad icional; (3) Pab-lon HL(-) ; (4) pTT3-A1 8-E7-Pablon HL.

Las muestras intracelulares de los productos de las construcciones de expresión también se analizan mediante análisis Western blot utilizando anticuerpos contra ambas de HC y LC . Se observan especies de prote ínas similares como en el sobrenadante cultivado . Se determina que las secuencias de aminoácido N-terminales tanto de la cadena pesada como de las cadenas ligeras son originales mediante análisis de espectrometría de masas. El análisis confirma que el corte del péptido de señal A1 8 tomar lugar precisamente en el punto correcto que que se desea para expresión de la cadena ligera . Además, la similitud con D2E7 expresado en forma tradicional se demuestra utilizando cromatog rafía de intercambio catiónico (CI EX) , la cual separa las proteínas tomando como base la carga de superficie neta y la cual puede detectar variantes de D2E7 e impu rezas. Por lo tanto , el péptido de señal A1 8 se puede utilizar en vectores de sORF para expresión de anticuerpo y es capaz de expresar en forma eficiente u n prod ucto de anticuerpo completamente procesado y ensamblado.

Además de los sistemas de expresión transitoria descritos anteriormente, también se generan líneas celulares estables para expresión de productos de anticuerpo. Las líneas de célula C HO estables se elaboran con las construcciones de expresión de sO RF utilizando vectores que tienen al componente de péptido de señal de la cadena ligera A18. La construcción de sORF A18-E7-PablonHL se clona en el plásmido pA190 utilizando técnicas recombinantes. Véase Figura 18 la cual provee un diagrama esquemático de la estructura de la construcción para pBJ-A18-LC-Pablon-HL (también referida como pA190-A18-E7-PablonHL). Esta construcción se transfecta utilizando el método de fosfato de calcio en células CHO B3.2 y se siembra en la casa de 48 96 cavidades en Medio Esencial Mínimo (MEM) Alfa Medio con FBS al 5%. Las muestras de transfección se tamizan y se someten a métodos de amplificación hasta con 100 nM de MTX. Se caracterizan los resultados de la expresión de la construcción en los cultivos. A 100 nM de MTX, las células con la construcción pA190-A18-E7-PablonHL expresan el anticuerpo en el intervalo de 1.1 a 16.9 pg/ml en las muestras del sobrenadante de cultivo. Los cuatro clones con la expresión más alta se subclonan mediante dilución limitante. Los subclones se analizan y se encuentra que expresan el anticuerpo en cantidades de 2.9 a 31.8 g/ml. Cuatro de las líneas de células subclonadas con los niveles de expresión más altos se adaptan para crecimiento en suspensión y producen cantidades promedio de 31 a 44 pg/ml tal como se mide a partir de las muestras tomadas en el día cuatro de cultivo.

Se evalúa la capacidad de las construcciones para generar productos de la cadena ligera maduros. Véase Figura 17 la cual provee los resultados de un experimento Western blot. Se caracterizan las muestras de productos de anticuerpo intracelulares.

Los lisados de célula entera se separan de conformidad con SDS-PAGE en un gel bajo condiciones reductoras, se transfieren a membranas de nitrocelulosa, se bloquean con solución para bloqueo (leche seca descremada en TTBS, solución salina regulada con tris con Tween 20), se incuban con anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano para cualquiera de la cadena pesada o la cadena ligera y se revelan utilizando el reactivo ECL (quimioluminiscencia realzada). Las muestras de conformidad con las designaciones de la construcción en los carriles de izquierda a derecha en el blot son: carril no numerado a la izquierda, marcadores de peso molecular; (Carril 1) control, D2E7 provenientes de células CHO; (2) control, pTT3-A18-E7-PablonHL en transfección transitoria con células HEK293; (3-11) varios clones de pA190-A18-E7-PablonHL, que corresponden respectivamente a los números de clon 1, 3, 7, 9, 12, 14, 18, 15, y 13 respectivamente. Las flechas marcadas con las letras "a" y "b" indican los productos de expresión como sigue: (a) banda superior, cadena ligera con péptido de señal, y (b) banda inferior, cadena ligera madura. En el producto de la cadena ligera madura, el péptido de señal ha sido cortado, lo que resulta en un producto con peso molecular más bajo con relación al precursor. Los resultados demuestran que las construcciones con el componente de péptido de señal de la cadena ligera A18 pueden expresar y producir el producto de la cadena ligera completamente madura la cual es comparable con la del anticuerpo D2E7.

Declaraciones referentes a la incorporación para referencia v va riaciones Cualquier información del listado de secuencias se considera parte de la descripción .

Todas las referencias mencionadas a través de toda esta solicitud , por ejemplo documentos de patente incluyendo patentes emitidas u otorgadas o eq uivalentes; publicaciones de solicitud de patente; solicitudes de patente no pu blicadas; y documentos de la literatura que no sean patentes u otro material fuente; quedan incorporadas para referencia en la presente solicitud en sus totalidades, como si se incorporará n individualmente para referencia. En caso de alg u na inconsistencia entre las referencias citadas y la descripción de la presente solicitud , la descripción de la presente solicitud prevalece. Algunas referencias provistas en la presente solicitud se i ncorporan para referencia para proveer información , por ejemplo, detalles concern ientes a las fuentes de los materiales de partida , materiales de pa rtida adicionales , reactivos adicionales, métodos de síntesis adicionales, métodos analíticos adicionales, materiales biológicos ad icionales, células ad icionales, y usos adicionales de la invención .

Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la presente solicitud son indicativas de los niveles de habilidad de los expertos en la técnica a la cual pertenece la invención . Las referencias citadas en la presente solicitud pueden ind icar el estado de la técnica hasta sus fechas de publicación o presentación, y se pretende q ue esta información se pueda utilizar en la presente solicitud , si fuera necesa rio , para excluir modalidades específicas que están en la técnica antecedente. Por ejemplo, cuando en la presente solicitud se reclama composición de materia , se debe entender q ue no se pretende incluir compuestos conocidos y dispon ibles en la técn ica a ntecedente a la invención del Solicitante, incluyendo compuestos para los cuales se provee una descripción habilitadora en las referencias citadas en la presente solicitud, en la composición de materia reclamada en la presente solicitud .

Cualesquiera apéndice o apéndices a la presente solicitud se incorporan para referencia como pa rte de la descripción y/o figu ras.

Cua ndo se reclama un compuesto , construcción o composición , se debe entender q ue no se pretende incluir a los compuestos, construcciones y composiciones conocidos en la técnica incluyendo aq uellos enseñados en las referencias d ivulgadas en la presente solicitud . C uando en la presente solicitud se utiliza un g ru po de Markush u otro agrupamiento, se pretende q ue todos los miembros individuales del g ru po y todas las combinaciones y sub-combinaciones posibles de dentro del g rupo también estén individualmente indicadas e incluidas en la descripción .

En donde los términos "comprenden" , "comprende" , "comprendido", o "que comprende" se utilicen en la presente solicitud , esto se deben interpretar como que especifican la presencia de las características, n úmeros enteros, pasos, o componentes ind icados a los q ue se haga referencia , pero no excluyen la presencia o adición de una o más de otra característica , número entero, paso, componente , o g rupo de los mismos. Por lo tanto tal como se utiliza en la presente solicitud , q ue comprende es sinón imo con que incluye, que contiene, que tiene , o caracterizado por, y es incluyente o de extremo abierto y no excluye elementos o pasos del método no indicados , adicionales. Tal como se utiliza en la presente solicitud, "que consiste de" excluye cualqu ier elemento , paso, o ing rediente, etc. no especificado en la descripción de la reivindicación . Tal como se utiliza en la presente solicitud , "q ue consiste esencialmente de" no excluye materiales o pasos que no afecten materialmente las características básicas y novedosas de la reivindicación (por ejemplo, referente a u n ing rediente activo) . En cada caso en la presente solicitud cualqu iera de los términos "q ue comprende", "q ue consiste esencialmente de" y "q ue consiste de" se puede reemplazar con por lo menos cualquiera de los otros dos términos, describiendo de esta manera modalidades y/o alcances separados los cuales no necesa riamente son coextensivos. U na modalidad de la invención descrita ilustrativamente en la presente solicitud idóneamente se puede practicar en ausencia de cualqu ier elemento o elementos o limitación o limitaciones no descritas específicamente en la presente solicitud .

Cada vez que se describa un intervalo en la presente solicitud , por ejemplo, un intervalo de temperaturas , intervalo de tiempo, intervalo de composición o de concentración , u otro intervalo de valores, etc. , se pretende que todos los intervalos intermedios y sub-intervalos así como todos los valores individ uales incluidos en los intervalos dados queden incluidos en la descripción . Esta invención no debe ser limitada por las modalidades descritas, incluyendo cualq uiera mostrada en las fig u ras o ejemplificadas en la descripción , las cuales se brindan a manera de ejemplo o ilustración y no de limitación . Se entenderá q ue cualesq uiera sub-i ntervalos o valores individuales en un intervalo o sub-intervalo que estén incluidos en la descripción en la presente solicitud pueden ser excluidos de las reivindicaciones de la presente solicitud .

La invención se ha descrito con referencia a varias modalidades y técn icas específicas y/o preferidas. Sin embargo , se debe entender que se pueden hacer muchas variaciones y modificaciones y aún permanecer dentro del alcance y campo de la invención . Será evidente para el experto en la técnica q ue se pueden emplear composiciones, métodos, dispositivos , elementos del dispositivo, materiales , procedimientos y técn icas d iferentes de aquellas descritas específicamente en la presente solicitud , en la práctica de la invención como se describe ampliamente en la presente solicitud sin recu rrir a experimentación indebida; esto se puede extender, por ejemplo, a materiales de partida, materiales biológicos , reactivos , métodos de síntesis, métodos de pu rificación , métodos anal íticos , métodos de prueba , y métodos biológicos diferentes de aq uellos ejemplificados específicamente. Se pretende que todos los equivalentes funcionales conocidos en la técnica de los anteriores (por ejemplo, composiciones, métodos, dispositivos, elementos del dispositivo, materiales, procedimientos y técnicas, etc.) descritos en la presente solicitud queden abarcados por esta invención. Los términos y expresiones que han sido utilizadas se utilizan como términos de descripción y no de limitación, y no hay intención en el uso de dichos términos y expresiones de excluir cualesquiera equivalentes de las características mostradas y descritas o porciones de las mismas, pero se reconoce que son posibles varias modificaciones dentro del alcance de la invención reclamada. Por lo tanto, se debe entender que aunque la presente invención se ha descrito específicamente mediante modalidades, modalidades preferidas, y características opcionales, los expertos en la técnica pueden recurrir a la modificación y variación de los conceptos descritos en la presente solicitud, y que dichas modificaciones y variaciones están consideradas dentro del alcance de la invención como queda definida por las reivindicaciones anexas.

Referencias Esta solicitud incorpora para referencia en particular cada uno de los siguientes ítems en su totalidad: Solicitud de Patente Provisional E.U.A No. de Serie 61 /256,544 presentada el 30 de octubre de 2009 por Gerald R. Carson et al.; Solicitud de Patente E.U.A No. de Serie 12/822,598 presentada el 24 de junio de 2010 por Gerald R. Carson et al.; Solicitud de Patente E.U.A No. de Serie. 11/459,098 presentada el 21 de julio de 2006 por Gerald R. Carson et al. (Publicada como US 20070065912, 22 de marzo de 2007); Solicitud de Patente Provisional E.U.A No. de Serie 60/701,855 presentada el 21 de julio de 2005 por Gerald R. Carson et al.; y Solicitud Internacional del PCT No. PCT/US06/28691 presentada el 21 de julio de 2006 por Gerald R. Carson et al. (Publicada como WO/2007/014 62, 1 de febrero de 2007).

Documentos de Patente E.U.A.: 5,981,182 de Jacobs, Jr., et al., 9 de noviembre de 1999, 7105341; 7,378,248 de Lorens, et al., 27 de mayo de 2008; 6,933,362 de Belfort, et al., 23 de agosto de 2005. E.U.A. 6,090,382 de Salfeld, et al. Expedida el 18 de julio de 2000 para Human antibodies that bind human TNF.alpha. E.U.A. 6,914,128 de Salfeld, et al., 5 de julio de 2005 para Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing. E.U.A. 6,258,562 de Salfeld, et al., 10 de julio de 2001 para Human antibodies that bind human TNF.alpha.

Documentos de Patente E.U.A.: 20030036643 A1 de Jin, Cheng He; et al., publicada el 20 de febrero de 2003; 20050158820 A1 de Kinsella, Todd M., publicada el 21 de julio de 2005 para In vivo production of cyclic peptides. Publicación de Solicitud de Patente E.U.A. 20050147610 de Ghayur, Tariq et al., 7 de julio de 2005. E.U.A 5,756,095 de Jutila, 26 de mayo de 1998 para Antibodies with specificity for a common epitope on E-selectin and L-selectin.

E.U.A.20070081996 de Hoffman; Rebecca S.; et al. 12 de abril de 2007 para Method of treating depression using a TNFalpha antibody.

Chen L, Benner J, Perler FB., Protein splicing in the absence of an intein penultimate histidine. J Biol Chem. 2000 Jul 7;275(27):20431 -5.

Cohén GN, et al., An integrated analysis of the genome of the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus abyssi. Mol Microbiol. 2003 Mar;47(6):1495-512.

Durocher Y, Perret S, Kamen A., Nucleic Acids Res. 2002 Jan 15;30(2):E9, High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.

Fukui T, Eguchi T, Atomi H, Imanaka T. A membrane-bound archaeal Lon protease displays ATP-independent proteolytic activity towards unfolded proteins and ATP-dependent activity for folded proteins. J Bacteriol. 2002 Jul;184(13):3689-98. PMID: 12057965.

Gandor C, et al., 1995 FEBS Letters 377:290-294.

Goddard MR, Burt A. Recurrent invasión and extinction of a selfish gene. Proc Nati Acad Sci U S A. 1999 Nov 23;96(24): 13880-5.

Gogarten JP, Hilario E. Inteins, introns, and homing endonucleases: recent revelations about the Ufe cycle of parasitic genetic elements. BMC Evol Biol.2006 Nov 13;6:94. PMID: 17101053 Gogarten JP, Senejani AG, Zhaxybayeva O, Olendzenski L, Hilario E. Inteins: structure, function, and evolution. Annu Rev Microbiol.2002;56:263-87.

Publicación Internacional No.: WO/2005/086654 para la Solicitud Internacional No.: PCT/US2005/005763, Fecha de publicación: 22.09.2005 de Wood David W et al.

Kimball AB, et al., Arch Dermatol. 2008 Feb; 144(2):200-7, Safety and efficacy of ABT-874, a fully human interleukin 12/23 monoclonal antibody, in the treatment of modérate to severe chronic plaque psoriasis: results of a randomized, placebo-controlled, phase 2 trial.

Liao YD, Jeng JC, Wang CF, Wang SC, Chang ST. Removal of N-terminal methionine from recombinant proteins by engineered E. coli methionine aminopeptidase. Protein Sci. 2004 Jul;13(7):1802-10.

Lecompte, O.; Ripp, R.; Puzos-Barbe, V.¡ Duprat, S.; Heilig, R.; Dietrich, J.; Thierry, J. C; Poch, O. (2001) Genome evolution at the genus level: comparison of three complete genomes of hyperthermophilic archaea. Genome Res. 1 1 (6): 981 -93.. PubMed ID: 1 1381026.

Mills Kenneth V., Jennifer S. Manning, Alicia M. García, and Lisa A. Wuerdeman, Protein Splicing of a Pyrococcus abyssi Intein with a C-terminal Glutamine, The Journal of Biological Chemistry, Vol.279, No.20, Issue of May 14, pp.20685-20691, 2004.

Mills Kenneth V., Deirdre M. Dorval, and Katherine T. Lewandowski, Kinetic Analysis of the Individual Steps of Protein Splicing for the Pyrococcus abyssi Pol 11 Intein, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 280, No. 4, Issue of January 28, pp. 2714- 2720, 2005.

Powell KT and Weaver JC, 1990 Bio/Technology 8:333- 337.

Saves I, Morlot C, Thion L, Rolland JL, Dietrich J, Masson JM, Nucleic Acids Res. 2002 Oct 1 ¡30(19):4158-65. Investigating the endonuclease activity of four Pyrococcus abyssi inteins.

Senejani AG, Hilario E, Gogarten JP. The intein of the Thermoplasma A-ATPase A subunit: structure, evolution and expression in E. coli. BMC Biochem.2001;2:13. PMID: 1 1722801 Southworth MW, Benner J, Perler FB, EMBO J. 2000;19(18):5019-26. An alternative protein splicing mechanism for inteins lacking an N-terminal nucleophile.

Xie, J.; Juang, J.F.; Shi, X.F.; Liu, C.Q. (2001) Analysis of the characteristic sequence of intein and revisión of its motifs. Chínese Sci Bull 46: 758-761.

Mannon PJ et al., 2004, N Engl J Med. 2004;351 (20):2069-79, Anti-interleukin-12 antibody for active Crohn's disease.

Xu y Perler, 1996. EMBO J. 15(9), 5146-5153.

Wu C, et al., Nat Biotechnol. 2007 Nov;25(1 1):1290-7. Simultaneous targeting of múltiple disease mediators by a dual-variable-domain ¡mmunoglobulin.

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1993); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullís et al., eds., 1994); y Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991).

Claims

REIVI N DICAC ION ES

1 .- U n vector de expresión aislado o pu rificado para generar uno o más prod uctos de proteína recombinante que comprende un inserto de marco de lectura abierto individual; d icho inserto comprende: (a) una secuencia de ácido nucleico de péptido de señal que codifica para un péptido de señal ; (b) una primera secuencia de ácido n ucleico que codifica para u n primer polipéptido; (c) una primera secuencia de ácido n ucleico de intercalado q ue codifica para un primer sitio de corte de proteína , en el cual dicho primer sitio de corte de proteína es provisto por un segmento de inteína de un gen de proteasa Ion de Pyrococcus o un gen klbA de Pyrococcus o Methanococcus, o un segmento de inteína modificada derivado a partir de los mismos; y (d) una seg unda secuencia de ácido n ucleico que codifica para u n segu ndo polipéptido; en donde dicha primera secuencia de ácido nucleico de intercalado que codifica para dicho primer sitio de corte de proteína está posicionado de manera operable entre d icha primera secuencia de ácido nucleico y dicha segu nda secuencia de ácido nucleico; en donde dicha secuencia de ácido nucleico de péptido de señal que codifica para dicho péptido de señal está posicionada de manera operable antes de dicha primera secuencia de ácido n ucleico; y en donde dicha vector de expresión puede expresar un polipéptido de marco de lectura abierto individual escindible en dicho primer sitio de corte de proteína .

2.- El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 1 , en donde d icho primer sitio de corte de proteína es provisto por un segmento de inteí na de un gen de proteasa Ion de Pyrococcus abyssi, Pyrococcus furiosus, o Pyrococcus horikoshii OT3 ; o un segmento de inteína de un gen klbA de Pyrococcus abyssi, Pyrococcus furiosus, o Methanococcus jannaschii; o un segmento de inteína modificada derivado respectivamente a partir de los mismos.

3.- El vector de expresión de conformidad con la reivind icación 1 , en donde el segmento de inteína o segmento de inteína modificado codifica pa ra u n penú ltimo residuo el cual es una Usina , serina o no u na histidina.

4 - El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicho segmento de inteína o segmento de inteína modificada es capaz de corte pero no de ligación completa de dicho primer polipéptido a dicho segu ndo polipéptido.

5.- El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicho primer sitio de corte de proteína es provisto por u n segmento de inteína que comprende u na secuencia que se selecciona a parti r del g ru po q ue consiste de SEQ ID NO: 1 , 3, 4, 6, 7 , 55, 35 , 37 , y 39 y segmentos de inteína modificada obten idos a partir de los mismos.

6. - El vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el primer polipéptido y el segundo polipéptido son capaces de ensamblado multimérico.

7. - El vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde por lo menos uno de dichos primer polipéptido y segundo polipéptido son capaces de secreción extracelular.

8. - El vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde por lo menos uno de dichos primer polipéptido y segundo polipéptido son de origen mamífero.

9. - El vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde dicho primer polipéptido comprende una cadena pesada de inmunoglobulina o un fragmento funcional de la misma, y dicho segundo polipéptido comprende una cadena ligera de inmunoglobulina o fragmento funcional de la misma, y dicho primer polipéptido está hacia el extremo 5' de dicho segundo polipéptido.

10. - El vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 que comprende solamente una de dicha secuencia de ácido nucleico de péptido de señal.

11. - El vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10 que comprende también una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica para un tercer polipéptido, y una segunda secuencia de ácido nucleico de intercalado que codifica para un segundo sitio de corte de proteína; en donde la segunda secuencia de ácido nucleico de intercalado y la tercera secuencia de ácido nucleico, en ese orden, están posicionadas de manera operable después de dicha segunda secuencia de ácido nucleico.

12. - El vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde dicho primero y dicho segundo polipéptidos comprenden un anticuerpo funcional u otra molécula de reconocimiento de antígeno; con una especificidad de antígeno dirigida a la unión de un antígeno que se selecciona a partir del grupo que consiste de: TNFa (tumor necrosis factor-alfa), receptor de eritropoyetina, RSV, EL/selectina, interleucina-1 , interleucina-12, interleucina-13, interleucina-18, interleucina-23, interleucina-33, CD81, CD19, IGF1, IGF2, EGFR, CXCL-13, GLP-1R, prostaglandina E2, y amiloide beta.

13. - El vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el primero y segundo polipéptidos comprenden un par de cadenas de inmunoglobulina provenientes de un anticuerpo D2E7, EL246, ABT-007, ABT-325, o ABT-874.

14. - El vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde el primero y segundo polipéptidos se seleccionan cada uno de manera independiente a partir de un segmento de la cadena pesada de inmunoglobulina o un segmento de la cadena ligera de inmunoglobulina proveniente de un segmento análogo de D2E7, EL246, ABT-007, ABT-325, ABT-874, u otro anticuerpo.

15. - El vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde dicho vector también comprende un elemento regulador de promotor para dicho inserto.

16. - El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 15, en donde dicho elemento regulador de promotor es inducible o constitutivo.

17. - El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 15, en donde dicho elemento regulador de promotor es específico de tejido.

18.- El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 15, en donde dicho promotor comprende un promotor tardío mayor de adenovirus.

19.- Una célula hospedera que comprende un vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18.

20.- La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 19, en donde dicha célula hospedera es una célula procariota.

21. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 20, en donde dicha célula hospedera es Escherichia coli.

22. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 19, en donde dicha célula hospedera es una célula eucariota.

23. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 22, en donde dicha célula eucariota se selecciona a partir del grupo que consiste de una célula protista, célula animal, célula vegetal, y célula fúngica.

24. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 23, en donde dicha célula eucariota es una célula animal que se selecciona a partir del grupo que consiste de una célula de mamífero, una célula aviar, y una célula de insecto.

25. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 24, en donde dicha célula hospedera es una línea de célula de mamífero.

26.- La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 24, en donde dicha célula hospedera es una célula CHO o una célula CHO deficiente en dihidrofolato reductasa.

27. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 24, en donde dicha célula hospedera es una célula COS o célula HEK.

28. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 23, en donde dicha célula hospedera es una célula de levadura.

29. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 28, en donde dicha célula de levadura es Saccharomyces cerevisiae.

30. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 24, en donde dicha célula hospedera es una célula de insecto Sf9 de Spodoptera frugiperda.

31.- Un método para producir una poli-proteína recombinante o una pluralidad de proteínas, que comprende cultivar una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 19 en un medio de cultivo bajo condiciones suficientes para permitir la expresión de una proteína de vector.

32.- El método de conformidad con la reivindicación 31 que comprende también recuperar y/o purificar dicha proteína de vector.

33. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-32, en donde dicha pluralidad de proteínas son capaces de ensamblado multimérico.

34. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-33, en donde la poli-proteína recombinante o pluralidad de proteínas son biológicamente funcionales y/o terapéuticas.

35.- Un método para producir un producto recombinante, en donde el producto es una proteína de inmunoglobulina o fragmento funcional de la misma, anticuerpo ensamblado, u otra molécula de reconocimiento de antígeno, que comprende cultivar una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 19 en un medio de cultivo bajo condiciones suficientes para producir el producto recombinante.

36. - Una proteína que se produce de conformidad con el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-35.

37. - Una poli-proteína que se produce de conformidad con el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31- 36.

38. - Una ¡nmunoglobulina ensamblada; otra molécula de reconocimiento de antígeno ensamblada; o cadena de ¡nmunoglobulina individual o fragmento funcional de la misma que se produce de conformidad con el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-37.

39. - La ¡nmunoglobulina; otra molécula de reconocimiento de antígeno; o cadena de ¡nmunoglobulina individual o fragmento funcional de la misma de conformidad con la reivindicación 38, en donde existe una capacidad para efectuar o contribuir para la unión a antígeno específica para el factor alfa de necrosis tumoral, receptor de eritropoyetina, RSV, EL/selectina, interleucina-1 , interleucina-12, interleucina-13, interleucina-18, interleucina-23, interleucina-33, CD81, CD19, IGF1, IGF2, EGFR, prostaglandina E2, CXCL-13, GLP-1 R, o amiloide beta.

40. - La ¡nmunoglobulina o fragmento funcional de la misma de conformidad con la reivindicación 39, en donde la ¡nmunoglobulina es D2E7 o ABT-874 o en donde el fragmento funcional es un fragmento respectivamente de los mismos.

41.- Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36-40, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

42.- El vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, que comprende también una secuencia de ácido nucleico que codifica para una marca.

43.- El vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en donde dicha secuencia de ácido nucleico de intercalado codifica adicionalmente para una marca.

44.- Un vector de expresión, célula hospedera con el vector, producto de expresión del vector, composición farmacéutica, y/o método para elaborar o utilizar cualquiera de los anteriores, en donde el vector es el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18 y comprende también un segmento que codifica para un péptido de señal de la cadena ligera.

45. - El vector, célula hospedera, producto de expresión del vector, composición farmacéutica y/o método de elaboración o uso de conformidad con la reivindicación 44, en donde el péptido de señal de la cadena ligera codificado es un péptido de señal de la cadena ligera kappa que se selecciona a partir del grupo que consiste de A17, A18, A19, A26, y H2G.

46. - El vector, célula hospedera, producto de expresión del vector, composición farmacéutica y/o método de elaboración o uso de conformidad con la reivindicación 44, en donde el péptido de señal de la cadena ligera codificado es un péptido de señal de la cadena ligera kappa VKII A18, SEQ ID NO:82 (secuencia de aminoácido RLPAQLLGLLMLWIPGSSA). RESU M E N Las modalidades de la invención se refieren a construcciones de vector y a métodos para expresión de polipéptidos incluyendo productos multiméricos tales como anticuerpos terapéuticos . Las construcciones particulares permiten la generación de prod uctos de expresión a partir de un marco de lectu ra abierto ind ivid ual (sO RF) . U na modalidad provee un vector de expresión aislado o purificado para genera r uno o más productos de proteína recombinante que comprenden un inserto de marco de lectura abierto individual ; d icho i nserto comprende u na secuencia de ácido nucleico de péptido de señal q ue codifica pa ra u n péptido de señal ; una primera secuencia de ácido nucleico que codifica para un primer polipéptido; u na primera secuencia de ácido n ucleico de intercalado que codifica para un primer sitio de corte de proteína , en la cual d icho primer sitio de corte de proteína es provisto por un segmento de inteína de un gen de proteasa Ion de Pyrococcus o un gen klbA de Pyrococcus o Methánococcus, o u n segmento de inteína mod ificada derivado a partir de los mismos; y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica para un segundo polipéptido. Ciertas modalidades de construcciones y métodos emplean un segmento de inteína de u n gen de proteasa Ion de Pyrococcus abyssi, Pyrococcus furiosus, o Pyrococcus horikoshii OT3; o un segmento de inteína de un gen klbA de Pyrococcus abyssi, Pyrococcus furiosus, o Methánococcus jannaschii; u otro segmento de inteína .