JP2007502623A - 膜タンパク質におけるフリンプロテアーゼ開裂部位の挿入およびその使用法 - Google Patents

Abstract

フリンプロテアーゼの開裂部位を、膜糖タンパク質のドメイン間に挿入する。トランスゴルジネットワークにおけるフリンによる開裂の際に、タンパク質は、その天然構造を保持した個別の膜を含まないドメインへと分離される。このプロトコールを用いて、構造解析用およびワクチンとしての試験用のウイルス膜タンパク質ドメインを産生できる。

Description

発明の分野
本発明は概して、膜糖タンパク質の研究および使用に関する。より具体的には、本発明は、天然の構造で維持されている、膜を含まない膜糖タンパク質を産生する方法を提供する。なお、仮出願ではない本特許出願は、現在は放棄された、2003年5月9日出願の米国特許仮出願第60/469,126号の恩典を主張する。

関連する技術分野の説明
多くの膜糖タンパク質が、高度に制約された高エネルギー構造の細胞内に集合されている。膜含有ウイルスの膜タンパク質は、高エネルギータンパク質の一例である。これらのタンパク質は、ジスルフィド結合により安定化された中間体を経て、小胞体（ER）内に集合する。この高エネルギー構造のために、これらのタンパク質を、これらが結合した膜から抽出する際に天然の構造で維持することは、不可能ではないにしても困難である。これらのタンパク質を膜から抽出することによって、弛緩した非天然構造への崩壊が起こり、このため、これらタンパク質の構造解析が困難になる。ウイルス膜タンパク質の場合、非天然構造のために、これらタンパク質は、ウイルスサブユニットワクチンとしての使用に対する有効性が無くなる。

インフルエンザウイルスの場合、HA1-HA2膜糖タンパク質内の利用可能なプロテアーゼ部位の発見により、この構造的問題が克服された（Wiley and Skehel, 1977）。この部位により、無傷のウイルスをプロテアーゼで処理した際に、タンパク質外部ドメインの放出が可能になった。放出された外部ドメインはその天然構造を保持しており、これによって、X線結晶構造解析による原子分解能でのその構造決定が可能になった（Wiley and Skehel, 1977）。

しかし、大部分の膜タンパク質は、インフルエンザウイルスにおいて見られるような利用可能なプロテアーゼ部位を含んではいない。この事実および、他のタンパク質精製法の失敗のために、天然構造でのこれらのタンパク質を得ることは不可能となっている。従って、先行技術には、天然構造で維持された膜を含まない膜糖タンパク質を産生する方法が欠けている。本発明は、当技術分野におけるこの長年の要求および要請の解決策となるものである。

発明の概要
本発明は、天然の細胞性プロテアーゼを用いて、膜二重層の放出の際に天然の構造を維持する、膜タンパク質ドメインを産生する方法を提供する。

このタンパク質分解性開裂および放出事象は、タンパク質が小胞体から搬出された後、および従って、ジスルフィド架橋形成、折りたたみ、および（必要ならば）他のタンパク質とのオリゴマー形成過程が生じた後に生じる。ゴルジ体におけるフリンプロテアーゼと結合した後、天然構造の喪失を阻止するプロトコールによって増殖培地から精製されうる非膜関連種へと、タンパク質が転換される。このプロトコールにより、構造解析用およびワクチンとしての試験用のウイルス膜タンパク質ドメイン産生のための新たな機会が与えられる。

フリンが挿入されたウイルスは、フリンを発現しない宿主細胞中で、高力価まで増殖することができる。これらの変異ウイルスが哺乳動物宿主に注射されると、感染して、集合過程を開始するが、トランスゴルジネットワークにおけるタンパク質集合の最終段階においては「自己破壊」するので、これらのウイルスをワクチンとして使用してもよい。

従って、一態様において、本発明は、膜糖タンパク質ドメインを産生する方法を含み、ここで、ドメインは膜を含まず、かつ天然の構造で維持されている。本方法は、以下の段階を含んでもよい：糖タンパク質を別々のドメインに分離する領域にフリン開裂配列を挿入する段階；宿主細胞において糖タンパク質を発現させる段階；宿主細胞のトランスゴルジネットワーク内でフリンにより糖タンパク質を切断し、それによって膜糖タンパク質ドメインを産生する段階；宿主細胞から糖タンパク質ドメインを分泌する段階；および、宿主細胞の培地から糖タンパク質ドメインを精製する段階であって、ドメインが膜を含まず、かつ天然の構造で維持されている段階。

別の態様において、本発明は、サブユニットワクチン候補として有用なαウイルス膜糖タンパク質のドメインを産生する方法を含み、ここで、該ドメインは膜を含まず、かつ天然の構造で維持されている。本方法は概して、以下の段階を含む：糖タンパク質を別々のドメインに分離する領域にフリン開裂配列を挿入する段階；宿主細胞において糖タンパク質を発現させる段階；宿主細胞のトランスゴルジネットワーク内でフリンにより糖タンパク質を切断し、それによって膜糖タンパク質ドメインを産生する段階；宿主細胞から糖タンパク質ドメインを分泌する段階；および、宿主細胞の培地から糖タンパク質ドメインを精製する段階であって、ドメインが膜を含まず、かつ天然の構造で維持されている段階。

別の態様において、本発明は、αウイルスに対するワクチン候補を産生する方法を含む。本方法は、以下の段階を含む：αウイルスの膜糖タンパク質を別々のドメインに分離する領域にフリン開裂配列を挿入する段階；フリン開裂配列を含む膜糖タンパク質をコードする配列を、αウイルスをコードするベクターに組み込む段階；フリンを発現しない宿主細胞においてαウイルスを発現させる段階；および、宿主細胞により産生されたαウイルスを収集する段階であって、収集されたウイルスが、αウイルスに対するワクチン候補となる段階。

本発明の、その他のおよびさらなる局面、特徴、および利点は、本発明の現在好ましい態様についての以下の説明から明らかになるであろう。これらの態様は、開示を目的として提供されるものである。

発明の詳細な説明
フリンは、真核生物細胞のトランスゴルジネットワーク内に存在するプロテアーゼである（Moehring et al., 1993）。その機能とは、細胞内の最終目的地へと送達される直前の段階で、タンパク質を開裂することである。フリンは、コンセンサスアミノ酸配列であるRXRR（配列番号：1）、RXRK（配列番号：2）またはKXKR（配列番号：3）（ここで、Xは任意のアミノ酸である；Moehring et al., 1993）を認識し、これらの配列を含むタンパク質がトランスゴルジネットワークに到達した際に該タンパク質を切断する。

本発明においては、膜糖タンパク質ドメインの露出した（外面に位置する）ドメインに、フリン開裂部位が導入される。改変タンパク質は、折り畳みおよび集合の通常プロセスを経て、その天然の構造を獲得すると考えられる。これらの事象は、小胞体からの搬出のために必要である。小胞体から搬出された後、タンパク質は分泌経路に沿って進み、細胞表面に到達する。タンパク質がトランスゴルジネットワークに到達すると、フリンプロテアーゼによって開裂される。タンパク質分解性事象により、その構造を損なうことなく、膜二重層由来のタンパク質の外部ドメインが放出される。

タンパク質はそれから分泌タンパク質となり、適切な精製プロトコールによって周囲の培地から精製されうる。

本過程の実行可能性を示すため、始原型αウイルスシンドビスウイルスE1膜糖タンパク質を、モデルとして選択した。αウイルスは、デング熱、西ナイル熱、ベネズエラ脳炎ウイルス、黄熱病等の重大なヒト疾患の原因となるある種のウイルス（アルボウイルス）の代表例である。600を上回るこれらの物質が知られているが、現在利用可能な有効なワクチン（黄熱病に対して）は僅か一種しか無い。上述した天然タンパク質構造の喪失のために、ウイルスタンパク質抽出物の又は変性ウイルスのサブユニットを産生することによるワクチンを産生する試みは失敗している。

シンドビスウイルスのE1糖タンパク質は、ウイルス感染細胞の小胞体内で集合して、密な、高度に制約された高エネルギー構造となる。小胞体から細胞表面に搬出されるためには、正確な折り畳みが必要条件となる。膜からウイルスE1タンパク質を除去する試みは、ジスルフィド架橋シャッフルがタンパク質を非天然構造にすることによる、天然構造の喪失をもたらす。

正確な折り畳み形式の本タンパク質は分離されて2つの別々のジスルフィド架橋安定化ドメインとなること、および、これら2つのドメイン間の連結部がE1-129アミノ酸の近辺であることが示されている（Mulvey and Brown, 1994）（図1）。これらのドメインの一つ目（1位〜129位のアミノ酸）は、膜透過機能を含み（機能ドメイン）、一方、第二のドメイン（139〜398）は、無傷の20面体格子（構造ドメイン）を含む。機能ドメインと構造ドメインを分離している領域内のフリン開裂部位の挿入により、膜タンパク質複合体からの天然構造の機能ドメインの放出が起こることが、下記データにより示されている。

フリン開裂部位が挿入されるべき対象となる部位の選択は、タンパク質の構造に基づいて、又は、構造が入手可能でない場合には、生化学的分析および/もしくは配列分析に基づいて、決定されることができる。

一般に、その部位は、大部分が極性でありかつ/又は荷電した残基の分節内であるべきであり、タンパク質の表面上にあることが多い。三次元構造が既知である場合、挿入部位は、広範な疎水性界面と整列された二次元構造エレメントを連結する表面ループ内にあるべきである。

タンパク質の構造が入手不可能である場合、このような候補部位を明らかにするのに、疎水性に基づく方法、二次構造予測法、および相同体の配列アラインメントが役立つことが多い。少量のタンパク質が入手可能な場合、プロテアーゼ消化に利用可能であり、かつ内在タンパク質構造を形成するのに必須でないこのような候補部位を決定するのに、限定的タンパク質分解消化、それに続くクロマトグラフ同時分画（chromatographic co-fractionation）およびN末端ポリペプチド配列決定/質量分析が役立ちうる。そのような部位における切断により、タンパク質が個々のドメインに分離されると考えられる。

膜を含まない膜糖タンパク質を得るための本方法を、HIV、ヘルペスウイルス、コロナウイルスなどの多くのウイルスに適用することができる。一般に、プロテアーゼフリン欠乏CHO細胞株またはウイルスの複製を支持するフリン欠損細胞株において、ウイルスが複製可能である場合、フリン開裂部位を任意のウイルス膜タンパク質に挿入することができる。放出された、ウイルス糖タンパク質の膜を含まない外部ドメインを、サブユニットワクチンとして使用することができる。

別の態様において、フリン陰性の哺乳動物宿主細胞内で、挿入されたフリンを保持する高力価のウイルス粒子を産生することができる。

これらのウイルスは、潜在的なワクチン候補となりうる。これらのウイルスが哺乳動物宿主に注射されると、感染して、集合過程を開始するが、フリンの開裂により、トランスゴルジネットワークにおけるタンパク質集合の最終段階において「自己破壊」する。このアプローチは、変異ウイルスの増殖を支持するフリンマイナス（furin-minus）細胞株が利用可能である場合はいつでも、多くのウイルス（例えばHIV、ヘルペスウイルスなど）に対して作用すると考えられる。

本明細書において使用される「膜を含まない糖タンパク質」とは、小胞体内で集合して、トランスゴルジネットワークを通る細胞経路により最終目的地まで送達される、任意の内在膜タンパク質を指す。

本明細書において使用される「膜を含まない膜糖タンパク質」とは、外部ドメイン内のいくつかの箇所においてプロテアーゼにより切断されることにより膜から放出された、内在膜タンパク質を指す。

本明細書において使用される「天然構造」とは、タンパク質が小胞体内で折り畳まれるように、タンパク質により達成される構造を指す。ウイルスタンパク質については、成熟した感染性ウイルス内に存在する機能的な形状についても指す。

本発明は、膜糖タンパク質ドメインを産生する方法を対象としており、ここで、ドメインは膜を含まず、かつ天然の構造で維持されている。一つの態様において、本方法は、αウイルス膜糖タンパク質などのウイルス膜糖タンパク質のドメインを産生するために用いることができる。その結果生じるウイルス膜糖タンパク質ドメインは、サブユニットワクチン候補として有用である。

まず第一に、膜糖タンパク質を別々のドメインに分離する領域に、フリン開裂配列を挿入する。一般に、適切な領域としては、タンパク質の表面、表面ループ、または大部分が極性残基である領域が含まれる。好ましくは、フリン開裂配列は配列番号：1、2、または3である。このような改変糖タンパク質が宿主細胞中で発現すると、この糖タンパク質は、トランスゴルジネットワーク内でのフリン開裂により、別々のドメインに分離される。続いて、宿主細胞の培地から糖タンパク質ドメインを精製することができ、精製されたドメインは膜を含まず、かつ天然の構造で維持されている。

本発明はまた、αウイルスに対するワクチン候補を産生する方法も対象とする。本方法は、αウイルスの膜糖タンパク質を別々のドメインに分離すると考えられる領域に、フリン開裂配列を挿入する段階を含む。一般に、適切な領域は、タンパク質の表面、表面ループ、または大部分が極性残基である領域が含まれる。好ましいフリン開裂配列は、配列番号：1、2、もしくは3であるか、または、これらフリン開裂配列のうち一つの断片もしくは明らかな変種である。次に、改変糖タンパク質を、αウイルスをコードするベクターに組み込んで、フリンを発現しない宿主細胞中で発現させる。これら宿主細胞により産生されるαウイルスは、αウイルスのワクチン候補となりうる。

以下の実施例は、本発明の様々な態様を説明する目的で提供されており、いかなる形においても本発明を限定することを意図したものではない。本発明が、本明細書に内在する目的、目標、および利益と同様に、本明細書において言及された目的の達成ならびに目標および利益の取得のために十分適合化されていることを、当業者は容易に理解するであろう。添付の特許請求の範囲により定義された本発明の趣旨に含まれる変更およびその他の用途は、当業者により想起されよう。

実施例１
フリン開裂後の、天然構造のタンパク質ドメインの放出
シンドビスウイルスのE1糖タンパク質の第一のドメインを膜タンパク質複合体から放出するため、タンパク質の構造ドメインから機能ドメインを分離する領域に、フリンプロテアーゼ開裂部位を挿入した。これは、ウイルスRNAの全長cDNAクローンにおける、突然変異誘発のQuick-Change技術(Stratagene) (Rice et al., 1987)を用いて行われた。

これらの変異を生じさせるために使用したプライマーを、表1に示す。可能ならば天然のアミノ酸配列を使用して、フリン感受性配列を部位E1-130（RXRK、配列番号：2）に、E1-133（KXKR、配列番号：3）に、およびE1-139（RXRR、配列番号：1）に配置させるような変異を生じさせた。これらの部位は、これらの部位がタンパク質表面上で曝露されており、かつそれによりプロテアーゼ開裂に利用可能であると考えられることを示した研究(Phinney et al., 2000; Phinney and Brown, 2000)に基づいて選択した。

これらの変異は、細胞関連酵素であるフリンへの曝露の際に、E1タンパク質からの、遠位のE1タンパク質ドメインの放出をもたらすことが予想される。これにより、無傷のE1タンパク質の分子量が、分子量58kDから、2つのタンパク質の分子量約17kDおよび41kDへと変化する。アミノ酸の変化がウイルス糖タンパク質の正常な折り畳みに与える影響を制御するために、フリンプロテアーゼを有さないCHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞株（CHORPE40）（Moehring et al., 1993; Moehring and Moehring, 1983）に、変異含有ウイルスRNAをトランスフェクトした。

図2は、E1変異体に対応する構築物であるF130、F133、およびF139をトランスフェクトした哺乳動物細胞において産生されたタンパク質を示す。

部位E1-130およびE1-133に開裂部位を配置することによって、予想通り、約41kDおよび17kDの分子量において移動する新規な種類のタンパク質が産出された。17kDのタンパク質の量は、細胞に関連すると示されたタンパク質と同様に、比較的少なく、かつ、17kDタンパク質の大部分が培地中に分泌された可能性が高い。野生型のトランスフェクション（Y420）においては、または非ウイルスメッセンジャー（P75）をトランスフェクトした細胞においては、これらのタンパク質は見出されない。

E1 393変異体は、E1外部ドメイン全体を放出することが意図された（図1参照）。393変異体のRNAをトランスフェクトしたBHK細胞の培地から免疫沈降されたタンパク質のSDS PAGEを、図3に示す。

変異体E1 139を用いた場合のように、E1 392における変異は所望の表現型を産生することができなかった（データは示さず）。フリン変異体E1 392のcDNAクローンから産生されたRNAをBHK細胞にトランスフェクトすることにより、糖タンパク質E2よりも早く移動しかつウイルス全体に対する抗体により免疫沈降されたタンパク質が、培地に放出された。野生型E1は439アミノ酸（58kDa）を有しており、野生型E2は423アミノ酸（53kDa）を有しており、かつ、切断型E1外部ドメインは、カルボキシ末端から47アミノ酸が失われた392アミノ酸（51kDa）を有することが予想される。

図3に示すように、E1 393変異体（F393）は、野生型E1よりも多くの切断型E1を産生したが、これは、393開裂部位において効果的なプロセシングが起こったことを示している。

（表１）E1フリン感受性変異産生用のプライマー対

実施例2
フリンが挿入されたウイルスの複製
フリンプロテアーゼ部位挿入が感染性ウイルスの産生に与える影響を、表2に示す。フリン開裂部位を含む変異体は、そのRNAがフリンプロテアーゼ含有BHK-21細胞にトランスフェクトされている場合には、極めて低いレベルの感染性ウイルスしか産生しないことが、表2により示されている。

対照的に、これらの変異体は、フリン活性を有さないCHO-RPE40細胞にトランスフェクトされた場合には、野生型（Y420）量のウイルスを産生する。変異体F-130およびF-133については、感染性ウイルスに組み込まれるため、これらの位置にフリン開裂部位が存在することは、E1の正しい折り畳みを妨害しないことが、この結果により示されている。折り畳まれたE1タンパク質をフリンが切断して2つの別々のドメインにするので、感染性ウイルス産生は、BHK細胞において、5〜6桁分阻害される。E1に有意な開裂が起こっていないにもかかわらず、変異体F-139は、BHK細胞における同様の成長阻害を示している。139置換の場合、この変異の配置によって、2つのグリコシル化部位のうちの一つが消失し（Pletnev et al., 2001）、これはこの部分的にグリコシル化されたタンパク質のより早い移動によって証明されている。グリコシル化部位の消失によって、感染性ウイルス産生を妨害する構造的変化がもたらされうる。

E1 393変異体は、同様のRNAトランスフェクション条件下における野生型ウイルスから産生される力価10⁹と比較して、BHK細胞から力価10³のビリオンを産生した。変異体393は、CHO RPE-40細胞（フリン陰性細胞）中で10⁷個〜10⁸個/mlのビリオンを産生した。したがって、E1 393変異体のウイルス産生は、野生型またはE1 130変異体およびE1 133変異体よりも有意に少ない（表2）。この違いの理由は明らかではないが、フリン393置換糖タンパク質における折り畳み又はオリゴマー形成の効率減少を、暗に示唆している可能性がある。

（表２）E1フリン変異体の複製

以下の参考文献は、本明細書において引用されたものである。

本明細書において言及された特許文献および刊行物はいずれも、本発明が属する技術分野の当業者の水準を示すものである。さらに、これらの特許文献および刊行物は、それぞれ個々の刊行物が明確かつ個別に参照として組み入れられるよう示されるのと同程度に、本明細書において参照として組み入れられる。

シンドビスウイルスのE1糖タンパク質における機能ドメインおよび構造ドメインは、129位〜140位のアミノ酸によって分離されている。130位、133位、又は139位の残基におけるフリン開裂部位の挿入により、タンパク質は、17kDの機能ドメイン（膜から放出される）および構造ドメイン （膜内で保持される）へと開裂される。E1の392位および393位で、全ての外部ドメインが放出される。 E1糖タンパク質内のフリン開裂部位を含む、シンドビスウイルス変異体により産生されたタンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動。数の表示は、開裂が起こるべきE1内のアミノ酸部位を示す。Y420は野生型ウイルスを示し；P75は非ウイルスメッセンジャーRNAを示し；E1はエンベロープタンパク質1を示し；E2はエンベロープタンパク質2を示し；Cはキャプシドタンパク質を示す。 E1 393位のフリン開裂部位を含むシンドビスウイルス変異体（F393）により産生されたタンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動。タンパク質は、2種の通常のウイルス糖タンパク質についてはE1およびE2、ならびに、フリン切断型E1タンパク質についてはE1^*として、表されている。Cはキャプシドタンパク質である。P75は非ウイルスRNAを含む変異体を示し；Y420は野生型ウイルスを示す。

Claims (16)

1. 膜糖タンパク質ドメインが膜を含まず、かつ天然の構造で維持されている、膜糖タンパク質ドメインを産生する方法であって、以下の段階を含む方法：
   該糖タンパク質を別々のドメインに分離する領域にフリン開裂配列を挿入する段階；
   宿主細胞において該糖タンパク質を発現させる段階；
   該宿主細胞のトランスゴルジネットワーク内でフリンにより該糖タンパク質を切断し、それによって膜糖タンパク質ドメインを産生する段階；
   該宿主細胞から該糖タンパク質ドメインを分泌する段階；および
   該宿主細胞の培地から該糖タンパク質ドメインを精製する段階であって、該ドメインが膜を含まず、かつ天然の構造で維持されている段階。
2. フリン開裂配列が、タンパク質の表面、表面ループ、および、大部分が極性残基である領域からなる群より選択される領域に挿入される、請求項1記載の方法。
3. フリン開裂配列が配列番号：1〜3からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
4. 膜糖タンパク質がウイルス性の膜糖タンパク質である、請求項1記載の方法。
5. サブユニットワクチン候補として有用なαウイルス膜糖タンパク質のドメインが膜を含まず、かつ天然の構造で維持されている、該ドメインを産生する方法であって、以下の段階を含む方法：
   該糖タンパク質を別々のドメインに分離する領域にフリン開裂配列を挿入する段階；
   宿主細胞において該糖タンパク質を発現させる段階；
   該宿主細胞のトランスゴルジネットワーク内でフリンにより該糖タンパク質を切断し、それによって膜糖タンパク質ドメインを産生する段階；
   該宿主細胞から該糖タンパク質ドメインを分泌する段階；および
   該宿主細胞の培地から該糖タンパク質ドメインを精製する段階であって、該ドメインが膜を含まず、かつ天然の構造で維持されている段階。
6. フリン開裂配列が、タンパク質の表面、表面ループ、および、大部分が極性残基である領域からなる群より選択される領域に挿入される、請求項5記載の方法。
7. フリン開裂配列が配列番号：1〜3からなる群より選択される、請求項5記載の方法。
8. αウイルスが、シンドビスウイルス、西ナイル熱を引き起こすウイルス、ベネズエラ脳炎（Venezuelan Encephalitis）ウイルス、および、黄熱病を引き起こすウイルスからなる群より選択される、請求項5記載の方法。
9. αウイルス膜糖タンパク質がシンドビスウイルスE1膜糖タンパク質である、請求項5記載の方法。
10. フリン開裂配列が、E1膜糖タンパク質の130位、133位、および393位からなる群より選択される部位に挿入される、請求項9記載の方法。
11. αウイルスに対するワクチン候補を産生する方法であって、以下の段階を含む方法：
    該αウイルスの膜糖タンパク質を別々のドメインに分離する領域にフリン開裂配列を挿入する段階；
    該フリン開裂配列を含む該膜糖タンパク質をコードする配列を、該αウイルスをコードするベクターに組み込む段階；
    フリンを発現しない宿主細胞において該αウイルスを発現させる段階；および
    該宿主細胞により産生されたαウイルスを収集する段階であって、収集されたウイルスが、αウイルスに対するワクチン候補となる段階。
12. フリン開裂配列が、タンパク質の表面、表面ループ、および、大部分が極性残基である領域からなる群より選択される領域に挿入される、請求項11記載の方法。
13. フリン開裂配列が配列番号：1〜3からなる群より選択される、請求項11記載の方法。
14. αウイルスが、シンドビスウイルス、西ナイル熱を引き起こすウイルス、ベネズエラ脳炎ウイルス、および、黄熱病を引き起こすウイルスからなる群より選択される、請求項11記載の方法。
15. 膜糖タンパク質がシンドビスウイルスE1膜糖タンパク質である、請求項11記載の方法。
16. フリン開裂配列が、E1膜糖タンパク質の130位、133位、および393位からなる群より選択される部位に挿入される、請求項15記載の方法。

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