JP2002505883A - 新規植物色素体プロモーター配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 アラビドプシス・プラスミドｃｌｐ Ｐ遺伝子のコーディング配列の上流にある５’フランキング領域から単離されたプロモーターを記載する。介在性調節配列を単離するために色素体遺伝子のタンパク質コーディング領域を使用するための新規の方法、及び天然の色素体プロモーターとはヌクレオチド配列が相違する外来色素体プロモーターを使用した、色素体形質転換の効率を改善するための新規の方法も記載する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、植物分子生物学に、そしてより特に、アラビドプシス・サリアナ（
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）（シロイヌナズナ）から単離され
た新規色素体（ｐｌａｓｔｉｄ）プロモーター、及びその使用方法に関する。本
発明は、介在性調節配列（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅｓ）を単離するための、色素体遺伝子のタンパク質コーディング
領域の新規使用方法にも関する。本発明は、さらに、色素体形質転換効率を改善
するための新規プラスチド・プロモーター配列の使用にも関する。

【０００２】 各植物細胞内に存在する数千コピーの環状色素体ゲノムの全ての内に、相同的
組換えにより遺伝子が挿入されるところの、色素体形質転換は、全可溶性植物タ
ンパク質の１０％を超えることができる発現レベルを許容する核発現遺伝子を上
廻る、多数のコピー数という利点を利用する。さらに、色素体形質転換は望まし
い。なぜなら、色素体によりコードされた形質が花粉で伝達されず；これ故、ト
ランスジェニック植物の野生型親類への不慮のトランスジーン逃避という潜在的
なリスクを回避するからである。色素体形質転換の他の利点は、ポリシストロン
単位としての多数の遺伝子の同時発現の実行可能性、及び核形質転換後に生じる
かもしれない位置効果及び遺伝子サイレンシングの除去を含む。色素体形質転換
技術は、米国特許第５，４５１，５１３号、同第５，５４５，８１７号、同第５
，５４５，８１８号、及び同第５，５７６，１９８号；国際出願第ＷＯ９５／１
６７８３号；及び Boyntom et al., Methods in Enzymology 217 : 510-536 (1993), Svab et al
, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 913-917 (1993)、及びMcBride et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 7301-7305 (1994)中に広く記載されている（こ
れら全てを、本願明細書中に援用する）。

【０００３】 タバコ色素体形質転換のための基本的技術は、選択マーカー、例えば、抗生物
質耐性遺伝子に隣接するクローン化された色素体ＤＮＡの領域を用いた、葉組織
の微粒子統を含む。ターゲティング配列といわれる１〜１．５kbのフランキング
領域は、色素体ゲノムとの相同的組換えを容易にし、そしてそれ故、１５６kbの
タバコ・プラストーム（ｐｌａｓｔｏｍｅ）の特定領域の置換又は修飾を許容す
る。初期には、スペクチノマイシン及び／又はストレプトマイシンに対する耐性
を付与する、葉緑体１６Ｓ ｒＲＮＡ及びｒｐｓ １２遺伝子における点変異が
、形質転換のための選択マーカーとして使用された（Svab et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87 : 8526-8530 (1990) ; Staub, J. M., and Maliga, P., Pl
ant Cell 4 : 39-45 (1992) ；両者を本願明細書中に援用する）。これは、標的
葉の１００爆撃当り約１の頻度で安定性ホモプラズミックな形質転換体をもたら
した。上記マーカー間のクロ−ニング部位の存在は、外来遺伝子の導入のための
色素体ターゲティング・ベクターの創製を許容する（Staub, J. M., and Maliga
, P., EMBO J. 12 : 601-606 (1993) 、本願明細書中に援用する）。形質転換頻
度における実質的な増加を、優勢選択マーカー、スペクチノマイシン解毒酵素ア
ミノグリコシド−３’−アデニルトランスフェラーゼをコードするバクテリアの
ａａｄ Ａ遺伝子により、劣性ｒＤＮＡ又はｒ−プロテイン抗生物質耐性遺伝子
を置換することにより得た（Svab et al., 1993)。従来、このマーカーは、緑藻
類のクラミドモナス・レインハードティ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉ
ｎｈａｒｄｔｉｉ）の色素体ゲノムの高頻度形質転換のために首尾よく使用され
てきた（Goldschmidt-Clermont, M., Nacl. Acids Res. 19 : 4083-4089 (1991)
、本願明細書中に援用する）。植物プロトプラストにおける色素体のトランスフ
ェクションに関する技術も記載されている（O'Neill et al., Plant Journal 3
(5) : 729-738 (1993)及びKoop et al., Planta 199 : 193-201 (1996)、両者を
本願明細書中に援用する）。

【０００４】 植物色素体内で外来遺伝子を発現させるために色素体ターゲティング・ベクタ
ー内で使用される特に好ましい植物色素体プロモーターは、ｃｌｐ Ｐ遺伝子プ
ロモータ−である。ｃｌｐ Ｐ遺伝子は、Ｃｌｐ ＡＴＰ依存性プロテアーゼの
タンパク質分解サブユニットをコードし、これは、アラビドプシス（Ａｒａｂｉ
ｄｏｐｓｉｓ）において、光合成及び非光合成植物組織の色素体内で構成的に発
現される（Shanklin et al., The Plant Cell 7 : 1713-1722 (1995)、本願明細
書中に援用する）。ｃｌｐ Ｐは、非光合成植物のゲノム内に保持されている数
種の植物色素体遺伝子の中の１でもあり（例えば、エピファガス・バージエアナ
（Epifagus virginiana) ; Morden et al. EMBO J 10 : 3281-3288 (1991))、そ
してｃｌｐ Ｐメッセージは、検出可能な色素体翻訳活性を欠く、大麦突然変異
体アルボストリアン（ａｌｂｏｓｔｒｉａｎｓ）の色素体内で発現されることが
知られている（Hiibschmann and Boerner, Plant Mol. Biol. 36 : 493-496 (19
98))。これ故、ｃｌｐ Ｐプロモーターは、非緑色色素体内でさえ転写活性であ
るようである。タバコｃｌｐ Ｐ遺伝子からのプロモーター領域の特徴付けは、
ＷＯ９７／０６２５０中に記載されている（本願明細書中に援用する）。この文
献中、タバコｃｌｐ Ｐ遺伝子は、核コードされた色素体（nuclear encoded pl
astid (NEP))ＲＮＡポリメラーゼと色素体コードされた色素体（plastid encode
d plastid (PEP))ＲＮＡポリメラーゼの両者により認識される５’プロモーター
配列をもつと特徴付けられている。（ＡＴＧ翻訳開始コドンから上流にある）−
５３ヌクレオチド位にマッピングされたタバコｃｌｐ Ｐプロモーター配列から
生じた一次転写物が、ｒｐｏ Ｂ遺伝子の欠失に因り色素体コードされたＲＮＡ
ポリメラーゼを欠いたタバコ突然変異体の退色した色素体内で高発現されている
と、ＷＯ９７／０６２５０中に特徴付けされている。

【０００５】 タバコｃｌｐ Ｐプロモーター配列は、タバコの色素体内でのアラビドプシス
のプロトポルフィリノーゲン１Ｘ（Protoporphyrinogen IX(“PROTOX”))遺伝子
の除草剤耐性の発現を駆動するために使用されてきた（ＷＯ９７／３２０１１、
本願明細書中に援用する）。ＧＵＳリポーター遺伝子を置換した同一構築物が、
タバコ色素体内に導入されてきた。これは、ｃｌｐ Ｐ駆動発現が緑色色素体に
限定されず、根色素体（ロイコプラスト（ｌｅｕｃｏｐｌａｓｔｓ）、アミロプ
ラスト（ａｍｙｌｏｐｌａｓｔｓ））及び花色素体（有色体（ｃｈｒｏｍｏｐｌ
ａｓｔｓ））内にも存在することを証明している。

【０００６】 色素体形質転換により示される約束にも拘らず、この技術は、つい最近、タバ
コ以外の植物に適用された。国際出願第ＷＯ９７／３２９７７号（本願明細書中
に援用する）は、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）、例えば、アブラナ（Ｂ
ｒａｓｓｉｃａ）及びシロイヌナズナ（アラビドプシスＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
）内で、葉及び子葉細胞を使用してトランスプラストミック（ｔｒａｎｓｐｌａ
ｓｔｏｍｉｃ）植物のための方法及び組成物を記載している。しかしながら、同
様に必要なのは、アラビドプシスその他の植物種の緑色及び非緑色色素体内での
トランスジーンの発現を駆動するために使用されることができる、タバコ以外の
植物、特にアラビドプシスからの新規色素体プロモーター配列である。

【０００７】 以上の点から、本発明の１の目的は、色素体全タイプ内で機能的であるアラビ
ドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来の新規
色素体プロモーターを提供することである。本発明の他の目的は、新規介在性調
節配列、例えば、新規プロモーター配列又は非翻訳３’又は５’ＲＮＡ配列を単
離するために色素体遺伝子のタンパク質コーディング領域を使用する方法を提供
することである。本発明のさらに他の目的は、色素体ゲノム内の天然ＤＮＡ配列
と、色素体形質転換ベクター中に取り込まれたキメラＤＮＡ断片内に封じ込めら
れた外来ＤＮＡ配列の間の不所望の相同的組換えを減少させることにより色素体
形質転換の効率を改善するために新規の色素体プロモーター配列を使用すること
である。

【０００８】 上記２の他の目的に加えて、本発明は、アラビドプシス色素体ｃｌｐ Ｐ遺伝
子のコーディング配列の上流にある５’フランキング領域から単離された核酸プ
ロモーターを提供する。好ましい態様においては、本発明の核酸プロモーターは
、配列番号１のヌクレオチド番号２６３の下流にあるプロモーター配列に実質的
に類似する。より好ましい態様においては、本発明の核酸プロモーターは、配列
番号１のヌクレオチド番号２６３の下流にあるプロモーター配列と同一の配列を
もつ。さらに他の態様においては、本発明の核酸プロモーターは、配列番号１に
実質的に類似する。さらに他の態様においては、本発明の核酸プロモーターは、
配列番号１内に含まれる。さらに他の態様においては、本発明の核酸プロモータ
ーは、配列番号１の連続した２０塩基対のヌクレオチド部分に配列が同一である
２０塩基対のヌクレオチド部分を含む。本発明は、着目の遺伝子のコーディング
配列に作用可能な状態で連結された本発明の核酸プロモーターを含むキメラ遺伝
子；上記キメラ遺伝子を含む植物形質転換ベクター；及び各々が上記キメラ遺伝
子を含む、トランスジェニック植物、植物細胞、植物種子、植物組織、又は植物
色素体；をも包含する。

【０００９】 他の側面においては、本発明は、２の色素体遺伝子のタンパク質コーディング
領域間から介在性調節ＤＮＡ配列を単離するための新規の方法であって、以下の
ステップ： （ａ）２の色素体遺伝子のタンパク質コーディング領域の、相対的方向及び変
性又は特異的ヌクレオチド配列を決定し； （ｂ）上記２の色素体遺伝子の中の１のタンパク質コーディング領域の決定さ
れた配列に基づき、第１の変性又は特異的ＰＣＲプライマーを設計し； （ｃ）上記２の色素体遺伝子の中の他のタンパク質コーディング領域の決定さ
れた配列に基づき、第２の変性又は特異的ＰＣＲプライマーを設計し；そして （ｄ）上記ステップ（ｂ）と（ｃ）のプライマーを使用して、ＤＮＡ断片を増
幅する、 を含み、これにより、増幅されたＤＮＡ断片が、上記２の色素体遺伝子のタンパ
ク質コーディング領域間からの介在性調節ＤＮＡ配列を含む、前記方法。上記方
法の好ましい態様においては、上記２の色素体遺伝子は、ｃｌｐ Ｐ遺伝子とｐ
ｓｂ Ｂ遺伝子である。この態様に従えば、上記介在性調節ＤＮＡ配列はｃｌｐ
Ｐプロモーターを含む。上記方法の他の好ましい態様においては、上記２の色
素体遺伝子は、１６Ｓ ｒＲＮＡとバリンｔＲＮＡ遺伝子である。この態様に従
えば、上記介在性調節ＤＮＡ配列は１６Ｓ ｒＲＮＡプロモーターを含む。

【００１０】 さらに他の側面においては、本発明は改良された色素体形質転換方法であって
、着目のコーディング配列に作用可能な状態で連結された色素体活性調節配列を
含むキメラ遺伝子により、宿主植物種の色素体を形質転換させ、ここで、上記調
節配列が、宿主植物色素体内の対応の天然調節配列に約９０％未満同一であるヌ
クレオチド配列をもち、これにより、上記キメラ遺伝子内の調節配列と、上記宿
主植物色素体内の対応の天然調節配列の間の不所望の体細胞性組換えが減少され
る、前記方法を提供する。上記方法の好ましい態様においては、上記キメラ遺伝
子は、上記宿主植物種の色素体ゲノムから単離され、そして上記調節配列のヌク
レオチドの少なくとも約１０％が突然変異されている。上記方法の他の好ましい
態様においては、上記キメラ遺伝子内の調節配列は、上記宿主植物種とは異なる
植物種の色素体ゲノムから単離される。例えば、上記キメラ遺伝子内の調節配列
は、アラビドプシスの色素体ゲノムから単離されることができる。１の特に好ま
しい態様においては、上記キメラ遺伝子内の調節配列は、アラビドプシスｃｌｐ
Ｐ遺伝子のコーディング配列の上流にある５’フランキング領域から単離され
た核酸プロモーターである。他の特に好ましい態様においては、上記キメラ遺伝
子内の調節配列は、アラビドプシス １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコーディング配
列の上流にある５’フランキング領域から単離された核酸プロモーターである。

【００１１】 本発明の他の目的及び利点は、本発明の以下の説明及び非限定的な例の研究か
ら当業者に明らかとなるであろう。 配列表中の配列の説明 配列番号１は、アラビドプシスｃｌｐ Ｐ遺伝子プロモーター領域のヌクレオ
チド配列である。

【００１２】 配列番号２は、実施例１において使用したプライマーＡ ｃｌｐ Ｐである。 配列番号３は、実施例１において使用したプライマーＡ ｐｓｂ Ｂである。 配列番号４は、実施例２において使用したプライマーＡｃｌｐ Ｐ １ａであ
る。 配列番号５は、実施例２において使用したプライマーＡｃｌｐ Ｐ ２ｂであ
る。

【００１３】 配列番号６は、実施例２において使用したプライマーｒｐｓ１６Ｐ １ａであ
る。 配列番号７は、実施例２において使用したプライマーｒｐｓ１６Ｐ １ｂであ
る。 配列番号８は、実施例３において使用した上鎖（ｔｏｐ−ｓｔｒａｎｄ）プラ
イマーである。

【００１４】 配列番号９は、実施例３において使用した下鎖（ｂｏｔｔｏｍ−ｓｔｒａｎｄ
）プライマーである。 配列番号１０は、アラビドプシス １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子プロモーター領域
のヌクレオチド配列である。 配列番号１１は、実施例４において使用した上鎖プライマーである。

【００１５】 配列番号１２は、実施例４において使用した下鎖プライマーである。 定義 明確にするために、本明細書中に使用する特定の用語を以下のように定義し、
そして提示する： 会合している（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）／作用可能な状態で連結さ
れた（Ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ Ｌｉｎｋｅｄ）とは：物理的又は機能的に関係
した２つの核酸配列をいう。例えば、プロモーター又は調節ＤＮＡ配列は、上記
２の配列が、上記調節ＤＮＡ配列がコーディング又は構造ＤＮＡ配列の発現レベ
ルに影響するように、作用可能な状態で連結され、又は配置されている場合に、
ＲＮＡ又はタンパク質をコードするＤＮＡ配列と“会合している”といわれる。

【００１６】 キメラ遺伝子／融合配列：調節核酸配列が、会合している核酸配列の転写又は
発現を調節することができるように、プロモーター又は調節核酸配列が、ｍＲＮ
Ａをコードし、又はタンパク質として発現される核酸配列に、作用可能な状態で
連結され、又は会合されているような、組換え核酸配列。上記キメラ遺伝子の調
節核酸配列は、通常、天然に存在するような会合している核酸配列に作用可能な
状態で連結されていない。

【００１７】 コーディング配列：ＲＮＡに転写される核酸配列、例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮ
Ａ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、センスＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ。好ましくは
、このＲＮＡは、その後、タンパク質を生成するために生物内で翻訳される。 遺伝子：ゲノム内に位置し、そして上述のコーディング配列に加えて、他の、
１次調節性の、上記コーディング部分の発現、すなわち、転写及び翻訳、の制御
に責任を負う配列を含む所定の領域。遺伝子は、他の５’及び３’非翻訳配列、
及び終結配列を含むこともできる。さらに、存在することができる要素は、例え
ば、イントロンである。

【００１８】 着目の遺伝子：植物に移入されたとき、その植物に対し、所望の特性、例えば
、抗生物質耐性、ウイルス耐性、昆虫（ｉｎｓｅｃｔ）耐性、病気耐性、又は他
の害虫に対する耐性、除草剤耐性、改善された栄養価、工業プロセスにおける改
良された性能、又は変更された再生産能力を付与する遺伝子。“着目の遺伝子（
ｓｅｎｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）”は、植物内での商業的に価値のある酵素
又は代謝産物の製造のために、植物に移入されるものであってもよい。

【００１９】 異種（Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）核酸配列：その中にそれが導入されている
ところの宿主ゲノムと自然には会合していない核酸配列であって、天然核酸配列
の非天然多コピー（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｐｉｅｓ）を含むもの。 同種（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）核酸配列：その中にそれが導入されているとこ
ろの宿主ゲノムと天然に会合している核酸配列。

【００２０】 相同的組換え：相同（同種）核酸分子間の核酸断片の双方の交換。 単離された：本発明の文脈においては、単離された核酸分子又は単離された酵
素は、ヒトの手により、その天然の環境から離れて存在し、そしてそれ故、天然
物ではない、核酸分子又は酵素である。単離された核酸分子又は酵素は、精製さ
れた形態で存在し、又は非天然環境、例えば、トランスジェニック宿主細胞内で
存在することができる。

【００２１】 最小プロモーター：上流の活性化の不存在下で、不活性であるか又はかなり低
下したプロモーター活性を有する、プロモーター要素。好適な転写因子の存在下
、上記最小プロモーターは、転写を許容するように働く。 核酸分子／核酸配列：いずれかの源から単離されることができる、１本鎖又は
２本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの線状セグメント。本発明の文脈においては、上記核酸
は、好ましくは、ＤＮＡのセグメントである。

【００２２】 植物：発達のいずれかの段階におけるいずれかの植物、特に種子植物。 植物細胞：プロトプラスト及び細胞壁を含む、植物の構造的及び生理学的単位
。上記植物細胞は、単離された単一細胞又は培養細胞の形態で、又は、高度に組
織化された単位の一部、例えば、植物組織、植物器官、又は植物全体として、存
在することができる。

【００２３】 植物細胞培養物（Ｃｕｌｔｕｒｅ）：植物単位、例えば、プロトプラスト、細
胞培養の細胞、植物組織中の細胞、花粉、花粉管、胚珠（ｏｖｕｌｅｓ）、胚嚢
（ｅｍｂｒｙｏ ｓａｃｓ）、接合子（ｚｙｇｏｔｅｓ）、及び各発達段階にお
ける胚（ｅｍｂｒｙｏｓ）の培養物。 植物材料：葉、茎、根、花又は花の部分、果実、花粉、卵細胞、接合子、種子
、挿木（ｃｕｔｔｉｎｇｓ）、細胞又は組織培養物、又は植物のいずれかの他の
部分又は果実。

【００２４】 植物器官：植物の別個の及び目に見える構造の及び分化した部分、例えば、根
、茎、葉、花芽（ｆｌｏｗｅｒ ｂｕｄ）、又は胚。 植物組織：本明細書中に使用するとき、構造的及び機能的単位に組織化された
植物細胞の一群。栽培された（ｉｎ ｐｌａｎｔａ）又は培養された（ｉｎ ｃ
ｕｌｔｕｒｅ）植物の組織を含む。この用語は、非限定的に、植物全体、植物器
官、植物種子、組織培養物、及び構造的及び／又は機能的単位に組織化された植
物細胞の群を含む。この定義に包含される先に又はその他に列記されたいずれか
の特定タイプの植物組織と共に、又は非存在下で、この用語の使用は、いずれか
の他のタイプの植物組織に限られたものであると意図されない。

【００２５】 プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼIIのための結合部位を含み、そしてＤＮＡ
の転写を開始させる、コーディング領域の上流にある非翻訳ＤＮＡ配列。プロモ
ーター領域は、遺伝子発現のレギュレーターとして作用する他の要素を含んでも
よい。 プロトプラスト：細胞壁をもたないか又はその一部だけをもつ、単離された植
物細胞。

【００２６】 調節配列：タンパク質又は他の遺伝子産物をコードする会合している構造的核
酸配列の、転写、翻訳又は発現を助け、高め、又は他の方法で影響を及ぼす非翻
訳核酸配列。調節配列はプロモーターを含む。プロモーター配列は、通常、翻訳
された配列の５’末端に位置し、典型的には、翻訳開始部位の５’末端から２０
〜１００ヌクレオチド離れて位置する。調節配列は、コーディング配列の５’及
び３’側に置かれた、転写されるが翻訳されない核酸配列を含んでもよい。これ
らの非翻訳ＲＮＡは、典型的には、遺伝子発現の翻訳後調節に関与する。

【００２７】 実質的に類似（Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ Ｓｉｍｉｌａｒ）：核酸に関し
て、引用核酸分子と少なくとも６０％の配列同一性を有する核酸分子。好ましい
態様においては、実質的に類似のＤＮＡ配列は、引用ＤＮＡ配列と少なくとも８
０％同一である；より好ましい態様においては、実質的に類似のＤＮＡ配列は、
引用ＤＮＡ配列に少なくとも９０％同一である；そして最も好ましい態様におい
ては、実質的に類似のＤＮＡ配列は、引用ＤＮＡ配列に少なくとも９５％同一で
ある。実質的に類似のヌクレオチド配列は、典型的には、以下の条件：５０℃、
７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ），０．５Ｍ ＮａＰＯ₄ pH７．０，１
mM ＥＤＴＡにおけるハイブリダイゼーション；５０℃，２×ＳＳＣ，１％ＳＤ
Ｓによる洗浄、の下、引用核酸分子、又はその断片に、ハイブリダイズする。タ
ンパク質又はペプチドに関しては、実質的類似のアミノ酸配列は、引用タンパク
質又はペプチドのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、そしてその引用
タンパク質又はペプチドと実質的に同一の活性を有する、アミノ酸配列である。

【００２８】 耐性：インヒビター又は除草剤に晒されたとき、正常な成長を続け又は機能す
る能力。 形質転換：植物色素体を含む、細胞、組織、又は植物内に異種ＤＮＡを導入す
る過程。形質転換された細胞、組織、又は植物は、形質転換過程の最終生成物だ
けでなく、そのトランスジェニック子孫を包含すると理解される。

【００２９】 形質転換された／トランスジェニック／組換え体とは：その中の異種核酸分子
が導入されているところの、宿主生物、例えば、バクテリア又は植物をいう。上
記核酸分子は、宿主のゲノム内に安定して組み込まれることができ、そして上記
核酸分子は、染色体外分子として存在することもできる。このような染色体外分
子は、自律複製性であることができる。形質転換された細胞、組織、又は植物は
、形質転換過程の最終生成物だけでなく、そのトランスジェニック子孫をも包含
すると理解される。“非形質転換”、“非トランスジェニック”、又は“非組換
え体”宿主は、異種核酸分子を含まない、野生型の生物、例えば、バクテリア又
は植物をいう。

【００３０】 ヌクレオチドは、以下の標準的な略号により、それらの塩基により示される：
アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及びグアニン（Ｇ）。アミノ
酸も同様に、以下の標準的な略号により示される：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、ア
ルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓ
ｐ；Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グルタミン
酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソ
ロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メ
チオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ
；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（
Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、及びバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。さらに、
（Ｘａａ；Ｘ）は、いずれかのアミノ酸を表す。

【００３１】 本発明は、Ｃｌｐ ＡＴＰ依存性プロテアーゼの植物同族体をコードするアラ
ビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）色素体ゲ
ノムからのｃｌｐ Ｐ遺伝子のためのプロモーター領域を提供する。開示された
プロモーターは、トランスジェニック植物の色素体内での、選択マーカー遺伝子
又はいずれかの他の着目の遺伝子のためのコーディング配列の発現を駆動するた
めに使用されることができる。本発明のプロモーターは、緑色及び非緑色の色素
体の両者の内でのトランスジーンの構成的発現のために有用であり、そしてそれ
故、その中で再生可能な形質転換体の選択が非緑色組織内での選択を要求すると
ころの、植物、例えばトウモロコシ（ｍａｉｚｅ）内での色素体形質転換のため
に特に有用である。

【００３２】 本発明のアラビドプシスｃｌｐ Ｐプロモーターは、本分野において知られた
方法、特に、以下の：米国特許第５，４５１，５１３号、同第５，５４５，８１
７号、同第５，５４５，８１８号、及び同第５，５７６，１９８号；国際特許出
願第ＷＯ９５／１６７８３号、同第ＷＯ９７／３２０１１号、及び同第ＷＯ９７
／３２９７７号；及びSvab et al. (1993)及びMcBride et al. (1994) に従って
、色素体形質転換ベクター内に組み込まれ、そして色素体内に形質転換されるこ
とができる。

【００３３】 本発明は、新規介在性調節配列、例えば、新規プロモーター、又は３’又は５
’ＵＴＲ’ｓを単離するために、色素体遺伝子のタンパク質コーディング領域を
使用する新規の方法をも提供する。このような方法は、以下の実施例中に詳細に
記載するように、アラビドプシス色素体ｃｌｐ Ｐプロモーター領域及びアラビ
ドプシス色素体１６Ｓ ｒＲＮＡプロモーター領域を単離するための、本願出願
人の技術により例示される。簡単に言えば、上記プロモーター領域の単離は、ア
ラビドプシス色素体ゲノム内の遺伝子の順番が、それについて色素体ゲノム配列
の全体が知られているところのニコチアーナ・タバガ（タバコＮｉｃｏｔｉａｎ
ａ ｔａｂａｃｕｍ）の順番に対して保存されている偶然により容易にされる。
タバコにおいては、ｃｌｐ Ｐは、そのコーディング配列が多数の植物種の間で
保存されているところのｐｓｂ Ｂ遺伝子とは異なった方向において存在する。
ほんの４４５塩基対が、タバコにおけるｃｌｐ Ｐ異なった方向の開始コドンか
ら、ｐｓｂ Ｂの開始コドンを分けているので、分岐したｃｌｐ Ｐとｐｓｂ
Ｂ遺伝子のタンパク質コーディング領域の配列が、上記遺伝子間の非コーディン
グ遺伝子間領域を増幅するためのＰＣＲのためのプライマーを設計するために使
用される。この領域は、１の方向においてｐｓｂ Ｂのためのプライマーを、そ
して他の方向においてｃｌｐ Ｐのためのプライマーを含む。アラビドプシス由
来の発現された配列タグ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ（Ｅ
ＳＴ））が、ｃｌｐ Ｐコーディング配列と５’非翻訳ＲＮＡ（５’ＵＴＲ）の
一部を含むようである、ＥＳＴデータベース中に存在する。このＥＳＴの配列は
、ｃｌｐ Ｐタンパク質の推定開始部をコードするアラビドプシスＤＮＡ配列に
基づき、ｃｌｐ ＰプロモーターのＰＣＲ増幅のためのプライマーを設計するた
めに使用される。これらプライマーは、ｐｓｂ Ｂ開始コドンの周囲に高保存さ
れたＤＮＡ配列にマッチするように設計されたものと対とされた。上記プライマ
ーを使用して、アラビドプシス色素体ｃｌｐ Ｐプロモーター領域を含む、約５
００ヌクレオチドのＤＮＡ断片を、アラビドプシスの全ＤＮＡから増幅した。ア
ラビドプシス色素体１６Ｓ ｒＲＮＡプロモーター領域を含むＤＮＡ断片を、同
様のやり方で増幅する。

【００３４】 上記の方法を使用して、当業者は、いずれかの植物の色素体ゲノムから、介在
性非翻訳配列、例えば、プロモーターその他の調節配列を単離するために、２つ
の近接する色素体遺伝子のタンパク質コーディング領域を使用することができる
。好ましくは、上記２の色素体遺伝子は、その２つの近接色素体遺伝子間に他の
転写配列が存在しないという点で、隣接している；しかしながら、上記２の近接
色素体遺伝子間の増幅された領域内に、小さな遺伝子、例えば、ｔＲＮＡをコー
ドする遺伝子がたとえ存在したとしても、上記の方法は働くであろうと予想され
る。好ましい態様においては、当業者は、いずれかの植物の色素体ゲノムから色
素体ｃｌｐ Ｐプロモーターを単離するために上記の方法を使用することができ
る。他の好ましい態様においては、当業者は、いずれかの植物の色素体ゲノムか
ら色素体１６Ｓ ｒＲＮＡプロモーターを単離するために上記の方法を使用する
ことができる。

【００３５】 本発明はさらに、色素体ゲノム内の天然ＤＮＡ配列と、色素体形質転換ベクタ
ー内に取り込まれたキメラＤＮＡ断片内に封じ込められた外来ＤＮＡ配列の間の
、不所望の組換えを減少させることにより、色素体形質転換の効率を改善するた
めに、新規色素体プロモーター、例えば、アラビドプシス色素体ｃｌｐ Ｐ又は
１６Ｓ ｒＲＮＡプロモーターを使用する方法を提供する。色素体ゲノム内の天
然ＤＮＡ配列と外来ＤＮＡ配列の間の比較的短い相同領域でさえ、色素体形質転
換体における体細胞性の組換えを最終的に引き起こすであろうということが知ら
れている。この生物学的特性は、選択マーカーに、同一の反復された異種ＤＮＡ
配列を隣接して置くことにより、緑藻類クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏ
ｎａｓ）の葉緑体内における色素体形質転換体から選択マーカーを除去するため
の手段として使用されてきた。要求されるホモロジーの最小サイズの広がり（ｔ
ｒａｃｔ）と、組換えに十分な特定のホモロジーの広がりの内の正確な配列同一
性の程度のいずれも同定されていないけれども、色素体ゲノムに対して５０bp程
の小さなホモロジーが組換えを誘導するために十分であることができる。これら
の組換え事件は、その中で色素体ゲノムの再編成が生じているところの細胞の分
裂から生じる葉の中の青白いセクターとして、トランスジェニック植物内で観察
される。極端な場合、その結果は、体細胞及びそれらの系統の大部分において生
じる組換えを示す、小さな緑色の斑をもつ、白色に近い葉である。

【００３６】 非組換え原性調節配列（例えば、プロモーター、及び５’及び３’ＵＴＲ’ｓ
）の本質的特徴は、着目の植物種の色素体内で異種遺伝子発現を正確に制御する
ように働く能力と、相同的色素体組換えを促進するために十分な配列同一性の欠
如の両者を含む。後者の特性は、８５％未満〜９０％の同一性まで配列が異なっ
ている。異なる植物種の色素体ゲノムから得られた異種調節配列を使用するか、
又は同一植物種の色素体ゲノムから得られた天然の調節配列を十分に突然変異誘
発させることによるかのいずれかにより、達成されることができる。１の態様に
おいては、本方法は、異種植物種、例えば、タバコ、トウモロコシ、米、大豆、
トマト、ポテト、その他の色素体内で着目の遺伝子の転写を指令するために本願
発明のアラブドプシスｃｌｐ Ｐプロモーターを使用することを含む。他の態様
においては、本方法は、異種植物種、例えば、タバコ、トウモロコシ、米、大豆
、トマト、ポテトその他の色素体内で着目の遺伝子の転写を指令するために、実
施例中に記載されたアラビドプシス１６Ｓ ｒＲＮＡプロモーターを使用するこ
とを含む。高等植物色素体遺伝子に加えて、色素体トランスジーンの非組換原性
調節のために有用な異種プロモーター、又は５’及び３’ＵＴＲ’ｓは、下等植
物又は藻類の色素体遺伝子、シアノバクテリアの染色体遺伝子、又は植物又は藻
類の葉緑体又はシアノバクテリアの細胞に感染するウイルスのゲノムからも得る
ことができる。

【００３７】 不所望の組換えを行うことができない、同一植物からの突然変異した天然遺伝
子の選択は、その配列同一性がその出発配列に対して高くとも９０％まで減少さ
れるような、調節配列のランダム突然変異誘発により容易にされる。 次に、ランダム突然変異された調節配列のプールを、色素体内で働く選択マー
カー遺伝子の上流にある各突然変異体をクローニングし、そしてその後、キメラ
ＤＮＡのプールの全体を野生型植物の色素体内に形質転換することにより、未だ
色素体活性（ｐｌａｓｔｉｄ−ａｃｔｉｖｅ）である（植物色素体内で正常に働
くことができる）サブセットについて、選択する。色素体内で未だ働くことがで
きる突然変異された配列だけが、トランスジェニック植物内での選択マーカーの
発現をもたらすであろう。選択マーカーを発現しているトランスジェニック植物
を、葉のセクタリングの頻度を観察することにより体細胞組換えについても評価
する。選択マーカーを発現し、そして所望の頻度の葉のセクタリングをもつ形質
転換植物の色素体ゲノムの標的化された領域を、次に、突然変異した調節配列が
存在するかどうかを決定するために配列決定する。従って、上記の突然変異した
配列は、着目の遺伝子の色素体内での発現を制御し、そして不所望の組換えの頻
度を減少させるために十分な、天然色素体ＤＮＡ配列に対する配列の相違を有す
る、基準に適合している。

【００３８】 実施例 本願発明を、以下の詳細な実施例を参照することによりさらに説明する。これ
らの実施例は、説明だけを目的とするものであって、特にことわらない限り限定
するものとして意図されていない。ここで使用する標準的な組換えＤＮＡ及び分
子クローニング技術は、本分野において周知であり、そしてAusubel (ed.), Cur rent Protocols in Molecular Biology , John wiley and sons, Inc. (1994) ;
T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning : A Labora
tory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989
) ; 及びT. J. Silhavy, M. L. Berman, and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (19
84) により記載されている。

【００３９】 実施例１：アラビドプシスｃｌｐ Ｐプロモーター領域の単離 アラビドプシスｃｌｐ Ｐプロモーター領域の単離は、アラビドプシス色素体
ゲノム内の遺伝子順番が、その色素体ゲノム配列の全体がそれについて知られて
いるところの、ニコテアーナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ
）の順番に比べて保存されている偶然により、容易にされる。タバコにおいては
、ｃｌｐ Ｐは、多くの植物種から配列決定されており、そして配列が保存され
ていることが示されている。ｐｓｂ Ｂ遺伝子とは異なる方向において存在する
。タバコ、トウモロコシ、小麦、及びニコチアナ・アキュミナ（Ｎｉｃｏｔｉａ
ｎａ ａｃｕｍｉａ）のｐｓｂ Ｂ配列の整列は、それらのＤＮＡコーディング
配列のように最初の８つのアミノ酸が同一に保存されていることを示している。
タバコにおいては、たった４４５塩基対が、ｃｌｐ Ｐの異なる方向の開始コド
ンからｐｓｂ Ｂ開始コドンを分けている。

【００４０】 以上の点から、本願出願人は、分岐したｃｌｐ Ｐとｐｓｂ Ｂ遺伝子のタン
パク質コーディング領域の配列が、上記遺伝子間の非コーディング遺伝子間領域
を増幅することができるであろう、ＰＣＲのためのプライマーを設計するために
使用されることができるということを推論する。この領域は、理論的には、１方
向においてｐｓｂ Ｂのためのプロモーターを、そして他の方向においてｃｌｐ
Ｐのためのプロモーターを含むであろう。アラビドプシスからの発現された配
列タグ（ＥＳＴ）配列は、ｃｌｐ Ｐコーディング配列の一部と５’非翻訳ＲＮ
Ａ（５’ＵＴＲ）を含むと思われるＴＩＧＲ ＮＨＣ ＡｔＥＳＴデータベース
（http : // www. tigr. org) 内に存在する。この配列の推定翻訳は、大腸菌（
Ｅ．ｃｏｌｉ）の成熟ｃｌｐ Ｐに類似し、そしてこれ故、色素体輸送ペプチド
を含まないようであるので、このＥＳＴ（ＴＩＧＲ ＮＨＣ ＡｔＥＳＴデータ
ベースからの配列番号＃Ｐ ３９８２）が色素体ｃｌｐ Ｐメッセージの一部を
表すと推論される。しかしながら、Shanklin et al. (1995)は、核コードされた
ｃｌｐ Ｐ同族体がアラブドプシス内に存在するかもしれないということを示唆
しているので、本願出願人は、真正な色素体コードされた遺伝子の代わりに、こ
れらのものの発見に用心している。定義によるＥＳＴは、発現されたメッセージ
から生じるので、ＥＳＴＰ ３９８２は、転写されていないｃｌｐ Ｐプロモー
ター領域のいずれをも含まないと予想される。

【００４１】 ＥＳＴＰ ３９８２のヌクレオチド配列は、アラビドプシス植物内のｃｌｐ
Ｐタンパク質の開始をコードするアラビドプシスＤＮＡ配列に基づき、ｃｌｐ
ＰプロモーターのＰＣＲ増幅のためのプライマーを設計するために使用される。
これらのプライマーは、アラビドプシス内で同様に保存されていると本願出願人
が推論する、ｐｓｂ Ｂ開始コドン付近の高保存ＤＮＡ配列にマッチするように
設計されたものと対とされる。使用されたプライマーは： Ａ ｃｌｐ Ｐ：5'-AAGGGACTTTTGGAACGCCAATAGGCAT-3'（配列番号２）、及び Ａ ｐｓｂ Ｂ：5'-CACGATACCAAGGCAAACCCATGGA-3'(配列番号３）である。

【００４２】 これらは、ｐｆｕ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用して、Ａ．サリアナ（Ａ
．ｔｈａｌｉａｎａ）（ｃｖ“Ｌａｎｄｓｂｕｒｇ ｅｒｅｃｔａ”）の全ＤＮ
Ａからの約５００ヌクレオチドのＤＮＡ断片を首尾よく増幅する。平滑末端ＤＮ
Ａ断片は、（上記クローニング・プライマーを使用して）直接的に、そしてプラ
スミド ｐＰＨ１４６ｂを構築するためにベクターｐＧＥＭ５Ｚｆ（−）のＥｃ
ｏＲＶ部位内へのクローニングの後に、配列決定される。この約５００bpのＰＣ
Ｒ断片のヌクレオチド配列を配列番号１に与える。配列分析は、ｃｌｐ Ｐ開始
コドンの上流に延びる２００bp領域を超えるタバコｃｌｐ Ｐプロモーター領域
に対する８６％の配列同一性を表した。従って、配列番号１は、アラビドプシス
のｃｌｐ Ｐプロモーター領域を含む。

【００４３】 実施例２：色素体形質転換ベクタ−内に、ＧＵＳリポーター遺伝子に融合され
たアラビドプシスｃｌｐ Ｐプロモーター及び天然ｃｌｐ Ｐ５’非翻訳配列と
、タバコ色素体ｒｐｓ １６遺伝子３’非翻訳配列を含むキメラ遺伝子の調製 Ｉ．アラビドプシス色素体ｃｌｐ Ｐ遺伝子プロモーターと完全５’非翻訳Ｒ
ＮＡ（５’ＵＴＲ）の増幅 プラスミドｐＰＨ１４６ｂからのＤＮＡを、アラビドプシス色素体ｃｌｐ Ｐ
遺伝子のＡＴＧ開始コドンに対して−２３４位にある、導入されたＥｃｏＲＩ制
限部位を含む、左から右への“上鎖”プライマー（配列番号１のヌクレオチド番
号２６３）（プライマーＡｃｌｐ Ｐ １ａ：5'GCGGAATTCATCATTCAGAAGCCCGTTC
GT-3'(配列番号４；下線はＥｃｏＲＩ制限部位））及び翻訳開始における、導入
されたＢｓｐＨＩ制限部位を取り込んでいるｃｌｐ ＰプロモーターのＡＴＧ開
始コドンに対して−２１から−１までの領域に相同である、右から左への“下鎖
”プライマー（プライマーＡｃｌｐ Ｐ ２ｂ：5'-GCGTCATGAAATGAAAGAAAAAGAG
AAT-3'（配列番号５；下線はＢｓｐＨＩ制限部位））を用いたＰＣＲのための鋳
型として使用する。このＰＣＲ反応は、以下の：７分間９５℃、その後の、４サ
イクルの、１分間９５℃／２分間４３℃／１分間７２℃、次の、２５サイクルの
、１分間９５℃／２分間５５℃／１分間７２℃のような、製造者の推奨（Perkin
Elmer/Roche, Branchburg, NJ) に従って、Perkin Elmer Thermal Cycler 480
内で、Ｐｆｕ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla CA)を用いて
企てられた。タバコｃｌｐ Ｐ配列５’ＵＴＲに対応するようにＡＴＧ近付に２
つの修飾をもつ、その左端にＥｃｏＲＩ部位を、そしてその右端にＢｓｐＨＩ部
位を含む、アラビドプシスｃｌｐ Ｐ遺伝子のプロモーター及び５’非翻訳領域
を含む２５０bpの増幅生成物を、標準的な手順を使用してゲル精製し、そしてＥ
ｃｏＲＩとＢｓｐＨＩにより消化した（全ての制限酵素をNew England Biolabs,
Beverly, MAから購入することができる）。

【００４４】 II．タバコ色素体ｒｐｓ １６遺伝子３’非翻訳ＲＮＡ配列（３’ＵＴＲ）の
増幅 N. tabacum c.v. “Xanthi NC ”からの全ＤＮＡを、リボソーム・タンパク質
Ｓ１６をコードしている色素体ｒｐｓ １６遺伝子のＴＡＡ終結コドン直後の、
導入されたＸｂａｌ制限部位を含む左から右への“上鎖”プライマー（プライマ
ーｒｐｓ １６Ｐ １ａ：5'-GCGTCTAGATCAACCGAAATTCAATTAAGG-3'（配列番号６
；下線はＸｂａｌ制限部位））及びｒｐｓ １６の３’ＵＴＲの３’末端におけ
る、導入されたＨｉｎｄIII 制限部位を取り込んでいるｒｐｓ １６のＴＡＡ終
結コドンに対して＋１３４から１５１までの領域に相同な、右から左への“下鎖
”プライマー（プライマーｒｐｓ １６Ｐ １ｂ：5'-CGCAAGCTTCAATGGAAGCAATG
ATAA-3'(配列番号７；下線はＨｉｎｄIII 制限部位））を用いた、上記のような
ＰＣＲのための鋳型として使用する。その左端にＸｂａｌ部位を、そしてその右
端にＨｉｎｄIII 部位を含むｒｐｓ １６遺伝子の３’非翻訳領域を含み、そし
てＮ．ｔａｂａｃｕｍ色素体配列のヌクレオチド４９４３〜５０９３に対応する
領域（Shinozaki et al., 1986) を含む、増幅生成物を、ゲル精製し、そしてＸ
ｂａＩとＨｉｎｄIII で消化する。

【００４５】 III ．ｃｌｐ Ｐ遺伝子プロモーター並びに５’及び３’ＵＴＲ’ｓへのＧＵ
Ｓリポーター遺伝子断片のライゲーション ＡＴＧ開始コドンにおいてＮｃｏＩ制限部位を、そして天然３’ＵＴＲ後にＸ
ｂａＩ部位を含む、プラスミドｐＲＡＪ２７５（Ｃｌｏｎｔｃｈ）から得られた
１８６４bpのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）リポーター遺伝子断片を、Ｎｃｏ
ＩとＸｂａＩによる消化により作った。この断片を、２５０bpのＥｃｏＲＩ／Ｂ
ｓｐＨＩアラビドプシスｃｌｐ Ｐプロモーター断片、１５７bpのＸｂａＩ／Ｈ
ｉｎｄIII タバコｒｐｓ１６の３’ＵＴＲ断片、及び３１４８bpの、クローニン
グ・ベクターｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）（Promega, Madison WI)からのＥｃｏＲＩ／
ＨｉｎｄIII 断片への４方反応においてライゲートして、プラスミドｐＰＨ１６
５を構築する。色素体形質転換ベクターｐＰＨ１６６を、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ
III でプラスミドｐＰＲＶIII ａ（Zoubenko et al. 1994) を消化し、そして得
られた７２８７bp断片を、ｐＰＨ１６５の２２２２bpのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄII
I 断片にライゲートすることにより、構築する。

【００４６】 実施例３：アラビドプシス１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子プロモーター領域の単離 アラビドプシス１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子プロモーター領域の単離は、アラビド
プシス色素体ゲノム内の遺伝子の順番が、その全色素体ゲノムが知られていると
ころの植物であるＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの順番に対して保存され
ている偶然により、容易にされる。シナピス・アルバ（Ｓｉｎａｐｉｓ ａｌｂ
ａ；カラシ）、アラビドプシスにひじょうに近い種においては、１６Ｓ ｒＲＮ
Ａ遺伝子とバリンｔＲＮＡは、タバコにおけるものと同じ方向をもつ（ＧｅｎＢ
ａｎｋ寄託番号ＣＨＳＡＲＲＮＩ）。アラビドプシス１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子プ
ロモーター領域を、鋳型として全A. thaliana (cv “Landsburg erecta”) を、
そしてNicotiana とSinapis albaの両者内で保存されている以下のプライマー：
“上鎖”プライマー（5'-CAGTTCGAGCCTGATTATCC-3'（配列番号８））と“下鎖”
プライマー（5'-GTTCTTACGCGTTACTCACC-3'（配列番号９））を使用して、ＰＣＲ
増幅（Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ、Stratagene, La Jolla, CA)
により単離する。タバコ色素体ゲノムのヌクレオチド１０２５０８〜１０２８７
２に対応するアラビドプシス１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子プロモーター領域（Shinoz
aki et al., 1986) を含む、予想される３７９bpの（Ｓｉｎａｐｉｓ ａｌｂａ
配列に基づく）増幅生成物を、ｐＧＥＭ５Ｚｆ（−）（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＥｃ
ｏＲＶ部位に平滑末端ライゲートして、ｐＡｒａｂ １６Ｓを構築し、そしてタ
バコ１６Ｓ ｒＲＮＡプロモーターに対する、配列分析及び比較を行う。アラビ
ドプシス１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子プロモーター領域成分は３６９bpであり、そし
て配列番号１０として記載する。

【００４７】 実施例４：色素体形質転換ベクター内に、アラビドプシス１６Ｓ ｒＲＮＡ遺
伝子プロモーター及びタバコｒｂｃ Ｌ遺伝子のリボソーム結合性部位に融合さ
れた天然５’非翻訳配列、ＧＵＳリポーター遺伝子、並びにタバコ色素体ｒｐｓ
１６遺伝子３’非翻訳配列を含む、キメラ遺伝子の調製 Ｉ．アラビドプシス色素体１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子プロモーター及び天然５’
非翻訳配列（５’ＵＴＲ）の増幅、及びタバコｒｂｃ Ｌ遺伝子のリボソーム結
合部位への融合 プラスミドｐＡｒａｂ １６ＳからのＤＮＡを、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子プロ
モーター領域の５’末端における、導入されたＥｃｏＲＩ制限部位（配列番号１
０の位置６３）を含む“上鎖”プライマー（5'-GCCGGAATTCTCGCTGTGATCGAATAAGA
ATG-3'（配列番号１１；下線はＥｃｏＲＩ制限部位））を用いたＰＣＲのための
鋳型として使用する。この“下鎖”プライマーは、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子プロ
モーター５’非翻訳領域の位置１７２まで延び（配列番号１０）、位置１５１（
ＴからＧ）（配列番号１０）、位置１５８（ＡからＣ）（配列番号１０）、及び
位置１６７（ＡからＣ）（配列番号１０）を変更することにより転写開始部位の
下流にある３つのＡＴＧを突然変異誘発し、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子５’ＵＴＲ
の３’末端に、５’伸長物としてタバコｒｂｃ Ｌ遺伝子のリボソーム結合部位
（位置５７５６９〜５７５８５）（Shinozaki et al., 1986) を融合し、そして
リボソーム結合部位の３’末端においてＢｓｐＨＩ部位を導入する（5'-GCCTTCA TGA ATCCCTCCCTACAACTATCCAGGCGCTTCAGATTCGCCTGGAGTT-3'(配列番号１２；下線は
ＢｓｐＨＩ制限部位））。ＰＣＲ増幅を、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラ
ーゼ・キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行う。３つのＡＴＧが突然変異
し、そしてタバコｒｂｃ Ｌ遺伝子のリボソーム結合部位をもつ、アラビドプシ
ス１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子プロモーターと５’非翻訳領域を含む１４５bpの増幅
生成物を、ゲル精製し、そしてＥｃｏＲＩとＢｓｐＨＩにより消化して、１３１
bp生成物を得る。

【００４８】 II．色素体形質転換ベクター内での、ＧＵＳリポーター遺伝子及びタバコ色素
体ｒｐｓ １６遺伝子３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）への、アラビドプシス１６
Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子プロモーター、５’ＵＴＲ、及びタバコｒｂｃ Ｌ遺伝子の
リボソーム結合部位のライゲーション ＡＴＧ開始コドンにおいてＮｃｏＩ制限部位を、そして終結コドン後にＸｂａ
Ｉ部位を含むプラスミドｐＲＡＪ２７５（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から得られた１８
６４bpのｂ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）リポーター遺伝子断片が、ＮｃｏＩと
ＸｂａＩによる消化により作られた。この断片を、１３１bpのＥｃｏＲＩ／Ｂｓ
ｐＨＩアラビドプシス１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子プロモーター、５’ＵＴＲ及びタ
バコｒｂｃ Ｌリボソーム結合部位断片、実施例２に記載したＸｂａＩ／Ｈｉｎ
ｄIII タバコｒｐｓ １６ ３’ＵＴＲ断片、及び３１４８bpのクローニング・
ベクターｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）（Promega, Madison, WI) からのＥｃｏＲＩ／Ｈ
ｉｎｄIII 断片に、４方反応においてライゲートする。色素体形質転換ベクター
を、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIII により先の構築物を消化し、そしてプラスミドｐ
ＰＲＶIII ａ（Zoubenko et al. 1994) からの７．３kbのＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ
III 断片に得られた２．１kb断片をライゲートすることにより構築する。

【００４９】 実施例５：タバコ色素体ゲノムの微粒子銃形質転換 Nicotiana tabacum c.v.“Xanthi nc ”の種を、Ｔ寒天培地上の１''環状アレ
イ内でプレート当り７で発芽させ、そして本質的にSvab, Z. and Maliga, P. ((
1993) PNAS 90, 913-917) 中に記載されたように、実施例２と実施例４中に記載
したプラスミドからのＤＮＡでコートされた１μｍタングステン粒子（M10, Bio
rad, Hercules, CA)により播種した後１２〜１４日目に爆撃する。爆撃された苗
木を２日間Ｔ培地上でインキュベートし、その後葉を切除し、そして５００μｇ
／mlのスペクチノマイシン２塩酸（Sigma, St. Louis, MO) を含むＲＭＯＰ培地
（Svab, Z., Hajdukiewicz, P. and Maliga, P. (1990) PNAS 87, 8526-8530)の
プレート上は明所（３５０〜５００μmol 光子／ｍ² ／ｓ）下で、背軸を上にし
て（ａｂａｘｉａｌ ｓｉｄｅ ｕｐ）置く。爆撃から３〜８週間後に退色した
葉の下に現れた抵抗性シュートを、同一の選択培地上にサブクローニングし、カ
ルスを形成せしめ、そして２次的シュートを単離し、そしてサブクローニングす
る。独立したサブクローン内の形質転換された色素体ゲノム・コピー（ｈｏｍｏ
ｐｌａｓｍｉｃｉｔｙ）の完全分類を、サザン・ブロッティングの標準的な技術
（Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor) により評価する。ＢａｍＨＩ
／ＥｃｏＲＩ消化された全細胞ＤＮＡ（Mettler, I. J. (1987) Plant Mol Biol
Reporter 5, 346-349) を、１％Ｔｒｉｓ−ボレート（ＴＢＥ）アガロース・ゲ
ル上で分離し、ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移し、そしてｒｐｓ ７／１
２色素体ターゲティング配列の一部を含むｐＣ８からの０．７kb ＢａｍＨＩ／
ＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片に対応する³²Ｐ−標識ランダム・プライムされたＤＮ
Ａ配列によりプロービングする。ホモプラズミック・シュートを、スペクチノマ
イシン含有ＭＳ／ＩＢＡ培地（McBride, K. E. et al. (1994) PNAS 91, 7301-7
305)上で無菌的に植え付け、そして温室に移す。

【００５０】 本願明細書中に記載する本願発明のさまざまな変更は、当業者にとって明らか
となるであろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲内に在るものと意図
される。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）色素体ｃｌｐ
   Ｐ遺伝子のコーディング配列の上流にある５’フランキング領域から単離された
   核酸プロモーターを含む核酸分子。
2. 【請求項２】 前記核酸プロモーターが、配列番号１のヌクレオチド番号２
   ６３の下流にあるプロモーター配列に実質的に類似する、請求項１に記載の核酸
   分子。
3. 【請求項３】 前記核酸プロモーターが、配列番号１のヌクレオチド番号２
   ６３の下流にあるプロモーター配列と配列が同一である、請求項１に記載の核酸
   分子。
4. 【請求項４】 前記核酸プロモーターが、配列番号１に実質的に類似する、
   請求項１に記載の核酸分子。
5. 【請求項５】 前記核酸プロモーターが、配列番号１内に含まれる、請求項
   １に記載の核酸分子。
6. 【請求項６】 前記核酸プロモーターが、配列番号１の連続した２０塩基対
   のヌクレオチド部分と配列が同一である２０塩基対のヌクレオチド部分を含む、
   請求項１に記載の核酸分子。
7. 【請求項７】 前記着目の遺伝子のコーディング配列に作用可能な状態で連
   結された、請求項１に記載の核酸分子を含むキメラ遺伝子。
8. 【請求項８】 請求項７に記載のキメラ遺伝子を含む植物形質転換ベクター
   。
9. 【請求項９】 各々が請求項７に記載のキメラ遺伝子を含む、トランスジェ
   ニック植物、植物細胞、植物種子、植物組織、又は植物色素体。
10. 【請求項１０】 ２の色素体遺伝子のタンパク質コーディング領域間から介
    在性調節ＤＮＡ配列を単離する方法であって、以下のステップ： （ａ）２９の色素体遺伝子のタンパク質コーディング領域の、相対的な方向、
    及び変性又は特異的ヌクレオチド配列を決定し； （ｂ）上記２の色素体遺伝子の中の１のタンパク質コーディング領域の決定さ
    れた配列に基づき、第１の変性又は特異的ＰＣＲプライマーを設計し； （ｃ）上記２の色素体遺伝子の中の他のタンパク質コーディング領域の決定さ
    れた配列に基づき、第２の変性又は特異的ＰＣＲプライマーを設計し；及び （ｄ）上記ステップ（ｂ）と（ｃ）のプライマーを使用してＤＮＡ断片を増幅
    する、 を含み、これによりその増幅されたＤＮＡ断片が、上記２の色素体遺伝子のタ
    ンパク質コーディング領域間からの介在性調節ＤＮＡ配列を含む、前記方法。
11. 【請求項１１】 前記２の色素体遺伝子が、ｃｌｐ Ｐ遺伝子とｐｓｂ Ｂ
    遺伝子である、請求項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記介在性調節ＤＮＡ配列が、ｃｌｐ Ｐプロモーターを
    含む、請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記２の色素体遺伝子が、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子とバリ
    ンｔＲＮＡ遺伝子である、請求項１０に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記介在性調節ＤＮＡ配列が、１６Ｓ ｒＲＮＡプロモー
    ターを含む、請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 改良された色素体形質転換方法であって、宿主植物種の色
    素体を、着目のコーディング配列に作用可能な状態で連結された色素体−活性調
    節配列を含むキメラ遺伝子で、形質転換させることを含み、ここで、上記調節配
    列が、上記宿主植物色素体内の対応の天然調節配列に約９０％未満の同一性を有
    するヌクレオチド配列をもち、これにより、上記キメラ遺伝子内の上記調節配列
    と上記宿主植物色素体内の対応の天然調節配列の間の不所望の体細胞性組換えが
    減少される、前記方法。
16. 【請求項１６】 前記キメラ遺伝子内の調節配列が、前記宿主植物種の色素
    体ゲノムから単離されており、かつ、前記調節配列のヌクレオチドの少なくとも
    約１０％が突然変異している、請求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記キメラ遺伝子内の調節配列が、前記宿主植物種と異な
    る植物種の色素体ゲノムから単離されている、請求項１５に記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記キメラ遺伝子内の調節配列が、アラビドプシス（Ａｒ
    ａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の色素体ゲノムから単離されている、請求項１７に記載の
    方法。
19. 【請求項１９】 前記キメラ遺伝子内の調節配列が、アラビドプシス色素体
    のｃｌｐ Ｐ遺伝子のコーディング配列の上流にある５’フランキング領域から
    単離された核酸プロモーターである、請求項１８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記キメラ遺伝子内の調節配列が、アラビドプシス色素体
    の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコーディング配列の上流にある５’フランキング領
    域から単離された核酸プロモーターである、請求項１８に記載の方法。