KR100719629B1

KR100719629B1 - 아마 종자 특이적 프로모터

Info

Publication number: KR100719629B1
Application number: KR1020027002637A
Authority: KR
Inventors: 쳐드하리사리타; 반루이젠기즈; 몰로니마우리스엠.; 신슈린더
Original assignee: 셈비오시스제네틱스인코포레이티드; 커먼웰스 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치 오가니제이션
Priority date: 1999-08-27
Filing date: 2000-08-25
Publication date: 2007-05-18
Also published as: CN1376204B; NO20020932L; WO2001016340A1; MX248919B; EP1212438B8; NO330787B1; AU782218B2; DE60028053D1; NZ517467A; AU6679200A; CN1376204A; NO20020932D0; EP1212438B1; MXPA02002108A; IL148270A0; BR0013596A; KR20020057950A; EP1212438A1; ES2261226T3; JP2003525030A

Abstract

본 발명은 아마 종자 및 다른 식물 종의 종자에서의 비-본래적(non-native) 유전자의 발현을 위한 신규한 방법을 제공한다. 상기 방법은 아마로부터 얻은 종자 특이적 프로모터의 사용을 수반한다. 또한, 신규한 아마 종자 특이적 프로모터, 신규한 아마 종자 특이적 프로모터를 포함하는 키메라 핵산 구조물, 신규한 아마 종자 특이적 프로모터를 포함하는 형질전환 식물 종자, 형질전환 식물 세포 및 형질전환 식물체를 제공한다. 상기 프로모터와 방법은, 예컨대 아마 종자 또는 다른 색물 종자의 종자 기름 및 단백질 조성물을 변화시키는데 유용하다.

Description

아마 종자 특이적 프로모터{FLAX SEED SPECIFIC PROMOTERS}

본 발명은 식물 종자의 구성요소를 변경하는데 유용한 식물 유전 공학적 방법과 관련된 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 아마로부터 얻어지고 다른 식물의 종자 뿐 아니라 아마 종자(flax seed)에서의 비-본래적(non-native) 유전자의 발현을 유발할 수 있는 프로모터와 관련된 것이다.

아마(flax) 또는 아마인(linseed, Linum usitatissimum)은 상업적으로 중요한 기름 종자(oilseed) 작물이다. 아마 기름(flax oil)과 아마 가루(flax meal)는 아마 종자로부터 얻어지는 유용한 원료이다. 보다 경제적으로 중요한 원료인 아마 섬유질(flax fiber)은 상기 식물의 줄기로부터 얻을 수 있다. 아마 기름은, 예컨대 광택제 및 도료의 제조에 있어서와 같이, 비-식용 목적으로 사용되며, 보다 최근에는 새롭게 재배되는 소위 리놀라(Linola)라는 품종 덕분에 마가린, 샐러드 오일 및 드레싱과 같은 식용품 분야의 제조에 사용하는데 적합하게 되었다(Green(1986) Can. J. Plant Sci, 66:499-503). 아마 섬유질이 리넨 섬유의 제조에 사용되는 반면, 아마 가루는 주로 반추동물의 먹이의 성분으로 사용된다. 원료의 소스로서의 경제적 중요성을 고려할 때, 예컨대 종자 수확량, 병충해 및 저온에 대한 내성과 같은 재배 효율의 관점과 판매부문(downstream)의 적용에 적합한 원료의 수확량과 질의 관점 모두에 있어서 사용가능한 아마 품종 포트폴리오를 보다 개선시키고 다양화시키는 것이 바람직하다. 리놀라 품종의 개발에 의하여 증명되는 바와 같이, 통상적인 식물 육종을 통하여 개선된 아마 품종을 얻을 수 있지만, 우량 재배 식물 라인의 개발은 장기간이 소요되기 때문에 식물 육종에 있어서 대규모의 투자를 필요로 한다. 식물 유전자 공학 기술에 의하여 무관한 종으로부터 직접 유전자를 분리하고 이들 유전자를 우량 재배 백그라운드에 전이시키는 것이 가능하고, 이로 인하여, 새로운 품종의 개발에 소요되는 시간이 상당히 단축되었다. 게다가, 식물 유전자 공학은 예컨대 치료제 등과 같이 아마로부터 천연적으로 얻을 수 없는 산물의 제조를 가능하게 한다.

식물 유전자 공학을 통하여 새로운 아마 품종을 개발하기 위하여, 도입된 외래 유전자 또는 비-본래적 유전자의 발현에 대한 조절이 가장 중요하다. 비-본래적 유전자의 발현수준, 비-본래적 유전자가 발현되는 특정 식물 조직 또는 기관, 및 비-본래적 유전자가 발현되는 식물의 성장 주기에 있어서의 특정 시기와 같은 비-본래적 유전자의 바람직한 발현특성은 개발되는 식물 계통의 적용에 따라 변할 것이다. 예컨대, 종자 기름 조성물의 변형은 종자 발생의 초기 단계에서의 지방산 대사에 수반되는 효소의 종자 특이적 발현이 낮은 수준으로 일어날 것을 필요로 할 수 있다(예컨대 미국특허 제5,420,034를 참조). 한편, 약제적 단백질의 발현은 식물 잎의 수확시에 높은 수준의 잎-특이적 발현을 요구하는 것이 바람직할 수 있다(미국 특허 제5,929,304호 참조)

비-본래적 유전자의 발현 특성을 조절하기 위하여, 많은 요소들이 영향을 받을 수 있다. 한 요소는 사용되는 전사 프로모터의 선택이다. 광범위한 식물 친화성 프로모터가 널리 사용가능하고, 35-S CaMV 프로모터(Rothstein et al.(1987), Gene 53: 153-161) 및 유비퀴틴 프로모터와 같은 구성적 프로모터(constitutive promoter), 예컨대 파세올린 프로모터(Sengupta-Gopalan et al., (1985),PNAS USA 82:3320-3324) 등의 종자 특이적 프로모터와 같은 조직 특이적 프로모터 및 열(Czarnencka et al., (1989), Mol. Cell. Biol. 9(8):3457-3464), 자외선, 반응 유도물질(elicitors) 및 부상(Lois et al., (1989) EMBO J. 8(6):1641-1648), 또는 내생 호르몬(Skriver et al., (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(16):7266-7270)과 같은 화학물질에 의하여 유도되는 프로모터와 같은 유도성 프로모터를 포함한 몇 몇 프로모터들이 문헌상 잘 기재되어 있다. 식물 내 비-본래적 유전자의 발현특성의 조절을 위하여 제조될 수 있는 다른 요소에는 인트론, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결 부위와 같은 전사 변형 요소가 포함된다. 비-본래적 유전자의 발현 특성은 또한 리보좀 결합 부위 및 숙주에 의하여 나타나는 코돈 바이어스(codon bias)와 같이 번역에 영향을 미치는 요소들에 의하여 조절될 수 있다. 또한, 비-본래적 유전자 그 자체는 형질전환 식물의 생존율에 영향을 줄 수 있고, 따라서 달성될 수 있는 발현 수준을 특정적으로 제한할 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 예컨대 잎 또는 종자에서의 조직 특이적 방법으로 단백질을 발현시킴으로써, 또는 통상적으로 단백질을 서브세포 구획(세포내 소기관)으로 유도할 수 있는 특이적 표적 서열의 존재 또는 부존재 하에서, 예컨대 세포질, 소포체 또는 액포와 같은 서로 다른 서브세포 구획의 단백질 축적을 제한함으로써, 이러한 문제를 극복할 수 있다. 발현특성에 영향을 미칠 수 있는 또 다른 요소는 자신을 숙주 염색체에 삽입하는 구조물에서의 위치이다. 이러한 효과는 같은 재조합 구조물로 형질전환된 다른 식물이 변동하는 재조합 단백질 발현 수준을 갖는 이유에 대한 설명을 제공할 수 있다.

본 발명자들이 아는 한, 아마 종자에서의 비-본래적 유전자의 발현은 오직 PCT 특허출원 국제공개 제98/18948호에 기재되어 있다. 이 출원에는 아마로부터 유도된 2 가지의 스테아로일-아실 담체 단백질 지방산 불포화효소(stearoyl-acyl carrier protein desaturase, SAD) 유전자가 기재되어 있다. 결합 SAD 프로모터 서열은 내생 또는 외래 유전자의 발현을 위한 아마 및 다른 식물의 변형에 유용하다. 그러나, 국제공개 제98/18948호에 기재된 방법은 SAD 프로모터가 아마에서 종자 특이적이지 않고 잎, 줄기, 꽃 및 종자에서 발현하게 한다는 사실에 의하여 제한된다. 따라서, 비-본래적 유전자의 발현은 종자 이외의 조직에서 바람직하지 못한 결과를 야기할 수 있다. 게다가, SAD 프로모터에 의하여 발현 수준과 발현 시기를 제한적으로 조절할 수 있다.

따라서, 관련 기술분야에 있어서, 아마 및 다른 식물의 종자에서의 비-본래적 유전자 발현을 위한 방법을 보다 개선하는 것이 필요하다.

발명의 요약

본 발명은 개선된 식물에서의 비-본래적 유전자의 종자 특이적 발현 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 개선된 아마에서의 비-본래적 유전자의 종자 특이적 발현방법에 관한 것이다.

따라서, 한 측면에 있어서, 본 발명은,

(a) 작동가능한 연결 성분으로서 (1) 아마로부터 얻은 종자 특이적 프로모터; 및 (2) 상기 아마 종자 특이적 프로모터에 대하여 비-본래적(non-native)인 발현시키고자 하는 핵산 서열을 5' 에서 3' 전사 방향으로 포함하는 키메라(chimeric) 핵산 구조물을 제조하는 단계;

(b) 상기 키메라 핵산 구조물을 아마 식물체 세포로 도입시키는 단계; 및

(c) 상기 아마 세포를 종자 형성이 가능한 성숙한 아마 식물체로 성장시키고, 이 때, 상기 아마 종자 특이적 프로모터의 조절 하에서 상기 발현시키고자 하는 핵산 서열을 종자 내 발현시키는 단계를 포함하는, 아마 종자 내에서의 발현시키고자 하는 핵산 서열의 발현방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 한 구체예에 있어서, 비-본래적 핵산 서열에 대한 프로모터에 의하여 주어지는, 예컨대 식물 생활 주기에서의 발현 시기와 같은 한 가지 이상의 발현특성은 본래의 핵산 서열에 대하여 부여되는 발현특성과 유사하다. 보다 바람직한 구체예에 있어서, 아마 종자 특이적 프로모터는 올레오신 프로모터, 2S 저장 단백질 프로모터 또는 레구민 유사(legumin-like) 종자 저장 단백질 프로모터이다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은,

(a) 작동가능한 연결 성분으로서 (1) 아마로부터 얻은 종자 특이적 프로모터; 및 (2) 상기 종자 특이적 프로모터에 대하여 비-본래적으로 발현시키고자 하는 핵산 서열을 5' 에서 3' 전사 방향으로 포함하는 키메라 핵산 구조물을 제조하는 단계;

(c) 상기 아마 식물체 세포를 종자 형성이 가능한 성숙한 아마 식물체로 성장시키고, 이때, 상기 종자 특이적 프로모터의 조절 하에서 상기 발현시키고자 하는 핵산 서열을 종자 내 발현시키는 단계를 포함하는 방법에 따라서 제조된 형질전환 아마 종자를 제공한다.

또 다른 측면으로, 본 발명은

(c) 상기 아마 식물체 세포를 종자 형성이 가능한 성숙한 아마 식물체로 성장시키고, 이때, 상기 종자 특이적 프로모터의 조절 하에서 상기 발현시키고자 하는 핵산 서열을 종자 내 발현시키는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조된 종자 형성이 가능한 아마 식물체를 제공한다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 예컨대 단백질 또는 종자의 기름 조성물의 변형에 유용한 것과 같이, 아마 종자 및 다른 식물 종의 종자에서의 비-본래적 유전자의 발현에 유용한 신규한 아마 종자 특이적 프로모터를 제공한다.

바람직한 구체예에 있어서, 종자특이적 프로모터는

(a) 도 1(SEQ. ID. NO.:1), 도 2(SEQ. ID. NO.:4), 도 3(SEQ. ID. NO.:6) 또는 도 4(SEQ. ID. NO.:8)에 나타난 핵산 서열, 단, T는 또한 U일 수 있다;

(b) 상기 (a)의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열;

(c) 상기 (a) 또는 (b)의 핵산 서열과 실질적 서열 상동성을 갖는 핵산 서열;

(d) 상기 (a), (b) 또는 (c)의 핵산 서열의 유사체인 핵산 서열; 또는

(e) 엄격한 혼성화 조건 하에서 상기 (a), (b), (c) 또는 (d)의 핵산 서열에 혼성화하는 핵산 서열을 포함한다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 아마로부터 얻고 신규한 아마 종자 특이적 프로모터를 포함하는 첫 번째 핵산 서열과 상기 첫 번째 핵산 서열에 대하여 비-본래적인 두 번째 서열을 포함하는 키메라 핵산 서열을 제공하는데, 이 때, 첫 번째 핵산 서열은 두 번째 핵산 서열과 작동가능하게 연결되어 있다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기하는 발명의 상세한 설명에 의하여 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명의 사상과 범위 내에서의 다양한 변화와 변형은 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것이므로, 발명의 상세한 설명과 특정 실시예는, 비록 본 발명의 바람직한 구체예고 표현되어 있다고 하더라도, 이는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것임을 이해하여야 할 것이다.

상기한 바와 같이, 본 발명은 개선된 식물, 특히 아마에서의 비-본래적 유전자의 발현 방법에 관한 것이다. 본 발명은 아마에서의 비-본래적 유전자의 종자 특이적 발현을 가능하게 하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 방법은 아마 종자에 서의 비-본래적 유전자의 발현에 대한 조절을 개선시키는 이점이 있다. 비-본래적 유전자의 발현은 종자에서만 한정적으로 일어나며, 따라서, 다른 식물기관 또는 조직에서의 발현으로부터 야기되는 잠재적이고 바람직하지 않은 효과를 제한할 수 있다. 게다가, 제공된 방법론에 의하여 비-본래적 유전자의 발현 수준 및 식물의 발생 주기에 있어서의 발현 시기와 같은 발현 특성의 조절을 향상시킬 수 있다. 본 발명의 방법은 본 발명에 따라서, 기름, 단백질 및 폴리사카라이드와 같은 중요한 원료에 대한 종자 조성물을 양적 및 질적으로 모두 변화시킬 수 있다는 점에서 특히 유용하다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은

(a) 작동가능한 연결 성분으로서 (1) 아마로부터 얻은 종자 특이적 프로모터; 및 (2) 상기 아마 종자 특이적 프로모터에 대하여 비-본래적인 발현시키고자 하는 핵산 서열을 5' 에서 3' 전사 방향으로 포함하는 혼성(chimeric) 핵산 구조물을 제조하는 단계;

(c) 상기 아마 세포를 종자 형성이 가능한 성숙한 아마 식물체로 성장시키고, 이 때, 상기 아마 종자 특이적 프로모터의 조절 하에서 상기 발현시키고자 하는 핵산 서열을 아마 종자 내 발현시키는 단계를 포함하는 발현시키고자 하는 핵산 서열의 발현방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 "비-본래적"이라는 용어는 보통은 상기 종자 특이적 프로모터와 관계없는 여하한 RNA 또는 DNA 서열을 비롯한 모든 핵산 서열을 의미한다. 여기에는 상기 프로모터와 동일한 식물종으로부터 얻어지지만, 야생형 (비트랜스제닉) 식물의 프로모터와 관계된 것은 아닌 동종의 핵산 서열 뿐만 아니라, 상기 프로모터와 다른 식물종으로부터 얻어진 이종의 핵산 서열이 포함된다.

비-본래적 핵산 서열은 아마로부터 얻은 종자 특이적 프로모터와 연결되어 혼성 구조물을 형성한다. 상기 혼성 구조물을 아마 식물체 내로 도입시켜서 비-형질전환 아마 식물체 세포 또는 비-형질전환 아마 식물체 세포로 부터 성장시킨 아마 식물체와 비교하여 현저하게 다른 표현형의 아마 식물체 세포 또는 이로부터 성장된 아마 식물체를 형성하는 형질전환 식물체 세포를 제조한다. 혼성 구조물의 핵산 서열과 동일한 인접 핵산 서열은 비-형질전환 아마 식물체 세포 또는 이로부터 성장시킨 아마 식물체에는 존재하지 않는다. 이 점에 있어서, 키메라 핵산 서열은 다른 식물 종으로부터 얻은 핵산 서열 또는 아마로부터 얻었지만 프로모터와 정상적으로 연결되지 않은 핵산 서열과 연결된 아마 프로모터를 포함하는 서열을 포함한다. 또한, 여기서 사용되는 키메라 핵산 서열은 아마 프로모터와 상기 프로모터에 정상적으로 연결되고 비-본래적 핵산 서열을 추가적으로 포함하는 핵산 서열을 포함하는 서열을 포함한다. 예컨대, 상기 프로모터가 아마 종자 특이적 올레오신 프로모터일 때, 아마 올레오신 프로모터에 대하여 "비-본래적"인 서열은 또한 본래 올레오신 프로모터와 결합된 올레오신 유전자와 본래 프로모터와 결합되지 않은 발현시키고자 하는 코딩 서열 사이의 융합체를 포함하는 서열을 포함한다. 또한, 비-본래적인 프로모터 서열과 발현시키고자 하는 단백질을 인코딩하는 유전자와 정상적으로 연결된 핵산서열을 분리시키는 분할 서열을 추가적으로 포함하는 상기의 융합 유전자를 포함함을 의미한다.

"핵산 서열"이라는 용어는 본래적으로 발생하는 염기, 당 및 당 사이(백본, back bone) 결합으로 구성되는 뉴클레오사이드 모노머 또는 뉴클레오타이드 모노머의 서열을 의미한다. 상기 용어는, 또한, 기능이 유사한 비-본래적 유발 모노머 또는 그의 일부분을 포함하는 변형되거나 치환된 서열을 포함한다. 본 발명의 핵산 서열은 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA)일 수 있으며, 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실을 포함하는 자연 발생 염기를 포함할 수 있다. 상기 서열은 크산틴(xanthine), 하이포크산틴(hypoxanthine), 2-아미노아데닌, 6-메틸, 2-프로필 및 다른 알킬 아데닌류, 5-할로 우라실, 5-할로 시토신, 6-아자 우라실, 6-아자 시토신 및 6-아자 티민, 슈도 우라실, 4-티오우라실, 8-할로 아데닌, 8-아미노 아데닌, 8-티올 아데닌, 8-티오 알킬 아데닌, 8-하이드록실 아데닌 및 다른 8-치환 아데닌, 8-할로 구아닌, 8-아미노 구아닌, 8-티올 구아닌, 8-티오알킬 구아닌, 8-하이드록실 구아닌 및 다른 8-치환 구아닌, 다른 아자(aza) 및 데아자(deaza) 우라실류, 티미딘류(thymidines), 시토신류, 아데닌류, 또는 구아닌류, 5-트리플루오로메틸 우라실 및 5-트리플루오로 시토신과 같은 변형된 염기를 또한 포함할 수 있다.

"종자 특이적 프로모터"라는 용어는 그 프로모터의 조절하에서 발현되는 유전자가, 다른 식물 조직에서는 실질적으로 전체 발현 수준의 5% 이하로 발현하면서, 주로 식물 종자 내에서 발현하는 것을 의미한다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 아마 종자 및 다른 식물종의 종자에서의 비-본래적 유전자의 발현에 유용한 신규한 아마 종자 특이적 프로모터를 제공한다. 상기 프로모터는 예컨대 종자의 단백질, 기름 또는 폴리사카라이드 조성물을 변형시키는데 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 종자 특이적 프로모터는,

(a) 도 1(SEQ. ID. NO.:1), 도 2(SEQ. ID. NO.:4), 도 3(SEQ. ID. NO.:6) 또는 도 4(SEQ. ID. NO.:8)에 나타낸 것과 같은 핵산 서열, 여기서, T는 또한 U일 수 있다;

(b) 상기 (a)의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열;

"실질적 서열 상동성을 갖는 서열"이라 함은, (a) 또는 (b)의 서열과 약간 또는 무시할 수 있는 정도의 서열 변이를 갖는 핵산 서열, 즉, 서열 기능이 실질적으로 동일하고 비-본래적 핵산 서열의 종자 특이적 발현을 유도할 수 있는 핵산 서열을 의미한다. 상기 변이는 위치 돌연변이 또는 구조 돌연변이에 기인할 수 있다. 실질적인 상동성을 갖는 핵산 서열은 도 1(SEQ. ID. NO.:1), 도 2(SEQ. ID. NO.:4), 도 3(SEQ. ID. NO.:6) 또는 도 4(SEQ. ID. NO.:8)에 나타낸 핵산 서열과 65% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 가장 바람직하게는 90-95%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.

"혼성화하는 서열"이라 함은, 엄격한 혼성화 조건하에서 서열 (a), (b), (c) 또는 (d)로 혼성화 할 수 있는 핵산 서열을 의미한다. DNA 혼성화를 촉진시키는 적절한 "엄격한 혼성화 조건"은 관련분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있으며, 또는 Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, N.Y.(1989), 6.3.1-6.3.6)에서 찾을 수 있다. 예컨대, 다음과 같은 조건이 사용될 수 있다: 약 45℃에서 6.0×염화나트륨/시트르산 나트륨(SSC)에서 처리한 후, 50℃에서 2.0×SSC로 세척. 조건의 엄격함은 세척 단계에서 사용되는 조건에 기초하여 선택된다. 예컨대, 세척 단계의 염 농도는 50℃에서 약 0.2×SSC로 매우 엄격하게 선택된다. 또한, 세척 단계의 온도는 약 65℃의 매우 엄격한 조건일 수 있다.

"유사체인 핵산 서열"이라 함은, 서열 (a), (b) 또는 (c)와 비교하여 변형된 핵산 서열을 의미하며, 이 때, 상기 변형이 본 명세서에 기재된 서열(즉, 종자 특이적 프로모터)의 유용성을 변화시키지 않는 것을 의미한다. 변형된 서열 또는 유사체는 (a), (b) 또는 (c)에 나타난 서열보다 향상된 특성을 가질 수 있다. 유사체를 제조하기 위한 변형의 일례로서, 도 1, 도 2, 도 3 또는 도 4에 나타난 서열의 자연 발생 염기(즉, 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티민) 중 한 가지가, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸, 2-프로필 및 다른 알킬 아데닌류, 5-할로 우라실, 5-할로 시토신, 6-아자 우라실, 6-아자 시토신 및 6-아자 티민, 슈도 우라실, 4-티오우라실, 8-할로 아데닌, 8-아미노 아데닌, 8-티올 아데닌, 8-티오 알킬 아데닌, 8-하이드록실 아데닌 및 다른 8-치환 아데닌, 8-할로 구아닌, 8-아미노 구아닌, 8-티올 구아닌, 8-티오알킬 구아닌, 8-하이드록실 구아닌 및 다른 8-치환 구아닌, 다른 아자 및 데아자 우라실류, 티미딘류, 시토신류, 아데닌류, 또는 구아닌류, 5-트리플루오로메틸 우라실 및 5-트리플루오로 시토신과 같은 변형된 염기로 치환될 수 있다.

변형의 또 다른 예는 도 1, 도 2, 도 3 또는 도 4에 나타난 핵산 분자의 인산 백본, 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 당간 결합, 또는 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로고리 당간 결합의 변형된 인 또는 산소 헤테로원자를 포함한다. 예컨대, 핵산 서열은 포스포로티오에이트(phosphorothioates), 포스포트리에스테르(phosphotriesters), 메틸 포스포네이트(methyl phosphonates) 및 포스포로디티오에이트 (phosphorodithioates)를 포함할 수 있다.

본 발명의 핵산 분자 유사체의 또 다른 예는 DNA (또는 RNA)의 데옥시리보오스 (또는 리보오스) 포스페이트 백본이 펩타이드에서 발견되는 것과 유사한 폴리아미드 백본으로 치환된 펩타이드 핵산(PNA)이다(P.E.Nielsen, et al Science 1991,254,1497). PNA 유사체는 효소에 의한 분해에 대하여 저항성이 있고 생체내(in vivo) 및 생체외(in vitro)에서 생존 기간이 연장되는 것으로 나타났다. 또한, PNA 가닥과 DNA 가닥 사이에 전하 반발이 없어서, PNA는 상보적인 DNA 서열에 보다 강력하게 결합한다. 다른 핵산 유사체는 폴리머 백본, 고리화 백본 또는 비고리화 백본을 함유하는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 예컨대, 뉴클레오타이드는 몰포리노 백본 구조(morpholino backbone structure)를 갖는다(미국특허 제5,034,506호). 상기 유사체는 리포터 작용기, 핵산 서열의 약동학적(pharmacokinetic) 특성 또는 약력학적(pharmacodynamic) 특성을 향상시키는 작용기와 같은 작용기를 포함한다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 아마로부터 얻고 신규한 아마 종자 특이적 프로모터를 포함하는 첫 번째 핵산 서열과 상기 첫 번째 핵산 서열에 대하여 비-본래적인 두 번째 서열을 포함하는 키메라 핵산 서열을 제공하는데, 이 때, 첫 번째 핵산 서열은 두 번째 핵산 서열과 작동가능하게 연결되어 있다. 바람직하게, 상기 프로모터는 도 1, 도 2, 도 3 또는 도 4에 나타난 핵산 서열 또는 엄격한 조건하에서 이들 서열에 혼성화하는 핵산 서열을 포함하는 프로모터로 구성된 군 중에서 선택된다.

본 발명에 있어서, 키메라 핵산 서열은 종자 세포 내에서의 우수한 발현을 위한 재조합 발현 벡터로 공지의 방법을 사용하여 혼입될 수 있다. 따라서, 본 발명은 종자 세포 내에서의 발현에 적합한 본 발명의 키메라 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한다.

"종자 세포 내에서의 발현에 적합한"이라 함은, 상기 재조합 발현 벡터가 발현을 위하여 사용되는 종자 세포를 기재로 선택되고, 원하는 아미노산 조성물의 펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열과 작동가능하게 연결되어 있는, 본 발명의 키메라 핵산 서열, 조절 부위 및 종결 부위를 포함한다는 것을 의미한다. "작동가능하게 연결된"은 펩타이드를 인코딩하는 키메라 핵산 서열이 종자 세포 내에서의 발현을 가능하게 하는 조절 서열과 종결 부위에 연결되어 있는 것을 의미한다. 전형적인 구조물은, 5' 에서 3' 방향으로, 식물체 내에서의 발현을 유도할 수 있는 프로모터를 갖는 조절 부위, 폴리펩타이드 코딩 부위 및 식물 세포 내에서 기능할 수 있는 전사 종결 부위를 포함하여 구성된다. 이들 구조물은 분자 생물학 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 방법론에 따라서 제조할 수 있다(예컨대: Sambrook et al.(1990), Molecular Cloning, 2^nd ed. Cold Spring Harbor Press 참조). 구조물의 제조는 제한 가수분해(restriction digestion), 리게이션(ligation), 겔 전기영동, DNA 시퀀싱 및 PCR과 같은 기술을 수반한다. 넓은 범위의 다양한 클로닝 벡터를 필요한 클로닝 단계를 수행하는데 사용할 수 있다. pBR322, pUC 시리즈 M13mp 시리즈, pACYC184, pBluescript 등과 같은 대장균(Escherichia coli)에서 작용가능한 복제 시스템을 갖는 클로닝 벡터가 이러한 목적을 위하여 특히 적합하다. 핵산 서열을 이들 벡터에 도입시킬 수 있으며, 상기 벡터는 적절한 배지에서 배양된 대장균을 형질전환시키는데 사용될 수 있다. 플라스미드는 세포의 수확 및 용해과정에서 세포로부터 회수할 수 있다. 최종적 구조물을 Ti 및 Ri 플라스미드와 같이 식물체 내로의 삽입에 친화적인 식물 벡터로 도입시킬 수 있다.

본 발명에 따른 아마 종자 내에서의 비-본래적 유전자의 발현을 위한 방법은 모든 아마 종자 특이적 프로모터를 사용하여 수행할 수 있으며, 선택된 특정 아마 종자 특이적 프로모터에 의하여 제한되지 않는다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 아마 종자 특이적 프로모터는 본래의 프로모터에 의한 본래 핵산 서열에 부여되는 발현 특성과 유사하거나 동일한 한 가지 이상의 발현 특성을 비-본래적 핵산 서열에 부여한다. 여기에 기재된 "발현 특성"이라 함은, 아마 종자 특이적 프로모터에 의하여 상기 아마 종자 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열에 부여되는 모든 측정가능한 특성 또는 효과를 의미한다. 따라서, 바람직한 구체예에 있어서, 비-본래적 핵산 서열의 식물 생활 주기에 있어서의 발현 시기는 본래적인 핵산 서열의 발현 시기와 유사하거나 동일하다. 또 다른 바람직한 구체예에 있어서, 이종 핵산 서열의 발현 수준은 본래의 핵산 서열의 발현 수준과 유사하거나 동일하다. 또 다른 특정 구체 예에 있어서, 예컨대 파장이나 빛의 강도 변화와 같은 빛의 조사 조건의 변화, 온도의 변화, 조직 손상, 예컨대 식물 호르몬(phytohormone) 및 살충제와 같은 화학물질의 농도 변화에 대한 비-본래적 핵산의 반응은 이러한 자극들에 대한 본래적 핵산 서열의 반응과 유사하다. 아마 종자 특이적 프로모터에 의하여 부여된 다른 원하는 발현 특성은 관련 분야의 통상의 지식을 갖는 자가 인지 가능하며, 이에 따라 종자 특이적 프로모터를 선택할 수 있다.

본 발명에 따라서 사용 가능한 아마 종자 특이적 프로모터는 올레오신과 같은 종자 저장 단백질과 결합되지 않은 종자 특이적 프로모터 뿐 아니라, 빅실린(vicilin) 및 레구민-유사 단백질을 포함하는 모든 알부민류 및 글로불린류와 같은 종자 저장 단백질과 결합된 프로모터를 포함한다. 다른 특정 발현을 위하여, 프로모터는 아실 담체 단백질(acyl carrier protein, ACP), 지방산포화효소(saturases), 지방산불포화효소(desaturases), 신장효소(elongases) 등과 같은 지방산 대사물질과 연결되어 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 종자 특이적 프로모터로서 올레오신 프로모터, 레구민-유사 종자 저장 단백질 프로모터 또는 2S 저장 단백질 프로모터가 사용된다. 특히 바람직한 구체예에 있어서, 종자 특이적 프로모터는 도 1, 도 2, 도 3 또는 도 4에 나타난 서열 또는 아마로부터 얻을 수 있고 엄격한 조건하에서 이들 4 가지 핵산 서열 중 어느 하나에 혼성화하는 모든 핵산 서열을 갖는다.

본 발명에 있어서, 다른 아마 종자 특이적 프로모터가 사용가능하다. 이들 프로모터는 여러가지 방법으로 얻을 수 있다. 아마 종자 단백질을 분리함에 있어서, 부분적으로 시퀀싱할 수 있고, 따라서 종자에 특이적인 RNA의 동정(identify)을 위한 핵산 프로브를 설계할 수 있다. 또한, 종자와 특이적으로 결합하는 RNA를 더욱 강화(enhance)시키기 위하여, 종자 세포로부터 cDNA를 제조할 수 있으며, 상기 cDNA를 비-종자 세포로부터의 mRNA 또는 cDNA와 함께 제거할 수 있다. 그리고 나서, 남아있는 종자 cDNA를 상보적 서열을 위한 게놈 DNA 라이브러리의 탐사에 사용할 수 있다. 그리고 나서 cDNA에 혼성화하는 서열을 얻을 수 있으며, 결합된 프로모터 부위를 분리할 수 있다. 또한, 다른 식물 종으로부터 얻은 공지된 종자 특이적 유전자를 사용하여 아마 종자 조직으로부터 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝 하고 이어서 그들과 연결된 프로모터를 분리하는 것이 가능하다. 종자에는 종자-저장 단백질이 상대적으로 풍부하기 때문에, 아마 종자 cDNA의 무작위 시퀀싱을 통하여 서열 정보를 얻는 것이 가능하다. 결합된 프로모터를 동정하기 위하여 공지된 종자-저장 단백질의 서열과 맞는 cDNA를 사용할 수 있다. 공지된 종자 특이적 단백질 및/또는 프로모터를 찾기 위하여, 예컨대 아라비돕시스(Arabidopsis)와 옥수수(maize)의 대규모 시퀀싱으로부터 얻은 서열 정보를 포함하는 데이터베이스를 탐사할 수 있고, 서열 유사성을 공유하는 아마의 프로모터 서열을 동정하는데 이러한 정보를 사용할 수 있다. 다른 아마 종자 특이적 프로모터를 분리하기 위하여 또 다른 방법을 사용할 수 있으며, 관련분야의 통상의 지식을 가진 자에게 알려지고 본 발명에 따라서 사용되는 방법에 의하여 신규한 아마 종자 특이적 프로모터를 찾을 수 있다.

프로모터에 연결된 발현시키고자 하는 핵산 서열은, 예컨대 효소와 같은 발현시키고자 하는 단백질 또는 펩타이드를 인코딩하는 모든 RNA 또는 DNA 서열, 또는 한 가지 이상의 오픈 리딩 프레임, 인트론, 비-코딩 리더 서열, 또는 그 상보적 서열이 전사, 예컨대 스플라이싱과 같은 mRNA 프로세싱, 또는 번역을 억제하는 모든 서열인 게놈 서열에 상보적인 서열을 포함하는 모든 핵산 서열일 수 있다. 발현시키고자 하는 핵산 서열은 합성되거나, 자연적으로 유도되거나, 이들을 조합한 것일 수 있다. 또한, 발현시키고자 하는 핵산 서열은, 예컨대 촉매 도메인 또는 특히 중요한 구조만을 포함하는 자연적 서열 단편일 수 있다. 발현시키고자 하는 핵산 서열의 성질에 따라서, 식물 우선적(preferred) 코돈을 갖는 서열을 합성하는 것이 바람직할 것이다. 식물 우선적 코돈은 발현 시키고자 하는 특정 식물 종에서 대량으로 발현하는 단백질 내에 가장 많이 존재하는 코돈으로부터 결정할 수 있다.
발현시키고자 하는 핵산 서열은 모든 다양한 재조합 단백질을 인코딩할 수 있다. 본 발명의 방법에 의하여 발현될 수 있는 재조합 단백질의 예에는, 바람직한 촉매 기능을 갖는 단백질 또는 높은 수준으로 축적되고 원할 때 추출할 수 있는 가치있는 단백질을 포함한다. 촉매 기능을 갖는 단백질은 종자의 발생시에 새로운 생화학적 표현형을 부여하는 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 새로운 표현형은 변형된 종자 단백질 또는 종자 기름 조성물 또는 종자 폴리사카라이드 조성물, 강화된 기존의 바람직한 산물 또는 특성의 생산, 및 안티센스, 라이보자임(ribozyme) 또는 코-서프레션(co-suppression) 기술을 이용한 바람직하지 않은 유전자 산물의 감소 또는 억제(Izant and Weintraub (1984) Cell 26: 1007-1015, antisense; Hazelhoff and Gerlach (1988) Nature 334: 585-591, ribozyme; Napoli et al. (1990) Plant Cell 2: 279-289, co-suppression)와 같은 변형을 포함한다.

예컨대 배아의 축 및 자엽(cotyledon)과 같이 서로 다른 배아 조직에서 세포 발현이 각기 다르게 나타나지만, 모든 배아 조직에서 원하는 단백질을 발현시키는 것을 기대할 수 있다. 발현시키고자 하는 핵산을 종자 발생의 모든 단계에서 발현시킬 수 있다. 본 발명의 특정 사용목적에 따라 발현 시기를 다르게 할 수 있다. 기름 변형에 수반되는 효소의 발현은 예컨대 종자 저장 단백질의 축적 전과 같이 종자발생의 초기에 일어나는 것이 바람직하다.

발현시키고자 하는 핵산 서열과 프로모터 부위 이외에도, 통상적으로 발현벡터는 전사를 종결시킬 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 전사 종결자는 약 200 내지 약 1,000 뉴클레오타이드 염기쌍인 것이 바람직하고, 식물체 내에서, 노팔린(nopaline) 합성 종결 부위(Bevan et al., (1983) Nucl. Acid. Res. 11: 369-385), 파세올린(phaseoline) 종결자(van der Geest et al. (1994) Plant J. 6(3): 413-423), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토핀(octopine) 합성 유전자의 종결자 또는 다른 유사 기능 요소와 같은 기능을 갖는 서열을 포함한다. 이들 전사 종결자 부위는 An(1987), Methods in Enzym. 153:292에 기재된 방법으로 얻거나, ClonTech, Palo Alto, California와 같이 상업적으로 입수 가능한 플라스미드에 이미 존재하고 있다. 적절한 종결자의 선택은 전사율에 영향을 미친다.

키메라 구조물은 AMV 리더(Jobling and Gehrke (1978), Nature 325: 622-625)과 같은 증진자(enhancer) 또는 인트론을 추가적으로 포함할 수 있다. 식물 종의 선택 및/또는 발현될 폴리펩타이드의 종류와 같은 요인에 따라 발현 벡터의 설계를 다르게 하여야 한다.

또한, 발현 벡터는 일반적으로 마커 유전자를 포함한다. 마커 유전자는, 선택(selectable) 마커 유전자 및 선별(screenable) 마커 유전자를 포함하여, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있도록 하는 모든 유전자를 포함한다. 통상적으로, 마커는 화학적 방법으로 선택될 수 있는 특성을 부여할 수 있는 것으로서, 예컨대 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제, 또는 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 등과 같은 항생제에 대하여 저항성이 있는 마커일 수 있다. 선별 마커는 관찰을 통하여 형질전환체를 동정하는데 사용될 수 있다. 이들은 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 또는 uidA 유전자, β-락탐아제(β-lactamase) 유전자 또는 푸른색(green) 형광 단백질을 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다(Niedz et al. (1995) Plant Cell Rep. 14:403).

통상적으로 핵산 서열을 식물 세포 내로 도입시키기 위하여, 관련분야의 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 다양한 기술을 사용할 수 있다. 아마 식물체 세포에 대한 아그로박테리움-매개(Agrobacterium -mediated) 형질전환이 보고되어 있으며, 아마 형질전환체는 원하는 경우에는 다양한 다른 기술(아래를 참조)들을 사용하여 키메라 DNA 구조물을 아마 세포에 도입시켜 얻을 수도 있지만, Dong and McHughen (1993) Plant Science 88:61-77에 기재된 방법에 따라서 이를 수행하여 얻을 수 있다.

관련분야의 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 통상적인 재배 방법에 따라서 재배된 형질전환된 아마 식물체는, 종자를 형성하는 것이 가능하다. 성숙한 아마 식물체에서 아마 종자를 얻은 후 야생형 종자에 대하여 바람직하게 변형된 특성을 분석할 수 있다.

식물체를 2 세대 이상 재배하고 교잡하거나 자가교배하여, 재조합 펩타이드의 생산을 포함하여 원하는 표현형 특성을 갖는 식물체 또는 계통을 동정할 수 있다. 재조합 특성의 계속되는 유전을 확인하기 위하여 식물체 내에서의 동형접합성을 확인하는 것이 바람직할 수 있다. 동형접합 식물체를 선별하는 방법은 식물 육종 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있으며, 이는 반복적인 자가교배와 선별 및 꽃밥과 홀씨 배양을 포함한다. 또한, 동형접합 식물체는 1배체(haploid) 세포 또는 조직을 형질전환시켜 1배체 묘목을 생성한 후, 공지된 모든 방법(예컨대, 콜히친 또는 다른 미세소관 분해제로 처리)을 이용하여 2배체(diploid) 식물체로 변환시킴으로써 얻을 수 있다.

또한, 본 발명은,

(c) 상기 아마 식물체 세포를 종자 형성이 가능한 성숙한 아마 식물체로 성장시키고, 이때, 상기 종자 특이적 프로모터의 조절 하에서 상기 발현시키고자 하는 핵산 서열을 종자 내 발현시키는 단계를 포함하는 방법에 따라서 제조된 형질전환 아마 종자를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 종자 특이적 프로모터는 2S 저장 단백질 프로모터, 글로불린 프로모터, 올레오신 프로모터 및 레구민-유사 종자 저장 단백질 프로모터로 구성되는 아마 종자 특이적 프로모터 군 중에서 선택된다. 특정 프로모터 서열을 도 1(SEQ. ID. NO.:1), 도 2(SEQ. ID. NO.:4), 도 3(SEQ. ID. NO.:6) 및 도 4(SEQ. ID. NO.:8)에 나타내었다.

또한, 본 발명은

(c) 상기 아마 식물체 세포를 종자 형성이 가능한 성숙한 아마 식물체로 성장시키고, 이때, 상기 종자 특이적 프로모터의 조절 하에서 상기 발현시키고자 하는 핵산 서열을 종자 내 발현시키는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조된 종자의 형성이 가능한 아마 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 아마 이외의 다른 식물체에 있어서 도 1(SEQ. ID. NO.:1), 도 2(SEQ. ID. NO.:4), 도 3(SEQ. ID. NO.:6) 및 도 4(SEQ. ID. NO.:8)에 나타난 신규한 프로모터를 사용하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 도 1, 도 2, 도 3 및 도 4에 나타난 프로모터 그룹에서 선택되는 프로모터 및 발현시키고자 하는 핵산 서열을 포함하는 키메라 핵산 구조물의 제조, 및 아마 이외의 다른 식물 종에서 아마 프로모터의 조절을 받으면서 종자 특이적 방법을 사용하는 발현시키고자 하는 핵산의 발현을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은

(a) 작동가능한 연결 성분으로서

(1) (i) 도 1(SEQ. ID. NO.:1), 도 2(SEQ. ID. NO.:4), 도 3(SEQ.ID. NO.:6) 또는 도 4(SEQ. ID. NO.:8)에 나타낸 것과 같은 핵산 서열, 여기서 T는 또한 U일 수 있다;

(ii) 상기 (i)의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열;

(iii) 상기 (i) 또는 (ii)의 핵산 서열과 실질적 서열 상동성을 갖는 핵산 서열;

(iv) 상기 (i), (ii) 또는 (iii)의 핵산 서열의 유사체인 핵산 서열; 또는

(v) 엄격한 혼성화 조건 하에서 상기 (i), (ii), (iii) 또는 (iv)의 핵산 서열에 혼성화하는 핵산 서열로 이루어진 종자 특이적 프로모터 그룹 중에서 선택된 종자특이적 프로모터; 및

(2) 상기 발현시키고자 핵산 서열을, 5' 에서 3' 전사 방향으로 포함하는 키메라 핵산 구조물을 제조하는 단계;

(b) 상기 키메라 핵산 구조물을 식물체 세포로 도입시키는 단계; 및

(c) 상기 식물체 세포를 종자 형성이 가능한 성숙한 식물체로 성장시키고, 이때, 상기 종자 특이적 프로모터의 조절 하에서 상기 발현시키고자 하는 핵산 서열을 종자 내 발현시키는 단계를 포함하는, 식물 종자 내에서의 발현시키고자 하는 핵산을 발현시키는 방법을 제공한다.

핵산, 특히 DNA를 식물 숙주 세포 내로 도입시키기 위하여 일반적으로 다양한 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어 Moloney et al. (1989), Plant Cell Rep. 8:238-242 또는 Hinchee et al. (1988) Bio/Technol. 6:915-922에 기재된 형질전환 프로토콜 또는 관련 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 다른 기술로, 표준 아그로박테리움(Agrobacterium) 벡터를 사용하여, 타바코와 같은 쌍자엽 식물 및 브라시카 나푸스(Brassica napus)와 같은 올레오아지너스(oleoagenous) 종으로부터 얻은 숙주 세포 내로 키메라 DNA 구조물을 도입시킬 수 있다. 광범위한 연구 결과, 예컨대 식물세포의 형질전환에 사용되는 T-DNA를 얻었으며, 이에 대하여 유럽특허 제0 120 516호, Hoekema et al. (1985), Chapter V In: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters BV, Alblasserdam); Knauf et al. (1983), Genetic Analysis of Host Expression by Agrobacterium, p.245, In: Molecular Genetics of Bacteria-Plant Interaction, Puhler, A. ed. Springer-Verlag, NY); 및 An et al. (1985), (EMBO J., 4:277-284)에 상세히 기재되어 있다. 또한 아그로박테리움(Agrobacterium) 형질전환은 외자엽(monocot) 식물 종을 형질전환하기 위하여 사용될 수 있다.(미국 특허 제5,591,616호)

통상적으로, 외식체(explant)를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes)와 함께 배양하여, 식물 숙주 세포 내 전사 구조물을 전이시킬 수 있다. 아그로박테리움(Agrobacterium)을 사용하여 형질전환 시킨 후, 식물세포를 선별을 위한 적절한 배지에 분산시키고, 이어서, 유합조직(callus), 분맥(shoots) 및 최종적으로 식물체를 회수한다. 아그로박테리움(Agrobacterium) 숙주는 T-DNA를 식물 세포에 전이시키기 위하여 필요한 vir 유전자를 포함하는 플라스미드를 품게 될 것이다. 주입과 일렉트로포레이션(아래를 참조)을 위하여, 무력화된 Ti-플라스미드(종양 유전자, 특히 T-DNA 부위가 결여된)를 식물세포 내로 도입시킬 수 있다.

비-아그로박테리움 기술은 본 명세서에 기재된 구조물을 사용하여 넓은 범위의 다양한 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물 종에서 형질전환 및 발현시킬 수 있게 한다. 이들 기술은 특히 아그로박테리움(Agrobacterium) 형질전환 체계에 적용하기 곤란한 식물 종의 형질전환에 유용하다. 유전자 전이에 사용되는 다른 기술에는 입자 충격법(particle bombardment, Sanford, (1988), Trends in Biotechn. 6:299-302), 일렉트로포레이션법(electroporation, Fromm et al.,(1985), PNAS USA, 82:5824-5828; Riggs and Bates, (1986), PNAS USA 83:5602-5606), PEG 매개 DNA 업테이크(Potrykus et al.,(1985), Mol. Gen. Genetics., 199:169-177), 마이크로인젝션(Reich et al., Bio/Techn. (1986) 4:1001-1004) 및 실리콘 카바이드 휘스커(silicone carbide whiskers, Kaeppler et al.(1990) Plant Cell Rep. 9:415-418)등이 포함된다.

비. 나푸스(B. napus)와 같이 더 특정한 적용에 있어서, 통상적으로 재조합 DNA 구조물을 도입시키기 위하여 표적화된 숙주 세포는, Moloney et al. (1989) Plant Cell Rep. 8:238-242에 기재된 바와 같이 자엽성 잎꼭지(cotyledonary petioles)로부터 유래된 것일 수 있다. 상업적으로 입수 가능한 기름 종자를 사용하는 다른 예는 콩 외식체의 자엽 형질 전환(Hinchee et al.,(1988) Bio/Technol. 6:915-922) 및 코튼의 줄기 형질전환(Umbeck et al.,(1987) Bio/Technol. 5:263-266)을 포함한다.

형질전환시킨 후, 예컨대 잎 디스크와 같은 세포를 선택적 배지에서 배양할 수 있다. 일단 분맥이 나타나기 시작하면, 이들을 절제하여 근형성 배지(rooting medium)에 옮긴다. 충분한 뿌리가 형성된 후, 식물체를 토양에 옮겨 심는다. 그리고 난 후, 추정 형질전환 식물체의 마커의 존재 여부를 시험한다. 적합한 프로브를 사용하여 게놈 DNA 상에서 서던 블러팅을 수행하여 숙주 세포의 게놈 내로의 삽입을 확인한다.

본 발명에서 제시된 방법은 광범위한 식물종의 접합에 사용될 수 있다. 특히 본 발명에 있어서 사용되는 바람직한 식물 세포에는 다음의 식물로부터 유래된 세포를 포함한다: 콩(Glycine max), 평지씨(Brassica napus, Brassica campestris), 해바라기(Helianthus annuus), 코튼(Gossypium hirsutum), 콘(Zea mays), 타바코(Nicotiana tobacum), 알팔라파(Medicago sativa), 밀(Triticum sp.), 보리(Hordeum vulgare), 귀리(Avena sativa L.), 사탕수수(Sorghum bicolor), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 감자(Solanum sp.), 아마/아마인(Linum usitatissimum), 홍화(Carthamus tinctorius), 기름 야자(Eleais guineeis), ㄸ따땅콩(Arachis hypogaea), 브라질 너트(Bertholletia excelsa), 코코넛(Cocus nucifera), 피마자(Ricinus communis), 고수풀(Coriandrum sativum), 호박(Cucurbita maxima), 호호바(Simmondsia chinensis) 및 쌀(Oryza sativa).

본 발명은 변형된 폴리펩타이드 또는 신규한 재조합 펩타이드의 축적에 의하여, 또는 혼입, 제거 또는 대사 단계에 의하여 식물체의 종자 본래의 가치를 향상시키는 것을 포함하는 다양한 용도를 갖는다. 본 발명을 사용하여 단백질의 질을 향상시키거나(예컨대, 필수적이거나 희귀한 아미노산의 농도를 증가시킴), 지방산 조성물을 변형시킴으로써 액상의 질을 향상시키거나, 탄수화물 조성물을 향상시키거나 증진시킬 수 있게 된다. 이러한 예로서, 루핀에서 발견되는 단백질과 같이 많은 황을 함유하는 단백질, 또는 황 아미노산이 부족한 종자의 브라질 너트를 들 수 있다. 또한, 단백질 또는 리신, 시스테인, 메티오닌 및 트립토판을 포함하여 필수 아미노산이 풍부한 단백질의 단편을 발현시킴으로써 단백질의 질을 향상시킬 수 있다. 또한, 트리글리세라이드(저장 지질)의 지방산 비율을 변화시킬 수 있는 전이효소(transferase enzyme)인 지방 아실 코엔자임 A(fatty acyl coenzyme A)를 발현시킬 수도 있다. 종자에 재조합 단백질을 축적할 수 있는 경우, 상기 단백질은 또한 약제적 또는 산업적 가치를 갖는 펩타이드일 수 있다. 이러한 경우, 펩타이드를 종자로부터 추출하여 의도하는 용도에 적합하도록 천연적 형태 또는 정제된 형태로 사용할 수 있다. 또한, 종자에서 발현되는 폴리펩타이드는 단편, 유도체 또는 본래 단백질일 수 있다. 약제학적으로 유용한 단백질은 히루딘과 같은 혈액응고 방지제, 모노클로날 항체 및 항체 단편을 포함하는 항체, 백신, 사이토킨 또는 소의 성장 인자와 같은 성장 인자, 콜린 분화 인자(CDF), 섬모 신경성장 인자(CNTF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 어류 성장 인자, 성선자극호르몬(gonadotropin), 과립세포-콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립세포-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인간 성장 인자, 인터페론 알파(IFN-α), 인터페론 베타(IFN-β), 인터페론 감마(IFN-γ), 인터루킨 1-알파(IL1-α), 인터루킨 1-베타(IL1-β), 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-5(IL-5), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-10(IL-10), 백혈병 억제 인자(LIF), 티오레독신(thioredoxin), 대식세포 콜로니-자극 인자(M-CSF), 골수단세포 성장 인자(myelomonocytic growth factor), 신경 성장 인자(NGF), 온코스타틴 엠(oncostatin M), 혈소판-유도 성장 인자(PDGF), 프로락틴, 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타 2(TGF-β2), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 및 종양 괴사 인자 베타(TNF-β)와 같은 성장 인자를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 또한 약제적으로 유용한 단백질은 포유류 단백질, 예컨대 알파-1-항트립신, 항-비만 단백질, 혈액 단백질, 콜라겐, 콜라게나아제, 엘라스틴, 엘라스타아제, 엔테로펩티다아제, 피브리노겐, 헤모글로빈, 인간 혈청 알부민, 인슐린, 락토페린, 미오글로빈 또는 폐 계면활성 단백질을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.

산업적으로 유용한 펩타이드는 알파-아밀라아제 또는 다른 아밀라아제, 아밀로글루코시다아제(amyloglucosidase), 아리비나아제(arabinase), 카탈라아제(catalase), 셀로바이오하이드로라아제(cellobiohydrolase), 셀룰라아제(cellulases), 키티나아제(chitinase), 키모트립신, 탈수소효소, 엔도-글루카나아제, 키모신, 엔도-갈락타나아제, 에스테라아제, 베타-갈락토시다아제, 알파-갈락토시다이제 또는 다른 갈락토시다아제, 위 리파아제, 글루카나아제, 글루코오스 이소머라아제, 헤미-셀룰라아제, 가수분해효소, 이소머라아제, 리그니나아제, 리파아제, 리아제(lyases), 리소자임, 산화효소, 산화환원효소, 파파인(papain), 펙티나아제, 펙틴 리아제, 퍼옥시다아제, 포스파타아제, 피타아제(phytase), 프로테아제, 풀루라나제(pullulanases), 환원효소, 세린 프로테아제, 티오레독신, 전이효소, 트립신, 및 크실라나아제를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.

다음의 실시예에 의하여 본 발명을 설명하고자 하지만 이에 의하여 본 발명이 한정되지는 않는다.

본 발명을 다음과 같은 도면과 관련하여 설명할 수 있다:

도 1은 16.0 kDa 올레오신 단백질(SEQ. ID. NOS.:2 및 3)을 인코딩하는 아마 게놈 클론의 DNA 서열(SEQ. ID. NO.:1)을 나타낸 것이다.

도 2는 18.6 kDa 올레오신 단백질(SEQ. ID. NO.:5)을 인코딩하는 아마 게놈 클론의 DNA 서열(SEQ. ID. NO.:4)을 나타낸 것이다.

도 3은 2S 저장 단백질(SEQ. ID. NO.:7)을 인코딩하는 아마 게놈 클론의 DNA 서열(SEQ. ID. NO.:6)을 나타낸 것이다.

도 4는 54.5 kDa 레구민-유사 종자 저장 단백질(SEQ. ID. NO.:9-12)을 인코딩하는 아마 게놈 클론의 DNA 서열(SEQ. ID. NO.:8)을 나타낸 것이다.

도 5는 아마 올레오신 DNA 서열로써 탐사된 아마 게놈 DNA을 서던 블러트 분석한 것을 나타낸 것이다.

도 6은 아마 올레오신의 종자 특이적 발현의 노던 블러트 분석을 나타낸 것이다.

도 7은 종자 발생동안의 아마 올레오신의 발생 발현을 노던 불러트 분석한 것을 나타낸 것이다.

도 8은 아마 올레오신 프로모터-GUS-아마 종결자 유전자 구조물로 포격된 아마 배아의 GUS 활성을 나타낸 것이다.

도 9는 2S 단백질 유전자 프로모터 GUS 융합체로 형질전환된 식물체의 아라비돕시스 종자 및 발생중인 아마 배아에서의 GUS의 발현을 나타낸 것이다.

도 10은 리닌(linin) 프로모터-GUS-리닌 종결자 유전자 구조물로 형질전환된 형질전환 아마 식물체에서의 GUS의 조직 특이적 발현을 나타낸 것이다.

도 11은 리닌 프로모터-GUS-리닌 종결자 유전자 구조물로 형질전환된 형질전환 아마 식물체에서의 GUS의 일시적 발현을 나타낸 것이다.

도 12는 리닌 프로모터-GUS-리닌 종결자 유전자 구조물로 형질전환된 형질전환 브라시카 나푸스(Brassica napus) 식물체(L1 내지 L9)에서의 GUS의 발현을 나타낸 것이다.

도 13은 종자 발생의 서로 다른 단계에서 리닌 프로모터-GUS-리닌 종결자 유전자 구조물로 형질전환된 형질전환 아라비돕시스 식물체에서의 GUS의 발현을 나타낸 것이다.

실시예 1

종자 특이적 아마 프로모터의 분리

아마 종자 특이적 cDNA-라이브러리로부터 종자 특이적 cDNA 클론을 분리하였다. 이들 cDNA 클론을 시퀀싱하고, Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)를 사용하여 이들 서열을 진뱅크(Genbank)와 같은 다른 공지된 데이터베이스의 서열들과 비교하였다. 이들 비교를 통하여 몇몇 분리된 cDNA에서 유래된 아미노산이 올레오신, 2S-알부민 및 레구민-유사 저장 단백질의 저분자량 종류 및 고분자량 종류 모두에 대하여 높은 정도의 유사성을 갖는다는 것이 밝혀졌다. 올레오신, 2S-알부민 및 레구민-유사 저장 단백질을 인코딩하는 cDNA(또는 그 일부분)로부터 각각 프로브를 제조하였으며, 이들을 4 가지의 녹병(rust) 저항 유전자에 대하여 동형접합성인 아마 계통 포지(Forge)로부터 제조된 게놈 라이브러리를 스크리닝하는데 사용하였다(Anderson et al. (1997), The Plant Cell 9:641-651). 매우 엄격한 스크리닝 후, 각 프로브에 대하여 양성인 몇몇 람다 클론을 동정하였다. 삽입단편을 플라스미드 벡터 pBluescript에 서브클로닝하고 시퀀싱하였다. 서열 정보에 의하여 올레오신, 2S 알부민 및 cDNAs 레구민-유사 cDNAs의 게놈 대응부를 분리해냈다는 것을 확인하였다. 고분자량 및 저분자량 올레오신 이소형(isoform), 2S-알부민 및 레구민-유사 유전자를 인코딩하는 서열을 포함하는 게놈 클론의 서열정보를 도 1 내지 도 4에 각각 나타내었다.

도 1 및 SEQ. ID. NO.:1은 16.0 kDa 올레오신 단백질(저분자량 또는 L-이소형)을 인코딩하는 아마 게놈 클론의 DNA 서열을 나타낸 것이다. 추정 조절 요소를 동정하고 표시하였다. 이들은 역반복 서열(염기쌍 805-813 및 821-829; 염기쌍 1858-1866 및 1877-1885), 동방향반복 서열(염기쌍 184-193 및 1102 및 1111; 염기쌍 393-402 및 1701-1710; 염기쌍 683-692 및 1546-1555; 염기쌍 770-781 및 799-810; 염기쌍 955-964 및 1936-1945; 염기쌍 1483-1496 및 1513-1526), 아브시식산 응답 요소(abscisic acid responsive element, ABRE: 염기쌍 1859-1866), CACA box(염기쌍 1933-1936), TATA box(염기쌍 1925-1931) 및 CAT box(염기쌍 1989-1993)을 포함한다. 또한, 폴리아데닐화 신호를 나타내었다(염기쌍 3020-3025). 오픈 리딩 프레임 중간에 1 개의 짧은 인드론(표시됨)이 포함되어 있으며, 2 개의 엑손을 번역하고 IUPAC 1 문자 아미노산 코드로 나타내었다.

도 2 및 SEQ. ID. NO.:4는 18.6 kDa 올레오신 단백질(고분자량 또는 H-이소형)을 인코딩하는 아마 게놈 클론의 DNA 서열을 나타낸 것이다. 추정 조절 요소를 동정하고 표시하였다. 이들은 동방향반복 서열(염기쌍 14-25 및 1427-1438; 염기쌍 80-89 및 1242-1251; 염기쌍 177-186 및 837-846; 염기쌍 1281-1290 및 1242-1251; 염기쌍 1591-1600 및 1678-1687)을 포함한다. 오픈 리딩 프레임에는 인트론을 포함하지 않으며, 이를 번역하여 IUPAC 1 문자 아미노산 코드로 나타내었다.

도 3 및 SEQ. ID. NO.:6는 2S 저장 단백질을 인코딩하는 아마 게놈 클론의 DNA 서열을 나타낸 것이다. 이 클론을 뉴클레오타이드 시퀀싱하여 식물 2S 저장 단백질군과 상동성을 나타내는 174 아미노산의 오픈 리딩 프레임을 갖는다는 것을 확인하였다. 이 서열은 글루타민이 풍부한 전분 QQQGQQQGQQQ(SEQ. ID. NO.:13)의 완벽한 보존성을 갖는 것을 포함하여, 브라시카 올레라세아(Brassica oleracea) 2S 저장 단백질과 38%의 전체적인 상동성을 갖는 오픈 리딩 프레임을 인코딩한다. 게다가, 2S 저장 단백질 유전자 프로모터는 몇몇 추정 프로모터 조절 요소를 함유하였다. 이들은 AT-rich 반복 서열(염기쌍 25-36, 97-108 및 167-190), RY-유사 반복 서열(염기쌍 240-247) G-box-유사 요소(염기쌍 274-280), 종자 특이적 box-유사 모티프(염기쌍 285-290) 및 TATA box(염기쌍 327-333)을 포함한다.

도 4 및 SEQ. ID. NO.:8은 54.4 kDa 아마 레구민-유사 종자 저장 단백질을 인코딩하는 아마 게놈 클론의 DNA 서열을 나타낸 것이다. 상기 레구민-유사 종자 저장 단백질 유전자는 또한 "리닌(linin)"이라고도 칭해진다. 리닌 유전자에서 유래된 아미노산 서열을 알. 코무니스(R. communis)의 레구민-유사 단백질, 엠. 살리시포리아(M. saliciforia), 큐. 로부르(Q. robur) 및 지. 히르수툼(G. hirsutum)의 레구민 전구체, 오. 사티바(O. sativa)의 글루테린 전구체 및 에이. 탈리아나(A. thaliana)의 12S 종자 저장 단백질과 비교하였다. 상기 리닌 유전자는 알. 코무니스(R. communis), 엠. 살리시포리아(M. saliciforia), 큐. 로부르(Q. robur), 지. 히르수툼(G. hirsutum), 오. 사티바(O. sativa) 및 에이. 탈리아나(A. thaliana)의 대응 단백질과의 서열 동일성/유사성이 각각 59/15, 47/16, 50/17, 45/17, 43/18 및 43/18 퍼센트인 것으로 나타났다. 프로모터 부위 내 추정 조절 요소를 동정하고 표시하였다. 이들은 역반복 서열(염기쌍 265-276 및 281-292; 염기쌍 513-524 및 535-545), 반복 서열(염기쌍 1349-1360 및 1367-1378; 염기쌍 1513-1529 및 1554-1572), 아브시식산 응답 요소(ABRE)(염기쌍 1223 및 1231), 레구민 box(RY 반복서열)(염기쌍 1223 과 1231 사이), 가능한 빅실린 box 부위(possible vicilin box region: 염기쌍 1887-1894), CAAT box(염기쌍 1782-1785) 및 TATA box(염기쌍 1966-1970)을 포함한다. 또한, 소포체 멤브레인 표적화를 위한 하나의 펩타이드를 표시하였다(염기쌍 2034-2080). 오픈 리딩 프레임 중간에 3 개의 짧은 인드론(표시됨)이 포함되어 있으며, 4 개의 엑손을 번역하여 IUPAC 1 문자 아미노산 코드로 나타내었다.

도 5는 아마 게놈 DNA의 서던 블러트 분석을 나타낸 것이다. 잎에서 60 ㎍의 아마 게놈 DNA를 분리하고, EcoRI(1 레인), HindIII(2 레인) 및 BamHI(3 레인)로 가수분해시키고, 이를 각각의 레인으로 로딩시켰다. A) 무작위 프라이밍(priming)된 ³²P-표지된 3T cDNA(고분자량 아마 올레오신 이소형)을 사용하여 혼성화시켰다. B) 무작위 프라이밍된 ³²P-표지된 7R cDNA(저분자량 아마 올레오신 이소형)을 사용하여 혼성화시켰다. 그 결과는 3T(고분자량 올레오신 이소형) 및 7R(저분자량 올레오신 이소형) 올레오신 cDNA 모두가 아마 게놈 DNA와 혼성화한다는 것을 보여준다. 보다 상세하게, 상기 결과는 가수분해의 각 레인의 2 개의 밴드에서 보여지는 바와 같이, 3T가 아마에서 2-카피의 유전자를 나타낼 수 있다는 것을 보여준다. 이와 유사하게, 각 가수분해에 나타나는 여러 개의 밴드에서 알 수 있는 바와 같이, 7R은 아마에서 다중유전자(multigen)를 나타낸다고 볼 수 있다.

실시예 2

아마 올레오신 유전자의 종자 특이적 발현

도 6은 아마 올레오신의 종자 특이적 발현의 노던 블러트 분석을 나타낸 것이다. 상이한 조직의 2개의 올레오신 mRNA의 노던 혼성화를 수행하였다. 총 10 ㎍의 RNA를 서로 다른 조직에서 추출하였다(R, 뿌리; C, 자엽; L, 잎; S, 종자 캡슐; E, 배아). (A) 고분자량 (H)-이소형을 인코딩하는 cDNA(도 2에 나타난 바와 같은 코딩 서열과 동일) 및 (B) 저분자량 (L)-이소형을 인코딩하는 cDNA(도 1에 나타낸 바와 같은 코딩 서열과 동일)로 멤브레인을 탐사하였다. 배아 및 배아를 포함하는 종자 캡슐에서만 전사체를 모두 발현시켰다.

실시예 3

종자 발생 동안의 아마 올레오신 유전자의 발생 발현

도 7은 종자 발생 동안의 아마 올레오신의 발생 발현을 노던 블러트 분석한 것을 나타낸 것이다. 레인 당 총 15 ㎍의 RNA를 아가로오스/포름알데히드 겔 상의 각 레인에 로딩시키고, 하이본드 N+ 멤브레인 상에 블러팅시켰다. 10J: 이 멤브레인을 ³²P dCTP 표지 아마 올레오신 cDNA 클론(저분자량 이소형)을 사용하여 탐사하였다. 나타난 단계는 개화기(DPA)가 지난 후 수 일째이다. 3T) 레인 당 총 15 ㎍의 RNA를 아가로오스/포름알데히드 겔 상의 각 레인에 로딩시키고, 하이본드 N+ 멤브레인 상에 블러팅시켰다. 3T: 이 멤브레인을 ³²P dCTP 표지 아마 올레오신 cDNA 클론(고분자량 이소형)을 사용하여 탐사하였다. 두 전사체 모두 발생의 매우 초기 단계(6DPA, 초기 자엽기)에 발현하였다. 16 내지 20 DPA(후기 자엽기)에 최대 발현하였고, 22 DPA(성숙한 배아)에서 감소하였다.

실시예 4

아마 올레오신 조절 서열의 조절적 제어하에서의 베타-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase, GUS)의 일시적 종자 특이적 발현

제한효소 가수분해, 리게이션(ligation) 및 중합효소 연쇄반응법(PCR)을 포함하여, 통상의 분자생물학 기술(예컨대, Sambrook et al.(1990) Molecular Cloning, 2nd ed. Cold Spring Harbor Press 참조)을 사용하여 두 가지의 구조물을 제조하였다.

구조물 pSC54: 벡터 GUSN358>S(Clontech Laboratories)로부터 얻은 베타-글루쿠로니다아제 리포터 코딩 서열을 뉴클레오타이드 21부터 1852까지의 프로모터 서열과 2395부터 3501까지의 종결자 서열 사이에 위치시켰다(도 1에 나타냄). 이러한 삽입단편을 pBluescript로 클로닝시켰고 생성된 벡터를 pSC54라고 명명하였다.

구조물 pSC60: 벡터 GUSN358>S(Clontech Laboratories)로부터 얻은 베타-글루쿠로니다아제 리포터 코딩 서열을 뉴클레오타이드 1부터 2023까지의 프로모터 서열과 2867부터 3925까지의 종결자 서열 사이에 위치시켰다(도 2에 나타냄). 이러한 삽입단편을 pBluescript 내로 클로닝시켰고 생성된 벡터를 pSC60이라고 명명하였다.

pSC54, pSC60 및 프로모터가 없는 GUS 구조물(대조군)을 통상적인 프로토콜(예컨대, Abenes et al.(1997) Plant Cell reports 17:1-7 참조)을 사용하고 입자 포격을 이용하여 아마 배아 내로 도입시켰다. 도 8은 pSC54, pSC60 및 프로모터가 없는 GUS 구조물로 포격된 아마 배아의 GUS 활성을 입자 포격 48 시간 후에 측정하여 나타낸 것이다. 이로부터 알 수 있는 바와 같이, 아마 올레오신 조절 서열은 아마 배아에서의 GUS 발현을 유발하는데 충분하다.

실시예 5

아마 2S 저장 단백질 유전자 프로모터의 조절적 제어하에서 아마 및 아라비돕시스에서의 베타-글루쿠로니다아제(GUS)의 안정적 종자 특이적 발현

도 3에 나타난 DNA 단편으로부터의 5' 및 3' 부위를 프로모터가 없는 GUS pBI101 벡터로 다음과 같이 혼입시킴으로써 GUS 리포터 유전자 구조물을 제조할 수 있다.

도 3에 나타난 DNA 단편의 5' 말단의 400 bp 앰플리콘(amplicon)을 다음과 같은 프라이머(위치는 도 3에 표시)를 사용하여 PCR 증폭시켰다.

5' 프라이머(1): 5'-TCCACTATGTAGGTCATA-3'(SEQ. ID. NO.:14)

3' 프라이머(1): 5'-CTTTAAGGTGTGAGAGTC-3'(SEQ. ID. NO.:15)

또한, 상기 PCR 프라이머는 400 bp 5'UTR 앰플리콘을 GUS 리포터 유전자 앞에 있는 pBI101 벡터의 HindIII/BamHI 자리로 클로닝하는데 사용되는 HindIII 및 BamHI에 대한 제한 자리를 포함한다. 도 3에 나타난 DNA 단편의 3' 비변역 부위(3'UTR)의 736 bp 앰플리콘을 다음과 같은 프라이머(위치는 도 3에 표시)를 사용하여 PCR 증폭시켰다.

5' 프라이머(2): 5'-AGGGGTGATCGATTA-3' (SEQ. ID. NO.:16)

3' 프라이머(2): 5'-GATAGAACCCACACGAGC-3' (SEQ. ID. NO.:17)

또한, 상기 PCR 프라이머는 SacI 및 EcoRI에 대한 제한 자리를 함유한다. pBI101 벡터의 NOS 종결자 부위를 SacI/EcoRI 가수분해에 의하여 제거하고 유사하게 가수분해된 도 3에 나타난 DNA 단편의 736 bp 3' UTR 앰플리콘을 유사하게 가수분해하여 대신 삽입하였다.

그리고 나서, GUS 리포터 구조물을 아그로박테리움 투미파시엔스(Agrobacterium tumifaciens) 계통의 AGLI에 일렉트로포레이션시키고, 전술된 프로토콜에 따라서 아마(Finnegan et al. (1993) Plant Mol Biol. 22(4):625-633) 및 아라비돕시스(Arabidopsis, Valvekens et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5536-5540)를 형질전환시켰다.

GUS 리포터 구조물을 운반하는 아마 및 아라비돕시스 식물체의 다양한 조직을 조직학적으로 검사하여 GUS 활성을 확인하였다. 아마의 경우에 있어서, 발생 중인 종자로부터 절단된 중간-성숙(mid-maturity) 배아, 잎 조직 및 뿌리 조직에 GUS 활성에 대하여 염색하였다. 아라비돕시스에 있어서, 발생 중인 종자를 GUS에 대하여, 그들의 장각과 식물(siliques) 본래의 위치에 염색하였다.

조직을 0.5 mM X-gluc, 0.5 M 인산 칼륨 버퍼(pH7.0), 1 mM EDTA, 0.5 M 소르비탈, 0.5 mM 칼륨 페리시아나이드(potassium ferricyanide) 및 0.5 mM 칼륨 페로시아나이드(potassium ferrocyanide)를 함유하는 조직화학적 버퍼에 침지시킴으로써 GUS 염색을 수행하였다. 염색 반응을 37℃에서 12-16시간 동안 수행하였고, 95% 에탄올을 첨가함으로써 반응을 종결시켰다. 그리고 나서, 포토그래피하기 전에 95%의 에탄올로 세척하는 것을 반복하여 조직으로부터 엽록소를 제거하였다. 도 9는 발생 중인 아마 배아 및 아라비돕시스 종자에서의 강력한 GUS 활성의 명백한 증거를 보여주는 반면, 아마의 뿌리 또는 잎, 또는 아라비돕시스 장각과 식물의 세포벽에서는 GUS 리포터 유전자가 발현한다는 어떠한 증거도 나타내지 않는다.

실시예 6

아마 레구민-유사 저장 단백질 유전자 조절 서열의 조절적 제어하에서 아마, 아라비돕시스 및 브라시카 나푸스에서의 베타-글루쿠로니다아제(GUS)의 안정적 종자 특이적 발현

제한효소 가수분해, 리게이션 및 중합효소 연쇄반응법(PCR)을 포함하여, 통상의 분자생물학 기술을 사용하여 구조물을 제조하였다. GUS 코딩 서열에 리게이션하는데 적합한 입체구조로서, 아마 레구민-유사 종자 저장 단백질의 5' 전사 개시 부위로부터 약 2 킬로베이스를 함유하는 DNA 단편을 얻기 위하여 PCR을 기초로 한 접근이 사용되었다. 이는 발현 분석을 원하는 정확한 서열을 증폭시키기 위하여 중합효소 연쇄반응법을 사용하는 것을 포함한다. 필요한 PCR 증폭을 수행하기 위하여, 다음과 같은 서열을 갖는 2 가지의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 합성하였다(Beckman Oligo 1000M DNA 합성기):

5' 프라이머: 5'TATCTAGA CTCAAGCATACGGACAAGGGT 3'(SJ-634)(SEQ.ID. NO.:18)

이탤릭체로 표시된 염기는 도 4에 나타난 서열의 뉴클레오타이드 위치 1 내지 21에 해당되는 것이다. 프라이머에 있어서 이들 서열의 부가적인 5' 쪽 뉴클레오타이드는 프로모터 서열과 동일하지는 않지만 증폭 산물의 5' 말단에 XbaI 자리를 위치시키기 위하여 포함된 것이다. XbaI(5'-TCTAGA-3')(SEQ. ID. NO.:19) 자리를 밑줄로 표시하였다.

다음과 같은 서열을 갖는 두 번째 (3') 프라이머를 합성하였다.

3' 프라이머 5'GGTTATCATTGTATGAACTGA 3'(SJ-618) (SEQ. ID. NO.:20)

상기 프라이머는 도 4에 기재된 2343부터 2363까지의 염기 서열과 정확하게 상보적인 서열(이탤릭체로 표시)을 포함한다. 천연 NcoI 부위(5'-CCATGG-3') (SEQ. ID. NO.:21)가 염기쌍 2034와 2039 사이의 개시코돈을 스트래들(straddle)한다는 사실 때문에, 상기 프라이머는 추가적인 제한효소 자리를 가지지 않게 설계되었으며, 이에 따라서 저장 단백질 프로모터를 적절한 클로닝 벡터에 삽입하는 것이 가능하게 되었다.

PCR 증폭 반응에 이들 두 가지의 프라이머를 사용하여 아마 종자 저장 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 1과 1342 사이에 5' 말단의 XbaI 부위 및 3' 말단으로부터 302 염기쌍의 NcoI 부위를 포함하는 서열을 함유하는 DNA 단편을 생산하였다. 효소 제조자들이 추천하는 조건과 1분 동안 94℃(변성), 1분 동안 55℃(어닐링) 및 3.5분 동안 72℃(신장)의 온도 프로그램, 및 Pfu 효소(Strategene)를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 도 4에 나타난 레구민 종자 저장 단백질 게놈 클론을 주형으로 하였다.

그리고 난 후, 생성된 증폭 산물을 XbaI과 NcoI으로 가수분해시켜, 원하는 2 kb 프로모터 부위를 제거하였다. 상기 프로모터 단편을 pGUS1318 이라고 칭해지는 NcoI와 XbaI으로 가수분해된 플라스미드의 XbaI 및 NcoI 자리 내로 클로닝하였다(플라스미드 pGUSN358S(Clontech Laboratories)를 NcoI와 EcoRI으로 절단하고, GUS 삽입단편을 다수의 클로닝 자리 내에 NcoI 자리를 포함하도록 개조된 pBluescriptKS+(Stratagene) 내로 클로닝하였다). 프로모터-GUS 융합체를 함유하는 생성된 플라스미드를 pPGUS1318이라고 명명하였다. 또한 아마의 레구민 종자 저장 단백질의 종결자를 상기 게놈 클론으로부터 증폭시켰다. 필요한 PCR 증폭을 수행하기 위하여, 다음과 같은 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 합성하였다: 5'프라이머: 5'GCAAGCTTAATGTGACGGTGAAATAATAACGG 3'(SJ620)(SEQ.ID. NO.:22)

삭제

이탤릭체로 표시된 염기는 도 4에 표시된 서열의 뉴클레오타이드 포지션 3780 내지 3803에 해당하는 것이다. 프라이머 내 이들 서열에 추가적인 5' 부분의 뉴클레오타이드는 프로모터 서열과 동일하지 않지만 증폭 산물의 5' 말단에 HindIII 자리를 위치시키기 위하여 포함된 것이다. HindIII 자리(5'-AAGCTT-3')(SEQ. ID. NO.:23)을 밑줄로 표시하였다.

3'프라이머 5'TAGGTACCTGGCAGGTAAAGACTCTGCTC 3'(SJ-618)(SEQ. ID. NO.:24)

상기 프라이머는 도 4에 표시된 서열의 4311부터 4290까지의 염기와 정확하게 상보적인 서열(이탤릭체로 표시)을 함유한다. 프라이머 내 이들 서열에 추가적인 5' 부분의 뉴클레오타이드는 프로모터 서열과 동일하지 않지만, 증폭 산물의 5' 말단에 KpnI 자리를 위치시키기 위하여 포함된 것이다. 상기 KpnI 자리(5'-GGTACC-3')(SEQ. ID. NO.:25)를 밑줄로 표시하였다.

이들 두 프라이머를 사용하여 PCR 증폭 반응하여 아마 종자 저장 단백질 유전자 종결자의 3779 내지 4311 뉴클레오타이드 사이에, 5' 말단에 HindIII 자리와 3' 말단에 KpnI 자리를 갖는 서열을 함유하는 DNA 단편을 제조하였다. PCR을 사용하는 증폭은 상기한 바와 같은 방법으로 하였다. 증폭 프로모터를 함유하는 상기 pPGUS1318 벡터를 XhoI로 가수분해시키고 Klenow로 처리하여 블런트 말단(blunt end)을 생성하였다. 그리고 나서, KpnI로 벡터를 가수분해시키고, GUS 코딩 서열의 3' 쪽에 위치하도록 상기 증폭된 종결자 서열을 삽입하였다. 아마 저장 단백질 프로모터, GUS 및 아마 종자 저장 단백질 종결자를 함유하는 생성된 벡터를 pPGUST라고 명명하였다.

리닌 프로모터-GUS 코딩 서열-리닌 종결자 서열을 함유하는 pPGUST의 XbaI-KpnI 삽입단편을 pSBS3000의 XbaI-KpnI 자리 내로 연결시켰다(상기 벡터는 아그로박테리움 이원(binary) 프로모터 pPZP221(Hajdukiewicz et al., 1994, Plant Molec. Biol. 25:989-994)로부터 유도된다. pSBS3000에 있어서, 제초제 글루포시네이트 암모늄(glufosinate ammonium)에 대하여 저항성을 부여하기 위하여, pPZP221의 식물 젠타마이신 저항 유전자를 파슬리(parsley) 유비퀴틴 프로모터-포스피노트리신(phosphinothricin) 아세틸 전이효소 유전자-파슬리 유비퀴틴 종결자 서열과 대체하였다.) 생성된 벡터를 pSBS2089라고 명명하였다. 또한, 리닌 프로모터-GUS 코딩 서열-리닌 종결자 서열을 포함하는 pPGUST의 XbaI-KpnI 삽입단편을 아그로박테리움 이원(binary) 플라스미드 pCGN1559의 XbaI-KpnI 자리에 연결시켰다(MacBride and Summerfield, 1990, Plant Molec. Biol. 14 269-276, 항생제 카나마이신에 대한 저항성 부여). 생성된 벡터를 pSBS2083이라고 명명하였다. 플라스미드 pSBS2089 및 pSBS2083을 아그로박테리움 균주 EHA101내로 일렉트로포레이션시켰다. 아그로박테리움 균주 EHA101(pSBS2089)은 아마 및 아라비돕시스 를 형질전환시키는데 사용하였고, 아그로박테리움 균주 EHA101(pSBS2083)은 브라시카 나푸스 를 형질전환시키는데 사용하였다. 아마 형질전환은, 형질전환 분맥(shoots)을 카나마이신 대신에 10 μM L-포스피노트리신에서 선택하는 것을 제외하고는, 실질적으로 Jordan and McHughen (1988) Plant cell reports 7: 281-284에 기재된 바에 따라서 수행하였다. 아라비돕시스의 형질전환은, 80μM의 L-포스피노트리신을 포함하는 아가로오스 플레이트 상에서 추정 형질전환 식물을 선택하는 것을 제외하고는, 실질적으로 "Arabidipsis Protocols; Methods in Molecular Biology" Vol. 82. Edited by Martinez-Zapater JM and Salinas J. ISBN 0-89603-391-0 pg 259-266(1998)에 기재된 바에 따라서 수행하였다. 브라시카 나푸스 의 형질전환은 실질적으로 Moloney et al. (1989). Plant Cell Reports, 8:238-242에 기재된 바에 따라서 수행하였다.

도 10은 리닌-GUS 유전자 구조물(pSBS2089)로 형질전환된 형질전환 아마 식물체에서의 GUS의 조직 특이적 발현을 보여준다. GUS 발현을 뿌리(R), 줄기(S), 잎(L), 눈(B) 및 배아(E)에서 측정하였다. 눈에서 약간의 발현이 나타났으며, 최대 발현은 배아 조직에서 나타났다. 형질전환되지 않은(WT) 조직에서는 어떠한 발현도 발견되지 않았다.

도 11은 리닌-GUS 유전자 구조물(pSBS2089)로 형질전환된 형질전환 아마 식물체에서의 GUS의 일시적 발현을 보여준다. 여기서 알 수 있는 바와 같이, 최대발현은 성숙한(메마르기 전의) 아마 배아에서 발현되었다.

도 12는 리닌-GUS 유전자 구조물(pSBS2083)로 형질전환된 형질전환 브라시카 나푸스 식물체(L1 내지 L9)에서의 GUS의 완전한 발현을 보여준다. 여기서 알 수 있는 바와 같이, 브라시카 나푸스 식물체에서 높은 수준의 발현이 달성 가능하다. 각각의 식물 형질전환체와 비교할 때, 위치 효과에 의한 전형적인 발현의 다양성 또한 관찰할 수 있다.

도 13은 종자 발생 동안 (리닌-GUS 유전자 구조물(pSBS2089)로 형질전환된) 형질전환 아라비돕시스 장각과 식물에서의 GUS의 발현을 보여준다. 여기서 알 수 있는 바와 같이, 아라비돕시스 종자 조직에서 높은 수준의 발현이 달성될 수 있다. 최대 발현은 종자 발생의 4 단계(성숙하지만 완전히 메마르지는 않음)에서 달성된다. 잎, 줄기, 뿌리 및 장각과 식물 세포벽와 같은 비-종자 조직에서는 발현이 발견되지 않았다(결과 미도시).

본 발명은 비록 현재 바람직한 실시예라고 사료되는 것이 무엇인지에 관하여 서술하였지만, 본 발명이 서술된 실시예에 의하여 한정되는 것이 아니라는 것을 이해하여야 한다. 반대로, 본 발명은 첨부되는 청구항의 사상과 범위 내에 포함되는 다양한 변형과 등가적 배열을 포함하는 것을 의도한다.

모든 간행물, 특허 및 특허출원은, 각각의 간행물, 특허 또는 특허 출원이 전체로서 참고문헌으로 포함되기 위하여 특별하고 개별적으로 표시되는 것과 동일한 범위로 전체로서 본 명세서의 참고문헌으로 포함된다.

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<110> Sembiosys Genetics Inc. Commonwealth Scientific <120> Flax Seed Specific Promoters <130> 9369-211 <140> <141> <150> US 60/151,044 <151> 1999-08-27 <150> US 60/161,722 <151> 1999-10-27 <150> CA 2,310,304 <151> 2000-05-30 <160> 25 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 4305 <212> DNA <213> Linum usitatissimum <400> 1 ttcaaaaccc gattcccgag gcggccctat tgaagatatg ggggaagttc gacgagatcg 60 atgtcgggtc gagtgctatg gtgatggtgc cgtttggggg gaggatgagc gagatagcca 120 agactagcat tccgttccca cacagagttg ggaatttgta ccaaatccaa cacttgtcgt 180 attggagcga cgatagggac gcggaaaaac acatccgttg gatcagggag ttgtacgatg 240 atctcgagcc ttatgtgtcg aagaatccga ggtatgctta cgtgaactac agggatctcg 300 acatcgggat gaatggagga ggtgaagggg atgagaaggg tacttatggt gaggctaagg 360 tgtgggggga gaagtacttt ggggtcaact ttgatcggtt ggttcgggtg aagacgattg 420 ttgatcccaa taatgtgttt cgaaacgagc agagcattcc ctcaattcca actcggttat 480 aaggatcaat gatcaatgag aattttcctt tccaatgtga ttacaagttc tattgggtca 540 gctttctcaa ctgctcctat tcatttagat taattcataa caactattaa tttaccagcc 600 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aatgtgaaaa actttacatt tgttattttc tactttaata ctatgctatt 1500 ttcaaaattt gaactttaat actatgtttt tatatagttt agtatatctt aatttttatg 1560 caaattcatc taattgtatt aaactatttt cgatccgtag ctaattattt cgaaggcaag 1620 tcaaagtgtt attgtggact atgtgagcta atattgaacc tttatctctc ccaaccactc 1680 aagttaattg aaccaaactc gatcggttgg gtttcgagct atttcgagcc attgttgtta 1740 tatgcacgtg agatatcaag attgacccga acactttatt atgataatgt agaaaaagaa 1800 aacatattct aagactacat gcatgcaaag tgcaacccct gcatggaaag ctgctcaaca 1860 cgtggcatag actcccgcca cgtgtccatt ccacctcatc acctcacccc caccgttcac 1920 ctcttattat atcacaacaa tcaatcaatc ctactcctcc atactcgaac aaatccgacc 1980 aacttatacc aatattccca aacttgatta atttctcagc aatatggatc agacgcacca 2040 gacatacgcc ggaaccacgc agaacccgag ctatggcggc gggggcacaa tgtaccagca 2100 gcagcagccg aggtcttacc aggcggtgaa ggcggccact gcagccaccg cgggtggatc 2160 cctcatcgtt ctgtccggtc tcatccttac ggccaccgtc atttcactca tcatagccac 2220 ccctctcctt gtcatcttca gccctgttct tgtcccggct ctcatcaccg tcgggctctt 2280 gatcaccggg tttcttgctt ccggtgggtt cggagtcgcc gccgtcaccg tcttgtcctg 2340 gatctatagg tatgtataag ctttggactt tagtattgtt ataaaataca taagctgatt 2400 tatgaacatg gatctcccaa caagagttat ttaaatgcat tctcggtctg actcgatcgg 2460 ttgggttttg agctactcgg tcacaatggt cgggtcggct ctggatctgt tatactaata 2520 tttggaagcc tgaagtttca ttgttctgcc ccaacttccc actacctttt gagggtgtta 2580 agaagccata caaactaatt atgaatccct cccaacaact cagaactcga gtcagtgggt 2640 tgtgacggtt ctctataaac atttcgaaaa tctttgttca atgaacgtag aaatgaccat 2700 gcttgatgat tgtgggtctt ataaggtacg tgaccggcgg gcacccggcg ggaggggatt 2760 cgctggacca ggctaggtcg aagctggccg gaaaggccag ggaggtgaag gacagggcgt 2820 cggagttcgc acagcagcat gtcacaggtg gtcaacagac ctcttaaaga gagtcctcta 2880 gttaaattgg tcttcgtttc tgtttcgtgg cggcttgtaa actctctttt aagtgtgctg 2940 ttttcctttt gtctcgtgtg ttgtaagtga aagtgtaatc gaagttccaa gttggagatg 3000 tttgtaacga tgatgttttc taataatcag agatattaaa agggttgcta atttagtatt 3060 gcgtctgatc tcggaccaaa ctcgcaagta aaattgcaga ggatgagttg tacagaacaa 3120 gcgtgcattg 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Linum usitatissimum <400> 3 Tyr Val Thr Gly Gly His Pro Ala Gly Gly Asp Ser Leu Asp Gln Ala 1 5 10 15 Arg Ser Lys Leu Ala Gly Lys Ala Arg Glu Val Lys Asp Arg Ala Ser 20 25 30 Glu Phe Ala Gln Gln His Val Thr Gly Gly Gln Gln Thr Ser 35 40 45 <210> 4 <211> 3501 <212> DNA <213> Linum usitatissimum <400> 4 tctagacatt tgacataaac cgaattcaaa gaacacaaca ttgactaaca ccaaaaagaa 60 atagagtagt gaaatttgga agattaaaaa atagaaacaa actgattctt agaaagaaga 120 gatgattagg tgctttcagt tcggtctgtc aggaaatcga gatgttcact tatttacatt 180 gtcgattcat ctcccaattg tcctggttcc tttactgtcc gacgcttttt tgaatcccag 240 ttaattccca tcaagtcttc cttcagctgc gtagcactgc tagctccaac atggagcgtg 300 gagtctactc gttcatgggg catcgcaaag gtttgccttc atgttctgct accagccagc 360 gcccaccgcc tcttggttgt gtggacaatt gcggtgaagc gcgcaagttg acatcccata 420 gtctcgacac ttcaccatat ggatgtttaa aacgtatatc acgagtgcga tctacatgtc 480 ccatcacacc acatataaag caatagtttg ggagcttttc atatttgaaa cgggcattga 540 cgacttgccc tctcgataat ttaatctttt tttctcttca gctgattgtg tgcatccatt 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cgagcaggcg aagaggcgca tgcaggatgc tgctgggtat atggggcaga agaccaagga 2340 agttgggcag gagatccaga ggaagtctca ggatgtgaaa gcatcagaca aataaggtga 2400 taataagggg ttttgggttc gtgtgtaaac tggtaaaatg gaaattctgg gttttactgt 2460 acttttgcat gtagtggaat gaatgagttc ttgttctctt ttgtctttta atcataaagt 2520 aagaagcagc atttcatgtt ctggttgaat attgtcaaga attcgcaaca aatttagcta 2580 aaccagttca atcttaccgg ttagacgact tcccagtaag aaacattcca ggtccatccc 2640 ggtataagag tctggacttc tgaaaccttt agaccttgga tttggaaaaa agatgaaacc 2700 tttagaataa attacaacga tggcagattg tacaaaactg gagtcgagat catgtaaatt 2760 agcccataac taagaaccgg cgatgacaac aattactagg aatatggttg ttgggctggt 2820 cggcggctag cggtgatgat ttggaagaat cggggatcca gaatgtgaga accgaatcat 2880 cgacgaacat tacccggcga ggagcccatt tcaagcaact ttggaactcc tatatggctg 2940 ttccagcagg ccacctgctc aagaaagaaa gaagccatgt cagaaatcct tacgaaatct 3000 aactggatgc tgatatgaat ccgccaggtg tgcggagttc tttacaggca ggatctataa 3060 agaagaaaca tgttttgtat tggcattgtt gatgttccaa gcacgcagcg atctatctcc 3120 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Phe Leu Ala Ser Gly Met 100 105 110 Ala Gly Leu Thr Gly Leu Thr Ser Leu Ser Trp Phe Ala Arg Tyr Leu 115 120 125 Gln Gln Ala Gly Gln Gly Val Gly Val Gly Val Pro Asp Ser Phe Glu 130 135 140 Gln Ala Lys Arg Arg Met Gln Asp Ala Ala Gly Tyr Met Gly Gln Lys 145 150 155 160 Thr Lys Glu Val Gly Gln Glu Ile Gln Arg Lys Ser Gln Asp Val Lys 165 170 175 Ala Ser Asp Lys 180 <210> 6 <211> 1676 <212> DNA <213> Linum usitatissimum <400> 6 tccactatgt aggtcatatc catcatttta atttttgggc accattcaat tccatcttgc 60 ctttagggat gtgaatatga acggccaagg taagagaata aaaataatcc aaattaaagc 120 aagagaggcc aagtaagata atccaaatgt acacttgtca tcgccgaaat tagtaaaata 180 cgcggcatat tgtattccca cacattatta aaataccgta tatgtattgg ctgcatttgc 240 atgaataata ctacgtgtaa gcccaaaaga acccacgtgt agcccatgca aagttaacac 300 tcacgacccc attcctcagt ctccactata taaacccacc atccccaatc ttaccaaacc 360 caccacacga ctcacaactc gactctcaca ccttaaagaa ccaatcacca ccaaaaaatg 420 gcaaagctga tgagcctagc agccgtagca acgcagttcc tcttcctgat cgtggtggac 480 gcatccgtcc gaaccacagt gattatcgac gaggagacca accaaggccg cggtggaggc 540 aaggtggcag ggacagcagc agtctgcgag cagcagatcc agcagcgaga cttcctgagg 600 agctgccagc agttcatgtg ggagaaagtc cagaggggcg gccacagcca ctattacaac 660 cagggccgtg gaggaggcga acagagccag tacttcgaac agctgtttgt gacgacctta 720 agcaattgcg caccgcggtg caccatgcca ggggacttga agcgtgccat cggccaaatg 780 aggcaggaaa tccagcagca gggacagcag cagggacagc agcaggaagt tcagaggtgg 840 atccagcaag ctaaacaaat cgctaaggac ctccccggac agtgccgcac ccagcctagc 900 caatgccagt tccagggcca gcagcaatct gcatggtttt gaaggggtga tcgattatga 960 gatcgtacaa agacactgct aggtgttaag gatggataat aataataata atgagatgaa 1020 tgtgttttaa gttagtgtaa cagctgtaat aaagagagag agagagagag agagagagag 1080 agagagagag agagagagag agaggctgat gaaatgttat gtatgtttct tggtttttaa 1140 aataaatgaa agcacatgct cgtgtggttc tatcgaatta ttcggcggtt cctgtgggaa 1200 aaagtccaga agggcggccg cagctactac tacaaccaag gccgtggagg agggcaacag 1260 agccagcact tcgatagctg ctgcgatgat cttaagcaat tgaggagcga gtgcacatgc 1320 aggggactgg agcgtgcaat cggccagatg aggcaggaca tccagcagca gggacagcag 1380 caggaagttg agaggtggtc ccatcaatct aaacaagtcg ctagggacct tccgggacag 1440 tgcggcaccc agcctagccg atgccagctc caggggcagc agcagtctgc atggttttga 1500 agtggtgatc gatgagatcg tataaagaca ctgctaggtg ttaaggatgg gataataaga 1560 tgtgttttaa gtcattaacc gtaataaaaa gagagagagg ctgatggaat gttatgtatg 1620 tatgtttctt ggtttttaaa attaaatgga aagcacatgc tcgtgtgggt tctatc 1676 <210> 7 <211> 174 <212> PRT <213> Linum usitatissimum <400> 7 Met Ala Lys Leu Met Ser Leu Ala Ala Val Ala Thr Gln Phe Leu Phe 1 5 10 15 Leu Ile Val Val Asp Ala Ser Val Arg Thr Thr Val Ile Ile Asp Glu 20 25 30 Glu Thr Asn Gln Gly Arg Gly Gly Gly Lys Val Ala Gly Thr Ala Ala 35 40 45 Val Cys Glu Gln Gln Ile Gln Gln Arg Asp Phe Leu Arg Ser Cys Gln 50 55 60 Gln Phe Met Trp Glu Lys Val Gln Arg Gly Gly His Ser His Tyr Tyr 65 70 75 80 Asn Gln Gly Arg Gly Gly Gly Glu Gln Ser Gln Tyr Phe Glu Gln Leu 85 90 95 Phe Val Thr Thr Leu Ser Asn Cys Ala Pro Arg Cys Thr Met Pro Gly 100 105 110 Asp Leu Lys Arg Ala 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catttttttt caacgtgtcc aatcaatcca 600 caaacaaagc agaagacagg taatctttca tacttatact gacaagtaat agtcttaccg 660 tcatgcataa taacgtctcg ttccttcaag aggggttttc cgacatccat aacgacccga 720 agcctcatga aagcattagg gaagaacttt tggttcttct tgtcatggcc tttataggtg 780 tcagccgagc tcgccaattc ccgtccgact ggctccgcaa aatattcgaa cggcaagtta 840 tggacttgca accataactc cacggtattg agcaggacct attgtgaaga ctcatctcat 900 ggagcttcag aatgtggttg tcagcaaacc aatgaccgaa atccatcaca tgacggacgt 960 ccagtgggtg agcgaaacga aacaggaagc gcctatcttt cagagtcgtg agctccacac 1020 cggattccgg caactacgtg ttgggcaggc ttcgccgtat tagagatatg ttgaggcaag 1080 acccatctgt gccactcgta caattacgag agttgttttt tttgtgattt tcctaagttt 1140 ctcgttgatg gtgagctcat attctacatc gtatggtctc tcaacgtcgt ttcctgtcat 1200 ctgatatccc gtcatttgca tccacgtgcg ccgcctcccg tgccaagtcc ctaggtgtca 1260 tgcacgccaa attggtggtg gtgcgggctg ccctgtgctt cttaccgatg ggtggaggtt 1320 gagtttgggg gtctccgcgg cgatggtagt gggttgacgg tttggtgtgg gttgacggca 1380 ttgatcaatt tacttcttgc ttcaaattct ttggcagaaa acaattcatt agattagaac 1440 tggaaaccag agtgatgaga cggattaagt cagattccaa cagagttaca tctcttaaga 1500 aataatgtaa cccctttaga ctttatatat ttgcaattaa aaaaataatt taacttttag 1560 actttatata tagttttaat aactaagttt aaccactcta ttatttatat cgaaactatt 1620 tgtatgtctc ccctctaaat aaacttggta ttgtgtttac agaacctata atcaaataat 1680 caatactcaa ctgaagtttg tgcagttaat tgaagggatt aacggccaaa atgcactagt 1740 attatcaacc gaatagattc acactagatg gccatttcca tcaatatcat cgccgttctt 1800 cttctgtcca catatcccct ctgaaacttg agagacacct gcacttcatt gtccttatta 1860 cgtgttacaa aatgaaaccc atgcatccat gcaaactgaa gaatggcgca agaacccttc 1920 ccctccattt cttatgtggc gaccatccat ttcaccatct cccgctataa aacaccccca 1980 tcacttcacc tagaacatca tcactacttg cttatccatc caaaagatac ccaccatggc 2040 tagatcatca agccctttgc ttctctcact ctgcattttc gccattctct tccactcttc 2100 tctgggtagg cagcaattcc agcaggggaa cgagtgccag atcgacagga tcgacgcatc 2160 cgagccggac aaaaccatcc aggcagaagc tggcaccatc gaggtatggg accagaaccg 2220 ccagcaattc cagtgcgctg gtgttgccgt tgtaaggcgc accattgagc ccaaaggtct 2280 tctcttgcct ttctacagca acacccctca gctcatctac atcgttcaag gtataaatta 2340 aatcagttca tacaatgata accaccactt cgaatgtatt tatcaaatat caatgatcga 2400 tgcacctgta tgtgttgtgt atattcaggt aggggagtta caggaatcat gttcccakga 2460 tgtccagaga cattcgagga atcccagcag caaggacaac agggccaaca gggtagttcc 2520 caagaccagc accagaagat ccgccgcttc cgtgaaggtg acgtcattgc cgtccctgcc 2580 ggtgtagccc actggtccta caacgatggc aacgaaccag tcatggccat tgttgtccat 2640 gacacttcca gccacctcaa ccaactggac aacaacccca gggtatataa gcattgccgt 2700 agttgctaat aaattgcaca caattggaac tctattttca gtatctaata actttttcct 2760 tttttggcag aacttctact tggcaggaaa cccgagagac gagttcgaac aatcgcagca 2820 aggaggcagg ctgagccgtg gggagagtga aggtggacga ggacgcaggg aacctcttca 2880 acctgcaaca acctcttctt gcggaatcga ctccaagctc atcgcggagg cgttcaatgt 2940 cgacgagaac gtggcaagga ggctacagag cgagaacgac aacagaggcc agatcgtccg 3000 agtcgaaggc gagctcgaca tcgtcagacc tccgaccagt atccaggagg agtcacagga 3060 gcagggaggt cgtggtggtg gccgctacta ctccaatgga gtggaggaga ccttctgctc 3120 catgagacta attgagaaca tcggcgatcc ttctcgggca gacattttca ctccagaagc 3180 cggccgcgtt agatccctca acagccacaa cctccccgtc ctgcaatgga tccagcttag 3240 cgccgagaga ggcgttctct acaatgtata gatctcactc acgcaccaac tctaaattga 3300 atccctaatt atttaattca ccgatatctg accgaccggt ttgaattttg taggaagcga 3360 tcaggctgcc gcactggaac atcaacgcac acagcatagt gtacgcgatc agaggacaag 3420 ccagagtcca gatcgtgaac gaggaaggga attcggtgtt cgatggagtg ctgcaggaag 3480 gacaggtggt gacggtgccg cagaacttcg cggtggtaaa gagatcccag agcgagaggt 3540 ttgagtgggt ggcgttcaag accaacgaca acgcgatggt gaactcgcta gccgggagga 3600 catcggcagt aagggcgatc cccgcggatg tactggctaa cgcctggagg gtgtcgccgg 3660 aggaggcgag gagggtgaag ttcaacaggc aggagactca cttggctagc accaggggcc 3720 agtccaggtc gcccgggagg ttgaatgtcg tcaaggaggt gatcaacttg cttatgtaaa 3780 atgtgacggt gaaataataa cggtaaaata tatgtaataa taataataat aaagccacaa 3840 agtgagaatg aggggaaggg gaaatgtgta atgagccagt agccggtggt gctaattttg 3900 tatcgtattg tcaataaatc atgaattttg tggtttttat gtgttttttt aaatcatgaa 3960 ttttaaattt tataaaataa tctccaatcg gaagaacaac attccatatc catggatgtt 4020 tctttaccca aatctagttc ttgagaggat gaagcatcac cgaacagttc tgcaactatc 4080 cctcaaaagc tttaaaatga acaacaagga acagagcaac gttccaaaga tcccaaacga 4140 aacatattat ctatactaat actatattat taattactac tgcccggaat cacaatccct 4200 gaatgattcc tattaactac aagccttgtt ggcggcggag aagtgatcgg cgcggcgaga 4260 agcagcggac tcggagacga ggccttggat gagcagagtc tttacctgcc agggcgtgaa 4320 ggggaagagc ggccttctgg agtaggagtt cagcaagcgg cggttccttg gcggagtaag 4380 cggacgtaag ggtggntgtc gacgtcntcg tttcnggagg cgnattcatg aagggttaaa 4440 gtcanatctg tagctctcga gtgctcaggg agccnaaaga cgttgggaaa ccgtcgncgt 4500 ttggggcatc agtcngcggg gcacgcttcc ctcctgctgc tccanaancn angtanattt 4560 aaaaganatg ggaaattaan taatggnaat nannaggagg attgnaacgg tcnganccgn 4620 angaanagtt tttannggtt taaatactgg gggagtngna gccngccnct ggttccngtg 4680 tagangaaac caagnnccgg gaggnttnca nnngnnaggg agaaaaagga nncatttnan 4740 nangcngagg gacatgaanc ggtacngagc tgnggttcan nnancggcgn nnggnagtcc 4800 cnngggaccn ggntggggtn anaagggaan ggaacattng gtngnangga naanaccntt 4860 ttacnattgc ctttgcaggn nngtntnggc ncntncgggt nacatnccgc tgcatgggct 4920 ttggggngcc nanaggnagc cncangggna nncngccncc ttgtncangn cgctnaagtt 4980 cnattgtana tggncgttg 4999 <210> 9 <211> 96 <212> PRT <213> Linum usitatissimum <400> 9 Met Ala Arg Ser Ser Ser Pro Leu Leu Leu Ser Leu Cys Ile Phe Ala 1 5 10 15 Ile Leu Phe His Ser Ser Leu Gly Arg Gln Gln Phe Gln Gln Gly Asn 20 25 30 Glu Cys Gln Ile Asp Arg Ile Asp Ala Ser Glu Pro Asp Lys Thr Ile 35 40 45 Gln Ala Glu Ala Gly Glu Val Trp Asp Gln Asn Arg Gln Gln Phe Gln 50 55 60 Cys Ala Gly Val Ala Val Val Arg Arg Thr Ile Glu Pro Lys Gly Leu 65 70 75 80 Leu Leu Pro Phe Tyr Ser Asn Thr Pro Gln Leu Ile Tyr Ile Val Gln 85 90 95 <210> 10 <211> 85 <212> PRT <213> Linum usitatissimum <400> 10 Gly Arg Gly Val Thr Gly Ile Met Phe Pro Xaa Cys Pro Glu Thr Phe 1 5 10 15 Glu Glu Ser Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln Gly Ser Ser Gln 20 25 30 Asp Gln His Gln Lys 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Gln Leu Ser Ala Glu Arg 145 150 155 160 Gly Val Leu Tyr Asn 165 <210> 12 <211> 141 <212> PRT <213> Linum usitatissimum <400> 12 Glu Ala Ile Arg Leu Pro His Trp Asn Ile Asn Ala His Ser Ile Val 1 5 10 15 Tyr Ala Ile Arg Gly Gln Ala Arg Val Gln Ile Val Asn Glu Glu Gly 20 25 30 Asn Ser Val Phe Asp Gly Val Leu Gln Glu Gly Gln Val Val Thr Val 35 40 45 Pro Gln Asn Phe Ala Val Val Lys Arg Ser Gln Ser Glu Arg Phe Glu 50 55 60 Trp Val Ala Phe Lys Thr Asn Asp Asn Ala Met Val Asn Ser Leu Ala 65 70 75 80 Gly Arg Thr Ser Ala Val Arg Ala Ile Pro Ala Asp Val Leu Ala Asn 85 90 95 Ala Trp Arg Val Ser Pro Glu Glu Ala Arg Arg Val Lys Phe Asn Arg 100 105 110 Gln Glu Thr His Leu Ala Ser Thr Arg Gly Gln Ser Arg Ser Pro Gly 115 120 125 Arg Leu Asn Val Val Lys Glu Val Ile Asn Leu Leu Met 130 135 140 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Linum usitatissimum <400> 13 Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln 1 5 10 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 14 tccactatgt aggtcata 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 15 ctttaaggtg tgagagtc 18 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 16 aggggtgatc gatta 15 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 17 gatagaaccc acacgagc 18 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 18 tatctagact caagcatacg gacaagggt 29 <210> 19 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: XbaI site <400> 19 tctaga 6 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 20 ggttatcatt gtatgaactg a 21 <210> 21 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: NcoI site <400> 21 ccatgg 6 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 22 gcaagcttaa tgtgacggtg aaataataac gg 32 <210> 23 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HindIII Site <400> 23 aagctt 6 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 24 taggtacctg gcaggtaaag actctgctc 29 <210> 25 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: KpnI Site <400> 25 ggtacc 6

Claims

(a) 작동가능한 연결 성분으로서,

(1) 올레오신 프로모터, 2S 저장 단백질 프로모터 및 레구민-유사 종자 저장 단백질 프로모터로 구성된 군에서 선택되는 것인, 아마로부터 얻은 종자 특이적 프로모터; 및

(2) 상기 아마 종자 특이적 프로모터에 대하여 비-본래적(non-native)인 발현시키고자 하는 핵산서열을 5'에서 3'전사 방향으로 포함하는 키메라(chimeric) 핵산 구조물을 제조하는 단계;

(b) 상기 키메라 핵산 구조물을 아마 식물체 세포로 도입시키는 단계; 및

(c) 상기 아마 세포를 종자 형성이 가능한 성숙한 아마 식물체로 재배하고,

상기 아마 종자 특이적 프로모터의 조절 하에서 상기 발현시키고자 하는 핵산 서열을 종자 내에서 발현시키는 단계를 포함하는,

아마 종자 내에서 발현시키고자 하는 핵산 서열의 발현방법.
제1항에 있어서, 상기 종자 특이적 프로모터에 의하여 자신의 본래 핵산 서열에 부여되는 조직-특이적 및 종자-특이적 발현 특성 중에서 적어도 하나의 발현 특성이 상기 비-본래적 핵산서열에 부여되는 방법.
삭제
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제1항에 있어서, 상기 아마 종자 특이적 프로모터가

(a) 도 1(SEQ ID NO:1)에 나타난 뉴클레오타이드 1 내지 2023을 포함하는 핵산 서열, 단, T는 또한 U일 수 있다; 또는

(b) 상기 (a)의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 아마 종자 특이적 프로모터가

(a) 도 2(SEQ ID NO:4)에 나타난 뉴클레오타이드 1 내지 1852를 포함하는 핵산 서열, 단, T는 또한 U일 수 있다; 또는

(b) 상기 (a)의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 아마 종자 특이적 프로모터가

(a) 도 3(SEQ ID NO:6)에 나타난 뉴클레오타이드 1 내지 417을 포함하는 핵산 서열, 단, T는 또한 U일 수 있다; 또는

(b) 상기 (a)의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 아마 종자 특이적 프로모터가

(a) 도 4(SEQ ID NO:8)에 나타난 뉴클레오타이드 1 내지 2037을 포함하는 핵산 서열, 단, T는 또한 U일 수 있다; 또는

(b) 상기 (a)의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 발현시키고자 하는 핵산 서열의 발현이 종자 내에서 상기 발현시키고자 하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 재조합 단백질을 축적시키는 것인 방법.
(a) 작동가능한 연결 성분으로서,

(1) 올레오신 프로모터, 2S 저장 단백질 프로모터 및 레구민-유사 종자 저장 단백질 프로모터로 구성된 군에서 선택되는 것인, 아마로부터 얻은 종자 특이적 프로모터; 및

(2) 상기 아마 종자 특이적 프로모터에 대하여 비-본래적인 발현시키고자 하는 핵산 서열을 5'에서 3' 전사 방향으로 포함하는 키메라 핵산 구조물을 제조하는 단계;

(b) 상기 키메라 핵산 구조물을 아마 식물체 세포로 도입시키는 단계; 및

(c) 상기 아마 세포를 종자 형성이 가능한 성숙한 아마 식물체로 재배하고, 상기 아마 종자 특이적 프로모터의 조절 하에서 상기 발현시키고자 하는 핵산 서열을 종자 내에서 발현시키는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조된 형질전환 아마 종자.
제10항에 있어서, 상기 종자 특이적 프로모터에 의하여 자신의 본래 핵산 서열에 부여되는 조직-특이적 및 종자-특이적 발현 특성 중에서 적어도 하나의 발현 특성이 상기 비-본래적 핵산 서열에 부여되는 방법.
삭제
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제11항에 있어서, 상기 아마 종자 특이적 프로모터가

(a) 도 1(SEQ ID NO:1)에 나타난 뉴클레오타이드 1 내지 2023을 포함하는 핵산 서열, 단, T는 또한 U일 수 있다; 또는

(b) 상기 (a)의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 형질전환 아마 종자.
제11항에 있어서, 상기 아마 종자 특이적 프로모터가

(a) 도 2(SEQ ID NO:4)에 나타난 뉴클레오타이드 1 내지 1852를 포함하는 핵산 서열, 단, T는 또한 U일 수 있다; 또는

(b) 상기 (a)의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 형질전환 아마 종자.
제11항에 있어서, 상기 아마 종자 특이적 프로모터가

(a) 도 3(SEQ ID NO:6)에 나타난 뉴클레오타이드 1 내지 417을 포함하는 핵산 서열, 단, T는 또한 U일 수 있다; 또는

(b) 상기 (a)의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 형질전환 아마 종자.
제11항에 있어서, 상기 아마 종자 특이적 프로모터가

(a) 도 4(SEQ ID NO:8)에 나타난 뉴클레오타이드 1 내지 2037을 포함하는 핵산 서열, 단, T는 또한 U일 수 있다; 또는

(b) 상기 (a)의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 형질전환 아마 종자.
제11항에 있어서, 상기 발현시키고자 하는 비-본래적 핵산 서열의 발현이 종자 내에서 상기 발현시키고자 하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 재조합 단백질을 축적시키는 것인 형질전환 아마 종자.
(a) 작동 가능한 연결 성분으로서,

(1) 올레오신 프로모터, 2S 저장 단백질 프로모터 및 레구민-유사 종자 저장 단백질 프로모터로 구성된 군에서 선택되는 것인, 아마로부터 얻은 종자 특이적 프로모터; 및

(2) 상기 아마 종자 특이적 프로모터에 대하여 비-본래적인 발현시키고자 하는 핵산 서열을 5'에서 3' 전사 방향으로 포함하는 키메라 핵산 구조물을 제조하는 단계;

(b) 상기 키메라 핵산 구조물을 아마 식물체 세포로 도입시키는 단계; 및

(c) 상기 아마 세포를 종자 형성이 가능한 성숙한 아마 식물체로 재배하고,

상기 아마 종자 특이적 프로모터의 조절 하에서 상기 발현시키고자 하는 핵산 서열을 종자 내에서 발현시키는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조된 종자를 형성할 수 있는 형질전환 아마 식물체.
(a) 도 1(SEQ ID NO:1)에 나타난 뉴클레오타이드 1 내지 2023을 포함하는 핵산 서열, 단, T는 또한 U일 수 있다; 또는

(b) 상기 (a)의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는,

식물체 내에서 종자 특이적 발현을 유도할 수 있는 분리된 핵산 서열.
(a) 도 2(SEQ ID NO:4)에 나타난 뉴클레오타이드 1 내지 1852를 포함하는 핵산 서열, 단, T는 또한 U일 수 있다; 또는

(b) 상기 (a)의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는,

식물체 내에서 종자 특이적 발현을 유도할 수 있는 분리된 핵산 서열.
(a) 도 3(SEQ ID NO:6)에 나타난 뉴클레오타이드 1 내지 417을 포함하는 핵산 서열, 단, T는 또한 U일 수 있다; 또는

(b) 상기 (a)의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는,

식물체 내에서 종자 특이적 발현을 유도할 수 있는 분리된 핵산 서열.
(a) 도 4(SEQ ID NO:8)에 나타난 뉴클레오타이드 1 내지 2037을 포함하는 핵산 서열, 단, T는 또한 U일 수 있다; 또는

(b) 상기 (a)의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는,

식물체 내에서 종자 특이적 발현을 유도할 수 있는 분리된 핵산 서열.
(a) (1) 도 1(SEQ ID NO:1)에 나타난 뉴클레오타이드 1 내지 2023을 포함하는 핵산 서열, 단, T는 또한 U일 수 있다; 또는

(2) 핵산 서열(a)에 상보적인 핵산 서열; 및

(b) 상기 아마 종자 특이적 프로모터에 대하여 비-본래적인 두 번째 핵산 서열을 포함하는 분리된 키메라 핵산 서열.
(a) (1) 도 2(SEQ ID NO:4)에 나타난 뉴클레오타이드 1 내지 1852를 포함하는 핵산 서열, 단, T는 또한 U일 수 있다; 또는

(2) 핵산 서열(a)에 상보적인 핵산 서열; 및

(b) 상기 아마 종자 특이적 프로모터에 대하여 비-본래적인 두 번째 핵산 서열을 포함하는 분리된 키메라 핵산 서열.
(a) (1) 도 3(SEQ ID NO:6)에 나타난 뉴클레오타이드 1 내지 417을 포함하는 핵산 서열, 단, T는 또한 U일 수 있다; 또는

(2) 핵산 서열(a)에 상보적인 핵산 서열; 및

(b) 상기 아마 종자 특이적 프로모터에 대하여 비-본래적인 두 번째 핵산 서열을 포함하는 분리된 키메라 핵산 서열.
(a) (1) 도 4(SEQ ID NO:8)에 나타난 뉴클레오타이드 1 내지 2037을 포함하는 핵산 서열, 단, T는 또한 U일 수 있다; 또는

(2) 핵산 서열(a)에 상보적인 핵산 서열; 및

(b) 상기 아마 종자 특이적 프로모터에 대하여 비-본래적인 두 번째 핵산 서열을 포함하는 분리된 키메라 핵산 서열.
(a) 제 15 항에 따른 키메라 핵산 서열을 식물 세포에 도입시키는 단계; 및

(b) 상기 식물 세포를 종자 형성이 가능한 성숙한 식물체로 성장시키고, 이 때, 두 번째 핵산 서열을 종자 특이적 프로모터의 조절하에서 종자 내 발현시키는 단계를 포함하는 식물 종자 내에서의 발현시키고자 하는 핵산 서열의 발현 방법.
제28항에 있어서, 상기 식물 세포가 콩(Glycine max), 평지씨(Brassica napus, Brassica campestris), 해바라기(Helianthus annuus), 코튼(Gossypium hirsutum), 콘(Zea mays), 타바코(Nicotiana tobacum), 알팔라파(Medicago sativa), 밀(Triticum sp.), 보리(Hordeum vulgare), 귀리(Avena sativa L.), 사탕수수(Sorghum bicolor), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 감자(Solanum sp.), 아마/아마인(Linum usitatissimum), 홍화(Carthamus tinctorius), 기름 야자(Eleais guineeis), 땅콩(Arachis hypogaea), 브라질 너트(Bertholletia excelsa), 코코넛(Cocus nucifera), 피마자(Ricinus communis), 고수풀(Coriandrum sativum), 호박(Cucurbita maxima), 호호바(Simmondsia chinensis) 및 쌀(Oryza sativa)로 구성되는 식물군 중에서 선택되는 방법.
제28항의 방법에 따라서 제조된 식물체.
제24항에 따른 키메라 핵산 서열을 포함하는 식물 세포.
제24항에 따른 키메라 핵산 서열을 포함하는 식물 종자.
제25항의 방법에 따라서 제조된 식물체로부터 얻은 식물 종자.
제 23 항에 따른 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터.
제24항에 따른 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터.
(a) 도 1(SEQ ID NO:1), 도 2(SEQ ID NO:4), 도 3(SEQ ID NO:6) 또는 도 4(SEQ ID NO:8)에 나타난 핵산 서열, 단, T는 또한 U일 수 있다; 또는

(b) 상기 (a)의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 서열.