JP5757870B2 - デサチュラーゼをコードする核酸および改変植物油 - Google Patents
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Description
a)配列番号1、3、5、7、31、33、35もしくは37のいずれか1つに示される核酸配列を有する核酸;
b)配列番号2、4、6、8、32、34、36もしくは38のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸;
c)配列番号1、3、5、7、31、33、35もしくは37のいずれか1つに示される核酸配列と少なくとも60%同一である核酸配列を有する核酸であって、デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記核酸;
d)配列番号2、4、6、8、32、34、36もしくは38のいずれか1つに示されるアミノ酸配列と少なくとも74.1%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸であって、デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記核酸;
e)a)〜d)のいずれか1つに記載の核酸に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸であって、デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記核酸;
f)デサチュラーゼ活性を有する、a)〜e)のいずれか1つに記載の核酸配列によりコードされるポリペプチドの断片をコードする核酸;ならびに
g)a)〜f)のいずれか1つに記載の核酸の少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む核酸、
からなる群より選択される核酸を含むポリヌクレオチドに関する。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドから誘導され、本発明のポリヌクレオチドの転写または翻訳を阻害することができるポリヌクレオチド変異体にも関する。そのような変異体ポリヌクレオチドとしては、アンチセンス核酸、リボザイム、siRNA分子、モルホリノ核酸(ホスホロジアミダートモルホリノオリゴ)、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、阻害的オリゴヌクレオチド、またはマイクロRNA分子が挙げられ、それらは全て本発明のポリヌクレオチドを特異的に認識する。これらの技術は当業者にはよく知られている。上記の種類の好適な変異体ポリヌクレオチドを、本発明のポリヌクレオチドの構造に基づいて容易に設計することができる。
a)配列番号102、104、106、108、110、112、135、137もしくは139のいずれか1つに示される核酸配列を有する核酸;
b)配列番号102、104、106、108、110、112、135、137もしくは139のいずれか1つに示される核酸配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸;
c)a)で特定された核酸配列と少なくとも60%同一である核酸配列を有する核酸;
d)配列番号102、104、106、108、110、112、135、137もしくは139のいずれか1つに示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも60%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸であって、該ポリペプチドをコードする前記核酸がアシルトランスフェラーゼ活性を有する前記核酸;
e)a)〜d)のいずれか1つに記載の核酸に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸であって、デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記核酸;
f)アシルトランスフェラーゼ活性を有する、a)〜e)のいずれか1つに記載の核酸配列によりコードされるポリペプチドの断片をコードする核酸;ならびに
g)a)〜f)のいずれか1つに記載の核酸の少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む核酸、
からなる群より選択される核酸を含む、アシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを意図する。
例えばラッカセイ属(Arachis)、例えば属および種Arachis hypogaea[落花生]、アマ科(Linaceae)、例えばリナム属(Linum)、アデノリナム属(Adenolinum)、例えば属および種Linum usitatissimum、Linum humile、Linum austriacum、Linum bienne、Linum angustifolium、Linum catharticum、Linum flavum、Linum grandiflorum、Adenolinum grandiflorum、Linum lewisii、Linum narbonense、Linum perenne、Linum perenne var. lewisii、Linum pratense もしくはLinum trigynum[アマニ]、Lythrarieae科、例えばザクロ属(Punica)、例えば属および種Punica granatum [ザクロ]、アオイ科(Malvaceae)、例えばワタ属(Gossypium)、例えば属および種Gossypium hirsutum、Gossypium arboreum、Gossypium barbadense、Gossypium herbaceumもしくは Gossypium thurberi[木綿]、ゼニゴケ科(Marchantiaceae)、例えばゼニゴケ属(Marchantia)、例えば属および種 Marchantia berteroana、Marchantia foliacea、Marchantia macropora、バショウ科(Musaceae)、例えばバショウ属(Musa)、例えば属および種Musa nana、Musa acuminata、Musa paradisiaca、Musa spp. [バナナ]、アカバナ科(Onagraceae)、例えばカミソニア属(Camissonia)、オエノセラ属(Oenothera)、例えば属および種 Oenothera biennisもしくはCamissonia brevipes[月見草]、ヤシ科(Palmae)、例えばアブラヤシ属(Elaeis)、例えば属および種Elaeis guineensis[油ヤシ]、ケシ科(Papaveraceae)、例えば、ケシ属(Papaver)、例えば属および種Papaver orientale、Papaver rhoeas、Papaver dubium [ケシ]、ゴマ科(Pedaliaceae)、例えばゴマ属(Sesamum)、例えば属および種Sesamum indicum[ゴマ]、コショウ科(Piperaceae)、例えばコショウ属(Piper)、アルタンテ属(Artanthe)、サダソウ属(Peperomia)、ステフェンシア属(Steffensia)、例えば属および種Piper aduncum、Piper amalago、Piper angustifolium、Piper auritum、Piper betel、Piper cubeba、Piper longum、Piper nigrum、Piper retrofractum、Artanthe adunca、Artanthe elongata、Peperomia elongata、Piper elongatum、Steffensia elongata[カイエンペッパー]、イネ科(Poaceae)、例えばオオムギ属(Hordeum)、ライムギ属(Secale)、エンバク属(Avena)、ソルガム属(Sorghum)、ウシクサ属(Andropogon)、シラゲガヤ属(Holcus)、キビ属(Panicum)、イネ属(Oryza)、トウモロコシ属(Zea(トウモロコシ))、コムギ属(Triticum)、例えば属および種Hordeum vulgare、Hordeum jubatum、Hordeum murinum、Hordeum secalinum、Hordeum distichon、Hordeum aegiceras、Hordeum hexastichon、Hordeum hexastichum、Hordeum irregulare、Hordeum sativum、Hordeum secalinum[オオムギ]、Secale cereale[ライムギ]、Avena sativa、Avena fatua、Avena byzantina、Avena fatua var. sativa、Avena hybrida[オートムギ]、Sorghum bicolor、Sorghum halepense、Sorghum saccharatum、Sorghum vulgare、Andropogon drummondii、Holcus bicolor、Holcus sorghum、Sorghum aethiopicum、Sorghum arundinaceum、Sorghum caffrorum、Sorghum cernuum、Sorghum dochna、Sorghum drummondii、Sorghum durra、Sorghum guineense、Sorghum lanceolatum、Sorghum nervosum、Sorghum saccharatum、Sorghum subglabrescens、Sorghum verticilliflorum、Sorghum vulgare、Holcus halepensis、Sorghum miliaceum、Panicum militaceum[ミレット]、Oryza sativa、Oryza latifolia [イネ]、Zea mays[トウモロコシ]、Triticum aestivum、Triticum durum、Triticum turgidum、Triticum hybernum、Triticum macha、Triticum sativumもしくはTriticum vulgare[コムギ]、チノリモ科(Porphyridiaceae)、例えばクロテス属(Chroothece)、フリンチエラ属(Flintiella)、ペトロバネラ属(Petrovanella)、チノリモ属(Porphyridium)、ロデラ属(Rhodella)、ロドソラス属(Rhodosorus)、バンホエフェニア属(Vanhoeffenia)、例えば属および種Porphyridium cruentum、ヤマモガシ科(Proteaceae)、例えばマカデミア属(Macadamia)、例えば属および種Macadamia intergrifolia[マカデミア]、プラシノ藻綱(Prasinophyceae)、例えば、ネフロセルミス属(Nephroselmis)、プラシノコッカス属(Prasinococcus)、シェルフェリア属(Scherffelia)、テトラセルミス属(Tetraselmis)、マントニエラ属(Mantoniella)、オストレオコッカス属(Ostreococcus)、例えば、属および種Nephroselmis olivacea、Prasinococcus capsulatus、Scherffelia dubia、Tetraselmis chui、Tetraselmis suecica、Mantoniella squamata、Ostreococcus tauri、アカネ科(Rubiaceae)、例えばコーヒーノキ属(Coffea)、例えば属および種Coffea spp.、Coffea arabica、Coffea canephoraもしくはCoffea liberica [コーヒー]、ゴマノハグサ科(Scrophulariaceae)、例えば、モウズイカ属(Verbascum)、例えば属および種Verbascum blattaria、Verbascum chaixii、Verbascum densiflorum、Verbascum lagurus、Verbascum longifolium、Verbascum lychnitis、Verbascum nigrum、Verbascum olympicum、Verbascum phlomoides、Verbascum phoenicum、Verbascum pulverulentumもしくはVerbascum thapsus[ビロードモウズイカ]、ナス科(Solanaceae)、例えばトウガラシ属(Capsicum)、タバコ属(Nicotiana)、ナス属(Solanum)、トマト属(Lycopersicon)、例えば属および種Capsicum annuum、Capsicum annuum var. glabriusculum、Capsicum frutescens[コショウ]、Capsicum annuum[パプリカ]、Nicotiana tabacum、Nicotiana alata、Nicotiana attenuata、Nicotiana glauca、Nicotiana langsdorffii、Nicotiana obtusifolia、Nicotiana quadrivalvis、Nicotiana repanda、Nicotiana rustica、Nicotiana sylvestris[タバコ]、Solanum tuberosum[ジャガイモ]、Solanum melongena[ナス]、Lycopersicon esculentum、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme、Solanum integrifoliumもしくはSolanum lycopersicum[トマト]、アオギリ科(Sterculiaceae)、例えばカカオ属(Theobroma)、例えば属および種 Theobroma cacao[カカオ]またはツバキ科(Theaceae)、例えばツバキ属(Camellia)、例えば属および種Camellia sinensis[茶]からなる群より選択される植物である。本発明に従ってトランスジェニック植物として用いられる特に好ましい植物は、大量の脂質化合物を含む油果実作物、例えば、ラッカセイ、菜種、キャノーラ、ヒマワリ、紅花、ケシ、カラシ、麻、ヒマシ油植物、オリーブ、ゴマ、キンセンカ、ザクロ、月見草、ビロードモウズイカ、アザミ、野バラ、ヘーゼルナッツ、アーモンド、マカダミア、アボカド、月桂樹、カボチャ、亜麻仁、大豆、ピスタチオ、ルリヂサ、樹木(油ヤシ、ココナッツ、クルミ)または作物、例えば、トウモロコシ、小麦、ライ麦、オート麦、ライ小麦、コメ、大麦、綿、キャッサバ、コショウ、マンジュギク、ジャガイモ、タバコ、ナスおよびトマトなどのナス科植物、ソラマメ種、エンドウ豆、アルファルファもしくは低木(コーヒー、カカオ、茶)、ヤナギ種、ならびに多年草および飼料作物である。本発明に従う好ましい植物は、ピーナッツ、菜種、キャノーラ、ヒマワリ、紅花、ケシ、カラシ、麻、ヒマシ油植物、オリーブ、キンセンカ、ザクロ、月見草、カボチャ、亜麻仁、大豆、ルリヂサ、樹木(油ヤシ、ココナッツ)である。特に好ましいのは、ヒマワリ、紅花、タバコ、ビロードモウズイカ、ゴマ、綿、カボチャ、ケシ、月見草、クルミ、亜麻仁、麻、アザミまたは紅花である。非常に特に好ましい植物は、紅花、ヒマワリ、ケシ、月見草、クルミ、亜麻仁、または麻などの植物である。
R1=ヒドロキシル、コエンザイムA(チオエステル)、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾジホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルイノシトール、スフィンゴ塩基もしくは式II:
R2=水素、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾジホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルイノシトールまたは飽和もしくは不飽和C2-C24-アルキルカルボニルであり、
R3=水素、飽和もしくは不飽和C2-C24-アルキルカルボニルであるか、またはR2およびR3は互いに独立に、式Ia:
n=2、3、4、5、6、7、または9であり、m=2、3、4、5または6であり、p=0または3である)
に示される構造を有する化合物を包含する。
の二重結合、特に好ましくは、2、3または4個の二重結合を含む。上記ラジカルは全て、対応する脂肪酸から誘導されたものである。
a)配列番号1、3、5、7、31、33、35、37、102、106、108、110、112、135、137もしくは139に記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、点突然変異、トランケーション、反転、欠失、付加、置換および相同組換えからなる群より選択される少なくとも1つの技術により破壊される前記核酸分子;
b)配列番号1、3、5、7、31、33、35、37、102、106、108、110、112、135、137もしくは139に記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、配列番号1、3、5、7、31、33、35、37、102、106、108、110、112、135、137もしくは139に記載の配列と比較して1個以上の核酸改変を含み、その改変が点突然変異、トランケーション、反転、欠失、付加および置換からなる群より選択される、前記核酸分子;ならびに
c)配列番号1、3、5、7、31、33、35、37、102、106、108、110、112、135、137もしくは139に記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該核酸分子の調節領域が、点突然変異、トランケーション、反転、欠失、付加、置換および相同組換えからなる群より選択される少なくとも1つの技術により、該分子の野生型調節領域と比較して改変される、前記核酸分子、
からなる群より選択される核酸分子を含む細胞に関する。
以下、本発明の実施形態を示す。
(1)a)配列番号1、3、5、7、31、33、35もしくは37のいずれか1つに示される核酸配列を有する核酸;
b)配列番号2、4、6、8、32、34、36もしくは38のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸;
c)配列番号1、3、5、7、31、33、35もしくは37のいずれか1つに示される核酸配列と少なくとも60%同一である核酸配列を有する核酸であって、デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記核酸;
d)配列番号2、4、6、8、32、34、36もしくは38のいずれか1つに示されるアミノ酸配列と少なくとも74.1%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸であって、デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記核酸;
e)a)〜d)のいずれか1つに記載の核酸に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸であって、デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記核酸;
f)デサチュラーゼ活性を有する、a)〜e)のいずれか1つに記載の核酸配列によりコードされるポリペプチドの断片をコードする核酸;ならびに
g)a)〜f)のいずれか1つに記載の核酸の少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む核酸、
からなる群より選択される核酸を含むポリヌクレオチド。
(2)(1)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
(3)発現ベクターである、(2)に記載のベクター。
(4)前記ポリヌクレオチドが種子特異的プロモーターの制御下にある、(3)に記載のベクター。
(5)種子特異的プロモーターが、コンリニン1、コンリニン2、ナピン、USP、LeB4、Arc、Fae、ACP、LuPXR、SBPおよびLuFad3からなる群より選択される、(4)に記載のベクター。
(6)(1)に記載のポリヌクレオチドを含むか、または(3)〜(5)のいずれか1に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
(7)前記細胞が植物細胞である、(6)に記載の宿主細胞。
(8)前記植物細胞が、油種子作物から得られた細胞である、(7)に記載の宿主細胞。
(9)油種子作物が、亜麻(Linum種)、菜種(Brassica種)、大豆(GlycineおよびSoja種)、ヒマワリ(Helianthus種)、綿(Gossypium種)、トウモロコシ(Zea mays)、オリーブ(Olea種)、紅花(Carthamus種)、ココア(Theobroma cacoa)、ピーナッツ(Arachis種)、麻、カメリナ、ハマナ、油ヤシ、ココナッツ、アメリカホドイモ、ゴマ種子、トウゴマの実、ブラッダーポッド、シラキ、シアの実、タングナッツ、カポックの実、ポピー種子、ホホバ種子およびエゴマからなる群より選択される、(8)に記載の宿主細胞。
(10)前記細胞が微生物細胞である、(6)に記載の宿主細胞。
(11)微生物細胞が、カンジダ、クリプトコッカス、リポミセス、ロドスポリジウム、ヤロウイア、トラウストキトリウム、ピチウム、シゾキトリウムおよびクリテコジニウムからなる群より選択される、(10)に記載の宿主細胞。
(12)(1)に記載のポリヌクレオチド、(2)〜(5)のいずれか1に記載のベクターもしくは(6)〜(9)のいずれか1に記載の宿主細胞を含む植物または植物種子。
(13)好適な培養培地中で(6)〜(11)のいずれか1に記載の宿主細胞を培養することによって、(1)に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを製造することを含む、ポリペプチドの製造方法。
(14)(1)に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
(15)不飽和脂肪酸が産生されるように、(6)〜(11)のいずれか1に記載の宿主細胞または(12)に記載の植物もしくは植物種子を培養することを含む、不飽和脂肪酸の製造方法。
(16)不飽和脂肪酸の産生調節が起こるように、(6)〜(11)のいずれか1に記載の宿主細胞または(12)に記載の植物もしくは植物種子を培養することを含む、不飽和脂肪酸の産生を調節する方法。
(17)前記方法が、前記培養物から不飽和脂肪酸を回収する工程をさらに含む、(15)または(16)に記載の方法。
(18)不飽和脂肪酸が産生されるような条件下で、少なくとも1種のデサチュラーゼ標的分子を含む組成物と、(14)に記載の少なくとも1種のポリペプチドとを接触させることを含む、不飽和脂肪酸の製造方法。
(19)デサチュラーゼ標的分子がオレイン酸、リノール酸、γ-リノレン酸、α-リノレン酸、ジホモ-γ-リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸(n-3)、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸およびドコサペンタエン酸である、(18)に記載の方法。
(20)不飽和脂肪酸が、ARA 20:4 (5,8,11,14)、EPA 20:5 (5,8,11,14,17)、およびDHA 22:6 (4,7,10,13,16,19)からなる群より選択される、(15)〜(19)のいずれか1に記載の方法。
(21)(15)〜(20)のいずれか1に記載の方法の工程と、前記不飽和脂肪酸を含む油を調製または単離するさらなる工程とを含む、油の製造方法。
(22)宿主細胞、植物または植物種子に、(1)に記載のポリヌクレオチドまたは(2)〜(5)のいずれか1に記載のベクターを導入することを含む、不飽和脂肪酸を生成することができる宿主細胞、植物または植物種子の作製方法。
(23)(12)に記載の植物もしくは植物種子により産生されるか、または(20)に記載の方法により取得可能である油。
(24)動物飼料、栄養補助食品、または食品の製造における、(1)に記載のポリヌクレオチド、(2)〜(5)のいずれか1に記載のベクター、(6)〜(11)のいずれか1に記載の宿主細胞、(12)に記載の植物もしくは植物種子または(23)に記載の油の使用。
(25)a)配列番号1、3、5、7、31、33、35もしくは37に記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、点突然変異、トランケーション、反転、欠失、付加、置換および相同組換えからなる群より選択される少なくとも1つの技術により破壊された前記核酸分子;
b)配列番号1、3、5、7、31、33、35もしくは37に記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、配列番号1、3、5、7もしくは9に記載の配列と比較して1個以上の核酸改変を含み、該改変が点突然変異、トランケーション、反転、欠失、付加および置換からなる群より選択される、前記核酸分子;ならびに
c)配列番号1、3、5、7、31、33、35もしくは37に記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該核酸分子の調節領域が、点突然変異、トランケーション、反転、欠失、付加、置換および相同組換えからなる群より選択される少なくとも1つの技術により、該分子の野生型調節領域と比較して改変された、前記核酸分子、
からなる群より選択される核酸分子を含む細胞。
ここで、本発明を以下の実施例を参照してより詳細に説明するが、しかしながら、それらはどんなものでも本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
材料および方法
ドレクスレラ・トリチシ-レペンチス(Drechsler tritici-repentis)、シリンドルカルポン・ハーテロネマ(Cylindorcarpon heteronema)、ディプロイダ・ナタレンシス(Diplodia natalensis)、スタゴノスポラ・ノドラム(Stagonospora nodorum)およびミクロドチウム・ニバラ(Microdochium nivalae)の増殖と収穫
菌類をDSMZ(German collection of microorgamisms and cells, Braunschweig)から取得し、以下の条件下でプレート上で増殖させた。
ペリプラネタ・アメリカーナを、庭園土壌上、70加羅0%の湿度、25〜30℃で培養した。飼料として、新鮮な野菜を添加したドッグフードを用いた。RNAの単離を、EP0464553に記載のように行った。
RNAの単離を上記のように行った。転写物を逆転写酵素PCR(RT-PCR)により分析した。第1鎖cDNAを、製造業者の説明書に従って、SMART RACE cDNA Amplificationキット(BD-Clontech, Basingstoke, UK)を用いて全RNAから合成した。一本鎖cDNAを以下のプライマーを用いて増幅した。
酵母中での発現および特性評価のために、新規デサチュラーゼ遺伝子のORF配列を、5'末端にKozak配列を付加するプライマーを用いてORF配列を増幅することにより、ベクターpYES2-TOPO(Invitrogen)中にクローニングした(表3)。上記と同じPCRプロトコルを用いた。表4に記載のベクターを作製し、新規デサチュラーゼ遺伝子の機能的特性評価のために用いた。
サッカロミセス・セレビジア株INVSC(Invitrogen)を、表4に記載の構築物または対照としての空のベクター(pYES2-bluntII-TOPO)を用いて形質転換した。形質転換された細胞を、ラフィノースを含む最少培地中で増殖させ、2%ガラクトースを用いて誘導した。48時間の増殖後、全酵母脂肪酸を抽出し、得られたFAMEをGCにより分析した。
植物における新規デサチュラーゼ遺伝子の発現のために、アグロバクテリウム形質転換のためのバイナリープラスミドを設計した。
a)トランスジェニック菜種植物の生成(Moloneyら、1992, Plant Cell Reports, 8:238-242に従う修正プロトコル)
菜種植物の形質転換については、3%サッカロースを補給したMurashige-Skoog培地(MurashigeおよびSkoog 1962 Physiol. Plant. 15, 473)(3MS培地)中で増殖させた陽性形質転換アグロバクテリウムコロニーの一晩培養物の1:50希釈液を用いた。滅菌菜種植物の葉柄(Petiol)または子葉下(Hypocotyledon)を、1:50のアグロバクテリウム希釈液と共に5〜10分間、ペトリ皿中でインキュベートした。次いで、0.8%bacto-Agarを含む3MS培地上、25℃で暗室中、3日間の同時インキュベーションを行った。3日後、培養物を、500 mg/l クラフォラン(セフォタキシム-ナトリウム)、50 mg/lカナマイシン、20μMベンジルアミノプリン(BAP)および1.6 g/lグルコースを含むMS培地上で毎週、16時間明室/8時間暗室上に置いた。成長する芽を、2%サッカロース、250 mg/lクラフォランおよび0.8%Bacto-Agarを含むMS培地に移した。3週間後でも、根の形成は観察されず、根の形成を増強するために、成長ホルモン2-インドールブチル酸を培地に添加した。
ブラシカ・カリナタ系列C90-1163(高エルカ酸系)および10H3(ゼロエルカ酸系)の種子を、形質転換に用いた。Moloneyら(1992)により記載されたプロトコルを、ブラシカ・カリナタの形質転換に用いた。5〜6日齢の苗に由来する子葉、葉柄を切り出し、所望の遺伝子構築物を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス株GV3101を接種し、22℃で2日間同時培養した後、25 mg/Lカナマイシンを含む再生培地に移した。
トランスジェニック亜麻植物の作製を、粒子ボンバードメントを用いるBellら、1999, In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 35(6):456-465の方法に従って実行した。アグロバクテリウム形質転換を、Mlynarovaら(1994), Plant Cell Report 13: 282-285に従って実行することができた。
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構築物LJB1139(配列番号71)のために、トランスジェニックセイヨウアブラナ植物を取得した。種子の脂肪酸分析により、予想された新規脂肪酸が産生されることが示された(図6)。オレイン酸およびリノール酸は、非トランスジェニックセイヨウアブラナ油と比較して、それぞれ、11.7%および2.3%減少した。GLA(24.4%)およびSDA(6.8%)が新規に産生された脂肪酸である。さらに高レベルのEPAを達成することができた(最大21.7%のEPA)。この油は、ヒトの消費および飼料にとって非常に有益な脂肪酸である。有益な脂肪酸組成物を産生する他の遺伝子組合せは、それぞれ、LJB1139においては配列番号23の除去、ならびに配列番号25、27もしくは29の付加である。配列番号11の除去および配列番号133の付加はさらに、別の新規脂肪酸スペクトルをもたらす。
Δ5デサチュラーゼ、Δ6デサチュラーゼおよびΔ6エロンガーゼを含む3種の遺伝子の最小セットが、内因性LA(18:2Δ9,12)およびALA(18:3Δ9,12,15)からのARAおよびEPAの合成にとって必要である。トランスジェニック植物におけるEPA産生に対する、2種の新規デサチュラーゼ遺伝子CpDesXおよびPi-ω3の寄与を定量するために、本発明者らは、3種の遺伝子の最小セットを担持する植物におけるARAおよびEPAの基本レベルを知ることが必要であった。この目的のために、ピチウム・イレグラレ由来Δ6デサチュラーゼ(配列番号9)、トラウストキトリウム種由来Δ5デサチュラーゼ(配列番号13)、およびタラシオシラ・シュードナナ由来Δ6エロンガーゼ(配列番号11)を含む遺伝子構築物Napin-3(図5)を、高エルカ酸ブラシカ・カリナタ系に導入した。Napin-3を担持する植物のトランスジェニック種子中で、GLAおよびSDAはそれぞれ、総脂肪酸の平均17.6%および4.3%であった(表9)。ARAの量は12.2%(平均8.4%)に達し、EPAは2.3%の平均レベル(0.8%〜3.5%の範囲)を有していた。Δ6およびΔ5デサチュラーゼは非常に良好に機能し、その基質変換レベルはそれぞれ、73.7%および85.6%であったが、Δ6エロンガーゼの変換レベルは36.3%であった。新規ω-6脂肪酸(GLA、DGLAおよびAA)の総量は種子脂肪酸の27.5%であったが、ω3脂肪酸(SDA、ETAおよびEPA)は6.9%であり、これはω6経路がω3経路よりも効率的に動作していることを示している。
実施例5に示されたように、様々な遺伝子と調節エレメントを組合わせることにより、様々なブラシカ種の種子油中で有意なレベルの新規脂肪酸を産生させることができる。ARA、EPAおよび/もしくはDHAなどの特殊な脂肪酸のさらなる増加のため、または新規脂肪酸の全体の産生の増加のためには、さらなる遺伝子が必要であり得る。そのようなさらなる遺伝子は、その対応する産生プール(リン脂質、アシル-CoA)からの様々な脂肪酸のシャッフリングにおいて、または新規脂肪酸を様々な分子(ジアシルグリセロール、リゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルセリン、1-アシル-ホスファチジルコリンなど)にエステル化することによる機能を有してもよい。アシルトランスフェラーゼは、上記のようにそのような活性を利用する。過去には、新規脂肪酸の産生を増加させるためのそのような活性を単離するいくつかの手法があった(例えば、WO2004/076617、WO2004/087902)。実施例5に記載の遺伝子と共に上記の遺伝子を形質転換することにより新規遺伝子活性を導入すること以外に、別の方法は過剰発現または下方調節(アンチセンスRNA、逆転RNAまたはmiRNA技術)によるアシルトランスフェラーゼ活性を有する内因性遺伝子の調節である。
BnLPLAT1_AA (ORF 配列番号137)は、BnLPLAT1_A_40 (配列番号102)の変異体である;
BnLPLAT1_CC (ORF 配列番号139)は、BnLPLAT1_C_40 (配列番号104)の変異体である; および
BnLPLAT2_AA (ORF 配列番号135)は、BnLPLAT2_C_50 (配列番号106)の変異体である。
Claims (22)
- a)配列番号1に示される核酸配列を有する核酸;
b)配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸;
c)配列番号1に示される核酸配列と少なくとも95%同一である核酸配列を有する核酸であって、デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記核酸;及び
d)配列番号2に示されるアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸であって、デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記核酸;
から成る群より選択される核酸を含むポリヌクレオチド。 - 請求項1に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 発現ベクターである、請求項2に記載のベクター。
- 前記ポリヌクレオチドが種子特異的プロモーターの制御下にある、請求項3に記載のベクター。
- 種子特異的プロモーターが、コンリニン1、コンリニン2、ナピン、USP、LeB4、Arc、Fae、ACP、LuPXR、SBP及びLuFad3から成る群より選択される、請求項4に記載のベクター。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドを含むか、又は請求項3〜5のいずれか1項に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
- 前記細胞が植物細胞である、請求項6に記載の宿主細胞。
- 前記植物細胞が、油種子作物から得られた細胞である、請求項7に記載の宿主細胞。
- 油種子作物が、亜麻(Linum種)、菜種(Brassica種)、大豆(Glycine及びSoja種)、ヒマワリ(Helianthus種)、綿(Gossypium種)、トウモロコシ(Zea mays)、オリーブ(Olea種)、紅花(Carthamus種)、ココア(Theobroma cacoa)、ピーナッツ(Arachis種)、麻、カメリナ、ハマナ、油ヤシ、ココナッツ、アメリカホドイモ、ゴマ種子、トウゴマの実、ブラッダーポッド、シラキ、シアの実、タングナッツ、カポックの実、ポピー種子、ホホバ種子及びエゴマから成る群より選択される、請求項8に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が微生物細胞である、請求項6に記載の宿主細胞。
- 微生物細胞が、カンジダ、クリプトコッカス、リポミセス、ロドスポリジウム、ヤロウイア、トラウストキトリウム、ピチウム、シゾキトリウム及びクリテコジニウムから成る群より選択される、請求項10に記載の宿主細胞。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチド、請求項2〜5のいずれか1項に記載のベクター若しくは請求項6〜9のいずれか1項に記載の宿主細胞を含む植物又は植物種子。
- 好適な培養培地中で請求項6〜11のいずれか1項に記載の宿主細胞を培養することによって、請求項1に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを製造することを含む、ポリペプチドの製造方法。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
- 不飽和脂肪酸が産生されるように、請求項6〜11のいずれか1項に記載の宿主細胞又は請求項12に記載の植物若しくは植物種子を培養することを含む、不飽和脂肪酸の製造方法。
- 不飽和脂肪酸の産生調節が起こるように、請求項6〜11のいずれか1項に記載の宿主細胞又は請求項12に記載の植物若しくは植物種子を培養することを含む、不飽和脂肪酸の産生を調節する方法。
- 前記方法が、前記培養物から不飽和脂肪酸を回収する工程をさらに含む、請求項15又は16に記載の方法。
- 不飽和脂肪酸が産生されるような条件下で、少なくとも1種のデサチュラーゼ標的分子を含む組成物と、請求項14に記載の少なくとも1種のポリペプチドとを接触させることを含む、不飽和脂肪酸の製造方法。
- デサチュラーゼ標的分子がオレイン酸、リノール酸、γ-リノレン酸、α-リノレン酸、ジホモ-γ-リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸(n-3)、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸及びドコサペンタエン酸である、請求項18に記載の方法。
- 不飽和脂肪酸が、ARA 20:4 (5,8,11,14)、EPA 20:5 (5,8,11,14,17)、及びDHA 22:6 (4,7,10,13,16,19)から成る群より選択される、請求項15〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項15〜20のいずれか1項に記載の方法の工程と、前記不飽和脂肪酸を含む油を調製又は単離する更なる工程とを含む、油の製造方法。
- 宿主細胞、植物又は植物種子に、請求項1に記載のポリヌクレオチド又は請求項2〜5のいずれか1項に記載のベクターを導入することを含む、不飽和脂肪酸を生成することができる宿主細胞、植物又は植物種子の作製方法。
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