CN1222621C - 新的植物质体启动子序列 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了从拟南芥属质体clpP基因编码序列上游5’侧翼区分离的一种新启动子。本发明还描述了应用质体基因的蛋白质编码区分离间插调节序列的新方法以及应用与天然质体启动子在核苷酸序列方面有所不同的外源质体启动子提高质体转化效率的新方法。

Description

新的植物质体启动子序列
本发明主要涉及植物分子生物学，更具体地涉及从拟南芥分离的新的质体启动子及其应用方法。本发明还涉及应用质体基因的蛋白质编码区分离间插调节序列的新方法。本发明还涉及应用新的质体启动子序列提高质体转化效率。
质体转化(其中使基因通过同源重组插入出现在每个植物细胞中之环状质体基因组的所有数千个拷贝中)利用优于核表达基因的庞大拷贝数之便利，使表达水平可超过可溶性植物蛋白总量的10％。此外，由于质体编码的性状不能通过花粉传播，因而使质体转化比较理想；故避免了有害转基因逃逸到转基因植物野生型亲属的潜在危险。质体转化的其它便利包括可以便于使多个基因作为一个聚顺反子单元同时表达，并且可以消除核转化可能存在的位置效应和基因沉默。质体转化技术在美国专利第5,451,513、5,545,817、5,545,818和5,576,198号中；国际专利申请第WO 95/16783号中；以及在Boynton等，酶学方法217；510-536(1993)，Svab等，美国国家科学院学报90：913-917(1993)，和McBride等，美国国家科学院学报91：7301-7305(1994)(均全文引入作为参考)中有较全面描述。
烟草质体转化的基本技术涉及用位于选择性标记，如抗生素抗性基因侧翼的克隆化质体DNA区对叶组织的粒子轰击。这一命名为靶向序列的1-1.5kb侧翼区促进了与质体基因组的同源重组，并因此使156kb烟草原质体系的特定区被取代或修饰。最初，叶绿体16S rRNA的点突变以及赋予壮观霉素和/或链霉素抗性的rps 12基因在转化中作为选择性标记应用(Svab等，美国国家科学院学报87：8526-8530(1990)；Staub，J.M.& Maliga，P.，植物细胞4：39-45(1992)；均全文引入作为参考)。由此产生稳定的同质转化体，转化频率大约每100次对靶叶的轰击产生一个转化体。这些标记之间的克隆位点的存在使得能产生可导入外源基因的质体靶向载体(Staub，J.M.& Maliga，P.，EMBO J.12：601-606(1993)，已引入本文作为参考)。通过以一个显性选择标记即编码壮观霉素解毒酶氨基糖苷-3’-腺苷转移酶的细菌aadA基因取代隐性rDNA或r-蛋白质抗生素抗性基因可使转化频率实质性提高(Svab等，1993)。此前，这一标记已成功用于绿藻Chlamydomonas reinhardtii质体基因组的高频转化(Goldschmidt-Clermont，M.，核酸研究19：4083-4089(1991)，已引入本文作为参考)。用于植物原生质体中质体转染的技术已有描述(O’Neill等，植物杂志3(5)：729-738(1993)和Koop等，Planta 199：193-201(1996)，均全文引入作为参考)。
应用于质体靶向载体中以在植物质体中表达外源基因的一个特别优选植物质体启动子是clpP基因启动子。clpP基因编码Clp ATP依赖性蛋白酶的蛋白裂解亚单位，这种蛋白酶在拟南芥属植物中是在光合成型和非光合成型植物组织的质体中组成型表达的(Shanklin等，植物细胞7：1713-1722(1995)，已引入作为参考)。clpP还是非光合成植物(如Epifagus virginiana；Morden等，EMBO J10：3281-3288(1991))基因组中保留的为数不多的几个植物质体基因之一，而已知clpP信息在大麦白色突变株(albostrians)的质体中表达，这种突变体缺乏可检测的质体翻译活性(Hubschmann & Borner，植物分子生物学36：493-496(1998))。故，clpP启动子甚至在非绿色质体中似乎也具有转录活性。对烟草clpP基因的启动子区的鉴定在WO 97/06250(已引入本文为参考)中有述。在这一参考文献中，烟草clpP基因经鉴定具有可被核编码质体(NEP)RNA聚合酶和质体编码质体(PEP)RNA聚合酶识别的5’启动子序列。由定位于-53位核苷酸(从翻译起始密码子ATG向上游)的烟草clpP启动子序列产生的一种初步转录体已在WO 97/06250中得到鉴定，它能在因缺失rpoB基因而缺乏质体编码的RNA聚合酶的烟草突变体的白化质体中以高水平表达。
一种烟草clpP启动子序列已用于驱动抗除草剂形式的拟南芥植物原卟啉原IX(“PROTOX”)基因在烟草质体中的表达(WO 97/32011，已引入本文为参考)。取代GUS报道基因的相同构建体已导入烟草质体，证实了clpP驱动的表达不局限于绿色质体，也可发生于根质体(白色体，造粉体)和花质体(色质体)中。
尽管质体转化技术显示了希望，但直到最近，这项技术才应用于除烟草以外的其它植物。国际专利申请第WO 97/32977号(已引入本文作为参考)描述了用于在十字花科，如芸苔属植物和拟南芥属植物中用叶和子叶细胞创造转质体(transplastomic)植物的方法和组合物。然而，除此之外还需要非烟草植物，尤其拟南芥属植物的新的质体启动子序列，这种序列能用于驱动转基因在拟南芥属植物及任何其它植物物种的绿色和非绿色质体中进行表达。
从上述角度看，本发明的目标之一是提供来自拟南芥的能在所有类型质体中发挥功能的新的质体启动子。本发明的另一目标是提供利用质体基因的蛋白质编码区分离新的间插调节序列，如新的启动子序列或者3’或5’RNA非翻译序列的方法。本发明的又一目标是应用新的质体启动子序列，通过减少质体基因组中天然DNA序列与已插入质体转化载体的嵌合DNA片段中的外源DNA序列之间不必要的同源重组，而提高质体转化效率。
本发明更进一步提供从拟南芥质体clpP基因编码序列上游的5’侧翼区分离的核酸启动子。在一个优选实施方案中，本发明的核酸启动子实质上类似于SEQ ID NO：1第263位核苷酸下游的启动子序列。在一个更优选实施方案中，本发明的核酸启动子具有与SEQ ID NO：1第263位核苷酸下游之启动子序列完全相同的序列。在另一实施方案中，本发明的核酸启动子实质上类似于SEQ ID NO：1。在另一实施方案中，本发明的核酸启动子包含在SEQ ID NO：1中。在另一实施方案中，本发明的核酸启动子包含一段20个碱基对的核苷酸部分，该部分与SEQ ID NO：1中一段连续20个碱基对的核苷酸部分具有相同序列。本发明还包含嵌合基因，其中本发明的核酸启动子与目的基因的编码序列可操作连接；含有一个这样的嵌合基因的植物转化载体；以及分别含有一个这样的嵌合基因的转基因植物、植物细胞、植物种子、植物组织、或植物质体。
在另一方面，本发明提供用于分离两种质体基因的蛋白质编码区之间的间插调节DNA序列的新方法，该方法包括以下步骤：
(a)测定两种质体基因的相对取向以及它们的蛋白质编码区的简并或特异性核苷酸序列；
(b)根据所测两种质体基因之一的蛋白质编码区序列设计第一个简并或特异性PCR引物；
(c)根据所测两种质体基因之另一种的蛋白质编码区序列设计第二个简并或特异性PCR引物；
(d)用步骤(b)和(c)的引物扩增一段DNA片段，其中所扩增的DNA片段包含两种质体基因蛋白质编码区之间的一段间插调节DNA序列。
在该方法的一个优选实施方案中，所述两种质体基因为clpP基因和psbB基因。根据这一实施方案，所述间插调节DNA序列包含一个clpP启动子。在该方法的另一优选实施方案中，所述两种质体基因为16S rRNA基因和缬氨酸tRNA基因。根据这一实施方案，所述间插调节DNA序列包含一个16S rRNA启动子。
在另一方面，本发明提供一种改进的质体转化法，包括用含有质体活  性调节序列以及与之可操作连接的目的编码序列的嵌合基因转化宿主植物的质体，其中所述调节序列具有与该宿主植物质体中相应天然调节序列相同性不到90％的核苷酸序列，其中所述嵌合基因中的调节序列与该宿主植物质体中相应的天然调节序列之间不理想的体细胞重组已减少。在该方法的一个优选实施方案中，所述嵌合基因分离自该宿主植物的质体基因组，并至少约10％的调节序列核苷酸已发生突变。在该方法的另一优选实施方案中，所述嵌合基因中的调节序列分离自不同于宿主的其它植物的质体基因组。例如，所述嵌合基因中的调节序列可能分离自拟南芥属植物的质体基因组。在一个特别优选实施方案中，所述嵌合基因中的调节序列是分离自拟南芥属植物clpP基因编码序列上游5’侧翼区的核酸启动子。在另一特别优选实施方案中，所述嵌合基因中的调节序列是分离自拟南芥属植物16S rRNA基因编码序列上游5’侧翼区的核酸启动子。
本发明的其它目标和便利之处在本领域技术人员研究了以下对本发明的描述和非限制性实施例之后，将十分明了。
                   对序列表中序列的描述
SEQ ID NO：1是拟南芥属植物clpP基因启动子区的核苷酸序列。
SEQ ID NO：2是实施例1中所用引物A_clpP。
SEQ ID NO：3是实施例1中所用引物A_psbB。
SEQ ID NO：4是实施例2中所用引物Aclp_P1a。
SEQ ID NO：5是实施例2中所用引物Aclp_P2b。
SEQ ID NO：6是实施例2中所用引物rps 16P_1a。
SEQ ID NO：7是实施例2中所用引物rps 16P_1b。
SEQ ID NO：8是实施例3中所用顶链(top-strand)引物。
SEQ ID NO：9是实施例3中所用底链(bottom-strand)引物。
SEQ ID NO：10是拟南芥属植物16S rRNA基因启动子区的核苷酸序列。
SEQ ID NO：11是实施例4中所用顶链引物。
SEQ ID NO：12是实施例4中所用底链引物。
                           定义
为了更明确，对说明书中所用的某些术语作如下定义：
相关/可操作连接：指两段物理相关或功能相关的核酸序列。例如，若一段启动子或调节DNA序列与编码一段RNA或一种蛋白质的DNA序列可操作连接，或所处位置使该调节DNA序列能影响该编码或结构DNA序列的表达水平时，称这两种序列“相关”。
嵌合基因/融合序列：一段重组核酸序列，其中启动子或调节核酸序列与编码mRNA或表达为蛋白质的核酸序列可操作连接或相关，从而使该调节核酸序列能调节所相关核酸序列的转录或表达。自然界中，嵌合基因的调节核酸序列通常不与该相关的核酸序列可操作连接。
编码序列：可转录为RNA如mRNA，rRNA，tRNA，snRNA，有义RNA或反义RNA的核酸序列。优选该RNA随后在生物体中被翻译为蛋白质。
基因：基因组中一段特定区，且除了上述编码序列以外，还包含其它部分，主要有负责控制表达，即编码部分的转录和翻译的调节序列。基因还可包含其它5’和3’非翻译区以及终止序列。还可能会出现的元件有，例如内含子。
目的基因：任何下述基因，当将它们转移至植物中时，赋予该植物所需特性如抗生素抗性、病毒抗性、昆虫抗性、疾病抗性、或对其它有害生物的抗性、除草剂耐受性、营养价值提高、工业化加工中的性能改善或再生能力的改变。“目的基因”还可以是转移至植物中用于在该植物中生产有商业价值的酶类或代谢产物的基因。
异源核酸序列：一段并非与其将导入之宿主基因组天然相关的核酸序列，包括天然核酸序列的非天然多重拷贝。
同源核酸序列：一段与其将导入之宿主基因组天然相关的核酸序列。
同源重组：同源核酸分子之间核酸片段的相互交换。
分离的：在本发明的内容中，分离的核酸分子或分离的酶是通过人为手段使其脱离其天然环境而存在并因此而不属于自然产物的核酸分子或酶。分离的核酸分子或酶可能以纯化形式存在，也可能存在于非天然环境如转基因宿主细胞中。
最小启动子：缺乏上游活化作用时没有活性或启动子活性大大降低的启动子元件。在有适当转录因子存在时，该最小启动子能发挥功能使转录进行。
核酸分子/核酸序列：可从任何来源分离的单链或双链DNA或RNA线性片段。在本发明中，所述核酸分子优选为DNA片段。
植物：处于任何发育阶段的任何植物，尤其种子植物。
植物细胞：植物的结构和生理单位，包含原生质体和细胞壁。所述植物细胞可能是分离的单细胞或培养细胞形式，或作为较高级单位如植物组织、植物器官、或植物整体的一部分。
植物细胞培养物：对植物单位如原生质体、培养细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子以及处于各种发育阶段的胚的培养物。
植物材料：植物的叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、合子、种子、插条、细胞或组织培养物、或任何其它部分或产物。
植物器官：植物中独立的、具有肉眼可见结构的分化部分，如根、茎、叶、花蕾、或胚。
植物组织：本文中指组成一个结构和功能性单位的一组植物细胞。包括植物中的或培养中的任何植物组织。该术语包括，但不限于，整个植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及组成一定结构和/或功能单位的任意组植物细胞。该术语与上文所列任何特殊类型的植物组织联合使用、或在缺乏上文所列任何特殊类型的植物组织时使用、或包含在本定义中时并不打算排除任何其它类型的植物组织。
启动子：编码区上游一段非翻译DNA序列，包含RNA聚合酶II的结合位点，可起始DNA的转录。启动子区可能还包括能作为基因表达的调节物发挥功能的其它元件。
原生质体：无细胞壁或只有部分细胞壁的分离的植物细胞。
调节序列：有助于、可提高、或可影响相关的结构核酸序列(编码蛋白质或其它基因产物)的转录、翻译或表达的一段非翻译核酸序列。调节序列包括启动子。启动子序列通常位于翻译序列的5’端，常常是距离翻译起始点5’端20-100个核苷酸的位置。调节序列还可包括位于编码序列5’和3’端、可转录但不能翻译的核酸序列。这些非翻译RNA通常参与基因表达的转录后调节。
实质上相似：对核酸而言，是与参照核酸分子有至少60％序列相同的核酸分子。在一个优选实施方案中，一段实质上相似的DNA序列与参照DNA序列至少80％相同；在一个更优选实施方案中，一段实质上相似的DNA序列与参照DNA序列至少90％相同；在一个最优选实施方案中，一段实质上相似的DNA序列与参照DNA序列至少95％相同。一段实质上相似的核苷酸序列通常可与参照核酸分子，或它们的片段在下述条件下杂交：在7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO4 pH7.0，1mM EDTA，50℃杂交；用2X SSC，1％SDS，在50℃漂洗。对蛋白质或肽而言，一段实质上相似的氨基酸序列是与参照蛋白质或肽的氨基酸序列至少90％相同，并具有与参照蛋白质或肽实质上相同的活性的氨基酸序列。
耐受性：当接触抑制物或除草剂时能继续正常生长或发挥正常功能的能力。
转化：将外源DNA导入细胞、组织、或植物，包括植物质体的过程。转化的细胞、组织或植物均理解为不仅包含转化过程的终产物，还包含它们的转基因后代。
转化的/转基因的/重组的：指导入了异源核酸分子的宿主生物体如细菌或植物。该核酸分子可稳定整合至该宿主的基因组中，或该核酸分子还可作为染色体外分子存在。这类染色体外分子可自我复制。转化的细胞、组织、或植物均理解为不仅包含转化过程的终产物，还包括它们的转基因后代。“非转化的”、“非转基因的”或“非重组的”宿主指不包含异源核酸分子的野生型生物体如细菌或植物。
核苷酸用它们的碱基表示，碱基缩写标准如下：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、和鸟嘌呤(G)。氨基酸也类似地用以下缩写表示：丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酰胺(Gln；Q)、谷氨酸(Glu；E)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)、和缬氨酸(Val；V)。此外，(Xaa；X)代表任何氨基酸。
本发明提供了来自拟南芥质体基因组、可编码Clp ATP-依赖性蛋白酶之植物类似物的clpP基因的启动子区。所公开的启动子可用于驱动转基因植物质体中选择性标记基因或其它目的基因的编码序列的表达。本发明的启动子十分有用于转基因在绿色和非绿色质体中的组成型表达，并因此特别有用于植物如玉米中的质体转化，其中对可再生转化体的选择需要在非绿色组织中选择。
本发明的拟南芥属植物clpP启动子可根据本领域已知的方法掺入质体转化载体并转化进质体中，所述方法尤其包括：美国专利第5,451,513、5,545,817、5,545,818和5,576,198；国际专利申请第WO 95/16783、WO 97/32011和WO 97/32977；以及Svab等(1993)和McBride等(1994)。
本发明还提供应用质体基因的蛋白质编码区分离新的间插调节序列，如新的启动子或者3’或5’UTR的新方法。本申请人用于分离拟南芥质体clpP启动子区和拟南芥质体16S rRNA启动子区的技术(如下文实施例所详述)是这类方法的具体实施。简之，当拟南芥属质体基因组中的基因顺序相对于烟草(其完整质体基因组序列均已知的一种植物)的基因顺序为保守时可便于这些启动子区的分离。在烟草中，clpP的取向与psbB基因(其编码序列在很多植物物种之间是保守的)相背离。由于烟草中psbB起始密码子与取向相背离的clpP起始密码子之间只分隔445个碱基对，故相背离的clpP和psbB基因的蛋白质编码区序列可用于设计经PCR扩增这些基因之间非编码区的引物。该区包括在一个方向上的psbB启动子和在另一方向上的clpP启动子。在表达序列标签(EST)数据库中发现了拟南芥属植物的EST序列，它似乎包括clpP编码序列的一部分以及5’非翻译RNA(5’UTR)。可根据拟南芥属植物DNA序列中编码clpP蛋白质假定起始区的序列，用所述EST序列设计用于对clpP启动子进行PCR扩增的引物。这些引物与经设计和psbB起始密码子附近高度保守DNA序列匹配的序列可配对。应用这些引物可从拟南芥属植物的总DNA中扩增出包括拟南芥属植物质体clpP启动子区的一段近500个核苷酸的DNA片段。一段包括拟南芥属植物质体16S rRNA启动子区的DNA片段可通过类似方法扩增。
应用上述方法，本领域一般技术人员可利用两个非常接近的质体基因的蛋白质编码区，从任何植物的质体基因组中分离间插非翻译序列，如启动子以及其它调节序列。优选两个质体基因相互比邻，使这两个接近的质体基因之间没有其它被转录序列；但可以预见，即使在这两个接近的质体基因之间的扩增区内存在一个小基因如编码tRNA的基因，该方法也能实行。在一个优选实施方案中，本领域的一般技术人员可应用上述方法从任何植物的质体基因组中分离质体clpP启动子。在另一优选实施方案中，本领域的一般技术人员可应用上述方法从任何植物的质体基因组中分离质体16S rRNA启动子。
本发明还提供应用新的质体启动子如拟南芥属植物质体clpP或16S rRNA启动子，通过减少质体基因组中天然DNA序列与插入质体转化载体内的嵌合DNA片段中所含外源DNA序列之间不必要的重组，而提高质体转化效率的方法。已知质体基因组中的天然DNA序列与外源DNA序列之间的同源区相对较短也能最终导致在质体转化体中发生体细胞重组。这一生物学特性甚至已作为一种方法用于通过使选择性标记侧翼带有相同的重复异源DNA序列而使这些选择性标记从绿藻-衣藻叶绿体的质体转化体中除去。尽管既没有鉴别出发生重组需要的同源片段最小大小，也没有鉴别出足以发生重组的具体同源片段中序列相同性精确程度，但与质体基因组有少至50bp的同源片段可能就足以诱导重组。这些重组事件可在转基因植物中观察，如已发生质体基因组重排的细胞分裂后使叶片产生白化区。在更极端的实例中，叶子几乎全部白化，只剩下小片绿色，说明大多数体细胞及它们的子代均发生了重组。
非重组性的调节序列(如启动子以及5’和3’UTR区)的基本特征包括控制外源基因在目的植物物种的质体中正确表达的能力，以及缺乏启动同源质体重组所需的足够序列相同性。后一特征可通过应用来自不同植物(因序列差异使相同性不到85-90％)质体基因组的异源调节序列获得，或可以通过使同一植物物种的质体基因组的天然调节序列发生足够多的突变而获得。在一个实施方案中，该方法涉及利用本发明的拟南芥属植物clpP启动子指导目的基因在异源植物物种如烟草、玉米、水稻、大豆、西红柿、马铃薯、或其它植物的质体中转录。在另一实施方案中，该方法涉及利用实施例中所述拟南芥属植物的16S rRNA启动子指导目的基因在异源植物物种如烟草、玉米、水稻、大豆、西红柿、马铃薯、或其它植物的质体中转录。除了高等植物质体基因，对质体转基因的非重组性调节十分有效的异源启动子或者5’和3’UTR区也可从较低等植物或藻类的质体基因、蓝细菌的染色体基因、或感染植物或藻类叶绿体或蓝细菌细胞的病毒的基因组获得。
选择同一植物中已突变不能进行不必要重组的天然基因时，可对调节序列随机诱变以使相对于最初序列的序列相同性下降至多达90％而使选择更加容易。通过将各突变体克隆到在质体中起作用的选择标记基因上游，然后将整个嵌合DNA群体转化至野生型植物的质体中，选择出随机突变调节序列群中仍有质体活性(能在植物质体中发挥正常作用)的亚群。只有那些仍然能在质体中发挥功能的突变序列可使所述选择性标记在转基因植物中表达。还可通过观察叶片扇形分区的频率对表达所述选择性标记的转基因植物进行体细胞重组评估。表达选择性标记并具有所需叶片扇形分区频率的转化植物的质体基因组打靶区随后经测序确定其存在何种突变的调节序列。该突变序列因此符合控制目的基因在质体中表达，并具有相对于天然质体DNA序列足够的序列差异以降低不必要重组频率的标准。
                          实施例
本发明进一步参照以下详述的实施例进行描述。这些实施例意在举例说明，并非限制，除非有特别说明。在此所用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域已知并述于Ausubel(编)，分子生物学最新方案，John Wiley & Sons，Inc.(1994)；T.Maniatis，E.F.Fritsch& J.Sambrook，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)；和T.J.Silhavy，M.L.Berman & L.W.Enquist，基因融合实验，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1984)。
        实施例1：拟南芥属植物clpP启动子区的分离
因拟南芥属质体基因组中的基因顺序恰好相对于烟草(其完整质体基因组序列均已知的一种植物)的基因顺序比较保守，这有利于拟南芥属植物clpP启动子区的分离。在烟草中，clpP的取向与psbB基因相背离，psbB基因已从多种植物物种中测序得到并显示为保守序列。对烟草、玉米、小麦和Nicotiana acumina的psbB序列进行比对，显示最初8个氨基酸如它们的DNA编码序列一样是完全保守的。在烟草中，只有445个碱基对使psbB起始密码子与取向背离的clpP的起始密码子隔开。
鉴于上述，本申请人推测取向背离的clpP基因和psbB基因的蛋白质编码区序列可用于设计引物，用于PCR扩增这些基因之间的间插非编码区。理论上，这一区将包括在一个方向上的psbB启动子以及在另一方向上的clpP启动子。在TIGR NHC AtEST数据库(http：//www.tigr.org)中发现了拟南芥属植物可表达序列标记(EST)序列，该序列似乎包括clpP编码序列的一部分以及5’非翻译RNA(5’UTR)。由于该序列的假定翻译过程与大肠杆菌成熟clpP的相似，并因此似乎不包括质体转位肽，因而推定该EST(TIGR NHC AtEST数据库中SeqID#P_3982)代表质体clpP信号的一部分。然而，因Shanklin等(1995)已提出，拟南芥属植物中有可能存在核编码的clpP同系物，本申请人对这些基因的发现比对真正质体所编码基因的发现更为谨慎。由于由定义可知EST源自所表达的信号，因而预计ESTP_3982不包括任何不转录的clpP启动子区。
ESTP_3982的核苷酸序列可用于根据拟南芥属植物中编码clpP蛋白起点的DNA序列设计引物用于经PCR扩增clpP启动子。这些引物与经设计和psbB起始密码子附近的高度保守DNA序列相匹配的序列可配对，申请人推测这些序列在拟南芥属植物中具有相似保守性。所用引物为：
A_clpP：5’-AAGGGACTTTTGGAACGCCAATAGGCAT-3’(SEQ ID NO：2)
A_psbB：5’-CACGATACCAAGGCAAACCCATGGA-3’(SEQ ID NO：3).
这些引物用Pfu热稳定性DNA聚合酶成功地从拟南芥(栽培品种“Landsburg erecta”)的总DNA中扩增得到约500个核苷酸的一个DNA片段。所述平端DNA片段从两端直接测序(用克隆引物)并随后克隆至载体pGEM5Zf(-)的EcoRV位点，构建质粒pPH146b。这一约500bp的PCR片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。序列分析揭示与烟草clpP启动子区中从clpP起始密码子向上游延伸的一个约200bp区具有86％的序列相同性。因此，SEQ ID NO：1包括拟南芥clpP启动子区。
实施例2：制备在质体转化载体中包含拟南芥clpP启动子和与GUS报道基因融合的天然clpP 5’非翻译序列以及烟草质体rps 16基因之3’非翻译序列的嵌合基因
I.拟南芥质体clpP基因启动子和完整的5’非翻译RNA(5’UTR)的扩增。
以质粒pPH146b的DNA为模板，用在相对于拟南芥属质体clpP基因ATG起始密码子的第-234位核苷酸(SEQ ID NO：1的第263位核苷酸)处引入EcoRI限制位点的一种从左向右“顶链”引物(引物Aclp_P1a：5’-GCG GAATTCATCATTCAGAAGCCCGTTCGT-3’(SEQ ID NO：4；下划线为EcoRI限制性位点))和与相对于clpP启动子ATG起始密码子的-21至-1区同源、在翻译起始点引入BspHI限制性位点的一种从右向左“底链”引物(引物Aclp_P2b：5’-GCG TCATGAAATGAAAGAAAAAGAGAAT-3’(SEQ ID NO：5；下划线为BspHI限制性位点))进行PCR。该PCR反应用Pfu热稳定性DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla CA)在Perkin Elmer 480型热循环仪上按厂家(Perkin Elmer/Roche，Branchburg，NJ)建议的条件如下进行：95℃7分钟，然后按95℃1分钟/43℃2分钟/72℃1分钟进行4个循环，再按95℃1分钟/55℃2分钟/72℃1分钟进行25个循环。一种包含拟南芥属clpP基因的启动子和5’非翻译区、并在ATG附近有两处变化以与烟草clpP序列5’UTR一致的250bp扩增产物(其左端有EcoRI位点，其右端有BspHI位点)用标准过程凝胶电泳纯化，并用EcoRI和BspHI(所有限制酶可从New England Biolabs，Beverly，MA购买)消化。
II.烟草质体rps 16基因3’非翻译RNA序列(3’UTR)的扩增。
以烟草栽培品种“Xanthi NC”的总DNA为模板，用在紧邻编码核糖体蛋白S16之质体rps 16基因的TAA终止密码子之后引入XbaI限制性位点的一种从左向右“顶链”引物(引物rps 16P_1a：5’-GCG TCTAGATCAACCGAAATTCAATTAAGG-3’(SEQ ID NO：6；下划线为XbaI限制性位点))和与相对于rps 16之TAA终止密码子+134至+151的区同源、在rps 16之3’UTR的3’端引入HindIII限制性位点的一种从右向左“底链”引物(引物rps 16P_1b：5’-CGC AAGCTTCAATGGAAGCAATGATAA-3’(SEQ ID NO：7；下划线为HindIII限制性位点))如上述进行PCR。包含rps 16基因之3’非翻译区、并包含与烟草质体DNA序列(Shinozaki等，1986)中第4943-5093位核苷酸相应的区的扩增产物(其左端有XbaI位点，其右端有HindIII位点)经凝胶电泳纯化并用XbaI和HindIII消化。
III.GUS报道基因片段与clpP基因启动子以及5’和3’UTR的连接。
质粒pRAJ275(Clontech)在其ATG起始密码子处包含一个NcoI限制性位点，在其天然3’UTR之后包含一个XbaI位点。用NcoI和XbaI消化该质粒产生一种1864bp的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)报道基因片段。将该片段与上述250bp的拟南芥属clpP启动子EcoRI/BspHI片段、157bp的烟草rps 16之3’UTR XbaI/HindIII片段、以及克隆载体pGEM3Zf(-)(Promega，Madison WI)的3148bpEcoRI/HindIII片段用一个四步反应连接，以构建质粒pPH165。质粒pPRV111a(Zoubenko等，1994)用EcoRI和HindIII消化，将所得7287bp的片段与pPH165的2222bp EcoRI/HindIII片段连接，构建成质体转化载体pPH166。
实施例3：拟南芥属16S rRNA基因启动子区的分离
因拟南芥属质体基因组中的基因顺序恰好相对于烟草(其完整质体基因组均已知的一种植物)的基因顺序保守，这有利于拟南芥属16SrRNA基因启动子区的分离。在与拟南芥属亲缘关系很接近的欧白芥中，16S rRNA基因以及缬氨酸tRNA的取向与在烟草中的(GeneBank录入号CHSARRN1)相同。以拟南芥(cv“Landsburg erecta”)的总DNA为模板，用在烟草以及欧白芥(Sinapis alba)中均保守的下述引物：“顶链”引物(5’-CAGTTCGAGCCTGATTATCC-3’(SEQ ID NO：8))和“底链”引物(5’-GTTCTTACGCGTTACTCACC-3’(SEQ ID NO：9))，经PCR扩增(Pfu Turbo DNA聚合酶，Stratagene，La Jolla，CA)分离拟南芥属16S rRNA基因启动子区。将包含对应于烟草质体基因组(Shinozaki等，1986)第102508-102872位核苷酸的拟南芥属16SrRNA基因启动子区的预计379bp(以欧白芥序列计)的扩增产物经钝端连接至pGEM5Zf(-)(Promega)的EcoRV位点，以构建pArab 16S，进行测序分析并与烟草16S rRNA启动子比较。拟南芥属16S rRNA基因启动子区的产物为369bp，示于SEQ ID NO：10。
实施例4：制备在质体转化载体中包含与烟草rbcL基因的核糖体结合位点、GUS报道基因融合的拟南芥属16S rRNA基因启动子和天然5’非翻译序列以及烟草质体rps 16基因之3’非翻译序列的嵌合基因
I.拟南芥属质体16S rRNA基因启动子和天然5’非翻译序列(5’UTR)的扩增以及与烟草rbcL基因之核糖体结合位点的融合。
以质粒pArab 16S的DNA为模板，用在16S rRNA基因启动子区的5’端(SEQ ID NO：10的第63位)引入EcoRI限制性位点的“顶链”引物(5’-GCCG GAATTCTCGCTGTGATCGAATAAGAATG-3’(SEQ ID NO：11；下划线为EcoRI限制性位点))进行PCR扩增。“底链”引物延伸至16SrRNA基因启动子5’非翻译区的第172位(SEQ ID NO：10)，通过改变第151位(T变为G)(SEQ ID NO：10)、第158位(A变为C)(SEQID NO：10)和第167位(A变为C)(SEQ ID NO：10)使转录起始位点下游的三个ATG发生突变，使烟草rbcL基因的核糖体结合位点(第57569-57585位)(Shinozaki等，1986)作为5’延伸与16S rRNA基因5’UTR的3’端融合，并在核糖体结合位点的3’端引入BspHI位点(5’-GCCT TCATGAATCCCTCCCTACAACTATCCAGGCGCTTCAGATTCGCCTGGAGTT-3’(SEQ ID NO：12；下划线为BspHI限制性位点))。PCR扩增用Pfu Turbo DNA聚合酶试剂盒(Stratagene)进行。包含拟南芥属16S rRNA基因启动子和三个ATG突变了的5’非翻译区以及烟草rbcL基因核糖体结合位点的145bp扩增产物经凝胶电泳纯化，并用EcoRI和BspHI消化，产生一种131bp的产物。
II.将拟南芥属16S rRNA基因启动子、5’UTR和烟草rbcL基因之核糖体结合位点与GUS报道基因和烟草质体rps 16基因3’非翻译区(3’UTR)在质体转化载体中连接。
质粒pRAJ275(Clontech)在ATG起始密码子处有一个NcoI限制性位点，在终止密码子之后有一个XbaI位点。该质粒用NcoI和XbaI消化产生一个1864bp的b-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)报道基因片段。将该片段与131bp拟南芥属16S rRNA基因启动子、5’UTR和烟草rbcL核糖体结合位点EcoRI/BspHI片段、实施例2所述烟草rps 16之3’UTR XbaI/HindIII片段、以及克隆载体pGEM3Zf(-)(Promega，MadisonWI)的3148bp EcoRI/HindIII片段用一个四步反应连接。上述构建体用EcoRI和HindIII消化，将所得2.1kb片段与质粒pPRV111a(Zoubenko等，1994)的7.3kb EcoRI/HindIII片段连接，构建成一种质体转化载体。
实施例5：对烟草质体基因组的biolistic转化
将烟草栽培品种‘Xanthi nc’的种子按1”环形阵列播种在T琼脂培养基上，每平板播7个，使之发芽。播种12-14天后，用包被了实施例2和4所述质粒之DNA的1μm钨粒子(M10，Biorad，Hercules，CA)基本上按Svab，Z.& Maliga，P.((1993)PNAS 90，913-917)所述轰击。轰击过的幼苗在T培养基上培养2天，然后切下叶子，将其离轴侧朝上置于含有500μg/ml壮观霉素二盐酸盐(Sigma，St.Louis，MO)的RMOP培养基平板上在光(350-500μmol光子/m2/s)中生长(Svab，Z.，Hajdukiewica，P.& Maliga，P.(1990)PNAS87，8526-8530)。将轰击3-8周后变白的叶子下出现的抗性苗在同样的选择性培养基上再次克隆培养，使之形成愈伤组织，并对次级苗进行分离和再克隆。不同亚克隆中转化的质体基因组拷贝(同质)的彻底分离通过Southern印迹的标准技术(Sambrook等，(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港)进行评估。BamHI/EcoRI消化的细胞总DNA(Mettler，I.J.(1987)plant Mol Biol Report 5，346-349)在1％Tris-硼酸(TBE)琼脂糖凝胶上分离，转移至尼龙膜(Amersham)并用32P-标记的随机引发DNA序列探测，其中所述探测序列对应于pC8中含有rps7/12质体打靶序列的0.7kb BamHI/HindIII DNA片段。同质苗经无菌操作扎根于含有壮观霉素的MS/IBA培养基(McBride，K.E.等(1994)PNAS 91，7301-7305)上并转移至温室。
对本文所述本发明的各种改变是本领域技术人员显而易见的。这些改变均将包含在所附权利要求书的范围内。
                                  序列表
<110>Novartis AG
<120>新的植物质体启动子序列
<130>PH/5-30422/CGC 1988
<140>
<141>
<160>12
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>499
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(497)..(499)
<223>clpP ATG起始密码子
<220>
<221>misc_feature
<222>((6)..(8))的互补物
<223>psbB ATG起始密码子
<400>1
aaacccatgg aaatacccct ttatcaacga aaaatagaca ctatgtaact ttattgcatt 60
ggaaaaaact atgctacgta cccccccttt ttaggtaatt atttcggaga aaggattaat 120
atttgttcta ttctgttagt aataatggaa caattcaatt catagaaaaa aagggaagcg 180
gatctattct atatccgata agtaccaata tgcaatgggg gttaatccta ttttctatga 240
accaagatag ctattgttgt tgatcattca gaagcccgtt cgtaaaaaat ttcctttagt 300
tttattcatt ctctcttact ttacttttat tttatatttt attttagctt attcaactta 360
tgtattaaat atcattaatt taaatatgat taataaagta ggaaaaaagg ataatagtat 420
taaaaaacga aaccccaatt ttacgtttcc acatcaaagt gaaatagaga acttcattct 480
cttttttttt catttcatg                                              499
<210>2
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：衍生自ESTP_3982的A_clpP PCR引物
<400>2
aagggacttt tggaacgcca ataggcat                                    28
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：衍生自psbB起始密码子附近的保守DNA序列的A_psbB PCR引物
<400>3
cacgatacca aggcaaaccc atgga                                       25
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：Aclp_Pla引物
<400>4
gcggaattca tcattcagaa gcccgttcgt                                  30
<210>5
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：Aclp_P2b引物
<400>5
gcgtcatgaa atgaaagaaa aagagaat                                    28
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：rps 16P_1a引物
<400>6
gcgtctagat caaccgaaat tcaattaagg                                  30
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：rps 16_1b引物
<400>7
cgcaagcttc aatggaagca atgataa                                     27
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：顶链引物
<400>8
cagttcgagc ctgattatcc                                             20
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：底链引物
<400>9
gttcttacgc gttactcacc                                             20
<210>10
<211>369
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>10
cagttcgagc ctgattatcc ctaaacccaa tgaatgtgag tttttctatt ttgacttgct 60
ccctcgctgt gatcgaataa gaatggataa gaggctcgtg ggattgacgt gagggggtag 120
gggtagctat atttctggga gcgaactcca tgcgaatatg aagcgcatgg atacaagtta 180
tgacttggaa tgaaagacaa ttccgaatca gctttgtcta cgaagaagga agctataagt 240
aatgcaacta tgaatctcat ggagagttcg atcctggctc aggatgaacg ctggcggcat 300
gcttaacaca tgcaagtcgg acgggaagtg gtgtttccag tggcggacgg gtgagtaacg 360
cgtaagaac                                                         369
<210>11
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：顶链引物
<400>11
gccggaattc tcgctgtgat cgaataagaa tg                               32
<210>12
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：底链引物
<400>12
gccttcatga atccctccct acaactatcc aggcgcttca gattcgcctg gagtt      55

Claims (12)

1.一种分离的启动子序列，其中包含SEQ ID NO：1的核苷酸263-499。
2.一种嵌合基因，其中包含权利要求1的启动子序列以及与之可操作连接的、编码目的基因的序列。
3.一种植物转化载体，其中包含权利要求2的嵌合基因。
4.一种转基因植物细胞，其中包含权利要求2的嵌合基因。
5.一种转基因植物组织，其中包含权利要求2的嵌合基因。
6.一种转基因植物质体，其中包含权利要求2的嵌合基因。
7.一种分离的启动子序列，其中包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。
8.一种嵌合基因，其中包含权利要求7的启动子序列以及与之可操作连接的、编码目的基因的序列。
9.一种植物转化载体，其中包含权利要求8的嵌合基因。
10.一种转基因植物细胞，其中包含权利要求8的嵌合基因。
11.一种转基因植物组织，其中包含权利要求8的嵌合基因。
12.一种转基因植物质体，其中包含权利要求8的嵌合基因。
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