CN1809643A - 在膜蛋白中插入弗林蛋白酶切割位点及其用途 - Google Patents

在膜蛋白中插入弗林蛋白酶切割位点及其用途 Download PDF

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Abstract

在膜糖蛋白域之间插入弗林蛋白酶的切割位点。在高尔基体外侧网络，通过弗林蛋白酶切割，把蛋白分成单个无膜的域，并保留其天然构象。该操作程序可用于生产病毒膜蛋白域，用于结构分析和疫苗试验。

Description

在膜蛋白中插入弗林蛋白酶切割位点及其用途 相关申请的交叉参考
本非临时专利申请要求2003年5月9日提交的、现已放弃的美国临时专利申请60/469,126的优先权。
                             发明背景
发明领域
本发明一般地涉及膜糖蛋白的研究和用途。更具体说，本发明提供了生产维持天然构象的无膜的膜糖蛋白的方法。
相关领域描述
很多膜糖蛋白以高度约束和能量富集的构象组装在细胞内。含膜病毒的膜蛋白是能量富集蛋白的实例。这些蛋白通过中间体在内质网内组装，二硫键使该中间体处于稳态。因为这个高能量构型，所以从其结合膜中抽提它们时，维持这些蛋白的天然构象如果不是说不可能，也是非常困难的。从膜中抽提这些蛋白导致这些蛋白折叠成为非天然的松散构型，这会使对这些蛋白的结构分析难于进行。在病毒膜蛋白的情况下，非天然构象使这些蛋白在亚基病毒疫苗应用中无效。
在流感病毒的情况下，由于HA1-HA2膜糖蛋白中蛋白酶可及位点的发现(Wiley和Skehel，1977)克服了该构象问题。用该蛋白酶一处理完整病毒，该位点就允许蛋白胞外域释放。释放胞外域保留了它的天然构象，因此可以通过X射线晶体学(Wiley和Skehel，1977)的原子解析确定其结构。
然而，大部分膜蛋白不含如流感病毒中发现的这种蛋白酶可及位点。这一事实和其他蛋白纯化方法的失败，使得不可能获得天然构象的这些蛋白。因此，之前领域缺乏一种生产维持天然构象的无膜的膜糖蛋白的方法。本发明提供了对于这个本领域中长期持续的需求和期望的解决方案。
                          发明摘要
本发明提供用天然存在的细胞蛋白酶来生产膜蛋白域的操作程序，该域从双分子层膜释放后保持其天然构象。这个蛋白水解酶切和释放的事件发生在已经把蛋白运输到内质网外后，也就是在二硫键形成、折叠和与其他蛋白寡聚化(如果需要)过程发生后。在使弗林蛋白酶进入高尔基体后，该蛋白就转化成非膜关联物质，它可以通过防止失去天然构象的操作程序从生长培养基中纯化。该操作程序提供生产病毒膜蛋白域的新机会，以用于结构分析和疫苗试验。
带有弗林插入的病毒可以在宿主细胞中生长到较高的滴度，而并不表达弗林。这些突变病毒可以用作疫苗，因为当把它们注入哺乳动物宿主时，这些病毒会感染并开始装配过程，但在高尔基体外侧网络的蛋白组装最后阶段“自我毁灭”。
因此，在一个实施方式中，本发明包括一种生产膜糖蛋白域的方法，其中该域是无膜的，并且维持天然构象。该方法可包括下述步骤：将弗林蛋白酶切割序列插入到将该膜糖蛋白分成单独域的区域；在宿主细胞中表达该糖蛋白；用弗林蛋白酶在宿主细胞的高尔基体外侧网络中切割糖蛋白，由此产生膜糖蛋白域；从宿主细胞分泌该糖蛋白域；和从宿主细胞的培养基中纯化该糖蛋白域，其中该域是无膜的，并维持天然构象。
在另一实施方式中，本发明包括一种生产α-病毒膜糖蛋白域的方法，该膜糖蛋白用作亚基疫苗候选物，其中所述域是无膜的，并维持天然构象。该方法通常包括下述步骤：将弗林蛋白酶切割序列插入到将膜糖蛋白分成单独域的区域；在宿主细胞中表达该糖蛋白；用弗林蛋白酶在宿主细胞的高尔基体外侧网络中切割糖蛋白，由此产生膜糖蛋白域；从宿主细胞分泌该糖蛋白域；和从宿主细胞的培养基中纯化该糖蛋白域，其中该域是无膜的，并维持天然构象。
在另一实施方式中，本发明包括一种生产α-病毒疫苗候选物的方法。该方法包括下述步骤：将弗林蛋白酶切割序列插入到将α-病毒的膜糖蛋白分成单独域的区域；将编码包含弗林蛋白酶切割序列的膜糖蛋白的序列掺入到一个编码α-病毒的载体上；在不表达弗林蛋白酶的宿主细胞中表达α-病毒；和收集宿主细胞产生的α-病毒，其中收集的病毒即是对α-病毒疫苗的候选物。
本发明其他和进一步的方面、特征和优点在下面的本发明优选实施例的描述中是显而易见的。给出这些实施例是为了公开的目的。
附图说明
图1：由氨基酸129-140分隔开辛德毕斯病毒的E1糖蛋白中的功能和结构域。在残基130、133或139插入弗林蛋白酶切割位点将把该蛋白切割成17kD的功能域(从膜中释放)和结构域(保留在膜上)。在E1392和393位点会释放整个胞外域。
图2：由辛德毕斯病毒突变体产生的蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳，该蛋白质在E1糖蛋白上含有弗林蛋白酶切割位点。数字标识显示了在E1上应该发生切割的氨基酸位点。Y420，野生型病毒；P75，非病毒信使RNA；E1，包膜蛋白2；C，壳体蛋白。
图3：由辛德毕斯病毒突变体产生的蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳，该蛋白质在位置E1393(F393)处含有弗林蛋白酶切割位点。将两种正常病毒的糖蛋白标识为E1、E2，弗林蛋白酶截断的E1蛋白标识为E1*。C是壳体蛋白。P75，含有非病毒RNA的突变体；Y420，野生型病毒。
                           发明详述
弗林蛋白酶是存在于真核细胞高尔基体外侧网络的蛋白酶(Moehring等，1993)。它的功能是在蛋白就要运达它们的最终细胞目的地之前，切割蛋白。弗林蛋白酶识别共有氨基酸序列RXRR(SEQ ID No.：1)、RXRK(SEQ ID No.：2)或KXKR(SEQ ID No.：3)(其中X是任意氨基酸，Moehring等，1993)，当含有这些序列的蛋白到达高尔基体外侧网络时，将其切割。
本发明中，将一个弗林蛋白酶切割位点引入到一个膜糖蛋白的暴露域(位于外部)。修饰的蛋白将经过正常的折叠和组装过程，获得其天然构型。这些事件对于将它运输到内质网外是必需的。运输到内质网外后，该蛋白沿着分泌途径行进到细胞表面。当该蛋白到达高尔基体外侧网络时，弗林蛋白酶将其切割。蛋白水解事件将该蛋白的胞外域从双分子层膜释放，而不会损坏其构象。该蛋白现在是一个分泌蛋白，可以通过合适的纯化程序从周围培养基中纯化。
为了证实该方法的可行性，选择α-病毒辛德毕斯病毒原型作为模型。该α-病毒代表一类对人类重要疾病负有责任的病毒(虫媒病毒)，这些疾病有登革热、西尼罗河热、委内瑞拉脑炎、黄热病等。虽然有超过600种已知药剂，但是现在可用的只有一种有效疫苗(抗黄热病)。通过生产抽提病毒蛋白的亚基或变性病毒来生产疫苗的尝试都失败了，因为缺乏上述的天然蛋白构象。
辛德毕斯病毒的E1糖蛋白在病毒感染细胞的内质网中组装成一个紧凑、高度约束和能量富集的构象。正确的折叠是将其从内质网运输到细胞表面的先决条件。从膜上去除病毒E1蛋白的尝试导致其天然构象的丢失，因为二硫键搅乱使蛋白成为非天然构象。
已经显示，该蛋白的正确折叠形式被分为两个独立的二硫键稳定域，这两个域之间的连接大约在氨基酸E1-129处(Mulvey和Brown，1994)(图1)。这些域(氨基酸1-129)中的第一个包含穿膜功能(功能域)，而第二个域(130-398)维持二十面晶格结构的完整(结构域)。下面列出的数据显示，在将功能域和结构域分开的区域插入弗林蛋白酶切割位点导致功能域从膜蛋白复合物中以天然构象释放。
选择弗林蛋白酶切割位点插入的位置，可根据蛋白结构确定，或在结构无法获得的情况下，根据生化和/或序列分析来确定。通常，该位点应该是在具有显著极性或带电荷的残基片断上，最可能是在蛋白的表面。如果三维结构是已知的话，插入位点应该在表面环中，该环将排列好的二级结构元件与延伸疏水界面连接。
当该蛋白的结构无法获得时，基于疏水性的方法、二级结构预测法和同源序列比对经常可以帮助揭示该候选位点。如果可以获得少量蛋白，有限的蛋白水解消化，然后通过层析共分级分离和N末端多肽测序/质谱可以帮助确定该候选位点，该位点是蛋白酶消化可及的，且对于形成完整蛋白结构来说不必需在这样位点的切割使蛋白分离成单独的域。
本发明获得无膜的膜糖蛋白的快速方法可以应用于很多病毒，例如HIV、疱疹病毒、冠状病毒等。通常，可以把弗林蛋白酶切割位点插入到任何病毒膜蛋白，只要该病毒能够在缺乏弗林蛋白酶的CHO细胞系中，或在支持病毒复制的弗林蛋白酶缺陷型细胞系中复制即可。释放的病毒糖蛋白中无膜的胞外域可以用作亚基疫苗。
在另一实施方式中，可以在弗林蛋白酶阴性的哺乳动物宿主细胞中产生带有弗林蛋白酶插入的高滴度的病毒颗粒。当注入哺乳动物宿主时，这些病毒就会感染并开始组装过程，但是由于弗林蛋白酶的切割，病毒在高尔基体外侧网络在蛋白组装最后阶段会“自我毁灭”。该方法对于很多病毒均适用(例如HIV、疱疹病毒)，只要弗林蛋白酶阴性细胞系可以支持变异病毒的生长即可。
这里使用的“膜糖蛋白”指任意完整的膜蛋白，它在内质网组装并借助通过高尔基体外侧网络的细胞路径运输至最终目的地。
这里使用的“无膜的膜糖蛋白”指已经从膜上释放的完整的膜蛋白，该蛋白是通过蛋白酶在胞外域某点上切割蛋白进行的。
这里使用的“天然构象”指蛋白在内质网中折叠所获得的构象。对于病毒蛋白来说，也指成熟的感染性病毒中存在的功能形式。
本发明涉及生产膜糖蛋白域的方法，其中所述域是无膜的，并维持天然构象。在一个实施方式中，该方法可以用来生产病毒膜糖蛋白域，如α-病毒膜糖蛋白域。产生的病毒膜糖蛋白域可以用作亚基疫苗候选物。
首先，将弗林蛋白酶切割序列插入到将膜糖蛋白分成单独域的区域。通常，合适的区域包括蛋白表面、表面环或具有明显极性的残基的区域。优选地，该弗林蛋白酶切割序列是SEQ ID No.1、2或3的序列。宿主细胞中一表达该修饰糖蛋白，通过弗林蛋白酶切割就在高尔基体外侧网络中把该糖蛋白分离成不同域。然后，可以从宿主细胞培养基中纯化该糖蛋白域，其中纯化蛋白域是无膜的，并维持天然构象。
本发明也涉及生产α-病毒疫苗候选物的方法。该方法包括将弗林蛋白酶切割序列插入到将α-病毒膜糖蛋白分成单独域的区域。通常，合适的区域包括蛋白表面、表面环或具有明显极性的残基的区域。优选地，该弗林蛋白酶切割序列是SEQ IDNo.1、2或3的序列或片断，或这些弗林蛋白酶切割序列之一的明显突变体。然后将该修饰糖蛋白掺入到编码α-病毒的载体中，并在不表达弗林蛋白酶的宿主细胞中表达。由这些宿主细胞产生的α-病毒即α-病毒疫苗候选物。
给出下述实施例的目的在于说明本发明的各种实施方式，而并无意以任何方式限制本发明。本领域技术人员容易理解，本发明很适合实现其目的和获得上述的结果和优点，以及这里包含的目的、结果和优点。本领域技术人员能够在权利要求的范围限定的本发明精神的范围内对本发明做出改动和用于其他用途。
                        实施例1
蛋白域在弗林蛋白酶切割后以天然构象释放
为了从膜蛋白复合体中释放辛德毕斯病毒的E1糖蛋白的第一个域，将弗林蛋白酶切割位点插入到将该蛋白的结构域与功能域分离开的区域。在病毒RNA的全长cDNA克隆中，用Quick-ChangeTM突变技术(Strategene)来完成该过程(Rice等，1987)。
表1显示了用于产生这些突变的引物。当可能时，用天然存在的氨基酸序列在位置E1-130(RXRK，SEQ ID No.2)、E1-133(KXKR，SEQ ID No.3)和E1-139(RXRR，SEQ ID No.1)制造突变，以置入弗林蛋白酶敏感序列。对这些位点的选择基于下述研究，该研究证明这些位点暴露在蛋白表面并因此可用于蛋白酶切割(Pbinney等，2000；Phinney和Brown，2000)。
据预测，这些突变会在E1蛋白接触带有弗林蛋白酶的细胞时，导致其远端E1蛋白域释放。这会将分子量为58KD的完整E1蛋白改变成两个分子量大约为17kD和41kD的蛋白。为了在病毒糖蛋白的正常折叠过程中控制氨基酸改变效应，将含有突变的病毒RNA转染到不含弗林蛋白酶的CHO(中国仓鼠卵巢)细胞系(CHO-RPE40)(Moehring等，1993；Moehring和Moehring，1983)。
图2显示用E1突变体F130、F133和F139的构建体的转染哺乳动物细胞中产生的蛋白。将切割位点置于位置E1-130和E1-133导致产生新的蛋白种类，凝胶迁移中，其分子量大约为41和17KD，与预测相符。17kD蛋白的量相当少，因为这里显示的蛋白是与细胞结合的蛋白，而很可能大多数17kD蛋白被分泌到培养基中。在野生型转染(Y420)或转染非病毒信息(P75)的细胞中，并没有看到这些蛋白。
E1393突变体是用来释放整个E1胞外域(见图1)。图3显示了从BHK细胞培养基中免疫沉淀的蛋白的SDS PAGE，该细胞是用393突变体的RNA转染的。
在突变体E1139的情况下，在E1392处的突变不能产生期望表型(数据未显示)。用突变弗林蛋白酶E1392的cDNA克隆产生的RNA转染BHK细胞，使得某种蛋白释放到培养基中，该蛋白的凝胶迁移速度比糖蛋白E2更快，并被抗全病毒的抗体免疫沉淀。野生型E1有439个氨基酸(58kDa)，野生型E2有423个氨基酸(53kDa)，而截短的E1胞外域预计有392个氨基酸(51kDa)，从羧基端丢失了47个氨基酸。
如图3所示，E1393突变体(F393)比野生型E1产生更多的截短E1，说明在393切割位点发生了有效加工。
                        表1
            用于产生E1弗林蛋白酶敏感突变的引物组
  突变体  引物组   SEQ ID No.
  F-130  正义5’GCACACTCGCGCGCGGAAAGTAGG 3’反义5’CCTACTTTCCGCGCGCGAGTGTGC 3’   45
  F-133  正义5’CCGCGATGAAAGTAAAACGCCGTATTGTGTACG 3’反义5’CCGTACTCAATACGGCGTTTTACTTTCATGCGG 3’   67
  F-139  正义5’CTACGGGAGGACTAGGAGATTCCTAGATGTGT 3’反义5’ACACATCTAGGAATCTCCTAGTCCTCCCGTAC 3’   89
  F-392  正义5’GAGCACCCCGAGACACAAAAGAGACCAAGAATTTC 3’反义5’GAAATTCTTGGTCTCTTTTGTGTCTCGGGGTGCTC 3’   1011
  F-393  正义5’GAGCACCCCGCACAGAAATAGACGAGAATTTCAAGC 3’反义5’GCCGGCTTGAAATTCTCGTCTATTTCTGTGCGGGGT 3’   1213
                           实施例2
每割带有弗林蛋白酶插入的病毒
表2显示感染病毒生产中弗林蛋白酶位点插入的影响。表2显示含有弗林蛋白酶切割位点的突变体在其RNA转染到含有弗林蛋白酶敏感序列的BHK-21细胞时，产生非常低水平的感染病毒。
相反，当这些突变体转染到没有弗林蛋白酶活性的CHO-RPE40细胞时，则产生野生(Y420)量的病毒。对于F-130和F-133突变体来说，此结果显示弗林蛋白酶切割位点在这些位置的存在，并不阻止E1的正确折叠，当该位点掺入到感染病毒中时。在BHK细胞中，感染病毒的生产被抑制了5-6个数量级，因为弗林蛋白酶已经将折叠的E1蛋白切割成两个单独域。突变体F-139在BHK细胞中显示了类似的生长抑制，即使并未发生E1的明显切割。在139取代的情况下，该突变位置去除了两个糖基化位点(Pletnev等，2001)之一，这是由该部分糖基化蛋白更快的凝胶迁移所证明的。糖基化位点的去除可能导致构象变化，而阻止感染病毒的生产。
E1 193突变体从BHK细胞产生的滴度为103病毒粒子，相比而言，野生型病毒在相似的RNA转染条件下产生的滴度为109。突变体393在CHO RPE40细胞(弗林蛋白酶阴性细胞)中产生107到108病毒粒子/毫升。因此E1 393突变体比野生型或E1130和E1 133突变体产生的病毒明显少(表2)。这个差异的原因并不清楚，但可能暗示在弗林蛋白酶393-取代的糖蛋白中，折叠效率或寡聚物形成效率降低。
                      表2
             E1弗林蛋白酶突变体的复制
  突变体   在BHK-21中的生长  在CHO-RPE40中的生长
  Y420(野生型)   1.0×109  1.25×1010
  F-130   4.0×104  5.23×1010
  F-133   4.4×105  5.13×1010
  F-139   5.8×104  1.95×1010
  F-393   103  107-108
下面是本申请引用的文献：
Moehring等，Expression of mouse furin in a Chinese hamster cell resistantto Pseudomonas exotoxin A and viruses complements the genetic lesion.J Biol.Chem.268：2590-4(1993).
Moehring和Moehring，Strains of CHO-K1 cells resistant to Pseudomonasexotoxin A and cross-resistant to diphtheria toxin and viruses.Infecct.Immun.41：998-1009(1983).
Mulvey和Brown，Formation and rearrangement of disulfide bonds duringmaturation of the Sindbis virus E1glycoprotein.J.Virol.68：805-812(1994).
Phinney和Brown，Sindbis virus glycoprotein E1 is divided into twodiscrete domains at amino acid 129 by disulfide bridge connections.J Virol.74：9313-6(2000).
Phinney等，The surface conformation of Sindbis virus glycoproteins E1and E2 at neutral and low pH，as determined by mass spectrometry-based mapping.J Virol.74：5667-78(2000).
Pletnev等，Locations of carbohydrate sites on alphavirus glycoproteinsshow that E1 forms an icosahedral scaffold.Cell 105：127-36(2001).
Rice等，Production of infectious RNA transcripts from Sindbis virus cDNAclones：mapping of lethal mutations，rescue of a temperature-sensitive marker，and in vitro mutagenesis to generate defined mutants.J Virol.61：3809-19(1987).
Wiley和Skehel，Crystallization and x-ray diffraction studies on thehaemagglutinin glycoprotein from the membrane of influenza virus.J Mol.Biol.112：343-7(1977).
本说明书中涉及的任何专利和出版物均说明了该发明所属于的本领域技术人员的水平。另外，这些专利和出版物在本申请中以相同形式引入作为参考，即在引入各出版物作为参考时，作出具体地个别说明。
序列表
<110>D.T.布朗(BROWN，DENNIS T.)
<120>在膜蛋白中插入弗林蛋白酶切割位点及其用途
<130>CLFR：236WO
<140>PCT/US2004/014485
<141>2004-05-07
<150>60/469,126
<151>2003-05-09
<160>13
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>4
<212>PRT
<213>未知生物
<220>
<223>未知生物的描述：弗林切割位点中的共有氨基酸序列
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)
<223>X＝任何天然存在的氨基酸
<400>1
Arg Xaa Arg Arg
  1
<210>2
<211>4
<212>PRT
<213>未知生物
<220>
<223>未知生物的描述：弗林切割位点中一致的氨基酸序列
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)
<223>X＝任何天然存在的氨基酸
<400>2
Arg Xaa Arg Lys
  1
<210>3
<211>4
<212>PRT
<213>未知生物
<220>
<223>未知生物的描述：弗林切割位点中一致的氨基酸序列
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)
<223>X＝任何天然存在的氨基酸
<400>3
Lys Xaa Lys Arg
  1
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：突变体F130的正义引物
<400>4
 gcacactcgc gcgcggaaag tagg                                       24
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：突变体F130的反义引物
<400>5
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<210>6
<211>33
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<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：突变体F133的正义引物
<400>6
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<210>7
<211>33
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<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：突变体F133的反义引物
<400>7
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>人工序列的描述：突变体F139的正义引物
<400>8
ctacgggagg actaggagat tcctagatgt gt                                   32
<210>9
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：突变体F139的反义引物
<400>9
acacatctag gaatctccta gtcctcccgt ac                                   32
<210>10
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<213>人工序列
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<223>人工序列的描述：突变体F392的正义引物
<400>10
gagcaccccg agacacaaaa gagaccaaga atttc                               35
<210>11
<211>35
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<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：突变体F392的反义引物
<400>11
gaaattcttg gtctcttttg tgtctcgggg tgctc                               35
<210>12
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<220>
<223>人工序列的描述：突变体F393的正义引物
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gagcaccccg cacagaaata gacgagaatt tcaagc                               36
<210>13
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：突变体F393的反义引物
<400>13
gccggcttga aattctcgtc tatttctgtg cggggt                               36

Claims (16)

1.一种生产膜糖蛋白域的方法，其中所述域是无膜的，并且维持天然构象，所述方法包括下述步骤：
将弗林蛋白酶切割序列插入将所述膜糖蛋白分成单独域的区域；
在宿主细胞中表达所述糖蛋白；
用弗林蛋白酶在所述宿主细胞的高尔基体外侧网络中切割所述糖蛋白，由此产生膜糖蛋白域；
从所述宿主细胞分泌所述糖蛋白域；和
从所述宿主细胞的培养基中纯化所述糖蛋白域，其中所述域是无膜的，并维持天然构象。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述弗林蛋白酶切割序列插入在选自蛋白表面、表面环和具有明显极性的残基区域的区域。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述弗林蛋白酶切割序列选自SEQID No.1-3的序列。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述膜糖蛋白是病毒膜糖蛋白。
5.一种生产α-病毒膜糖蛋白域的方法，该膜糖蛋白域用作亚基疫苗候选物，其中所述域是无膜的，并维持天然构象，所述方法包括下述步骤：
将弗林蛋白酶切割序列插入到将所述膜糖蛋白分成单独域的区域；
在宿主细胞中表达所述糖蛋白；
用弗林蛋白酶在所述宿主细胞的高尔基体外侧网络中切割所述糖蛋白，由此产生膜糖蛋白域；
从所述宿主细胞分泌所述糖蛋白域；和
从所述宿主细胞的培养基中纯化所述糖蛋白域，其中所述域是无膜的，并维持天然构象。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，将所述弗林蛋白酶切割序列插入到选自蛋白表面、表面环和具有明显极性的残基区域的区域。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述弗林蛋白酶切割序列选自SEQID No.1-3的序列。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述α-病毒选自辛德毕斯病毒、引起西尼罗河热的病毒、委内瑞拉脑炎病毒和引起黄热病的病毒。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述α-病毒膜糖蛋白是辛德毕斯病毒E1膜糖蛋白。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，将弗林蛋白酶切割序列插入到所述E1膜糖蛋白中选自130、133和393的位置。
11.一种生产α-病毒疫苗候选物的方法，所述该方法包括下述步骤：
将弗林蛋白酶切割序列插入到将所述α-病毒的膜糖蛋白分成单独域的区域；
将一个编码包含所述弗林蛋白酶切割序列的所述膜糖蛋白的序列掺入到一个编码所述α-病毒的载体上；
在不表达弗林蛋白酶的宿主细胞中表达所述α-病毒；和
收集所述宿主细胞产生的α-病毒，其中收集的病毒即α-病毒疫苗候选物。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，将所述弗林蛋白酶切割序列插入到选自蛋白表面、表面环或具有明显极性的残基区域的区域。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述弗林蛋白酶切割序列选自SEQ ID No.1-3的序列。
14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述α-病毒选自辛德毕斯病毒、引起西尼罗河热的病毒、委内瑞拉脑炎病毒和引起黄热病的病毒。
15.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述膜糖蛋白是辛德毕斯病毒E1膜糖蛋白。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，将弗林蛋白酶切割序列插入到所述E1膜糖蛋白中选自130、133和393的位置。
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