DE112009001385T5

DE112009001385T5 - Fettsäure-Dehydratasen und Anwendungen davon

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Publication number: DE112009001385T5
Application number: DE112009001385T
Authority: DE
Inventors: Jörg BAUER; Xiao Qiu
Original assignee: Bioriginal Food and Science Corp; BASF Plant Science GmbH
Current assignee: Bioriginal Food and Science Corp; BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2008-06-03
Filing date: 2009-06-02
Publication date: 2011-04-14
Also published as: AU2009253939B2; US20110088123A1; WO2009147127A1; US8901374B2; EP2285967B1; CA2726489A1; AU2009253939A1; EP2285967A1

Abstract

Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus folgendem besteht:
a) einer Nukleinsäuresequenz, welche eine Fettsäure-Dehydratase aus Brassica napus oder Euglena gracilis codiert;
b) einer Nukleinsäuresequenz, umfassend eine Sequenz, wie sie in der SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 gezeigt ist;
c) einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz umfasst, wie sie in der SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 gezeigt ist;
d) einer Nukleinsäuresequenz, die eine natürlich vorkommende allelische Variante eines Polypeptids codiert, umfassend die Aminosäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 gezeigt ist;
e) einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, welche zu mindestens 50% identisch zu der Aminosäuresequenz ist, wie sie in der SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 gezeigt ist, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid mit Dehydrataseaktivität codiert;...

Description

Die Erfindung betrifft im Prinzip das Gebiet der rekombinanten Herstellung von Fettsäuren. Sie sieht Nukleinsäuremoleküle vor, welche neue Mitglieder der Fettsäure-Dehydratase-Familie codieren. Die Erfindung sieht auch rekombinante Expressionsvektoren, welche Dehydratase-Nukleinsäuremoleküle enthalten, Wirtszellen, in die die Expressionsvektoren eingeführt worden sind, und Verfahren zur großtechnischen Herstellung von langkettigen mehrfach ungesättigten Fettsäuren (LCPUFAs), z. B. ARA, EPA und DHA, vor.
Fettsäuren sind Carbonsäuren mit langkettigen Kohlenwasserstoff-Seitengruppen, welche eine fundamentale Rolle in vielen biologischen Prozessen spielen. Fettsäuren werden in der Natur selten frei vorgefunden sondern kommen eher in veresterter Form als die Hauptkomponente von Lipiden vor. Als solches sind Lipide/Fettsäuren Quellen für Energie (z. B. b-Oxidation). Darüber hinaus sind Lipide/Fettsäuren ein integraler Teil von Zellmembranen und sind deshalb für die Verarbeitung von biologischer oder biochemischer Information unverzichtbar.
Fettsäuren können in zwei Gruppen eingeteilt werden: gesättigte Fettsäuren, gebildet aus Kohlenstoff-Einfachbindungen, und die ungesättigten Fettsäuren, welche eine oder mehrere Kohlenstoff-Doppelbindungen in cis-Konfiguration enthalten. Ungesättigte Fettsäuren werden durch terminale Dehydratasen hergestellt, die der Klasse der Nicht-Häm-Eisenenzyme angehören. Alle diese Enzyme sind Teil eines Elektronen-Transportsystems, welches zwei weitere Proteine enthält, nämlich Cytochrom b₅ und NADH-Cytochrom b₅-Reductase. Im Genaueren katalysieren derartige Enzyme die Bildung von Doppelbindungen zwischen den Kohlenstoffatomen eines Fettsäuremoleküls, zum Beispiel durch Katalysieren der Sauerstoff-abhängigen Dehydrierung von Fettsäuren (Sperling et al., 2003). Menschen und andere Säuger besitzen ein begrenztes Spektrum an Dehydratasen, welche für die Bildung von bestimmten Doppelbindungen in ungesättigten Fettsäuren erforderlich sind, und besitzen daher eine beschränkte Kapazität für das Synthetisieren essentieller Fettsäuren, z. B., langkettiger mehrfach ungesättigter Fettsäuren (LCPUFAs). Somit müssen Menschen manche Fettsäuren über ihre Nahrung aufnehmen. Solche essentiellen Fettsäuren schließen, zum Beispiel, Linolsäure (C18:2), Linolensäure (C18:3) und Arachidonsäure (C20:4) ein. Im Gegensatz dazu sind Insekten, Mikroorganismen und Pflanzen in der Lage, eine viel größere Vielfalt an ungesättigten Fettsäuren und ihren Derivaten zu synthetisieren. Tatsächlich ist die Biosynthese von Fettsäuren eine wichtige Aktivität von Pflanzen und Mikroorganismen.
Langkettige mehrfach ungesättigte Fettsäuren (LCPUFAs), wie Docosahexaensäure (DHA, 22:6(4, 7, 10, 13, 16, 19)), sind essentielle Komponenten von Zellmembranen verschiedener Gewebe und Organellen in Säugern (Nerven, Retina, Hirn und Immunzellen). Zum Beispiel, sind über 30% der Fettsäuren in Hirn-Phospholipid 22:6 (n-3) und 20:4 (n-6) (Crawford, M. A., et al., (1997) Am. J. Clin. Nutr. 66: 1032S–1041S). In der Retina macht DHA mehr als 60% der Gesamt-Fettsäuren im Stäbchen-Außensegment, dem lichtempfindlichen Teil der Photorezeptor-Zelle, aus (Giusto, N. M., et al. (2000) Prog. Lipid Res. 39: 315–391). Klinische Untersuchungen haben gezeigt, dass DHA essentiell für das Wachstum und die Entwicklung des Gehirns in Kleinkindern, und für die Aufrechthaltung der normalen Hirnfunktion in Erwachsenen ist (Martinetz, M. (1992) J. Pediatr. 120: S129–S138). DHA hat auch signifikante Auswirkungen auf die Photorezeptorfunktion, die am Signaltransduktions-Vorgang beteiligt ist, die Rhodopsin-Aktivierung und die Stäbchen- und Zäpfchen-Entwicklung (Giusto, N. M., et al. (2000) Prog. Lipid Res. 39: 315–391). Darüber hinaus wurde einige positive Effekte von DHA auch bei Krankheiten, wie Hypertension, Arthritis, Atherosklerose, Depression, Thrombose und Krebs, gefunden (Horrocks, L. A., und Yeo, Y. K. (1999) Pharmacol. Res. 40: 211–215). Deshalb ist eine angemessene Nahrungszufuhr der Fettsäure bedeutsam für die Gesundheit des Menschen. Weil solche Fettsäuren nicht effizient von Kleinkindern, jungen Kindern und älteren Personen synthetisiert werden können, ist es besonders wichtig für diese Individuen, diese Fettsäuren adäquat aus der Nahrung aufzunehmen (Spector, A. A. (1999) Lipids 34: S1–S3).
Derzeitig sind die Hauptquellen für DHA Öle aus Fisch und Algen. Fischöl ist eine wichtige und traditionelle Quelle für diese Fettsäure, wobei sie allerdings für gewöhnlich zum Verkaufszeitpunkt oxidiert ist. Darüber hinaus ist die Versorgung mit Fischöl sehr variabel, insbesondere im Hinblick auf die schrumpfenden Fischpopulationen. Ferner ist die Algen-Quelle von Öl wegen des niedrigen Ertrags und den hohen Kosten bei der Extraktion kostspielig.
EPA und AA sind beide essentielle Δ5-Fettsäuren. Sie bilden eine einzigartige Klasse von Nahrungs- und Futter-Bestandteilen für Menschen und Tiere. EPA gehört zur n-3-Serie mit fünf Dopppelbindungen in der Acylkette. EPA findet sich in Meeresfrüchten und kommt häufig in öligem Fisch aus dem Nordatlantik vor. AA gehört zur n-6-Serie mit vier Doppelbindungen. Das Fehlen einer Doppelbindung in der ω-3-Position vermittelt AA andere Eigenschaften, als jene die in EPA gefunden werden. Die Eicosanoide, die aus AA hergestellt werden, haben starke inflammatorische und Plättchen-aggregierende Eigenschaften, wohingegen jene, die aus EPA abgeleitet sind, entzündungshemmende und Plättchenaggregation vermeidende Eigenschaften aufweisen. AA kann aus manchen Nahrungsmitteln, wie Fleisch, Fisch und Eiern, erhalten werden, aber die Konzentration ist gering.
Gamma-Linolensäure (GLA) ist eine andere in Säugern vorgefundene essentielle Fettsäure. GLA ist die metabolische Zwischenform für sehr langkettige n-6-Fettsäuren und für verschiedene aktive Moleküle. In Säugern ist die Bildung von langkettigen mehrfach ungesättigten Fettsäuren durch Δ6-Entsättigung Geschwindigkeits-begrenzt. Von vielen physiologischen und pathologischen Zuständen, wie Alterung, Stress, Diabetes, Ekzem und manchen Infektionen, wurde gezeigt, dass sie den Δ6 Entsättigungs-Schritt senken. Darüber hinaus wird GLA leicht katabolisiert von der Oxidation und raschen Zellteilung, die mit bestimmten Störungen, z. B. Krebs oder Entzündung, assoziiert sind. Deshalb kann die Nahrungs-Ergänzung mit GLA die Gefahren dieser Erkrankungen verringern. Klinische Untersuchungen haben gezeigt, dass Nahrungs-Ergänzung mit GLA wirksam zur Behandlung einiger pathologischer Zustände ist, wie atopisches Ekzem, prämenstruelles Syndrom, Diabetes, Hypercholesterinämie sowie entzündliche und Herzkreislauf-Erkrankungen.
Die vorherrschenden Quellen von GLA sind Öle aus Pflanzen wie Nachtkerze (Oenothera biennis), Borretsch (Borago officinalis L.), Schwarze Johannisbeere (Ribes nigrum), und aus Mikroorganismen wie Mortierella sp., Mucor sp., und Cyanobacteria. Jedoch ist die Verwendung dieser GLA-Quellen nicht ideal wegen den großen Schwankungen der Verfügbarkeit und den Kosten, die mit den Extraktionsverfahren verbunden sind.
Obwohl die Biotechnologie einen attraktiven Weg für die Herstellung von Spezialfettsäuren bietet, versagen die derzeitigen Techniken darin, eine effiziente Methode für die großtechnische Herstellung von ungesättigten Fettsäuren bereitzustellen. Folglich besteht ein Bedarf an einem verbesserten und effizienten Verfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren, wie GLA, DHA, EPA und AA.
Deshalb könnte das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem in der Bereitstellung von Mitteln und Verfahren ersehen werden, um den oben erwähnten Bedürfnissen zu entsprechen. Es wird gelöst durch die Ausführungsformen, die in den Patentansprüchen und hier nachstehend charakterisiert werden.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus folgendem besteht:

a) einer Nukleinsäuresequenz, welche eine Fettsäure-Dehydratase aus Brassica napus oder Euglena gracilis codiert;
b) einer Nukleinsäuresequenz, umfassend eine Sequenz, wie sie in der SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 gezeigt ist;
c) einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz umfasst, wie sie in der SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 gezeigt ist;
d) einer Nukleinsäuresequenz, die eine natürlich vorkommende allelische Variante eines Polypeptids codiert, umfassend die Aminosäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 gezeigt ist;
e) einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, welche zu mindestens 50% identisch zu der Aminosäuresequenz ist, wie sie in der SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 gezeigt ist, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid mit Dehydrataseaktivität codiert;
f) einer Nukleinsäuresequenz, welche zu mindestens 50% identisch zu der Aminosäuresequenz von einem beliebigen von a) bis e) ist, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid mit Dehydrataseaktivität codiert;
g) einer Nukleinsäuresequenz, welche an die Nukleinsäuresequenz von einem beliebigen von a) bis e) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid mit Dehydrataseaktivität codiert; und
h) einer Nukleinsäuresequenz von mindestens 15 benachbarten Nukleotiden der gesamten Nukleotidsequenz der SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9.

Vorzugsweise codiert das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung ein Fettsäure-Dehydratase-Protein mit einer Aktivität zum Katalysieren der Entfernung von H₂O aus 3-Hydroxyacyl-Fettsäure. Weiter bevorzugt ist die Hydroxylgruppe an Position Δ 3 der Fettsäure.
Der Begriff ”Nukleinsäuremolekül”, wie gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, beinhaltet weiterhin Varianten der zuvor erwähnten spezifischen Nukleinsäuremoleküle, d. h. jenen, die in SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 gezeigt sind, oder jenen, die ein Polypeptid codieren, das eine Aminosäuresequenz aufweist, wie in SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 gezeigt. Die Varianten können Orthologe, Paraloge oder sonstige Homologe des Polynukleotids der vorliegenden Erfindung repräsentieren.
Die Nukleinsäuremolekülvarianten umfassen vorzugsweise auch eine Nukleinsäuresequenz, dadurch gekennzeichnet dass die Sequenz aus den oben erwähnten spezifischen, in SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 gezeigten Nukleinsäuresequenzen abgeleitet werden kann durch mindestens eine Nukleotidsubstitution, -addition und/oder -deletion, wobei die Varianten-Nukleinsäuresequenz immer noch ein Polypeptid codieren soll, das Dehydratase-Aktivität, wie oben spezifiziert, aufweist. Varianten beinhalten auch Nukleinsäuremoleküle, die eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die zum Hybridisieren an die oben erwähnten spezifischen Nukleinsäuresequenzen, vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, in der Lage ist. Diese stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und können in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1–6.3.6, gefunden werden. Ein bevorzugtes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen sind Hybridisierungsbedingungen in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (= SSC) bei ungefähr 65°C, vorzugsweise gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 × SSC, 0,1% SOS bei 50 bis 65°C. Der Fachmann weiß, dass diese Hybridisierungsbedingungen abhängig vom Typ der Nukleinsäure und, zum Beispiel, bei Gegenwart von organischen Lösungsmitteln, in Bezug auf die Temperatur und Konzentration des Puffers abweichen. Zum Beispiel variiert unter ”Standard-Hybridisierungsbedingungen” die Temperatur abhängig vom Typ der Nukleinsäure zwischen 42°C und 58°C in wässrigem Puffer mit einer Konzentration von 0,1 bis 5 × SSC (pH 7,2). Wenn organisches Lösungsmittel in dem oben erwähnten Puffer vorhanden ist, zum Beispiel 50% Formamid, beträgt die Temperatur unter Standardbedingungen ungefähr 42°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride sind vorzugsweise 0,1 × SSC und 20°C bis 45°C, vorzugsweise zwischen 30°C und 45°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA-Hybride sind vorzugsweise 0,1 × SSC und 30°C bis 55°C, vorzugsweise zwischen 45°C und 55°C. Die oben erwähnten Hybridisierungstemperaturen werden zum Beispiel für eine Nukleinsäure mit ungefähr 100 bp (= Basenpaare) Länge und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid bestimmt. Der Fachmann weiß, wie man die erforderlichen Hybridisierungsbedingungen bestimmt, indem man auf Lehrbücher Bezug nimmmt, wie das oben erwähnte Textbuch, oder die folgenden Lehrbücher: Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laborstory, 1989; Harnes und Higgins (Hrsg.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Hrsg.) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford. Alternativ dazu, sind Nukleinsäuremolekülvarianten durch PCR-basierte Techniken erhältlich, wie etwa gemischte Oligonukleotidprimer-basierte Amplifikation von DNA, d. h. unter Verwendung degenerierter Primer gegen konservierte Domänen der Polypeptide der vorliegenden Erfindung. Konservierte Domänen des Polypeptids der vorliegenden Erfindung können durch einen Sequenzvergleich der Nukleinsäuresequenz des Nukleinsäuremoleküls oder der Aminosäuresequenz des Polypeptids der vorliegenden Erfindung mit anderen Dehydratase-Sequenzen identifiziert werden. Oligonukleotide, die als PCR-Primer geeignet sind sowie geeignete PCR-Bedingungen sind in den begletenden Beispielen beschrieben. Als Matrize kann DNA oder cDNA aus Bakterien, Pilzen, Pflanzen oder Tieren verwendet werden. Ferner schließen Varianten ein Nukleinsäuremolekül ein, umfassend Nukleinsäuresequenzen, die mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% identisch zu den in SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 gezeigten Nukleinsäuresequenzen sind, das Dehydratase-Aktivität beibehält. Außerdem sind auch Nukleinsäuremoleküle eingeschlossen, welche Nukleinsäuresequenzen umfassen, die Aminosäuresequenzen codieren, welche mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% identisch zu den Aminosäuresequenzen sind, die in SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 gezeigt sind, wobei das Polypeptid, das die Aminosäuresequenz umfasst, Dehydratase-Aktivität beibehält. Die prozentualen Identitätswerte werden vorzugsweise über die gesamte Aminosäure- oder Nukleinsäure-Sequenzregion berechnet. Eine Reihe von Programmen, basierend auf einer Vielzahl von Algorithmen, steht dem Fachmann zum Vergleichen verschiedener Sequenzen zur Verfügung. In diesem Zusammenhang geben die Algorithmen von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman besonders zuverlässige Ergebnisse ab. Zur Ausführung der Sequenzalignments sind das Programm PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351–360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151–153) oder die Programme Gap und BestFit (Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443–453 (1970)) und Smith und Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482–489 (1981))), welche Teil des GCG-Software-Pakets sind [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)], zu verwenden. Die oben zitierten Sequenzidentitätswerte in Prozent (%) bestimmt man vorzugsweise mit Hilfe des Programms GAP über die gesamte Sequenzregion hinweg mit den folgenden Einstellungen: Lückenwichtung: 50, Längen-Wichtung: 3, Durchschnittliche Übereinstimmung: 10,000 und Durchschnittliche Fehlpaarung: 0,000, was, außer es ist anderslautend angegeben, stets als die Standard-Einstellungen für Sequenzalignments zu verwenden ist.
Ein Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Fragment von beliebigen der oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen, ist ebenfalls als ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Das Fragment soll ein Polypeptid codieren, das noch Dehydratase-Aktivität, wie oben spezifiziert, aufweist. Demgemäß kann das Polypeptid die Domänen des Polypeptids der vorliegenden Erfindung umfassen, oder daraus bestehen, welche die besagte biologische Aktivität vermitteln. Ein Fragment, wie hierin gemeint, umfasst vorzugsweise mindestens 15, mindestens 20, mindestens 50, mindestens 100, mindestens 250 oder mindestens 500 aufeinanderfolgende Nukleotide von einer beliebigen der oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen oder codiert eine Aminosäuresequenz, umfassend mindestens 5, mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 50, mindestens 80, mindestens 100 oder mindestens 150 aufeinanderfolgende Aminosäuren von einer beliebigen der oben erwähnten Aminosäuresequenzen.
Das variante Nukleinsäuremolekül oder Fragmente, auf die oben Bezug genommen wird, codieren vorzugsweise Polypeptide, welche mindestens 10%, mindestens 20%, mindestens 30%, mindestens 40%, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80% oder mindestens 90% der Dehydratase-Aktivität beibehalten, die von dem Polypeptid, gezeigt in SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10, aufgewiesen wird. Die Aktivität kann getestet werden, wie es in den begleitenden Beispielen beschrieben ist.
Die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung bestehen entweder im Wesentlichen aus den oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen oder umfassen die oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen. Somit können sie auch weitere Nukleinsäuresequenzen enthalten. Vorzugsweise kann das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung weitere untranslatierte Sequenz am 3'- und am 5'-Ende der codierenden Genregion umfassen: mindestens 500, vorzugsweise 200, weiter bevorzugt 100 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts des 5'-Endes der codierenden Region und mindestens 100, vorzugsweise 50, weiter bevorzugt 20 Nukleotide der Sequenz stromabwärts des 3'-Endes der codierenden Genregion. Außerdem kann das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung Fusionsproteine codieren, worin ein Partner des Fusionsproteins ein Polypeptid ist, das von einer oben zitierten Nukleinsäuresequenz codiert wird, und der andere Partner des Fusionsproteins ein heterologes Polypeptid ist. Solche Fusionsproteine können als zusätzlichen Teil andere Enzyme der Fettsäure- oder Lipid-Biosynthesewege, Polypeptide zur Überwachung der Expression (z. B. grün, gelb, blau oder rot fluoreszierende Proteine, alkalische Phosphatase und dergleichen) oder sogenannte ”Tags” umfassen, die als ein detektierbarer Marker oder als Hilfsmaßnahme zu Reinigungszwecken dienen können. Tags für die verschiedenen Zwecke sind im Fachgebiet allgemein bekannt und umfassem FLAG-Tags, 6-Histidin-Tags, MYC-Tags und dergleichen.
Varianten-Nukleinsäuremoleküle, wie gemäß der vorliegenden Erfindung darauf Bezug genommen wird, können aus verschiedenen natürlichen als auch künstlichen Quellen erhalten werden. Zum Beispiel können Nukleinsäuremoleküle durch Mutagenese-Vorgehensweisen in vitro und in vivo unter Verwendung der oben erwähnten spezifischen Nukleinsäuremoleküle als Basis erhalten werden. Außerdem können Nukleinsäuremoleküle, die Homologe oder Orthologe sind, aus verschiedenen Tier-, Pflanzen- oder Pilz-Spezies erhalten werden. Vorzugsweise werden sie aus Pflanzen, wie Algen, zum Beispiel Isochrysis, Mantoniella, Ostreococcus oder Crypthecodinium, Algen/Diatomeen wie Phaeodactylum oder Thraustochytrium, Moosen, wie Physcomitrella oder Ceratodon, oder höheren Pflanzen, wie den Primulaceae, wie Aleuritia, Calendula stellata, Osteospermum spinescens oder Osteospermum hyoseroides, Mikroorganismen wie Pilzen, wie etwa Aspergillus, Thraustochytrium, Phytophthora, Entomophthora, Mucor oder Mortierella, Bakterien, wie Shewanella, Hefen oder Tieren erhalten. Bevorzugte Tiere sind Nematoden, wie Caenorhabditis, Insekten oder Wirbeltiere. Unter den Wirbeltieren können die Nukleinsäuremoleküle vorzugsweise aus Euteleostomi, Actinopterygii; Neopterygii; Teleostei; Euteleostei, Protacanthopterygii, Salmoniformes; Salmonidae oder Oncorhynchus, weiter bevorzugt aus der Ordnung der Salmoniformes, am stärksten bevorzugt der Familie Salmonidae, wie der Gattung Salmo, zum Beispiel aus den Gattungen und Spezies Oncorhynchus mykiss, Trutta trutta oder Salmo trutta fario, abgeleitet werden. Außerdem können die Nukleinsäuremoleküle aus den Diatomeen, wie etwa den Gattungen Thallasiosira oder Crypthecodinium, erhalten werden.
Das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung soll vorzugsweise entweder als ein isoliertes Nukleinsäuremolekül (d. h. isoliert aus seinem natürlichen Kontext, wie etwa einem Gen-Locus) oder in genetisch modifizierter Form bereitgestellt werden. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül kann zum Beispiel weniger als ungefähr 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb Nukleotidsequenzen umfassen, welche das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure abgeleitet ist, in natürlicher Weise flankieren. Das Nukleinsäuremolekül ist vorzugsweise doppel- oder einzelsträngige DNA, einschließlich cDNA oder RNA. Der Begriff umfasst einzel- als auch doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle. Außerdem sind auch chemisch modifizierte Nukleinsäuremoleküle, einschließlich natürlich vorkommenden modifizierten Nukleinsäuremolekülen, wie etwa glycosylierten oder methylierten Nukleinsäuremolekülen, oder künstlich modifizierten, wie etwa biotinylierten Nukleinsäuremolekülen, eingeschlossen.
In den der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden Untersuchungen wurden in vorteilhafter Weise Nukleinsäuremoleküle identifiziert, welche neue Dehydratasen aus Brassica napus und Euglena gracilis codieren. Im Genaueren sind die Brassica napus- und Euglena gracilis-Dehydratase BN-7, BN-G6 und EG-L3 Dehydratasen identifiziert worden. Jede dieser Dehydratasen ist zur Entfernung einer Hydroxylgruppe aus 3-Hydroxyacyl-CoA als Teil der Verlängerungsprozess für Fettsäuren in der Lage. Zum Beispiel ist festgestellt worden, dass die Expression der BN-7-, BN-G6- und EG-L3-Dehydratasen in einer Saccharomyces cerevisae-Mutante, die nicht zum Verlängern von Fettsäuren in der Lage war, den Elongations-Prozess wiederherstellt. DehydrataseDehydrataseDehydratase
Ebenfalls in bevorzugter Weise umfasst das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung ferner eine Nukleotidsequenz, welche ein heterologes Polypeptid codiert.
Die vorliegende Erfindung betrachtet einen Vektor, der das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung umfasst.
Der Begriff ”Vektor” beinhaltet vorzugsweise Phagen-, Plasmid-, virale oder retrovirale Vektoren sowie künstliche Chromosomen, wie künstliche Bakterien- oder Hefe-Chromosomen. Außerdem bezieht sich der Begriff auch auf Targetingkonstrukte, welche die zufällige oder ortsgerichtete Integration des Targetingkonstrukts in genomische DNA erlauben. Solche Target-Konstrukte umfassen vorzugsweise DNA von ausreichender Länge für eine entweder homologe oder heterologe Rekombination, wie es nachstehend im Einzelnen beschrieben wird. Der Vektor, der die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung beinhaltet, umfasst vorzugsweise ferner selektierbare Marker zur Vermehrung und/oder zur Selektion in einem Wirt. Der Vektor kann durch verschiedene im Fachgebiet allgemein bekannte Techniken in eine Wirtszelle eingeführt werden. Nachdem er in eine Wirtszelle eingebracht worden ist, kann der Vektor im Cytoplasma vorliegen oder kann in das Genom eingebaut werden. Im letztgenannten Fall versteht es sich, dass der Vektor ferner Nukleinsäuresequenzen umfasst kann, die eine homologe Rekombination oder heterologe Insertion erlauben. Vektoren können in prokaryotische oder eukaryotische Zellen über herkömmliche Transformations- oder Transfektionstechniken eingebracht werden. Die Begriffe ”Transformation” und ”Transfektion”, Konjugation und Transduktion, wie im vorliegenden Zusammenhang verwendet, sollen eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren zum Einbringen fremder Nukleinsäure (zum Beispiel DNA) in eine Wirtszelle, einschließlich Calciumphosphat-, Rubidiumchlorid- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion, natürliche Kompetenz, Kohlenstoffbasierten Clustern, chemisch vermitteltem Transfer, Elektroporation oder Teilchenbeschuss, umfassen. Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen, einschließlich Pflanzenzellen, können in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Laborhandbüchern, wie Methods in Molecular Biology, 1995, Bd. 44, Agrobacterium protocols, Hrsg.: Gartland and Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey, gefunden werden. Alternativ kann ein Plasmidvektor durch Hitzeschock- oder Elektroporationstechniken eingeführt werden. Sollte es sich bei dem Vektor um ein Virus handeln, kann es mit Hilfe einer passenden Verpackungs-Zelllinie vor Anwendung auf Wirtszellen in vitro verpackt werden. Retrovirale Vektoren können replikationskompetent oder replikationsdefekt sein. Im letztgenannten Fall wird die virale Vermehrung im Allgemeinen nur in komplementierenden Wirten/Zellen stattfinden.
Vorzugsweise ist der hier umschriebene Vektor als Klonierungsvektor geeignet, d. h. in mikrobiellen Systemen replizierbar. Derartige Vektoren sichern eine effiziente Klonierung in Bakterien, und, vorzugsweise, Hefen oder Pilzen, und ermöglichen die stabile Transformation von Pflanzen. Insbesondere müssen hierbei diverse binäre und cointegrierte Vektorsysteme genannt werden, die für die T-DNA-vermittelte Transformation geeignet sind. Derartige Vektorsysteme sind in der Regel dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest die für die Agrobakterium-vermittelte Transformation benötigten vir-Gene sowie die T-DNA begrenzenden Sequenzen (T-DNA-Border) beinhalten. Vorzugsweise umfassen diese Vektorsysteme auch weitere cis-regulatorische Regionen, wie Promotoren und Terminatoren und/oder Selektionsmarker, mit denen entsprechend transformierte Wirtszellen oder Organismen identifiziert werden können. Während bei cointegrierten Vektorsystemen vir-Gene und T-DNA-Sequenzen auf demselben Vektor angeordnet sind, basieren binäre Systeme auf wenigstens zwei Vektoren, von denen einer vir-Gene, aber keine T-DNA und ein zweiter T-DNA, jedoch kein vir-Gen trägt. Als Folge davon sind letztere Vektoren relativ klein, leicht zu manipulieren, und können sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium repliziert werden. Zu diesen binären Vektoren gehören Vektoren der Serien pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen. Erfindungsgemäß bevorzugt verwendet werden Bin19, pBI101, pBinAR, pGPTV und pCAMBIA. Eine Übersicht über binäre Vektoren und ihre Verwendung gibt Hellens et al, Trends in Plant Science (2000) 5, 446–451. Ferner können die Polynukleotide durch Verwenden entsprechender Klonierungsvektoren in Wirtszellen oder Organismen, wie Pflanzen oder Tiere, eingebracht werden und somit bei der Transformation von Pflanzen verwendet werden, wie jenen, die in Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15–38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205–225, veröffentlicht und zitiert sind.
Weiter bevorzugt ist der Vektor der vorliegenden Erfindung ein Expressionsvektor. In einem solchen Expressionsvektor ist das Nukleinsäuremolekül funktionsfähig mit Expressions-Steuerungssequenzen verbunden (ebenfalls als ”Expressionskassette” bezeichnet), welche die Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen oder isolierten Fraktionen davon erlauben. Die Expression des Polynukleotids umfasst die Transkription des Nukleinsäuremoleküls, vorzugsweise zu einer translatierbaren mRNA. Regulatorische Elemente, welche die Expression in eukaryotischen Zellen, vorzugsweise Säugerzellen, gewährleisten, sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Sie umfassen vorzugsweise regulatorische Sequenzen, welche die Initiation der Transkription gewähren, und gegebenenfalls Poly-A-Signale, welche die Termination der Transkription und Stabilisation des Transkripts sicherstelllen. Zusätzliche regulatorische Elemente können transkriptionelle als auch translationale Enhancer einschließen. Mögliche regulatorische Elemente, die eine Expression in prokaryotischen Wirtszellen zulassen, umfassen z. B. den lac-, trp- oder tac-Promotor in E. coli, und Beispiele für regulatorische Elemente, die eine Expression in eukaryotischen Wirtszellen zulassen, sind der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe oder der CMV-, SV40-, RSV-Promotor (Rous Sarkom-Virus), CMV-Enhancer, SV40-Enhancer oder ein Globin-Intron in Säuger und sonstigen Tierzellen. Außerdem können Steuerungssequenzen für induzierbare Expression in einem von der vorliegenden Erfindung beinhalteten Expressionsvektor zur Anwendung kommen. Solche induzierbaren Vektoren können tet- oder lac-Operatorsequenzen oder Sequenzen umfassen, die durch Hitzeschock oder andere Umweltfaktoren induzierbar sind. Geeignete Expressions-Steuerungssequenzen sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Neben Elementen, die für die Initiation der Transkription verantwortlich sind, können derartige regulatorische Elemente auch Transkriptionsterminationssignale, wie die SV40-poly-A-Stelle oder die tk-poly-A Stelle, stromabwärts des Polynukleotids, umfassen. Vorzugsweise ist der Expressionsvektor auch ein Gentransfer- oder Targeting-Vektor. Expressionsvektoren, die aus Viren, wie etwa Retroviruen, Vaccinia-Virus, Adeno-assoziiertem Virus, Herpesviren oder Rinderpapillomvirus, abgeleitet sind, können für die Zuführung des Nukleinsäuremoleküls oder Vektors der Erfindung in die angezielte Zellpopulation verwendet werden. Zum Konstruieren rekombinanter viraler Vektoren können dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannte Verfahren angewandt werden; siehe zum Beispiel die Techniken, die in Sambrook, Molecular Cloning A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory (1989) N. Y., und Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates und Wiley Interscience, N. Y. (1994), beschrieben sind.
Geeignete Expressionsvektoren sind im Fachgebiet bekannt, wie etwa der Okayama-Berg-cDNA-Expressionsvektor pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogene) oder pSPORTI (GIBCO BRL). Weitere Beispiele von typischen Fusions-Expressionsvektoren sind pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B., und Johnson, K. S. (1988) Gene 67: 31–40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), worin Glutathion-S-transferase (GST), Maltose-E-bindendes Protein bzw. Protein A mit dem rekombinanten Zielprotein fusioniert sind. Beispiele von geeigneten induzierbaren Nichtfusion-E. coli-Expressionsvektoren sind, unter anderem, pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69: 301–315) und pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60–89). Die Zielgenexpression des pTrc-Vektors basiert auf der Transkription durch Wirts-RNA-Polymerase von einem hybriden trp-lac-Fusionspromotor aus. Die Zielgenexpression aus dem pET 11d-Vektor basiert auf der Transkription von einem T7-gn10-lac-Fusionspromotor aus, welche von einer coexprimierten viralen RNA-Polymerase (T7 gn1) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird von den Wirtsstämmen BL21 (DE3) oder HMS174 (DE3) aus einem residenten λ-Prophagen bereitgestellt, der ein T7 gn1-Gen unter der transkriptionellen Steuerung des lacUV 5-Promotors beherbergt. Der Fachmann ist mit anderen Vektoren vertraut, welche in prokaryotischen Organismen geeignet sind; diese Vektoren sind zum Beispiel, in E. coli, pLG338, pACYC184, die pBR-Serie, wie pBR322, die pUC-Serie, wie pUC18 oder pUC19, die M113mp-Serie, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, λgt11 oder pBdCl, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667. Beispiele von Vektoren für die Expression in der Hefe S. cerevisiae umfassen pYeDesaturasec1 (Baldari et al. (1987) Embo J. 6: 229–234), pMFa (Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30: 933–943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113–123) und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren und Verfahren für die Konstruktion von Vektoren, welche zur Verwendung in anderen Pilzen geeignet sind, wie etwa den filamentösen Pilzen, umfassen diejenigen, welche ausführlich beschrieben sind in: van den Hondel, C. A. M. J. J., & Punt, P. J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi", in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy et al., Hrsg., S. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge, oder in: More Gene Manipulations in Fungi (J. W. Bennett & L. L. Lasure, Hrsg., S. 396–428: Academic Press: San Diego). Weitere geeignete Hefevektoren sind zum Beispiel pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23. Als Alternative können die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung auch in Insektenzellen unter Anwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren exprimiert werden. Baculovirus-Vektoren, welche für die Expression von Proteinen in kultivierten Insektenzellen (zum Beispiel Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Serie (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156–2165) und die pVL-Serie (Lucklow und Summers (1989) Virology 170: 31–39).
Die folgenden Promotoren und Expressions-Steuerungssequenzen können vorzugsweise in einem Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Promotoren cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-PR oder λ-PL werden vorzugsweise in gramnegativen Bakterien verwendet. Für gram-positive Bakterien können die Promotoren amy und SPO2 verwendet werden. Unter den Hefe- oder Pilz-Promotoren werden vorzugsweise ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH, oder aus Pflanzen die Promotoren CaMV/35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285–294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos oder der Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor verwendet. Ebenfalls bevorzugt in diesem Kontext sind induzierbare Promotoren, wie die Promotoren, beschrieben in EP A 0 388 186 (Benzylsulfonamidinduzierbar), Plant J. 2, 1992: 397–404 (Gatz et al., Tetracyclin-induzierbar), EP A 0 335 528 (Abscisinsäure-induzierbar) oder WO 93/21334 (Ethanol- oder Cyclohexenol-induzierbar). Weitere geeignete pflanzliche Promotoren sind der Promotor von cytosolischem FBPase oder der ST-LSI-Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 1989, 2445), der Phosphoribosylpyrophosphat-Amidotransferase-Promotor aus Glycine max (Genbank Zugangs-Nr. U87999) oder der Nodus-spezifische Promotor, der in EP-A-0 249 676 beschrieben ist. Besonders bevorzugt sind Promotoren, welche die Expression in Geweben gestatten, die an der Biosynthese von Fettsäuren beteiligt sind. Ebenfalls besonders bevorzugt sind Samen-spezifische Promotoren, wie der USP-Promotor in Übereinstimmung mit der Ausführung, aber auch andere Promotoren, wie die LeB4-, DC3-, Phaseolin- oder Napin-Promotoren. Weiterhin besonders vorteilhafte Promotoren sind Samen-spezifische Promotoren, welche für monokotyledone oder dikotyledone Pflanzen verwendet werden können und welche beschrieben sind in US 5 608 152 (Napin-Promotor aus Ölsamenraps), WO 98/45461 (Oleosin-Promotor aus Arobidopsis, US 5 504 200 (Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris), WO 91/13980 (Bce4-Promotor aus Brassica), von Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992: 233–239 (LeB4-Promotor aus einer Leguminose), wobei diese Promotoren für Dikotyle geeignet sind. Die folgenden Promotoren sind zum Beispiel für Monokotyle geeignet: Ipt-2- oder Ipt-1-Promotor aus Gerste ( WO 95/15389 und WO 95/23230 ), Hordein-Promotor aus Gerste, und andere Promotoren, welche geeignet sind und welche beschrieben werden in WO 99/16890 . Im Prinzip, ist es möglich, für das neue Verfahren alle natürlichen Promotoren zusammen mit ihren regulatorischen Sequenzen, wie jenen, die oben erwähnt wurden, zu verwenden. In gleicher Weise ist es möglich und vorteilhaft, synthetische Promotoren zu verwenden, entweder zusätzlich oder alleine, insbesondere wenn sie eine Samenspezifische Expression vermitteln, zum Beispiel wie in WO 99/16890 beschrieben.
Das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kann in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen), see Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3): 239–251 und die darin zitierten Bezugsstellen, und Pflanzenzellen aus höheren Pflanzen (zum Beispiel Spermatophyten, wie anbaufähigen Nutzpflanzen) durch Verwendung von Pflanzenexpressionsvektoren exprimiert werden. Beispiele von Pflanzenexpressionsvektoren umfassen diejenigen, welche ausführlich in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195–1197; und Bevan, M. W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12: 8711–8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, BD. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38, beschrieben werden. Eine Pflanzenexpressionskassette umfasst vorzugsweise regulatorische Sequenzen, welche zur Steuerung der Genexpression in Pflanzenzellen in der Lage sind, und welche funktionell so verknüpft sind, dass jede Sequenz ihre Funktion, wie etwa transkriptionelle Termination, erfüllen kann, zum Beispiel Polyadenylierungs-Signale. Bevorzugte Polyadenylierungs-Signale sind jene, die aus Agrobacterium tumefaciens-T-DNA abgeleitet sind, wie dem Gen 3 des Ti-Plasmids pTiACH5, das als Octopin-Synthase bekannt ist (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835 ff.), oder funktionale Äquivalente derselben, aber alle anderen Terminatoren, die in Pflanzen funktionell aktiv sind, sind auch geeignet. Da Pflanzen-Genexpression sehr häufig nicht auf transkriptionelle Spiegel beschränkt ist, umfasst eine Pflanzenexpressionskassette vorzugsweise andere funktionell gebundene Sequenzen, wie Translationsenhancer, zum Beispiel die Overdrive-Sequenz, welche die 5'-untranslatierte Tabakmosaikvirus-Leadersequenz umfasst, die das Protein/RNA-Verhältnis erhöht (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693–8711). Wie oben beschrieben, muss Pflanzen-Genexpression funktionell mit einem geeigneten Promotor verknüpft sein, der die Expression des Gens in einer zeitlichen, zellspezifischen oder gewebespezifischen Weise ausführt. Promotoren, die verwendet werden können, sind konstitutive Promotoren (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195–2202), wie jene, die aus Pflanzenviren abgeleitet sind, wie etwa 35S-CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285–294), 19S CaMV (siehe auch US 5352605 und WO 84/02913 ), oder pflanzliche Promotoren, wie der Promotor der kleinen Rubisco-Untereinheit, der in US 4 962 028 beschrieben ist. Andere bevorzugte Sequenzen für die Verwendung zur funktionsfähigen Verbindung in Pflanzengenexpressions-Kassetten sind Targeting-Sequenzen, die zur Steuerung des Genproduktes in sein entsprechendes Zellkompartiment notwendig sind (siehe eine Übersicht in Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285–423 und darin zitierte Literaturstellen), beispielsweise in die Vakuole, den Zellkern, alle Arten von Plastiden, wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, die Mitochondrien, das Endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxisomen und andere Kompartimente von Pflanzenzellen. Die Pflanzengenexpression lässt sich auch wie oben beschrieben über einen chemisch induzierbaren Promotor erleichtern (siehe eine Übersicht in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108). Chemisch induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn gewünscht wird, dass die Genexpression auf zeitspezifische Weise erfolgt. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäure-induzierbarer Promotor ( WO 95/19443 ), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397–404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor. Auch Promotoren, die auf biotische oder abiotische Stressbedingungen reagieren, sind geeignete Promotoren, beispielsweise der pathogeninduzierte PRP1-Gen-Promotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361–366), der hitzeinduzierbare hsp80-Promotor aus Tomate ( US 5,187,267 ), der kälteinduzierbare Alpha-Amylase-Promotor aus Kartoffel ( WO 96/12814 ) oder der durch Wunden induzierbare pinII-Promotor ( EP A 0 375 091 ). Es sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, welche die Genexpression in Geweben und Organen herbeiführen, in denen die Fettsäure-, Lipid- und Ölbiosynthese stattfindet, in Samenzellen, wie den Zellen des Endosperms und des sich entwickelnden Embryos. Geeignete Promotoren sind der Napingen-Promotor aus Raps ( US 5,608,152 ), der USP-Promotor aus Vicia faba (Baeumlein et al., Mol. Gen. Genet., 1991, 225 (3): 459–67), der Oleosin-Promotor aus Arabidopsis ( WO 98/45461 ), der Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris ( US 5,504,200 ), der Bce4-Promotor aus Brassica ( WO 91/13980 ) oder der Legumin-B4-Promotor (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233–9) sowie Promotoren, welche die Samen-spezifische Expression in monokotyledonen Pflanzen, wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis usw. herbeiführen. Geeignete beachtenswerte Promotoren sind der Ipt2- oder Ipt1-Gen-Promotor aus Gerste ( WO 95/15389 und WO 95/23230 ) oder die in WO 99/16890 beschriebenen (Promotoren aus dem Gerste-Hordein-Gen, dem Reis-Glutelin-Gen, dem Reis-Oryzin-Gen, dem Reis-Prolamin-Gen, dem Weizen-Gliadin-Gen, Weizen-Glutelin-Gen, dem Mais-Zein-Gen, dem Hafer-Glutelin-Gen, dem Sorghum-Kasirin-Gen, dem Roggen-Secalin-Gen). Dergleichen sind Promotoren besonders geeignet, welche die plastidenspezifische Expression herbeiführen, da Plastiden das Kompartiment sind, in dem die Synthetisierung von Vorläufern und manchen Endprodukten der Lipidbiosynthese erfolgt. Geeignete Promotoren, wie der virale RNA-Polymerase-Promotor, sind in WO 95/16783 und WO 97/06250 beschrieben, und der clpP-Promotor aus Arabidopsis wird in WO 99/46394 beschrieben.
Die oben genannten Vektoren bieten nur einen kleinen Überblick über Vektoren, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen. Weitere Vektoren sind dem Fachmann bekannt und sind zum Beispiel beschrieben in: Cloning Vectors (Hrsg.: Pouwels, P. H., et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Zellen siehe in den Kapiteln 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Aus dem oben genannten ergibt sich, dass der Vektor vorzugsweise ein Expressionsvektor ist. Weiter bevorzugt steht das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung unter der Steuerung eines Samen-spezifischen Promotors in den Vektor der vorliegenden Erfindung. Ein bevorzugter Samen-spezifischer Promotor, wie hierin gemeint, wird gewählt aus der Gruppe, die aus Conlinin 1, Conlinin 2, Napin, LuFad3, USP, LeB4, Arc, Fae, ACP, LuPXR und SBP besteht.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Wirtszelle, welche das Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfasst, oder welche mit dem Vektor der Erfindung transformiert ist.
Vorzugsweise ist die Wirtszelle eine pflanzliche Zelle und, weiter bevorzugt, eine aus einer Ölsaat-Nutzpflanze erhaltene pflanzliche Zelle. Weiter bevorzugt wird die Ölsaat-Nutzpflanze aus der Gruppe gewählt, die aus Flachs (Linum sp.), Raps (Brassica sp.), Sojabohne (Glycine und Soja sp.), Sonnenblume (Helianthus sp.), Baumwolle (Gossypium sp.), Mais (Zea mays), Olive (Olea sp.), Saflor (Carthamus sp.), Kakao (Theobroma cacoa), Erdnuss (Arachis sp.), Hanf, Camelina, Crambe, Ölpalme, Kokosnüssen, Erdnüssen, Sesamsaat, Kastorbohne, Lesquerella, Talgbaum, Sheanuss, Tungnuss, Kapok-Frucht, Mohnsamen, Jojobasamen und Perilla besteht.
Ebenfalls bevorzugt, ist die Wirtszelle eine mikrobielle Zelle. Weiter bevorzugt ist die mikrobielle Zelle aus der Gruppe gewählt, die aus Candida, Cryptococcus, Lipomyces, Rhodosporidium, Yarrowia, Thraustochytrium, Pythium, Schizochytrium und Crythecodinium besteht.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Pflanze oder Pflanzensaat, umfassend das Nukleinsäuremolekül der Erfindung, den Vektor der Erfindung oder die Wirtszelle der Erfindung.
Bevorzugte Pflanzen, die zur Einbringung des Nukleinsäuremolekül oder des Vektors der Erfindung verwendet werden sollen, sind Pflanzen, welche zum Synthetisieren von Fettsäuren in der Lage sind, wie alle dikotyledonen oder monokotyledonen Pflanzen, Algen oder Moose. Es versteht sich, dass Wirtszellen, die aus einer Pflanze abgeleitet sind, ebenfalls für die Erzeugung einer Pflanze gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Vorteilhafte Pflanzen sind ausgewählt aus der Gruppe der Pflanzenfamilien Adelotheciaceae, Anacardiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Caricaceae, Cannabaceae, Convolvulaceae, Chenopodiaceae, Crypthecodiniaceae, Cucurbitaceae, Ditrichaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Geraniaceae, Gramineae, Juglandaceae, Lauraceae, Leguminosae, Linaceae, Prasinophyceae oder Gemüsepflanzen oder Zierpflanzen wie Tagetes. Beispielhaft seien die folgenden Pflanzen genannt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Adelotheciaceae, wie die Gattungen Physcomitrella, wie die Gattung und Spezies Physcomitrella patens, Anacardiaceae wie die Gattungen Pistacia, Mangifera, Anacardium, zum Beispiel die Gattung und Spezies Pistacia vera [Pistazie], Mangiferindica [Mango] oder Anacardium occidentale [Cashew], Asteraceae, wie die Gattungen Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Helianthus, Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana, zum Beispiel die Gattung und Spezies Calendula officinalis [Garten-Ringelblume], Carthamus tinctorius [Saflor], Centaurea cyanus [Kornblume], Cichorium intybus [Chicorée], Cynara scolymus [Artischoke], Helianthus annus [Sonnenblume], Lactuca sativa, Lactuca crispa, Lactuca esculenta, Lactuca scariola L. ssp. sativa, Lactuca scariola L. var. integrata, Lactuca scariola L. var. integrifolia, Lactuca sativa subsp. romana, Locusta communis, Valeriana locusta [Salat], Tagetes lucida, Tagetes erecta oder Tagetes tenuifolia [Studentenblume], Apiaceae, wie die Gattung Daucus, zum Beispiel die Gattung und Spezies Daucus carota [Karotte], Betulaceae, wie die Gattung Corylus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Gorylus avellana oder Gorylus colurna [Haselnuss], Boraginaceae, wie die Gattung Borago, zum Beispiel die Gattung und Spezies Borago officinalis [Borretsch], Brassicaceae, wie die Gattungen Brassica, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Ölsamenraps], Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Melanosinapis communis [Senf], Brassica oleracea [Futterrübe] oder Arabidopsis thaliana, Bromeliaceae, wie die Gattungen Anana, Bromelia (Ananas), zum Beispiel die Gattungen und Spezies Anana comosus, Ananas ananas oder Bromelia comosa [Ananas], Caricaceae, wie die Gattung Carica, wie die Gattung und Spezies Carica papaya [Papaya], Cannabaceae, wie die Gattung Cannabis, wie die Gattung und Spezies Cannabis sativa [Hanf], Convolvulaceae, wie die Gattungen Ipomea, Convolvulus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba oder Convolvulus panduratus [Süßkartoffel, Batate], Chenopodiaceae, wie die Gattung Beta, wie die Gattungen und Spezies Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altissima, Beta vulgaris var. Vulgaris, Beta maritima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var. conditiva oder Beta vulgaris var. esculenta [Zuckerrübe], Crypthecodiniaceae, wie die Gattung Crypthecodinium, zum Beispiel die Gattung und Spezies Cryptecodinium cohnii, Cucurbitaceae, wie die Gattung Cucurbita, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Cucurbita maxima, Cucurbita mixta, Cucurbita pepo oder Cucurbita moschata [Kürbis], Cymbellaceae wie die Gattungen Amphora, Cymbella, Okedenia, Phaeodactylum, Reimeria, zum Beispiel die Gattung und Spezies Phaeodactylum tricornutum, Ditrichaceae, wie die Gattungen Ditrichaceae, Astomiopsis, Ceratodon, Chrysoblastella, Ditrichum, Distichium, Eccremidium, Lophidion, Philibertiella, Pleuridium, Saelania, Trichodon, Skottsbergia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Ceratodon antarcticus, Ceratodon columbiae, Ceratodon heterophyllus, Ceratodon purpureus, Ceratodon purpureus, Ceratodon purpureus ssp. convolutus, Ceratodon, purpureus spp. stenocarpus, Ceratodon purpureus var. rotundifolius, Ceratodon ratodon, Ceratodon stenocarpus, Chrysoblastella chilensis, Ditrichum ambiguum, Ditrichum brevisetum, Ditrichum crispatissimum, Ditrichum difficile, Ditrichum falcifolium, Ditrichum flexicaule, Ditrichum giganteum, Ditrichum heteromallum, Ditrichum lineare, Ditrichum lineare, Ditrichum montanum, Ditrichum montanum, Ditrichum pallidum, Ditrichum punctulatum, Ditrichum pusillum, Ditrichum pusillum var. tortile, Ditrichum rhynchostegium, Ditrichum schimperi Ditrichum tortile, Distichium capillaceum, Distichium hagenii, Distichium inclinatum, Distichium macounii, Eccremidium floridanum, Eccremidium whiteleggei, Lophidion strictus, Pleuridium acuminatum, Pleuridium alternifolium, Pleuridium holdridgei, Pleuridium mexicanum, Pleuridium ravenelii Pleuridium subulatum, Saelania glaucescens, Trichodon borealis, Trichodon cylindricus oder Trichodon cylindricus var. oblongus, Elaeagnaceae wie die Gattung Elaeagnus, zum Beispiel die Gattung und Spezies Olea europaea [Olive], Ericaceae wie die Gattung Kalmia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Kalmia latifolia, Kalmia angustifolia, Kalmia microphylla, Kalmia polifolia, Kalmia occidentalis, Cistus chamaerhodendros oder Kalmia lucida [Berglorbeer], Euphorbiaceae wie die Gattungen Manihot, Janipha, Jatropha, Ricinus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Manihot utilissima, Janipha manihot, Jatropha manihot, Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta [Manihot] oder Ricinus communis [Rizinus], Fabaceae wie die Gattungen Pisum, Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medicajo, Glycine, Dolichos, Phaseolus, Soja, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile [Erbse], Albizia berteriana, Albizia julibrissin, Albizia lebbeck, Acacia berteriana, Acacia littoralis, Albizia berteriana, Albizzia berteriana, Cathormion berteriana, Feuillea berteriana, Inga fragrans, Pithecellobium berterianum, Pithecellobium fragrans, Pithecolobium berterianum, Pseudalbizzia berteriana, Acacia julibrissin, Acacia nemu, Albizia nemu, Feuilleea julibrissin, Mimosa julibrissin, Mimosa speciosa, Sericanrda julibrissin, Acacia lebbeck, Acacia macrophylla, Albizia lebbek, Feuilleea lebbeck, Mimosa lebbeck, Mimosa speciosa [Seidenbaum], Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago varia [Alfalfa], Glycine max Dolichos soja, Glycine gracilis, Glycine hispida, Phaseolus max, Soja hispida oder Soja max [Sojabohne], Funariaceae wie die Gattungen Aphanorrhegma, Entosthodon, Funaria, Physcomitrella, Physcomitrium, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Aphanorrhegma serratum, Entosthodon attenuatus, Entosthodon bolanderi, Entosthodon bonplandii, Entosthodon californicus, Entosthodon drummondii, Entosthodon jamesonii, Entosthodon leibergii, Entosthodon neoscoticus, Entosthodon rubrisetus, Entosthodon spathulifolius, Entosthodon tucsoni, Funaria americana, Funaria bolanderi, Funaria calcarea, Funaria californica, Funaria calvescens, Funaria convoluta, Funaria flavicans, Funaria groutiana, Funaria hygrometrica, Funaria hygrometrica var. arctica, Funaria hygrometrica var. calvescens, Funaria hygrometrica var. convoluta, Funaria hygrometrica var. muralis, Funaria hygrometrica var. utahensis, Funaria microstoma, Funaria microstoma var. obtusifolia, Funaria muhlenbergii, Funaria orcuttii, Funaria plano-convexa, Funaria polaris, Funaria ravenelii, Funaria rubriseta, Funaria serrata, Funaria sonorae, Funaria sublimbatus, Funaria tucsoni, Physcomitrella californica, Physcomitrella patens, Physcomitrella readeri, Physcomitrium australe, Physcomitrium californicum, Physcomitrium collenchymatum, Physcomitrium colradense, Physcomitrium cupuliferum, Physcomitrium drummondii, Physcomitrium eurystomum, Physcomitrium flexifolium, Physcomitrium hookeri, Physcomitrium hookeri var. serratum, Physcomitrium immersum, Physcomitrium kellermanii, Physcomitrium megalocarpum, Physcomitrium pyriforme, Physcomitrium pyriforme var. serratum, Physcomitrium rufipes, Physcomitrium sandbergii, Physcomitrium subsphaericum, Physcomitrium washingtoniense, Geraniaceae, wie die Gattungen Pelargonium, Cocos, Oleum, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Cocos nucifera, Pelargonium grossularioides oder Oleum cocois [Kokosnuss], Gramineae, wie die Gattung Saccharum, zum Beispiel die Gattung und Spezies Saccharum officinarum, Juglandaceae, wie die Gattungen Juglans, Wallis, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Juglans regia, Juglans ailanthifolia, Juglans sieboldiana, Juglans cinerea, Walia cinerea, Juglans bixbyi, Juglans californica, Juglans hindsii, Juglans intermedia, Juglans jamaicensis, Juglans major, Juglans microcarpa, Juglans nigra oder Walia nigra [Walnuss], Lauraceae, wie die Gattungen Persea, Laurus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Laurus nobilis [Lorbeer], Persea americana, Persea gratissima oder Persea persea [Avocado], Leguminosae, wie die Gattung Arachis, zum Beispiel die Gattung und Spezies Arachis hypogaea [Erdnuss], Linaceae, wie die Gattungen Linum, Adenolinum, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense oder Linum trigynum [Leinsamen], Lythrarieae, wie die Gattung Punica, zum Beispiel die Gattung und Spezies Punica granatum [Granatapfel], Malvaceae, wie die Gattung Gossypium, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum oder Gossypium thurberi [Baumwolle], Marchantiaceae, wie die Gattung Marchantia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Marchantia berteroana, Marchantia foliacea, Marchantia macropora, Musaceae, wie die Gattung Musa, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisiaca, Musa spp. [Banane], Onagraceae, wie die Gattungen Camissonia, Oenothera, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Oenothera biennis oder Camissonia brevipes [Nachtkerze], Palmen, wie die Gattung Elacis, zum Beispiel die Gattung und Spezies Elaeis guineensis [Ölpalme], Papaveraceae, wie die Gattung Papaver, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Papaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium [Mohn], Pedaliaceae, wie die Gattung Sesamum, zum Beispiel die Gattung und Spezies Sesamum indicum [Sesam], Piperaceae, wie die Gattungen Piper, Artanthe, Peperomia, Steffensia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata [Cayenne-Pfeffer], Poaceae, wie die Gattungen Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea (Mais), Triticum, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon, Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon, Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum [Gerste], Secale cereale [Roggen], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [Hafer], Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum, Panicum militaceum [millet], Oryza sativa, Oryza latifolia [Reis], Zea mays [Mais], Triticum aestivum, Triticum durum, Tritcum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum oder Triticum vulgare [Weizen], Porphyridiaceae, wie die Gattungen Chroothece, Flintiella, Petrovanella, Porphyridium, Rhodella, Rhodosorus, Vanhoeffenia, zum Beispiel die Gattung und Spezies Porphyridium cruentum, Proteaceae, wie die Gattung Macadamia, zum Beispiel die Gattung und Spezies Macadamia intergrifolia [Macadamia], Prasinophyceae wie die Gattungen Nephroselmis, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Nephroselmis olivacea, Prasinococcus capsulatus, Scherffelia dubia, Tetraselmis chui, Tetraselmis suecica, Mantoniella squamata, Ostreococcus tauri, Rubiaceae wie die Gattung Cofea, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Cofea spp., Coffea arabica, Coffea canephora oder Coffea liberica [Kaffee], Scrophulariaceae, wie die Gattung Verbascum, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Verbascum blattaria, Verbascum chaixii, Verbascum densiflorum, Verbascum lagurus, Verbascum longifolium, Verbascum lychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum olympicum, Verbascum phlomoides, Verbascum phoenicum, Verbascum pulverulentum oder Verbascum thapsus [Königskerze], Solanaceae, wie die Gattungen Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Capsicum annuum, Capsicum annum var. glabriusculum, Capsicum frutescens [Pfeffer], Capsicum annum [Paprika], Nicotiana tabacum, Nicotiana alata, Nicotiana attenuata, Nicotiana glauca, Nicotiana langsdorffii, Nicotiana obtusifolia, Nicotiana quadrivalvis, Nicotiana repanda, Nicotiana rustica, Nicotiana sylvestris [Tabak], Solanum tuberosum [Kartoffel], Solanum melongena [Aubergine], Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum [Tomate], Sterculiaceae, wie die Gattung Theobroma, zum Beispiel die Gattung und Spezies Theobroma cacao [Kakao] oder Theaceae, wie die Gattung Camellia, zum Beispiel die Gattung und Spezies Camellia sinensis [Tee]. Insbesondere sind bevorzugte Pflanzen, die als transgene Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind, Ölfrucht-Nutzpflanzen, welche große Mengen an Lipidverbindungen umfassen, wie Erdnuss, Ölsamenraps, Canola, Sonnenblume, Saflor, Mohn, Senf, Hanf, Castoröl-Pflanze, Olive, Sesam, Calendula, Punica, Nachtkerze, Königskerze, Distel, Wildrosen, Haselnuss, Mandel, Macadamia, Avokado, Lorbeer, Kürbis, Leinsamen, Sojabohne, Pistazien, Borretsch, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss, Walnuss) oder Nutzpflanzen wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Cassava, Pfeffer, Tagetes, Nachtschattengewächse wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Spezies, Erbse, Alfalfa oder buschartige Pflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Spezies und merhjährige Gräder und Futterpflanzen. Bevorzugte Pflanzen gemäß der Erfindung sind Ölnutzpflanzen, wie Erdnuss, Ölsamenraps, Canola, Sonnenblume, Saflor, Mohn, Senf, Hanf, Castoröl-Pflanze, Olive, Calendula, Punica, Nachtkerze, Kürbis, Leinsamen, Sojabohne, Borretsch, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss). Besonders bevorzugt werden Sonnenblume, Saflor, Tabak, Königskerze, Sesam, Baumwolle, Kürbis, Mohn, Nachtkerze, Walnuss, Leinsamen, Hanf, Distel oder Saflor. Ganz besonders bevorzugte Pflanzen sind Pflanzen, wie Saflor, Sonnenblume, Mohn, Nachtkerze, Walnuss, Leinsamen oder Hanf.
Bevorzugte Moose sind Physcomitrella oder Ceratodon. Bevorzugte Algen sind Isochrysis, Mantoniella, Ostreococcus oder Crypthecodinium, und Algen/Diatomeen wie Phaeodactylum oder Thraustochytrium. Weiter bevorzugt sind die Algen oder Moose gewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Shewanella, Physcomitrella, Thraustochytrium, Fusarium, Phytophthora, Ceratodon, Isochrysis, Aleurita, Muscarioides, Mortierella, Phaeodactylum, Cryphthecodinium, spezifisch aus den Gattungen und Spezies Thallasiosira pseudonona, Euglena gracilis, Physcomitrella patens, Phytophtora infestans, Fusarium graminaeum, Cryptocodinium cohnii, Ceratodon purpureus, lsochrysis galbana, Aleurita farinosa, Thraustochytrium sp., Muscarioides viallii, Mortierella alpina, Phaeodactylum tricornutum oder Caenorhabditis elegans oder, besonders vorteilhaft, Phytophtora infestans, Thallasiosira pseudonona und Cryptocodinium cohnii.
Transgene Pflanzen können erhalten werden durch Transformationstechniken, wie veröffentlicht und zitiert in: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15–38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205–225. Vorzugsweise können tansgene Pflanzen durch T-DNA-vermittelte Transformation erhalten werden. Solche Vektorsysteme sind in der Regel dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens die vir-Gene enthalten, welche für die Agrobacterium-vermittelte Transformation erforderlich sind, und die Sequenzen, welche die T-DNA begrenzen (T-DNA-Border). Geeignete Vektoren sind andernorts in der Beschreibung in Einzelheiten beschrieben.
Die vorliegende Erfindung sieht auch ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids vor, umfassend das Kultivieren der Wirtszelle der Erfindung in einem geeigneten Kulturmedium, um dadurch das Polypeptid herzustellen, welches durch ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung codiert wird.
Das Polypeptid kann zum Beispiel durch alle herkömmlichen Reinigungstechniken erhalten werden, einschließlich Affinitätschromatographie, Größenausschluss-Chromatographie, Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Präzipitationstechniken, einschließlich Antikörperpräzipitation. Es versteht sich, dass das Verfahren – obwohl bevorzugt – nicht notwendigerweise eine im Wesentlichen reine Präparation des Polypeptids ergeben kann. Ein durch das Verfahren erhaltenes Polypeptid schließt Varianten-Polypeptide ein, welche posttranslational modifiziert, z. B. phosphoryliert oder myristyliert sind, oder welche entweder auf RNA- oder Protein-Ebene prozessiert sind.
Im Prinzip betrifft die vorliegende Erfindung jedoch ein Polypeptid, welches durch das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung codiert wird.
Der Begriff ”Polypeptid”, wie hierin verwendet, beinhaltet im Wesentlichen gereinigte Polypeptide oder Polypeptidpräparationen, welche zusätzlich andere Proteine umfassen. Ferner schließt der Begriff vorzugsweise ebenfalls Polypeptide ein, welche in einer Wirtszelle, Pflanze oder Pflanzensaat vorhanden sind, wobei die Wirtszelle, Pflanze oder Pflanzensaat nicht die biologische Quelle ist, in welcher das Polypeptid natürlicherweise vorkommt. Ferner betrifft der Begriff ebenfalls die Fusionsproteine oder Polypeptidfragmente, welche mindestens teilweise von dem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung, auf welches oben Bezug genommen wird, codiert sind. Darüber hinaus schließt er chemisch modifizierte Polypeptide ein. Solche Modifikationen können künstliche Modifikationen oder natürlich vorkommende Modifikationen, wie Phosphorylierung, Glykosylierung, Myristylierung und dergleichen sein. Die Begriffe ”Polypeptid”, ”Peptid” oder ”Protein” werden überall in dieser Patentschrift austauschbar verwendet. Wie oben angegeben, soll das Polypeptid der vorliegenden Erfindung Dehydratase-Aktivität aufweisen und kann daher für die Herstellung von ungesättigten Fettsäuren, entweder in einer Wirtszelle oder in einem transgenen Tier oder einer transgenen Pflanze, wie andernorts in dieser Beschreibung geschildert, verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls einen Antikörper, welcher das Polypeptid der vorliegenden Erfindung spezifisch erkennt.
Antikörper gegen die Polypeptide der Erfindung können durch allgemein bekannte Verfahren unter Verwendung eines gereinigten Polypeptids gemäß der Erfindung oder eines geeigneten, daraus abgeleiteten Fragments als Antigen hergestellt werden. Ein Fragment, welches als ein Antigen geeignet ist, kann durch Antigenizitäts-bestimmende Algorithmen, die im Fachgebiet allgemein bekannt sind, identifiziert werden. Derartige Fragmente können entweder aus dem Polypeptid der Erfindung durch proteolytischen Verdau erhalten werden oder können ein synthetisches Peptid sein. Vorzugsweise ist der Antikörper der vorliegenden Erfindung ein monoklonaler Antikörper, ein polyklonaler Antikörper, ein Einzelkettenantikörper, ein humaner oder humanisierter, oder ein primatisierter, chimärisierter Antikörper oder Fragment davon. Ebenfalls als Antikörper der vorliegenden Erfindung inbegriffen sind ein bispezifischer Antikörper, ein synthetischer Antikörper, ein Antikörperfragment, wie Fab-, Fv- oder scFv-Fragmente etc., oder ein chemisch modifiziertes Derivat von einem Beliebigen derselben. Der Antikörper der vorliegenden Erfindung soll spezifisch an das Polypeptid der Erfindung binden (d. h. er zeigt keine Kreuzreaktion mit anderen Polypeptiden oder Peptiden). Die spezifische Bindung kann durch verschiedene allgemein bekannte Techniken getestet werden.
Antikörper oder Fragmente davon können durch Anwendung von Verfahren erhalten werden, welche z. B. beschrieben sind in Harlow und Lane "Antibodies, A Laborstory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Monoklone Antikörper können durch die Techniken hergestellt werden, welche ursprünglich beschrieben sind in Köhler und Milstein, Nature 256 (1975), 495, und Galfré, Meth. Enzymol. 73 (1981), 3, welche die Fusion von Maus-Myelomzellen mit Milzzellen, die aus immunisierten Säugern abgeleitet sind, umfassen.
Die Antikörper können zum Beispiel für die Immunpräzipitation, Immunlokalisierung oder Reinigung (z. B. durch Affinitätschromatographie) der Polypeptide der Erfindung sowie für die Überwachung des Vorhandenseins der Varianten-Polypeptide, zum Beispiel in rekombinanten Organismen, und für die Identifizierung von Verbindungen, welche mit den Proteinen gemäß der Erfindung Wechselwirken, verwendet werden.
Von der vorliegenden Erfindung abgedeckt wird ein Verfahren zur Herstellung einer ungesättigten Fettsäure, umfassend das Kultivieren der Wirtszelle der Erfindung oder der Pflanze oder der Pflanzensaat der Erfindung, so dass die ungesättigte Fettsäure hergestellt wird.
Ebenfalls betrachtet wird ein Verfahren des Modulierens der Herstellung einer ungesättigten Fettsäure, welches das Kultivieren der Wirtszelle der Erfindung oder der Pflanze oder der Pflanzensaat der Erfindung umfasst, so dass die Modulierung der Herstellung einer ungesättigten Fettsäure auftritt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Verfahren der vorliegenden Erfindung, umfasst das Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens der ungesättigten Fettsäure aus der Kultur.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung einer ungesättigten Fettsäure, umfassend das Kontaktieren einer Zusammensetzung, die mindestens ein Dehydratase-Zielmolekül umfasst, mit mindestens einem Polypeptid der Erfindung unter Bedingungen, so dass eine langkettige ungesättigte Fettsäure hergestellt wird.
Der Begriff ”ungesättigte Fettsäure” oder ”verlängerte Fettsäure” wie hierin verwendet, umfasst vorzugsweise Verbindungen mit einer Struktur, wie in der allgemeinen Formel I gezeigt
worin die Variablen und Substituenten in der Formel I folgende sind
R¹ = Hydroxyl, Coenzym A (Thioester), Lysophosphatidylcholin, Lysophosphatidylethanolamin, Lysophosphatidylglycerol, Lysodiphosphatidylglycerol, Lysophosphatidylserin, Lysophosphatidylinositol, Sphingo-Base oder ein Rest der Formel II
R² = Wasserstoff, Lysophosphatidylcholin, Lysophosphatidylethanolamin, Lysophosphatidylglycerol, Lysodiphosphatidylglycerol, Lysophosphatidylserin, Lysophosphatidylinositol oder gesättigtes oder ungesättigtes C₂-C₂₄-Alkylcarbonyl,
R³ = Wasserstoff, gesättigtes oder ungesättigtes C₂-C₂₄-Alkylcarbonyl, oder R² und R³ unabhängig voneinander ein Rest der Formel Ia sind:
n = 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 9, m = 2, 3, 4, 5 oder 6 und p = 0 oder 3;
Vorzugsweise steht R¹ in der allgemein Formel I für Hydroxyl, Coenzym A (Thioester), Lysophosphatidylcholin, Lysophosphatidylethanolamin, Lysophosphatidylglycerol, Lysodiphosphatidylglycerol, Lysophosphatidylserin, Lysophosphatidylinositol, Sphingo-Base oder einen Rest der Formel II
Die oben erwähnten Reste von R¹ sind immer an die Verbindungen der allgemeinen Formel I in der Form ihrer Thioester gebunden.
Vorzugsweise ist R² in der allgemeinen Formel II Wasserstoff, Lysophosphatidylcholin, Lysophosphatidylethanolamin, Lysophosphatidylglycerol, Lysodiphosphatidylglycerol, Lysophosphatidylserin, Lysophosphatidylinositol oder gesättigtes oder ungesättigtes C₂-C₂₄-Alkylcarbonyl. Ferner sind Alkylreste, die erwähnt sein können, substituierte oder unsubstituierte, gesättigte oder ungesättigte C₂-C₂₄-Alkylcarbonyl-Ketten, wie etwa Ethylcarbonyl, n-Propylcarbonyl, n-Butylcarbonyl, n-Pentylcarbonyl, n-Hexylcarbonyl, n-Heptylcarbonyl, n-Octylcarbonyl, n-Nonylcarbonyl, n-Decylcarbonyl, n-Undecylcarbonyl, n-Dodecylcarbonyl, n-Tridecylcarbonyl, n-Tetradecylcarbonyl, n-Pentadecylcarbonyl, n-Hexadecylcarbonyl, n-Heptadecylcarbonyl, n-Octadecylcarbonyl-, n-Nonadecylcarbonyl, n-Eicosylcarbonyl, n-Docosanylcarbonyl- oder n-Tetracosanylcarbonyl, welche eine oder mehrere Doppelbindungen umfassen. Gesättigte oder ungesättigte C₁₀-C₂₂-Alkylcarbonyl-Reste, wie n-Decylcarbonyl, n-Undecylcarbonyl, n-Dodecylcarbonyl, n-Tridecylcarbonyl, n-Tetradecylcarbonyl, n-Pentadecylcarbonyl, n-Hexadecylcarbonyl, n-Heptadecylcarbonyl, n-Octadecylcarbonyl, n-Nonadecylcarbonyl, n-Eicosylcarbonyl, n-Docosanylcarbonyl oder n-Tetracosanylcarbonyl, die eine oder mehrere Doppelbindungen umfassen, werden bevorzugt. Bevorzugt sind gesättigte und/oder ungesättigte C₁₀-C₂₂-Alkylcarbonyl-Reste, wie C₁₀-Alkylcarbonyl, C₁₁-Alkylcarbonyl, C₁₂-Alkylcarbonyl, C₁₃-Alkylcarbonyl, C₁₄-Alkylcarbonyl, C₁₆-Alkylcarbonyl, C₁₈-Alkylcarbonyl, C₂₀-Alkylcarbonyl oder C₂₂-Alkylcarbonylreste, welche eine oder mehrere Doppelbindungen umfassen. Besonders bevorzugt sind gesättigte oder ungesättigte C₂₀-C₂₂-Alkylcarbonylreste, wie C₂₀-Alkylcarbonyl- oder C₂₂-Alkylcarbonylreste, die eine oder mehrere Doppelbindungen umfassen. Diese bevorzugten Reste können zwei, drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen umfassen. Die besonders bevorzugten Reste mit 20 oder 22 Kohlenstoffatomen in der Fettsäurekette umfassen bis zu sechs Doppelbindungen, vorteilhafterweise zwei, drei, vier oder fünf Doppelbindungen, speziell bevorzugt zwei, drei oder vier Doppelbindungen. Alle die oben erwähnten Reste werden aus den entsprechenden Fettsäuren abgeleitet. Vorzugsweise steht R³ in der Formel II für Wasserstoff, gesättigtes oder ungesättigtes C₂-C₂₄-Alkylcarbonyl. Alkylreste, die erwähnt werden können, sind substituierte oder unsubstituierte, gesättigte oder ungesättigte C₂-C₂₄-Alkylcarbonyl-Ketten, wie Ethylcarbonyl, n-Propylcarbonyl, n-Butylcarbonyl, n-Pentylcarbonyl, n-Hexylcarbonyl, n-Heptylcarbonyl, n-Octylcarbonyl, n-Nonylcarbonyl, n-Decylcarbonyl, n-Undecylcarbonyl, n-Dodecylcarbonyl, n-Tridecylcarbonyl, n-Tetradecylcarbonyl, n-Pentadecylcarbonyl, n-Hexadecylcarbonyl, n-Heptadecylcarbonyl, n-Octadecylcarbonyl-, n-Nonadecylcarbonyl, n-Eicosylcarbonyl, n-Docosanylcarbonyl oder n-Tetracosanylcarbonyl, welche eine oder mehrere Doppelbindungen umfassen. Gesättigte oder ungesättigte C₁₀-C₂₂-Alkylcarbonylreste, wie n-Decylcarbonyl, n-Undecylcarbonyl, n-Dodecylcarbonyl, n-Tridecylcarbonyl, n-Tetradecylcarbonyl, n-Pentadecylcarbonyl, n-Hexadecylcarbonyl, n-Heptadecylcarbonyl, n-Octadecylcarbonyl, n-Nonadecylcarbonyl, n-Eicosylcarbonyl, n-Docosanylcarbonyl oder n-Tetracosanylcarbonyl, welche eine oder mehrere Doppelbindungen umfassen, sind bevorzugt. Bevorzugt sind gesättigte und/oder ungesättigte C₁₀-C₂₂-Alkylcarbonyl-Reste, wie C₁₀-Alkylcarbonyl-, C₁₁-Alkylcarbonyl-, C₁₂-Alkylcarbonyl-, C₁₃-Alkylcarbonyl-, C₁₄-Alkylcarbonyl-, C₁₆-Alkylcarbonyl-, G₁₈-Alkylcarbonyl-, C₂₀-Alkylcarbonyl- oder C₂₂-Alkylcarbonyl-Reste, welche eine oder mehrere Doppelbindungen umfassen. Besonders bevorzugt sind gesättigte oder ungesättigte C₂₀-C₂₂-Alkylcarbonyl-Reste, wie C₂₀-Alkylcarbonyl- oder C₂₂-Alkylcarbonyl-Reste, welche eine oder mehrere Doppelbindungen umfassen. Diese bevorzugten Reste können zwei, drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen umfassen. Die besonders bevorzugten Reste mit 20 oder 22 Kohlenstoffatomen in der Fettsäurekette umfassen bis zu sechs Doppelbindungen, vorteilhafterweise zwei, drei, vier oder fünf Doppelbindungen, speziell bevorzugt zwei, drei oder vier Doppelbindungen. Alle die oben erwähnten Reste werden aus den entsprechenden Fettsäuren abgeleitet.
Die oben erwähnten Reste von R¹, R² und R³ können durch Hydroxyl- und/oder Epoxy-Gruppen substituiert sein und/oder können Dreifach-Bindungen umfassen.
Die ungesättigte Fettsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFAs). Die mehrfach ungesättigten Fettsäuren gemäß der Erfindung umfassen vorteilhafterweise mindestens zwei, vorteilhafterweise drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen. Die Fettsäuren umfassen speziell vorteilhafterweise zwei, drei, vier oder fünf Doppelbindungen. Ungesättigte Fettsäuren umfassen vorzugsweise 20 oder 22 Kohlenstoffatome in der Fettsäurekette. Gesättigte Fettsäuren werden vorteilhafterweise zu einem kleineren Ausmaß, oder überhaupt nicht, durch die Nukleinsäuren, die im Verfahren verwendet werden, umgesetzt. Zu einem kleineren Ausmaß versteht sich so, dass gemeint ist, dass die gesättigten Fettsäuren mit weniger als 5% der Aktivität, vorteilhafterweise weniger als 3%, insbesondere vorteilhafterweise mit weniger als 2% der Aktivität, im Vergleich zu mehrfach ungesättigten Fettsäuren, umgesetzt werden. Diese Fettsäuren, die hergestellt worden sind, können in dem Verfahren als ein Einzelprodukt hergestellt werden oder in einem Fettsäuregemisch vorhanden sein.
Vorteilhafterweise sind die Substituenten R² oder R³ in den allgemeinen Formeln I und II unabhängig voneinander gesättigtes oder ungesättigtes C₂₀-C₂₂-Alkylcarbonyl; und sind speziell vorteilhaft, unabhängig voneinander, ungesättigtes C₂₀- oder C₂₂-Alkylcarbonyl mit mindestens zwei Doppelbindungen.
Die mehrfach ungesättigten Fettsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise in Membranlipiden und/oder Triacylglyceriden gebunden, aber können auch als freie Fettsäuren oder anders gebunden in Form von sonstigen Fettsäureestern in den Organismen vorkommen. In diesem Zusammenhang können sie als ”reine Produkte” oder aber vorteilhafterweise in der Form von Mischungen von verschiedenen Fettsäuren oder Mischungen unterschiedlicher Glyceride vorliegen. Die diversen Fettsäuren, welche in den Triacylglyceriden gebunden sind, können aus kurzkettigen Fettsäuren mit 4 bis 6 C-Atomen, mittellangkettigen Fettsäuren mit 8 bis 12 C-Atomen oder langkettigen Fettsäuren mit 14 bis 24 C-Atomen abgeleitet sein. Gemäß des Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden die langkettigen Fettsäuren, speziell die langkettigen PUFAs (LCPUFAs) von C₂₀- und/oder C₂₂-Fettsäuren bevorzugt.
Bevorzugte ungesättigte Fettsäuren im Sinn der vorliegenden Erfindung sind aus der Gruppe gewählt, die aus DGLA 20:3 (8, 11, 14), AA 20:4 (5, 8, 11, 14), EPA 20:5 (5, 8, 11, 14, 17), DPA 22:5 (4, 7, 10, 13, 16) und DHA 22:6 (4, 7, 10, 13, 16, 19), 20:4 (8, 11, 14, 17) besteht.
Der Begriff ”Dehydratase-Zielmolekül” umfasst vorzugsweise Substrate der Polypeptide der Erfindung. Ein besonders bevorzugtes Zielmolekül ist 3-Hydroxyacyl-ACP oder 3-Hydroxyacyl-CoA von GLA 18:3 (6, 9, 12), DGLA 20:3 (8, 11, 14), AA 20:4 (5, 8, 11, 14) und Eicosapentaensäure 20:5 (5, 8, 11, 14, 17).
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle, Pflanze oder Pflanzensaat, die zur Erzeugung einer ungesättigten Fettsäure in der Lage ist, umfassend das Einführen des Nukleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung oder des Vektors der vorliegenden Erfindung in die Wirtszelle, Pflanze oder Pflanzensaat.
Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zur Erzeugung eines Öls vor, umfassend die Schritte der oben erwähnten Verfahren und den weiteren Schritt des Formulierens eines Öls, welches die ungesättigte Fettsäure umfasst.
Die vorliegende Erfindung schließt ein Öl ein, welches durch die Pflanze oder die Pflanzensaat der Erfindung hergestellt wird, oder durch das Verfahren der Erfindung erhältlich ist.
Der Begriff ”Öl” bezieht sich auf ein Fettsäuregemisch, das ungesättigte oder gesättigte, vorzugsweise veresterte, Fettsäuren) umfasst. Das Öl ist vorzugsweise reich an mehrfach ungesättigten freien oder, vorteilhafterweise, veresterten Fettsäure(n), insbesondere den hier oben genannten bevorzugten LCPUFAs. Die Menge an ungesättigten veresterten Fettsäuren beträgt vorzugsweise ungefähr 30%, wobei ein Gehalt von 50% stärker bevorzugt wird, und ein Gehalt von 60%, 70%, 80% oder mehr noch weiter bevorzugt ist. Für die Analyse kann der Fettsäure-Gehalt zum Beispiel durch GC bestimmt werden, nachdem die Fettsäuren durch Umesterung in die Methylester umgewandelt wurden. Das Öl kann verschiedene andere gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren umfasst, zum Beispiel Calendulasäure, Palmitinsäure, Palmitoleinsäure, Stearinsäure, Ölsäure und dergleichen. Der Gehalt der verschiedenen Fettsäuren im Öl oder Fett kann variieren, insbesondere abhängig von dem Ausgangsorganismus. Das Öl soll allerdings eine nicht natürlich vorkommende Zusammensetzung bezüglich der ungesättigten Fettsäure aufweisen. Außerdem kann das Öl der Erfindung auch andere molekulare Spezies umfassen. Im Speziellen kann es kleinere Verunreinigungen mit den Nukleinsäuremolekülen der Erfindung umfassen. Derartige Verunreinigungen können jedoch nur durch hochempfindliche Techniken, wie PCR, nachgewiesen werden.
Die vorliegende Erfindung schließt auch ein Verfahren zur Erzeugung eines Medikaments ein, umfassend die Schritte des Verfahrens der Erfindung und den weiteren Schritt des Formulierens eines Medikaments, welches die ungesättigte Fettsäure umfasst.
Der Begriff ”Medikament” wird hierin austauschbar mit dem Begriff ”Pharmazeutische Zusammensetzung”, der nachstehend ausführlich erläutert ist, verwendet. Der Begriff ”Medikament” oder ”Pharmazeutische Zusammensetzung”, wie hierin verwendet, umfasst die Verbindungen der vorliegenden Erfindung und gegebenenfalls einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Träger. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können als pharmazeutisch annehmbare Salze formuliert werden. Annehmbare Salze umfassen Acetat, Methylester, HCl, Sulfat, Chlorid und dergleichen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden vorzugsweise topisch oder systemisch verabreicht. Geeignete Routen der Verabreichung, welche herkömmlicherweise zur Arzneimittelverabreichung angewandt werden, sind die orale, intravenöse oder parenterale Verabreichung, sowie Inhalation. Abhängig von der Beschaffenheit und der Wirkungsweise einer Verbindung können die pharmazeutischen Zusammensetzungen jedoch auch auf anderen Wegen verabreicht werden. Zum Beispiel können Polynukleotidverbindungen in einer Gentherapie-Vorgehensweise durch Verwenden von viralen Vektoren oder Viren oder Liposomen verabreicht werden.
Darüber hinaus können die Verbindungen in Kombination mit anderen Arzneimitteln, entweder in einer gemeinsamen pharmazeutischen Zusammensetzung oder als getrennte pharmazeutische Zusammensetzungen verabreicht werden, wobei die getrennten pharmazeutischen Zusammensetzungen in der Form eines Kits von Teilen bereitgestellt werden können.
Die Verbindungen werden vorzugsweise in herkömmlichen Dosierungsformen verabreicht, die durch Vereinigen der Arzneimittel mit standardmäßigen pharmazeutischen Trägern gemäß herkömmlicher Vorgehensweisen hergestellt werden. Diese Vorgehensweisen können das Mischen, Granulieren und Komprimieren oder Lösen der Bestandteile, wie für die gewünschte Präparation angemessen, beinhalten. Es ist davon auszugehen, dass die Form und der Charakter des pharmazeutisch annehmbaren Trägers oder Verdünnungsmittels von der Menge an aktivem Bestandteil, mit der er vereinigt werden soll, der Route der Verabreichung sowie anderen allgemein bekannten Variablen vorgeschrieben wird.
Der/Die Träger müssen annehmbar sein, in dem Sinne, dass sie mit den anderen Bestandteilen der Formulierung verträglich und für einen Empfänger derselben nicht schädlich sind. Der verwendete pharmazeutische Träger kann zum Beispiel entweder ein Feststoff, ein Gel oder eine Flüssigkeit sein. Beispielhaft für feste Träger sind Laktose, Kaolin bzw. Terra alba, Saccharose, Talk, Gelatine, Agar, Pektin, Akaziengummi, Magnesiumstearat, Stearinsäure und dergleichen. Beispielhaft für flüssige Träger sind phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Sirup, Öl, wie Erdnussöl und Olivenöl, Wasser, Emulsionen, verschiedene Typen von Benetzungsmitteln, sterile Lösungen und dergleichen. In ähnlicher Weise kann der Träger oder das Verdünnungsmittel ein im Fachgebiet allgemein bekanntes Zeitverzögerungs-Material einschließen, wie etwa Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat allein oder mit einem Wachs. Zu den geeigneten Trägern gehören die oben Genannten sowie andere, welche im Fachgebiet allgemein bekannt sind, siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Esston, Pennsylvania.
Das/Die Verdünnungsmittel wird/werden so ausgewählt, dass die biologische Aktivität der Kombination nicht beeinträchtigt wird. Beispiele solcher Verdünnungsmittel sind destilliertes Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Ringer-Lösungen, Dextrose-Lösung und Hank-Lösung. Darüber hinaus kann die pharmazeutische Zusammensetzung oder Formulierung ebenfalls weitere Träger, Hilfsstoffe oder nicht-toxische, nicht-therapeutische, nicht-immunogene Stabilisatoren und dergleichen einschließen.
Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich auf eine in einer pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zu verwendende Menge der Verbindungen, welche die Symptome, die eine in dieser Patentschrift genannte Erkrankung oder Krankheit begleiten, verhindert, verbessert oder behandelt. Die therapeutische Wirksamkeit und die Toxizität derartiger Verbindungen können durch standardmäßige pharmazeutische Vorgehensweisen in Zellkulturen oder Versuchstieren bestimmt werden, z. B. die ED50 (die Dosis, welche in 50% der Population therapeutisch wirksam ist) und die LD50 (die Dosis, welche für 50% der Population tödlich ist). Das Dosisverhältnis zwischen therapeutischen und toxischen Effekten ist der therapeutische Index, und selbiger kann als das Verhältnis LD50/ED50 ausgedrückt werden.
Das Dosierungsschema wird vom behandelnden Arzt sowie weiteren klinischen Faktoren, vorzugsweise gemäß einer beliebigen der oben beschriebenen Methoden, bestimmt. Wie es auf dem Gebiet der Medizin allgemein bekannt ist, hängen Dosierungen für einen beliebigen Patienten von vielen Faktoren ab, einschließlich der Größe des Patienten, dem Körperoberflächenbereich, dem Alter, der jeweiligen, zu verabreichenden Verbindung, dem Geschlecht, der Zeit und Route der Verabreichung, dem allgemeinen Gesundheitszustand und anderen Arzneimitteln, welche einhergehend verabreicht werden. Der Fortschritt kann durch periodisches Überprüfen verfolgt werden. Eine typische Dosis kann zum Beispiel im Bereich von 1 bis 1000 μg liegen; allerdings werden Dosierungen unter oder über diesem beispielhaften Bereich in Betracht gezogen, insbesondere unter Berücksichtigung der zuvor genannten Faktoren. Im Allgemeinen sollte das Schema in Form einer regelmäßigen Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung im Bereich von Einheiten mit 1 μg, bis 10 mg täglich liegen. Wenn es sich bei dem Schema um eine kontinuierliche Infusion handelt, sollte sie ebenfalls jeweilig im Bereich von Einheiten mit 1 μg bis 10 mg je Kilogramm Körpergewicht pro Minute liegen. Der Fortschritt kann durch periodisches Überprüfen verfolgt werden. Allerdings kann die Menge der Substanzverabreichung, abhängig vom Subjekt und der Art der Verabreichung, über einen breiten Bereich hinweg variieren.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen und Formulierungen, auf welche hierin Bezug genommen wird, werden mindestens einmalig verabreicht, um eine in dieser Patentschrift genannte Erkrankung oder Krankheit zu behandeln oder zu verbessern oder zu verhindern. Allerdings können die pharmazeutischen Zusammensetzungen mehr als einmal, zum Beispiel ein- bis viermal täglich, bis zu einer nicht-begrenzten Anzahl an Tagen verabreicht werden.
Spezifische pharmazeutische Zusammensetzungen werden auf eine im Gebiet der Pharmazie allgemein bekannte Weise hergestellt und umfassen mindestens eine, hierin oben genannte, aktive Verbindung in Vermischung oder anderweitiger Assoziation mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel. Zur Herstellung dieser spezifischen pharmazeutischen Zusammensetzungen werden die aktive(n) Verbindung(en) üblicherweise mit einem Träger oder dem Verdünnungsmittel gemischt oder in einer Kapsel, einem Beutel, einer Versiegelung, Papier oder anderen geeigneten Behältern oder Vehikeln eingeschlossen oder verkapselt. Die resultierenden Formulierungen müssen an die Art der Verabreichung angepasst werden, d. h. in der Form von Tabletten, Kapseln, Suppositorien, Lösungen, Suspensionen oder dergleichen. Dosierungs-Empfehlungen sollen in den Verschreibungen oder den Benutzeranweisungen angegeben sein, um Anpassungen der Dosis in Abhängigkeit vom betreffenden Empfänger vorwegzunehmen.
Für kosmetische Anwendungen können die hierin als pharmazeutisch aktive Bestandteile des Medikamentes genannten Verbindungen als ein Haarwasser, eine Haarwuchsmittel-Zusammensetzung, ein Shampoo, ein Pulver, ein Gelee, eine Haarspülung, eine Salbe, eine Haarlotion, eine Paste, eine Haarcreme, ein Haarspray und/oder ein Haar-Aerosol formuliert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Medikament, umfassend das Nukleinsäuremolekül, den Vektor, die Wirtszelle, die Pflanze oder die Pflanzensaat oder das Öl der vorliegenden Erfindung.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des Nukleinsäuremoleküls, des Vektors, der Wirtszelle, der Pflanze oder der Pflanzensaat oder des Öls der Erfindung für die Herstellung von Tierfutter, einer Nahrungsmittelergänzung oder eines Lebensmittels.
Ferner umfasst die vorliegende Erfindung eine Zelle, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, das aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus:

a) einem Nukleinsäuremolekül, umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9, wobei das Nukleinsäuremolekül durch mindestens eine Technik disruptiert wird, gewählt aus der Gruppe, die aus einer Punktmutation, einer Verkürzung, einer Inversion, einer Deletion, einer Addition, einer Substitution und homologer Rekombination besteht;
b) einem Nukleinsäuremolekül, umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9, wobei das Nukleinsäuremolekül eine oder mehrere Nukleinsäuremodifikationen im Vergleich zu der in SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 dargestellten Sequenz umfasst, wobei die Modifikation gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Punktmutation, einer Verkürzung, einer Inversion, einer Deletion, einer Addition und einer Substitution; und
c) einem Nukleinsäuremolekül, umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9, wobei die regulatorische Region des Nukleinsäuremoleküls im Verhältnis zur regulatorischen Wildtyp-Region des Moleküls durch mindestens eine Technik modifiziert ist, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Punktmutation, einer Verkürzung, einer Inversion, einer Deletion, einer Addition, einer Substitution und einer homologen Rekombination.

Im Folgenden werden weitere bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ausführlicher beschrieben.
Die Verwendung der Nukleinsäuremoleküle und Polypeptide der vorliegenden Erfindung sieht ein Mittel zum Modulieren, zum Beispiel Steigern, der Herstellung von gewünschten, verlängerten Fettsäuren vor. Zum Beispiel gestattet die Einbringung dieser Dehydratase-Nukleinsäure- und Polypeptid-Moleküle in mikrobielle und pflanzliche Zellen, zum Beispiel unter der Steuerung eines Samen-spezifischen Promotors, die gesteigerte Herstellung von ungesättigten Fettsäuren in Ölsaat, wie etwa AA 20:4 (5, 8, 11, 14), EPA 20:5 (5, 8, 11, 14, 17), DPA 22:5 (4, 7, 10, 13, 16) und DHA 22:6 (4, 7, 10, 13, 16, 19).
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung, in einem Aspekt, ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus a) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, codierend Dehydratasen aus der Gattung Brassica oder Euglena, oder ein Komplement davon; b) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9, oder ein Komplement davon, einschließt; c) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2 oder 4 einschließt, oder ein Komplement davon; d) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches eine natürlich vorkommende allelische Variante eines Polypeptids, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2 oder 4 einschließt, codiert, oder ein Komplement davon; e) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz einschließt, die mindestens 50% identisch zur gesamten Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1 oder 3 ist, oder ein Komplement davon; f) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz einschließt, die under stringenten Bedingungen an das Komplement der Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1 oder 3 hybridisiert, oder ein Komplement davon; g) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein Fragment von mindestens 15 zusammenhängenden Nukleotiden von der gesamten Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1 oder 3 einschließt, oder ein Komplement davon. In einer besonderen Ausführungsform codiert das Nukleinsäuremolekül ein Dehydratase-Protein mit einer Aktivität zum Katalysieren der Entfernung einer Hydroxylgruppe aus einem Enoyl-CoA-Molekül, zum Beispiel der Entfernung der Hydroxylgruppe aus 3-Hydroxyeicosatrienoyl-CoA, 3-Hydroxyeicosatetraenoyl-CoA, 3-Hydroxydocosatetraenoyl-CoA und 3-Hydroxyldocosapentaenoyl-CoA der Fettsäure, und h) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches an das Komplement der Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 3, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 7 und SEQ ID NR: 9 in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei 65°C hybridisiert, oder ein Komplement davon. In einer anderen Ausführungsform schließt das isolierte Nukleinsäuremolekül weiterhin eine Nukleotidsequenz ein, welche ein heterologes Polypeptid codiert.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung einen Vektor, zum Beispiel einen Expressionsvektor, der ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung beinhaltet. In einer besonderen Ausführungsform kann das Nukleinsäuremolekül unter der Steuerung eines Samen-spezifischen Promotors, zum Beispiel Conlinin 1, Conlinin 2, Napin und LuFad3, stehen.
In einem anderen Aspekt richtet sich die Erfindung auf eine Wirtszelle, welche mit dem Expressionsvektor, der ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung einschließt, transfiziert ist. Die Wirtszelle kann eine pflanzliche Zelle sein, zum Beispiel eine Pflanzenzelle aus einer Ölsaat-Nutzpflanze, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Flachs (Linum sp.), Raps (Brassica sp.), Sojabohne (Glycine und Soja sp.), Sonnenblume (Helianthus sp.), Baumwolle (Gossypium sp.), Mais (Zea mays), Olive (Olea sp.), Saflor (Carthamus sp.), Kakao (Theobroma cacoa), Erdnuss (Arachis sp.), Hanf, Camelina, Crambe, Ölpalme, Kokosnüssen, Erdnüssen, Sesamsamen, Castorbohne, Lesquerella, Talgbaum, Shea-Nüssen, Tung-Nüssen, Kapok-Frucht, Mohnsamen, Jojoba-Samen und Perilla. Alternativ dazu kann die Wirtszelle eine mikrobielle Zelle sein, einschließlich, ohne Einschränkung darauf, Candida, Cryptococcus, Lipomyces, Rhodosporidium, Yarrowia, Thraustochytrium, Pythium, Schizochytrium und Crythecodinium.
In einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids durch Kultivieren einer Wirtszelle der Erfindung in einem geeigneten Kulturmedium vor, um dadurch das Polypeptid, zum Beispiel eine Fettsäure-Dehydratase, herzustellen.
In noch einem anderen Aspekt sieht die Erfindung isolierte Polypeptide vor, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus a) einem isolierten Fettsäure-Dehydratase-Polypeptid aus Brassica und Euglena; b) einem isolierten Polypeptid, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 einschließt; c) einem isolierten Polypeptid, welches eine natürlich vorkommende allelische Variante eines Polypeptids einschließt, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 einschließt: d) einem isolierten Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz einschließt, welche codiert wird von einem Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 einschließt; e) einem isolierten Polypeptid, welches von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, das die Nukleotidsequenz einschließt, welche mindestens 50% identisch zu der gesamten Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 ist; f) einem isolierten Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz einschließt, die mindestens 50% identisch zur gesamten Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 ist; und g) einem isolierten Polypeptid, welches ein Fragment eines Polypeptids einschließt, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 einschließt, wobei das Polypeptid-Fragment eine biologische Aktivität des vollständigen Polypeptids beibehält. In einer besonderen Ausführungsform ist das Polypeptid an der Herstellung einer verlängerten Fettsäure beteiligt. In einer anderen Ausführungsform katalysiert das Polypeptid die Bildung von Enoyl-Acyl-CoA-Molekülen durch Entfernen einer Hydroxylgruppe (es wird H₂O gebildet) aus 3-Hydroxy-Acyl-CoA. In einer anderen Ausführungsform schließt das Polypeptid ebenfalls eine heterologe Aminosäuresequenz ein.
In einem anderen Aspekt sieht die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer verlängerten Fettsäure durch Kultivieren einer Wirtszelle der Erfindung vor, sodass die verlängerte Fettsäure hergestellt wird. In einem anderen Aspekt sieht die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer verlängerten Fettsäure durch Kontaktieren einer Zusammensetzung, welche mindestens das Dehydratase-Zielmolekül beinhaltet, mit zumindest einem Polypeptid der Erfindung unter solchen Bedingungen vor, dass die verlängerte Fettsäure hergestellt wird. In noch einem anderen Aspekt sieht die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Zelle, die zur Erzeugung einer verlängerten Fettsäure fähig ist, durch Einbringen von Nukleinsäuremolekülen der Erfindung in die Zelle vor, wobei die Nukleinsäuremoleküle eine Dehydratase codieren, welche eine Aktivität zum Katalysieren der Entfernung einer Hydroxylgruppe aus 3-Hydroxy-Acyl-CoA aufweist. In noch einem anderen Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Modulieren, zum Beispiel Steigern, der Herstellung einer langkettigen ungesättigten Fettsäure durch Kultivieren einer mit dem Expressionsvektor der Erfindung transformierten Zelle, so dass eine Modulation der Herstellung der langkettigen ungesättigten Fettsäure auftritt. In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren für die großtechnische Herstellung einer langkettigen ungesättigten Fettsäure durch Kultivieren einer mit dem Expressionsvektor der Erfindung transformierten Zelle. In bestimmten Ausführungsformen führt die Expression des Nukleinsäuremoleküls zur Modulierung der Herstellung von langkettigen ungesättigten Fettsäuren, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, AA 20:4 (5, 8, 11, 14), EPA 20:5 (5, 8, 11, 14, 17), DPA 22:5 (4, 7, 10, 13, 16), DHA 22:6 (4, 7, 10, 13, 16, 19).
In einer Ausführungsform kann die durch die vorangehend genannten Verfahren hergestellte Fettsäure aus der Kultur gewonnen werden. In einer anderen Ausführungsform ist die Zelle eine Pflanzenzelle, zum Beispiel, eine Ölsaat-Nutzpflanze, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Flachs (Linum sp.), Raps (Brassica sp.), Sojabohne (Glycine und Soja sp.), Sonnenblume (Helianthus sp.), Baumwolle (Gossypium sp.), Mais (Zea mays), Olive (Olea sp.), Saflor (Carthamus sp.), Kakao (Theobroma cacoa), Erdnuss (Arachis sp.), Hanf, Camelina, Crambe, Ölpalme, Kokosnüssen, Erdnüssen, Sesamsamen, Castorbohne, Lesquerella, Talgbaum, Shea-Nüssen, Tung-Nüssen, Kapok-Frucht, Mohnsamen, Jojoba-Samen und Perilla. In einer besonderen Ausführungsform ist die Zelle von Brassica juncea. In einer noch anderen Ausführungsform ist die Zelle eine mikrobielle Zelle, zum Beispiel, Candida, Cryptococcus, Lipomyces, Rhodosporidium, Yarrowia, Thraustochytrium, Pythium, Schizochytrium und Crythecodinium.
In noch einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle, aufweisend a) ein Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 einschließt, wobei das Nukleinsäuremolekül durch mindestens eine Technik, gewählt aus der Gruppe, die aus einer Punktmutation, einer Verkürzung, einer Inversion, einer Deletion, einer Addition, einer Substitution und homologer Rekombination besteht, zum Beispiel so disruptiert wird, dass die Fettsäure-Dehydratase-Aktivität zerstört wird; b) ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9, wobei das Nukleinsäuremolekül eine oder mehrere Nukleinsäuremodifikationen im Vergleich zu der in SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 dargestellten Sequenz enthält, wobei die Modifikation gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Punktmutation, einer Verkürzung, einer Inversion, einer Deletion, einer Addition und einer Substitution, zum Beispiel, so dass das modifizierte Nukleinsäuremolekül ein Polypeptid codiert, welches Fettsäure-Dehydratase-Aktivität beibehält; oder c) ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9, wobei die regulatorische Region des Nukleinsäuremoleküls im Verhältnis zur regulatorischen Wildtyp-Region des Moleküls durch mindestens eine Technik modifiziert ist, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Punktmutation, einer Verkürzung, einer Inversion, einer Deletion, einer Addition, einer Substitution und einer homologen Rekombination, zum Beispiel, so dass Fettsäure-Dehydratase-Expression und/oder -Aktivität modifiziert (z. B. gesteigert) werden.
In weiteren Aspekten betrifft die Erfindung eine Pflanze, die einen Vektor wie hierin beschrieben einschließt, sowie von der Pflanze erzeugte Öle oder Samen. In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, die das Öl und/oder Samen einschließt, wobei die Zusammensetzung zur Verwendung als Tierfutter, Nahrungsmittelergänzung oder Lebensmittel geeignet ist. In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die den Samen oder das Öl umfasst. In noch einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung eine langkettige ungesättigte Fettsäure, die durch ein hierin beschriebenes Verfahren erhalten wird. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Zusammensetzungen, welche die durch ein hierin beschriebenes Verfahren hergestellten, langkettigen ungesättigten Fettsäuren einschließen, wobei die Zusammensetzung zur Verwendung als Tierfutter, Nahrungsmittelergänzung oder Lebensmittel geeignet ist. In noch einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche die langkettigen ungesättigten Fettsäuren einschließt, die durch ein hierin beschriebenes Verfahren hergestellt werden. In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend die Dehydratase-Polypeptide der Erfindung oder die transgenen Zellen der Erfindung, zum Beispiel zur Verwendung als Tierfutter, Nahrungsmittelergänzung, Lebensmittel oder pharmazeutische Zusammensetzung.
In folgenden werden besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Die vorliegende Erfindung basiert, zumindest zum Teil, auf der Ermittlung von Fettsäure-Dehydratase, welche hierin austauschbar als ”Dehydratasen” oder ”Dehydratase” – Nukleinsäure- und Protein-Moleküle bezeichnet wird (z. B. BN-7, BN-G8 aus Brassica napus (B. napus) und/oder EG-S6, EG-FF4 und EG-L3 aus Euglena gradclis (E. gracilis))BN-7, BN-G6, EG-S6, EG-FF4 und EG-L3). Diese neuen Moleküle sind Vertreter der Fettsäure-Dehydratase-Familie und werden in einer Vielzahl von Organismen, welche verlängerte Fettsäuren produzieren, wie etwa Brassica napus und Euglena gracilis, und vielen anderen Pflanzen-, Algen- und Pilzorganismen exprimiert. Die vorliegende Erfindung beruht ferner, zumindest teilweise, auf der Feststellung, dass die B. Napus- und E. gracilis-Fettsäure-Dehydratasen (z. B. BN-7, BN-G8, EG-S6, EG-FF4 und EG-L3BN-7, BN-G6, EG-S6, EG-FF4 und EG-L3) die Entfernung einer Hydroxylgruppe aus einer 3-Hydroxy-Acyl-CoA-Fettsäure katalysieren. DehydrataseBN-7, BN-G6, EG-S6, EG-FF4 und EG-L3-Dehydratasedehydratasedehydratasedehydratase. Im Allgemeinen werden die regulierenden Schritte in der Herstellung von langkettigen ungesättigten Fettsäuren, d. h. dem Biosyntheseweg langkettiger ungesättigter Fettsäure, katalysiert von Membranassoziierten Fettsäure-Dehydratase/Elongase-Komplexen. BN-7, BN-G6, EG-S6, EG-FF4 und EG-L3. Pflanzen und die meisten anderen eukaryotischen Organismen besitzen spezialisierte Elongase-Systeme für die Verlängerung von Fettsäuren über 18 C-Atome hinaus. Diese Elongase-Reaktionen haben einige bedeutende Merkmale mit dem Fettsäure-Synthase-Komplex (FAS) gemeinsam. Allerdings ist der Elongase-Komplex von dem FAS-Komplex verschieden, da der Komplex im Zytosol lokalisiert ist und membrangebunden vorkommt, ACP nicht beteiligt ist, und die Elongase-3-Keto-Acyl-CoA-Synthase die Kondensation von Malonyl-CoA mit einem Acyl-Primer katalysiert. Der Elongase-Komplex besteht aus vier Komponenten mit unterschiedlichen katalytischen Funktionen, der Keto-Acyl-Synthase (Kondensationsreaktion von Malonyl-CoA zu Acyl-CoA, Erzeugung einer um 2 C-Atome längeren Keto-Acyl-CoA-Fettsäure), der Keto-Acyl-Reductase (Reduktion der 3-Ketogruppe zu einer 3-Hydroxygruppe), der Dehydratase (Dehydratisierung führt zu einer 3-Enoyl-Acyl-CoA-Fettsäure) und der Enoyl-CoA-Reductase (Reduktion der Doppelbindung an Position 3, Ablösung aus dem Komplex). Für die Herstellung von langkettigen PUFA, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Arachidonsäure (AA 20:4 (5, 8, 11, 14)), Eicosapentaensäure (EPA 20:5 (5, 8, 11, 14, 17)), Docosapentaensäure (DPA 22:5 (4, 7, 10, 13, 16)), Docosahexaensäure (DHA 22:6 (4, 7, 10, 13, 16, 19)), ist die Elongations-Reaktion essentiell. Höhere Pflanzen weisen nicht den notwendigen Enzym-Satz auf, um langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäuren (4 oder mehr Doppelbindungen, 20 oder mehr C-Atome) herzustellen. Deshalb müssen die katalytischen Aktivitäten in die Pflanzen übertragen werden. Ein kritischer Schritt im Verfahren der Verlängerung ist die Dehydratations-Reaktion. Es konnten drei neue Aminosäuresequenzen aus Pflanzen und einer PUFA-produzierenden Alge identifiziert werden, welche die Dehydratations-Aktivität katalysieren. Durch Zuführung dieser Dehydratase, in Kombination mit Dehydratasen und Elongasen werden erhöhte Spiegel an PUFA erzeugt.
In Hinsicht auf die Beteiligung von langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren an verschiedenen zellulären Prozessen, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, der Bildung der zellulären Membranen verschiedener Gewebe und Organellen in Säugern (zum Beispiel Nerven-, Retina-, Gehirn- und Immunzellen), Förderung des Wachstums und der Entwicklung des Gehirns in Kleinkindern, Aufrechterhaltung der normalen Hirnfunktion bei Erwachsenen, Beeinflussung der Lichtrezeptor-Funktion, Beeinflussung des Signaltransduktions-Vorgangs, Aktivierung von Rhodopsin und Entwicklung von Stäbchen und Zäpfchen, können die Dehydratasen der vorliegenden Erfindung in Kombination mit Dehydratasen und Elongasen, wie z. B. in WO 2005/083093 beschrieben, in der Behandlung gewisser Erkrankungen verwendet werden, zum Beispiel jenen Erkrankungen, die durch fehlerhaft regulierte(s) Wachstum, Proliferation oder Differenzierung gekennzeichnet sind. Zum Beispiel können die Dehydratasen der vorliegenden Erfindung in Kombination mit Dehydratasen und Elongasen, wie z. B. in WO 2005/083093 beschrieben, bei der Behandlung von Krankheiten, wie etwa Hypertension, Diabetes, Hypercholesterinämie, Arthritis, Atherosklerose, Depressionen, Thrombose, Krebsarten (z. B. Karzinom, Sarkom oder Leukämie), Tumor-Angiogenese und -Metastase, Skelettdysplasie, Leberstörungen, myelodysplastischen Syndromen, atopischem Ekzem, prämenstruellem Syndrom sowie hämatopoetischen, entzündlichen und/oder myeloproliferativen Erkrankungen verwendet werden. Andere Erkrankungen, welche durch die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, schließen diejenigen Erkrankungen ein, welche mit Angiogenese zusammenhängen, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, erbliche hämorrhagische Telangiectasie vom Typ 1, Fibrodysplasia ossificans progressiva, idiopathischer Lungenfibrose und Klippel-Trenaunay-Weber-Syndrom.
Wie hierin verwendet, ist der Begriff ”Fettsäure” im Fachgebiet anerkannt und beinhaltet eine langkettige Carbonsäure auf Kohlenwasserstoff-Basis. Fettsäuren sind Komponenten vieler Lipide, welche Glyceride einschließen. Die am häufigsten, natürlich vorkommenden Fettsäuren sind Monocarbonsäuren, welche eine gerade Zahl an Kohlenstoffatomen (16 oder 18) aufweisen und welche gesättigt oder ungesättigt sein können. ”Ungesättigte” Fettsäuren enthalten cis-Doppelbindungen zwischen den Kohlenstoffatomen. Ungesättigte Fettsäuren, welche von der vorliegenden Erfindung abgedeckt sind, schließen zum Beispiel DHA, EPA und ARA ein. ”Mehrfach ungesättigte” Fettsäuren enthalten mehr als eine Doppelbindung, welche oftmals in einem Methylen-unterbrochenen System angeordnet sind (-CH=CH-CH₂-CH=CH-).
Fettsäuren werden hierin durch ein Nummerierungssystem beschrieben, in welchem die Zahl vor dem Doppelpunkt die Anzahl von Kohlenstoffatomen in der Fettsäure angibt. Im Fall von ungesättigten Fettsäuren steht die Zahl nach dem Doppelpunkt für die Anzahl an Doppelbindungen, welche vorhanden sind, gefolgt von einer Zahl in Klammern, welche die Position der Doppelbindungen anzeigt. Jede Zahl in Klammern steht für das niedriger nummerierte Kohlenstoffatom von den zwei, durch die Doppelbindung verbundenen Atomen. Zum Beispiel kann Ölsäure als 18:1 (9) beschrieben werden, und Linolsäure kann als 18:2 (9, 12) beschrieben werden, was 18 Kohlenstoffatome, eine Doppelbindung am Kohlenstoff 9 bzw. zwei Doppelbindungen an den Kohlenstoffen 9 und 12 anzeigt. Der Begriff ”Familie” bei der Bezugnahme auf die Protein- und Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung bedeutet beabsichtigtermaßen zwei oder mehr Proteine oder Nukleinsäuremoleküle mit einer/einem gemeinsamen strukturellen Domäne oder Motiv und mit ausreichender Aminosäure- oder Nukleotidsequenzhomologie, wie hierin definiert. Derartige Familienmitglieder können natürlich oder nicht-natürlich vorkommen und können entweder aus der gleichen oder aus unterschiedlichen Spezies stammen. Zum Beispiel kann eine Familie ein erstes Protein von menschlichem Ursprung sowie andere, unterschiedliche Proteine von menschlichem Ursprung, enthalten, oder kann, alternativ dazu, Homologe von nicht-menschlichem Ursprung, z. B. Ratten- oder Maus-Proteine, enthalten. Mitglieder einer Familie können auch gemeinsame funktionelle Merkmale aufweisen. ”Dehydratase” wird hierin austauschbar mit ”Dehydratase-Aktivität”, ”biologische Aktivität einer Dehydratase” oder ”funktionelle Aktivität einer Dehydratase” verwendet und beinhaltet eine Aktivität, welche von einem Dehydratase-Protein, -Polypeptid oder -Nukleinsäuremolekül auf eine Dehydratase-responsive Zelle oder auf ein Dehydratase-Substrat ausgeübt oder vermittelt wird, wie es gemäß Standardtechniken in vivo oder in vitro bestimmt wird. In einer Ausführungsform ist eine Dehydratase-Aktivität eine direkte Aktivität, wie etwa eine Assoziation mit einem Dehydratase-Zielmolekül. In einer anderen Ausführungsform schließt eine direkte Dehydratase-Aktivität ebenfalls die Entfernung einer 3-Hydroxyl-Gruppe und die Bildung eines 3-Enoyl-Acyl-CoA-Fettsäuremoleküls ein.
Wie hierin verwendet, ist ein ”Zielmolekül” oder ”Bindungspartner” ein Molekül, zum Beispiel ein Molekül, das an der Synthese von langkettigen mehrfach ungesättigten Fettsäuren beteiligt ist, zum Beispiel eine Zwischenstufen-Fettsäure (wie etwa eine ungesättigte Fettsäure, auf der der Einbau einer weiteren Doppelbindung gewünscht wird) oder eine gesättigte Fettsäure, mit welcher ein Dehydratase-Protein in der Natur so bindet oder wechselwirkt, dass eine Dehydratase-vermittelte Funktion erzielt wird. In besonderen Ausführungsformen kann es sich bei dem Zielmolekül oder Bindungspartner um ein Beliebiges von AA 20:4 (5, 8, 11, 14), Eicosadiensäure 20:2 (11, 14), Docosapentaensäure 22:5 (7, 10, 13, 16, 19) und Docosahexaensäure 22:6 (4, 7, 10, 13, 16, 19) handeln.
Verschiedene Aspekte der Erfindung werden in den nachfolgenden Unterabschnitten in weiteren Einzelheiten beschrieben:
I. Isolierte Nukleinsäuremoleküle
Ein Aspekt der Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche Dehydratase-Proteine oder biologisch aktive Abschnitte davon codieren. In einem anderen Aspekt richtet sich die Erfindung auf Nukleinsäurefragmente, welche zur Verwendung als Hybridisierungssonden zum Identifizieren von Dehydratase-codierenden Nukleinsäuremolekülen (z. B. Dehydratase-mRNA) ausreichend sind, sowie Fragmente zur Anwendung als PCR-Primer für die Amplifikation oder Mutation von Dehydratase-Nukleinsäuremolekülen. Der Begriff ”Nukleinsäuremolekül”, wie hierin verwendet, schließt beabsichtigterweise DNA-Moleküle (z. B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z. B. mRNA) sowie Analoge der DNA oder RNA, welche unter Verwendung von Nukleotidanalogen erzeugt werden, ein. Das Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, ist aber vorzugsweise doppelsträngige DNA.
Der Begriff ”isoliertes Nukleinsäuremolekül” schließt Nukleinsäuremoleküle ein, welche von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt sind, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure vorhanden sind. In Bezug auf genomische DNA beinhaltet der Begriff ”isoliert” zum Beispiel Nukleinsäuremoleküle, welche aus dem Chromosom, mit dem die genomische DNA in natürlicher Weise assoziiert ist, herausgetrennt sind. Vorzugsweise ist eine ”isolierte” Nukleinsäure frei von Sequenzen, welche die Nukleinsäure natürlicherweise in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure abgeleitet ist, flankieren (d. h. Sequenzen, welche an den 5'- und 3'-Enden der Nukleinsäure lokalisiert sind). Zum Beispiel kann das isolierte Dehydratase-Nukleinsäuremolekül, in verschiedenen Ausführungsformen, weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb an Nukleotidsequenzen enthalten, welche das Nukleinsäuremolekül in genomischer DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure abgeleitet ist, natürlicherweise flankieren. Außerdem kann ein ”isoliertes” Nukleinsäuremolekül, wie etwa ein cDNA-Molekül, im Wesentlichen frei von sonstigem zellulären Material oder Kulturmedium, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, sein, oder im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder sonstigen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, z. B. ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7, 9, oder ein Abschnitt davon, kann unter Anwendung von standardmäßigen Techniken der Molekularbiologie und der hierin angegebenen Sequenzinformationen isoliert werden. Unter Verwendung der Gesamtheit oder eines Abschnitts der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7, 9 als Hybridisierungssonden können Dehydratase-Nukleinsäuremoleküle mit Hilfe standardmäßiger Hybridisierungs- und Klonierungstechniken isoliert werden (z. B. wie beschrieben in Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Außerdem kann ein Nukleinsäuremolekül, das die Gesamtheit oder einen Abschnitt von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7, 9 beinhaltet, durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) isoliert werden, wobei man synthetische Oligonukleotidprimer verwendet, die basierend auf der Sequenz von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7, 9 entworfen sind.
Eine Nukleinsäure der Erfindung kann unter Verwendung von cDNA, mRNA oder genomischer DNA als Matrize und passenden Oligonukleotidprimern gemäß Standard-PCR-Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor einkloniert und durch DNA-Sequenz-Analyse charakterisiert werden. Ferner können Oligonukleotide, die den Dehydratase-Nukleotidsequenzen entsprechen, durch Standard-Synthesetechniken, z. B. mit Hilfe eines automatischen DNA-Synthesizers, hergestellt werden.
In noch einer anderen Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, das ein Komplement der in SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7, 9 gezeigten Nukleotidsequenz, oder ein Abschnitt von beliebigen dieser Nukleotidsequenzen ist. Ein Nukleinsäuremolekül, das komplementär zu der in SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7, 9 gezeigten Nukleotidsequenz ist, ist ein solches, das ausreichend komplementär zu der in SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7, 9 gezeigten Nukleotidsequenz ist, so dass es an die in SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7, 9 gezeigte Nukleotidsequenz hybridisieren kann, wodurch ein stabiler Duplex gebildet wird. In einer besonderen Ausführungsform handelt es sich bei der komplementären Sequenz der Erfindung um exakte Komplemente der Nukleinsäuremoleküle der Erfindung, zum Beispiel einer Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7, 93, einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid von SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8, 10 codiert, einer allelischen Variante davon und einer Nukleotidsequenz von mindestens 70% Identität zur Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7, 9. Zum Beispiel kann das Komplement ein vollständiges und komplettes Komplement eines Nukleinsäuremoleküls der Erfindung, zum Beispiel der Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1, sein.
In noch einer anderen Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung eine Nukleotidsequenz, die zu mindestens etwa 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% oder 60%, vorzugsweise mindestens etwa 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% oder 70%, weiter bevorzugt mindestens etwa 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, oder 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, oder 90%, oder 91%, 92%, 93%, 94%, und noch weiter bevorzugt mindestens etwa 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr zu der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7, 9 gezeigt wird, (z. B., zur gesamten Länge der Nukleotidsequenz) identisch ist, oder einen Abschnitt oder das Komplement von einer beliebigen dieser Nukleotidsequenzen. Bereiche und Identitätswerte, die zwischen den oben genannten Bereichen liegen (z. B. 70–90% identisch oder 80–95% identisch) werden von der vorliegenden Erfindung beabsichtigtermaßen ebenfalls eingeschlossen. Zum Beispiel ist beabsichtigt, dass Bereiche von Identitätswerten unter Verwendung einer Kombination von beliebigen der oben als Ober- und/oder Untergrenzen aufgeführten Werte eingeschlossen sind.
Darüber hinaus kann das Nukleinsäuremolekül der Erfindung nur einen Abschnitt der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7, 9 umfassen, zum Beispiel ein Fragment, das als Sonde oder Primer verwendet werden kann, oder ein Fragment, das einen Abschnitt eines Dehydratase-Proteins, z. B., einen biologisch aktiven Abschnitt eines Dehydratase-Proteins, codiert. Die aus der Klonierung des Dehydratase-Gens ermittelte Nukleotidsequenz gestattet die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Anwendung in der Identifizierung und/oder Klonierung anderer Vertreter der Dehydratase-Familie sowie von Dehydratase-Homologen aus anderen Spezies entworfen werden. Der Sonde/Primer (z. B. Oligonukleotid) umfasst typischerweise im Wesentlichen gereinigtes Oligonukleotid. Das Oligonukleotid umfasst in der Regel eine Region einer Nukleotidsequenz, welche unter stringenten Bedingungen an mindestens etwa 12 oder 15, vorzugsweise etwa 20 oder 25, weiter bevorzugt etwa 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide einer Sense-Sequenz von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7, 9, einer Antisense-Sequenz von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7, 9, oder einer natürlich vorkommenden allelischen Variante oder Mutante von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7, 9 hybridisiert.
Beispielhafte Sonden oder Primer sind mindestens (oder nicht mehr als) 12 oder 15, 20 oder 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 oder mehr Nukleotide lang und/oder umfassen aufeinanderfolgende Nukleotide eines hierin beschriebenen isolierten Nukleinsäuremoleküls. Ebenfalls innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung enthalten sind Sonden oder Primer, umfassend aneinandergrenzende oder aufeinanderfolgende Nukleotide eines hierin beschriebenen isolierten Nukleinsäuremoleküls, jedoch mit dem Unterschied von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Basen innerhalb der Sonden- oder Primersequenz. Sonden, die auf den Dehydratase-Nukleotidsequenzen basieren, können zum Nachweisen (z. B. spezifischen Nachweisen) von Transkripten oder genomischen Sequenzen, welche dieselben, oder homologe Proteine, codieren, verwendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Sonde ferner eine daran angeheftete Markierungsgruppe, wobei die Markierungsgruppe z. B. ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder ein Enzym-Cofaktor sein kann. In einer anderen Ausführungsform wird ein Satz von Primern bereitgestellt, z. B. Primer, die zur Verwendung in einer PCR geeignet sind, welche angewandt werden kann, um eine ausgewählte Region einer Dehydratasesequenz, z. B. eine Domäne, Region, Stelle oder sonstige hierin beschriebene Sequenz, zu amplifizieren. Die Primer sollten mindestens 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Basenpaare lang sein und weniger als 100, oder weniger als 200, Basenpaare Länge aufweisen. Die Primer sollten identisch sein, oder um nicht mehr als 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Basen abweichen, wenn sie mit einer hierin offenbarten Sequenz oder der Sequenz einer natürlich vorkommenden Variante verglichen werden. Derartige Sonden können als Teil eines diagnostischen Testkits zum Identifizieren von Zellen oder Gewebe, welche ein Dehydratase-Protein fehlexprimieren, verwendet werden, wie etwa durch Messen eines Spiegels einer Dehydratase-codierenden Nukleinsäure in einer Probe von Zellen aus einem Subjekt, z. B. Nachweisen von Dehydratase-mRNA-Spiegeln, oder Bestimmen, ob ein genomisches Dehydratasegen mutiert oder deletiert worden ist.
Ein Nukleinsäurefragment, das einen ”biologisch aktiven Abschnitt eines Dehydratase-Proteins” codiert, kann durch Isolieren eines Abschnitts der Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7, 9, welcher ein Polypeptid mit einer biologischen Dehydratase-Aktivität codiert (die biologischen Aktivitäten der Dehydratase-Proteine sind hierin beschrieben), Exprimieren des codierten Abschnitts des Dehydratase-Proteins (z. B. durch rekombinante Expression in vitro) und Nachprüfen der Aktivität des codierten Abschnitts des Dehydratase-Proteins hergestellt werden. In einer exemplarischen Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül mindestens 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 1000, 1250, 1300, 1350 oder 1400 oder mehr Nukleotide lang und codiert ein Protein mit einer Dehydratase-Aktivität (wie hierin beschrieben).
Die Erfindung beinhaltet weiterhin Nukleinsäuremoleküle, die von der in SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7, 9 gezeigten Nukleotidsequenz wegen der Degeneriertheit des genetischen Codes abweichen und daher die gleichen Dehydratase-Protein codieren, wie diejenigen, die von der in SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7, 9 gezeigten Nukleotidsequenz codiert werden. In einer anderen Ausführungsform besitzt ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung eine Nukleotidsequenz, die ein Protein mit einer Aminosäuresequenz codiert, welche um mindestens 1, aber nicht mehr als 5, 10, 20, 50 oder 100 Aminosäurereste von der in SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 gezeigten Aminosäuresequenz abweicht. In noch einer anderen Ausführungsform codiert das Nukleinsäuremolekül die Aminosäuresequenz von humaner Dehydratase. Wenn ein Alignment für diesen Vergleich benötigt wird, sollten die Sequenzen hinsichtlich maximaler Homologie aligniert werden.
Nukleinsäurevarianten können in natürlicher Weise vorkommen, wie etwa allelische Varianten (gleicher Genort), Homologe (unterschiedlicher Genort) und Orthologe (unterschiedlicher Organismus), oder können nicht-natürlich vorkommen. Nicht-natürlich vorkommende Varianten können durch Mutagenesetechniken hergestellt werden, einschließlich jenen, die auf Polynukleotide, Zellen oder Organismen angewandt werden. Die Varianten können Nukleotid-Substitutionen, -Deletionen, -Inversionen und -Insertionen enthalten. Die Variation kann in einem oder beiden von codierenden als auch nicht-codierenden Regionen auftreten. Die Variationen können sowohl konservative als auch nicht-konservative Aminosäuresubstitutionen hervorrufen (wie in dem codierten Produkt verglichen wird).
Allelische Varianten resultieren zum Beispiel aus DNA-Sequenzpolymorphismen innerhalb einer Population (z. B. der menschlichen Population), welche zu Veränderungen in den Aminosäuresequenzen der Dehydratase-Proteine führen. Derartige genetische Polymorphismen in den Dehydratase-Genen können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund der natürlichen allelischen Variation existieren.
Wie hierin verwendet bezeichnen die Begriffe ”Gen” und ”rekombinantes Gen” Nukleinsäuremoleküle, welche einen offenen Leserahmen, der ein Dehydratase-Protein, z. B. Ölsamen-Dehydratase-Protein, codiert, einschließen und ferner nicht-codierende regulatorische Sequenzen und Introns einschließen können.
Folglich betrifft die Erfindung, in einer Ausführungsform, isolierte Nukleinsäuremoleküle, die eine natürlich vorkommende allelische Variante eines Polypeptids codieren, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 umfasst. Außerdem kann das Nukleinsäuremolekül an ein Komplement eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7, 9, zum Beispiel unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren.
Zusätzlich zu der B. napus- und E. gracilis-%Fettsäure-Dehydratase von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7, 9, wird es der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen, dass DNA-Sequenzpolymorphismen, welche zu Veränderungen in den Aminosäuresequenzen von Dehydratase-Proteinen führen, innerhalb einer Population (z. B. der B. napus- und E. gracilis-Population) existieren können. Solche genetischen Polymorphismen im Fettsäuredehydratase-Gen können aufgrund der natürlichen Variation zwischen Individuen innerhalb einer Population existieren. Derartige natürlichen Variationen können typischerweise zu einer Varianz von 1–5% hinsichtlich der Nukleotidsequenz des Dehydratase-Gens führen. Allelische Varianten der BN-7-, BN-G6-, EG-S6-, EG-FF4- und EG-L3-Dehydratase schließen sowohl funktionelle als auch nicht-funktionelle Dehydratase-Proteine ein. Funktionelle allelische Varianten sind natürlich vorkommende Aminosäuresequenzvarianten des Dehydratase-Proteins, das die Fähigkeit behält, zum Beispiel (i) mit einem Dehydratase-Substrat oder -Zielmolekül (zum Beispiel einer Fettsäure, wie etwa einer Zwischenstufen-Fettsäure) wechselzuwirken; und/oder (ii) eine Hydroxylgruppe im Dehydratase-Substrat oder -Zielmolekül zu entfernen. Funktionelle allelische Varianten werden typischerweise lediglich eine konservative Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren von SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10, oder eine Substitution, Deletion oder Insertion von nicht-kritischen Resten in nicht-kritischen Regionen des Proteins enthalten.
Nicht-funktionelle allelische Varianten sind natürlich vorkommende Aminosäuresequenzvarianten des Dehydratase-Proteins, z. B., BN-7-, BN-G6-, EG-S6-, EG-FF4-und EG-L3-Dehydratase, welche nicht die Fähigkeit aufweisen, z. B. (i) mit einem Dehydratase-Substrat oder -Zielmolekül (z. B. einer Zwischenstufen-Fettsäure) wechselzuwirken; und/oder (ii) eine Hydroxylgruppe im Dehydratase-Substrat oder -Zielmolekül zu entfernen. Nicht-funktionelle allelische Varianten werden typischerweise eine nicht-konservative Substitution, eine Deletion oder Insertion oder eine vorzeitige Verkürzung der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10, oder eine Substitution, Insertion oder Deletion in kritischen Resten oder kritischen Regionen des Proteins enthalten.
Die vorliegende Erfindung sieht ferner Orthologe (z. B. humane Orthologe des Dehydratase-Proteins) vor. Orthologe der B. napus- und E. gracilis-Dehydratase-Proteine sind Proteine, die aus anderen Organismen isoliert werden und die Dehydratase-Substrat- oder Zielmolekül-Bindungsmechanismen, Mechanismen zur Hydroxyentfernung, Mechanismen zur Modulation von Wachstum und Entwicklung des Gehirns in Kleinkindern, Mechanismen zur Aufrechterhaltung der normalen Gehirnfunktion in Erwachsenen, Fähigkeit zur Beeinflußung der am Signaltransduktionsvorgang beteiligten Photorezeptorfunktion, Fähigkeit zur Beeinflußung der Rhodopsin-Aktivierung, Entwicklungsmechanismen von Stäbchen und/oder Zäpfchen, und/oder Mechanismen zur Modulation von zellulärem Wachstum und/oder Proliferation von den nicht-humanen Dehydratase-Proteinen in gleicher Weise besitzen. Orthologe der B. napus- und E. gracilis-Dehydratase-Proteine können leicht identifiziert werden, zumal sie eine Aminosäuresequenz umfassen, die im Wesentlichen homolog zu SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 ist.
Ferner liegen Nukleinsäuremoleküle, die andere Dehydratase-Familienvertreter codieren und, die somit eine Nukleotidsequenz aufweisen, welche sich von den Dehydratase-Sequenzen von SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 unterscheidet, beabsichtigerweise innerhalb der Umfangs der Erfindung. Zum Beispiel kann eine andere DehydratasecDNA basierend auf der Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 BN-7, BN-G6, EG-S6, EG-FF4 oder EG-L3 identifiziert werden. Außerdem liegen Nukleinsäuremoleküle, die Dehydratase-Proteine aus verschiedenen Spezies codieren und, daher, eine Nukleotidsequenz aufweisen, welche von den Dehydratasesequenzen von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7, 9 abweicht, beabsichtigerweise innerhalb des Umfangs der Erfindung. DehydrataseBN-7, BN-G6, EG-S6, EG-FF4 oder EG-L3
Nukleinsäuremoleküle, welche natürlichen allelischen Varianten und Homologen der Dehydratase-cDNAs der Erfindung entsprechen, können basierend auf ihrer Homologie zu den hierin offenbarten Dehydratase-Nukleinsäuren unter Verwendung der hierin offenbarten cDNAs, oder eines Abschnitts davon, als Hybridisierungssonde gemäß standardmäßigen Hybridisierungstechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden.
Orthologe, Homologe und allelische Varianten können unter Anwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren (z. B. durch Hybridisierung an ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, zum Beispiel unter stringenten Hybridisierungsbedingungen) identifiziert werden. In einer Ausführungsform weist ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung mindestens 15, 20, 25, 30 oder mehr Nukleotide Länge auf und hybridisiert unter stringenten Bedingungen an das Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 umfasst. In einer anderen Ausführungsform weist die Nukleinsäure eine Länge von mindestens 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 1000, 1250, 1300, 1350 oder 1400 oder mehr Nukleotiden auf.
Wie hierin verwendet, soll der Begriff ”hybridisiert unter stringenten Bedingungen” Bedingungen für das Hybridisieren und Waschen beschreiben, unter denen Nukleotidsequenzen, die signifikant identisch oder homolog zueinander sind, aneinander hybridisiert bleiben. Vorzugsweise sind die Bedingungen derartig, dass Sequenzen, die mindestens etwa 70%, weiter bevorzugt mindestens etwa 80%, noch weiter bevorzugt mindestens etwa 85% oder 90% identisch zueinander sind, aneinander hybridisiert bleiben. Solche stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und lassen sich in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg., John Wiley & Sons, Inc. (1995), Abschnitte 2, 4, und 6, nachschlagen. Weitere stringente Bedingungen können in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), Kapitel 7, 9 und 11, gefunden werden. Ein bevorzugtes nicht-einschränkendes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen schließt die Hybridisierung in 4 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei etwa 65–70°C (oder alternativ Hybridisierung in 4 × SSC plus 50% Formamid bei etwa 42–50°C), gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 1 × SSC bei etwa 65–70°C, ein. Ein bevorzugtes nicht-einschränkendes Beispiel für hochstringente Hybridisierungsbedingungen schließt die Hybridisierung in 1 × SSC, bei etwa 65–70°C (oder, alternativ, Hybridisierung in 1 × SSC plus 50% Formamid bei etwa 42–50°C), gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,3 × SSC bei etwa 65–70°C, ein. Ein bevorzugtes nichteinschränkendes Beispiel von Hybridisierungsbedingungen mit verringerter Stringenz schließt die Hybridisierung 4 × SSC, bei etwa 50–60°C (oder, alternativ, Hybridisierung in 6 × SSC plus 50% Formamid bei etwa 40–45°C), gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 2 × SSC bei etwa 50–60°C, ein. Bereiche zwischen den oben genannten Werten, z. B., bei 65–70°C oder bei 42–50°C, werden beabsichtigtermaßen ebenfalls von der vorliegenden Erfindung abgedeckt. SSPE (1 × SSPE ist 0,15 M NaCl, 10 mM NaH₂PO₄ und 1,25 mM EDTA, pH 7,4) kann für SSC (1 × SSC ist 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat) in den Hybridisierungs- und Waschpuffern substituiert werden; Waschschritte werden je 15 Minuten lang durchgeführt, nachdem die Hybridisierung abgeschlossen ist. Die Hybridisierungstemperatur für Hybride, die voraussichtlich weniger als 50 Basenpaare lang sind, sollte 5–10°C niedriger als die Schmelztemperatur (T_m) des Hybrids sein, wobei die T_m gemäß den folgenden Gleichungen bestimmt wird. Für Hybride mit einer Länge von weniger als 18 Basenpaaren, T_m(°C) = 2(Anzahl der A + T-Basen) + 4(Anzahl der G + C-Basen). Für Hybride mit einer Länge zwischen 18 und 49 Basenpaaren, T_m(°C) = 81,5 + 16,6(log₁₀[Na⁺]) + 0,41(%G + C) – (600/N), wobei N für die Anzahl an Basen in dem Hybrid steht, und [Na⁺] die Konzentration an Natriumionen im Hybridisierungspuffer ist ([Na⁺] für 1 × SSC = 0,165 M). Der Fachmann wird des Weiteren erkennen, dass den Hybridisierungs- und/oder Waschpuffern zusätzliche Reagentien zugegeben werden können, um die nicht-spezifische Hybridisierung von Nukleinsäuremolekülen an Membranen, zum Beispiel Nitrozellulose- oder Nylonmembranen, zu verringern, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Blockiermittel (z. B., BSA oder Lachs- oder Heringssperma-Träger-DNA), Detergentien (z. B., SDS), Chelatbildnermittel (z. B., EDTA), Ficoll, PVP und dergleichen. Insbesondere bei Verwendung von Nylonmembranen handelt es sich bei einem weiteren bevorzugten, nicht-einschränkenden Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen um Hybridisierung in 0,25–0,5 M NaH₂PO₄, 7% SDS bei etwa 65°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten bei 0,02 M NaH₂PO₄, 1% SDS bei 65°C (siehe z. B. Church und Gilbert (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1991–1995), oder alternativ dazu 0,2 × SSC, 1% SDS.
Vorzugsweise entspricht ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung, das unter stringenten Bedingungen an die Sequenz von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 hybridisiert, einem natürlich-vorkommenden Nukleinsäuremolekül. Ein ”natürlich-vorkommendes” Nukleinsäuremolekül, wie hieirn verwendet, bezeichnet ein RNA- oder DNA-Molekül mit einer Nukleotidsequenz, die in der Natur vorkommt (z. B. ein natürliches Protein codiert).
Der Fachmann weiß es ferner richtig einzuschätzen, dass zusätzlich zu natürlich vorkommenden allelischen Varianten der Dehydratase-Sequenzen, die in der Population vorkommen können, Änderungen durch Mutation in den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 eingebracht werden können, wobei es zu Änderungen in der Aminosäuresequenz der codierten Dehydratase-Proteine kommt, ohne dass das Funktionsvermögen der Dehydratase-Proteine verändert wird. Zum Beispiel können Nukleotidsubstitutionen, die zu Aminosäuresubstitutionen an ”nicht-essentiellen” Aminosäureresten führen, in der Sequenz von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 vorgenommen werden. Ein ”nicht-essentieller” Aminosäurerest ist ein Rest, der von der Wildtypsequenz von BN-7, BN-G6, EG-S6, EG-FF4 oder EG-L3, z. B. der Sequenz von SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10, abgeändert werden kann, ohne dass die biologische Aktivität verändert wird, wohingegen ein ”essentieller” Aminosäurerest für die biologische Aktivität erforderlich ist. Zum Beispiel wird von Aminosäureresten, die zwischen den Dehydratase-Proteinen der vorliegenden Erfindung konserviert sind, z. B. jenen, die in einem Häm-Bindungsmotiv oder einem Histidin-Motiv vorhanden sind, vorhergesagt, für eine Veränderung besonders unempfänglich bzw. unzugänglich zu sein. Darüber hinaus ist es bei weiteren Aminosäureresten, die zwischen den Dehydratase-Proteinen der vorliegenden Erfindung und anderen Vertretern der Fettsäure-Dehydratase-Familie konserviert sind, nicht wahrscheinlich, dass sie einer Veränderung zugänglich sind.
Folglich betrifft ein weiterer Aspekt der Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die Dehydratase-Proteine codieren, welche Änderungen in Aminosäureresten enthalten, die für die Aktivität nicht essentiell sind. Solche Dehydratase-Proteine unterscheiden sich hinsichtlich der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10, aber behalten die biologische Aktivität bei. In einer Ausführungsform umfasst das isolierte Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die ein Protein codiert, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens etwa 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% oder 60%, vorzugsweise mindestens etwa 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% oder 70%, weiter bevorzugt mindestens etwa 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, oder 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, oder 90% oder 91%, 92%, 93%, 94%, und noch weiter bevorzugt mindestens etwa 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr zu SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10, z. B. zur gesamten Länge von SEQ ID NR: 2 oder 4, identisch ist.
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend ein Dehydratase-Protein, das zu dem Protein von SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 homolog ist, kann durch Einführen einer oder mehrerer Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen in die Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 erzeugt werden, so dass eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen in das codierte Protein eingebracht werden. Mutationen können durch Standardtechniken, wie ortsgerichtete Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese, in SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 eingeführt werden. Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einem oder mehreren vorhergesagten nicht-essentiellen Aminosäureresten vorgenommen. Eine ”konservative Aminosäuresubstitution” ist eine solche, bei der der Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ersetzt wird. Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten sind im Fachgebiet definiert worden. Zu diesen Familien gehören Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z. B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z. B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein, Tryptophan), nichtpolaren Seitenketten (z. B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin), beta-verzweigten Seitenketten (z. B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z. B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin). So wird ein vorbestimmter, nicht-essentieller Aminosäurerest in einem Dehydratase-Protein vorzugsweise mit einem anderen Aminosäurerest aus der gleichen Seitenkettenfamile ersetzt. Alternativ dazu können, in einer anderen Ausführungsform, Mutationen statistisch entlang der Gesamtheit oder eines Teils einer Dehydratase codierenden Sequenz eingeführt werden, wie etwa durch Sättigungsmutagenese, und die resultierenden Mutanten können hinsichtlich biologischer Dehydratase-Aktivität gescreent werden, um Mutanten zu identifizieren, die Aktivität beibehalten. Im Anschluss an die Mutagenese von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9, kann das codierte Protein rekombinant exprimiert werden, und man kann die Aktivität des Proteins bestimmen.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein Mutanten-Dehydratase-Protein hinsichtlich der Fähigkeit geassayt werden, (i) mit einem Dehydratase-Substrat oder Zielmolekül (z. B. einer Zwischenstufen-Fettsäure) zu interagieren; und/oder (ii) eine Doppelbindung zwischen Kohlenstoffatomen in einem Dehydratase-Substrat oder Zielmolekül zu bilden.
II. Isolierte Dehydratase-Proteine
Ein Aspekt der Erfindung betrifft isolierte oder rekombinante Dehydratase-Proteine und -Polypeptide, sowie biologisch aktive Abschnitte derselben. In einer Ausführungsform können native Dehydratase-Proteine aus Zellen oder Gewebequellen durch ein entsprechendes Reinigungsschema mithilfe von standardmäßigen Proteinreinigungstechniken isoliert werden. In einer anderen Ausführungsform werden Dehydratase-Proteine durch rekombinante-DNA-Techniken hergestellt. Alternativ zur rekombinanten Expression kann ein Dehydratase-Protein oder -Polypeptid unter Anwendung standardmäßiger Peptidsynthesetechniken chemisch synthetisiert werden.
Ein ”isoliertes” oder ”gereinigtes” Protein, oder ein biologisch aktiver Abschnitt desselben, ist im Wesentlichen frei von zellulärem Material oder anderen kontaminierenden Proteinen aus der Zelle oder Gewebequelle, aus der das Dehydratase-Protein abgeleitet ist, oder im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wurde. Der Ausdruck ”im Wesentlichen frei von zellulärem Material” beinhaltet Präparationen von Dehydratase-Protein, in welchen das Protein von zellulären Komponenten der Zellen, aus denen es isoliert oder rekombinant produziert wurde, getrennt ist. In einer Ausführungsform beinhaltet der Ausdruck ”im Wesentlichen frei von zellulärem Material” Präparate von Dehydratase-Protein mit weniger als etwa 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, oder 30% (bezogen auf das Trockengewicht) Nicht-Dehydratase-Protein (hierin ebenfalls bezeichnet als ein ”kontaminierendes Protein”), weiter bevorzugt weniger als etwa 20% Nicht-Dehydratase-Protein, noch weiter bevorzugt weniger als etwa 10% Nicht-Dehydratase-Protein, und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 5% Nicht-Dehydratase-Protein. Wenn das Dehydratase-Protein oder ein biologisch aktiver Abschnitt desselben rekombinant hergestellt wird, ist es vorzugsweise ebenfalls im Wesentlichen frei von Kulturmedium, d. h. Kulturmedium repräsentiert weniger als etwa 20%, weiter bevorzugt weniger als etwa 10%, und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 5% des Volumens der Proteinpräparation.
Der Ausdruck ”im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien” beinhaltet Präparationen von Dehydratase-Protein, in denen das Protein von chemischen Vorläufern oder sonstigen Chemikalien, welche an der Synthese des Proteins beteiligt sind, getrennt ist. In einer Ausführungsform beinhaltet der Ausdruck ”im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien” Präparationen von Dehydratase-Protein mit weniger als etwa 30% (bezogen auf Trockengewicht) chemischen Vorläufern oder Nicht-Dehydratase-Chemikalien, weiter bevorzugt weniger als etwa 20% chemischen Vorläufern oder Nicht-Dehydratase-Chemikalien, noch weiter bevorzugt weniger als etwa 10% chemischen Vorläufern oder Nicht-Dehydratase-Chemikalien, und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 5% chemischen Vorläufern oder Nicht-Dehydratase-Chemikalien. Es versteht sich, dass die Proteine dieser Erfindung ebenfalls in einer Form vorliegen können, welche unterschiedlich zu ihren entsprechenden, natürlich vorkommenden Proteinen ist, und/oder welche noch in Assoziation mit wenigstens einigen zellulären Komponenten vorliegt. Zum Beispiel kann das Protein mit einer zellulären Membran assoziiert sein.
Wie hierin verwendet, beinhaltet ein ”biologisch aktiver Abschnitt” eines Dehydratase-Proteins ein Fragment eines Dehydratase-Proteins, das an einer Wechselwirkung zwischen einem Dehydratase-Molekül und einem Nicht-Dehydratase-Molekül (z. B. einem Dehydratase-Substrat, wie Fettsäure) teilnimmt. Zu biologisch aktiven Abschnitten eines Dehydratase-Proteins zählen Peptide, umfassend Aminosäuresequenzen, die zu den Dehydratase-Aminosäuresequenzen, z. B. den in SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 gezeigten Aminosäuresequenzen, ausreichend homolog oder davon abgeleitet sind, welche genügend Aminosäurereste einschließen, um mindestens eine Aktivität eines Dehydratase-Proteins aufzuzeigen. Typischerweise umfassen biologisch aktive Abschnitte eine Domäne oder ein Motiv mit mindestens einer Aktivität des Dehydratase-Proteins, zum Beispiel der Fähigkeit (i) mit einem Dehydratase-Substrat oder -Zielmolekül wechselzuwirken (z. B. einer Fettsäure, wie etwa einer gesättigten Fettsäure und einer Zwischenstufen-Fettsäure) und/oder (ii) eine Doppelbindung zwischen Kohlenstoffatomen in einem Dehydratase-Substrat oder -Zielmolekül zu bilden. Ein biologisch aktiver Abschnitt eines Dehydratase-Proteins kann ein Polypeptid sein, welches zum Beispiel 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400 oder 450 oder mehr Aminosäuren lang ist.
In einer Ausführungsform umfasst ein biologisch aktiver Abschnitt eines Dehydratase-Proteins eine Domäne, welche zwischen Dehydratasen konserviert ist und welche bekanntermaßen an einer Dehydratase-Aktivität teilnimmt. Zum Beispiel kann mindestens eine Domäne oder ein Motiv, das unter den BN-7-, BN-G6-, EG-S6-, EG-FF4- oder EG-L3BN-7 BN-G6-, EG-S6-, EG-FF4- und EG-L3-Aminosäuresequenzen konserviert ist, innerhalb der biologisch aktiven Fragmente eingebunden sein, um Dehydratase-Aktivität zu bewahren. Alternativ dazu kann mindestens eine Domäne oder ein Motiv, die/das unter den Fettsäure-Dehydratasen aus verschiedenen Organismen konserviert ist, wie abgebildet in der 3, innerhalb der biologisch aktiven Fragmente eingebunden sein, um Dehydratase-Aktivität zu bewahren.
In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt ein Dehydratase-Protein eine in SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 gezeigte Aminosäuresequenz. In anderen Ausführungsformen ist das Dehydratase-Protein im Wesentlichen identisch zu SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 und behält die funktionelle Aktivität des Proteins von SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 bei, aber unterscheidet sich in der Aminosäuresequenz aufgrund natürlicher allelischer Variation oder Mutagenese, wie im oben stehenden Unterkapitel I ausführlich beschrieben. In einer anderen Ausführungsform ist das Dehydratase-Protein ein Protein, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens etwa 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% oder 60%, vorzugsweise mindestens etwa 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% oder 70%, weiter bevorzugt mindestens etwa 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, oder 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90% oder 91%, 92%, 93%, 94%, und noch weiter bevorzugt mindestens etwa 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr identisch zu SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 ist.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Dehydratase-Protein, das von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, bestehend aus einer Nukleotidsequenz, die mindestens etwa 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, oder 60%, vorzugsweise mindestens etwa 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, oder 70%, weiter bevorzugt mindestens etwa 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, oder 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, oder 90%, oder 91%, 92%, 93%, 94%, und noch weiter bevorzugt mindestens etwa 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr identisch zu einer Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9, oder einem Komplement davon, ist. Diese Erfindung betrifft ferner ein Dehydratase-Protein, das von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, bestehend aus einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an ein Komplement eines Nukleinsäuremoleküls hybridisiert, das die Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9, oder ein Komplement davon, umfasst.
Zur Bestimmung der prozentualen Identität von zwei Aminosäuresequenzen oder zwei Nukleinsäuresequenzen, werden die Sequenzen für Zwecke des optimalen Vergleichens aligniert (z. B. können Lücken in eine oder beide von einer ersten und einer zweiten Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenz für ein optimales Alignment eingeführt werden, und nicht-homologe Sequenzen können für Vergleichszwecke außer Acht gelassen werden). Der Vergleich von Sequenzen und die Bestimmung der prozentualen Identität zwischen zwei Sequenzen können mit Hilfe eines mathematischen Algorithmus durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäuresequenzen unter Verwendung des Algorithmus von Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444–453 (1970)) bestimmt, der in das GAP-Programm im GCG-Software-Paket (verfügbar unter http://www.gcg.com) eingebunden worden ist, wobei entweder eine Blossum 62-Matrix oder eine PAM250-Matrix und eine Lücken-Wichtung von 16, 14, 12, 10, 8, 6 oder 4 und eine Längen-Wichtung von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 angewandt werden. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die prozentuale Identität zwischen zwei Nukleotidsequenzen mit Hilfe des GAP-Programms im GCG-Software-Paket (verfügbar unter http://www.gcg.com) bestimmt, wobei eine NWSgapdna.CMP-Matrix und eine Lücken-Wichtung von 40, 50, 60, 70 oder 80 und eine Längen-Wichtung von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 angewandt werden. Ein bevorzugtes nicht-einschränkendes Beispiel von Parametern, die im Verbund mit dem GAP-Programn zu verwenden sind, schließen eine Blosum 62-Wertungsmatrix mit einem Lückenstrafwert von 12, einem Lückenerweiterungs-Strafwert von 4, und einem Rasterschub-Lückenstrafwert von 5 ein.
In einer anderen Ausführungsform wird die prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäure- oder Nukleotidsequenzen unter Verwendung des Algorithmus von Meyers und Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11–17 (1988)) bestimmt, der in das ALIGN-Programm (Version 2.0 oder Version 2.0U) eingebunden worden ist, wobei eine PAM120-Wichtungs-Restetabelle, ein Lückenlängenstrafwert von 12 und ein Lückenstrafwert von 4 angewandt werden.
Die Nukleinsäure- und Proteinsequenzen der vorliegenden Erfindung können ferner als eine ”Suchsequenz” verwendet werden, um eine Suche gegen öffentliche Datenbanken durchzuführen, um beispielsweise andere Familienvertreter oder verwandte Sequenzen zu identifizieren. Derartige Suchen können unter Verwendung der Programme NBLAST und XBLAST (Version 2.0) von Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–10, durchgeführt werden. BLAST-Nukleotid-Suchen können mit dem Programm NBLAST, Punktwert = 100, Wortlänge = 12, durchgeführt werden, um zu Dehydratase-Nukleinsäuremolekülen der Erfindung homologe Nukleotidsequenzen zu erhalten.
BLAST-Protein Suchen können mit dem Programm XBLAST, Punktwert = 50, Wortlänge = 3, durchgeführt werden, um zu Dehydratase-Proteinmolekülen der Erfindung homologe Aminosäuresequenzen zu erhalten. Zum Erstellung von lückenhaltigen Alignments zu Vergleichszwecken kann ”Gapped BLAST” eingesetzt werden, wie in Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389–3402, beschrieben. Bei Verwendung der Programme BLAST und Gapped BLAST können die Standardparameter der jeweiligen Programme (z. B. XBLAST und NBLAST) benutzt werden; siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
III. Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren
Die vorliegende Erfindung sieht neue und verbesserte Verfahren zur Herstellung langkettiger ungesättigter Fettsäuren, z. B., langkettiger mehrfach ungesättigter Fettsäuren (LCPUFA' s) und ungesättigter Fettsäuren, wie AA 20:4 (5, 8, 11, 14), EPA 20:5 (5, 8, 11, 14, 17), DPA 22:5 (4, 7, 10, 13, 16), DHA 22:6 (4, 7, 10, 13, 16, 19), vor.
A. Rekombinante Zellen und Verfahren zur Kultivierung von Zellen
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner rekombinante Vektoren, welche Nukleinsäuresequenzen einschließen, welche die Genprodukte, wie hierin beschrieben, vorzugsweise BN-7-, BN-G6-, EG-S6-, EG-FF4- und EG-L3-Genprodukte, codieren. Der Begriff rekombinanter Vektor beinhaltet einen Vektor (z. B. Plasmid), der so verändert, modifiziert oder manipuliert worden ist, dass er größere, weniger oder andere Nukleinsäuresequenzen als diejenigen, die im nativen Vektor oder Plasmid eingeschlossen sind, enthält. In einer Ausführungsform schließt ein rekombinanter Vektor die, mindestens ein Fettsäuredehydratase-Enzym codierende, Nukleinsäuresequenz, funktionsfähig verknüpft an regulatorische Sequenzen, ein. Der Ausdruck” funktionsfähig verknüpft an regulatorische Sequenz(en)” bedeutet, dass die Nukleotidsequenz von Interesse an die regulatorischen Sequenz(en) in einer Weise gebunden ist, welche eine Expression (z. B., gesteigerte, erhöhte, konstitutive, basale, abgeschwächte, verringerte oder unterdrückte Expression) der Nukleotidsequenz, vorzugsweise die Expression eines durch die Nukleotidsequenz codierten Genprodukts (z. B., wenn der rekombinante Vektor in eine Zelle eingebracht wird) gestattet. Exemplarische Vektoren sind in weiteren Einzelheiten hierin beschrieben, sowie zum Beispiel in Frascotti et al, U.S.-Pat. Nr. 5 721 137 , dessen Inhalt hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist.
Der Begriff ”regulatorische Sequenz” schließt Nukleinsäuresequenzen ein, welche die Expression von anderen (nicht-regulatorischen) Nukleinsäuresequenzen beeinflußen (z. B. modulieren oder regulieren). In einer Ausführungsform ist eine regulatorische Sequenz in einem rekombinanten Vektor in einer ähnlichen oder identischen Position und/oder Orientierung bezüglich eines betreffenden Gens von Interesse enthalten, wie dies für die regulatorische Sequenz und das Gen von Interesse beobachtet wird, wie sie/es in der Natur auftritt, z. B. in einer nativen Position und/oder Orientierung. Zum Beispiel kann ein Gen von Interesse (z. B. ein BN-7-, BN-G6-, EG-S6-, EG-FF4- oder EG-L3-Gen) in einem rekombinanten Vektor in funktionsfähiger Verknüpfung mit einer regulatorischen Sequenz enthalten sein, welche das Gen in dem natürlichen Organismus begleitet oder daran angrenzt (z. B. funktionsfähig verknüpft mit ”nativer” BN-7, BN-G6, EG-S6, EG-FF4 oder EG-L3 regulatorischer Sequenz, z. B. mit dem ”nativen” BN-7-, BN-G6-, EG-S6-, EG-FF4- oder EG-L3-Promotor). Alternativ kann ein Gen von Interesse (z. B. ein BN-7-, BN-G6-, EG-S6-, EG-FF4- oder EG-L3-Gen) in einem rekombinanten Vektor in funktionsfähiger Verknüpfung an eine regulatorische Sequenz enthalten sein, welche ein anderes (z. B. unterschiedliches) Gen in dem natürlichen Organismus begleitet oder daran angrenzt. Zum Beispiel kann ein BN-7-, BN-G6-, EG-S6-, EG-FF4- oder EG-L3-Gen in einem Vektor in funktionsfähiger Verknüpfung an Nicht-BN-7, -BN-G6, -EG-S6, -EG-FF4 oder -EG-L3 regulatorische Sequenzen enthalten sein. Alternativ dazu kann ein Gen von Interesse (z. B. ein BN-7-, BN-G6-, EG-S6-, EG-FF4- oder EG-L3-Gen) in einem Vektor in funktionsfähiger Verknüpfung an eine regulatorische Sequenz aus einem anderen Organismus enthalten sein. Zum Beispiel können regulatorische Sequenzen aus anderen Mikroben (z. B. andere bakterielle regulatorische Sequenzen, Bakteriophagen-regulatorische Sequenzen und dergleichen) funktionsfähig an ein bestimmtes Gen von Interesse gebunden sein.
Bevorzugte regulatorische Sequenzen schließen Promotoren, Enhancer, Terminationssignale und andere Expressions-Steuerelemente (z. B. Bindungsstellen für transkriptionale und/oder translationale regulatorische Proteine, zum Beispiel, in der transkribierten mRNA) ein. Solche regulatorischen Sequenzen sind zum Beispiel, in Sambrook, J., Fritsh, E. F., und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, beschrieben. Regulatorische Sequenzen schließen diejenigen, welche die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in einer Zelle lenken (z. B. konstitutive Promotoren und starke konstitutive Promotoren), diejenigen, welche die induzierbare Expression einer Nukleotidsequenz in einer Zelle lenken (z. B. induzierbare Promotoren, zum Beispiel, Xylose-induzierbare Promotoren) und diejenigen, welche die Expression einer Nukleotidsequenz in einer Zelle abschwächen oder unterdrücken (z. B. Attenuations-Signale oder Repressorsequenzen), ein. Es liegt ebenfalls innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, die Expression eines Gens von Interesse durch Entfernen oder Deletieren von regulatorischen Sequenzen zu regeln. Zum Beispiel können an der Negativ-Regulation der Transkription beteiligte Sequenzen entfernt werden, so dass die Expression eines Gens von Interesse gesteigert wird.
In einer Ausführungsform schließt ein rekombinanter Vektor der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuresequenzen ein, welche mindestens ein Genprodukt (z. B., BN-7, BN-G6, EG-S6, EG-FF4 oder EG-L3) codieren, die funktionsfähig an einen Promotor oder eine Promotorsequenz gebunden sind.
In einer bestimmten Ausführungsform werden Samen-spezifische Promotoren verwendet, um die Herstellung der gewünschten ungesättigten Fettsäure zu steigern. Zum Beispiel beschreibt die am 21. August 2003 veröffentlichte U.S.-Patentveröffentlichung Nr. 2003-0159174 , deren gesamter Inhalt hiermit ausdrücklich durch den Bezug darauf hierin einbezogen ist, die Verwendung von bestimmten Samen-spezifischen Promotoren, einschließlich zum Beispiel Conlinin, Conlinin 2 und LuFad3 aus der Gattung Linum. Der Fachmann auf dem Gebiet wird es richtig einschätzen, dass andere Promotoren, zum Beispiel, Samen-spezifische Promotoren, wie Napin, verwendet werden können, um die Expression der Dehydratase-Nukleotidsequenz zu modulieren, zum Beispiel zu steigern.
In noch einer weiteren Ausführungsform schließt ein rekombinanter Vektor der vorliegenden Erfindung eine Terminatorsequenz oder Terminatorsequenzen (z. B. Transkriptionsterminator-Sequenzen) ein. Der Begriff ”Terminatorsequenzen” schließt regulatorische Sequenzen ein, welche dazu dienen, die Transkription von mRNA zu terminieren. Terminatorsequenzen (oder Tandem-Transkriptionsterminatoren) können ferner dazu dienen, mRNA (z. B. durch Hinzufügung von Struktur zu mRNA), zum Beispiel gegen Nucleasen, zu stabilisieren.
In noch einer anderen Ausführungsform schließt ein rekombinanter Vektor der vorliegenden Erfindung Antibiotikumresistenz-Sequenzen ein. Der Begriff ”Antibiotikumresistenz-Sequenzen” schließt Sequenzen ein, welche beim Wirtsorganismus die Resistenz gegen Antibiotika fördern oder verleihen. In einer Ausführungsform sind die Antibiotikumresistenz-Sequenzen aus der Gruppe gewählt, die aus cat(Chloramphenicol-Resistenz)-, tet(Tetracyclin-Resistenz)-Sequenzen, erm(Erythromycin-Resistenz)-Sequenzen, neo-(Neomycin-Resistenz)-Sequenzen und spec(Spectinomycin-Resistenz)-Sequenzen besteht. Rekombinante Vektoren der vorliegenden Erfindung können ferner Homologe-Rekombinations-Sequenzen (z. B., Sequenzen, die entworfen sind, um Rekombination des Gens von Interesse in das Chromosom des Wirtsorganismus zu erlauben) einschließen. Zum Beispiel können amyE-Sequenzen als Homologie-Ziele für eine Rekombination in das Wirtschromosom verwendet werden.
Der Begriff ”manipulierte Zelle” schließt eine Zelle ein, welche manipuliert (z. B., gentechnisch verändert) oder modifiziert worden ist, so dass die Zelle mindestens eine Fettsäure-Dehydratase, z. B., BN-7, BN-G6, EG-S6, EG-FF4 oder EG-L3, aufweist, so dass eine ungesättigte Fettsäure hergestellt wird. Die Modifikation oder Manipulierung solcher Mikroorganismen kann gemaß einer beliebigen hierin beschriebenen Methodik erfolgen, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Deregulation eines biosynthetischen Wegs und/oder Überexpression von mindestens einem biosynthetischen Enzym. Ein ”manipuliertes” Enzym (z. B. ein ”manipuliertes” biosynthetisches Enzym) schließt ein Enzym ein, dessen Expression oder Herstellung verändert oder modifiziert worden ist, so dass mindestens ein vorgeschaltete(r/s) oder nachgeschaltete(r/s) Vorläufer, Substrat oder Produkt des Enzyms, zum Beispiel im Vergleich zu einem entsprechenden Wildtyp- oder natürlich vorkommenden Enzym, verändert oder modifiziert ist.
Der Begriff ”überexprimiert” oder ”Überexpression” schließt die Expression eines Genproduktes (z. B. einer Fettsäure-Dehydratase) bei einem größeren Spiegel als demjenigen, der vor der Manipulierung der Zelle oder in einer vergleichbaren Zelle, die nicht manipuliert worden ist, exprimiert wird, ein. In einer Ausführungsform kann die Zelle genetisch manipuliert (z. B. gentechnisch verändert) werden, damit sie einen Spiegel an Genprodukt überexprimiert, welcher größer ist als jener, der vor der Manipulierung der Zelle oder in einer vergleichbaren Zelle, welche nicht manipuliert worden ist, exprimiert wird. Genetische Manipulation kann, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, das Verändern oder Modifizieren von regulatorischen Sequenzen oder Stellen, welche mit der Expression eines bestimmten Gens assoziiert sind (z. B. durch Hinzufügen starker Promotoren, induzierbarer Promotoren oder mehrerer Promotoren, oder durch Entfernen regulatorischer Sequenzen, so dass die Expression konstitutiv ist), das Modifizieren der chromosomalen Lokalisierung eines bestimmten Gens, das Verändern von Nukleinsäuresequenzen, die an ein bestimmtes Gen angrenzen, wie etwa einer Ribosomenbindungsstelle oder eines Transkriptionsterminators, das Erhöhen der Kopienzahl eines bestimmten Gens, das Modifizieren von Proteinen (z. B. regulatorischen Proteinen, Suppressoren, Enhancern, Transkriptionsaktivatoren und dergleichen), die an der Transkription eines bestimmten Gens und/oder der Translation eines bestimmten Genproduktes beteiligt sind, oder jedwede sonstigen herkömmlichen Mittel zur Deregulierung von Expression eines bestimmten Gens, die Routine im Fachgebiet darstellen (einschließlich, ohne Einschränkung darauf, Verwendung von Antisense-Nukleinsäuremolekülen, zum Beispiel zum Blockieren der Expression von Repressorproteinen) einschließen.
In einer anderen Ausführungsform kann die Zelle physikalisch oder umweltmäßig manipuliert werden, um einen Spiegel an Genprodukt überzuexprimieren, der größer ist als derjenige, der vor der Manipulierung der Zelle oder in einer vergleichbaren Zelle, die nicht manipuliert worden ist, exprimiert wird. Zum Beispiel kann eine Zelle mit einem Mittel behandelt, oder in dessen Gegenwart kultiviert, werden, von dem bekannt ist oder vermutet wird, die Transkription eines bestimmten Gens und/oder die Translation eines bestimmten Genproduktes zu erhöhen, so dass die Transkription und/oder Translation gesteigert oder erhöht werden. Alternativ dazu kann eine Zelle bei einer Temperatur kultiviert werden, die gewählt ist, um die Transkription eines bestimmten Gens und/oder die Translation eines bestimmten Genproduktes so zu erhöhen, dass die Transkription und/oder Translation gesteigert oder erhöht werden.
Der Begriff ”dereguliert” oder ”Deregulierung” beinhaltet die Veränderung oder Modifikation von mindestens einem Gen in einer Zelle, welches ein Enzym in einem Biosyntheseweg codiert, so dass der Spiegel oder die Aktivität des biosynthetischen Enzyms in der Zelle verändert oder modifiziert wird. Vorzugsweise wird mindestens ein Gen, welches ein Enzym in einem Biosyntheseweg codiert, so verändert oder modifiziert, dass das Genprodukt gesteigert oder erhöht wird. Der Ausdruck ”deregulierter Weg” kann auch einen biosynthetischen Weg einschließen, in welchem mehr als ein Gen, das ein Enzym in einem biosynthetischen Weg codiert, verändert oder modifiziert ist, so dass der Spiegel oder die Aktivität von mehr als einem biosynthetischen Enzym verändert oder modifiziert ist. Die Fähigkeit, einen Weg in einer Zelle zu ”deregulieren” (z. B. gleichzeitig mehr als ein Gen in einem gegebenen Biosyntheseweg zu deregulieren) erwächst aus dem besonderen Phänomen bei Zellen, in dem mehr als ein Enzym (z. B. zwei oder drei biosynthetische Enzyme) von Genen codiert werden, welche auf einem zusammenhängenden Stück genetischem Material angrenzend aneinander vorkommen, welches als ein ”Operon” bezeichnet wird.
Der Begriff ”Operon” beinhaltet eine koordinierte Einheit der Genexpression, welche einen Promotor, und möglicherweise ein regulatorisches Element einschließt, die mit einem oder mehreren, vorzugsweise mindestens zwei Strukturgenen (z. B. Genen, die Enzyme, beispielsweise biosynthetische Enzyme codieren) assoziiert sind. Die Expression der Strukturgene kann zum Beispiel durch regulatorische Proteine, welche an das regulatorische Element binden, oder durch Anti-Termination der Transkription koordiniert reguliert werden. Die Strukturgene können transkribiert werden, was eine einzelne mRNA ergibt, die sämtliche der Strukturproteine codiert. Aufgrund der koordinierten Regulierung von in einem Operon enthaltenen Genen kann die Änderung oder Modifikation des einzigen Promotors und/oder regulatorischen Elements zur Änderung oder Modifikation von jedem Genprodukt, das durch das Operon codiert wird, führen. Die Änderung oder Modifikation des regulatorischen Elementes kann, ohne Einschränkung darauf, das Entfernen des endogenen Promotors und/oder regulatorischen Elemente(s), das Hinzufügen starker Promotoren, induzierbarer Promotoren oder mehrfacher Promotoren, oder das Entfernen von regulatorischen Sequenzen, so dass die Expression der Genprodukte modifiziert wird, das Modifizieren der chromosomalen Lokalisierung des Operons, das Verändern von Nukleinsäuresequenzen, die zum Operon benachbart oder innerhalb des Operons liegen, wie etwa einer Ribosomenbindungsstelle, das Erhöhen der Kopienzahl des Operons, das Modifizieren von Proteinen (z. B. regulatorischen Proteinen, Suppressoren, Enhancern, Transkriptionsaktivatoren und dergleichen), die an der Transkription des Operons und/oder der Translation der Genprodukte des Operons beteiligt sind, oder beliebige sonstige herkömmliche Methoden zur Deregulierung von Expression von Genen, welche auf dem Fachgebiet routinemäßig sind (einschließlich, ohne Einschränkung darauf, Verwendung von Antisense-Nukleinsäuremolekülen, zum Beispiel zum Blockieren der Expression von Repressorproteinen) einschließen. Die Deregulierung kann auch das Ändern der codierenden Region von einem oder mehreren Genen beinhalten, um beispielsweise ein Enzym zu erhalten, welches rückkopplungsresistent ist oder eine höhere oder geringere spezifische Aktivität aufweist.
Eine besonders bevorzugte ”rekombinante” Zelle der vorliegenden Erfindung ist gentechnisch verändert worden, um ein Pflanzen-abgeleitetes Gen oder Genprodukt oder ein Mikroorganismus-abgeleitetes Gen oder Genprodukt zu überexprimieren. Der Begriff ”Pflanzen-abgeleitet”, ”Mikroorganismen-abgeleitet” oder ”abgeleitet aus” beinhaltet zum Beispiel ein Gen, welches natürlicherweise in einem Mikroorganismus oder einer Pflanze, z. B. einer Ölsamen-Pflanze, gefunden wird oder ein Genprodukt (z. B. BN-7, BN-G6, EG-S6, EG-FF4 oder EG-L3), oder das von einem Pflanzengen oder einem Gen aus einem Mikroorganismus codiert wird (z. B. codiert von SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 3, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 7 oder SEQ ID NR: 9).
Die Methodik der vorliegenden Erfindung beinhaltet rekombinante Zellen, welche mindestens eine Fettsäure-Dehydratase überexprimieren. In einer Ausführungsform ist eine rekombinante Zelle der vorliegenden Erfindung gentechnisch manipuliert worden, um eine Claviceps purpurea-Fettsäure-Dehydratase zu überexprimieren (z. B. ist manipuliert worden, um mindestens eine Fettsäure-Dehydratase zu überexprimieren, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 aufweist, oder von der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 codiert wird).
In In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Zelle (z. B. eine mikrobielle Zelle), welche mit einem Vektor transformiert worden ist, umfassend eine Fettsäure-Dehydratase-Nukleinsäuresequenz (z. B. eine Fettsäure-Dehydratase-Nukleinsäuresequenz, wie in SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 dargelegt).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Modulieren der Herstellung von Fettsäuren, umfassend das Kultivieren von Zellen, die mit den Nukleinsäuremolekülen der vorliegenden Erfindung (z. B. einer Dehydratase) transformiert sind, so dass eine Modulierung der Fettsäureherstellung auftritt (z. B. die Herstellung von ungesättigten Fettsäuren gesteigert wird). Das Verfahren zum Kultivieren von Zellen, die durch die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung (z. B. BN-7, BN-G6, EG-S6, EG-FF4 oder EG-L3) zur Modulierung der Herstellung von Fettsäuren transformiert sind, wird hierin als ”Biotransformation” bezeichnet. Die Biotransformationsverfahren können rekombinante Zellen und/oder Dehydratasen, die hierin beschrieben sind, verwenden. Der Begriff ”Biotransformationsverfahren”, hierin ebenfalls bezeichnet als ”Biokonversions-Verfahren”, beinhaltet biologische Verfahren, welche zur Herstellung (z. B. Transformation oder Konversion) von einer beliebigen Verbindung (z. B. Substrat, Zwischenstufe oder Produkt) führen, welche vorgeschaltet zu einer Fettsäure-Dehydratase oder einer Verbindung (z. B. Substrat, Zwischenstufe oder Produkt), die einer Fettsäure-Dehydratase nachgeschaltet ist, insbesondere einer ungesättigten Fettsäure, angeordnet ist. In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Biotransformationsverfahren für die Herstellung einer ungesättigten Fettsäure, welches das Kontaktieren einer Zelle, die mindestens eine Fettsäure-Dehydratase überexprimiert, mit mindestens einem passenden Substrat unter Bedingungen, so dass eine ungesättigte Fettsäure hergestellt wird, und gegebenenfalls das Gewinnen der Fettsäure umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Biotransformationsverfahren für die Herstellung von ungesättigten Fettsäuren, welches das Kontaktieren einer Zelle, die BN-7, BN-G6, EG-S6, EG-FF4 oder EG-L3 überexprimiert, mit einem passenden Substrat (z. B. einer Zwischenstufen-Fettsäure) unter Bedingungen, so dass eine ungesättigte Fettsäure (z. B. DHA, ARA oder EPA) hergestellt wird, und gegebenenfalls das Gewinnen der ungesättigten Fettsäure umfasst. Bedingungen, unter denen eine ungesättigte Fettsäure hergestellt wird, können beliebige Bedingungen einschließen, welche zu der gewünschten Herstellung einer ungesättigten Fettsäure führen.
Die in den Biotransformations-Reaktionen verwendeten Zelle(n) und/oder Enzyme liegen in einer Form vor, welche ihnen erlaubt, ihre beabsichtigte Funktion auszuführen (z. B. eine gewünschte Fettsäure herzustellen). Die Zellen können ganze Zellen sein oder es kann sich lediglich um diejenigen Portionen der Zellen handeln, welche zum Erhalten des gewünschten Endresultats notwendig sind. Die Zellen können (z. B. in einer geeigneten Lösung, wie gepufferten Lösungen oder Medien) suspendiert, gespült (z. B. von Medien aus der Kultivierung der Zelle freigespült), mit Aceton getrocknet, immobilisiert (z. B. mit Polyacrylamidgel oder k-Carrageenan oder auf synthetischen Trägern, zum Beispiel Kügelchen, Matrizen und dergleichen), fixiert, vernetzt oder permeabilisiert werden (z. B. permeabilisierte Membranen und/oder Wände aufweisen, sodass Verbindungen, zum Beispiel Substrate, Zwischenstufen oder Produkte, leichter durch die Membran oder Wand hindurchtreten können). Der Typ der Zelle kann jedwede Zelle sein, die in der Lage ist, innerhalb der Verfahren der Erfindung verwendet zu werden, z. B. pflanzliche, tierische oder mikrobielle Zellen.
Der Typ der Zelle kann jedwede Zelle sein, die fähig ist innerhalb der Verfahren der Erfindung verwendet zu werden, z. B. pflanzliche, tierische oder mikrobielle Zellen, vorzugsweise eine pflanzliche oder mikrobielle Zelle. In einer Ausführungsform ist die Zelle eine Pflanzen-Zelle, zum Beispiel, eine Ölsamen-Pflanze, einschließlich, ohne Einschränkung darauf, Flachs (Linum sp.), Raps (Brassica sp.), Sojabohne (Glycine und Soja sp.), Sonnenblume (Helianthus sp.), Baumwolle (Gossypium sp.), Mais (Zea mays), Olive (Olea sp.), Saflor (Carthamus sp.), Kakao (Theobroma cacoa), Erdnuss (Arachis sp.), Hanf, Camelina, Crambe, Ölpalme, Kokosnüssen, Erdnüssen, Sesamsamen, Castorbohne, Lesquerella, Talgbaum, Shea-Nüssen, Tung-Nüssen, Kapok-Frucht, Mohnsamen, Jojoba-Samen und Perilla. In einer anderen Ausführungsform ist die Zelle Brassica juncea. Die am 21. August 2003 veröffentlichte U.S.-Patentveröffentlichung Nr. 2003-0159174 , deren gesamter Inhalt hiermit ausdrücklich durch den Bezug darauf hierin einbezogen ist, stellt eine umfangreiche Belehrung über die Transformation von Pflanzenzellen bereit, um die Herstellung eines gewünschten Endprodukts zu optimieren.
In noch einer anderen Ausführungsform ist die Zelle eine mikrobielle Zelle, zum Beispiel, Candida, Cryptococcus, Lipomyces, Rhodosporidium, Yarrowia, Thraustochytrium, Pythium irregulare, Schizochytrium und Crythecodinium. Der Fachmann auf dem Gebiet wird es richtig verstehen, dass andere mikrobielle Zellen in Übereinstimmung mit den hierin angegebenen Verfahren, zum Beispiel, für die Herstellung einer desaturierten bzw. entsättigten Fettsäure, verwendet werden können.
Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung beinhaltet das Heranwachsenlassen der rekombinanten Pflanze oder das Kultivieren der hierin beschriebenen rekombinanten Mikroorganismen, so dass eine gewünschte Verbindung (z. B. eine gewünschte ungesättigte Fettsäure) hergestellt wird. Der Begriff ”Kultivieren” schließt das Halten und/oder Wachsenlassen eines lebenden Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung (z. B. Halten und/oder Wachsenlassen einer Kultur oder eines Stammes) ein. In einer Ausführungsform wird ein Mikroorganismus der Erfindung in Flüssigmedien kultiviert. In einer anderen Ausführungsform wird ein Mikroorganismus der Erfindung in Festmedien oder Halbfestmedien kultiviert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Mikroorganismus der Erfindung in Medien (z. B. einem sterilen flüssigen Medium) kultiviert, umfassend Nährstoffe, die für das Halten und/oder Wachstum des Mikroorganismus essentiell oder vorteilhaft sind (z. B. Kohlenstoffquellen oder Kohlenstoffsubstrat, zum Beispiel komplexe Kohlehydrate, wie Bohnen- oder Kornmehl, Stärken, Zucker, Zuckeralkohole, Kohlenwasserstoffe, Öle, Fette, Fettsäuren, organische Säuren und Alkohole; Stickstoffquellen, zum Beispiel pflanzliche Proteine, Peptone, Peptide und Aminosäuren, abgeleitet aus Körnern, Bohnen und Wurzelknollen, Proteine, Peptide und Aminosäuren, abgeleitet aus tierischen Quellen, wie etwa Fleisch, Milch und tierischen Nebenprodukten, wie Peptonen, Fleischextrakten und Caseinhydrolysaten; anorganische Stickstoffquellen, wie Harnstoff, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat und Ammoniumphosphat; Phosphorquellen, zum Beispiel Phosphorsäure, Natrium- und Kaliumsalze davon; Spurenelemente, zum Beispiel Magnesium-, Eisen-, Mangan-, Calcium-, Kupfer-, Zink-, Bor-, Molybdän- und/oder Kobaltsalze; sowie Wachstumsfaktoren, wie etwa Aminosäuren, Vitamine, Wachstumsförderer und dergleichen).
Vorzugsweise werden Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung unter reguliertem pH-Wert kultiviert. Der Begriff ”regulierter pH” beinhaltet jedweden pH-Wert, der zur Herstellung des gewünschten Produktes (z. B. einer ungesättigten Fettsäure) führt. In einer Ausführungsform werden Mikroorganismen bei einem pH-Wert von etwa 7 kultiviert. In einer anderen Ausführungsform werden Mikroorganismen bei einem pH-Wert von zwischen 6,0 und 8,5 kultiviert. Der gewünschte pH-Wert kann durch eine beliebige Anzahl von dem Fachmann auf dem Gebiet bekannten Verfahren aufrechterhalten werden.
Ebenfalls bevorzugt werden Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung unter gesteuerter Belüftung kultiviert. Der Begriff ”gesteuerte Belüftung” schließt eine ausreichende Belüftung (z. B. Sauerstoff) ein, um zur Herstellung des gewünschten Produktes (z. B. einer ungesättigten Fettsäure) zu führen. In einer Ausführungsform wird die Belüftung durch Regulieren der Sauerstoffspiegel in der Kultur, zum Beispiel durch Regulieren der Menge von im Kulturmedium gelöstem Sauerstoff, gesteuert. Vorzugsweise wird die Belüftung der Kultur durch das Bewegen der Kultur gesteuert. Das Bewegen kann durch einen Propeller oder eine ähnliche mechanische Bewegungsvorrichtung, durch Umwälzen oder Schütteln des Wachstumsgefäßes (z. B. Fermenter) oder durch diverse Pumpvorrichtungen vorgesehen werden. Die Belüftung kann ferner durch die Passage von steriler Luft oder von Sauerstoff durch das Medium (z. B. durch das Fermentationsgemisch) gesteuert werden. Ebenfalls bevorzugt werden Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung ohne übermäßige Schaumbildung (z. B. durch Zusetzen von Anti-Schaummitteln) kultiviert.
Darüber hinaus können Pflanzen oder Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung bei gesteuerten Temperaturen kultiviert werden. Der Begriff ”gesteuerte Temperatur” beinhaltet eine beliebige Temperatur, welche zur Herstellung des gewünschten Produktes (z. B. einer ungesättigten Fettsäure) führt. In einer Ausführungsform schließen gesteuerte Temperaturen Temperaturen zwischen 15°C und 95°C ein. In einer anderen Ausführungsform schließen gesteuerte Temperaturen Temperaturen zwischen 15°C und 70°C ein. Bevorzugte Temperaturen betragen zwischen 20°C und 55°C, weiter bevorzugt zwischen 30°C und 45°C oder zwischen 30°C und 50°C.
Mikroorganismen können in flüssigen Medien kultiviert (z. B. gehalten und/oder wachsen gelassen) werden, und werden vorzugsweise entweder kontinuierlich oder periodisch bzw. satzweise mittels herkömmlicher Kulturverfahren, wie stehender Kultur, Reagenzglas-Kultur, Schüttelkultur (z. B. Rotationsschüttelkultur, Schüttel-Kolbenkultur etc.), Belüftungs-Spinner-Kultur oder Fermentation, kultiviert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Mikroorganismen in Schüttelkolben kultiviert. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform werden die Mikroorganismen in einem Fermenter (z. B. einem Fermentierungsverfahren) kultiviert. Fermentierungsverfahren der vorliegenden Erfindung beinhalten, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Satz-, Fed-Batch- und kontinuierliche Verfahren zur Fermentation. Der Ausdruck ”Satz-Verfahren” oder ”Satz-Fermentation” bezieht sich auf ein geschlossenes System, in welchem die Zusammensetzung aus Medium, Nährstoffen, ergänzenden Additiven und dergleichen zu Beginn der Fermentation eingestellt und während der Fermentation keiner Veränderung unterzogen wird, wobei jedoch Maßnahmen durchgeführt werden können, um derartige Faktoren wie pH-Wert und Sauerstoffkonzentration zu regulieren, um eine übermäßige Ansäuerung des Mediums und/oder das Absterben der Mikroorganismen zu verhindern. Der Begriff ”Fed-Batch-Verfahren oder ”Fed-Batch”-Fermentation bezieht sich auf eine Satz-Fermentation mit der Ausnahme, dass ein oder mehrere Substrate oder Ergänzungsstoffe mit Voranschreiten der Fermentation hinzugegeben werden (z. B. in Zuwächsen oder kontinuierlich hinzugesetzt werden). Der Ausdruck ”kontinuierliches Verfahren” oder ”kontinuierliche Fermentation” bezieht sich auf ein System, in welchem ein definiertes Fermentationsmedium kontinuierlich in einen Fermenter gegeben wird und gleichzeitig eine identische Menge an verbrauchtem oder ”konditioniertem” Medium entnommen wird, vorzugsweise zur Gewinnung des gewünschten Produktes (z. B. einer ungesättigten Fettsäure). Zahlreiche derartige Verfahren sind entwickelt worden und auf dem Fachgebiet allgemein bekannt.
Der Ausdruck ”Kultivieren unter Bedingungen, so dass eine gewünschte Verbindung (z. B. eine ungesättigte Fettsäure, zum Beispiel DHA) hergestellt wird” beinhaltet das Halten und/oder Wachsenlassen von Pflanzen oder Mikroorganismen unter Bedingungen (z. B. Temperatur, Druck, pH, Dauer etc.), die passend oder ausreichend sind, um die Herstellung der gewünschten Verbindung zu erhalten oder um gewünschte Erträge der hergestellten jeweiligen Verbindung zu erhalten. Zum Beispiel wird die Kultivierung während einer ausreichenden Zeit fortgesetzt, um die gewünschte Menge einer ungesättigten Fettsäure (z. B. DHA) herzustellen. Vorzugsweise wird die Kultivierung während einer ausreichenden Zeit fortgesetzt, um im Wesentlichen eine maximale Produktion der ungesättigten Fettsäure zu erreichen. In einer Ausführungsform wird die Kultivierung etwa 12 bis 24 Stunden lang fortgesetzt. In einer anderen Ausführungsform wird die Kultivierung während etwa 24 bis 36 Stunden, 36 bis 48 Stunden, 48 bis 72 Stunden, 72 bis 96 Stunden, 96 bis 120 Stunden, 120 bis 144 Stunden oder länger als 144 Stunden fortgesetzt. In einer anderen Ausführungsform wird die Kultivierung während einer ausreichenden Zeit fortgesetzt, um Produktionserträge an ungesättigten Fettsäuren zu erreichen, wobei zum Beispiel Zellen so kultiviert werden, dass mindestens etwa 15 bis 20 g/Liter ungesättigte Fettsäuren hergestellt werden, mindestens etwa 20 bis 25 g/Liter ungesättigte Fettsäuren hergestellt werden, mindestens etwa 25 bis 30 g/Liter ungesättigte Fettsäuren hergestellt werden, mindestens etwa 30 bis 35 g/Liter ungesättigte Fettsäuren hergestellt werden, mindestens etwa 35 bis 40 g/Liter ungesättigte Fettsäuren (z. B. mindestens etwa 37 g/Liter ungesättigte Fettsäuren) hergestellt werden oder mindestens etwa 40 bis 50 g/Liter ungesättigte Fettsäuren hergestellt werden. In noch einer anderen Ausführungsform werden Mikroorganismen unter Bedingungen kultiviert, sodass eine bevorzugte Ausbeute an ungesättigten Fettsäuren, zum Beispiel ein Ertrag innerhalb eines oben dargelegten Bereiches, in etwa 24 Stunden, in etwa 36 Stunden, in etwa 48 Stunden, in etwa 72 Stunden oder in etwa 96 Stunden hergestellt wird.
Bei der Herstellung ungesättigter Fettsäuren kann es ferner wünschenswert sein, Zellen der vorliegenden Erfindung in Gegenwart von ergänzenden Fettsäure-Biosynthesesubstraten zu kultivieren. Der Begriff ”ergänzendes Fettsäure-Biosynthesesubstrat” beinhaltet ein Mittel oder eine Verbindung, welche(s), bei Inkontaktbringen mit einer Zelle oder bei Einschließen in dem Kulturmedium einer Zelle, dazu dient, die Biosynthese von ungesättigter Fettsäure zu steigern oder erhöhen. Ergänzende Fettsäure-Biosynthesesubstrate der vorliegenden Erfindung können in Form einer konzentrierten Lösung oder Suspension (z. B. in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Wasser oder Puffer) oder in der Form eines Feststoffes (z. B. in Form eines Pulvers) zugesetzt werden. Außerdem können ergänzende Fettsäure-Biosynthesesubstrate der vorliegenden Erfindung als einzelnes Aliquot, kontinuierlich oder periodisch über eine gegebene Zeitspanne hinweg zugegeben werden.
Die Methodik der vorliegenden Erfindung kann ferner einen Schritt des Gewinnens einer gewünschten Verbindung (z. B. einer ungesättigten Fettsäure) einschließen. Der Begriff ”Gewinnen” einer gewünschten Verbindung beinhaltet das Extrahieren, Abernten, Isolieren oder Reinigen der Verbindung aus Kulturmedien. Das Gewinnen der Verbindung kann gemäß einer beliebigen herkömmlichen Isolierungs- oder Reinigungsmethode durchgeführt werden, welche im Fachgebiet bekannt ist, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Behandlung mit einem herkömmlichen Harz (z. B. Anionen- oder Kationenaustauschharz, nicht-ionisches Adsorptions-Harz etc.), Behandlung mit einem herkömmlichen Adsorbens (z. B. Aktivkohle, Kieselsäure, Silicagel, Cellulose, Aluminiumoxid etc.), Veränderung des pH-Wertes, Lösungsmittelextraktion (z. B. mit einem herkömmlichen Lösungsmittel, wie einem Alkohol, Ethylacetat, Hexan und dergleichen), Dialyse, Filtration, Aufkonzentrieren, Kristallisieren, Umkristallisieren, pH-Einstellung, Lyophilisierung und dergleichen. Zum Beispiel kann eine Verbindung aus Kulturmedien gewonnen werden, indem zuerst die Mikroorganismen aus der Kultur entfernt werden. Das Medium wird dann durch oder über ein Kationenaustauschharz geleitet, um unerwünschte Kationen zu entfernen, und danach durch oder über ein Anionenaustauschharz geleitet, um unerwünschte anorganische Anionen und organische Säuren mit stärkeren Aciditäten als die ungesättigte Fettsäure von Interesse (z. B. DHA) zu entfernen.
Vorzugsweise wird eine gewünschte Verbindung der vorliegenden Erfindung ”extrahiert”, ”isoliert” oder ”gereinigt”, so dass die resultierende Präparation im Wesentlichen frei von anderen Komponenten (z. B. frei von Mediumkomponenten und/oder Fermentationsnebenprodukten) ist. Der Ausdruck ”im Wesentlichen frei von anderen Komponenten” beinhaltet Präparationen der gewünschten Verbindung, in welchen die Verbindung von Mediumkomponenten oder Fermentationsnebenprodukten der Kultur, aus der sie hergestellt wird, abgetrennt (z. B. gereinigt oder teilweise gereinigt) ist. In einer Ausführungsform weist die Präparation mehr als etwa 80% (bezogen auf Trockengewicht) an der gewünschten Verbindung (z. B. weniger als etwa 20% sonstige Mediumkomponenten oder Fermentationsnebenprodukte), weiter bevorzugt mehr als etwa 90% der gewünschten Verbindung (z. B. weniger als etwa 10% sonstige Mediumkomponenten oder Fermentationsnebenprodukte), noch weiter bevorzugt mehr als etwa 95% der gewünschten Verbindung (z. B. weniger als etwa 5% sonstige Mediumkomponenten oder Fermentationsnebenprodukte), und am stärksten bevorzugt mehr als etwa 98–99% gewünschte Verbindung (z. B. weniger als etwa 1–2% sonstige Mediumkomponenten oder Fermentationsnebenprodukte) auf. Wenn die gewünschte Verbindung eine ungesättigte Fettsäure ist, die zu einem Salz abgewandelt wurde, ist die Verbindung vorzugsweise weiterhin frei (z. B. im Wesentlichen frei) von chemischen Kontaminanten, die mit der Bildung des Salzes assoziiert sind. Wenn die gewünschte Verbindung eine ungesättigte Fettsäure ist, welche zu einem Alkohol abgewandelt worden ist, ist die Verbindung vorzugsweise weiterhin frei (z. B. im Wesentlichen frei) von chemischen Kontaminanten, die mit der Bildung des Alkohols assoziiert sind.
In einer alternativen Ausführungsform wird die gewünschte ungesättigte Fettsäure nicht aus der Pflanze oder dem Mikroorganismus gereinigt, zum Beispiel, wenn die Pflanze oder der Mikroorganismus biologisch nicht-gefährlich (z. B. sicher) ist. Zum Beispiel kann die gesamte Pflanze oder Kultur (oder der Kulturüberstand) als eine Quelle für das Produkt (z. B. Rohprodukt) verwendet werden. In einer Ausführungsform wird die Pflanze oder Kultur(oder der Kulturüberstand)-Überstand ohne Modifikation verwendet. In einer anderen Ausführungsform wird die Pflanze oder die Kultur (oder der Kulturüberstand) aufkonzentriert. In noch einer anderen Ausführungsform wird die Pflanze oder Kultur (oder der Kulturüberstand) pulverisiert, getrocknet oder lyophilisiert.
B. Hochertrags-Herstellungsmethoden
A Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Hochertrags-Herstellungsverfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren, z. B. DHA, umfassend das Kultivieren einer manipulierten Pflanze oder eines manipulierten Mikroorganismus unter Bedingungen, so dass die ungesättigte Fettsäure bei einem signifikant hohen Ertrag hergestellt wird. Der Ausdruck ”Hochertrags-Herstellungsverfahren”, beispielsweise ein Hochertrags-Herstellungsverfahren zur Herstellung einer gewünschten Verbindung (z. B. zur Herstellung einer ungesättigten Fettsäure), beinhaltet ein Verfahren, das zur Herstellung der gewünschten Verbindung bei einem Spiegel führt, der über denjenigen, der bei vergleichbaren Herstellungsverfahren gewöhnlich ist, hinaus erhöht ist oder darüber liegt. Vorzugsweise führt ein Hochertrags-Herstellungsverfahren zur Herstellung der gewünschten Verbindung bei einem signifikant hohen Ertrag. Der Begriff ”signifikant hoher Ertrag” schließt einen Produktions- oder Ertrags-Spiegel ein, der über denjenigen, der bei vergleichbaren Herstellungsverfahren gewöhnlich ist, hinaus ausreichend erhöht ist oder darüber liegt, wobei er zum Beispiel auf einen für die kommerzielle Herstellung des gewünschten Produkts (z. B. Herstellung des Produktes bei kommerziell praktikablen Kosten) ausreichenden Spiegel erhöht ist. In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Hochertrags-Herstellungsverfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren, welches das Kultivieren eine(r/s) manipulierten Pflanze oder Mikroorganismus unter Bedingungen, so dass eine ungesättigte Fettsäure bei einem größeren Spiegel als 2 g/Liter hergestellt wird, einschließt. In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Hochertrags-Herstellungsverfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren, welches das Kultivieren eine(r/s) manipulierten Pflanze oder Mikroorganismus unter Bedingungen, so dass eine ungesättigte Fettsäure bei einem größeren Spiegel als 10 g/Liter hergestellt wird, einschließt. In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Hochertrags-Herstellungsverfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren, welches das Kultivieren eine(r/s) manipulierten Pflanze oder Mikroorganismus unter Bedingungen, so dass eine ungesättigte Fettsäure bei einem größeren Spiegel als 20 g/Liter hergestellt wird, einschließt. In noch einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Hochertrags-Herstellungsverfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren, welches das Kultivieren eine(r/s) manipulierten Pflanze oder Mikroorganismus unter Bedingungen, so dass eine ungesättigte Fettsäure bei einem größeren Spiegel als 30 g/Liter hergestellt wird, einschließt. In noch einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Hochertrags-Herstellungsverfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren, welches das Kultivieren eine(r/s) manipulierten Pflanze oder Mikroorganismus unter Bedingungen, so dass eine ungesättigte Fettsäure bei einem größeren Spiegel als 40 g/Liter hergestellt wird, einschließt.
Die Erfindung betrifft ferner ein Hochertrags-Herstellungsverfahren zur Herstellung einer gewünschten Verbindung (z. B. zur Herstellung einer ungesättigten Fettsäure), welches die Kultivierung einer/eines manipulierten Pflanze oder Mikroorganismus unter solchen Bedingungen beinhaltet, dass ein ausreichend erhöhter Spiegel der Verbindung innerhalb einer kommerziell wünschenswerten Zeitspanne hergestellt wird. In einer beispielhaften Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Hochertrags-Herstellungsverfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren, welches die Kultivierung einer/eines manipulierten Pflanze oder Mikroorganismus unter Bedingungen beinhaltet, so dass eine ungesättigte Fettsäure bei einem größeren Spiegel als 15–20 g/Liter in 36 Stunden hergestellt wird. In einer anderen Ausführungsform, betrifft die Erfindung ein Hochertrags-Herstellungsverfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren, welches die Kultivierung einer/eines manipulierten Pflanze oder Mikroorganismus unter Bedingungen beinhaltet, so dass eine ungesättigte Fettsäure bei einem größeren Spiegel als 25–30 g/Liter in 48 Stunden hergestellt wird. In einer anderen Ausführungsform, betrifft die Erfindung ein Hochertrags-Herstellungsverfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren, welches die Kultivierung einer/eines manipulierten Pflanze oder Mikroorganismus unter Bedingungen beinhaltet, so dass eine ungesättigte Fettsäure bei einem größeren Spiegel als 35–40 g/L in 72 Stunden, zum Beispiel größer als 37 g/Liter in 72 Stunden hergestellt wird. In einer anderen Ausführungsform, betrifft die Erfindung ein Hochertrags-Herstellungsverfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren, welches die Kultivierung einer/eines manipulierten Pflanze oder Mikroorganismus unter Bedingungen beinhaltet, so dass eine ungesättigte Fettsäure bei einem größeren Spiegel als 30–40 g/Liter in 60 Stunden, zum Beispiel größer als 30, 35 oder 40 g/Liter in 60 Stunden hergestellt wird. Werte und Bereiche, die innerhalb der hierin dargelegten Bereiche eingeschlossen sind, oder dazwischen liegen, befinden sich beabsichtigtermaßen ebenfalls innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Zum Beispiel ist beabsichtigt, dass eine Herstellung von ungesättigter Fettsäure bei Spiegeln von mindestens 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 und 39 g/Liter in 60 Stunden innerhalb des Bereichs von 30–40 g/Liter in 60 Stunden eingeschlossen ist. In einem anderen Beispiel ist es beabsichtigt, dass Bereiche von 30–35 g/Liter oder 35–40 g/Liter innerhalb des Bereichs von 30–40 g/Liter in 60 Stunden eingeschlossen sind. Darüber hinaus wird es der Fachmann richtig verstehen, dass die Kultivierung eines manipulierten Mikroorganismus zum Erreichen eines Produktionsniveaus von zum Beispiel ”30–40 g/Liter in 60 Stunden” das Kultivieren des Mikroorganismus während zusätzlichen Zeitperioden (z. B. längeren Zeitperioden als 60 Stunden) einschließt, was gegebenenfalls dazu führt, dass noch höhere Erträge an einer ungesättigten Fettsäure hergestellt werden.
IV. Zusammensetzungen
Die erfindungsgemäßen Dehydratase-Nukleinsäuremoleküle, -Proteine und Fragmente derselben können verwendet werden, um langkettige ungesättigte Fettsäuren herzustellen, welche in Zusammensetzungen eingebracht werden können. Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung schließen z. B. Zusammensetzungen zur Verwendung als Tierfutter, Zusammensetzungen zur Verwendung als Nutraceuticals (z. B. Nahrungsergänzungen) sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Verabreichung geeignet sind, ein. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen typischerweise eine ungesättigte Fettsäure und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Wie hierin verwendet, wird mit dem Ausdruck ”pharmazeutisch annehmbarer Träger” beabsichtigt, jedwede und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakteriellen und antifungalen Mittel, isotonischen und absorptionsverzögernden Mittel und dergleichen einzuschließen, die mit einer pharmazeutischen Verabreichung verträglich sind. Die Verwendung derartiger Medien und Mittel für pharmazeutisch wirksame Substanzen ist im Fachgebiet allgemein bekannt. Mit der Ausnahme, dass irgendein herkömmliches Medium oder Mittel mit der aktiven Verbindung unverträglich ist, wird deren Verwendung in den Zusammensetzungen in Betracht gezogen. Ergänzende, aktive Verbindungen können ebenfalls in die Zusammensetzungen eingebracht werden.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung wird formuliert, um mit ihrer beabsichtigten Verabreichungsroute verträglich zu sein. Beispiele für Wege der Verabreichung beinhalten die parenterale, z. B. intravenöse, intradermale, subkutane, orale (z. B. Inhalation), transdermale (topische), transmukosale und rektale Verabreichung. Zur parenteralen, intradermalen oder subkutanen Anwendung verwendete Lösungen oder Suspensionen können die folgenden Komponenten einschließen: ein steriles Verdünnungsmittel, wie Wasser zur Injektion, Kochsalzlösung, fixierte Öle, Polyethylenglycole, Glycerin, Propylenglycol oder andere synthetische Lösungsmittel; antibakterielle Mittel, wie Benzylalkohol oder Metylparabene; Antioxidationsmittel, wie Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; Chelatbildnermittel, wie Ethylendiamintetraessigsäure; Puffer, wie Acetate, Citrate oder Phosphate, und Mittel zur Einstellung der Tonizität, wie etwa Natriumchlorid oder Dextrose. Der pH-Wert kann mit Säuren oder Basen, wie Chlorwasserstoffsäure oder Natriumhydroxid, eingestellt werden. Die parenterale Präparation kann in Ampullen, Wegwerfspritzen oder Mehrfachdosis-Gefäßen, die aus Glas oder Kunststoff hergestellt sind, eingeschlossen werden.
Zur Injektionsanwendung geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen beinhalten sterile wässrige Lösungen (sofern wasserlöslich) oder Dispersionen und sterile Pulver zur extemporanen Zubereitung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen. Für die intravenöse Verabreichung schließen geeignete Träger physiologische Kochsalzlösung, Bakteriostatikum-Wasser, Cremophor EL^TM (BASF, Parsippany, NJ) oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ein. In allen Fällen muss die Zusammensetzung steril sein und sollte in dem Ausmaß fluid sein, dass eine einfache Anwendbarkeit mit Spritzen vorliegt. Sie muss unter den Bedingungen der Herstellung und Aufbewahrung stabil sein und muss gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilzen, konserviert werden. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder Dispersionsmedium sein, enthaltend zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol (zum Beispiel Glycerol, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol und dergleichen), und geeignete Mischungen davon. Die geeignete Fluidität kann zum Beispiel durch Verwenden einer Beschichtung, wie Lecithin, durch Aufrechthalten der erforderlichen Teilchengröße im Fall von Dispersion und durch den Einsatz von Tensiden beibehalten werden. Die Verhinderung der Einwirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antifungale Mittel erzielt werden, zum Beispiel Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Ascorbinsäure, Thimerosal und dergleichen. In vielen Fällen wird es bevorzugt, isotonische Mittel, zum Beispiel Zucker, Polyalkohole, wie Mannitol, Sorbitol, Natriumchlorid, in der Zusammensetzung einzuschließen. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch Einschließen eines Mittels, welches die Absorption verzögert, zum Beispiel Aluminiummonostearat und Gelatine, in die Zusammensetzung bewirkt werden.
Sterile injizierbare Lösungen können durch Vereinigen der aktiven Verbindung (z. B. eine LCPUFA, oder ein Fragment davon, hergestellt mittels der Nukleinsäure- und Proteinmoleküle der vorliegenden Erfindung) in der erforderlichen Menge in einem passenden Lösungsmittel mit einem oder einer Kombination der oben aufgeführten Bestandteil(en), wie erforderlich, hergestellt werden, worauf eine Sterilfiltrierung folgt. Dispersionen werden im Allgemeinen durch Einbringen der aktiven Verbindung in ein steriles Vehikel hergestellt, das ein basisches Dispersionsmedium und die erforderlichen anderen Bestandteile aus den oben Aufgezählten enthält. Im Fall von sterilen Pulvern für die Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen handelt sich bei den bevorzugten Zubereitungsverfahren um Vakuumtrocknung und Gefriertrocknung, wodurch man ein Pulver des aktiven Bestandteils samt jedwedem zusätzlichen gewünschten Bestandteil aus einer zuvor sterilfiltrierten Lösung derselben erhält.
Orale Zusammensetzungen schließen im Allgemeinen ein inertes Verdünnungsmittel oder einen essbaren Träger ein. Sie können in Gelatinekapseln eingeschlossen oder zu Tabletten komprimiert werden. Für den Zweck der oralen therapeutischen Verabreichung kann die aktive Verbindung mit Exzipienten vereinigt und in der Form von Tabletten, Pastillen oder Kapseln verwendet werden. Orale Zusammensetzungen können des Weiteren unter Verwendung eines flüssigen Trägers zum Gebrauch als Mundwasser hergestellt werden, wobei die Verbindung in dem flüssigen Träger oral angewandt und gegurgelt und ausgespuckt oder heruntergeschluckt wird. Pharmazeutisch verträgliche Bindemittel und/oder Hilfsmaterialien können als Teil der Zusammensetzung eingeschlossen werden. Die Tabletten, Pillen, Kapseln, Pastillen und dergleichen können Beliebige der nachstehenden Bestandteile, oder Verbindungen einer ähnlichen Beschaffenheit, enthalten: ein Bindemittel, wie mikrokristalline Zellulose, Tragant-Gummi oder Gelatine; einen Exzipienten, wie Stärke oder Lactose, ein Zerfallsmittel, wie Alginsäure, Primogel oder Maisstärke; ein Gleitmittel, wie Magnesiumstearat oder Sterotes; ein Schmiermittel, wie kolloidales Siliciumdioxid; einen Süßmacher, wie Saccharose oder Saccharin; oder ein Geschmacksmittel, wie Pfefferminze, Methylsalicylat oder Orangenaroma.
Für die Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen in der Form eines Aerosolsprays aus einem druckbeaufschlagten Behälter oder einem Spender, der ein geeignetes Treibmittel, z. B. ein Gas, wie Kohlendioxid, enthält, oder einem Zerstäuber abgegeben.
Eine systemische Verabreichung kann auch durch transmukosale oder transdermale Mittel erfolgen. Für transmukosale oder transdermale Verabreichung werden Penetrationsmittel, die für die zu durchdringende Barriere angemessen sind, in der Formulierung verwendet. Derartige Penetrationsmittel sind im Fachgebiet allgemein bekannt und schließen zum Beispiel, für transmukosale Verabreichung, Detergentien bzw. Tenside, Gallensalze und Fusidinsäure-Derivate ein. Die transmukosale Verabreichung kann durch die Anwendung von Nasensprays oder Suppositorien bewerkstelligt werden. Für die transdermale Verabreichung werden die aktiven Verbindungen zu Dermatika, Salben, Gelen oder Cremes formuliert, wie es im Fachgebiet allgemein bekannt ist.
Die Verbindungen können auch in der Form von Suppositorien (z. B. mit herkömmlichen Suppositorium-Grundlagen wie Kakaobutter und anderen Glyceriden) oder Retentions-Einläufen für die rektale Zuführung zubereitet werden.
In einer Ausführungsform werden die aktiven Verbindungen mit Trägern hergestellt, welche die Verbindung gegen eine rasche Eliminierung aus dem Körper schützen, wie etwa einer Formulierung mit regulierter Freisetzung, einschließlich Implantaten und mikroverkapselten Zuführungssystemen. Biologisch abbaubare, biokompatible Polymere können verwendet werden, wie etwa Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglycolsäure, Collagen, Polyorthoester und Polymilchsäure. Verfahren zur Herstellung solcher Formulierungen werden dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein. Die Materialien können auch kommerziell von Alza Corporation und Nova Pharmaceuticals, Inc., erworben werden. Liposomale Suspensionen (einschließlich Liposomen, die mit monoklonalen Antikörpern gegen virale Antigene zu infizierten Zellen gelenkt werden) können ebenfalls als pharmazeutisch annehmbare Träger verwendet werden. Diese können gemäß dem Fachmann auf dem Gebiet bekannten Verfahren hergestellt werden, zum Beispiel wie im U.S.-Patent Nr. 4 522 811 beschrieben.
Für die Leichtigkeit der Verabreichung und die Gleichmäßigkeit der Dosierung ist es besonders vorteilhaft, orale oder parenterale Zusammensetzungen in Dosierungseinheitsform zu formulieren. Eine Dosierungseinheitsform, wie hierin verwendet, bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die als Einzel-Dosierungen für das zu behandelnde Subjekt geeignet sind; wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an aktiver Verbindung enthält, welche zum Hervorrufen des gewünschten therapeutischen Effekts in Assoziation mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger berechnet wurde. Die Spezifikation für die Dosierungseinheitsformen der Erfindung wird von den Einzelmerkmalen der aktiven Verbindung und der jeweils zu erzielenden therapeutischen Wirkung sowie den Einschränkungen, mit denen die Technik der Compoundierung einer derartigen aktiven Verbindung zur Behandlung von Individuen einhergeht, vorgeschrieben und ist direkt von diesen abhängig.
Toxizität und therapeutische Wirksamkeit derartiger Verbindungen können durch standardmäßige pharmazeutische Vorgehensweisen in Zellkulturen oder Versuchstieren, z. B. zur Ermittlung der LD50 (der für 50% der Population tödlichen Dosis) und der ED50 (der bei 50% der Population therapeutisch effektiven Dosis), bestimmt werden. Das Dosisverhältnis zwischen toxischen und therapeutischen Effekten ist der therapeutische Index, und dieser kann als das Verhältnis LD50/ED50 ausgedrückt werden.
Verbindungen, welche hohe therapeutische Indizes aufzeigen, sind bevorzugt. Obgleich Verbindungen, welche toxische Nebenwirkungen aufzeigen, verwendet werden können, sollte darauf geachtet werden, ein Zuführungssystem zu entwerfen, das derartige Verbindungen zu der Stelle des betroffenen Gewebes ziellenkt, um einen potenziellen Schaden an nicht-infizierten Zellen zu minimieren und dadurch die Nebenwirkungen zu verringern.
Die aus den Zellkultur-Assays und Tieruntersuchungen erhaltenen Daten können bei der Zubereitung einer Auswahl von Dosierungen für die Verwendung in Menschen Anwendung finden. Die Dosierung derartiger Verbindungen liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereiches von Kreislauf-Konzentrationen, welche den ED50 beinhalten, mit geringer oder gar keiner Toxizität. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereiches in Abhängigkeit von der verwendeten Dosierungsform und der angewandten Route zur Verabreichung variieren. Für jedwede, im Verfahren der Erfindung verwendete Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis anfänglich aus Zellkultur-Assays abgeschätzt werden. Eine Dosis kann in Tiermodellen formuliert werden, um einen Kreislauf-Plasmakonzentrationsbereich zu erzielen, der den IC50 (d. h. die Konzentration der Testverbindung, welche eine halbmaximale Inhibition der Symptome erzielt) einschließt, wie es in der Zellkultur bestimmt wird. Derartige Informationen können genutzt werden, um die brauchbaren Dosierungen in Menschen genauer zu bestimmen. Die Spiegel in Plasma können zum Beispiel durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie gemessen werden.
Wie hierin definiert, liegt eine therapeutisch wirksame Menge an Protein oder Polypeptid (d. h. eine effektive Dosierung) im Bereich von etwa 0,001 bis 30 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise etwa 0,01 bis 25 mg/kg Körpergewicht, weiter bevorzugt etwa 0,1 bis 20 mg/kg Körpergewicht, und noch weiter bevorzugt etwa 1 bis 10 mg/kg, 2 bis 9 mg/kg, 3 bis 8 mg/kg, 4 bis 7 mg/kg oder 5 bis 6 mg/kg Körpergewicht. Der Fachmann wird es richtig einschätzen, dass gewisse Faktoren die Dosis beeinflussen können, welche benötigt wird, um ein Subjekt wirkungsvoll zu behandeln, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, die Schwere der Krankheit oder Erkrankung, frühere Behandlungen, der allgemeine Gesundheitszustand und/oder das Alter des Patienten sowie sonstige vorhandene Krankheiten. Darüber hinaus kann die Behandlung eines Subjektes mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines Proteins, Polypeptids oder Antikörpers eine einzelne Behandlung einschließen oder kann, vorzugsweise, eine Reihe von Behandlungen beinhalten.
In einem bevorzugten Beispiel wird ein Subjekt mit einer LCPUFA im Bereich von zwischen etwa 0,1 bis 20 mg/kg Körpergewicht einmal wöchentlich während zwischen etwa 1 bis 10 Wochen, vorzugsweise zwischen 2 bis 8 Wochen, weiter bevorzugt zwischen etwa 3 und 7 Wochen, und noch weiter bevorzugt während etwa 4, 5 oder 6 Wochen behandelt. Es wird ebenfalls richtig eingeschätzt werden, dass die wirksame Dosis von zur Behandlung verwendetem Antikörper, Protein oder Polypeptid über den Verlauf der jeweiligen Behandlung hinweg steigen oder sinken kann. Änderungen der Dosierung können daraus folgen, und aus den Ergebnissen von diagnostischen Assays, wie hierin beschrieben, offensichtlich werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in einem Behälter, einer Packung oder einer Spendervorrichtung, zusammen mit Anweisungen zur Verabreichung eingeschlossen werden.
FIGUREN
1 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Dehydratasen aus Brassica napus (BN-7 und BNG8) wie folgend: (A) die cDNA-Sequenz der mRNA (SEQ ID NR: 1, und 3) (1A); die translatierten Aminosäuresequenzen (SEQ ID NR: 2 und 4) (1B).
2 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz einer Dehydratase aus Euglena gracilis (EG-S6, EG-FF4 und EG-L3) wie folgend: die cDNA-Sequenz der mRNA (SEQ ID NR: 5, 7 und 9) (2A); die translatierte Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 6, 8 und 10) (2B).
3 zeigt ein Aminosäure-Alignment von Dehydratase aus Brassica napus, Euglena gracilis (BN-7, BN-G8, EG-S6, EG-FF4 und EG-L3), und jenes der Dehydratase aus Saccharomyces cerevisae YJL097W.
4 ist eine Komplementations-Untersuchung mit den Dehydratasen BN-7, BN-G8, EG-S6, EG-FF4 und EG-L3, die in den Hefe-Expressionsvektor YES2.1/V5His-TOPO kloniert und in den Hefestamm YSC4034-97041153 transformiert wurden. Das Wachsenlassen der Hefe für BN-7, BN-G6 und EG-L3 zeigt für diese Sequenzen deren Dehydratase-Aktivität. EG-S6 und EG-FF4 zeigen keine Dehydratase-Aktivität.
Diese Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, welche nicht als einschränkend ausgelegt werden sollten. Der Inhalt aller Bezugsstellen, Patente und veröffentlichten Patentanmeldungen, die überall in dieser Anmeldung sowie den Figuren zitiert sind, ist hierin durch den Bezug darauf einbezogen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Organismen und Kulturbedingungen
Für Komplementationsuntersuchungen wurden Klone in den heterozygoten ”magic marker”-Stamm YSC4034-97041153 von Open Biosystems transformiert, und positive Klone wurden auf DOB-Uracil-Platten selektiert. Für die Regeneration von Haploiden wurde das in Pan et al 2004 (Molecular Cell16: 487–496) geschilderte Verfahren angewandt. Kurz gesagt wurden Kulturen über Nacht in DOB-Uracil wachsen gelassen, dann wurden ungefähr 25 OD₆₀₀ jeder Kultur gewaschen und in frischem Medium resuspendiert und 3 Stunden lang wachsen gelassen. Danach wurden die Zellen in Sporulations-Medium (1% Kaliumacetat, 0,005% Zinkacetat) suspendiert, 5 Tage lang sporulieren gelassen und auf Haploid-Selektions-”magic”-Mediumplatten (2% Galactose, Aminosäure-Mix – Uracil-Leucin-Histidin-Arginin, 0,17% Stickstoffbase ohne Aminosäuren oder Ammoniumsuifat, 0,1% Natriumglutamat) ausplattiert, welche 200 mg/Liter G418 und 60 mg/Liter Canavanin enthielten.
Beispiel 2: Klonieren von BN-7-, BN-G6-, EG-S6-, EG-FF4- und EG-L3-DehydratasecDNA
Brassica napus EST, GB-Zugangsnummer CX192963, mit einem abgeleiteten Translationsprodukt, das Ähnlichkeit zu jenem des Hefegens YJL097W aufweist, wurde durch Datenbank-Suchen identifiziert. Auf der Grundlage dieser Sequenz wurden die Primer BNDH-F (5'-gttagtacatggcggggtctttctc-3') und BNDH-R (5'-tttttattccctcttggatttggag-3') entworfen. Brassica napus-RNA aus unreifen Samen wurde revers transkribiert, und die cDNA wurde als eine Matrize für PCR mit der Korrekturlese-Polymerase PfuUltra und den Primern BN-F und BN-R verwendet. PCR-Produkte wurden in den Vektor pYES2.1/V5-His-TOPO einkloniert. Klone, welche Inserts in der korrekten Orientierung enthielten, wurden durch PCR-Analyse selektiert und sequenziert. Zwei Klone mit leicht unterschiedlichen Sequenzen, BN-G6 und BN-7, wurden erhalten.
Euglena gracilis EST, GB-Zugangsnummer EC672518, mit einem abgeleiteten Translationsprodukt, das Ähnlichkeit zu jenem des Hefegens YJL097W aufweist, wurde durch Datenbank-Suchen identifiziert. Der Vorwärtsprimer EDHR1 (5'-cggcgctgtgccagcatgtatg-3', SEQ ID NR: 13) wurde mit dem Marathon (BD Biosciences) AP1-Primer verwendet, um das 5'-End des Gens aus Euglena gracilis-cDNA, konstruiert mit Hilfe des ”Marathon cDNA Amplification Kit”, zu amplifizieren. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des 5'-RACE-Produkts wies darauf hin, dass die Euglena gracilis-Dehydratase eine sehr lange N-terminale Erweiterung im Vergleich zu den entsprechenden Brassica napus- oder Hefegenen zu haben schien. Basierend auf der Sequenz des 5'-RACE-Produkts sowie denjenigen von Genbank-Sequenzen mit Homologie zu diesem 5'-Ende, wurden drei Primer, EGDH-LF (5'-ggaacatgcaccactttcggccg-3') EGDH-SF (5'-ggaacatgtacaacgctggccaagc-3') und EGDH-FF (5'-ggaacatggcggttttcaccaactacgtcc-3') entworfen, um Sequenzen, beginnend an dem am meisten 5' gelegenen Methionin, dem ersten Methionins innerhalb des Bereichs des abgeleiteten Translationsprodukts mit Homologie zu den Hefe- und Brassica-Sequenzen, bzw. der am meisten N-terminal gelegenen Region des Euglena-Gens mit Homologie zu den anderen Genen, zu amplifizieren. Der letztgenannte Primer, EGDH-FF, enthielt ein künstliches Methionin-Startcodon. RNA aus Euglena gracilis wurde revers transkribiert, und die cDNA wurde als eine PCR-Matrize in Reaktionen verwendet, welche einen der drei Vorwärtsprimer gemeinsam mit EGDH-R (5'-CCAAGCTTGTGTCATTGATTCTTCTTCTCGG-3') einschlossen. PCR-Produkte wurden in den Vektor pYES2.1/V5-His-TOPO einkloniert. Klone, welche Inserts in der korrekten Orientierung enthielten, wurden durch PCR-Analyse selektiert und sequenziert. Drei Klone mit Inserts von verschiedenen Längen, EG-L3, EG-S6 und EG-FF4, wurden erhalten.
Eine Liste von identifizierten codierenden Volllängensequenzen, und der jeweils verwendeten Primersequenzen zum Erhalten derselben, ist in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1: Liste von codierenden Volllängensequenzen und verwendeten Primersequenzen.
Eine Liste von aus den in Tabelle 1 beschriebenen Sequenzen abgeleiteten Aminosäuren ist in Tabelle 2 gezeigt.

Gen Organismus SEQ ID NR:

BN-G6 B. napus 4

BN-7 B. napus 2

EG-L3 E. gracilis 10

EG-FF4 E. gracilis 8

EG-S6 E. gracilis 6
Beispiel 3: Hefe-Transformation und Wachstums-Bedingungen
Der S. cerevisiae-Stamm YSC4034-97041153 von Open Biosystems wurde mit den Konstrukten (pYES2.1/V5-His-TOPO-BN-G6, pYES2.1/V5-His-TOPO-BN-7, pYES2.1/V5-His-TOPO-EG-L3, pYES2.1/V5-His-TOPO-EG-FF4, pYES2.1/V5-His-TOPO-EG-S6) unter Verwendung des S. C. EasyComp Transformation Kit (Invitrogen, Carlsbad, California) bei Selektion auf Uracil-defizientem Medium transformiert. Zur Prüfung der Dehydratase-Aktivität wurden Komplementations-Untersuchungen durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde der heterozygote ”magic marker”-Stamm YSC4034-97041153 von Open Biosystems verwendet. Dieser Stamm zeigt keinerlei Dehydratase-Aktivität auf. Da die Dehydratase-Aktivität verlängerte Fettsäuren liefert, und diese Fettsäuren für Zellwachstum und -teilung erforderlich sind, wird der betreffende Hefestamm auf Medium, das die verlängerten Fettsäuren nicht enthält, nicht wachsen.
Transformanten wurden behandelt, wie es in Beispiel 1 für die Wachstumsbedingungen beschrieben ist. Nach 3 Tagen bildeten sich Kolonien auf den Platten, auf denen Zellen ausgestrichen worden waren, welche aus, die Plasmide EG-L3, BN-G6 und BN-7 enthaltenden Kulturen sporuliert hatten, wohingegen sich keine Kolonien auf Platten bildeten, die man mit Zellen bestrichen hatte, welche aus Kulturen abgeleitet waren, die die Klone EG-S6, EG-FF4 oder pYES2.1 trugen (4).
Deshalb scheinen sowohl die Brassica napus-Sequenzen als auch die lange Version der Euglena gracilis-Sequenz zum Komplementieren der letalen Nullmutation im Hefe-3-hydroxy acyl-CoA dehydratase-Gen YJL097W in der Lage zu sein.
Zusammenfassend, konnte durch die Komplementation einer Hefe-Mangelmutante gezeigt werden, dass die Dehydratase-Sequenz EG-L3, BN-G6 und BN-7 funktionelle Dehydratasen sind.
Beispiel 4: Expression von EG-L3, BN-G6 und BN-7 in Pflanzen
Zur Untersuchung der Brauchbarkeit von EG-L3, BN-G6 und BN-7 in der Herstellung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren in Pflanzen, zum Beispiel, zur Nutraceutical-Anwendung, wurde das EG-L3-, BN-G6- und BN-7-Gen in Arabidopsis thaliana unter der Steuerung eines Samen-spezifischen Brassica napus-Napin-Speicherprotein-Promotors exprimiert. Der binäre Vektor für Pflanzenexpression, der das Kandidatengen enthielt, wurde durch das In-planta-Agrobacterium-Infiltrations-Vorgehen in A. thaliana Col0 eingebracht. Transgene reife Samen wurden hinsichtlich der Produktion von ungewöhnlichen Fettsäuren durch Gaschromatographie analysiert. Transgene Pflanzen zeigen erhöhte Spiegel an mehrfach ungesättigten Fettsäuren.
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Alle in dieser Beschreibung angeführten Referenzen sind hierin durch den Bezug eingeschlossen, und zwar sowohl bezüglich ihres gesamten Offenbarungsgehaltes als auch des Offenbarungsgehaltes, welcher in dieser Beschreibung spezifisch erwähnt ist.
Zusammenfassung
Die Erfindung stellt isolierte Nukleinsäuremoleküle bereit, welche neue Vertreter der Fettsäure-Dehydratase-Familie codieren. Die Erfindung stellt ebenfalls rekombinante Expressionsvektoren, die Dehydratase-Nukleinsäuremoleküle enthalten, Wirtszellen, in welche die Expressionsvektoren eingeführt worden sind, und Verfahren zur großtechnischen Herstellung von langkettigen mehrfach ungesättigten Fettsäuren (LCPUFAs), z. B. SDA, EPA und DHA, bereit.

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus folgendem besteht: a) einer Nukleinsäuresequenz, welche eine Fettsäure-Dehydratase aus Brassica napus oder Euglena gracilis codiert; b) einer Nukleinsäuresequenz, umfassend eine Sequenz, wie sie in der SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 gezeigt ist; c) einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz umfasst, wie sie in der SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 gezeigt ist; d) einer Nukleinsäuresequenz, die eine natürlich vorkommende allelische Variante eines Polypeptids codiert, umfassend die Aminosäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 gezeigt ist; e) einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, welche zu mindestens 50% identisch zu der Aminosäuresequenz ist, wie sie in der SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 gezeigt ist, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid mit Dehydrataseaktivität codiert; f) einer Nukleinsäuresequenz, welche zu mindestens 50% identisch zu der Aminosäuresequenz von einem beliebigen von a) bis e) ist, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid mit Dehydrataseaktivität codiert; g) einer Nukleinsäuresequenz, welche an die Nukleinsäuresequenz von einem beliebigen von a) bis e) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid mit Dehydrataseaktivität codiert; und h) einer Nukleinsäuresequenz von mindestens 15 benachbarten Nukleotiden der gesamten Nukleotidsequenz der SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9.
Nukleinsäuremolekül von Anspruch 1, wobei das Nukleinsäuremolekül ein Fettsäure-Dehydratase-Protein mit einer Aktivität zur Katalyse der Entfernung von H₂O von einer 3-Hydroxyacylfettsäure codiert.
Nukleinsäuremolekül von Anspruch 2, wobei die Hydroxygruppe an der Position Δ3 ist.
Nukleinsäuremolekül von einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Nukleinsäuremolekül ferner eine Nukleotidsequenz umfasst, welche ein heterologes Polypeptid codiert.
Vektor, umfassend das Nukleinsäuremolekül von von einem der Ansprüche 1 bis 4.
Vektor von Anspruch 5, welcher ein Expressionsvektor ist.
Vektor von Anspruch 5 oder 6, wobei das Nukleinsäuremolekül unter der Kontrolle eines Samen-spezifischen Promotors ist.
Vektor von Anspruch 7, wobei der Samen-spezifische Promotor aus der Gruppe gewählt wird, die aus Conlinin 1, Conlinin 2, Napin, USP, LeB4, Arc, Fae, ACP, LuPXR, SBP und LuFad3 besteht.
Wirtszelle, umfassend das Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, oder welche mit dem Expressionsvektor von einem der Ansprüche 5 bis 8 transformiert ist.
Wirtszelle von Anspruch 9, wobei die Zelle eine Pflanzenzelle ist.
Wirtszelle von Anspruch 10, wobei die Pflanzenzelle eine Zelle ist, die von einer Ölsamen-Nutzpflanze erhalten wird.
Wirtszelle von Anspruch 11, wobei die Ölsamen-Nutzpflanze aus der Gruppe gewählt wird, die aus Flachs (Linum sp.), Raps (Brassica sp.), Sojabohnen (Glycine und Soja sp.), Sonnenblume (Helianthus sp.), Baumwolle (Gossypium sp.), Mais (Zea mays), Olive (Olea sp.), Saflor (Carthamus sp.), Kakao (Theobroma cacoa), Erdnuss (Arachis sp.), Hanf, Camelina, Crambe, Palmöl, Kokusnuss, Erdnuss, Sesam, Castorbohne, Lesquerella, Talgbaum, Sheanuss, Tungnuss, Kapokfrucht, Mohnsamen, Jojoba und Perilla besteht.
Wirtszelle von Anspruch 9, wobei die Zelle eine mikrobielle Zelle ist.
Wirtszelle von Anspruch 13, wobei die mikrobielle Zelle aus der Gruppe gewählt wird, die aus Candida, Cryptococcus, Lipomyces, Rhodosporidium, Yarrowia, Thraustochytrium, Pythium, Schizochytrium und Crythecodinium besteht.
Planze oder Pflanzensaat, umfassend das Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, den Vektor gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 oder die Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, umfassend das Kultivieren der Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14 in einem geeigneten Kulturmedium, um dadurch das Polypeptid herzustellen, welches durch ein Nukleinsäuremolekül von einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird.
Polypeptid, welches durch ein Nukleinsäuremolekül von einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird.
Verfahren zur Herstellung einer verlängerten Fettsäure, umfassend das Kultivieren der Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14 oder der Pflanze oder der Pflanzensaat von Anspruch 15, so dass die ungesättigte Fettsäure hergestellt wird.
Verfahren des Modulierens der Herstellung einer langkettigen ungesättigten Fettsäure, welches das Kultivieren der Wirtszelle von einem der Ansprüche 9 bis 14 oder der Pflanze oder der Pflanzensaat von Anspruch 15 umfasst, so dass die Modulierung der Herstellung einer langkettigen ungesättigten Fettsäure auftritt.
Verfahren von Anspruch 18 oder 19, wobei das Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens der langkettigen ungesättigten Fettsäure aus der Kultur umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer langkettigen ungesättigten Fettsäure, umfassend das Kontaktieren einer Zusammensetzung, die mindestens ein Dehydratase-Zielmolekül umfasst, mit mindestens einem Polypeptid von Anspruch 17 unter Bedingungen, so dass eine langkettige ungesättigte Fettsäure hergestellt wird.
Verfahren von Anspruch 21, wobei das Dehydratase-Zielmolekül 3-Hydroxyacyl-ACP oder 3-Hydroxyacyl-CoA von GLA 18:3 (6, 9, 12), DGLA 20:3 (8, 11, 14), AA 20:4 (5, 8, 11, 14) und Eicosapentaensäure 20:5 (5, 8, 11, 14, 17) ist.
Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle, Pflanze oder Pflanzensaat, die zur Erzeugung einer ungesättigten Fettsäure in der Lage ist, umfassend das Einführen des Nukleinsäuremoleküls gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder des Vektors gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 in die Wirtszelle, Pflanze oder Pflanzensaat.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18 bis 23, wobei die ungesättigte Fettsäure aus der Gruppe gewählt wird, die aus DGLA 20:3 (8, 11, 14), AA 20:4 (5, 8, 11, 14), EPA 20:5 (5, 8, 11, 14, 17), DPA 22:5 (4, 7, 10, 13, 16) und DHA 22:6 (4, 7, 10, 13, 16, 19), 20:4 (8, 11, 14, 17) besteht.
Verfahren zur Erzeugung eines Öls, umfassend die Schritte des Verfahrens von einem der Ansprüche 18 bis 24 und den weiteren Schritt des Formulierens eines Öls, welches die langkettige ungesättigte Fettsäure umfasst.
Öl, welches durch die Pflanze oder die Pflanzensaat von Anspruch 15 hergestellt wird, oder durch das Verfahren von Anspruch 25 erhältlich ist.
Verfahren zur Erzeugung eines Medikaments, umfassend die Schritte des Verfahrens von einem der Ansprüche 18 bis 24 und den weiteren Schritt des Formulierens eines Medikaments, welches die langkettige ungesättigte Fettsäure umfasst.
Medikament, welches das Nukleinsäuremolekül von einem der Ansprüche 1 bis 4, den Vektor von einem der Ansprüche 5 bis 8, die Wirtszelle von einem der Ansprüche 9 bis 11, die Pflanze oder Pflanzensaat von Anspruch 15 oder das Öl von Anspruch 26 umfasst.
Verwendung von dem Nukleinsäuremolekül von einem der Ansprüche 1 bis 4, von dem Vektor von einem der Ansprüche 5 bis 8, von der Wirtszelle von einem der Ansprüche 9 bis 11, von der Pflanze oder Pflanzensaat von Anspruch 15 oder von dem Öl von Anspruch 26 für die Herstellung von Tierfutter, einer Nahrungsmittelergänzung oder eines Lebensmittels.
Zelle, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, welches aus der Gruppe gewählt ist, die aus folgendem besteht: a) einem Nukleinsäuremolekül, umfassend die Nukleotidsequenz der SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9, wobei das Nukleinsäuremolekül durch mindestens eine Technik disruptiert wurde, welche aus einer Punktmutation, einer Verkürzung, einer Inversion, einer Deletion, einer Addition, einer Substitution und einer homologen Rekombination besteht; b) einem Nukleinsäuremolekül, umfassend die Nukleotidsequenz der SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9, wobei das Nukleinsäuremolekül eine oder mehrere Nukleinsäuremodifikationen im Vergleich zu der in der SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 dargelegten Sequenz umfasst, wobei die Modifikation aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus einer Punktmutation, einer Verkürzung, einer Inversion, einer Deletion, einer Addition und einer Substitution besteht, und c) einem Nukleinsäuremolekül, umfassend die Nukleotidsequenz der SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9, wobei die Regulationsregion des Nukleinsäuremoleküls im Vergleich zu der Regulationsregion des Moleküls vom Wild-Typ durch mindestens eine Technik modifiziert worden ist, welche aus einer Punktmutation, einer Verkürzung, einer Inversion, einer Deletion, einer Addition, einer Substitution und einer homologen Rekombination besteht.