JP2013509188A - Ｓｏｒｆ構築物および複数の遺伝子発現 - Google Patents

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Abstract

本発明の実施形態は、多量体産物（治療抗体など）を含むポリペプチド発現のためのベクター構築物および方法に関する。
特定の構築物により、シングルオープンリーディングフレーム（ｓＯＲＦ）から発現産物を生成することが可能である。１つの実施形態は、シングルオープンリーディングフレームインサートを含む１つ以上の組換えタンパク質産物を生成するための単離または精製された発現ベクターであって、前記インサートが、シグナルペプチドをコードするシグナルペプチド核酸配列、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列、第１のタンパク質切断部位をコードする第１の介在核酸配列であって、前記第１のタンパク質切断部位が、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）のｌｏｎプロテアーゼ遺伝子またはパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）もしくはメタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）のｋｌｂＡ遺伝子のインテインセグメントまたはインテインセグメント由来の改変インテインセグメントによって提供される、第１のタンパク質切断部位をコードする第１の介在核酸配列、および第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列を含む、単離または精製された発現ベクターを提供する。構築物および方法の一定の実施形態は、パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、またはパイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）ＯＴ３のｌｏｎプロテアーゼ遺伝子のインテインセグメント、またはパイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）またはメタノコッカス・ヤナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）のｋｌｂＡ遺伝子のインテインセグメント、または他のインテインセグメントを使用する。

Description

組換え発現テクノロジーの分野では、所望のタンパク質産物の高産生レベルの達成および所望の純度の産物を生成できることが目下の問題である。かかる問題は、抗体である生物学的治療薬を含むタンパク質産物に特に関連するが、この分野における進歩は他の生物学的製剤にも関連する。本発明の一定の実施形態は、少なくとも一部であるが、これらの問題の１つ以上の態様に取り組んでいる。
以下の略語を適用可能である：ＯＲＦ、オープンリーディングフレーム；ｓＯＲＦ、シングルオープンリーディングフレーム；ＭＷ、分子量；ＨＣまたはＨ、免疫グロブリン重鎖；ＬＣまたはＬ、免疫グロブリン軽鎖；ｐａｂ、パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）；ｐｆｕ、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）；ｐｈｏ、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）ＯＴ３；ａａまたはＡＡ、アミノ酸（ｓ）；ＳＰ、シグナルペプチド；ＬＣＳＰ、軽鎖シグナルペプチド；ＭＴＸ、メトトレキサート。
本発明の実施形態は、一般に、発現カセット、ベクター構築物、組換え宿主細胞ならびに組換えポリタンパク質およびプレタンパク質の組換え発現およびプロセシング（翻訳後プロセシングが含まれる。）方法に関する。実施形態では、１つ以上の発現産物は免疫グロブリンである。
実施形態では、発現ベクターは、１つ以上のインテインセグメントを含む。実施形態では、インテインセグメントは、生物パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）およびパイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）ＯＴ３の１つ以上のｌｏｎインテインに由来する。
実施形態では、一定のエレメントの順序および有無に関して構築物の構造を設定する。１つの実施形態では、一定のベクター遺伝子セグメントの順序は、ＨＬ（ＨおよびＬはそれぞれ免疫グロブリン重鎖および軽鎖を示す。）である。別の実施形態では、順序はＬＨである。特定の実施形態では、構築物は、（−）（マイナス記号は構築物がＯＲＦのはじめの１つのシグナルペプチドおよびインテインの最後のアミノ酸と第２のタンパク質サブユニットの第１のアミノ酸との間に挿入されたメチオニンを有することを示す。）としてラベリングされたデザイン（例えば、インテイン後の成熟抗体鎖）を有する。特定の実施形態では、構築物は、（＋）（プラス記号は、ＯＲＦのはじめの第１のシグナルペプチドおよびインテイン下流の第２のタンパク質サブユニットのはじめの第２のシグナルペプチドの存在を示す。）としてラベリングされたデザインを有する。特定の実施形態では、立体配置はＨＬ（−）である。
実施形態では、本発明は、一過性発現条件下での実験由来の培養上清中で測定した場合に２、５、１０、２０、３０、４０または５０マイクログラム／ｍｌを超える分泌産物が存在するタンパク質発現レベルを得ることができるｓＯＲＦ（シングルオープンリーディングフレーム）構築物デザインを提供する。実施形態では、本発明は、安定なＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞発現系を使用した条件を使用した実験由来の培養上清中で測定した場合に２０マイクログラム／ｍｌ／日を超えるタンパク質発現レベルを得ることができるｓＯＲＦ構築物を提供する。１つの実施形態では、発現レベル（μｇ／ｍｌ／日）は、１から２４の範囲、１０超または２０超である。特定の実施形態では、発現レベルは２４μｇ／ｍｌ／日である。実施形態では、タンパク質発現は、重鎖および軽鎖の多量体単位に自己アセンブリした分泌抗体のタンパク質発現である。実施形態では、抗体はＩｇＧイソ型の抗体である。
１つの実施形態では、本発明は、シングルオープンリーディングフレームインサートを含む１つ以上の組換えタンパク質産物を生成するための単離または精製された発現ベクターであって、前記インサートが、以下：
（ａ）シグナルペプチドをコードするシグナルペプチド核酸配列、
（ｂ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列、
（ｃ）第１のタンパク質切断部位をコードする第１の介在核酸配列であって、前記第１のタンパク質切断部位が、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）のｌｏｎ前記プロテアーゼ遺伝子またはパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）もしくはメタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）のｋｌｂＡ遺伝子のインテインセグメントまたは前記インテインセグメント由来の改変インテインセグメントによって提供される、第１のタンパク質切断部位をコードする第１の介在核酸配列および
（ｄ）第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列
を含み、
前記第１のタンパク質切断部位をコードする第１の介在核酸配列が、前記第１の核酸配列と前記第２の核酸配列との間に作動可能に配置され、
前記シグナルペプチドをコードするシグナルペプチド核酸配列が、前記第１の核酸配列の前に作動可能に配置され、
前記発現ベクターが、前記第１のタンパク質切断部位で切断可能なシングルオープンリーディングフレームポリペプチドを発現することができる、単離または精製された発現ベクターを提供する。
種々の介在セグメントおよび方法を含む実施形態の文脈において明確にするために、タンパク質切断部位をコードする介在核酸配列は、介在核酸配列が少なくとも１つの第１のタンパク質切断部位をコードする介在核酸配列であり得る。正準インテインでは、例えば、切断反応は、一般に、自己前進的および急速な様式で進行する。さらなる説明は、基礎となる機構の理解に一部依存する。エクステイン成分を考察したプロセシング後の見込みから、それぞれインテインセグメントのＮ末端およびＣ末端に向かって第１のタンパク質切断部位および第２のタンパク質切断部位が存在すると理解することができる。切断部位の命名は、切断反応が起こり得る順序に必ず対応することを意図せず、所与の機構において動態学的に異なることが認められる場合でさえも切断反応が１つの切断反応部位で単一および比較的協調的な事象であると認められ得ると認識される。この記載はまた、組成物および方法の実施形態を提供し、当該分野で認められるように、介在セグメントは１つ以上の切断部位を含む。また、プロセシング機構の理解に応じて、１つの切断部位または２つの切断部位を含むセグメントは、それぞれ、介在セグメントを部分的または完全に切り出すことが可能である。
１つの実施形態では、介在核酸配列は第２のタンパク質切断部位をさらにコードする。
発現ベクターの１つの実施形態では、第１のタンパク質切断部位は、パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）またはパイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）ＯＴ３のｌｏｎプロテアーゼ遺伝子のインテインセグメントまたはパイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）またはメタノコッカス・ヤナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）のｋｌｂＡ遺伝子のインテインセグメントまたはこれらにそれぞれ由来する改変インテインセグメントによって提供される。
１つの実施形態では、インテインセグメントまたは改変インテインセグメントは、リジン、セリンであるか、ヒスチジンではない最後から２番目の残基をコードする。１つの実施形態では、インテインセグメントまたは改変インテインセグメントは、切断可能であるが、第１のポリペプチドの第２のポリペプチドへのライゲーションを完了できない。
１つの実施形態では、第１のタンパク質切断部位は、配列番号１、３、４、６、７、５５、３５、３７および３９からなる群から選択される配列を含むインテインセグメントならびにこれらに由来する改変インテインセグメントによって提供される。
１つの実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、多量体アセンブリが可能である。１つの実施形態では、前記第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのうちの少なくとも１つが細胞外分泌可能である。１つの実施形態では、前記第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのうちの少なくとも１つが哺乳動物起源である。１つの実施形態では、第１のポリペプチドは免疫グロブリン重鎖またはこの重鎖の機能的フラグメントを含み、前記第２のポリペプチドは免疫グロブリン軽鎖またはこの軽鎖の機能的フラグメントを含み、前記第１のポリペプチドは、前記第２のポリペプチドの上流（５’側）にある。
発現ベクターの１つの実施形態では、ベクターは、たった１つのシグナルペプチド核酸配列を含む。
１つの実施形態では、発現ベクターは、第３のポリペプチドをコードする第３の核酸配列および第２のタンパク質切断部位をコードする第２の介在核酸配列をさらに含み、該第２の介在核酸配列および第３の核酸配列はこの順序で、前記第２の核酸配列の後に作動可能に配置される。
発現ベクターの１つの実施形態では、腫瘍壊死因子−α、エリスロポエチン受容体、ＲＳＶ、ＥＬ／セレクチン、インターロイキン−１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１７、インターロイキン−１８、インターロイキン−２３、インターロイキン−３３、ＣＤ８１、ＣＤ１９、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＥＧＦＲ、ＣＸＣＬ−１３、ＧＬＰ−１Ｒ、プロスタグランジンＥ２およびアミロイドβからなる群から選択される抗原への結合を指示する抗原特異性を有する第１および前記第２のポリペプチドは、機能的抗体または他の抗原認識分子を含む。
発現ベクターについての本発明の１つの実施形態では、第１および第２のポリペプチドは、Ｄ２Ｅ７、ＥＬ２４６、ＡＢＴ−００７、ＡＢＴ−３２５またはＡＢＴ−８７４の抗体由来の免疫グロブリン鎖対を含む。１つの実施形態では、第１および第２のポリペプチドは、Ｄ２Ｅ７、ＥＬ２４６、ＡＢＴ−００７、ＡＢＴ−３２５、ＡＢＴ−８７４または他の抗体の類似のセグメント由来の免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖のセグメントからそれぞれ独立して選択される。
１つの実施形態では、発現ベクターは、前記インサートのためのプロモーター調節エレメントをさらに含む。１つの実施形態では、プロモーター調節エレメントは誘導性または構成性である。１つの実施形態では、プロモーター調節エレメントは組織特異的である。１つの実施形態では、プロモーターはアデノウイルス主要後期プロモーターを含む。
１つの実施形態では、本発明は、本明細書中に記載のベクターを含む宿主細胞を提供する。１つの実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。１つの実施形態では、宿主細胞はエシュリキア・コライ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。１つの実施形態では、宿主細胞は真核細胞である。１つの実施形態では、真核細胞は、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞および真菌細胞からなる群から選択される。１つの実施形態では、真核細胞は、哺乳動物細胞、トリ細胞および昆虫細胞からなる群から選択される動物細胞である。１つの実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞株である。１つの実施形態では、宿主細胞はＣＨＯ細胞またはジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損ＣＨＯ細胞である。１つの実施形態では、宿主細胞はＨＥＫ（ヒト胎児腎臓）細胞またはアフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ細胞）である。１つの実施形態では、宿主細胞は酵母細胞である。１つの実施形態では、酵母細胞はサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。１つの実施形態では、宿主細胞はスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９昆虫細胞である。
１つの実施形態では、本発明は、宿主細胞をベクタータンパク質を発現させるのに十分な条件下にて培養培地中で培養することを含む、組換えポリタンパク質または複数のタンパク質を産生する方法を提供する。１つの実施形態では、本方法は、さらに、ベクタータンパク質を回収および／または精製することを含む。産生方法の１つの実施形態では、複数のタンパク質は多量体アセンブリが可能である。１つの実施形態では、組換えポリタンパク質または複数のタンパク質は、生物学的に機能的および／または治療的である。
１つの実施形態では、本発明は、組換え産物の産生方法であって、産物が免疫グロブリンタンパク質またはこのタンパク質の機能的フラグメント、アセンブリされた抗体または他の抗原認識分子であり、宿主細胞を組換え産物を産出するのに十分な条件下にて培養培地中で培養することを含む、方法を提供する。１つの実施形態では、本発明は、本明細書中に記載の方法に従って産生されたタンパク質またはポリタンパク質を提供する。実施形態では、本発明は、本明細書中の方法に従って産生されたアセンブリされた免疫グロブリン、アセンブリされた他の抗原認識分子または各免疫グロブリン鎖もしくはこれらの機能的フラグメントを提供する。１つの実施形態では、免疫グロブリン、他の抗原認識分子または各免疫グロブリン鎖もしくはこれらの機能的フラグメントに関して、腫瘍壊死因子−α、エリスロポエチン受容体、ＲＳＶ、ＥＬ／セレクチン、インターロイキン−１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン１７、インターロイキン−１８、インターロイキン−２３、インターロイキン−３３、ＣＤ８１、ＣＤ１９、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＥＧＦＲ、ＣＸＣＬ−１３、ＧＬＰ−１Ｒ、プロスタグランジンＥ２またはアミロイドβへの特異的抗原（抗原は、リガンドまたはカウンターレセプターなどであり得る。）結合をもたらすか寄与する能力が存在する。１つの実施形態では、免疫グロブリンまたはグロブリンの機能的フラグメントは免疫グロブリンＤ２Ｅ７またはＡＢＴ−８７４であるか、機能的フラグメントは各フラグメントである。
１つの実施形態では、本発明は、治療有効量のタンパク質および医薬的に許容可能なキャリアを含む医薬的組成物を提供する。
１つの実施形態では、本発明は、タグをコードする核酸配列をさらに含む本明細書中に記載の発現ベクターを提供する。ベクター構築物の１つの実施形態では、介在核酸配列はタグをさらにコードする。
１つの実施形態では、第１および前記第２のポリペプチドは、腫瘍壊死因子−α、エリスロポエチン受容体、ＲＳＶ、ＥＬ／セレクチン、インターロイキン−１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１７、インターロイキン−１８、インターロイキン−２３、インターロイキン−３３、ＣＤ８１、ＣＤ１９、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＥＧＦＲ、ＣＸＣＬ−１３、ＧＬＰ−１Ｒ、プロスタグランジンＥ２およびアミロイドβからなる群から選択される抗原への結合を指示する抗原特異性を有する機能的抗体または他の抗原認識分子を含む。１つの実施形態では、第１および第２のポリペプチドは、Ｄ２Ｅ７、ＥＬ２４６、ＡＢＴ−００７、ＡＢＴ−３２５またはＡＢＴ−８７４の抗体由来の免疫グロブリン鎖対を含む。１つの実施形態では、第１および第２のポリペプチドは、Ｄ２Ｅ７、ＥＬ２４６、ＡＢＴ−００７、ＡＢＴ−３２５、ＡＢＴ−８７４または他の抗体の類似のセグメント由来の免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖のセグメントからそれぞれ独立して選択される。
１つの実施形態では、ベクターは、前記ｓＯＲＦインサートのプロモーター調節エレメントをさらに含む。１つの実施形態では、前記プロモーター調節エレメントは誘導性または構成性である。１つの実施形態では、前記プロモーター調節エレメントは組織特異的である。１つの実施形態では、前記プロモーターはアデノウイルス主要後期プロモーターを含む。
１つの実施形態では、ベクターは、前記第１のタンパク質切断部位を切断可能なプロテアーゼをコードする核酸をさらに含む。１つの実施形態では、プロテアーゼをコードする前記核酸は、前記ｓＯＲＦインサート内に作動可能に配置され、前記発現ベクターは、プロテアーゼをコードする前記核酸と前記第１の核酸および前記第２の核酸の少なくとも１つとの間に存在する第２の切断部位をコードするさらなる核酸をさらに含む。
１つの実施形態では、本発明は、本明細書中に記載のベクターを含む宿主細胞を提供する。１つの実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。１つの実施形態では、前記宿主細胞はエシュリキア・コライ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。１つの実施形態では、前記宿主細胞は真核細胞である。１つの実施形態では、前記真核細胞は、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞および真菌細胞からなる群から選択される。１つの実施形態では、前記真核細胞は、哺乳動物細胞、トリ細胞および昆虫細胞からなる群から選択される動物細胞である。好ましい実施形態では、前記宿主細胞はＣＨＯ細胞またはジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損ＣＨＯ細胞である。１つの実施形態では、前記宿主細胞はＣＯＳ細胞である。１つの実施形態では、前記宿主細胞は酵母細胞である。１つの実施形態では、前記酵母細胞はサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。１つの実施形態では、前記宿主細胞は、昆虫スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９細胞である。１つの実施形態では、前記宿主細胞はヒト胎児腎臓細胞である。
１つの実施形態では、本発明は、宿主細胞をベクタータンパク質を発現させるのに十分な条件下にて培養培地中で培養することを含む、組換えポリタンパク質または複数のタンパク質の産生方法を提供する。１つの実施形態では、本方法は、さらに、前記ベクタータンパク質を回収および／または精製することを含む。１つの実施形態では、前記複数のタンパク質は、多量体アセンブリが可能である。１つの実施形態では、組換えポリタンパク質または複数のタンパク質は、生物学的に機能的および／または治療的である。
１つの実施形態では、本発明は、請求項３８に記載の宿主細胞を免疫グロブリンタンパク質またはこのタンパク質の機能的フラグメント、アセンブリされた抗体または他の抗原認識分子を産生するのに十分な条件下にて培養培地中で培養することを含む、免疫グロブリンタンパク質またはこのタンパク質の機能的フラグメント、アセンブリされた抗体または他の抗原認識分子の産生方法を提供する。
１つの実施形態では、本発明は、本明細書中の方法に従って産生されたタンパク質またはポリタンパク質を提供する。１つの実施形態では、本発明は、本明細書中の方法に従って産生されたアセンブリされた免疫グロブリン、アセンブリされた他の抗原認識分子または各免疫グロブリン鎖もしくはこれらの機能的フラグメントを提供する。１つの実施形態では、免疫グロブリン、他の抗原認識分子または各免疫グロブリン鎖もしくはこれらの機能的フラグメントは、腫瘍壊死因子−α、エリスロポエチン受容体、インターロイキン−１８、ＥＬ／セレクチンまたはインターロイキン−１２への特異的抗原結合をもたらすか寄与する能力を有する。１つの実施形態では、免疫グロブリンはＤ２Ｅ７であるか、機能的フラグメントはＤ２Ｅ７のフラグメントである。
１つの実施形態では、本発明は、発現ベクター、ベクターを有する宿主細胞、ベクター発現産物、医薬的組成物、および／または上記のいずれかの作製方法または使用方法を提供し、ベクターは、請求項１から９のいずれかのベクターであり、軽鎖シグナルペプチドをコードするセグメントをさらに含む。１つの実施形態では、コードされた軽鎖シグナルペプチドは、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２６およびＨ２Ｇからなる群から選択されるκ軽鎖シグナルペプチドである。１つの実施形態では、コードされた軽鎖シグナルペプチドは、ＶＫＩＩκ軽鎖シグナルペプチドＡ１８（配列番号８２（アミノ酸配列ＭＲＬＰＡＱＬＬＧＬＬＭＬＷＩＰＧＳＳＡ））である。
１つの実施形態では、本発明の組成物は、単離または精製されている。
１つの実施形態では、本発明の組成物はペプチド化合物である。１つの実施形態では、本発明の組成物は核酸化合物である。１つの実施形態では、本発明のペプチド化合物を、ペプチドまたは少なくとも１つの他のペプチドを使用して多量体の複合体（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ｃｏｍｐｌｅｘ）にアセンブリする。
１つの実施形態では、本発明は、本発明の組成物を含む医薬的処方物を提供する。１つの実施形態では、本発明は、本発明の組成物または組成物の医薬的処方物の合成方法を提供する。１つの実施形態では、医薬的処方物は、１つ以上の当該分野で理解されている賦形剤、キャリアおよび／または他の成分を含む。１つの実施形態では、本発明の組成物の有効量は、治療有効量であり得る。
１つの実施形態では、本発明のペプチド組成物を、組換え法または合成技術を使用して調製する。１つの実施形態では、本発明の核酸組成物を、組換え法または合成技術を使用して調製する。
実施形態では、本発明は、医薬の製造における使用方法を提供する。
本発明の実施形態の他の態様、特徴、および利点は、添付の図面および当該分野の文脈と併せて考慮した場合、以下の説明から明らかである。
一般に、本明細書中で使用した用語および句は、この分野で認識されている意味を有し、当業者に公知の標準的なテキスト、学術雑誌および文脈の参照によって見出すことができる。本明細書中に提供した定義は、本発明の実施形態の文脈での特定の用途を明確にすることを意図する。
いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、本発明に関連する基本的な原理または機構の信頼性または理解に関して本明細書中で考察することができる。いかなる説明または仮説の究極的な正確さと無関係に、本発明の実施形態が有効および有用であり得ると認識される。
図１は、ｓＯＲＦ発現構築物（ｐＴＴ３ ｐａｂ ｌｏｎ ＨＬ（−））の略図を示す。 図２は、Ｄ２Ｅ７抗体の発現構築物中のｓＯＲＦ成分の構造を示す。 図３は、ｓＯＲＦ発現産物のタンパク質分析のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。分泌型ＩｇＧ分子を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィによって精製し、非還元条件下（Ａ）および還元条件下（Ｂ）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。レーンおよびサンプルは以下である（左から右）：（レーン１）ＭＷ標準マーカー；（２）コントロール構築物産物；（３）Ｐａｂ−ｌｏｎ ｍｕｔ Ａ１；（４）Ｐａｂ−ｌｏｎ ｍｕｔ Ａ２；（５）ｐＴＴ３ ｐｆｕ ｌｏｎ ＹＰ，および（６）ｐＴＴ３ ｐｆｕ ｌｏｎ ＭＡ。 図４は、さらなるｓＯＲＦ発現産物のタンパク質分析のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。分泌型ＩｇＧを、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィによって精製し、非還元条件下（Ａ）および還元条件下（Ｂ）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。レーンおよびサンプルは以下である（左から右）：（レーン１）ＭＷマーカー；（２）コントロール；（３）ｐＴＴ３ ｐｆｕ ｌｏｎ ＨＬ（−）；および（４）ｐＴＴ３ ｐｆｕ ｌｏｎ ＭｕｔＡ。 図５は、ｋｌｂＡインテインを使用してｓＯＲＦ構造から産生した分泌型抗体の分析を示す。Ｐａｂ−ｋｌｂＡ ＨＬ（−）構築物およびＭｊａ−ｋｌｂＡ ＨＬ（−）構築物から分泌されたＩｇＧ産物を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィによって精製し、還元条件下（パネルＡ、ＢおよびＣ）および非還元条件下（パネルＤ）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。パネルＡおよびＤは染色したゲルの画像を示し、パネルＢはヒトＩｇＧ１ Ｆｃに対する抗体を使用した免疫ブロットであり、パネルＣはヒトκ軽鎖に対する抗体を使用した免疫ブロットである。レーンおよびサンプルは以下である（左から右）：（レーン１）コントロール；（２）Ｐａｂ−ｋｌｂＡ ＨＬ（−）；および（３）Ｍｊａ−ｋｌｂＡ ＨＬ（−）。コントロールは、２つの個別のオープンリーディングフレームの発現から産生された同一の抗体である。 図６は、Ｎ末端スプライシングジャンクションのアミノ酸残基を改変したＰａｂ ｋｌｂＡインテインを使用したシングルオープンリーディングフレーム構築物の発現の結果を示す。分泌型ＩｇＧタンパク質を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィによって精製し、非還元条件下および還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。レーンおよびサンプルは以下である（左から右）：（レーン１）ＭＷマーカー；（２）従来のベクターを使用して産生された同一の抗体（コントロール）；（３）ｐＴＴ３ Ｐａｂ ｋｌｂａ ＨＬ（−）ｗｔ；（４）ｐＴＴ３ Ｐａｂ ｋｌｂａ ＨＬ（−）ＧＣ；および（５）ｐＴＴ３ Ｐａｂ ｋｌｂａ ＨＬ（−）ＫＣ。 図７は、ＣＨＯ細胞株系における安定な発現ベクターとしての使用に適応したｓＯＲＦ発現構築物であるｐＡ１９０−Ｐａｂ−ｌｏｎ ＨＬ（−）の略図を示す。 図８は、ｓＯＲＦ構築物トランスフェクションクローン（ｓＯＲＦ Ｐａｂ ｌｏｎ構築物）の安定な発現系のための培養物密集度に到達するまでの時間および頻度の結果を示す。 図９は、軽鎖ジャンクション変異を有する一過性発現構築物のｓＯＲＦ成分の構造の略図を示す。一連の構築物を、「Ｍ１−Ｘ」（第１のレーン）および「Ｄ２−Ｘ」（第２のレーン）（Ｘは任意のアミノ酸を示す。）と命名している。 図１０は、Ｍｅｔ１残基の異形に基づいた軽鎖ジャンクション変異を有する一連のｓＯＲＦ構築物についてのＩｇＧ分泌の結果を示す。 図１１は、Ａｓｐ２残基の異形に基づいた軽鎖ジャンクション変異を有する一連のｓＯＲＦ構築物についてのＩｇＧ分泌の結果を示す。 図１２は、軽鎖ジャンクション変異を有する構築物のＭｅｔ１およびＡｓｐ２シリーズのそれぞれの例由来のタンパク質産物についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。 図１３は、ＡＢＴ−８７４抗体を発現することができる一過性発現構築物のｓＯＲＦ成分の構造の略図を示す。 図１４は、タグを含むインサートの導入のための溶媒露出ループの好ましい位置（破線の矢印はＤＯＤエンドヌクレアーゼドメインの末端に向かうセグメントＨおよびＦの近隣のジャンクションを指す。）に照らしたインテインの一定の構造モチーフを示す。 図１５は、ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクション系で用いる軽鎖シグナルペプチドＡ１８を有する発現構築物のプラスミドマップを示す。 図１６は、抗体発現構築物の産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。 図１７は、トランスフェクションされた細胞株（一過性にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞および安定してトランスフェクションされたＣＨＯ細胞が含まれる。）由来の抗体発現構築物産物のウェスタンブロット分析の結果を示す。 図１８は、ＣＨＯ細胞の安定したトランスフェクション系で用いる軽鎖シグナルペプチドＡ１８を有する発現構築物のプラスミドマップを示す。
本発明を、以下の非限定的な例によってさらに理解することができる。
一定の情報は、当該分野の開示（２００７年３月２２日のＣａｒｓｏｎらのＵＳ２００７００６５９１２による開示が含まれる。）によって認識される。
本発明は、化合物構造または生物活性タンパク質（酵素、ホルモン（例えば、インスリン）、サイトカイン、ケモカイン、受容体、抗体、または他の分子など）の発現のための系（例えば、構築物および方法）を提供する。好ましくは、タンパク質は、免疫調節タンパク質（インターロイキン、全長免疫グロブリン、これらのフラグメント、当該分野で理解されている他の抗原認識分子または他の生物治療分子など）である。かかる系の概観は免疫グロブリン分子と特に関連し、この免疫グロブリン分子は組換え産生が単一のプロモーターの転写調節下での重鎖および軽鎖のコード配列の発現に基づいており、単一の翻訳産物（ポリタンパク質）の個別の重鎖および軽鎖への変換がインテイン成分によって媒介される。
１つの実施形態では、免疫グロブリンポリタンパク質分子の第１および第２の鎖のいずれかは重鎖または軽鎖であり得る。組換え免疫グロブリンセグメントをコードする配列は、全長コード配列またはフラグメントであり得る。特定の実施形態では、第２の軽鎖コード配列は、本発明の実施でプロセシングされるべきポリタンパク質をコードする配列の一部でなければならない。即ち、まとめると、２つの軽鎖および１つの重鎖を任意の順序で含む３つのセグメントが存在する。特定の実施形態では、構築物は、これらの成分をこの順序で使用して形成される：ａ）ＩｇＨ−ＩｇＬ；ｂ）ＩｇＬ−ＩｇＨ；ｃ）ＩｇＨ−ＩｇＬ−ＩｇＬ；ｄ）ＩｇＬ−ＩｇＨ−ＩｇＬ；ｅ）ＩｇＬ−ＩｇＬ−ＩｇＨ；ｆ）ＩｇＨ−ＩｇＨ−ＩｇＬ；ｇ）ＩｇＨ−ＩｇＬ−ＩｇＨおよび／またはｈ）ＩｇＬ−ＩｇＨ−ＩｇＨ。１つの実施形態では、ハイフンは、切断部位配列が存在する位置を示すことができる。
または、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のコード配列を、これらのコード配列間のインテインコード配列にインフレームで融合する。ここで、インテインは、スプライシング活性を天然に欠き得るか、欠くように改変することができ、または、スプライシングが好んで起こらないか、非スプライシング抗体分子が優性であるような低効率でスプライシングが起こるように重鎖および軽鎖の末端がデザインされている。さらに、改変インテインを、エンドヌクレアーゼ領域が存在しないように（エンドヌクレアーゼ領域が事前に存在していた場合）さらに改変することができるが、但し、軽鎖および重鎖の抗体ポリペプチドが一次翻訳産物の介在インテイン部分を含まないように部位特異的タンパク質切断活性が残存することを条件とする。軽鎖または重鎖の抗体ポリペプチドのいずれかは、Ｎ−エクステインであり得、いずれかはＣ−エクステインであり得る。
ベクターは、全長ポリタンパク質を発現することができる任意の組換えベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、複製コンピテントアデノウイルスベクター、複製欠損アデノウイルスベクターおよびガトレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターまたは非ウイルスベクター（プラスミド）または当業者に公知の任意の他のベクター）であり得、免疫グロブリンまたは他のタンパク質が発現される宿主細胞に適切なベクターを選択する。バキュロウイルスベクターは、昆虫細胞中での遺伝子発現に利用可能である。多数のベクターが当業者に公知であり、多数が市販されているか、そうでなければ、当業者が容易に利用できる。
プロモーターを含む調節配列；宿主細胞
組換え免疫グロブリンまたは他のタンパク質の発現のためのベクターは、当業者に公知の多数のプロモーターのうちのいずれかを含むことができる。このプロモーターは、構成性、調節性または誘導性、細胞型特異的、組織特異的または種特異的である。さらなる具体例には、例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ Ｍ，Ｂｕｊａｒｄ Ｈ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９２，１５；８９（１２）：５５４７−５１）が含まれる。ベクターは、キメラ遺伝子が発現される宿主細胞に適合したレプリコンであり、望ましくは、細菌細胞（有利には、エシュリキア・コライ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、（分子生物学的操作に都合のよい細胞））中でも同様に機能的なレプリコンも含む。
遺伝子発現用の宿主細胞は、制限されないが、動物細胞、特に哺乳動物細胞であり得るか、微生物細胞（細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞であるが、好ましくは真核細胞）または植物細胞であり得る。特に適切な宿主細胞には、昆虫培養細胞（スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞など）、酵母細胞（サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）など）、真菌細胞（トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、オーレオバシジウム種（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｕｍ）およびペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）など）ならびに哺乳動物細胞（ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞（マウス）、ベロ細胞（アフリカミドリザル）など）が含まれ、種々のトランスジェニック動物系（ブタ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシが含まれるが、これらに限定されない。）も同様に使用することができる。ニワトリ系は卵白中での発現で公知であり、トランスジェニックヒツジ、ヤギおよびウシ系は、とりわけ、乳中での発現で公知である。バキュロウイルス（特にＡｃＮＰＶ）ベクターを、例えば、昆虫細胞株におけるポリヘドリンプロモーターまたは他の強力プロモーターの調節下でのｓＯＲＦの発現を使用した本発明のシングルＯＲＦ抗体の発現および切断のために使用することができ、かかるベクターおよび細胞株は当業者に周知であり、市販されている。哺乳動物細胞中で使用されるプロモーターは、構成性（ヘルペスウイルスＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ ３１：３５５，１９８２；ＳＶ４０初期プロモーター、Ｂｅｎｏｉｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４，１９８１）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６７７７，１９８２）、サイトメガロウイルスプロモーター（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ４５：１０１，１９８０）、マウス乳癌ウイルスプロモーター（一般に、Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｌｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，ｐｐ．１６２−１８１，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９６を参照のこと））または調節性（メタロチオネインプロモーター、例えば、Ｈａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：２７３，１９８２）であり得る。ベクターは、特定の哺乳動物細胞に感染するウイルス（特に、レトロウイルス、ワクシニアウイルスおよびアデノウイルス）に基づき得る。これらの誘導体は当業者に公知であり、市販されている。プロモーターには、サイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス後期プロモーターおよびワクシニア７．５Ｋプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。酵母および真菌ベクター（例えば、Ｖａｎ ｄｅｎ Ｈａｎｄｅｌ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｉｎ：Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．ａｎｄ Ｌａｓｕｒｅ，Ｌ．Ｌ．（ｅｄｓ．），Ｍｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ，Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，３９７−４２８を参照のこと）およびプロモーターも周知であり、広く利用可能である。エノラーゼは周知の構成性酵母プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼは周知の調節性プロモーターである。
特定のプロモーター、転写終結配列および他の任意選択的な配列（組織特異的配列をコードする配列など）は、主に、発現が望まれる細胞型によって選択される。この細胞は、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、ニワトリ細胞または他の動物細胞であり得る。
シグナル配列
切断、タンパク質分解的プロセシング、または自己プロセシングされるべきであり、ベクター中に組み込まれるタンパク質のコード配列は、１つ以上のシグナル配列をコードする１つ以上の配列をさらに含むことができる。これらのコードされたシグナル配列を、ポリタンパク質内の１つ以上の成熟セグメントに会合することができる。例えば、免疫グロブリン重鎖リーダー配列をコードする配列は、ポリタンパク質コード配列の残部とインフレームで作動可能に連結された重鎖のコード配列に先行することができる。同様に、軽鎖リーダーペプチドコード配列または他のリーダーペプチドコード配列を免疫グロブリン軽鎖コード配列の一方または両方にインフレームで会合することができ、リーダー配列鎖はいずれかの自己プロセシング部位（２Ａなど）由来の隣接鎖またはプロテアーゼ認識配列をコードする配列によって分離され、適切なリーディングフレームが維持されている。
免疫グロブリン重鎖および軽鎖の化学量論
本明細書中の多数の実施形態では、免疫グロブリン／抗体の軽鎖（ＩｇＬ）および重鎖（ＩｇＨ）は、約１：１（ＩｇＬ：ＩｇＨ）の比にて宿主細胞内にベクターレベルまたは発現細胞内レベルで存在する。本明細書中または他に記載の組換えアプローチは重鎖および軽鎖の等モル発現を信頼しているが（例えば、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ２００５／０００３４８２Ａ１またはＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ２００４／１１３４９３を参照のこと）、他の実施形態では、本発明は、軽鎖および重鎖のコード配列を２：１の比で有し、一次翻訳産物がポリタンパク質である場合に鎖の自己プロセシングまたはタンパク質分解プロセシングと同時発現する方法、発現カセットおよびベクターを提供する。実施形態では、比は１：１超（約２：１または２：１超など）である。特定の実施形態では、軽鎖コード配列を、１：１（ＩｇＬ：ＩｇＨ）を超える比で使用する。特定の実施形態では、ＩｇＬ：ＩｇＨの比は２：１である。従って、実施形態では、ｓＯＲＦ抗体発現テクノロジーによって得られる利点には、重鎖および軽鎖についての遺伝子量の比、ＥＲにおける多サブユニットアセンブリのための重鎖および軽鎖のポリペプチドの近接ならびに高効率でタンパク質が分泌される可能性を操作することができる能力が含まれる。
本発明は、さらに、免疫グロブリン（即ち、抗体）の重鎖および軽鎖の１つまたは少なくとも２つのいずれかをコードする配列、切断部位（自己プロセシング切断部位など）、プロテアーゼ認識部位または部位間のシグナルペプチドをコードする配列を含み、さらなるタンパク質分解性切断部位をコードする配列をさらに含むことができるベクターを使用して形質転換されるか感染された宿主細胞または宿主細胞の安定なクローンを提供する。全長組換え免疫グロブリンもしくはグロブリンのフラグメントまたは複数のサブユニット（例えば、二鎖分子もしくは多鎖分子または事実上プロタンパク質として産生され、切断またはプロセシングされて前駆体由来タンパク質および活性部分を放出する鎖）から構成される他の生物学的に活性なタンパク質の生成におけるかかる細胞またはクローンの使用も本発明の範囲内に含まれる。非限定的な例には、インスリン、インターロイキン−１８、インターロイキン−１、骨形態形成タンパク質４、骨形態形成タンパク質２、任意の他の二鎖の骨形態形成タンパク質、神経成長因子、レニン、キモトリプシン、トランスフォーミング成長因子β、およびインターロイキン１βが含まれる。
関連する態様では、本発明は、かかる細胞またはクローンによって産生された組換え免疫グロブリン分子もしくはこの分子のフラグメントまたは他のタンパク質（免疫グロブリンは、自己プロセシング切断部位（インテインまたはヘッジホッグドメインなど）、切断部位またはシグナルペプチド切断部位由来のアミノ酸を含む。）ならびにこれらの産生のための方法、ベクターおよび宿主細胞を提供する。実施形態では、本発明は、１つ以上の本明細書中に記載の構築物を含む宿主細胞を提供する。
本発明は、免疫グロブリン分子または分子のフラグメントの発現のための単一のベクター構築物およびインビトロまたはインビボでの使用方法を提供する。ベクターは、第１の免疫グロブリンコード配列と第２の免疫グロブリンコード配列との間および第２免疫グロブリンコード配列と第３の免疫グロブリンコード配列との間に自己プロセシング配列または他のプロテアーゼ認識配列を有し、これにより、単一のプロモーターおよび転写物を使用して機能的抗体分子を発現することが可能である。例示的なベクター構築物は、オープンリーディングフレームの間に自己プロセシング切断部位をコードする配列を含み、自己プロセシング切断部位に隣接するアミノ酸（切断後に自己プロセシング切断部位を含む。）除去のためのさらなるタンパク質分解性切断部位をさらに含むことができる。ベクター構築物は、インビトロおよびインビボでの生物学的に活性な全長免疫グロブリンまたはこのグロブリンのフラグメントの産生の増強に関連する方法で有用である。いずれか一方の鎖のコード配列が他方の鎖のコード配列と比較して１を超える比で存在する必要があるわけではないと理解されるが、少なくとも２つの異なる鎖を有する他の生物学的に活性なタンパク質を同一のストラテジーを使用して作製することができる。
特定の組成物および方法を本明細書中で例示しているが、多数の別の組成物および方法のうちのいずれかを適用可能であり、本発明の実施での使用に適切であると理解される。本発明のポリタンパク質発現カセットおよびベクター、宿主細胞ならびに方法を当該分野で標準的な手順を使用して評価することができることも理解される。本発明の実施には、他で示さない限り、細胞生物学、分子生物学（組換え技術が含まれる。）、微生物学、生化学および免疫学の従来技術を使用する。これらの従来技術は、当業者の範囲内である。かかる技術は、文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ＆ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９３）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）（それぞれ、本明細書中で参照により明確に援用される。）など）で完全に説明されている。
他で示さない限り、本明細書中で使用した全ての用語は、当業者に理解されている意味を有し、本発明の実施には従来の微生物学技術および組換えＤＮＡテクノロジーを使用することができる。これらの技術は、当業者の知識の範囲内である。
用語「改変された」は、本明細書中においてタンパク質の文脈で一般に使用される場合、少なくとも１つのアミノ酸残基が基準分子中で置換されているか、基準分子から欠失されているか、基準分子に付加されているセグメントをいう。同様に、核酸の文脈では、本用語は、少なくとも１つの核酸サブユニットが基準分子中で置換されているか、基準分子から欠失されているか、基準分子に付加されているセグメントをいう。
用語「インテイン」は、本明細書中で使用する場合、典型的には、自身の除去を容易にし、エクステインとして公知の隣接セグメントを連結させるタンパク質の内部セグメントをいう。インテインの多数の例が種々の生物型で認められており、ある場合には、構造的および／または機能的特徴を共有している。本発明は、存在が評価され、さらに認識または発見されるインテインおよびインテインの変種を広く使用することができる。例えば、Ｇｏｇａｒｔｅｎ ＪＰ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２；５６：２６３−８７；Ｐｅｒｌｅｒ，Ｆ．Ｂ．（２００２），ＩｎＢａｓｅ，ｔｈｅ Ｉｎｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０，３８３−３８４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡのインターネットウェブサイト；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂ／ｉｎｔｅｉｎｓ．ｈｔｍｌ；Ａｍｉｔａｉ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３，４７（１）：６１−７３；Ｇｏｒｂａｌｅｎｙａ ＡＥ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９８；２６（７）：１７４１−１７４８．Ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｉｎｔｅｉｎｓも参照のこと）を参照のこと。タンパク質において、インテイン含有単位またはインテインスプライシング単位を、構造的特徴が切断、ライゲーションなどの反応に寄与し得る隣接エクステイン部分を含むと理解することができる。本用語はまた、「改変インテイン」成分を有するインテインベースの系を言及するカテゴリーとして理解することができる。
用語「改変インテイン」は、本明細書中で使用する場合、切断または切り出されたエクステインがインテインによって完全にライゲーションされないように少なくとも１つのアミノ酸残基がインテインスプライシング単位中で置換されるか、インテインスプライシング単位から欠失するか、インテインスプライシング単位に付加される合成インテインまたは天然インテインをいうことができる。
用語「ベクター」は、本明細書中で使用する場合、１つ以上の異種または組換えＤＮＡ配列を含み、異なる宿主細胞間の移送のためにデザインされたＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子（プラスミド、ウイルスまたは他のビヒクルなど）をいう。用語「発現ベクター」および「遺伝子療法ベクター」は、細胞中に異種ＤＮＡフラグメントを組み込んで発現するのに有効な任意のベクターをいう。クローニングベクターまたは発現ベクターは、さらなるエレメントを含むことができる。例えば、発現ベクターは２つの複製系を有することができ、これ故に、２つの生物中（例えば、発現用のヒト細胞中ならびにクローニングおよび増幅用の原核生物宿主中）で維持することが可能である。タンパク質またはポリペプチドが発現されるような核酸の細胞への導入に有効な任意の適切なベクターを使用することができる（例えば、ウイルスベクターまたは非ウイルスプラスミドベクター）。発現に有効な任意の細胞（例えば、昆虫細胞および真核細胞（酵母細胞または哺乳動物細胞など））が本発明の実施で有用である。
用語「異種ＤＮＡ」および「異種ＲＮＡ」は、ヌクレオチドが存在する細胞またはゲノムの一部またはベクターに対して内因性（未変性）ではないヌクレオチドをいう。一般に、異種ＤＮＡまたはＲＮＡを、形質導入、感染、トランスフェクション、形質転換、エレクトロポレーション、または遺伝子銃形質転換などによって細胞に付加する。かかるヌクレオチドは、一般に、少なくとも１つのコード配列を含むが、コード配列が発現される必要はない。用語「異種ＤＮＡ」は、「異種コード配列」または「導入遺伝子」をいうことができる。
本明細書中で使用する場合、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」を交換可能に使用することができ、典型的には、本発明の自己プロセシング切断部位含有ベクターを使用して発現される目的の「タンパク質」および「ポリペプチド」をいう。かかる「タンパク質」および「ポリペプチド」は、以下にさらに記載のように、研究、診断、または治療目的に有用な任意のタンパク質またはポリペプチドであり得る。本明細書中で使用する場合、ポリタンパク質は、プロセシングされて２つ以上のポリペプチド産物を産生する運命にあるタンパク質である。
本明細書中で使用する場合、用語「多量体」は、アセンブリされて機能タンパク質を形成する２つ以上のポリペプチド鎖（時折、「サブユニット」という）から構成されるタンパク質をいう。多量体は、２個（二量体）、３個（三量体）、４個（四量体）、またはこれを超える（例えば、五量体など）ペプチド鎖から構成され得る。多量体は、自己アセンブリに起因し得るか、アセンブリを補助するための触媒などの成分を必要とし得る。多量体は、単に同一のペプチド鎖（ホモ多量体）または２つ以上の異なるペプチド鎖（ヘテロ多量体）から構成され得る。かかる多量体は、構造的または化学的に機能的であり得る。多数の多量体が当該分野で公知であり、使用されている（酵素、ホルモン、抗体、サイトカイン、ケモカイン、および受容体が含まれるが、これらに限定されない。）。このようなものとして、多量体は、生物学的（例えば、医薬的）および産業的（例えば、バイオプロセシング／生物産生）有用性の両方を有することができる。
本明細書中で使用する場合、用語「タグ」は、ベクターインサートの１つ以上の発現産物が検出および／または精製されるように機能することができる発現ベクター中に組み込むことができるペプチドをいう。かかるタグは当該分野で周知であり、タグには、放射性標識したアミノ酸またはマークしたアビジン（例えば、光学的方法または比色法によって検出することができる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出することができるビオチニル部分のポリペプチドへの結合が含まれ得る。ＦＬＡＧ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、セルロース結合ドメイン、チオレドキシン、ＮｕｓＡ、ミスチン（ｍｉｓｔｉｎ）、キチン結合ドメイン、クチナーゼ、ＡＧＴ、ＧＦＰなどのアフィニティタグが、タンパク質発現系および精製系などで広範に使用されている。ポリペプチド用のタグのさらなる非限定的な例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：ヒスチジンタグ、放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、または１５３Ｓｍ）；蛍光タグ（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素タグ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；化学発光タグ；ビオチニル基；二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）および磁性因子（ガドリニウムキレートなど）。
本発明のウイルス遺伝子療法ベクターに関して本明細書中で使用する場合、用語「複製欠損の」は、ウイルスベクターが独立してさらに複製できず、このゲノムをパッケージングできないことを意味する。例えば、目的の細胞にｒＡＡＶビリオンを感染させた場合、感染細胞中で異種遺伝子が発現されるが、感染した細胞がＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子およびアクセサリー機能遺伝子を欠くという事実のために、ｒＡＡＶは複製できない。
本明細書中で使用する場合、「レトロウイルス導入ベクター」は、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含み、ベクターのパッケージングに必要なヌクレオチド配列をさらに含む発現ベクターをいう。好ましくは、レトロウイルス導入ベクターはまた、細胞中の導入遺伝子の発現に必要な配列を含む。
本明細書中で使用する場合、「パッケージング系」は、組換えウイルスのパッケージングに関与するウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む一連のウイルス構造をいう。典型的には、パッケージング系の構築物は、パッケージング細胞に最終的に組み込まれる。
本明細書中で使用する場合、「第２世代の」レンチウイルスベクター系は、機能的アクセサリー遺伝子を欠くレンチウイルスパッケージング系（アクセサリー遺伝子（ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆ）が欠失または不活化されている系など）をいう。例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：８７１−８７５を参照のこと。
本明細書中で使用する場合、「第３世代の」レンチウイルスベクター系は、第２世代ベクター系の特徴を有し、機能的ｔａｔ遺伝子をさらに欠くレンチウイルスパッケージング系（ｔａｔ遺伝子が欠失または不活化されている系など）をいう。典型的には、個別の発現構築物上のｒｅｖをコードする遺伝子を提供する。例えば、Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１を参照のこと。
ウイルスまたはウイルスベクターに関して本明細書中で使用する場合、「偽型」は、未変性ウイルスエンベロープタンパク質の異種または機能的に改変されたウイルスエンベロープタンパク質への置換をいう。
組換えＤＮＡ構築物またはベクターに関して本明細書中で使用する場合、用語「作動可能に連結された」は、組換えＤＮＡ構築物またはベクターのヌクレオチド成分が、通常、相互に共有結合することを意味する。一般に、「作動可能に連結された」ＤＮＡ配列は隣接しており、分泌リーダーの場合、隣接し、同一のリーディングフレーム中に存在する。しかし、エンハンサーは、発現が上方制御される配列と隣接する必要はない。本用語は、「作動可能に配置された」と一致する。
エンハンサー配列はプロモーター依存性遺伝子発現に影響を及ぼし、エンハンサー配列は、未変性遺伝子の５’または３’領域中に配置することができる。「エンハンサー」は、近接遺伝子の転写を刺激または阻害するシス作用性エレメントである。転写を阻害するエンハンサーを「サイレンサー」ともいう。エンハンサーは、コード配列および転写された領域の下流の位置から数キロベース対（ｋｂ）までの距離にわたっていずれかの配向で機能することができる（即ち、コード配列と会合することができる。）。さらに、インスレーターまたはクロマチンオープニング配列（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｏｐｅｎｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（マトリックス結合領域など）（Ｃｈｕｎｇ，Ｃｅｌｌ，１９９３，Ａｕｇ １３；７４（３）：５０５−１４，Ｆｒｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００１，１２：３４９−３５４，Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ １０７，２００４，９５−１０５）を使用して、安定に組み込まれた遺伝子カセットの転写を増強することができる。
本明細書中で使用する場合、用語「遺伝子」または「コード配列」は、適切な調節配列と作動可能に連結された場合にインビトロまたはインビボで転写され（ＤＮＡ）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡ）核酸配列を意味する。遺伝子は、コード領域の前および後に領域（例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）または「リーダー」配列および３’ＵＴＲまたは「トレーラー」配列ならびに各コードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を含んでも含まなくてもよい。
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指示し、これにより、ＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列（即ち、転写の指示に十分な最小の配列）である。プロモーターおよび対応するタンパク質またはポリペプチドの発現は、細胞型特異的、組織特異的または種特異的であり得る。エンハンサー配列（プロモーター配列と隣接していてもしてなくてもよい。）も本発明の核酸構築物またはベクターに含まれる。
「転写調節配列」または発現調節配列には、本明細書中で広く使用する場合、しばしば栄養シグナルまたは環境シグナルに応答して関連するコード配列の転写を調整または制御するプロモーター配列および物理的に関連する配列が含まれる。これらの関連する配列は、組織または細胞特異的発現、環境シグナルに対する応答、転写を増加または減少させるタンパク質の結合などを決定することができる。「調節性プロモーター」は、活性がシスまたはトランス作用因子（例えば、外部シグナルまたは外部因子によって活性化される誘導性プロモーター）に影響を受ける任意のプロモーターである。
「構成性プロモーター」は、ほとんどの場合に多数または全ての組織／細胞型でのＲＮＡ産生を指示する任意のプロモーター（例えば、哺乳動物細胞中でのクローン化したＤＮＡインサートの構成性発現を促進するヒトＣＭＶ最初期エンハンサー／プロモーター領域）である。
用語「転写調節タンパク質」、「転写調節因子」および「転写因子」を本明細書中で交換可能に使用し、ＤＮＡ応答エレメントに結合し、これにより、関連する遺伝子の発現を転写的に制御する核タンパク質をいう。転写調節タンパク質は、一般に、ＤＮＡ応答エレメントに直接結合するが、場合によっては、ＤＮＡへの結合は間接的であり得る（別のタンパク質に結合し、別のタンパク質が次いでＤＮＡ応答エレメントに結合するか結合されることによる。）。
本明細書中で使用する場合、用語「免疫グロブリン」および「抗体」は、目的の抗原決定基に結合することができるインタクトな分子およびこの分子のフラグメント（Ｆａ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなど）をいう。かかる「免疫グロブリン」および「抗体」は、分子量がおよそ２３，０００ダルトンの２つの同一のポリペプチド軽鎖および分子量５３，０００から７０，０００の２つの同一の重鎖から構成される。４つの鎖は、ジスルフィド結合によって「Ｙ」立体配置にて連結する。重鎖はγ（ＩｇＧ）、μ（ＩｇＭ）、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）またはε（ＩｇＥ）に分類され、所与の抗体のエフェクター機能を決定する免疫グロブリンのクラス命名の根拠である。軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類される。本明細書中で「免疫グロブリンまたはグロブリンのフラグメント」について言及する場合、かかる「このフラグメント」が免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメント（特に、インタクトな免疫グロブリンの少なくとも１０％の結合親和性でフラグメントの同族リガンドに結合するフラグメント）であると理解される。
抗体のＦａｂフラグメントは、抗体分子の１価の抗原結合フラグメントである。Ｆｖフラグメントは、一般に、２つの鎖として発現される軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作されたフラグメントである。
用語「ヒト化抗体」は、依然として抗体の元の結合活性を保持しながらヒト抗体によりよく類似するように非抗原結合領域中の１つ以上のアミノ酸が置換されている抗体分子をいう。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，６０２，５０３を参照のこと。
用語「抗原決定基」は、本明細書中で使用する場合、特定の抗体と接触する分子のフラグメント（即ち、エピトープ）をいう。タンパク質またはペプチドまたはタンパク質の糖ペプチドまたは糖タンパク質の多数の領域は、タンパク質上の所与の領域または三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を誘導することができる。これらの領域または構造を、抗原決定基またはエピトープという。抗原決定基は、インタクトな抗原（即ち、免疫応答の誘発のために使用される免疫原）と抗体への結合を競合することができる。
用語「フラグメント」は、本発明の組換えタンパク質またはポリペプチドに関して言及する場合、対応する全長タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列の全てではなく一部が同一であり、対応する全長タンパク質またはポリペプチドの機能または活性の少なくとも１つが保持されているアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを意味する。フラグメントは、好ましくは、全長タンパク質またはポリペプチドの少なくとも２０から１００個の連続するアミノ酸残基を含む。
用語「投与」または「導入」は、本明細書中で使用する場合、当業者に公知の任意の経路による必要とするヒトまたは動物へのタンパク質（免疫グロブリンが含まれる。）の送達を意味する。医薬的なキャリアおよび処方物または組成物も当業者に周知である。投与経路には、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、経皮、粘膜、腫瘍内または粘膜が含まれ得る。または、これらの用語は、細胞もしくは培養細胞または被験体の細胞もしくは器官への組換えタンパク質発現のためのベクターの送達をいうことができる。かかる投与または導入は、インビボ、インビトロまたはエクスビボで起こり得る。組換えタンパク質またはポリペプチドの発現用ベクターを、トランスフェクション（典型的には、物理的手段（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、エレクトロポレーション、微量注入またはリポフェクション）による細胞への異種ＤＮＡの挿入を意味する。）、感染（典型的には、感染性因子（即ち、ウイルス）による導入をいう）または形質導入（典型的には、細胞の安定なウイルス感染またはウイルス性因子（例えば、バクテリオファージ）によるある生物から別の生物への遺伝子材料の移入を意味する。）によって細胞に導入することができる。
「形質転換」を、典型的には、異種ＤＮＡを含む細菌または癌遺伝子を発現し、これにより、連続的成長様式に変換された細胞（例えば、腫瘍細胞）をいうために使用する。細胞を「形質転換する」ために使用されるベクターは、プラスミド、ウイルス、または他のビヒクルであり得る。
典型的には、細胞への異種ＤＮＡの投与、導入、または挿入のために使用される手段（即ち、ベクター）に依存して、細胞を「形質導入した」、「感染した」、「トランスフェクションした」または「形質転換した」という。用語「形質導入した」、「トランスフェクションした」および「形質転換した」を、異種ＤＮＡの導入方法と無関係に本明細書中で交換可能に使用することができる。
本明細書中で使用する場合、用語「安定に形質転換した」、「安定にトランスフェクションした」および「トランスジェニック」は、ゲノム中に取り込まれた非天然（異種）核酸配列を有する細胞をいう。安定なトランスフェクションは、このゲノムへの取り込みによるかエピソームエレメントとして安定に複製するトランスフェクションしたＤＮＡを含む娘細胞集団から構成される細胞株またはクローンの樹立によって証明される。場合によっては、「トランスフェクション」は、安定ではない（即ち、一過性である。）。一過性トランスフェクションの場合、外因性または異種のＤＮＡが発現されるが、導入された配列はゲノムに取り込まれないか、宿主細胞は複製できない。
本明細書中で使用する場合、「エクスビボ投与」は、初代細胞を被験体から取り、ベクターを細胞に投与して形質導入されたか、感染されたか、トランスフェクションされた組換え細胞を産生し、組換え細胞を同一または異なる被験体に再投与する過程をいう。
「多シストロン性転写物」は、１つを超えるタンパク質コード領域（即ち、シストロン）を含むｍＲＮＡ分子をいう。２つのコード領域を含むｍＲＮＡを、「二シストロン性転写物」と示す。「５’近位」コード領域またはシストロンは、この翻訳開始コドン（通常、ＡＵＧ）が多シストロン性ｍＲＮＡ分子の５’末端に近いコード領域である。「５’遠位」コード領域またはシストロンは、翻訳開始コドン（通常、ＡＵＧ）がｍＲＮＡの５’末端に最も近い開始コドンではないコード領域またはシストロンである。
用語「５’遠位」および「下流」を、ｍＲＮＡ分子の５’末端に隣接しないコード領域をいうために同義語として使用する。
本明細書中で使用する場合、「同時転写された」は、２つ（２つ以上）のオープンリーディングフレームまたはコード領域またはポリヌクレオチドが、プロモーターを含む単一の転写調節エレメントまたは制御エレメントの転写調節下にあることを意味する。
用語「宿主細胞」は、本明細書中で使用する場合、ベクターを使用して形質導入されたか、感染されたか、トランスフェクションされたか、形質転換された細胞をいう。ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどであり得る。培養条件（温度およびｐＨなど）は、発現のために選択された宿主細胞と共に以前に使用されている培養条件であり、当業者に明らかである。用語「宿主細胞」が、元の形質導入されたか、感染されたか、トランスフェクションされたか、形質転換された細胞およびこの細胞の子孫を指すことが認識される。
本明細書中で使用する場合、用語「生物学的活性」および「生物学的に活性な」は、培養物中の細胞株または無細胞系（ＥＬＩＳＡプレートにおけるリガンド−受容体アッセイなど）中の特定のタンパク質に寄与する活性をいう。「免疫グロブリン」、「抗体」またはこれらのフラグメントの「生物学的活性」は、抗原決定基に結合し、これによって免疫学的機能を促進する能力をいう。ホルモンまたはインターロイキンの「生物学的活性」は、当該分野で公知の通りである。
本明細書中で使用する場合、用語「腫瘍」および「癌」は、正常な成長および／または発達の調節の少なくとも部分的な喪失を示す細胞をいう。例えば、しばしば、腫瘍細胞または癌細胞は、一般に、接触阻止が喪失して浸潤性を示すことがき、および／または転移能力を有する。
抗体は、重鎖および軽鎖のヘテロ二量体である免疫グロブリンタンパク質である。典型的な抗体は、相互に会合した２つの重鎖および２つの軽鎖（またはこれらの機能的フラグメント）を有する多量体である。抗体は、しばしばアイソタイプに依存して、二量体、三量体、四量体、五量体などのさらなる次元の高分子構造を有することができる。抗体は、哺乳動物培養発現系において単一のベクターまたは２つのベクターからの全長形態の発現が非常に困難であることが証明されている。以下の幾つかの方法が抗体産生のために現在使用されている：「ポリクローナル」抗体を産生するための動物のインビボ免疫化、モノクローナル抗体を産生するためのＢ細胞ハイブリドーマインビトロ細胞培養（Ｋｏｈｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．１９８８．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８（本明細書中で参照により援用される。））および組換えＤＮＡテクノロジー（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．のＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６３３１４１５（本明細書中で参照により援用される。）に記載）。
免疫グロブリンポリペプチドの基本分子構造は、分子量がおよそ２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖および分子量５３，０００から７０，０００の２つの同一の重鎖を含み、４つの鎖は、ジスルフィド結合によって「Ｙ」立体配置にて連結することが周知である。アミノ酸配列は、各鎖のＹの上部がＮ末端であり、下部がＣ末端である。Ｎ末端は可変領域（およそ１００アミノ酸長）であり、これが抗原結合の特異性を付与する。
本発明は、全免疫グロブリン型（未変性配列（即ち、抗原による刺激に応答して産生される配列）を有する全長抗体および抗体フラグメント、重鎖および軽鎖の両方の抗原結合可変領域が単一の安定に折り畳まれたポリペプチド鎖に組み合わされる単鎖抗体、１価抗体（第２の重鎖のＦｃ領域に結合した重鎖／軽鎖二量体を含む。）、免疫グロブリン分子の全「Ｙ」領域（即ち、「Ｙ」の分枝部）、軽鎖のみまたは重鎖のみまたはこの一部（即ち、Ｆａｂ’として一般に公知の１つの重鎖と１つの軽鎖との凝集体）を含む「Ｆａｂフラグメント」、２つ以上の異なる抗原に特異性を有する「ハイブリッド免疫グロブリン」（例えば、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，６２３，９４０に記載のクアドローマまたは二重特異性抗体）、重鎖および軽鎖が異なる種または特異性に由来する重鎖および軽鎖を模倣する「複合免疫グロブリン（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）」ならびに重鎖および軽鎖の各アミノ酸配列の一部が１つを超える種に由来する（即ち、可変領域がある起源（マウス抗体など）に由来する一方で、定常領域が別の起源（ヒト抗体など）に由来する。）「キメラ抗体」が含まれるが、これらに限定されない。）の改良された産生方法に関する。
本発明の組成物および方法は、重鎖または軽鎖が「哺乳動物」、「キメラ」であるか、有効性を増強する様式で改変された免疫グロブリンまたはグロブリンのフラグメントの産生で有用である。改変された抗体には、非改変形態と同一の生物学的活性を保持するアミノ酸および核酸配列の変種および活性が変化する（即ち、補体結合、膜との相互作用および他のエフェクター機能を改善する定常領域の変化または抗原結合特性を改善する可変領域の変化）ように改変されたアミノ酸および核酸配列の変種の両方が含まれる。本発明の組成物および方法は、さらに、触媒免疫グロブリンまたはこのフラグメントを含むことができる。
「変種」免疫グロブリンコードポリヌクレオチド配列は、基準ポリペプチド配列由来の１つ以上のアミノ酸が変化した「変種」免疫グロブリンのアミノ酸配列をコードすることができる。以下のこの同一の考察は、目的の他の生物学的に活性なタンパク質配列（およびこのコード配列）に適用可能である。変種ポリヌクレオチド配列は、置換されたアミノ酸が置換するアミノ酸に類似の構造的または化学的な性質を有する「保存的」置換を含む変種アミノ酸配列をコードすることができる。目的のタンパク質の変種を、天然に存在する配列のアミノ酸配列と実質的に同一（少なくとも約８０から９９（これらの間の全ての整数）％同一）であり、機能的に等価な三次元構造を形成し、天然に存在するタンパク質の生物学的活性を保持するアミノ酸配列を使用して作製することができると理解される。タンパク質の機能に影響を及ぼすことなくタンパク質配列中の一定のアミノ酸を置換することができることが生物学分野で周知である。一般に、保存的アミノ酸置換または類似のアミノ酸の置換は、タンパク質機能に影響を及ぼすことなく許容される。類似のアミノ酸は、サイズおよび／または電荷特性が類似するアミノ酸であり得る（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸ならびにイソロイシンおよびバリンは共に類似のアミノ酸対である。）。意図する場合を除いて未変性の二次構造および三次構造の形成が破壊されない場合、連続した置換が可能である。アミノ酸対間の類似性は、当該分野で多数の方法にて評価されている。例えば、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１９７８．Ｖｏｌｕｍｅ ５，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３，Ｃｈａｐｔｅｒ ２２，ｐａｇｅｓ ３４５−３５２（本明細書中で参照により援用される。）は、アミノ酸類似性の１つの指標として使用することができるアミノ酸置換の頻度表を提供している。Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．の頻度表は、種々の進化的に異なる起源由来の同一機能を有するタンパク質のアミノ酸配列の比較に基づく。
開示のヌクレオチド（およびアミノ酸）配列の置換変異、挿入および欠失変種を、当業者に周知の方法によって容易に調製することができる。変種が具体的に例示した本発明の配列と実質的に同一の配列を有し、所望の機能性が保存されている限り、これらの変種を具体的に例示した配列と同一の様式で使用することができる。
本明細書中で使用する場合、実質的配列同一性は、変種のポリヌクレオチドまたはタンパク質が変種が由来するポリヌクレオチドまたはタンパク質と同一の能力で機能することができるのに十分な相同性（または同一性）をいう。好ましくは、この配列同一性は７０％または８０％を超え、より好ましくは、この同一性は８５％を超えるか、この同一性は９０％を超え、および／または、これは９５％を超える（７０％と１００％との間の全ての整数）。配列の機能が等価であるか、配列の機能が改善されるようにデザインされているか、そうでなければ、方法論的利点が得られるように置換変異、挿入変異および欠失変異を作製することは、十分に当業者の能力の範囲内である。任意の天然に存在するタンパク質に関して読み取ることができるか、承認された先行技術の事項に関して読み取られる実施形態／変種は、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲内であることが意図されない。一定の得られた元の全長配列のフラグメントおよび／または変異体が全長配列の望ましい特徴を保持することができるように本発明のポリヌクレオチド配列を短縮および／またはそうでなければ変異することができることが当該分野で周知である。より巨大な核酸分子からのフラグメントの生成に適切な広範な種々の制限酵素は周知である。さらに、Ｂａｌ３１エキソヌクレアーゼを時間制限されたＤＮＡの限定された消化のために都合良く使用することができることが周知である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．１９８２．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ １３５−１３９（本明細書中で参照により援用される。）を参照のこと。Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．１９８３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１３００６−１３５１２も参照のこと。Ｂａｌ３１エキソヌクレアーゼ（一般に、「ｅｒａｓｅ−ａ−ｂａｓｅ」手順という。）の使用により、当業者は、対象となる核酸の一方または両方の末端からヌクレオチドを除去して対象となるヌクレオチド配列と機能的に等価な広範なフラグメントを生成することができる。当業者は、この様式で元のコード配列のあらゆる位置から調節された種々の長さの数百のフラグメントを生成することができる。当業者は、生成されたフラグメントをその特徴について日常的に試験またはスクリーニングし、本明細書中に教示のフラグメントの有用性を決定することができる。全長配列の変異配列またはこのフラグメントを、部位特異的変異誘発を用いて容易に産生することができることも周知である。例えば、Ｌａｒｉｏｎｏｖ，Ｏ．Ａ．ａｎｄ Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ，Ｖ．Ｇ．１９８２．Ｇｅｎｅｔｉｋａ １８：３４９−５９；Ｓｈｏｒｔｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１５：２６５−９４（共に本明細書中で参照により援用される。）を参照のこと。当業者は、欠失型、挿入型または置換型の変異を日常的に産生し、全長野生型配列またはこのフラグメント（例えば、ホルモン、サイトカイン、抗原結合活性または他の生物学的活性を保持するもの）の所望の特徴を含む得られた変異体を同定することができる。
さらにまたは択一的に、変種ポリヌクレオチド配列は、「非保存的」置換（置換されたアミノ酸が置換されるアミノ酸と異なる構造または化学的性質を有する。）を含む変種アミノ酸配列をコードすることができる。変種免疫グロブリンコードポリヌクレオチドはまた、アミノ酸の挿入または欠失またはこの両方を含む変種アミノ酸配列をコードすることができる。さらに、変種免疫グロブリンコードポリヌクレオチドは、基準ポリヌクレオチド配列と同一のポリペプチドをコードすることができるが、遺伝暗号の縮重により、基準ポリヌクレオチド配列由来の１つ以上の塩基が変化しているポリヌクレオチド配列を有する。
用語「フラグメント」は、本発明の組換え免疫グロブリンについて言及する場合、対応する全長免疫グロブリンタンパク質のアミノ酸配列の全部ではないが一部が同一であり、対応する全長タンパク質と本質的に同一の生物学的な機能または活性を保持するか、対応する全長タンパク質の少なくとも１つの機能または活性を保持するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。フラグメントは、好ましくは、少なくとも２０から１００個の全長免疫グロブリンの連続するアミノ酸残基を含み、好ましくは、全長抗体と同一の抗原に結合する能力を保持している。
本明細書中で使用する場合、用語「配列同一性」は、配列アラインメントプログラムを使用してアラインメントした場合の２つ以上のアラインメントした配列における核酸またはアミノ酸配列の同一性を意味する。用語「相同率」は、本明細書中では、本明細書中の用語「同一率」と相互交換可能に使用され、配列アラインメントプログラムを使用してアラインメントした場合の２つ以上のアラインメントした配列の間の核酸またはアミノ酸配列の同一性レベルをいう。例えば、本明細書中で使用する場合、８０％相同は、当該分野で理解されている定義したアルゴリズムによって決定される８０％配列同一性と同一の事項を意味し、従って、所与の配列のホモログは、所与の配列の長さに関して８０％を超える配列同一性を有する。
比較に最適な配列アラインメントを、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ．１９８１．Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ．１９７０．Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ．１９８８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性の検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．１９９０．Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）（国立生物工学情報センターのウェブページ（ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照のこと。）から公的に入手可能なソフトウェアを使用）、または目視（一般に、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，以下を参照のこと。）によって行うことができる。本発明の目的のために、比較に最適な配列アラインメントを、最も好ましくは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ．１９８１．Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズムによって行う。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．１９９０およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．１９９７も参照のこと。
用語「同一の」または「同一性」率は、２つ以上の核酸配列またはタンパク質配列の文脈において、本明細書中に記載の１つの配列比較アルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムまたは当該分野で公知の他のアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ））または目視を使用して測定したところ、最大に対応するように比較およびアラインメントした場合に同一であるか、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドと指定の同一率を有する２つ以上の配列または部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）をいう。
本発明によれば、未変性配列または基準配列に対して８０、８５、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％（および８０％と１００％との間の全ての整数）またはこれを超える配列同一性を有する自己プロセシング切断ポリペプチドおよびポリペプチド自体をコードする配列変種も含まれる。少なくとも５単位、少なくとも１０単位または少なくとも１５単位の連続ストレッチを示すポリペプチドのアミノ酸フラグメントおよび記載の同一性条件に従って相同なフラグメントおよび少なくとも１５単位、少なくとも３０単位または少なくとも４５単位の連続ストレッチを示す核酸配列のフラグメントも含まれる。特定の実施形態では、核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書中に開示の各配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％同一である。
核酸配列は、２つの配列が中から高ストリンジェンシーなハイブリッド形成および洗浄条件下で相互に特異的にハイブリッド形成する場合、基準核酸配列に「選択的にハイブリッド形成可能」であると見なされる。ハイブリッド形成条件は、核酸結合複合体またはプローブの融点（Ｔｍ）に基づく。例えば、「最大ストリンジェンシー」は、典型的には、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い。）で起こり、「高ストリンジェンシー」は、Ｔｍより約５から１０℃低い温度で起こり、「中ストリンジェンシー」は、プローブのＴｍより約１０から２０℃低い温度で起こり、「低ストリンジェンシー」は、Ｔｍより約２０から２５℃低い温度で起こる。機能的には、最大ストリンジェンシー条件を使用して、ハイブリッド形成プローブと厳密に同一であるかほぼ厳密に同一である配列を同定することができる一方で、高ストリンジェンシー条件を使用して、プローブと約８０％以上の配列同一性を有する配列を同定する。
中および高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件は当該分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ，１９８９，Ｃｈａｐｔｅｒｓ ９ ａｎｄ １１およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１９９３を参照のこと。）。高ストリンジェンシー条件の例には、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハート液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性キャリアＤＮＡ中における４２℃でのハイブリッド形成ならびにその後の室温で２回の２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳでの洗浄および４２℃でさらなる２回の０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳでの洗浄が含まれる。目的の天然に存在するタンパク質と同一の生物学的活性を有するポリペプチドをコードし、中から高ストリンジェンシーのハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する２Ａ配列変種は、本発明の範囲内であると見なされる。
遺伝暗号の縮重の結果として、同一のポリペプチド配列をコードする多数のコード配列（構造成分、自己プロセシング成分（例えば、インテイン）、調節成分（例えば、シグナルペプチダーゼ切断配列）または他の成分が含まれる。）を産生することができる。例えば、トリプレットＣＧＴは、アミノ酸であるアルギニンをコードする。または、アルギニンは、トリプレットヌクレオチド配列ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＡＧＡおよびＡＧＧによってコードされる。従って、コート領域中の同義語コドンのかかる置換が本発明が対象とする配列変種の範囲内に含まれると認識される。
かかる配列変種が高ストリンジェンシー条件下で親配列とハイブリッド形成してもしなくてもよいとさらに認識される。例えば、配列変種が親ヌクレオチドによってコードされる各アミノ酸の異なるコドンを含む場合、この可能性がある。かかる変種は、これにもかかわらず、本発明によって具体的に意図され、含まれる。
治療方法としての抗体の可能性は、今日、現在のテクノロジーの産生能力および費用によって制限されている。免疫グロブリン（または他のタンパク質）の産生のために改良されたウイルスまたは非ウイルスの単一の発現ベクターは、単一のベクターからの２つ以上のコード配列（即ち、二重特異性または多重特異性を有する免疫グロブリンまたは他のタンパク質）の発現および送達を容易にする。本発明は、これらの制限に取り組み、任意の免疫グロブリン（即ち、抗体）もしくはグロブリンのフラグメントまたは本明細書中にさらに詳述した他のマルチパートタンパク質（ｍｕｌｔｉｐａｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）もしくは結合タンパク質対（操作された抗体（単鎖抗体など）、全長抗体または抗体フラグメント、二本鎖ホルモン、二本鎖サイトカイン、二本鎖ケモカインおよび二本鎖受容体などが含まれる。）に適用可能である。
インテイン
本明細書中で使用する場合、インテインは、Ｎ−エクステインによって一次発現産物のＮ末端に向かって結合し、Ｃ−エクステインによって一次発現産物のＣ末端に向かって結合する発現されたタンパク質内のセグメントである。天然に存在するインテインは、インテインの切り出しならびにＮ−およびＣ−エクステインの再連結（タンパク質ライゲーション）を媒介する。しかし、本発現産物の文脈において、インテインの一次配列または隣接エクステインのアミノ酸配列は、タンパク質骨格の切断がエクステインの非存在下または減少したか最小のライゲーション量で起こり、この結果、エクステインタンパク質は、連結して融合タンパク質を形成することなく一次翻訳産物（ポリタンパク質）から放出されるような配列である。一次発現産物（任意のタンパク質分解的切断前のｍＲＮＡによって合成されたタンパク質）のインテイン部分は、Ｎ−エクステイン／インテインおよびインテイン／Ｃ−エクステインジャンクションでのタンパク質分解的切断を媒介する。一般に、天然に存在するインテインはまた、Ｎ−エクステインおよびＣ−エクステインの相互のスプライシング（ペプチド結合形成による連結）を媒介する。しかし、本発明では、２つのポリペプチド（抗体分子の重鎖および軽鎖によって具体的に例示される。）を発現させるという目的に適用される場合、タンパク質ライゲーションが起こらないことが好ましい。天然にまたは変異によってライゲーション活性を持たないインテインの組み込むことによってこれを行うことができる。または、スプライシングを、放出されたタンパク質のライゲーションを防止するようにスプライシング部位またはこの部位の隣のアミノ酸を変化させる変異によって防止することができる。Ｘｕ ａｎｄ Ｐｅｒｌｅｒ，１９９６，ＥＭＢＯ Ｊ．１５：５１４６−５１５３を参照のこと。例えば、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＣｙｓは、通常、Ｃ−エクステインの始まりで生じ、スプライシングを改変するか妨害するように変化させることができる。特定のインテインでは、スプライシングに及ぼす影響により、発現されたタンパク質のライゲーションが防止されるか減少する。
インテインは、この遺伝子が他のタンパク質の遺伝子内のみで見出されるタンパク質クラスである。エクステインと呼ばれる隣接宿主遺伝子と共に、インテインは単一のｍＲＮＡとして転写され、単一のポリペプチドとして翻訳される。翻訳後に、インテインは、自己触媒的事象を開始してインテイン自体を除去し、新規のポリペプチド結合を用いて隣接宿主タンパク質セグメントが連結する。この反応は、インテインのみによって触媒され、他の細胞タンパク質、補因子、ＡＴＰを必要としない。インテインは、種々の単細胞生物中で見出され、これらのインテインは異なるサイズを有する。多数のインテインは、ゲノム内の移動性を担うエンドヌクレアーゼドメインを含む。
インテイン媒介反応は、生物工学において、特にインビトロ状況下（精製およびタンパク質チップ構築など）および植物株の改良で使用されている（Ｐｅｒｌｅｒ，Ｆ．Ｂ．２００５．ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ ５７（７）：４６９−７６）。未変性インテインヌクレオチド配列およびこれらの変異体の幾つかへの変異の導入により、性質が変化することが報告されている（Ｘｕ ａｎｄ Ｐｅｒｌｅｒ，１９９６．ＥＭＢＯ Ｊ．１５（９），５１４６−５１５３）。インテインに加えて、細菌インテイン様（ＢＩＬ）ドメインおよびヘッジホッグ（Ｈｏｇ）自己プロセシングドメイン、Ｈｏｇ／インテイン（ＨＩＮＴ）スーパーファミリーの他の２つのメンバーはまた、類似の機構によって翻訳後自己プロセシングを触媒することが公知である（Ｄａｓｓａ ｅｔ．ａｌ．２００４．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（３１）：３２００１−３２００７）。
インテインは、特異的宿主タンパク質中のインフレーム挿入として生じる。自己スプライシング反応では、インテイン自体が前駆体タンパク質から切り出される一方で、隣接領域（エクステイン）が連結するようになり、これにより、宿主遺伝式能を修復する。これらのエレメントはまた、ゲノム内の移動性を担うエンドヌクレアーゼ機能を含む。インテインは種々のサイズ（１３４から１６５０アミノ酸）で生じ、真正細菌、真核生物および古細菌のゲノム中で同定されている。モデルスプライシング／レポーター系を使用した実験により、エンドヌクレアーゼ、タンパク質切断およびタンパク質スプライシング機能を分離することができることが示されている（Ｘｕ ａｎｄ Ｐｅｒｌｅｒ．１９９６．ＥＭＢＯ Ｊ．１５：５１４６−５１５３）。下記の例は、抗体の重鎖および軽鎖由来の配列を有する融合タンパク質を作製するために、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）Ｐｈｏ Ｐｏｌ Ｉ、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＶＭＡおよびシネコシスティス種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｐ．）由来のインテインを使用している。インテインのスプライシング能力を欠失させるようにデザインされたインテインの変異により、自己切断されて正確にコードされた抗体の重鎖および軽鎖を産生する単一のポリペプチドが得られる。このストラテジーを他の多鎖タンパク質、ホルモンまたはサイトカインの発現で同様に使用することができ、このストラテジーを、前駆体タンパク質（プロタンパク質）の成熟した生物学的に活性な形態へのプロセシングに適合させることもできる。パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）Ｐｈｏ Ｐｏｌ Ｉ、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＶＭＡおよびシネコシスティス種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｐ．）のインテインの使用を本明細書中で具体的に例示しているが、当業者に公知の他のインテインを、本発明のポリタンパク質発現ベクターおよび方法で使用することができる。
パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）Ｐｈｏ Ｐｏｌ Ｉ、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＶＭＡおよびシネコシスティス種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｐ．）のインテインに加えて、多数の他のインテインが当業者に公知である（例えば、Ｐｅｒｌｅｒ，Ｆ．Ｂ．２００２，ＩｎＢａｓｅ，ｔｈｅ Ｉｎｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０（１）：３８３−３８４およびインテインデータベースとレジストリ（ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓウェブサイト（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｉｎｂａｓｅ／）で利用可能）を参照のこと。）。インテインは、広範な生物（酵母、マイコバクテリアおよび超好熱性古細菌など）で同定されている。一定のインテインは、エンドヌクレアーゼ活性ならびに部位特異的タンパク質切断およびスプライシング活性を有する。エンドヌクレアーゼ活性は本発明の実施に必要なく、タンパク質切断活性が維持されるという条件で、エンドヌクレアーゼコード領域を欠失させることができる。
タンパク質スプライシング過程の機構は非常に詳細に研究されており（Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２１５９−２２１６８；Ｘｕ ａｎｄ Ｐｅｒｌｅｒ．１９９６．ＥＭＢＯ Ｊ １５：５１４６−５１５３）、保存アミノ酸はインテインおよびエクステインのスプライシングポイントで見出されている（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．１９９４．ＥＭＢＯ Ｊ １３：５５１７−５５２２）。本明細書中に記載の一定の構造は、インテインのＣ末端にインフレームで融合した第２のコード配列と共に、第１のコード配列の３’末端に融合したインテイン配列を含む。適切なインテイン配列を、タンパク質スプライシングエレメントを含むことが公知の任意のタンパク質から選択することができる。全ての公知のインテインを含むデータベースを、ワールドワイドウェブで見出すことができる（Ｐｅｒｌｅｒ，Ｆ．Ｂ．１９９９．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：３４６−３４７）。インテインコード配列を、第２のコード配列の３’末端→５’末端方向に（インフレームで）融合する。一定のオルガネラにこのタンパク質をターゲティングするために、適切なペプチドシグナルをタンパク質のコード配列に融合することができる。
第２のエクステインコード配列の後、インテインコード配列−エクステインコード配列を、同一細胞中の複数のタンパク質の発現が望まれるたびに繰り返すことができる。多インテイン含有構築物について、異なる起源由来のインテインエレメントを使用することが有用であり得る。発現すべき最後の遺伝子配列の後、転写終結配列（有利には、ポリアデニル化配列を含む。）を挿入することが望ましい。ポリアデニル化配列および終結配列の順序は、当該分野で理解されている通りであり得る。１つの実施形態では、ポリアデニル化配列は終結配列に先行し得る。
改変インテインスプライシング単位を、かかる目的の改変インテインがインテインからのエクステインの切り出しを触媒することができるが、エクステインのライゲーションを触媒できないようにデザインしている（例えば、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ７０２６５２６およびＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ２００２０１２９４００を参照のこと。）。パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）種のＧＢ−ＤのＤＮＡポリメラーゼ中でのＣ末端エクステインジャンクションの変異誘発により、エクステインおよびインテインの切断を誘導するが、その後のエクステインのライゲーションを防止する変化したスプライシングエレメントが産生された（Ｘｕ ａｎｄ Ｐｅｒｌｅｒ．１９９６．ＥＭＢＯ Ｊ １５：５１４６−５１５３）。セリン５３８のアラニンまたはグリシンのいずれかへの変異（Ｓｅｒ→ＡｌａまたはＧｌｙ）により、切断が誘導されるが、ライゲーションは回避された。かかる位置では、Ｓｅｒ→ＭｅｔまたはＳｅｒ→Ｔｈｒも使用して、個別のセグメントに切断され、少なくとも部分的に再ライゲーションされないポリタンパク質が発現される。他のインテインスプライシング単位中の等価な残基の変異はまた、インテインに対してＣ末端エクステインジャンクションでのアミノ酸の相対的保存に起因して、エクステインセグメントのライゲーションを防止することができる。低保存／相同性の場合、例えば、最初の数個（例えば、約５個）のＣ−エクステインの残基および／または最後の数個のインテインセグメントの残基は系統的に変化しており、これらの残基を所与のエクステインセグメント（特に、本明細書中に開示され、当該分野で理解されているエクステインセグメント）の切断を補助するが、スプライシングを補助しない能力についてスクリーニングする。エンドヌクレアーゼドメインを含まないインテインが存在し、これらには、シネコシスティス種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｐ）ｄｎａＥインテインおよびマイコバクテリウム・ゼノピ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｎｏｐｉ）ＧｙｒＡタンパク質が含まれる（Ｍａｇｎａｓｃｏ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００４，４３，１０２６５−１０２７６；Ｔｅｌｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６３７８−６３８２）。他のインテインは、自然界に認められるか、エンドヌクレアーゼ含有インテインをコードする配列からのエンドヌクレアーゼコードドメインの除去によって人為的に作製されている（Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１５５８７−１５５９０）。所望により、スプライシング機能を実施するために必要な最小数のアミノ酸からなるように、インテイン（マイコバクテリウム・ゼノピ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｎｏｐｉ）ＧｙｒＡタンパク質由来のインテインなど）を最初に選択する（Ｔｅｌｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．１９９７．前出）。別の実施形態では、エンドヌクレアーゼ活性を持たないインテイン（エンドヌクレアーゼドメインを除去するように改変されたマイコバクテリウム・ゼノピ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｎｏｐｉ）ＧｙｒＡタンパク質由来のインテインまたはサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＶＭＡ インテインなど）を選択する（Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９７．前出）。
インテインスプライシング単位のさらなる改変によって切断反応の反応速度を変化させ、スプライシング単位の遺伝子配列の簡潔な改変によってタンパク質投薬量を調整することができる。
１つの実施形態では、Ｃ末端エクステインの第１の残基を、グリシンまたはアラニンを含むように操作する（パイロコッカス種（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）ＧＢ−ＤのＤＮＡポリメラーゼを使用してエクステインライゲーションを防止することが示された改変）（Ｘｕ ａｎｄ Ｐｅｒｌｅｒ．１９９６．ＥＭＢＯ Ｊ １５：５１４６−５１５３）。この実施形態では、好ましいＣ末端エクステインタンパク質は、天然に、未変性のアミノ酸配列中のＮ末端メチオニンの後にグリシン残基またはアラニン残基を含む。エクステインのグリシンまたはアラニンのインテインのＣ末端への融合により、ポリタンパク質のプロセシング後に未変性アミノ酸配列が得られる。別の実施形態では、未変性配列を変化させるか、未変性配列のＮ末端上にさらなるアミノ酸残基を付加することによってグリシンまたは人工アラニンをＣ末端エクステイン中に配置させる。この実施形態では、タンパク質の未変性アミノ酸配列は、ポリタンパク質プロセシング後に１つのアミノ酸が変化する。さらなる実施形態では、本発明で有用な他の改変は、ＵＳ７０２６５２６に記載されている。
１つの実施形態では、インテインは、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ７，０２６，５２６などに従う。特定の実施形態では、インテインは、パイロコッカス種（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）ＧＢ−ＤのＤＮＡポリメラーゼインテインである。１つの実施形態では、Ｃ末端エクステインのセリンのアラニンまたはグリシンへの変異により、ポリタンパク質の切り出しを促進することができるが、エクステイン単位をライゲーションできない改変されたインテインスプライシングエレメントが形成される。１つの実施形態では、インテインは、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ７，０２６，５２６のマイコバクテリウム・ゼノピ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｎｏｐｉ）ＧｙｒＡ最小インテインである。１つの実施形態では、Ｃ末端エクステインのトレオニンのアラニンまたはグリシンへの変異により、ポリタンパク質の切り出しを促進するが、エクステイン単位をライゲーションしない改変されたインテインスプライシングエレメントが形成される。
本明細書中に記載の一定のインテインについて、構築物および方法の実施形態によって分泌されたタンパク質産物、特に、多量体タンパク質（抗体が含まれる。）の発現を改良することができると認識される。
シグナルペプチドおよびシグナルペプチダーゼ
タンパク質がアミノ酸配列内に膜にターゲティングするタンパク質についての情報を含むというシグナル仮説は、３０年以上前から知られている。Ｍｉｌｓｔｅｉｎらは、骨髄腫細胞由来のＩｇＧの軽鎖をより高い分子量の形態で合成し、小胞体（ミクロソーム）を翻訳系に添加した場合に成熟形態に変換されることを発見し、ミクロソームがアミノ末端伸長ペプチドの除去によって前駆体タンパク質形態を成熟形態に変換するプロテアーゼを含むというこれらの結果に基づいたモデルを提案していた。シグナル仮説は、やがて、異なる細胞内膜（ミトコンドリアおよびクロロプラストなど）に局在したタンパク質内の異なるターゲティング配列を含むように拡大された。これらの異なるターゲティング配列は、後に、特異的なシグナルペプチダーゼ（ＳＰアーゼ）によって排出されたタンパク質から切断されることが見出された。
細菌におけるシグナルペプチド切断に関与するＳＰアーゼが少なくとも３つ存在する。ＳＰアーゼＩは、ＳｅｃＹＥＧ経路またはツインアルギニン移行（ｔｗｉｎ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）（Ｔａｔ）経路によって排出される非リポタンパク質基質をプロセシングすることができる。Ｓｅｃ経路によって排出されるリポタンパク質は、ＳＰアーゼＩＩによって切断される。ＳＰアーゼＩＶは、ＩＩ型分泌装置の成分であるＩＶ型プレピリン（ｐｒｅｐｉｌｉｎ）およびプレピリン様タンパク質を切断する。
真核生物では、小胞体（ＥＲ）膜にターゲティングされるタンパク質は、共翻訳的または翻訳後のいずれかでタンパク質をＳｅｃ６１移行機構にターゲティングするシグナルペプチドによって媒介される。ＥＲシグナルペプチドは、細菌対応物のＥＲシグナルペプチドと類似の特徴を有する。ＥＲシグナルペプチドは、シグナルペプチダーゼ複合体（ＳＰＣ）によるＥＲ内腔への排出後に排出されたタンパク質から切断される。
真核細胞内の異なる位置にタンパク質を分類するシグナルペプチドは異ならなければならない。何故なら、これらの細胞が多数の異なる膜区画および水性区画を含むからである。ＥＲにターゲティングされるタンパク質は、しばしば、切断可能なシグナル配列を含む。驚いたことに、多数の人工ペプチドが移行シグナルとして機能することができる。最も重要な鍵となる特徴は、一定の閾値を超える疎水性を示すことと考えられる。ＥＲシグナルペプチドは、細菌シグナルペプチドよりもロイシン残基の含有率が高い。シグナル認識粒子（ＳＲＰ）は、リボゾームから出現した後に切断可能なシグナルペプチドに結合する。ＳＲＰは、新生タンパク質のＥＲ膜へのターゲティングに必要である。タンパク質のＥＲ内腔への移行後、排出されたタンパク質は、ＳＰＣによってプロセシングされる。別の実施形態は、真核細胞中に天然に存在するシグナル（リーダー）ペプチドプロセシング酵素を活用する。
公知のＥＲシグナルペプチドのほとんどは、Ｎ末端切断性または内部非切断性である。最近、多数のウイルスポリタンパク質（Ｃ型肝炎ウイルス、ハンタウイルス、フラビウイルス、風疹ウイルスおよびＣ型インフルエンザウイルス中で見出されるウイルスポリタンパク質など）は、ＥＲ ＳＰＣによって切断される可能性が最も高い内部シグナルペプチドを含むことが見出された。ポリタンパク質の成熟に関するこれらの研究は、ＳＰＣがアミノ末端に存在するシグナルペプチドだけでなく、内部シグナルペプチドの後も切断することができることを示している。従って、予想されるシグナルペプチダーゼ基質特異性エレメントの変異誘発により、ウイルス感染性を遮断することができる。
プレセニリン型アスパラギン酸プロテアーゼシグナルペプチドペプチダーゼ（ＳＰＰ）は、これらの膜貫通領域内のシグナルペプチドを切断する。ＳＰＰは、ヒトにおけるシグナルペプチド由来ＨＬＡ−Ｅエピトープの生成に不可欠である。
シグナルペプチダーゼは当該分野で周知である。例えば、Ｐａｅｔｚｅｌ Ｍ．２００２．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０２（１２）：４５４９；Ｐｅｋｏｓｚ Ａ．１９９８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９５：１３２３３−１３２３８；Ｍａｒｉｕｓ Ｋ．２００２．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ １０：７３５−７４４；Ｏｋａｍｏｔｏ Ｋ．２００４．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３７０−６３８０，Ｖｏｌ．７８；Ｍａｒｔｏｇｌｉｏ Ｂ．２００３．Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２：Ｒ２０１−Ｒ２０６およびＸｉａ Ｗ．２００３．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１６：２８３９−２８４４を参照のこと。
本発明の実施形態は、単一の転写物中のポリペプチドの発現のために内部切断性シグナルペプチドを利用する。次いで、単一の転写されたポリペプチドは、ＳＰＣによって切断されて、各ペプチドが個別に遊離されるか、各ペプチドがタンパク質にアセンブリされる。本発明の方法は、単一の転写されたポリペプチド中での免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の発現、その後の切断、その後の成熟免疫グロブリンへのアセンブリに適用可能である。このテクノロジーは、単一の転写されたポリペプチド中のポリペプチドであるサイトカイン、成長因子または種々の他のタンパク質（例えば、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１２ｐ３５）に適用可能であり、次いで、単一の転写されたポリペプチド中でＩＬ−１２またはＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−２３ｐ１９にアセンブリし、次いで、ＩＬ−２３にアセンブリする。
シグナルペプチダーゼアプローチは、哺乳動物発現ベクターに適用可能であり、これにより、前駆体タンパク質またはポリタンパク質から機能的抗体または他のプロセシングされた産物が発現される。抗体の場合、抗体は重鎖および軽鎖の両方を含むポリタンパク質としてベクターから産生され、重鎖と軽鎖との間の介在配列は内部切断性シグナルペプチドである。この内部切断性シグナルペプチドを、ＥＲプロテアーゼ（主に、シグナルペプチダーゼ、プレセニリンまたはプレセニリン様プロテアーゼ）によって切断して、重鎖および軽鎖が折り畳みおよびアセンブリされて機能的分子が得られ、望ましくは分泌され得る。Ｃ型肝炎ウイルス由来の内部切断性シグナルペプチドに加えて、ＥＲプロテアーゼによって切断することができる他の内部切断性配列に代えることができる。同様に、本発明の実施は、シグナルペプチダーゼが切断を担う宿主細胞に制限する必要はないが、プロテアーゼ（プレセニリン、プレセニリン様プロテアーゼおよびポリペプチドのプロセシングのための他のプロテアーゼが含まれるが、これらに限定されない。）も含む。これらのプロテアーゼは、とりわけ、引用文献中で概説されている。
さらに、本発明は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の発現に制限されないが、単一の転写物中で発現された他のポリペプチドおよびポリタンパク質およびその後の内部シグナルペプチド切断による個別のペプチドまたはタンパク質の放出も含む。これらのタンパク質は、相互に成熟産物にアセンブリされてもされなくてもよい。
各ポリペプチドが交互の順序で存在する発現構築物（即ち、「ペプチド１−内部切断性シグナルペプチド−ペプチド２」または「ペプチド２−内部切断性シグナルペプチド−ペプチド１」）も本発明の範囲内に含まれる。本発明は、さらに、内部切断性シグナルペプチドによって連結された２つ以上のペプチド（「ペプチド１−内部切断性シグナルペプチド−ペプチド２−内部切断性シグナルペプチド−ペプチド３」など）の発現を含む。
さらに、本発明を、Ｉ型およびＩＩ型膜貫通タンパク質の両方の発現ならびに発現構築物に関連する他のプロテアーゼ切断部位に適用する。
本発明は、さらに、単一の転写物内でコードされるポリタンパク質内の１つ以上のポリペプチドの成熟のために内部切断性シグナルペプチドを利用することができる。次いで、単一の転写されたポリペプチドは、ＳＰＣによって切断されて、各ペプチドが個別に遊離されるか、各ペプチドがタンパク質にアセンブリされる。本発明の実施形態は、単一の転写されたポリペプチド中で免疫グロブリンの重鎖および軽鎖を発現し、最終的に成熟免疫グロブリンにアセンブリするための組成物および方法を含む。本発明は、単一の転写されたポリペプチド中でのポリペプチドであるサイトカイン、成長因子または種々の他のタンパク質の発現（例えば、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１２ｐ３５の発現）に適用可能であり、次いで、単一の転写されたポリペプチド中でＩＬ−１２またはＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−２３ｐ１９にアセンブリし、次いで、ＩＬ−２３にアセンブリする。
シグナルペプチドの改変
ｓＯＲＦ構築物の実施形態では、改変したシグナルペプチドを使用する。例えば、Ｈｅａｖｙｃｈａｉｎ−ｉｎｔ−ＬｉｇｈｔＣｈａｉｎの構築物では、部位特異的変異誘発によって軽鎖シグナルペプチド配列の疎水性が減少した場合に、抗体分泌レベルは約１０倍に増加した。シグナルペプチドを、２００７年３月２２日出願のＣａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．のＵＳ２００７００６５９１２に記載のように使用することができる。
タグ
本発明のｓＯＲＦ構築物デザインの実施形態は、タグ、好ましくは内部タグを含む改変されたインテインの使用を含む。種々のタグが当該分野で公知である。本発明のタグには、蛍光タグおよび化学発光タグが含まれるが、これらに限定されない。かかる構築物を使用して、ポリタンパク質の発現量を、各細胞において蛍光検出を使用してモニタリングすることができる。さらに、これらの細胞を、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用してタンパク質発現レベルに従って分類することができる。かかるタグの使用は、このタグによってＦＡＣＳ分析による高産生性の細胞または細胞株の選択が可能であるので、安定な細胞株世代で特に有用である。本発明で教示されるように、全長インテインは、隣接する抗体の重鎖および軽鎖からの自己切断後の細胞溶解物中で認められる。これにより、蛍光標識したインテインの検出および安定な細胞株世代での使用のための基礎が得られる。タグを、タンパク質精製で使用することもできる。
ミニインテイン（ｍｉｎｉ−ｉｎｔｅｉｎ）
多数のインテイン（Ｐ．ホリコシイ（Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）ＰｏｌＩインテインおよびＳｃｅ．ＶＭＡインテインが含まれる。）中に存在するエンドヌクレアーゼ領域が遺伝子発現系に特に有利というわけではないので、エンドヌクレアーゼドメインを任意選択的に欠失させ、小リンカーと置換して「ミニインテイン」を作製することができる。これらの操作されたミニインテインはまた、記載の構築物デザインで有用であり、インテインコード領域が有意により小さいために目的のポリペプチドをコードする配列をより巨大にし、および／または組換えＤＮＡ分子の取り扱いをより容易にすることが可能であるという利点が得られる。
実施形態では、完全なヒトの特徴を有する抗体または抗体のアナログを使用することが有利である。これらの試薬は、非ヒト種由来の抗体またはアナログによって誘導される望ましくない免疫応答を回避する。自己プロセシングペプチド由来のアミノ酸残基に対する起こり得る宿主免疫応答に取り組むために、タンパク質分解性切断部位のコード配列を、第１のタンパク質のコード配列と自己プロセシングペプチドのコード配列との間に挿入して（当該分野で公知の標準的方法論を使用）、発現されたポリペプチド（即ち、抗体）から自己プロセシングペプチド配列を除去することができる。これは、インビボで用いる治療抗体または診断抗体で特に有用である。
遺伝子送達およびベクター（ウイルスベクターが含まれる。）
本発明は、２つ以上のポリペプチドまたはタンパク質のコード配列および自己プロセシング切断配列を含む構築物の細胞への導入のための種々のベクターのうちのいずれかの使用を考慮する。遺伝子発現ベクターの多数の例は当該分野で公知であり、ウイルスまたは非ウイルス起源であり得る。本発明の実施で使用することができる非ウイルス遺伝子送達法には、プラスミド、リポソーム、核酸／リポソーム複合体および陽イオン性脂質などが含まれるが、これらに限定されない。
ウイルスおよび他のベクターは細胞を効率よく形質導入し、自己のＤＮＡを宿主細胞に導入することができる。組換えウイルスベクターの生成では、非必須遺伝子を、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする発現可能な配列に置換する。例示的なベクターには、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクター（レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターが含まれる。）、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター（複製可能形態、複製欠損形態およびガトレス形態が含まれる。）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、サルウイルス４０（ＳＶ−４０）ベクター、ウシ乳頭腫ベクター、エプスタイン・バーベクター、ヘルペスベクター、ワクシニアベクター、モロニーマウス白血病ベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳癌ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクターおよび非ウイルスプラスミドなど）が含まれるが、これらに限定されない。バキュロウイルスベクターは周知であり、昆虫細胞での発現に適切である。哺乳動物細胞または他の真核細胞での発現に適切な多数のベクターが当業者に周知であり、この多数が市販されている。販売者には、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩおよびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯが含まれるが、これらに限定されない。多数のベクター配列がＧｅｎＢａｎｋから利用可能であり、ベクターに関するさらなる情報は、インターネットで理研バイオリソースセンターから利用可能である。
１つの実施形態では、ベクターは、典型的には、複製起点を含み、ベクターは、ベクターを同定および選択することができる「マーカー」または「選択マーカー」機能をさらに含んでも含まなくてもよい。任意の選択マーカーを使用することができる一方で、組換えベクターで用いる選択マーカーは一般に当該分野で公知であり、適切な選択マーカーの選択は宿主細胞に依存する。抗生物質または他の毒素に耐性を付与するタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子の例には、アンピシリン、メトトレキサート、テトラサイクリン、ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．１９８２．Ｊ Ｍｏｌ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−４１）、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．１９８０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２−７）、ピューロマイシン、ゼオマイシン（ゼオマイシン）、ハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ ｅｔ ａｌ．１９８５．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：４１０−３）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミンシンテターゼおよびＧ４１８が含まれるが、これらに限定されない。当業者に理解されるように、発現ベクターは、典型的には、発現されるコード配列に応じて、複製起点、発現すべきコード配列（リボゾーム結合部位も同様）に作動可能に連結されたプロモーター、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列を含む。
ベクターまたは他のＤＮＡ配列に対する「組換え」という言及は、典型的には単離形態または天然で見出されるとして作動可能に連結されないＤＮＡ配列の作動可能な結合を単に認めている。調節（発現および／または制御）配列は、発現配列および／または制御配列が核酸配列の転写（必要に応じて、翻訳）を制御する場合に配列をコードする核酸に作動可能に連結される。従って、発現配列および／または制御配列には、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン（即ち、ＡＴＧ）（コード配列の５’側）、イントロンのスプライシングシグナルおよび終止コドンが含まれ得る。
アデノウイルス遺伝子療法ベクターは、強力な一過性発現、優れた力価ならびにインビボで分裂細胞および非分裂細胞に形質導入する能力を示すことが公知である（Ｈｉｔｔ ｅｔ ａｌ．２０００．Ａｄｖ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ ５５：４７９−５０５）。組換えＡｄベクターは、ベクターを複製欠損Ａｄビリオンに組み込むことができるパッケージング部位、２つ以上の目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、目的の免疫グロブリンの重鎖および軽鎖）のコード配列、および自己プロセシング切断部位のみまたはさらなるタンパク質分解性切断部位との組み合わせをコードする配列を含むことができる。感染性ビリオンへの組み込みに必要であるか役立つ他のエレメントには、５’および３’Ａｄ ＩＴＲ、Ｅ２遺伝子、Ｅ４遺伝子の一部および任意選択的にＥ３遺伝子が含まれる。
組換えＡｄベクターをカプセル化する複製欠損Ａｄビリオンを、Ａｄパッケージング細胞およびパッケージングテクノロジーを使用した当該分野で公知の標準的技術によって作製する。これらの方法の例を、例えば、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，８７２，００５に見出すことができる。２つ以上の目的のポリペプチドまたはタンパク質のコード配列を、一般に、ウイルスゲノムの欠失Ｅ３領域中のアデノウイルスに挿入する。本発明の実施で用いる好ましいアデノウイルスベクターは、１つ以上の野生型Ａｄ遺伝子産物（例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４）を発現しない。好ましい実施形態は、典型的にはＥ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４および（任意選択的に）Ｅ３の遺伝子領域の機能を補完するパッケージング細胞株と共に使用されるビリオンである。例えば、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．５，８７２，００５、５，９９４，１０６、６，１３３，０２８および６，１２７，１７５を参照のこと。
本明細書中で使用する場合、「アデノウイルス」および「アデノウイルス粒子」は、他で示さない限り、ウイルス自体またはウイルスの誘導体をいい、全ての血清型およびサブタイプならびに天然に存在する形態および組換え形態を対象とする。かかるアデノウイルスは野生型であり得るか、当該分野で公知であるか本明細書中に開示の種々の方法で改変することができる。かかる改変には、感染性ウイルスを作製するために粒子にパッケージングしたアデノウイルスゲノムへの改変が含まれる。かかる改変には、当該分野で公知の欠失（１つ以上のＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３またはＥ４のコード領域の欠失など）が含まれる。例示的なパッケージング細胞および産生細胞は、２９３細胞、Ａ５４９細胞またはＨｅＬａ細胞に由来する。アデノウイルスベクターを、当該分野で公知の標準的な技術を使用して精製および処方する。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、染色体組み込みによって細胞に潜伏感染することができるヘルパー依存性ヒトパルボウイルスである。染色体組み込み能力および非病原性のために、ＡＡＶは、ヒト遺伝子療法ベクターとして大きな潜在的可能性を有する。本発明の実施での使用のために、ｒＡＡＶビリオンを、当業者に公知の標準的な方法論を使用して産生することができ、ｒＡＡＶビリオンが転写方向に作動可能に連結された成分として調節配列（転写開始配列および転写終結配列が含まれる。）および目的のコード配列を含むように構築する。より具体的には、本発明の組換えＡＡＶベクターは、ベクターを複製欠損ＡＡＶビリオンに組み込むことができるパッケージング部位、２つ以上の目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、目的の免疫グロブリンの重鎖および軽鎖）のコード配列、自己プロセシング切断部位のみまたは１つ以上のさらなるタンパク質分解性切断部位との組み合わせをコードする配列を含む。本発明の実施で用いるＡＡＶベクターを、転写方向に作動可能に連結された成分として調節配列（転写開始配列および転写終結配列が含まれる。）も含むように構築する。これらの成分は、５’末端および３’末端で機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する。「機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列」は、ＩＴＲ配列がＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージングを意図する場合に機能することを意味する。
組換えＡＡＶベクターはまた、標的細胞中での選択された組換えポリペプチドまたはタンパク質産物の発現および産生を指示することができることを特徴とする。従って、組換えベクターは、少なくとも全てのキャプシド形成に不可欠なＡＡＶの配列および組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオン感染のための物理的構造を含む。これ故、発現ベクターで用いるＡＡＶ ＩＴＲは野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく（例えば、Ｋｏｔｉｎ．１９９４．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：７９３−８０１に記載）、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更することができるか、ＡＡＶ ＩＴＲは幾つかのＡＡＶ血清型のうちのいずれかに由来し得る。一般に、ＡＡＶベクターは、当業者に公知のアデノ随伴ウイルス血清型由来の任意のベクターであり得る。
典型的には、ＡＡＶ発現ベクターを産生細胞に導入し、その後にＡＡＶヘルパー構築物を導入する。ここで、ヘルパー構築物は、産生細胞中で発現することができるＡＡＶコード領域を含み、ＡＡＶベクターに存在しないＡＡＶヘルパー機能を補完する。ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，５４８，２８６（本明細書中で参照により援用される。）に記載のように、ヘルパー構築物を、典型的にはｐ５の後の開始コドンのＡＴＧからＡＣＧへの変異によって巨大なＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８）の発現を下方制御するようにデザインすることができる。この後に、ヘルパーウイルスおよび／またはさらなるベクターを産生細胞に導入し、このヘルパーウイルスおよび／またはさらなるベクターは効率的なｒＡＡＶウイルス産生を補助することができる補助機能を提供する。次いで、産生細胞を培養してｒＡＡＶを産生する。これらのことを、標準的な方法論を使用して行う。本発明の組換えＡＡＶベクターをカプセル化する複製欠損ＡＡＶビリオンを、ＡＡＶパッケージング細胞およびパッケージングテクノロジーを使用した当該分野で公知の標準的技術によって作製する。これらの方法の例を、例えば、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．５，４３６，１４６；５，７５３，５００、６，０４０，１８３、６，０９３，５７０および６，５４８，２８６（全体が本明細書中で参照により援用される。）中に見出すことができる。パッケージングのためのさらなる組成物および方法は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ２００２／０１６８３４２）（これも全体が本明細書中で参照により援用される。）に記載されており、当業者の知識の範囲内の技術が含まれる。
本発明の実施では、ｒＡＡＶまたは他のベクター（発現ベクタービリオン）の産生のための宿主細胞には、哺乳動物細胞、昆虫細胞、微生物および酵母が含まれる。宿主細胞はまた、ＡＡＶベクターゲノムが安定に維持およびパッケージングされる宿主細胞または産生細胞中でＡＡＶ（または他の）ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子が安定に維持されるパッケージング細胞であり得る。例示的なパッケージング細胞および産生細胞は、２９３細胞、Ａ５４９細胞またはＨｅＬａ細胞に由来する。ＡＡＶベクターを、当該分野で公知の標準的な技術を使用して精製および処方する。さらなる適切な宿主細胞（ベクターに依存する。）には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損変種（ＣＨＯ ＤＸ Ｂ１１細胞またはＣＨＯ ＤＧ４４細胞など）（例えば、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ．１９８０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：４２１６−４２２０を参照のこと）、ＰｅｒＣ．６細胞（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．２００３．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１９：１６３−１６８）またはＳｐ／２０マウス骨髄腫細胞（Ｃｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．１９９４．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：２４４８−２４５５）が含まれる。
レトロウイルスベクター
レトロウイルスベクターを、遺伝子送達のために使用することができる（Ｍｉｌｌｅｒ．１９９２．Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０）。レトロウイルスベクター（特に、レンチウイルスベクター）を、本発明の実施で使用することができる。従って、用語「レトロウイルス」または「レトロウイルスベクター」は、本明細書中で使用する場合、「レンチウイルス」および「レンチウイルスベクター」がそれぞれ含まれることを意味する。レトロウイルスベクターが試験されており、広範な標的細胞のゲノムへの目的の遺伝子の安定な導入に適切な送達ビヒクルであることが見出されている。レトロウイルスベクターが非再構成の単一コピーの導入遺伝子を細胞に送達させる能力により、レトロウイルスベクターが細胞への遺伝子の移入に十分に適するようになる。さらに、レトロウイルスは、宿主細胞上の特異的細胞表面受容体へのレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質の結合によって宿主細胞に侵入する。この結果として、コードした未変性エンベロープタンパク質が未変性エンベロープタンパク質と異なる細胞特異性を有する（例えば、未変性エンベロープタンパク質と比較して異なる細胞表面受容体に結合する。）異種エンベロープタンパク質に置換される偽型レトロウイルスベクターはまた、本発明の実施で有用であり得る。１つ以上の標的タンパク質コード配列をコードするレトロウイルスベクターの特異的標的細胞への送達を指示する能力は、本発明の実施で望ましい。
本発明は、レトロウイルスベクター（例えば、１つ以上の導入遺伝子配列を含むレトロウイルス導入ベクターおよび１つ以上のパッケージングエレメントを含むレトロウイルスパッケージングベクターが含まれる。）を提供する。特に、本発明は、偽型レトロウイルスの産生のための異種または機能的に改変されたエンベロープタンパク質をコードする偽型レトロウイルスベクターを提供する。
本発明のレトロウイルスベクターのコア配列は、多種多様なレトロウイルス（例えば、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型レトロウイルスが含まれる。）ならびにスプーマウイルスおよびレンチウイルスに容易に由来し得る（ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８５を参照のこと。）。本発明の組成物および方法での使用に適切なレトロウイルスの例には、レンチウイルスが含まれるが、これに限定されない。本発明の組成物および方法での使用に適切な他のレトロウイルスには、トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス形成ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスが含まれるが、これに限定されない。特に好ましいマウス白血病ウイルスには、４０７０Ａおよび１５０４Ａ（Ｈａｒｔｌｅｙ ａｎｄ Ｒｏｗｅ．１９７６．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９：１９−２５）、エーベルソン（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ−９９９）、フレンド（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ−２４５）、グラフィ、グロス（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ−５９０）、クリステニハーベイ肉腫ウイルスおよびローシャー（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ−９９８）ならびにモロニーマウス白血病ウイルス（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ−１９０）が含まれる。かかるレトロウイルスを、寄託機関または保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）など）から容易に入手することができるか、市販の技術を使用して公知の供給源から単離することができる。その他は市販されている。
１つの実施形態では、本発明のレトロウイルスベクター配列は、レンチウイルスに由来し得る。好ましいレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、１型または２型（即ち、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２。ＨＩＶ−１は以前にリンパ節腫関連ウイルス３（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）関連ウイルス（ＡＲＶ）と呼ばれていた。））または同定され、ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ様疾患に関連しているＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に関連する別のウイルスである。他のレンチウイルスには、ヒツジビスナ・マエディウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシレンチウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）およびヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）が含まれる。
レトロウイルスの適切な属および菌株は当該分野で周知である（例えば、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ｓｅｅ ｅ．ｇ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ５８，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ １７６８−１７７１（論文中の表１を含む。）（本明細書中で参照により援用される。）を参照のこと。）。レトロウイルスを産生する産生細胞株および産生細胞株生成のためのレトロウイルスパッケージング系ならびにかかるパッケージング系の作製方法も当該分野で公知である。
典型的なパッケージング系は、少なくとも２つのパッケージングベクター（ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子またはｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列を含む第１のパッケージングベクターならびに異種または機能的に改変されたエンベロープ遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列を含む第２のパッケージングベクター）を含む。レトロウイルスエレメントは、レンチウイルス（ＨＩＶなど）に由来し得る。ベクターは、機能的ｔａｔ遺伝子および／または機能的アクセサリー遺伝子（ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｎｅｆ）を欠き得る。系は、さらに、ｒｅｖ遺伝子を含むヌクレオチド配列を有する第３のパッケージングベクターを含むことができる。パッケージング系を、第１、第２、および任意選択的に第３のヌクレオチド配列を含むパッケージング細胞の形態で提供することができる。
実施形態では、種々の発現系、特に、真核細胞、有利には哺乳動物細胞を使用した発現系に適用可能である。未変性タンパク質をグリコシル化する場合、好ましい実施形態は、発現されるタンパク質を未変性様グリコシル化させる発現系を含むことができる。
レンチウイルスは、幾つかのビリオン構造タンパク質（一般に、ｅｎｖ遺伝子によってコードされるエンベロープ糖タンパク質ＳＵ（ｇｐ１２０）およびＴＭ（ｇｐ４１）、ｇａｇ遺伝子によってコードされるＣＡ（ｐ２４）、ＭＡ（ｐ１７）およびＮＣ（ｐ７−１１）ならびにｐｏｌ遺伝子によってコードされるＲＴ、ＰＲおよびＩＮが含まれる。）を共有する。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２は、ウイルスＲＮＡの合成およびプロセシングならびに他の複製機能の制御に関与するアクセサリータンパク質および他のタンパク質を含む。ｖｉｆ遺伝子、ｖｐｒ遺伝子、ｖｐｕ／ｖｐｘ遺伝子およびｎｅｆ遺伝子によってコードされるアクセサリータンパク質を、組換え系から除外（または不活化）することができる。さらに、ｔａｔおよびｒｅｖを、例えば変異または欠失によって除外または不活化することができる。
第１世代のレンチウイルスベクターパッケージング系は、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖのための個別のパッケージング構築物を提供し、典型的には、安全上の理由で異種または機能的に改変されたエンベロープタンパク質を使用する。第２世代レンチウイルスベクター系では、アクセサリー遺伝子（ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆ）が欠失しているか不活化されている。第３世代のレンチウイルスベクター系は、ｔａｔ遺伝子が欠失しているかそうでなければ不活化している（例えば、変異による。）系である。
通常はｔａｔによって得られる転写制御の代わりに、強力構成性プロモーター（ヒトサイトメガロウイルス最初期（ＨＣＡＡＶ−ＩＥ）エンハンサー／プロモーターなど）の使用によって転写制御することができる。他のプロモーター／エンハンサーを、当該分野で理解されているように、構成性プロモーター活性の強さ、標的組織に対する特異性（例えば、肝臓特異的プロモーター）または望ましい発現の調節に関する他の因子に基づいて選択することができる。例えば、幾つかの実施形態では、発現を調節するために誘導性プロモーター（ｔｅｔなど）を使用することが望ましい。ｒｅｖをコードする遺伝子を、典型的な第３の世代のレンチウイルスベクター系が４つのプラスミド（ｇａｇｐｏｌ、ｒｅｖ、エンベロープおよび導入ベクターについてそれぞれ１つ）を含むように個別の発現構築物上に提供することができる。使用したパッケージング系の世代と無関係に、ｇａｇおよびｐｏｌを、単一の構築物上または個別の構築物上に提供することができる。
典型的には、パッケージングベクターをパッケージング細胞中に含め、トランスフェクション、形質導入または感染によって細胞内に導入する。トランスフェクション方法、形質導入方法または感染方法は、当業者に周知である。本発明のレトロウイルス導入ベクターを、トランスフェクション、形質導入または感染によってパッケージング細胞株に導入して、産生細胞または細胞株を生成することができる。本発明のパッケージングベクターを、標準的な方法（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションが含まれる。）によってヒト細胞または細胞株内に導入することができる。幾つかの実施形態では、パッケージングベクターを、優性選択マーカー（ｎｅｏ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、グルタミンシンテターゼまたはＡＤＡなど）と共に細胞内に導入し、その後に適切な薬物の存在下で選択し、クローンを単離する。選択マーカー遺伝子を、パッケージングベクターによってコードされる遺伝子に物理的に連結することができる。
パッケージング機能が適切なパッケージング細胞によって発現されるように作製されている安定な細胞株は公知である。例えば、パッケージング細胞を記載しているＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，６８６，２７９およびＯｒｙ ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１１４００−１１４０６を参照のこと。安定な細胞株の産生についてのさらなる説明を、Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：８４６３−８４７１およびＺｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０に見出すことができる。
Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：８７１−７５は、ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を含むｐｏｌの３’側の配列が欠失されたレンチウイルスパッケージングプラスミドを教示している。構築物はｔａｔ配列およびｒｅｖ配列を含み、３’ＬＴＲはポリＡ配列に置換されている。５’ＬＴＲ配列およびΨ配列は、別のプロモーター（誘導性プロモーターなど）に置換される。例えば、ＣＭＶプロモーターまたはこの誘導体を使用することができる。
パッケージングベクターは、レンチウイルスタンパク質発現を増強し、安全性を強化するようなパッケージング機能にさらに変化することができる。例えば、ｇａｇ上流の全ＨＩＶ配列を除去することができる。また、エンベロープの下流配列を除去することができる。さらに、ＲＮＡのスプライシングおよび翻訳を増強するようにベクターを改変することを取ることができる。
任意選択的に、条件的パッケージング系を使用する（Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．１９９８．前出に記載のパッケージング系など）。例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０に記載のように、ＨＩＶ−１長末端反復（ＬＴＲ）の欠失によってベクターのバイオセーフティを改善する自己不活化ベクター（ＳＩＮ）の使用も好ましい。誘導性ベクター（テトラサイクリン誘導性ＬＴＲなどによる。）も使用することができる。
プロモーター
実施形態では、本発明のベクターは、典型的には、異種調節配列（構成性プロモーター（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭＯＭＬＶ ＬＴＲおよびＰＧＫ プロモーターなど）、組織または細胞型特異的プロモーター（ｍＴＴＲ、ＴＫ、ＨＢＶ、ｈＡＡＴが含まれる。）、調節性または誘導性のプロモーター、エンハンサーなどが含まれるが、これらに限定されない。）を含む。
一定の有用なプロモーターには、ＬＳＰプロモーター（ＩＩＩ ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ８Ｓ２：２３−３０）、ＥＦ１−αプロモーター（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．１９９０．Ｇｅｎｅ ９１（２）：２１７−２３）およびＧｕｏ ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３（９）：８０２−１０）が含まれる。最も好ましいプロモーターには、伸長因子１−α（ＥＦ１ａ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルス最初期遺伝子（ＣＭＶ）プロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰｓ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターおよびＣＫ６プロモーターが含まれる。本発明の実施で有用な有益なプロモーターは、アデノウイルス主要後期プロモーターである（Ｂｅｒｋｎｅｒ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ．１９８５．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：８４１−８５７）。関連プロモーターの構造および機能に関する情報は当該分野で公知である。関連配列を、公的なデータベースから容易に入手し、本発明の態様の実施で用いるベクターに組み込むことができる。
本発明の実施で特に好ましいプロモーターは、アデノウイルス主要後期プロモーターである。発現カセットは、５’→３’方向で、アデノウイルス主要後期プロモーター、目的のタンパク質または目的のタンパク質鎖の第１のコード配列に作動可能にした３成分からなるリーダー配列、自己プロセシング配列またはプロテアーゼ切断配列をコードする配列、目的のタンパク質またはタンパク質鎖の第２のコード配列、および、任意選択的に、自己プロセシング配列またはプロテアーゼ切断配列をコードする配列、その後に目的のタンパク質またはタンパク質鎖の第３のコード配列を含むことができる。これらの全コード配列を、翻訳がポリタンパク質コード配列内で終結しないように同一リーディングフレーム中に共有結合する。タンパク質合成中またはポリペプチド合成の完了後、自己プロセシングまたはタンパク質分解性プロセシングは、ポリタンパク質を適切なタンパク質鎖またはタンパク質に切断する。免疫グロブリン合成の場合、軽鎖のコード配列は、ポリタンパク質コード配列内に２回存在する。有益には、リーダー配列のコード領域を、タンパク質またタンパク質鎖の配列に会合することができ、シグナルペプチダーゼによるプロセシングは、プロセシング部位の下流のタンパク質のＮ末端で一定の残存アミノ酸残基を除去するというさらなる利点を得ることができる。免疫グロブリン重鎖の成分は、Ｍｅｔ（タンパク質開始メチオニン）、ＨＣ（重鎖）、ＬＣ（軽鎖）、ＳＰＰＣ（自己プロセシングまたはプロテアーゼ切断部位）である。免疫グロブリン合成のための発現構築物には以下が含まれ得る：Ｍｅｔ−プロテアーゼ−ＳＰＰＣ−ＨＣリーダー配列−ＨＣ−ＳＰＰＣ−ＬＣリーダー配列−ＬＣ−ＳＰＰＣ−ＬＣリーダー配列−ＬＣ、Ｍｅｔ−プロテアーゼ−ＳＰＰＣ−ＬＣリーダー配列−ＬＣ−ＳＰＰＣ−ＬＣリーダー配列−ＬＣ−ＳＰＰＣ−ＨＣリーダー配列−ＨＣ、Ｍｅｔ−プロテアーゼ−ＳＰＰＣ−ＬＣリーダー配列−ＬＣ−ＳＰＰＣ−ＨＣリーダー配列−ＨＣ−ＳＰＰＣ−ＬＣリーダー配列−ＬＣ、ＨＣリーダー配列−ＨＣ−ＳＰＰＣ−ＬＣリーダー配列−ＬＣ−ＳＰＰＣ−ＬＣリーダー配列−ＬＣ、ＬＣリーダー配列−ＬＣ−ＳＰＰＣ−ＨＣリーダー配列−ＨＣ−ＳＰＰＣ−−ＬＣリーダー配列−ＬＣ、ＬＣリーダー配列−ＬＣ−ＳＰＰＣ−ＬＣリーダー配列−ＬＣ−ＳＰＰＣ−ＨＣリーダー配列−ＨＣ、Ｍｅｔ−プロテアーゼ−ＳＰＰＣ−ＨＣリーダー−ＨＣ−ＳＰＰＣ−ＬＣリーダー−ＬＣ。
抗体を含む生物治療分子（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）
本発明の範囲内で、特定の発現した抗体（免疫グロブリン）には、とりわけ、以下に特異的に結合する抗体が含まれ得る：腫瘍壊死因子（ヒューミラ／Ｄ２Ｅ７に対応し、および／または由来する操作抗体、Ａｂｂｏｔｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｂｅｒｍｕｄａの商標はアダリムマブ）、インターロイキン−１２（ＡＢＴ−８７４由来の操作抗体）、インターロイキン−１８（ＡＢＴ−３２５由来の操作抗体）、組換えエリスロポエチン受容体（ＡＢＴ−００７由来の操作抗体）またはＥ／Ｌセレクチン（ＥＬ２４６−ＧＧ由来の操作抗体）。操作ポリタンパク質のコード配列およびアミノ酸配列は、本明細書中に開示されているか、当該分野で利用可能である。本発明に適切なさらなる抗体には、例えば、レミケード（インフリキシマブ）、リツキサン／マブセラ（Ｍａｂｔｈｅｒａ）（リツキシマブ）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、アバスチン（ベバシズマブ）、シナジス（パリビズマブ）、エルビタックス（セツキシマブ）、レオプロ（アブシキシマブ）、オルソクローン（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ）ＯＫＴ３（ムロモナブ−ＣＤ３）、ゼナパックス（ダクリズマブ）、シムレクト（バシリキシマブ）、マイロターグ（ゲムツズマブ）、キャンパス（アレムツズマブ）、ゼバリン（イブリツモマブ）、ゾレア（Ｘｏｌａｉｒ）（オマリズマブ）、ベキサール（トシツモマブ）およびラプティバ（Ｒａｐｔｉｖａ）（エファリズマブ（ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ））（一般に、商標名の後の括弧内にそれぞれの一般名を示す。）が含まれる。さらなる適切なタンパク質には、例えば、１つ以上のエポエチンアルファ、エポエチンベータ、エタネルセプト、ダルベポエチンアルファ、フィルグラスチム、インターフェロンベータ１ａ、インターフェロンベータ１ｂ、インターフェロンアルファ−２ｂ、インスリングラルジン、ソマトロピン、テイパラチド（ｔｅｒｉｐａｒａｔｉｄｅ）、フォリトロピンアルファ、ドルナーゼ、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、イミグルセラーゼ、ネシリチド（ｎｅｓｉｒｉｔｉｄｅ）、レノグラスチムおよびフォンウィルブランド因子（１つ以上の一般名は、製品の１つ以上の商標名にそれぞれ対応し得る。）が含まれる。当該分野で理解されるように、他の抗体およびタンパク質は、本発明に適切である。
本発明はまた、２つ以上の目的のポリペプチドまたはタンパク質またはプロタンパク質のコード配列の発現の調節を考慮する。遺伝子制御系は、特定の遺伝子の発現調整で有用である。１つの例示的なアプローチでは、遺伝子制御系またはスイッチは、リガンド結合ドメイン、転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを有するキメラ転写因子を含む。ドメインを、実質的に任意の供給源から得ることができ、多数の方法のうちのいずれかで組み合わせて新規のタンパク質を得ることができる。制御可能な遺伝子系はまた、キメラ転写因子と相互作用するＤＮＡ応答エレメントを含む。この転写調節エレメントを、制御すべき遺伝子と隣接して配置する。
本発明の実施で使用することができる例示的な転写制御系には、例えば、ショウジョウバエエクジソン系（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：３３４６）、カイコエクジソン系（Ｓｕｈｒ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：７９９９）、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ（Ｖａｌｅｎｔｉｓ，Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸの商標）合成プロゲステロン受容体系（誘導因子としてＲＵ４８６を使用する。）（Ｏｓｔｅｒｗａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．２００１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８（２２）：１２５９６−６０１）、ＴｅｔおよびＲｅｖＴｅｔ系（テトラサイクリン制御発現系、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡの商標）（標的の転写を制御（オンまたはオフ）する小分子（テトラサイクリン（Ｔｃ）またはアナログ（例えば、ドキシサイクリン）など）を使用する。）（Ｋｎｏｔｔ ｅｔ ａｌ．２００２．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３２（４）：７９６，７９８，８００）、ＡＲＩＡＤ制御テクノロジー（Ａｒｉａｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）（２つの細胞内分子（それぞれ、転写アクチベーターまたはＤＮＡ結合タンパク質のいずれかに連結している。）を合わせるための小分子の使用に基づく）が含まれる。これらの成分が１つになる場合、目的の遺伝子の転写が活性化される。Ａｒｉａｄは、ホモ二量体化に基づく系およびヘテロ二量体化に基づく系を有する（Ｒｉｖｅｒａ ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２（９）：１０２８−１０３２；Ｙｅ ｅｔ ａｌ．２０００．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：８８−９１）。
抗体もしくは抗体のフラグメントまたは自己プロセシングもしくはプロテアーゼ切断された組換えポリペプチドの形態の他の異種タンパク質もしくはプロタンパク質をコードする核酸配列を含む本発明の発現ベクター構築物の実施形態を、外来遺伝子、治療遺伝子または導入遺伝子の細胞（例えば、体細胞）への送達のためまたはベクター形質導入細胞による組換えポリペプチドの産生においてインビトロ、エクスビボまたはインビボで細胞に導入することができる。
宿主細胞およびベクターの送達
本発明のベクター構築物を、当該分野で公知の標準的な方法論を使用してインビトロまたはエクスビボで適切な細胞に導入することができる。かかる技術には、例えば、リン酸カルシウムを使用したトランスフェクション、培養細胞への微量注入（Ｃａｐｅｃｃｈｉ．１９８０．Ｃｅｌｌ ２２：４７９−４８８）、エレクトロポレーション（Ｓｈｉｇｅｋａｗａ ｅｔ ａｌ．１９８８．ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：７４２−７５１）、リポソーム媒介遺伝子移入（Ｍａｎｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．１９８８．ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：６８２−６９０）、脂質媒介形質導入（Ｆｅｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．１９８７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７）および高速微粒子銃を使用した核酸送達（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．１９８７．Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０−７３）が含まれる。
インビトロまたはエクスビボ発現のために、機能的タンパク質産物の発現に有効な任意の細胞を使用することができる。タンパク質発現のために使用される細胞および細胞株の多数の例が当該分野で公知である。例えば、原核細胞および昆虫細胞を発現のために使用することができる。さらに、真核微生物（酵母など）を使用することができる。原核生物系、昆虫系および酵母系における組換えタンパク質の発現は、当該分野で一般に公知であり、本発明の組成物および方法を使用した抗体または他のタンパク質の発現に適応させることができる。
発現に有用な細胞の例には、さらに、哺乳動物細胞（線維芽細胞など）、非ヒト哺乳動物由来の細胞（ヒツジ、ブタ、マウスおよびウシの細胞など）および昆虫細胞などが含まれる。哺乳動物細胞の具体例には、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ ＤＸ Ｂ１１細胞、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞、ＰｅｒＣ．６細胞、Ｓｐ２／０細胞、２９３細胞、ＮＳＯ細胞、３Ｔ３線維芽細胞、Ｗ１３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＰＧ２細胞およびＭＤＣＫ細胞が含まれるが、これらに限定されない。
宿主細胞を、プロモーターの誘導、形質転換体の選択または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切なように修正された従来の栄養培地中で培養する。哺乳動物宿主細胞を、種々の培地中で培養することができる。市販の培地（ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ １６４０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ）（Ａｌｐｈａ Ｍｅｄｉｕｍ）およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）など）は、典型的には、宿主細胞の培養に適切である。所与の培地に、一般に、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質、微量元素およびグルコースまたは等価なエネルギー源を補足する。任意の他の必要な補助因子を、当業者に周知の適切な濃度で含めることもできる。特定の細胞株に適切な培養条件（温度およびｐＨなど）は当該分野で一般に公知であり、例えば、ＡＴＣＣカタログ（インターネット上の「ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ＳｅａｒｃｈＣａｔａｌｏｇｓ／ＡｌｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ．ｃｆｍ」で利用可能）中または販売者が説明する多数の細胞株の培養のための培養条件が提案されている。
発現ベクターを、種々の経路（例えば、皮内、静脈内、腫瘍内、脳内、門脈内、腹腔内、筋肉内、膀胱内など）によってインビボで投与して自己プロセシング切断配列を介して連結した複数の遺伝子を送達させて、動物モデルまたはヒト被験体において２つ以上のタンパク質またはポリペプチドを発現させることができる。投与経路に応じて、治療タンパク質は、この効果を局所的に（脳内または膀胱）または全身に（他の投与経路）引き出すことができる。オープンリーディングフレームに対して５’側の組織特異的プロモーターの使用により、全オープンリーディングフレームによってコードされたタンパク質またはポリペプチドの組織特異的発現が起こる。
インビトロ、エクスビボまたはインビボで導入遺伝子を保有する組換え発現ベクターを標的細胞に導入する種々の方法は以前に記載されており、当該分野で周知である。本発明は、目的の２つ以上のタンパク質またはポリペプチドのコード配列を含む組換えベクターをターゲティングされた細胞に感染させ、ターゲティングされた細胞中でタンパク質またはポリペプチドを発現させることによる治療方法、ワクチンおよび癌治療を提供する。
例えば、本発明の組換えベクターのインビボ送達を、広範な種々の器官型（脳、肝臓、血管、筋肉、心臓、肺および皮膚が含まれるが、これらに限定されない。）にターゲティングすることができる。
エクスビボ遺伝子移入の場合、標的細胞を宿主から取り出し、本発明の組換えベクターおよび当該分野で周知の方法を使用して研究室内で遺伝子操作する。
本発明の組換えベクターを、従来の投与様式（上記の様式が含まれるが、これらに限定されない。）を使用して投与することができる。本発明の組換えベクターは、種々の処方物（溶液および懸濁液、微小胞、リポソームおよび注射液または注入液（ｉｎｆｕｓｉｂｌｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が含まれるが、これらに限定されない。）中に存在し得る。好ましい形態は、投与様式および治療的適応に依存する。
実施形態では、インビボでの免疫グロブリンまたは他の生物学的に活性なタンパク質の産生における発現ベクター構築物の利点には、患者における長期間および持続した抗体発現のための単一ベクターの投与、完全な生物活性を有する抗体または抗体のフラグメント（または他の生物学的に活性なタンパク質）のインビボ発現およびヒト細胞中に生成された抗体の天然の翻訳後修飾が含まれる。望ましくは、発現したタンパク質は、発現したタンパク質を複数回投与するか、必要とする患者において連続的に発現した場合に免疫応答が減少するか誘発されないように、天然に存在するタンパク質と同一であるか十分に同一である。
本発明の組換えベクター構築物の実施形態は、さらに、治療または研究で用いる組換え抗体および他の生物学的に活性なタンパク質のインビトロ産生で有用である。組換えタンパク質の産生方法は当該分野で周知であり、本明細書中に記載の自己プロセシング切断部位または他のプロテアーゼ切断部位を含有するベクター構築物を使用した組換え抗体の発現のために使用することができる。
１つの態様では、本発明は、発現ベクター（上記など）を細胞に導入してトランスフェクションされた細胞を得ることによる組換え免疫グロブリンまたはグロブリンのフラグメントの産生方法を提供する。ここで、ベクターは、５’→３’方向に免疫グロブリン重鎖および２つの軽鎖またはこれらのフラグメントのコード配列に作動可能に連結したプロモーター、各鎖の間の自己プロセシング配列を含む。いずれかの免疫グロブリン重鎖のコード配列または免疫グロブリン軽鎖のコード配列が所与のベクター構築物内の自己プロセシング配列に対して５’側（即ち、第１）であり得ると認識される。
抗体のための構築物の１つの実施形態では、抗体または免疫グロブリンまたはこれらのフラグメントの第１または第２の鎖をコードする配列は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＡ由来の重鎖またはフラグメントを含む。広く述べられているように、抗体または免疫グロブリンまたこれらのフラグメントの鎖をコードする配列には、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＡ由来の軽鎖またはこのフラグメントも含まれる。本発明の実施形態は、全抗体分子およびこれら分子の改変形態または誘導形態（例えば、他の抗原認識分子のフラグメント（Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）およびＦ（ａｂ’）２など）が含まれる。）のタンパク質に対応する遺伝子に関する。抗体およびフラグメントは、動物由来であるか、ヒトマウスキメラであるか、ヒト化されているか、デイムニゼーション（Ｄｅｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ）（商標）（Ｂｉｏｖａｔｉｏｎ Ｌｔｄ）によって変更されているか、Ｆｃ受容体に対する親和性を変化させるために変更されているか、完全にヒトであり得る。リガンド結合分子の実施形態を、当該分野で理解されているように親和性成熟させることができる。好ましい実施形態では、抗体または他の組換えタンパク質は、投与されるヒトまたは動物において免疫応答を誘発しないか、誘起が最小である。
抗体は二重特異性抗体であり得、ジアンチボディ（ｄｉａｎｔｉｂｏｄｙ）、クアドローマ、ミニ抗体（ｍｉｎｉ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ＳｃＢｓ抗体およびノブズ−イントゥ−ホールズ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）抗体が含まれるが、これらに限定されない。
抗体自体の産生および回収を、当該分野で周知の種々の方法で行うことができる（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．１９８８．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。他の目的のタンパク質を、当業者に周知の方法に従って回収および／または精製および／または使用する。
本発明の実施形態の実施では、組換えＤＮＡテクノロジーを使用した抗体または抗体の変種（アナログ）を、宿主細胞の成長およびコード配列の発現に適切な培養条件下での改変組換え宿主細胞の培養によって産生することができる。発現の成功をモニタリングするために、抗原に対する抗体レベルを、標準的技術（ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡなど）を使用してモニタリングすることができる。当該分野で公知の標準的な技術を使用して、培養上清から抗体を回収する。これらの抗体の精製形態を、勿論、標準的な精製技術（プロテインＡカラム、プロテインＧカラムもしくはプロテインＬカラムによるアフィニティクロマトグラフィが含まれるが、これらに限定されない。）によるか、特異性が望まれる特定の抗原に関するか、さらに抗原の特定のエピトープに関して容易に調製することができる。抗体を、従来のクロマトグラフィ（イオン交換カラム、疎水性相互作用カラム、親和性カラムまたはサイズ排除カラムなど）を使用して当該分野で理解されているように精製することもできる。精製技術を開示している、１９９７年６月２４日付のＲｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ，ｅｔ ａｌ．のＵＳ５，６４１，８７０（発明の名称「抗体精製のための低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィ」）および２００８年９月２３日付のＳｈｕｋｌａ，ｅｔ ａｌ．のＵＳ７，４２７，６５９（発明の名称「疎水性相互作用クロマトグラフィによる流出画分中のタンパク質の精製過程」）も参照のこと。精製技術を、他のテクノロジー（硫酸アンモニウム沈殿およびサイズ制限（ｓｉｚｅ−ｌｉｍｉｔｅｄ）膜濾過など）との種々の組み合わせまたは併用して行うことができる。シグナルペプチドを含むように発現系をデザインする場合、得られた抗体は培養培地または上清中に分泌されるが、細胞内産生も可能である。細胞内の内容物を回収し、精製に供することができる。
ポリタンパク質の所望のプロセシングレベル（例えば、最も完全なプロセシング）を促進する細胞培養条件を選択することができる。細胞培養過程の間または後に、かかるプロセシングは細胞内で起こり得るが、細胞外でも起こり得る。
ヒトＩｇ遺伝子座を用いて操作したマウス由来の抗原特異性の完全なヒトモノクローナル抗体の産生および選択は以前に記載されている（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３１：３３−４２；Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．１９９５．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ６：５６１−５６６；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９４．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｖｏｌ．７：１３−２１）。
トランスジェニックヤギの乳汁中で治療モノクローナル抗体が高レベルで発現されており、抗原結合レベルが従来の細胞培養テクノロジーを使用して産生されたモノクローナル抗体の抗原結合レベルと等価であることが示されている。この方法は、トランスジェニック動物が乳汁中にヒト治療タンパク質を発現することを可能にする遺伝情報を有するトランスジェニック動物の乳汁中でのヒト治療タンパク質の発生に基づく。一旦ヒト治療タンパク質が産生されると、これらの組換えタンパク質を、標準的なテクノロジーを使用して乳汁から効率的に精製することができる。例えば、Ｐｏｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．１９９９．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３１：１４７−１５７およびＹｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｒｅｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９（６）：６０９−６１０を参照のこと。トランスジェニック動物由来の動物乳、卵白、血液、尿、精漿およびカイコの繭は、産業規模での組換えタンパク質の産生のための供給源として有望であることが証明されている（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ Ｌ Ｍ．２００２．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １３：６２５−６２９；Ｌｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．２０００．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ，２１（８）：３６４−７０およびＧｕｒａ Ｔ．２００２．Ｎａｔｕｒｅ，４１７：５８４−５８６０）。本発明は、自己プロセシング切断部位および／またはプロテアーゼ認識部位をコードする本発明のベクターを使用した組換え抗体または変種（アナログ）または目的の他のタンパク質の発現のためのトランスジェニック動物発現系の使用を考慮する。
アグロバクテリウム感染、遺伝子銃形質転換およびプロトプラスト形質転換などによって形質転換された植物（ジャガイモ、トマト、タバコ、イネおよび他の植物）中での組換えタンパク質の産生も首尾よく証明されている。トランスジェニックタバコ植物の種子中での組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ発現および植物中での単鎖抗体を含む抗体の発現が証明されている。例えば、Ｓｔｒｅａｆｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｈｏｗａｒｄ．２００３．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．３３：４７９−９３；Ｓｃｈｉｌｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．２００３．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６０：４３３Ａ５；Ｐｏｇｕｅ ｅｔ ａｌ．２００２．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．４０：４５−７４およびＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ．２００３．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２７８：９５−１０４を参照のこと。本発明は、プロテアーゼ切断部位または自己プロセシング切断部位をコードする本発明のベクターを使用した組換え免疫グロブリンまたはこのフラグメントまたは目的の他のタンパク質の発現のためのトランスジェニック植物発現系の使用を考慮する。
昆虫細胞と併せたバキュロウイルスベクター発現系はまた、組換えタンパク質産生のための生存可能なプラットフォームとして広く受け入れられている。バキュロウイルスベクター発現系は、哺乳動物細胞培養と比較した利点（培養の容易さおよびより高い発現レベルなど）が報告されている。例えば、Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．２００２．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．６：５−１１およびＩｋｏｎｏｍｏｕ ｅｔ ａｌ．２００３．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６２：１−２０を参照のこと。本発明は、さらに、自己プロセシング切断部位をコードする本発明のベクターを使用した組換え免疫グロブリンまたはこのグロブリンのフラグメントの発現のためのバキュロウイルスベクター発現系の使用を考慮する。バキュロウイルスベクターおよび適切な宿主細胞は、当業者に周知であり、市販されている。
自己プロセシング切断部位をコードする本発明のベクターを使用した組換え免疫グロブリンまたはグロブリンのフラグメントまたは目的の他のタンパク質の発現のために、酵母ベースの系（２または３ハイブリッド系が含まれる。）を使用することもできる。例えば、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，６４３，７４５（本明細書中で参照により援用される。）を参照のこと。
自己プロセシングペプチドのみのコード配列またはさらなるタンパク質分解性切断部位のコード配列との組み合わせを含む本発明の発現カセットおよびベクターおよび組換え宿主細胞が任意のタンパク質発現系（この多くが当該分野で公知であり、この例を本明細書中に記載している。）における２または３ハイブリッド系の組換え免疫グロブリンまたはグロブリンのフラグメント、プロタンパク質、生物学的に活性なタンパク質およびタンパク質成分の発現で有用であると理解される。当業者は、本発明のベクター、宿主細胞および方法の実施形態を任意のタンパク質発現系での使用に容易に適合させることができる。
［実施例１］
Ｌｏｎプロテアーゼインテインおよび発現構築物
３つのＡＴＰ依存性Ｌｏｎプロテアーゼインテインが、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）インテインデータベース（ＩｎＢａｓｅ，Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ；ａｔ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂ／ｉｎｔｅｉｎｓ．ｈｔｍｌ）に報告されている。Ｐｅｒｌｅｒ，Ｆ．Ｂ．（２００２）．ＩｎＢａｓｅ，ｔｈｅ Ｉｎｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０，３８３−３８４を参照のこと。これらのインテインは、生物パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）（ＰａｂＬｏｎインテイン）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（ＰｆｕＬｏｎインテイン）およびパイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）ＯＴ３（Ｐｈｏ Ｌｏｎインテイン）に由来していた。これらのＬｏｎインテインでは、エンドヌクレアーゼドメイン、インテインの最後から２番目の残基としてヒスチジンの代わりにリジンが存在することおよび長さが異なること（それぞれ、３３３、４０１および４７４アミノ酸）が提案されている。ＮＥＢデータベースでは、３つ全てのｌｏｎインテインが理論上のインテインとして示されており、データベースによれば、リストの貢献者はスプライシングされた産物の存在が所与のインテインエントリーについて証明されていることを示していなかったことを示す。ＰａｂＬｏｎインテインのエンドヌクレアーゼドメインが実験的に活性を持たないことが見出されたことが注目される（Ｓａｖｅｓ Ｉ，Ｍｏｒｌｏｔ Ｃ，Ｔｈｉｏｎ Ｌ，Ｒｏｌｌａｎｄ ＪＬ，Ｄｉｅｔｒｉｃｈ Ｊ，Ｍａｓｓｏｎ ＪＭ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｆｏｕｒ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ ｉｎｔｅｉｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００２ Ｏｃｔ １；３０（１９）：４１５８−６５）。
本発明者らは、遺伝子のＡＴＰ依存性プロテアーゼｌｏｎファミリー中に含まれるインテインが種々のシングルオープンリーディングフレーム構築物デザインにおける抗体の重鎖および軽鎖の切断の媒介で非常に有効であることを発見した。これらのインテインに関連する配列情報を本明細書中に示す。
Ｌｏｎインテイン配列およびベクター構築物デザイン
表１は、ＰａｂＬｏｎインテイン（ＮＣＢＩ／タンパク質における受入番号ＣＡＢ５０４８６．１、ＰＡＢ１３１３ ＰａｂＬｏｎインテイン（−１および＋１エクステイン残基を含む。））についてのタンパク質配列情報（配列番号１）を提供する。
Figure 2013509188
表２は、コドン使用頻度に対して最適にしたＰａｂＬｏｎインテインのヌクレオチド配列を記載している。
Figure 2013509188
表３は、配列番号２によってコードされるタンパク質配列（配列番号３）を記載している。
Figure 2013509188
表４は、ＰｆｕＬｏｎインテイン（ＮＣＢＩ／タンパク質における受入番号ＡＡＬ８０５９１．１、ＰＦ０４６７（−１および＋１エクステイン残基を含む。））についてのタンパク質配列情報（配列番号４）を提供する。
Figure 2013509188
表５は、未変性ＰｆｕＬｏｎインテインについてのヌクレオチド配列情報（配列番号５）を提供する。
Figure 2013509188
表６は、配列番号５によってコードされるタンパク質配列（配列番号６）を記載している。
Figure 2013509188
ＰｆｕＬｏｎインテインを、ＰＣＲ技術を使用してクローン化した。ＰａｂＬｏｎインテインヌクレオチド配列を、哺乳動物コドン使用頻度に従ったデザインによって合成した。パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｉｉ）のｌｏｎプロテアーゼインテインのタンパク質配列を、Ｉｎｂａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓが後援する公的に企画されたインテインデータベース）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂ／ｉｎｔｅｉｎｓ．ｈｔｍｌ）から入手した。得られたタンパク質配列を、ＥＭＢＬ受入番号ＣＡＢ５０４８６．１、ｇｉ５４５９０００として列挙しているが、ウェブサイト上に列挙したタンパク質配列を使用した。Ｐａｂ−ｌｏｎインテインタンパク質配列を表７に示す。
Figure 2013509188
このＰａｂ−ｌｏｎタンパク質配列を、独自の方法を使用したＧｅｎｅＡｒｔ（ＧｅｎｅＡｒｔ ＡＧ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、哺乳動物発現用に最適化されたＤＮＡ配列に逆翻訳（ｂａｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｅ）した。得られたＰａｂ−ｌｏｎインテインＤＮＡ配列を表８に示す。ＤＮＡ構築物により、特定のクローニングベクターおよび発現ベクターならびに従来の技術を使用した対応する分子生物学アプローチの選択に応じて、さらなる隣接アダプターを任意選択的に得ることができると認識される。ＤＮＡ配列を、９９９ｂｐフラグメントとして合成し（ＧｅｎｅＡｒｔ合成番号０６１１４６７）、ＧｅｎｅＡｒｔベクタープラスミドｐＧＡ４中に送達させた。ｈｔｔｐ：／／ｐａｒｔｓｒｅｇｉｓｔｒｙ．ｏｒｇのＲｅｇｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｐａｒｔｓ（Ｐａｒｔ：ＢＢａ＿Ｊ７０００３が含まれる。）を参照のこと。得られたＤＮＡ材料を再度配列決定し、デザインした配列に対応すると判断した。このＤＮＡ材料をその後のＰａｂ−ｌｏｎインテイン含有プラスミド構築物の供給源／テンプレートとして直接使用し、プラスミドは再度増殖されなかった。
Figure 2013509188
以下の哺乳動物発現ベクターを構築した：ｐＴＴ３−ｐｆｕ ｌｏｎ ＨＬ（＋）、ｐＴＴ３−ｐｆｕ ｌｏｎ ＨＬ（−）、ｐＴＴ３−ｐｆｕ ｌｏｎ ＬＨ（＋）、ｐＴＴ３−ｐｆｕ ｌｏｎ ＬＨ（−）、ｐＴＴ３−ｐｆｕ ｌｏｎ ＬＫＨ（＋）、ｐＴＴ３−ｐｆｕ ｌｏｎ ＬＫＨ（−）、ｐＴＴ３−ｐａｂ ｌｏｎ ＨＬ（＋）、ｐＴＴ３ ｐａｂ ｌｏｎ ＨＬ（−）、ｐＴＴ３−ｐａｂ ｌｏｎ ＬＨ（＋）、ｐＴＴ３−ｐａｂ ｌｏｎ ＬＨ（−）、ｐＴＴ３−ｐａｂ ｌｏｎ ＬＫＨ（＋）、ｐＴＴ３−ｐａｂ ｌｏｎ ＬＫＨ（−）。ここで、Ｈ成分およびＬ成分は、Ｄ２Ｅ７と命名した抗体の免疫グロブリン重鎖および軽鎖を示す。ｐＴＴ３ ｐａｂ ｌｏｎ ＨＬ（−）構築物の略図については図１を参照のこと。図２は、Ｄ２Ｅ７抗体を発現することができるこれらの一過性発現ベクターのｓＯＲＦ成分の構造の態様を図示している。
ｐＴＴ３ベクターが特定の実施形態を示すにもかかわらず、さらなる実施形態は１つ以上の本明細書中に開示のタンパク質をコードする単離核酸に関係する態様を含むことができる。さらなる実施形態は、前記ベクターがｐｃＤＮＡ、ｐＴＴ（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００２，ＶｏＩ ３０，Ｎｏ．２：Ｅ９）、ｐＴＴ３、ｐＥＦＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．ａｎｄ Ｎａｇａｔａ，Ｓ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ １８，Ｎｏ．１７：５３２２）、ｐＢＶ、ｐＪＶおよびｐＢＪからなる群から選択される単離核酸配列を含むベクターを提供する。上述の通り、種々の構築物をｐＴＴ３ベクター骨格上に作製した。このベクターは、浮遊培養においてトランスフェクションされた２９３Ｅ細胞（エプスタイン・バーウイルス核抗原１を発現する。）中にエピソームを増幅することが可能なＥＢＶ複製起点を有する。ベクターｐＴＴについて記載しているＤｕｒｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．を参照のこと。ｐＴＴと比較して、２００５年７月７日に出願されたＧｈａｙｕｒ，Ｔａｒｉｑ ｅｔ ａｌ．のＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ２００５０１４７６１０に示されるように、ｐＴＴ３はさらなる多重クローニング部位を有する。
各ｐＴＴ３ベースのベクターは、ＣＭＶプロモーターによって制御される１つのＯＲＦを有していた。ＯＲＦ中で、インテイン配列を、抗体の重鎖と軽鎖との間（それぞれ、ＨＣとＬＣとの間、または単純にＨとＬとの間）にＨＣ−インテイン−ＬＣまたはＬＣ−インテイン−ＨＣの順序にてインフレームで挿入した。「ＨＬ」表記を有する構築物は、抗体ＨＣコード配列を有し、この配列にインテインが続き、その後にＬＣコード配列が続く。「ＬＨ」表記を有する構築物は、ＬＣコード配列を有し、この配列にインテインが続き、その後にＨＣコード配列が続く。「ＬＫＨ」表記を有する構築物は、ＬＣとインテインとの間に挿入されたリジン（Ｋ）を有する。「（−）」表記を有する構築物は、ＯＲＦのはじめに１つのシグナルペプチドを有し、インテインの最後のアミノ酸と成熟抗体の重鎖または軽鎖の最初のアミノ酸との間に挿入されたメチオニンを有し、インテインが続く。「（＋）」表記を有する構築物は、ＯＲＦのはじめに１つのシグナルペプチドを有し、インテインの下流に存在する抗体サブユニットのはじめに第２のシグナルペプチドを有する。
構築物を、一過性トランスフェクションによって２９３Ｅ細胞に導入した。簡潔に述べれば、ＯＲＦ構築物およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をコードするｐＴＴ３ベクターを使用して複合体を調製した。ＰＥＩ−ＤＮＡ複合体を使用して、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞をトランスフェクトした（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：Ｅ９を参照のこと）。細胞および培養上清を、トランスフェクションの４から７日後に分析のために回収した。
構築物によるタンパク質発現。複数の一過性発現実験では、培養上清サンプルを、トランスフェクションの７日後または８日後に回収した。サンプルをＥＬＩＳＡによって評価し、ＩｇＧの測定値由来の分泌型抗体の含有レベルまたは含有範囲を以下に示す。
Figure 2013509188
上記の一連の構築物と同一の抗体を発現し、同一の制御エレメントを使用する従来の２ベクター系を、コントロールとしてこれらの実験に含めた（表の最終行を参照のこと。）。従って、コントロールベクターは、２つの個別のｐＴＴ３ベクター中に保有された２つの個別のＯＲＦ由来の抗体の重鎖および軽鎖の従来の導入アプローチを使用してＤ２Ｅ７抗体を発現した。このコントロールベクター系から得られた抗体分泌レベルは、表中に示すように１０から６０μｇ／ｍｌの範囲であった。
Ｌｏｎインテインを使用した幾つかのｓＯＲＦ構築物デザインによって得られたＩｇＧ分泌レベルは、従来のコントロールベクターを使用して得たレベルと比較して同一の範囲であるかより高い。これらのレベルは、哺乳動物細胞で１．６μｇ／ｍｌと報告された「２Ａ」テクノロジーを使用して得られたレベルより有意に高い（Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：５８４−５９０）。ＰａｂＬｏｎインテインおよびＰｆｕＬｏｎインテインの両方を構築物デザインで使用して所望の抗体産生レベルを得ることができる一方で、記載のｐＴＴ３構築物中のＰａｂＬｏｎインテインは、より高い抗体分泌レベルを得ることが可能であった。これらのデータはまた、一般に、ＬＨ構築物デザインを使用する場合よりもＨＬ構築物デザインを使用する場合に抗体分泌レベルが高いことを示唆している。免疫グロブリン鎖の順序の特徴とシグナル配列の態様との組み合わせにより、ＨＬ（−）構築物は、研究した構築物のうちで最高レベルの分泌型抗体産物を生成することができた。
発現産物のさらなる特徴付け
表９中に列挙した一定のｓＯＲＦ構築物を、発現の態様（発現産物の分析が含まれる。）に関してさらに特徴付けた。これらの構築物は、比較的高レベルの分泌型抗体を産生した以下の４つの例を含んでいた：ｐＴＴ３ ｐｆｕ ｌｏｎ ＨＬ（−）、ｐＴＴ３ ｐｆｕ ｌｏｎ ＨＬ（＋）、ｐＴＴ３ ｐｆｕ ｌｏｎ ＬＫＨ（−）およびｐＴＴ３ ｐａｂ ｌｏｎ ＨＬ（−）。これらの構築物から産生された分泌型抗体を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィによって精製し、還元および非還元のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、これらのＨＬおよびＬＣのＮ末端アミノ酸配列を決定した。
ｐＴＴ３ ｐｆｕ ｌｏｎ ＨＬ（−）を使用して産生されたサンプルは抗体ＨＣ、抗体ＬＣおよび完全にアセンブリされた抗体に対応するゲル移動バンド（非還元ゲルによる。）を含んでおり、移動度は従来のベクター（上記のコントロールＤ２Ｅ７ベクターなど）を使用した伝統的な方法によって産生された抗体と区別することはできなかった。還元ゲル上に、抗体のＨＣおよびＬＣに対応するバンドに加えて、２つのより高い分子量（ＭＷ）のバンドも存在しており、これらはプロセシングされなかった３成分からなるタンパク質（ＨＣ−インテイン−ＬＣ）および部分的にプロセシングされたＨＣ−インテイン融合物に対応しているようであった。この評価は、ウェスタンブロット分析および質量分析に基づいていた。これら２つのバンドの存在量は培養条件に依存するようであり、培養条件の修正によって減少し得る。これらのより高いＭＷの産物を、本明細書中に提供され、および／または当該分野で理解されていると考えられる他の記載に従った方法を使用して完全にプロセシングされた抗体製剤原料から都合良く取り出すことができる。
ｐＴＴ３ ｐｆｕ ｌｏｎ ＨＬ（＋）を使用して産生されたサンプルは、抗体ＨＣ、抗体ＬＣおよび完全抗体に対応するバンド（非還元ゲルによる。）を含んでおり、移動度は伝統的な方法によって産生された抗体と区別することはできなかった。さらに、３成分からなるポリタンパク質に対応する１つのより高いＭＷのバンドが存在していた。ｐＴＴ３ ｐｆｕ ｌｏｎ ＬＫＨ（−）を使用して産生したされたサンプルはまた、ＨＣ、ＬＣおよび完全抗体に対応するバンド（非還元ゲルによる。）を含んでおり、移動度は従来のベクターを使用して産生された抗体と区別することはできなかった。還元ゲル上に、ＨＣおよびＬＣに対応するバンドに加えて、２つのより高いＭＷバンドも存在していた。これらのうちの第１のバンドは、他のベクターデザインについて上に記載のように３成分からなるポリタンパク質に対応し、第２のバンドはＬＣ−インテイン融合産物（このジャンクションでの不完全な切断に起因する。）に対応していた。産物の相対存在量に関して、ＬＣ−インテイン融合物は切断されたＬＣと同量のようであった。
ｐＴＴ３ ｐａｂ ｌｏｎ ＨＬ（−）を使用して産生されたサンプルは、ＨＣ、ＬＣおよび完全抗体に対応するバンド（非還元ゲルによる。）を含んでおり、移動度は伝統的な方法によって産生された抗体と区別することはできなかった。還元ゲル上に、ＨＣおよびＬＣに対応するバンドに加えて、１つの主要なより高いＭＷのバンドが存在し、このバンドはウェスタンブロット分析に基づいてプロセシングされなかった３成分からなるタンパク質に対応しているようであった。ｐＴＴ３ ｐｆｕ ｌｏｎ ＨＬ（−）を使用して産生されたサンプルと比較して、この３成分からなるより高いＭＷのバンドの量は比較的少なかった。この結果は、本発明者らのベクターデザインにおいてＰｆｕ ｌｏｎインテインおよびＰａｂ ｌｏｎインテインが同種であり、機能的に類似していても、Ｐａｂ ｌｏｎ構築物からの発現後に認められるＨＣ−インテイン融合はほとんど存在しないため、Ｐａｂ ｌｏｎ媒介性のＮ末端切断はＰｆｕ ｌｏｎによって媒介されるＮ末端切断より完全であることを示唆している。しかし、両構築物が完全にアセンブリされた抗体産物を得ることができるということが留意される。
一方では、プロセシングされなかったタンパク質および部分的にプロセシングされたタンパク質のような一定のタンパク質産生物は、他の構築物の産生物（完全にプロセシングされ、完全に自己アセンブリされた抗体産物など）と比較して夾雑物を含む産物と見なし得る。他方では、かかる一定のタンパク質産生物は、例えば、依然として完全抗体産物を生成することができるさらなるプロセシング反応および／または定方向のアセンブリのための材料として有用であり得る。これらのタンパク質産生物が夾雑物を含む副産物と見なされる場合、記載のように除去を容易にし、これにより、所望の成分（完全抗体など）を富化または精製するための選択肢およびアプローチが存在する。
種々の構築物の発現系由来の培養上清の細胞外サンプルに加えて、細胞内サンプルも得て、ＨＣおよびＬＣの両方に対する特異性を有する検出抗体を使用したウェスタンブロット分析によって分析した。培養上清サンプル中にタンパク質種について記載のような類似のタンパク質種が認められた。
種々の構築物の重鎖産物および軽鎖産物の両方のＮ末端アミノ酸配列を決定した（以下の表を参照のこと。）。結果は、インテイン媒介性タンパク質切断が２つのスプライシングジャンクション（即ち、ＨＣおよびインテイン成分のジャンクションおよびＬＣおよびインテイン成分のジャンクション）で正確に起こることを示していた。
Figure 2013509188
Ｌｏｎインテイン構築物由来のＩｇＧ１抗体の機能的性質
表９のｓＯＲＦ構築物デザイン由来の分泌型Ｄ２Ｅ７抗体産物も、抗原特異的ＥＬＩＳＡによって分析した。分析結果は、構築物の抗体産物がヒトＴＮＦα（Ｄ２Ｅ７抗体のリガンド）に結合することを証明していた。従って、インテインベースの構築物および発現系は、ｓＯＲＦ産物を発現および生成して機能的および抗原特異的な完全に自己アセンブリされた多量体抗体を得ることができる。
ｐＴＴ３ ｐｆｕ ｌｏｎ ＨＬ（−）構築物を使用して産生された抗体を、プロテインＡアフィニティ精製およびその後のＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィ）によって精製した。精製した抗体を、ＢｉａＣｏｒｅ（商標）システムを使用した表面プラズモン共鳴テクノロジーによって分析した。ｓＯＲＦ構築物の産生物の特徴付けは、関連リガンドＴＮＦαへのこの結合の態様を含んでいた。表１１では、会合速度定数（ｋａ、単位１／Ｍｓ）；解離速度定数（ｋｄ、単位１／ｓ）および平衡解離定数（ＫＤ、単位Ｍ）の動態パラメータに関するＢｉａＣｏｒｅ分析由来の値の結果を示す。解離定数値（ＫＤ）は、従来のベクター（２つの異なる免疫グロブリン鎖ＯＲＦｓを有する。）を使用して産生されたアダリムマブ（Ｄ２Ｅ７）抗体の値に類似すると理解される。
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［実施例２］
軽鎖配列の異形を有する抗体を産生するｓＯＲＦ構築物
幾つかのｓＯＲＦ構築物を、Ｄ２Ｅ７の免疫グロブリン軽鎖由来の異形である軽鎖配列を使用して生成した。これらのｓＯＲＦ構築物を、重鎖を使用してＤ２Ｅ７と同様に操作した。従って、ＩｇＧ１抗体材料を産生することができた。構築物ｐＴＴ３ ｐｆｕ ｌｏｎ ＨＬ（−）およびｐＴＴ３ ｐａｂ ｌｏｎ ＨＬ（−）を骨格として使用して、本発明者らは、Ｃ末端スプライシングジャンクション（即ち、インテインと下流免疫グロブリン軽鎖成分との間のジャンクション）で配列異形を有する構築物を生成し、試験した（表１２を参照のこと）。一定の構築物の分泌型免疫グロブリンを、プロテインＡアフィニティ精製によって精製し、還元および非還元のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。細胞内サンプルも、ＨＣおよびＬＣの両方に対する抗体を使用したウェスタンブロット分析によって分析した。例えば、図３および図４を参照のこと。
図３は、ｓＯＲＦ発現産物のタンパク質分析のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの結果を図示している。分泌型ＩｇＧ分子を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィによって精製し、非還元条件下（Ａ）および還元条件下（Ｂ）でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分離した。レーンおよびサンプルは左から右に以下である：（レーン１）ＭＷマーカー；（２）コントロール構築物の産物（非ｓＯＲＦ発現系由来のＤ２Ｅ７抗体）；（３）Ｐａｂ−ｌｏｎ ｍｕｔ Ａ１；（４）Ｐａｂ−ｌｏｎ ｍｕｔ Ａ２；（５）ｐＴＴ３ ｐｆｕ ｌｏｎ ＹＰおよび（６）ｐＴＴ３ ｐｆｕ ｌｏｎ ＭＡ。
図４は、さらなるｓＯＲＦ発現産物のタンパク質分析のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの結果を図示している。分泌型ＩｇＧを、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィによって精製し、非還元条件下（Ａ）および還元条件下（Ｂ）でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分離した。レーンおよびサンプルは左から右に以下である：（レーン１）ＭＷマーカー；（２）コントロールＤ２Ｅ７産物；（３）ｐＴＴ３ ｐｆｕ ｌｏｎ ＨＬ（−）および（４）ｐＴＴ３ ｐｆｕ ｌｏｎ ＭｕｔＡ。
Figure 2013509188
表１２の構築物によって産生された免疫グロブリンの分泌レベルを表１３に示す。成熟軽鎖のＮ末端のアミノ酸を決定し、部分的配列の特徴付けの結果を示す。
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結果
これらの構築物について、＋１位（インテインの直後）での異なるＡＡ残基の使用は抗体の分泌量の一因のようであった。この位置でのアミノ酸残基Ｈ、Ｙ、Ｒ、Ｖ、Ｑ、Ａ、ＮおよびＭの使用により、比較的より高い抗体発現レベルが得られた。軽鎖のＮ末端アミノ酸についての分析（表１３）により、インテインのＣ末端での完全および正確な切断が示唆された。構築物ｐＴＴ３ ｐｆｕ ｌｏｎ ＨＬ（−）およびｐＴＴ３ ｐａｂ ｌｏｎ ＨＬ（−）によって産生された抗体に類似して、プロセシングされたＨＣおよびＬＣは、アセンブリされた完全抗体も同様に、分泌型タンパク質種の大部分を占めた。しかし、構築物ｐＴＴ３ ｐｆｕ ｌｏｎ ＭｕｔＢなどのようにアミノ酸であるアスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）をインテインの直後に使用した場合、抗体はほとんど分泌されなかった。この構築物によって産生された細胞内タンパク質を分析した。Ｄがインテイン後の第１のアミノ酸である場合、Ｃ末端スプライシングジャンクションでの切断はほとんどなく、これによって抗体ＬＣはほとんど得られず、比較的大量のインテイン−ＬＣ融合タンパク質が得られると判断された。
κアイソタイプ可変領域（Ｖκ）の成熟生殖系列の軽鎖のアミノ酸配列は一般にＤ、Ｅ、Ｎ、ＡまたはＶから始まり、λアイソタイプ（Ｖλ）のアミノ酸配列は一般にＱ、Ｓ、ＬまたはＮから始まる。本発明者らの結果から、抗体産生のためにＰａｂ ｌｏｎまたはＰｆｕ ｌｏｎインテインを使用したｓＯＲＦベクターの実施形態には、任意のアミノ酸から始まるＬＣを有するｓＯＲＦベクターが含まれる。好ましい実施形態では、より高い効率で完全なプロセシングを達成するために、ＬＣはＤまたはＥ（かかるアミノ酸が効力のある選択肢として役立ち得る場合でも）以外のアミノ酸から始まる。
本発明者らは、インテインとインテインから下流の成熟抗体ＬＣとの間の領域がＮ末端スプライシングジャンクションでの切断効率に寄与するようであるということを見出した。例えば、本発明者らは、構築物ｐＴＴ３ ｐｆｕ ｌｏｎ ＨＬ（−）およびｐＴＴ３ ｐｆｕ ｌｏｎ ＭｕｔＡの産生物を比較した。ｐＴＴ３ ｐｆｕ ｌｏｎ ＨＬ（−）を使用した場合にＮ末端スプライシングジャンクションでの切断が完全でなく、いくらか部分的にプロセシングされたＨＣ−インテイン融合タンパク質が得られる一方で、構築物ｐＴＴ３ ｐｆｕ ｌｏｎ ＭｕｔＡを代わりに使用した場合にタンパク質種の量は有意に減少する（図２を参照のこと）。従って、種々の構築物が所望の産物の生成で有用であり得る一方で、一定の構築物は、特に望ましい産物（例えば、完全にプロセシングされ、自己アセンブリされた多量体の分泌型抗体）を比較的より高い収率で生成する能力などの特質を有し得る。
［実施例３］
ｓＯＲＦ構築物のインテイン成分のためのさらなる選択肢
メタノコッカス・ヤナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）およびパイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）由来のｋｌｂＡ遺伝子のインテイン
本発明者らは、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）種およびパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）種など由来のｋｌｂＡ遺伝子のインテインを含むｓＯＲＦ構築物のためのさらなるインテインの選択肢を調査した。本発明者らは、ｋｌｂＡ遺伝子中に含まれるインテインもタンパク質の発現およびプロセシング（種々のシングルオープンリーディングフレーム構築物デザイン中の抗体の重鎖および軽鎖の切断状況が含まれる。）の媒介のための効率的な選択肢であることを発見した。
特に、本発明者らは、メタノコッカス・ヤナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）（Ｍｊａ ｋｌｂＡインテイン）、パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）（Ｐａｂ ｋｌｂＡインテイン）およびパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ ｋｌｂＡインテイン）由来のｋｌｂＡインテインを試験した。最初の２つの生物由来のインテインはミニインテイン（エンドヌクレアーゼドメインを欠く。）であるのに対して、Ｐｆｕ ｋｌｂＡはフルサイズのインテインである。未変性インテインタンパク質セグメントの配列長は、それぞれ、１６８、３３３および５２２アミノ酸である。これらのインテインに関連する配列情報を、以下の表中に提供する。従って、インテイン、改変インテインおよび構築物を、発現系のために作製する。
ＫｌｂＡインテイン配列およびベクター構築物のデザイン
Ｍｊａ ｋｌｂＡのヌクレオチド配列を、哺乳動物コドン使用頻度が相対的に最適化されるように改変した。表１４は、このように改変されているメタノコッカス・ヤナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）のＭｊａ ｋｌｂＡインテイン遺伝子についての核酸配列情報を提供している（配列番号３４）。表１５は、Ｍｊａ ＫｌｂＡインテインセグメントについてのタンパク質配列情報を提供している。ＮＣＢＩ中の受入番号Ｑ５８１９１／タンパク質ＭＪ０７８１も参照のこと。表１６は、未変性配列と比較してコドン使用頻度の態様に関して改変されたＰａｂ ｋｌｂＡインテイン遺伝子についての核酸配列情報を提供している。未変性配列については、Ｐａｂ ＫｌｂＡインテインについてのＮＥＢ Ｉｎｂａｓｅ情報の受入番号（ＮＣＢＩ中のＢ７５０５０／タンパク質、ＰＡＢ１４５７）を参照のこと。この情報源に従って、表示のタンパク質のアミノ酸配列を、−１および＋１エクステイン残基（それぞれＧおよびＣのようである。）を含むように示す。表１７は、Ｐａｂ ＫｌｂＡインテインタンパク質セグメントについてのアミノ酸配列情報を提供している。表１８は、Ｐｆｕ ｋｌｂＡインテイン遺伝子（未変性）についての核酸配列情報を提供している。表１９は、Ｐｆｕ ＫｌｂＡインテインタンパク質セグメントについてのアミノ酸配列情報を提供している。ＮＣＢＩの受入番号ＡＥ０１０２１１も参照のこと。
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本発明者らは、哺乳動物コドン使用頻度を使用した配列を有するＭｊａ ｋｌｂＡインテインおよびＰａｂ ｋｌｂＡインテインのヌクレオチド配列を合成した。以下の哺乳動物発現ベクターを構築する：ｐＴＴ３−Ｐａｂ ｋｌｂＡ ＨＬ（−）；ｐＴＴ３−Ｐａｂ ｋｌｂＡ ＨＬ（＋）；ｐＴＴ３−Ｐａｂ ｋｌｂＡ ＬＨ（−）；ｐＴＴ３−Ｍｊａ ｋｌｂＡ ＨＬ（−）；ｐＴＴ３−Ｍｊａ ｋｌｂＡ ＨＬ（＋）；ｐＴＴ３−Ｍｊａ ｋｌｂＡ ＬＨ（−）。本明細書中の他の場所に記載のように、これらの構築物を、ＰＴＴ３ベクター骨格上に作製した。Ｐｆｕ ｋｌｂＡインテインのヌクレオチド配列は未変性配列であり、ｐＴＴ３−Ｐｆｕ−ｋｌｂＡ−ＨＬ（＋）も構築した。
Ｌｏｎプロテアーゼインテインを使用する構築物について示すように、「ＨＬ」表記を有する全ての構築物は、抗体免疫グロブリン重鎖（ＨＣ）コード配列を有し、この配列にインテインセグメントが続き、その後に軽鎖（ＬＣ）コード配列が続く。同様に、「ＬＨ」表記を有する全ての構築物は、抗体ＬＣコード配列を有し、この配列にインテインセグメントが続き、その後にＨＣコード配列が続く。「（−）」表記を有する構築物は、ＯＲＦのはじめに１つのシグナルペプチドを有し、インテインセグメントの最後のアミノ酸とエクステインセグメント（例えば、成熟抗体の重鎖または軽鎖）の下流の最初のアミノ酸との間に挿入されたメチオニンを有し、インテインが続く。「（＋）」表記を有する構築物は、ＯＲＦのはじめに１つのシグナルペプチドを有し、インテインの下流に存在する抗体サブユニットのはじめに第２のシグナルペプチドを有する。
種々のＫｌｂＡインテインセグメントおよび立体配置を有する構築物を、一過性トランスフェクション技術によって２９３Ｅ細胞に導入した。トランスフェクションの７から８日後、培養上清を、ＥＬＩＳＡを使用したＩｇＧレベルの測定によって分泌型抗体について分析した。各構築物発現系のサンプル１ｍｌあたりのマイクログラムを単位にした値を使用したこれらの結果については、表２０を参照のこと。
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本発明者らは、構築物ｐＴＴ３−Ｐａｂ ｋｌｂＡ ＨＬ（−）およびｐＴＴ３−Ｍｊａ ｋｌｂＡ ＨＬ（−）によって発現された分泌型抗体産物を精製し、分析した。抗体産物をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィによって精製し、還元条件下および非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動技術によって特徴付けた。図５を参照のこと。非還元条件下では、これら２つのベクター由来の培養上清サンプルは主に単一バンドとして移動したが、コントロール抗体と比較して明らかに分子量が大きかった。還元条件下では、本発明者らは、これら２つのベクター由来の培養上清サンプルが抗体ＬＣおよびＨＣ−インテイン融合成分にサイズで対応する検出可能なバンドを含んでいることを見出した。ＩｇＧ１ Ｆｃまたはκ軽鎖に対するいずれかの抗体を使用した対応する免疫ブロットは、これらのバンドの特徴付けと一致する。これらの結果は、Ｃ末端スプライシングジャンクションで比較的効率的に切断されるが、Ｎ末端スプライシングジャンクションでの切断は効率がより低いか概してさらにほとんど切断しないことを示唆している。しかし、切断効率が完全に満たない構築物および発現系を考慮しても、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖サブユニットはアセンブリすることができ、完全なＩｇＧ抗体分子として分泌できるようになった。
Ｎ末端インテインスプラインシングジャンクションでのＫｌｂインテインの改変
Ｎ末端スプライシングジャンクションでの切断についての上記の結果を考慮して、本発明者らは、切断効率を増強するためのさらなる試みに従事した。本発明者らは、これら２つのインテイン（Ｐａｂ ｋｌｂＡおよびＭｊａ ｋｌｂＡ）のそれぞれの第１のアミノ酸がシステイン（Ｃｙｓ；Ｃ）の代わりにアラニン（Ａｌａ；Ａ）であることに留意した。本発明者らは、システインが他のインテイン系における求核試薬として機能することができる残基であることを理解している。本発明者らは、免疫グロブリンＨＣセグメントの末端でのインテイン上流のｋｌｂＡエクステインを起源とする１つのアミノ酸（グリシン）の導入と組み合わせたこの位置での求核性アミノ酸（システイン）の再導入の効果を試験した。これらのさらなる構築物のタンパク質セグメントについての配列情報を提供している表２１を参照のこと。表は、未変性Ｐａｂ ｋｌｂａインテイン、Ｐａｂ ｋｌｂａ ＨＬ（−）構築物（この文脈ではＷＴという）およびＮ末端スプライシングジャンクションに変異を有する３つの構築物（Ｐａｂ ｋｌｂａ ＨＬ（−）ＧＣ、Ｐａｂ ｋｌｂａ ＨＬ（−）ＧＡおよびＰａｂ ｋｌｂａ ＨＬ（−）ＫＣ）の２つのスプライシングジャンクションでのアミノ酸残基を提供している。アスタリスク（＊）は、変種アミノ酸残基が変異体構築物中に導入されている位置を示す。これらの構築物のうちで、Ｐａｂ−ｋｌｂＡ ＨＬ（−）ＧＣは、Ｎ末端インテインジャンクションで、効率的な切断でタンパク質を発現およびプロセシングする能力を示した。一定の構築物由来のＩｇＧタンパク質の発現およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図示している図６も参照のこと。
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ベクター生成のための材料と方法：Ｐａｂ−ｋｌｂＡ ＨＬ（−）変種ＧＡ、ＧＣおよびＫＣの構築
一定のベクター構築物の幾つかの変種形態を生成した。Ｐａｂ−ｋｌｂＡ ＨＬ（−）変異体ＧＡ、ＧＣおよびＫＣをＰＣＲによって構築した。順方向プライマーＨＣ−Ｆおよび逆方向プライマーＨｉｎｔ−Ｒを使用して重鎖の３’末端をＰＣＲ増幅させてＰＣＲ産物＃１を生成した。順方向プライマーＧＡ−Ｆ、ＧＣ−ＦおよびＫＣ−Ｆは、所望の変異および重鎖の３’末端の相補配列を含んでいた。プライマーＧＡ−Ｆ、ＧＣ−ＦまたはＫＣ−Ｆおよび逆方向プライマーであるインテイン−Ｒ−２を使用してＰａｂ−ｋｌｂＡインテインの５’末端を増幅してＰＣＲ産物＃２を産生した。次いで、ＰＣＲ産物＃１および＃２を、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを使用して精製した。精製したＰＣＲ産物を共にアニーリングし、アウトサイドプライマーＨＣ−Ｆおよびインテイン−Ｒ−２を使用して増幅してＰＣＲ産物＃３を生成した。ベクターＰａｂ−ｋｌｂＡ ＨＬ（−）を、制限酵素ＳａｃＩＩおよびＲｓｓＩＩを使用して消化し、次いで、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを使用して精製した。ＰＣＲ産物＃３を、Ｍａｘｉｍｕｍ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ５α細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中での相同組換えによってＰａｂ−ｋｌｂＡ−ＨＬ（−）（ＳａｃＩＩおよびＲｓｓＩＩを使用して切断した。）にサブクローン化した。正確な変異を保有する形質転換体を、コロニーＰＣＲおよびその後の配列決定によって決定した。正確なクローン由来のＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉキットを使用して増幅および精製した。プライマー配列を以下の表中に示す。
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［実施例４］
安定なベクターおよびｓＯＲＦ構築物を発現する細胞株の生成
安定な発現ベクターおよびかかるベクターを発現する細胞株を、ｓＯＲＦ構築物の実施形態を使用して作製することができる。例として、ＰａｂＬｏｎインテインを有するｓＯＲＦを含む安定な発現ベクターを、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞株中に安定にトランスフェクションした。本発明者らは、エレメント（ＣＭＶエンハンサー、アデノウイルス主要後期プロモーター、ＳＶ４０ポリＡ配列、ガストリン転写ターミネーター、ＳＶ４０プロモーターによって駆動されるＤＨＦＲコード配列および一過性発現系で使用したｐＴＴ３ ｐａｂ ｌｏｎ ＨＬ（−）中のＯＲＦと同一のＯＲＦが含まれる。）を使用して安定なｓＯＲＦ発現ベクターをデザインおよび調製した。ｓＯＲＦ構築物ｐＡ１９０−Ｐａｂ−ｌｏｎ ＨＬ（−）をこのようにして調製した。この構築物は、安定な発現ベクターとして使用することができる（図７を参照のこと。）。さらなる構築物を同様に調製した。
リン酸カルシウムトランスフェクション技術を使用して、ｐＡ１９０構築物をＣＨＯ細胞に導入し（ＣＨＯ Ｂ３．２と命名）、２００細胞／ウェルの密度で４８個の９６ウェルプレートのＭＥＭおよび５％ＦＢＳを含む選択培地中にプレートした。トランスフェクションプレートを、細胞成長／コロニーおよびＩｇＧ分泌についてモニタリングした。
ｓＯＲＦ安定発現ベクターｐＡ１９０−Ｐａｂ−ｌｏｎ ＨＬ（−）由来の３０クローンおよびコントロール安定発現ベクターｐＡ１９０トランスフェクション反応由来の３２クローンのサンプリングを選択し、成長させた。この段階で、ＩｇＧ分泌レベルを増幅させていない選択したクローンについて評価し、２０ｎＭ メトトレキサート（ＭＴＸ）での増幅後にもこのレベルを評価した。安定な発現系のために、ｓＯＲＦベクターは、有意な頻度で成長陽性ウェル生成し（全４６０８ウェルのうち２３０４の陽性ウェル）、これらのウェルは相当な数（２３０４のうちの４４３）および比率（１９％）のＩｇＧ分泌陽性のサンプルを有していた。約２９個の選択されたクローンについて１２ウェルプレート中で０ｎＭ ＭＴＸを使用した条件下でのＩｇＧ分泌レベルは、約０．３から約２．５マイクログラム／ｍｌ培養上清の範囲であった。２０ｎＭ ＭＴＸを使用した条件下で、約２４個の選択したクローンについてのＩｇＧ分泌レベルは約０．１から約６マイクログラム／ｍｌの範囲であり、選別したクローンの約半分が２μｇ／ｍｌを超える分泌レベルを示した。ｓＯＲＦ構築物クローンの接着培養容器中でのコンフルエンシーが比較的迅速に示されたことにも留意した。例えば、２０ｎＭ ＭＴＸを使用した接着培養では、ＳＯＲＦクローンはより迅速に成長し、従来のベクタークローンより早くコンフルエンスに到達した。２０ｎＭ ＭＴＸ中での第１継代で、従来のベクター由来のクローンの２８％が６日以内（４日、５日、または６日のいずれか）にコンフルエンシーに到達したのに対して、ｓＯＲＦ ｐａｂ ｌｏｎベクター由来のクローンの７７％が６日以内にコンフルエンシーに到達した（図８を参照のこと。）。これらのデータは、従来のベクターと比較して安定な発現系の作製（ＣＨＯ細胞株を作製する目的が含まれる。）においてｓＯＲＦ発現ベクター使用の大きな利点を示唆している。ｓＯＲＦクローンはまた、１００ｎＭ ＭＴＸを使用した直接増幅条件下で有利なレベルの抗体分泌を示した。ある実験では、１００ｎＭ ＭＴＸに曝露した１６クローンのＩｇＧ分泌レベルは平均で６ｕｇ／ｍｌであり、上位５つのクローンは平均して１２ｕｇ／ｍｌであり、最も高いクローンの産生レベルは２４ｕｇ／ｍｌであった。以下の表は、各増幅ことで最も高い発現レベルを有するＭＴＸ増幅を使用した結果を示す。値を、ｐＡ１９０−Ｐａｂ−ｌｏｎ−ＨＬ（−）構築物を有する種々のクローンについてマイクログラム／ｍｌのＩｇＧで示す。
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安定な発現系のための材料と方法
Ｈ／Ｔおよび１０％透析ＦＢＳを補足したＡｌｐｈａ ＭＥＭ中で培養したチャイニーズハムスター卵巣細胞を、リン酸カルシウム共沈手順を使用して発現ベクターを用いてトランスフェクションした。Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｕｎｉｔ １６．２３：Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ＣＨＯ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｍ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．，ｅｄｓ；Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），２：１６．２３．１を参照のこと。翌日、細胞を室温でトリプシン／ＥＤＴＡを使用して移入し、５％透析ＦＢＳを補足したＡｌｐｈａ−ＭＥＭ（α−ＭＥＭ＋５％ ｄＦＢＳ）（発現ベクター由来のＤＨＦＲを発現するトランスフェクションした細胞に選択性を示す成長培地）中に再懸濁した。選択を生き抜いた培養上清を、ヒトＩｇＧγ鎖に特異的なＥＬＩＳＡを使用してスクリーニングした。最高のＥＬＩＳＡシグナルを与えた細胞株を、ＭＴＸを含むα−ＭＥＭ＋５％ ｄＦＢＳ中で培養した。ＭＴＸは、ベクターの増幅に起因してより高いレベルの酵素を産生する細胞を選択するＤＨＦＲのインヒビターである。細胞株を、種々のＭＴＸ濃度で培養し、抗体発現についてモニタリングした。
実施形態では、本発明の組成物および方法は、ｐＡ２０５ベクター構築物またはこの誘導体（例えば、２００８年１０月２日出願のＧｉｏｎ ｅｔ ａｌ．のＵＳ２００８０２４１８８３に記載）を使用することができる。
従って、安定な細胞発現系を、種々のｓＯＲＦデザインおよび構築物を使用して生成する。特に、ｓＯＲＦ系は、生物学的治療薬（抗体分子など）の発現のためのＣＨＯプラットフォームの取り込みに十分に適合している。
［実施例５］
ｓＯＲＦ構築物中のインテインＣ末端スプライシングジャンクションの態様の特徴付け
本発明者らは、ｓＯＲＦ構築物中のインテインＣ末端スプライシングジャンクションの態様を調査した。本発明者らは、Ｃ末端スプライシングジャンクションでの切断効率に影響を及ぼし得るインテイン下流の第１のアミノ酸およびスプライシングジャンクションの長さに関する態様を一部特徴付けるために約４０の新規の構築物を生成した。これらのさらなる構築物は、軽鎖ジャンクション変異の異形を有していた。概要として、本発明者らは軽鎖のＮ末端またはＮ末端付近の残基に注目し、１位のメチオニン（Ｍｅｔ１）および２位のアスパラギン酸（Ａｓｐ２）をそれぞれ全２０種の可能な天然アミノ酸残基と置換した。図９を参照のこと。これら２つの一連の軽鎖ジャンクション変異構築物は、ＨＣ−インテイン−ＬＣ立体配置でＤ２Ｅ７抗体コード配列およびＰａｂＬｏｎインテインセグメントを使用した。
構築物を、２９３細胞にトランスフェクションした。一過性発現により、ほとんどのＭｅｔ置換構築物を使用して高ＩｇＧ力価を得た。多数のこれらの構築物はこの位置にＭｅｔを有するコントロール構築物よりも高い発現レベルを得た。図１０を参照のこと。Ａｓｐ置換構築物から、一般に、より低い抗体発現レベルが得られた。図１１を参照のこと。
ポリタンパク質のプロセシング効率を調査した。例えば、図１２を参照のこと。Ｍｅｔの異形に基づいた構築物のライブラリーは、前述のＰａｂ Ｌｏｎ ＨＬ（−）構築物と同様に、ポリタンパク質由来のＨＣおよびＬＣの両方の効率的なプロセシングを得た。Ａｓｐの異形に基づいた構築物のライブラリーは、Ｃ末端プロセシングが比較的不十分なようであり、ＬＣをほとんど生成せず、相当量のインテイン−ＬＣ融合タンパク質種を生成した。この不完全な切断の結果は、スプライシングジャンクションでのアミノ酸の性質と無関係であると解釈され、従って、１つのアミノ酸単位の全体的な長さの相違に関連するようである。しかし、比較的非効率な構築物でさえも依然として幾つかのＩｇＧ産物を産生することができるということが留意される。
ある実験では、メチオニン−異形ライブラリー中の２０構築物のうちの１０構築物由来のＩｇＧ抗体産物をさらに分析した。サンプルをプロテインＡアフィニティクロマトグラフィを使用してバッチ精製し、軽鎖成分を質量分析（分子量評価が含まれる。）によって分析した。質量分析の結果は、インテイン媒介反応によって生じる正確な切断を使用した構築物デザインで操作した場合に一定の構築物（Ｐａｂ ｌｏｎ Ｍ１ Ａ、Ｐａｂ ｌｏｎ Ｍ１ Ｄ、Ｐａｂ ｌｏｎ Ｍ１ Ｅ、Ｐａｂ ｌｏｎ Ｍ１ Ｆ、Ｐａｂ ｌｏｎ Ｍ１ Ｇ、Ｐａｂ ｌｏｎ Ｍ１ Ｈ、Ｐａｂ ｌｏｎ Ｍ１ Ｉ、Ｐａｂ ｌｏｎ Ｍ１ Ｋ、Ｐａｂ ｌｏｎ Ｍ１ Ｌおよび Ｐａｂ ｌｏｎ Ｍ１ Ｃ）から抗体軽鎖が形成されることを示した。Ｃｙｓを使用してＭｅｔを置換した構築物は、プロセシングがより少ないＨＣ成分およびＬＣ成分を産生し、スプライシング産物であり得る１つのタンパク質種を含んでいた。これにより、抗体軽鎖の＋１位のＣｙｓがタンパク質スプライシングをいくらか補助することができると示唆された。産生された全ての抗体軽鎖において、ＬＣの第１のアミノ酸の存在は、これらのベクターを使用して産生された抗体産物のＬＣのＮ末端領域が同種であり、ＬＣが内因性であり得るアミノペプチダーゼ活性によるプロセシングの影響を受けやすいことを証明している。
［実施例６］
ｓＯＲＦ構築物を使用した抗体ＡＢＴ−８４７の発現
本発明者らは、ヒトλ軽鎖を含む抗体を発現するように適合されたｓＯＲＦ構築物を作製した。本発明者らは、ＡＢＴ−８４７（抗原（インターロイキン−１２）に対する特異性を有する完全なヒト抗体）を使用して作業した。この抗体は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプの重鎖およびλアイソタイプの軽鎖を有する。ヒトＩＬ−１２に結合するヒト抗体および産生方法について記載された２００５年７月５日にＳａｌｆｅｌｄ、ｅｔ ａｌ．に付与されたＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ６，９１４，１２８を参照のこと。
ＡＢＴ−８７４を発現することができる５つのｓＯＲＦ構築物を、相同組換えを使用して作製した。図１３は、これらの構築物のＳＯＲＦ成分の構造を図示している。これらの構築物のうちの３つはＨＣ−インテイン−ＬＣ立体配置を有し、２つの構築物はＬＣ−インテイン−ＨＣ立体配置を有していた。これらのベクターを一過性トランスフェクションによってＨＥＫ２９３細胞に導入し、この抗体発現レベルをＩｇＧ ＥＬＩＳＡによって評価した。３つのＨＣ−インテイン−ＬＣ構築物は、培養上清サンプル中に類似の立体配置（ＨＣ−インテイン−ＬＣ）を有するがＤ２Ｅ７抗体セグメントを有する構築物に類似の抗体力価を生じた。両方の場合、ＡＢＴ−８７４およびＤ２Ｅ７のｓＯＲＦ発現系はＰａｂ Ｌｏｎ ＨＬ（−）の態様を使用した。ＬＣ−インテイン−ＨＣ立体配置でＡＢＴ−８７４抗体セグメントを有する２つの構築物は、より低いＩｇＧ力価レベルを生じた。
上清中に産生されたＩｇＧのサンプルを、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィによってバッチ精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分析した。これらの分析により、ＬＣ成分が３つ全てのＨＣ−インテイン−ＬＣ構築物中のポリタンパク質から完全にプロセシングされたことが明らかとなった。
ＩｇＧサンプルも質量分析を使用して特徴付けた。この分析により、３つのＨＣ−インテイン−ＬＣ構築物から産生されたＬＣが構築物デザインに従って適切なアミノ酸から開始されることが確認された。この結果は、立体配置中で使用したインテインによって媒介されている正確な切断と一致する。余分なメチオニン残基を持たない２つの構築物から産生されたＬＣ成分は、ＡＢＴ−８７４抗体のコントロールサンプル由来の材料の場合と同一であった。従って、Ｄ２Ｅ７抗体について行われたように改変を行うことができる一方で、かかる改変は、記載の構築物由来の発現産物中の所望のＮ末端ＬＣアミノ酸配列の獲得を考慮して任意である。質量分析も使用してＨＣの分子量を評価し、構築物デザインに従って推定ＭＷを示した。
［実施例７］
インテインベースの精製タグを使用したｓＯＲＦ構築物
本発明の実施形態では、インサートを使用して構築物をデザインする。インサートを使用する構築物の実施形態では、インサートは検出可能なシグナルを提供することができるか、結合エレメントまたは認識エレメントを得るのに有用である。本発明の実施形態では、一定の構築物関連発現産物の１つ以上のかかる産物からの分離が容易になるように構築物をデザインする。例えば、インテインスプライシング反応由来の部分的にアセンブリされたタンパク質を含む成分の混合物から完全にプロセシングされ、アセンブリされた多量体抗体産物を精製可能なようにベクターをデザインする。ＨＬ構築物の発現との関連において、Ｈ成分、インテイン成分およびＬ成分が生成される十分に効率的な切断の達成とは対照的に、Ｈ−インテイン−Ｌの構造によってＨ−インテインジャンクションまたはインテイン−Ｌジャンクションの一方または両方で不完全な切断反応を起こり、従って、Ｈ−インテイン、インテイン−Ｌまたは３成分からなるＨ−インテイン−Ｌのタンパク質副産物が生成され得る。しかし、後者の状況でさえも、インテイン成分の除去に有用であり得る。従って、インテイン切断および／またはライゲーション反応を少なくとも部分的に効率的にするためのタグ、好ましくは内部タグをインテインに備えるためのストラテジーを作製した。
本明細書中の他の場所に記載のように、ｓＯＲＦ構築物由来の培養上清サンプル中で、免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖のいずれかに結合したインテインタンパク質を含む幾つかの部分的にプロセシングされた中間体が認められた。本発明者らは、Ｐｆｕ ｌｏｎインテインおよびＰａｂ ｌｏｎインテインが内部ポリヒスチジンタグ（ＩＨＴ）を含むｓＯＲＦ構築物をデザインした。これにより、プロセシングされなかった夾雑物を迅速および効率的に分離するための組成物および方法が得られる。
本発明者らは、ペプチドまたは巨大タンパク質の挿入によってインテインを改変することができることを見出した。好ましくは、溶媒露出ループに挿入する。構造モデリングと併せた幾つかのインテインの配列アラインメントの分析により、パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）（ＰＡＢ）ＬＯＮインテインおよびパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（ＰＦＵ）ＬＯＮインテイン内に溶媒露出ループが同定された。このループは、エンドヌクレアーゼ（Ｈ）ドメインモチーフとインテインのＦ／Ｇブロックとの間に存在する（図１４を参照のこと）。図１４は、タグを含むインサートの導入のためのＨとＦ／Ｇブロックとの間の溶媒露出ループの好ましい位置（破線の矢印）と関連するインテインの一定の構造モチーフを図示している。インターネットウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｉｎｂａｓｅ／ｍｏｔｉｆｓ＿ｅｎｄｏ．ｐｈｐ（ＩｎＢａｓｅ，Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ：ＤＯＤ Ｈｏｍｉｎｇ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｍｏｔｉｆｓ；ＩｎＢａｓｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：Ｐｅｒｌｅｒ，Ｆ．Ｂ．，２００２，ＩｎＢａｓｅ，ｔｈｅ Ｉｎｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０，３８３−３８４）（一定のインテイン構造の特徴（モチーフが含まれる。）を図示する略図の情報源）で利用可能な情報も参照のこと。本発明者らは、表示したドメインの間の領域がこの溶媒露出ループ内で使用することができる多数の可能な挿入部位を許容すると判断した。上記情報源によれば、図１４において、保存残基の一定の特徴を以下に示す：ボックスで囲んだアミノ酸−標準的なスプライシング反応における求核試薬、大文字−標準的なインテイン中の保存アミノ酸、小文字−改変された機構によってスプライシングすることができる多形インテイン中のアミノ酸。
部位特異的変異誘発を使用して、本発明者らは、このループ内にポリヒスチジンアフィニティタグを挿入し、これらのインテインが機能する能力を試験した。ＩＨＴはＰＡＢ−ＬＯＮインテインやＰＦＵ−ＬＯＮインテインの自己プロセシング能を破壊せず、ポリヒスチジンタグを使用してタンパク質を精製することができ、従って、ループが溶媒露出性を示すことを示す。さらに、ＰＦＵ−ＲＩＲ１−１構造の結晶構造の試験により、アミノ末端およびカルボキシル末端の自己触媒反応を実質的または完全に破壊しない限り、任意のタンパク質をこの領域中に挿入することができると示唆される。例えば、非常に接近したアミノ末端残基およびカルボキシ末端残基を有するポリペプチドタグまたはタンパク質は、インテインの自己触媒活性を実質的に破壊しないはずである。好ましい実施形態では、タグなどのインサートを有する構築物を提供する。ここで、この構築物は、１つ以上の所望のインテイン活性（例えば、切断および／またはライゲーション）を示すことができる。従って、インテインのこの溶媒露出ループを含む構築物の成分を、多数の異なる機能的分子を作製するために改変することができる。
Ｐｆｕ ｌｏｎインテインについて、タグ配列を挿入した。好ましい挿入位置は、挿入部位上流のアミノ酸配列がＩＥＦＩＰ（ＡＡ３２３から３２７）であり、挿入部位下流のアミノ酸配列がＩＳＦＳＰ（ＡＡ３２８から３３２）である位置である。Ｐａｂ ｌｏｎインテインについて、タグ配列を挿入した。好ましい挿入位置は、挿入部位上流のアミノ酸配列がＩＩＦＤＡ（ＡＡ２９１から２９５）であり、挿入部位下流のアミノ酸配列がＧＲＬＤＶ（ＡＡ２９６から３００）である位置である。Ｐｆｕ ｌｏｎインテイン構築物およびＰａｂ ｌｏｎインテイン構築物のそれぞれにおいて、挿入したタグ配列は以下を含んでいた：ＨＨＨＨＨＨ（配列番号５６）、ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号５７）およびＨＱＨＱＨＱ（配列番号５８）。後者のタグ配列（Ｈ＝ヒスチジンおよびＱ＝グルタミン）によって証明されるように、インサートはポリヒスチジンタグ以外であり得る。当該分野で理解されるように、さらなるインサート配列を使用することができる。
ＩＨＴ改変インテインｓＯＲＦ構築物の抗体分泌レベルは、ＩＨＴ改変を用いないレベルに類似していた。この結果により、ＩＨＴ改変がインテインがｓＯＲＦ産物の自己プロセシングで機能する能力を破壊せず、ＩＨＴが正確にプロセシングされた抗体の培地への分泌を阻止することもないことが示唆される。
固定化金属アフィニティクロマトグラフィを使用して、本発明者らは、夾雑物を含むインテインをＩＨＴによってプロテインＡ精製した抗体調製物から迅速および効率的に除去することができることを証明した。これらのＩＨＴ構築物によって正確にプロセシングされた抗体を分離することができ、ｓＯＲＦ由来の生物学的製剤（治療抗体が含まれる。）の補足的な産生方法を示す。
Ｈｉｓを内部的にタグ化したｓＯＲＦ構築物を使用して、Ｄ２Ｅ７抗体分子を、ニッケルカラムクロマトグラフィ技術を使用した流出モードでインテイン含有タンパク質種から効率的に分離した。同様に、Ｐａｂ ｌｏｎ ＨＬ（−）構築物を使用して産生したＤ２Ｅ７抗体も、Ｑカラムを使用してインテイン含有タンパク質種から効率的に分離した。Ｐａｂ ｌｏｎ ＨＬ（−）から産生し、プロテインＡテクノロジーによって精製したＩｇＧサンプルおよびＰａｂ ｌｏｎ ＨＬ（−）／１０ Ｈｉｓ構築物から産生し、ｐｒｏＡおよびＮｉ−樹脂の両方によって精製したＩｇＧサンプルもＳＥＣ分画によって分析した。精製後サンプルは、単量体ＩｇＧ種の純度が改善されていた。サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）により、残存する微量の夾雑物さらに除去した。精製したＩｇＧサンプルを、特異的抗原ＴＮＦａに対する結合親和性についてＢｉａＣｏｒｅによって分析した。これらのサンプルの親和性は、従来のベクターを使用して産生されたＤ２Ｅ７抗体と区別できなかった。
［実施例８］
Ｐｈｏ ｌｏｎインテイン
パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）ＯＴ３のＰｈｏ ｌｏｎインテインのアミノ酸配列を以下に示す。Ｉｎｂａｓｅ（ＮＥＢインテインデータベース）に従ったＮＣＢＩ／タンパク質（ＰＨ０４５２）中の受入番号ＢＡＡ２９５３８．１も参照のこと。
Figure 2013509188
［実施例９］
ベクターおよび軽鎖シグナルペプチド。
タンパク質発現についてのシングルオープンリーディングフレームベクターに関連するさらなる利点を得た。実施形態では、ベクターは、哺乳動物細胞中での発現のために免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｇｕｌｉｎ）のタンパク質を使用する。かかるベクターでは、軽鎖シグナルペプチドを含む軽鎖成分の立体配置をデザインし、生成する。
シングルオープンリーディングフレーム構築物の実施形態では、未変性ヒト抗体軽鎖情報源由来のシグナルペプチドを使用する。例えば、ヒト軽鎖シグナルペプチドは、Ｖ ＢＡＳＥ（情報源（ＧｅｎｂａｎｋおよびＥＭＢＬのデータライブラリーなど）由来のヒト生殖系列可変領域の配列に関する情報のデータベースを含む。）中に報告されている。Ｖ ＢＡＳＥデータベースは、ＭＲＣタンパク質工学センター（ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ（インターネットアドレスｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／から利用可能）と提携している。Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ Ｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，Ｖｏｌ．３４，Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ Ｄ７８１−Ｄ７８４；Ｒｅｔｔｅｒ Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００５ Ｊａｎｕａｒｙ １；３３（Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ）：Ｄ６７１−Ｄ６７４も参照のこと。特定の実施形態では、種々のアミノ酸（天然アミノ酸が含まれる。）を有するＩｇＧ１抗体を産生するために使用することができる複数のベクターデザインを提供する。
一般に１９から２３アミノ酸長の範囲であり、以下の表中に示す配列（Ｈｕ Ｖｋ、ヒトκ可変領域；ＬＣＳＰ、軽鎖シグナルペプチド）を有する一定のヒト軽鎖シグナルペプチドを提供する。未変性ペプチド（ヒト起源の未変性ペプチドなど）と比較してアミノ酸の配列および／または長さが異なり得る変種ペプチドも提供する。所与のアミノ酸配列について、１つ以上の他の配列とのアラインメントと比較するためのギャップを示すことができる。１つの実施形態では、所与の軽鎖シグナルペプチドまたはこれをコードする核酸配列を提供する。１つの実施形態では、配列または配列のセグメントの合成構築物（発現ベクター、合成（化学合成など）分子または組換え発現産物など）としてアミノ酸配列または核酸配列を提供する。
Figure 2013509188
Figure 2013509188
一定のＶκシグナルペプチドを、Ｌ５（Ｅ７と命名した免疫グロブリン軽鎖（腫瘍壊死因子αに対する抗原特異性を有する抗体分子Ｄ２Ｅ７の軽鎖に対応する。）のシグナルペプチドである。）の代わりに使用した。また、Ｌ５の一定の変異体の変異ライブラリーを構築し、変異体Ｌ５ペプチドを未変性Ｌ５ペプチドの代わりに使用した。哺乳動物発現ベクターを、パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）ｌｏｎインテインを使用してＨＬ方向で構築した。以下のベクターを生成した：ｐＴＴ３−Ａ１４−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ、ｐＴＴ３−Ａ１７−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ、ｐＴＴ３−Ａ１８−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ、ｐＴＴ３−Ａ１９−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ、ｐＴＴ３−Ａ２３−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ、ｐＴＴ３−Ａ２６−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ、ｐＴＴ３−Ａ２７−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ、ｐＴＴ３−Ｂ２−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ、ｐＴＴ３−Ｂ３−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ、ｐＴＴ３−Ｌ２−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ、ｐＴＴ３−Ｌ２０−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ、ｐＴＴ３−Ｌ２５−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ、ｐＴＴ３−ｍｕｔ−１Ｒ−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ、ｐＴＴ３−ｍｕｔ−１Ｒ２Ｇ−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ、ｐＴＴ３−ｍｕｔ−２Ｒ−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ、ｐＴＴ３−ｍｕｔ−２Ｇ−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ、ｐＴＴ３−ｍｕｔ−２Ｒ２Ｇ−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ、ｐＴＴ３−ｍｕｔ−３Ｇ−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ、ｐＴＴ３−ｍｕｔ−３Ｒ２Ｇ−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ、ｐＴＴ３−ｍｕｔ−４Ｇ−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ、ｐＴＴ３−ｍｕｔ−Ｈ＋２Ｇ−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ。これらの構築物をＰＴＴ３ベクター骨格上に作製した。このベクターは、浮遊培養においてトランスフェクションされた２９３Ｅ細胞（エプスタイン・バーウイルス核抗原１を発現する細胞）中にエピソームを増幅することが可能なＥＢＶ複製起点を有する。各ベクターは、ＣＭＶプロモーターによって駆動する１つのＯＲＦを有していた。ＯＲＦ中で、インテイン配列を、抗体の重鎖と軽鎖との間にＨＣ−インテイン−ＬＣの順序にてインフレームで挿入した。ｐＴＴ３−Ａ１８−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ構築物の構造の略図を図１５中に示す。
構築物を、一過性トランスフェクションによって２９３Ｅ細胞に導入し、複数の一過性発現実験を行った。所与の実験では、サンプルをトランスフェクション８日後にトランスフェクションした細胞の培養物上清からサンプルを回収し、分析した。サンプルは、ＩｇＧ ＥＬＩＳＡによって評価したレベルの分泌型抗体を含んでおり、このデータを、抗体（マイクログラム）／サンプル（ｍｌ）を単位として以下の表に示す。未変性コントロールは、Ｌ５ ＬＣＳＰ配列を使用したベクターであった。別のコントロール（表中に示さない。）として、同一の抗体を発現する従来の２ベクター系および同一の制御エレメントの使用をこれらの実験に含めた。このコントロールベクター系から得た抗体分泌レベルは８０から２０６μｇ／ｍｌの範囲であった。これらの軽鎖シグナルペプチドを使用した幾つかのｓＯＲＦ構築物デザインによって得られたＩｇＧ分泌レベルは、従来のベクターを使用して得た範囲とほぼ同程度に匹敵する。これらの発現レベルは、未変性Ｌ５ Ｅ７シグナルペプチドを使用した発現レベルより有意に高い（Ｐａｂｌｏｎ ＨＬ（＋）構築物を使用して２．０μｇ／ｍｌ）。これらの抗体分泌レベルはまた、「２Ａ」テクノロジーを使用して得られたレベル（哺乳動物細胞において１．６ｕｇ／ｍｌと報告されている（Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：５８４−５９０））より有意に高い。
Figure 2013509188
抗体産物レベルを測定した表示の構築物のうち、最高レベルの分泌型抗体を産生した５つの構築物由来の産物を、さらなる分析のために選択した。産物は以下の５つの構築物に対応していた：ｐＴＴ３−Ａ１７−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ、ｐＴＴ３−Ａ１８−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ、ｐＴＴ３−Ａ１９−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ、ｐＴＴ３−Ａ２６−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬおよびｐＴＴ３−ｍｕｔＨ＋２Ｇ−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ。これらの構築物から産生された分泌型抗体を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィによって精製し、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、このＨＣおよびＬＣのＮ末端アミノ酸配列を決定した。ｐＴＴ３−Ａ１８−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬを使用して産生したサンプルは、抗体の重鎖および軽鎖に対応するタンパク質移動バンドを含み、移動度は伝統的な方法によって産生された類似の抗体と区別できなかった。還元ゲル上に、抗体のＨＣおよびＬＣに対応するバンドに加えて、２つのより高い分子量のバンドも存在しており、これらはプロセシングされなかった３成分からなるタンパク質（ＨＣ−インテイン−ＬＣ）に対応しているようであった。プロセシングされなかったか部分的にプロセシングされたタンパク質などの構築物に関連する夾雑物を、本明細書中に記載のように従来の技術に従って都合良く除去することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果の例を示す図１６を参照のこと。分泌型ＩｇＧ抗体を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィによって精製し、還元条件下のゲル中でＳＤＳ−ＰＡＧＥ技術を使用して分離した。レーン中のサンプルは左から右に以下である：レーン（１）ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２タンパク質標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）タンパク質分子量マーカー；（２）コントロール（伝統的な非ｓＯＲＦ発現ベクター系使用して産生されたＤ２Ｅ７抗体）；（３）Ｐａｂ−ｌｏｎ ＨＬ（−）；（４）ｐＴＴ３−Ａ１８−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ。
発現構築物の産物の細胞内サンプルも、ＨＣおよびＬＣの両方に対する抗体を使用したウェスタンブロット分析によって分析した。培養上清中に類似のタンパク質種が認められた。質量分析によって重鎖および軽鎖の両方のＮ末端アミノ酸配列が未変性であると判断された。分析により、Ａ１８シグナルペプチド切断が軽鎖発現が望まれる正確に的確なポイントで起こっていたことが確認された。さらに、伝統的に発現されたＤ２Ｅ７との類似性が陽イオン交換クロマトグラフィ（ＣＩＥＸ）によって証明された。このクロマトグラフィは正味の表面電荷に基づいてタンパク質を分離し、Ｄ２Ｅ７の変種および混入物を検出することができる。従って、Ａ１８シグナルペプチドを抗体発現のためにｓＯＲＦベクター中で使用することができ、完全にプロセシングされ、アセンブリされた抗体産物を効率的に発現することができる。
上記の一過性発現系に加えて、抗体産物の発現のための安定な細胞株も生成した。安定なＣＨＯ細胞株を、Ａ１８軽鎖シグナルペプチド成分を有するベクターを使用したｓＯＲＦ発現構築物を用いて作製した。ｓＯＲＦ構築物Ａ１８−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬを、組換え技術を使用してプラスミドｐＡ１９０にクローン化した。ｐＢＪ−Ａ１８−ＬＣ−Ｐａｂｌｏｎ−ＨＬ（ｐＡ１９０−Ａ１８−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬともいう。）の構築物の構造の略図を提供している図１８を参照のこと。この構築物を、リン酸カルシウム法によってＣＨＯ Ｂ３．２細胞にトランスフェクションし、４８個の９６ウェルプレート中の５％ＦＢＳを有する最小必須培地（ＭＥＭ）（Ａｌｐｈａ Ｍｅｄｉｕｍ）中にプレートした。トランスフェクションサンプルをスクリーニングし、１００ｎＭ ＭＴＸまでを使用した増幅法に供した。培養物中の構築物発現の結果を特徴付けた。１００ｎＭ ＭＴＸでは、構築物ｐＡ１９０−Ａ１８−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬを使用した細胞は、培養上清サンプル中に１．１から１６．９μｇ／ｍｌの範囲で抗体を発現した。４つの最も高い発現クローンを、限界希釈によってサブクローン化した。サブクローンを試験し、２．９から３１．８μｇ／ｍｌの量で抗体を発現することが見出された。発現レベルが最高の４つのサブクローン化した細胞株を懸濁液中で成長するように適合させ、４日目の培養物から取り出したサンプルから測定した場合に平均量３１から４４μｇ／ｍｌを産生した。
構築物が成熟軽鎖産物を生成する能力を評価した。ウェスタンブロット実験由来の結果を提供している図１７を参照のこと。細胞内抗体産物のサンプルを特徴付けた。全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに従って還元条件下のゲル中に分離し、ニトロセルロース膜に移し、ブロッキング液（ＴＴＢＳ（ツウィーン２０を有するトリス緩衝化生理食塩水）を含む脱脂粉乳）でブロッキングし、重鎖または軽鎖のいずれかに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合抗体とインキュベートし、ＥＣＬ（増強化学発光（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ））試薬を使用して発色させた。ブロット中のレーン中の構築物の命名に従ったサンプルは以下である（左から右）：番号のない左のレーン（分子量マーカー）；（レーン１）コントロール（ＣＨＯ細胞由来のＤ２Ｅ７）；（２）コントロール（ＨＥＫ２９３細胞を使用した一過性トランスフェクションにおけるｐＴＴ３−Ａ１８−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ）；（３から１１）クローン番号１、３、７、９、１２、１４、１８、１５および１３にそれぞれ対応するｐＡ１９０−Ａ１８−Ｅ７−ＰａｂｌｏｎＨＬ由来の種々のクローン。文字「ａ」および「ｂ」でラベリングした矢印は、以下の発現産物を示す：（ａ）上のバンド、シグナルペプチドを有する軽鎖および（ｂ）下のバンド、成熟軽鎖。成熟軽鎖産物では、シグナルペプチドが切断されており、この結果、前駆体と比較して低い分子量を有する産物が得られた。結果は、Ａ１８軽鎖シグナルペプチド成分を有する構築物が完全に成熟した軽鎖産物を発現および産生することができ、この産物はＤ２Ｅ７抗体の産物に匹敵することを証明している。
参照による援用および変形形態に関する記載
任意の配列表情報は、明細書の一部と見なされる。
本出願を通して言及した全ての引用文献（例えば、特許書類（発行または登録された特許または等価物が含まれる。）、特許出願公開書類、非公開の特許出願書類および非特許文献または他の原資料）は、個別の参照により援用されているかのように、この全体が本明細書中で参照により援用される。引例と本出願の開示との間に任意の矛盾がある場合、本明細書中の開示を優先する。本明細書中に提供した幾つかの文献は、情報（例えば、本発明の出発物質、さらなる出発物質、さらなる試薬、さらなる合成方法、さらなる分析方法、さらなる生物材料、さらなる細胞およびさらなる使用の情報源に関する詳細）を得るために参照により援用される。
本明細書中で言及した全ての特許および刊行物は、本発明に属する当業者の技術レベルを示す。本明細書中に引用された文献は公開日または出願日の時点で最新の技術を示すことができ、この情報を、必要に応じて本明細書中で使用して先行技術にある特定の実施形態を排除することができることを意図する。例えば、物質の組成物を特許請求の範囲に記載する場合、公知であり、出願人の発明の先行技術で利用可能な化合物（本明細書中に引用された文献中に実施可能な程度の開示が提供されている化合物が含まれる。）が本明細書中の物質の組成物のクレームに含まれることを意図しないと理解すべきである。
本明細書に添付した任意の付属書類は、明細書および／または図面の一部として参照により援用される。
化合物、構築物または組成物を特許請求の範囲に記載する場合、当該分野で公知の化合物、構築物および組成物（本明細書中に開示の文献中に教示のものが含まれる。）が含まれることを意図しないと理解すべきである。マーカッシュ群または他の群を本明細書中で使用する場合、群の全ての個別の要素および群内で可能な全ての組み合わせおよびサブコンビネーション（ｓｕｂｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が個別に記載され、開示に含まれることも意図される。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいた（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を本明細書中で使用する場合、これらは記述した特徴、整数、ことまたは成分の存在を特定すると解釈すべきであるが、１つ以上の他の特徴、整数、こと、成分またはこれらの群の存在や付加を排除しない。従って、本明細書中で使用する場合、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）、有する（ｈａｖｉｎｇ）または、によって特徴付けられる（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ）と同義であり、包括的または非限定であり、さらなる引用していない要素または方法のことを排除しない。本明細書中で使用する場合、「からなる」は、特許請求の範囲で特定されていない任意の要素、ことまたは成分などを排除する。本明細書中で使用する場合、「本質的にからなる」は、クレームの基本的および新規の特徴（例えば、有効成分に関する。）に実質的に影響を及ぼさない材料またはことを排除しない。本明細書中の各例では、任意の用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「本質的にからなる」および「からなる」を、他の２つの用語の少なくともいずれかと置換することができ、これにより、必ずしも同一の広がりを持たない個別の実施形態および／または範囲を開示することができる。本明細書中に例示的に記載した本発明の実施形態を、本明細書中に具体的に開示していない任意の要素または限度の不在下で適切に実施することができる。
ある範囲（例えば、温度範囲、時間範囲、組成物もしくは濃度の範囲または他の値の範囲など）を本明細書中に開示する場合は常に、全ての中間の範囲および部分的な範囲ならびに所与の範囲内に含まれる全ての個別の値が本開示に含まれることを意図する。本発明は開示の実施形態（図面中に示されるか明細書中に例示される任意の実施形態が含まれる。）によって制限されず、これらの実施形態は例示または例証のために記載し、本発明を制限しない。本明細書中の説明中に含まれる範囲または部分範囲中の任意の部分範囲または個別の値を特許請求の範囲から排除することができると理解される。
本発明を、種々の特定のおよび／または好ましい実施形態および技術を参照して記載している。しかし、本発明の精神および範囲内に属しながら多数の変形形態および修正形態を得ることができると理解すべきである。本明細書中に具体的に記載されているもの以外の組成物、方法、デバイス、デバイスの要素、材料、手順および技術を過度の実験に依存することなく本明細書中に広く開示のように本発明の実施で使用することができることが当業者に明らかである。これを、例えば、具体的に例示されているもの以外の出発物質、生物材料、試薬、合成方法、精製方法、分析方法、アッセイ方法および生物学的方法に拡大することができる。本明細書中に記載の全ての当該分野で公知の機能的等価物（例えば、組成物、方法、デバイス、デバイスの要素、材料、手順および技術など）は、本発明に含まれることが意図される。使用してきた用語および表現を、説明のために使用するが、本発明を制限せず、かかる用語および表現の使用において表示および記載の特徴またはこれらの一部のいかなる等価物も排除することを意図しないが、特許請求の範囲に記載の発明の範囲内で種々の修正が可能であると認識される。従って、本発明を実施形態、好ましい実施形態および選択的な特徴によって具体的に開示しているが、本明細書中に開示の概念の修正形態および変形形態を当業者が用いることができ、かかる修正形態および変形形態が添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内であると見なされると理解すべきである。
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Claims (46)

  1. シングルオープンリーディングフレームインサートを含む１つ以上の組換えタンパク質産物を生成するための単離または精製された発現ベクターであって、前記インサートが、以下：
    （ａ）シグナルペプチドをコードするシグナルペプチド核酸配列、
    （ｂ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列、
    （ｃ）第１のタンパク質切断部位をコードする第１の介在核酸配列であって、前記第１のタンパク質切断部位が、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）のｌｏｎプロテアーゼ遺伝子またはパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）もしくはメタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）のｋｌｂＡ遺伝子のインテインセグメントまたは前記インテインセグメント由来の改変インテインセグメントによって提供される、第１のタンパク質切断部位をコードする第１の介在核酸配列および
    （ｄ）第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列
    を含み、
    前記第１のタンパク質切断部位をコードする第１の介在核酸配列が、前記第１の核酸配列と前記第２の核酸配列との間に作動可能に配置され、
    前記シグナルペプチドをコードするシグナルペプチド核酸配列が、前記第１の核酸配列の前に作動可能に配置され、
    前記発現ベクターが、前記第１のタンパク質切断部位で切断可能なシングルオープンリーディングフレームポリペプチドを発現することができる、単離または精製された発現ベクター。
  2. 前記第１のタンパク質切断部位が、パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、またはパイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）ＯＴ３のｌｏｎプロテアーゼ遺伝子のインテインセグメント、またはパイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、またはメタノコッカス・ヤナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）のｋｌｂＡ遺伝子のインテインセグメント、または前記各インテインセグメント由来の改変インテインセグメントによって提供される、請求項１の発現ベクター。
  3. インテインセグメントまたは改変インテインセグメントが、リジン、セリンであるが、ヒスチジンではない最後から２番目の残基をコードする、請求項１の発現ベクター。
  4. 前記インテインセグメントまたは改変インテインセグメントが、切断可能であるが、前記第１のポリペプチドの前記第２のポリペプチドへのライゲーションを完了できない、請求項１の発現ベクター。
  5. 前記第１のタンパク質切断部位が、配列番号１、３、４、６、７、５５、３５、３７および３９からなる群から選択される配列を含むインテインセグメントおよび前記インテインセグメント由来の改変インテインセグメントによって提供される、請求項１の発現ベクター。
  6. 第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが多量体アセンブリ可能である、請求項１から５のいずれかの発現ベクター。
  7. 前記第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの少なくとも１つが細胞外分泌可能である、請求項１から６のいずれかの発現ベクター。
  8. 前記第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの少なくとも１つが哺乳動物起源である、請求項１から７のいずれかの発現ベクター。
  9. 前記第１のポリペプチドが免疫グロブリン重鎖またはこの重鎖の機能的フラグメントを含み、前記第２のポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖またはこの軽鎖の機能的フラグメントを含み、前記第１のポリペプチドが前記第２のポリペプチドの上流に存在する、請求項１から８のいずれかの発現ベクター。
  10. たった１つの前記シグナルペプチド核酸配列を含む、請求項１から９のいずれかの発現ベクター。
  11. 第３のポリペプチドをコードする第３の核酸配列および第２のタンパク質切断部位をコードする第２の介在核酸配列をさらに含み、該第２の介在核酸配列および第３の核酸配列がこの順序で、前記第２の核酸配列の後に作動可能に配置される、請求項１から１０のいずれかの発現ベクター。
  12. 前記第１および前記第２のポリペプチドが、ＴＮＦα（腫瘍壊死因子−α）、エリスロポエチン受容体、ＲＳＶ、ＥＬ／セレクチン、インターロイキン−１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１８、インターロイキン−２３、インターロイキン−３３、ＣＤ８１、ＣＤ１９、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＥＧＦＲ、ＣＸＣＬ−１３、ＧＬＰ−１Ｒ、プロスタグランジンＥ２およびアミロイドβからなる群から選択される抗原への結合を指示する抗原特異性を有する機能的抗体または他の抗原認識分子を含む、請求項１から１１のいずれかの発現ベクター。
  13. 第１および第２のポリペプチドが、Ｄ２Ｅ７、ＥＬ２４６、ＡＢＴ−００７、ＡＢＴ−３２５またはＡＢＴ−８７４の抗体由来の免疫グロブリン鎖対を含む、請求項１から１２のいずれかの発現ベクター。
  14. 第１および第２のポリペプチドが、Ｄ２Ｅ７、ＥＬ２４６、ＡＢＴ−００７、ＡＢＴ−３２５、ＡＢＴ−８７４または他の抗体の類似のセグメント由来の免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖のセグメントからそれぞれ独立して選択される、請求項１から１３のいずれかの発現ベクター。
  15. 前記ベクターが、前記インサートのプロモーター調節エレメントをさらに含む、請求項１から１４のいずれかの発現ベクター。
  16. 前記プロモーター調節エレメントが誘導性または構成性である、請求項１５に記載の発現ベクター。
  17. 前記プロモーター調節エレメントが組織特異的である、請求項１５に記載の発現ベクター。
  18. 前記プロモーターがアデノウイルス主要後期プロモーターを含む、請求項１５に記載の発現ベクター。
  19. 請求項１から１８のいずれかに記載のベクターを含む宿主細胞。
  20. 前記宿主細胞が原核細胞である、請求項１９に記載の宿主細胞。
  21. 前記宿主細胞がエシュリキア・コライ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項２０に記載の宿主細胞。
  22. 前記宿主細胞が真核細胞である、請求項１９に記載の宿主細胞。
  23. 前記真核細胞が、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞および真菌細胞からなる群から選択される、請求項２２に記載の宿主細胞。
  24. 前記真核細胞が、哺乳動物細胞、トリ細胞および昆虫細胞からなる群から選択される動物細胞である、請求項２３に記載の宿主細胞。
  25. 前記宿主細胞が哺乳動物細胞株である、請求項２４に記載の宿主細胞。
  26. 前記宿主細胞がＣＨＯ細胞またはジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損ＣＨＯ細胞である、請求項２４に記載の宿主細胞。
  27. 前記宿主細胞がＣＯＳ細胞またはＨＥＫ細胞である、請求項２４に記載の宿主細胞。
  28. 前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項２３に記載の宿主細胞。
  29. 前記酵母細胞がサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項２８に記載の宿主細胞。
  30. 前記宿主細胞がスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９昆虫細胞である、請求項２４に記載の宿主細胞。
  31. 組換えポリタンパク質または複数のタンパク質を産生する方法であって、請求項１９の宿主細胞をベクタータンパク質を発現させるのに十分な条件下にて培養培地中で培養することを含む、方法。
  32. 前記ベクタータンパク質を回収および／または精製することをさらに含む、請求項３１の方法。
  33. 前記複数のタンパク質が多量体アセンブリ可能である、請求項３１から３２のいずれかの方法。
  34. 組換えポリタンパク質または複数のタンパク質が生物学的に機能的および／または治療的である、請求項３１から３３のいずれかの方法。
  35. 組換え産物の産生方法であって、該産物が免疫グロブリンタンパク質またはタンパク質の機能的フラグメント、アセンブリされた抗体または他の抗原認識分子であり、請求項１９に記載の宿主細胞を該組換え産物を産出するのに十分な条件下にて培養培地中で培養することを含む、方法。
  36. 請求項３１から３５のいずれかの方法に従って産生されたタンパク質。
  37. 請求項３１から３６のいずれかの方法に従って産生されたポリタンパク質。
  38. 請求項３１から３７のいずれかの方法に従って産生されたアセンブリされた免疫グロブリン、アセンブリされた他の抗原認識分子または各免疫グロブリン鎖もしくはこれらの機能的フラグメント。
  39. 腫瘍壊死因子−α、エリスロポエチン受容体、ＲＳＶ、ＥＬ／セレクチン、インターロイキン−１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１８、インターロイキン−２３、インターロイキン−３３、ＣＤ８１、ＣＤ１９、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＥＧＦＲ、プロスタグランジンＥ２、ＣＸＣＬ−１３、ＧＬＰ−１Ｒまたはアミロイドβへの特異的抗原結合をもたらすか寄与する能力が存在する、請求項３８に記載の免疫グロブリン、他の抗原認識分子または各免疫グロブリン鎖もしくはこれらの機能的フラグメント。
  40. 免疫グロブリンがＤ２Ｅ７またはＡＢＴ−８７４であるか、機能的フラグメントがそれぞれ前記免疫グロブリンのフラグメントである、請求項３９に記載の免疫グロブリンまたはグロブリンの機能的フラグメント。
  41. 請求項３６から４０のいずれかに記載の治療有効量のタンパク質および医薬的に許容可能なキャリアを含む、医薬的組成物。
  42. タグをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１から１８のいずれかの発現ベクター。
  43. 前記介在核酸配列がタグをさらにコードする、請求項１から１８のいずれかの発現ベクター。
  44. ベクターが、請求項１から１８のいずれかのベクターであり、および軽鎖シグナルペプチドをコードするセグメントをさらに含む、請求項１から４３の発現ベクター、該ベクターを有する宿主細胞、ベクター発現産物、医薬的組成物、ならびに／または作製方法もしくは使用方法。
  45. コードされた軽鎖シグナルペプチドが、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２６およびＨ２Ｇからなる群から選択されるκ軽鎖シグナルペプチドである、請求項４４のベクター、宿主細胞、ベクター発現産物、医薬的組成物および／または作製方法もしくは使用方法。
  46. コードされた軽鎖シグナルペプチドが、ＶＫＩＩκ軽鎖シグナルペプチドＡ１８（配列番号８２（アミノ酸配列ＭＲＬＰＡＱＬＬＧＬＬＭＬＷＩＰＧＳＳＡ））である、請求項４４のベクター、宿主細胞、ベクター発現産物、医薬的組成物および／または作製方法もしくは使用方法。
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