JP2009525750A - 色素体ゲノム内に挿入された外来遺伝子の二次組換えを防止するための色素体形質転換システム - Google Patents

Abstract

本発明は、色素体ゲノム内に挿入された外来遺伝子の二次組換えを防止するための色素体形質転換システムに関するもので、より詳細にはタバコ以外の生物から分離したプロモーターとターミネーターを含んだ色素体形質転換用発現ベクターに関するものである。本発明の色素体形質転換用組換え発現ベクターは、既存のタバコ由来プロモーター／ターミネーター（例、ｒｒｎプロモーター／ｐｓｂＡターミネーター）と比較して同等な程度に色素体で外来タンパク質を効果的に大量生産することができると同時に、色素体内の二次組換えを防止することができるので、目的とする外来遺伝子を安全かつ正常に形質転換して外来タンパク質を発現する形質転換植物体を製造するのに極めて有用である。

Description

本発明は、色素体ゲノム内に挿入された外来遺伝子の二次組換えを防止するためのベクター開発に関するもので、具体的にはタバコ以外の生物から分離したプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）とターミネーター（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）を含んだ色素体形質転換用発現ベクターに関するものである。

色素体は、光合性を担当する葉緑体（ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）、澱粉保存をする澱粉体（ａｍｙｌｏｐｌａｓｔ）、色素を含まない白色体（ｌｕｅｋｏｐｌａｓｔ）、花及び果物の色に関与する有色体（ｃｈｒｏｍｏｐｌａｓｔ）などに分類され、植物細胞一つに２００個までの色素体が存在し、一つの色素体は１００個のゲノムを有していて、１０，０００〜５０，０００コピーの遺伝子が存在する。一方、植物の核は、普通１〜２コピーのゲノムを有している。したがって、色素体形質転換による外来遺伝子の導入は、核を形質転換させた時と比べて目的タンパク質を約１０，０００倍以上効率的に生産することができる。

色素体形質転換に関する大部分の研究がタバコで行なわれており、それ以外にシロイヌナズナ、じゃがいも、トマトなどで成功した事例がある。しかし、タバコ以外の植物体では形質転換効率が非常に低いことが知られている。このような低い効率は、色素体の形質転換が非常に不充分に起きて、結果的に形質転換された植物体を選別する過程に長い時間と複雑な作業が要求されるからであると考えられる。タバコの場合、幾多の研究を通じてその特性が広く知られているので、比較的高い効率の達成が可能である。

最近、前記のような理由で色素体形質転換方法によって外来遺伝子を植物に導入することによって新しい形質を植物に付与する方法が開発された（Ｓｖａｂ，Ｚ．， Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．，Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，１９９０年，第８７巻，８５２６−８５３０頁（非特許文献１）；Ｓｔａｕｂ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０００年，第１８巻，３３３−３３８頁（非特許文献２））。このような色素体形質転換方法は、大きく分けて色素体形質転換工程と形質転換された植物体の選抜工程とからなる。

色素体形質転換でホモプラスミー（ｈｏｍｏｐｌａｓｍｙ）を作る長期間の選抜過程と、低い形質転換効率の問題点を克復して、簡便で効率的な形質転換方法を開発するために、大韓民国公開特許第２００２−００２１８号では、核に導入したリコンビナーゼが色素体に移動するようにした植物体を使用して、目的遺伝子配列とマーカー遺伝子配列を含む色素体形質転換用ベクターを製作して、色素体形質転換を遂行した後、色素体でのマーカー遺伝子の発現程度によって選別することで、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）効率と形質転換効率が高い色素体形質転換方法を完成した。

組換えタンパク質の生産は、微生物と動物細胞システムを使用して主になされてきたが、最近、植物と植物細胞培養を通じて組換えタンパク質を生産しようとする研究が活発に進行されている。植物を使用した外来遺伝子の形質転換は、アグロバクテリウムを媒介にした形質転換方法が主に使用されている。植物発現システムは、微生物発現システムが有している解読後の修飾過程の短所を克復することができ、生産された組換えタンパク質の活用価値を高めることができる。また、植物細胞の培地や培養条件が動物細胞に比べて簡単で、比較的安価で動物ウイルスや毒素などの感染の危険性が少ないという長所がある（Ｄｏｒａｎ，Ｐ．Ｍ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０００年，第１１巻，１９９−２０４頁（非特許文献３））。最近、植物細胞培養を使用して外来タンパク質を発現しようとする研究が多く遂行されており、モデルシステムとしては、β−グルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）（Ｋｕｒａｔａ，Ｈ．，Ｔ．Ｔａｋｅｍｕｒａ，Ｓ．Ｆｕｒｕｓａｋｉ，ａｎｄ Ｃ．Ｉ．Ｋａｄｏ，Ｊ Ｆｅｒｍｅｎｔ Ｂｉｏｅｎｇ，１９９８年，第８６巻，３１７−３２３頁（非特許文献４））、抗体（ＬａＣｏｕｎｔ，Ｗ．，Ｇ．Ａｎ，Ｊ．Ｍ．Ｌｅｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ．，１９９７年，第１９巻，９３−９６頁（非特許文献５））、インターロイキン（Ｍａｇｎｕｓｏｎ，Ｎ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅ Ｐｕｒｉｆ，１９９８年，第１３巻，４５−５２頁（非特許文献６））、リシン（ｒｉｃｉｎ）（Ｓｅｈｎｋｉ，Ｐ．Ｃ．ａｎｄ Ｒ．Ｊ．Ｆｅｒｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ，１９９９年，第１５巻，１８８−１９５頁（非特許文献７））、α１−アンチトリプシン（Ｔｅｒａｓｈｉｍａ，Ｍ．ら，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９９年，第５２巻，５１６−５２３頁（非特許文献８））などがある。

植物発現システムの宿主細胞としては、タバコ懸濁細胞または根毛が主に使用されており、これらは形質転換が容易で蛍光測定が比較的易しくて成長速度が早い（Ｗｏｎｇｓａｍｕｔｈ，Ｒ．，Ｐ．Ｍ．Ｄｏｒａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，１９９７年，第５４巻，４０１−４１５頁（非特許文献９））。また、組換えタンパク質発現に関与するプロモーターによって多様な植物種を宿主細胞に使用することができる。一例として、スクロースの枯渇を信号にして組換えタンパク質発現を誘導するプロモーターを使用するための稲細胞培養がある（Ｔｅｒａｓｈｉｍａ，Ｍ．ら， Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９９年，第５２巻，５１６−５２３頁（非特許文献８））。

既存のタバコ葉緑体形質転換に使用するプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）／ターミネーター（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）システムは、タバコ由来のプロモーターとターミネーターを使用するので形質転換体が作られる過程で初めて相同組換えが起きた後、以後ターミネーター部位と既存タバコ葉緑体ゲノム内の同一な塩基配列との間で再度組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が起きて、非正常的な葉緑体ゲノムを有する植物体が生産される（Ｓｔａｕｂ ＪＭ，Ｍａｌｉｇａ Ｐ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９４年，第９１巻，７４６８−７４７２頁（非特許文献１０）；Ｓｖａｂ Ｚ，Ｍａｌｉｇａ Ｐ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９３年，第９０巻，９１３−９１７頁（非特許文献１１））。本発明者らは、既存の典型的なｒｒｎプロモーターとｐｓｂＡターミネーターを有する色素体形質転換ベクターを使用した場合、１００％すべての形質転換植物体で二次組換えが起きて、約５０％の確率で二次組換えによって生成される小さな大きさのサブゲノム（ｓｕｂｇｅｎｏｍｅ）が大部分を占める非正常的な色素体形質転換体が生産されることを確認したが、このような場合には、導入遺伝子の安定的維持及び発現が保障されなかった。

Ｓｖａｂ，Ｚ．， Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．，Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，１９９０年，第８７巻，８５２６−８５３０頁 Ｓｔａｕｂ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０００年，第１８巻，３３３−３３８頁 Ｄｏｒａｎ，Ｐ．Ｍ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０００年，第１１巻，１９９−２０４頁 Ｋｕｒａｔａ，Ｈ．，Ｔ．Ｔａｋｅｍｕｒａ，Ｓ．Ｆｕｒｕｓａｋｉ，ａｎｄ Ｃ．Ｉ．Ｋａｄｏ，Ｊ Ｆｅｒｍｅｎｔ Ｂｉｏｅｎｇ，１９９８年，第８６巻，３１７−３２３頁 ＬａＣｏｕｎｔ，Ｗ．，Ｇ．Ａｎ，Ｊ．Ｍ．Ｌｅｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ．，１９９７年，第１９巻，９３−９６頁 Ｍａｇｎｕｓｏｎ，Ｎ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅ Ｐｕｒｉｆ，１９９８年，第１３巻，４５−５２頁 Ｓｅｈｎｋｉ，Ｐ．Ｃ．ａｎｄ Ｒ．Ｊ．Ｆｅｒｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ，１９９９年，第１５巻，１８８−１９５頁 Ｔｅｒａｓｈｉｍａ，Ｍ．ら，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９９年，第５２巻，５１６−５２３頁 Ｗｏｎｇｓａｍｕｔｈ，Ｒ．，Ｐ．Ｍ．Ｄｏｒａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，１９９７年，第５４巻，４０１−４１５頁 Ｓｔａｕｂ ＪＭ，Ｍａｌｉｇａ Ｐ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９４年，第９１巻，７４６８−７４７２頁 Ｓｖａｂ Ｚ，Ｍａｌｉｇａ Ｐ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９３年，第９０巻，９１３−９１７頁

本発明の目的は、色素体形質転換時に発生する二次組換えを防止するための色素体形質転換用組換え発現ベクター、前記ベクターを使用した外来遺伝子形質転換植物体の製造方法及び前記方法によって外来遺伝子が形質転換された形質転換植物体を提供することである。

前記目的を達成するために、本発明は対象植物体のゲノム内に存在するＤＮＡ塩基配列と相同性が低い外来プロモーター、リボソーム結合部位（ｒｂｓ）配列、対象植物体の色素体ゲノム内に存在する ＤＮＡポリヌクレオチド配列と相同性が低い外来ターミネーターを順次に含む色素体形質転換用組換え発現ベクターを提供する。

また、本発明は、前記発現ベクターを使用した外来遺伝子形質転換植物体の製造方法を提供する。

同時に、本発明は、前記製造方法によって外来遺伝子が形質転換された形質転換植物体を提供する。

以下、本発明を詳しく説明する。

既存のタバコ由来プロモーター／ターミネーターを有する葉緑体形質転換ベクターに外来遺伝子を挿入して葉緑体形質転換を遂行すると、元々形質転換ベクターに存在するｐｓｂＡターミネーターと外来遺伝子に存在するｐｓｂＡターミネーターとの間の単一交差によってお互いに異なる大きさの色素体ゲノムが形成される（図１ａ）。それに加えて、元々色素体形質転換ベクターに存在するｔｒｎＩとｐｓｂＡターミネーター部位が、元々色素体ゲノムに存在するｔｒｎＩとｐｓｂＡターミネーター部位と二重交差によってお互いに異なる大きさの色素体ゲノムを形成することができる（図１ｂ）。本発明者らは、ＰＣＲ分析、配列分析及びサザンブロットを通じて前記現象を確認した（図２〜図７参照）。

そこで、本発明者らは、タバコに由来したｒｒｎプロモーターとｐｓｂＡターミネーターの代りに稲（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に由来したｃｌｐプロモーターと、大膓菌に由来したｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーターを使用して、色素体形質転換用組換え発現ベクターを製作した（図８参照）。本発明者らは、前記組換え発現ベクターに外来遺伝子であるＧＦＰ挿入した後、前記ＧＦＰ形質転換用組換え発現ベクターをタバコ植物体に形質転換した。以後、前記形質転換植物体を対象に選別遺伝子を対象に多様な組合のプライマーを使用したＰＣＲ分析及びプローブを製作して、サザンブロットを遂行して本発明の色素体形質転換用組換え発現ベクターを使用時、既存ベクターと異なり二次組換えが発生しないことを確認した（図９、図１０参照）。本発明者らは、外来遺伝子として導入されたＧＦＰが正常に発現するかどうか確認するために、蛍光顕微鏡でＧＦＰ活性を調査した。その結果、形質転換植物体の葉緑体でも既存に使用したプロモーターを使用した場合のようにＧＦＰが正常に発現することを確認した（図１１参照）。それに加えて、本発明者らは、前記形質転換植物体を対象にノーザンブロットを遂行して外来遺伝子であるＧＦＰが正常に転写されて発現することを確認した（図１２参照）。

前記結果を通じて、本発明の色素体形質転換用組換え発現ベクターは、既存の発現ベクター使用時に発生した二次組換えを防止するので、正常に外来遺伝子を形質転換植物体に導入して発現させるのに有用に使用することができる。

本発明は、対象植物体の色素体ゲノム内に存在するＤＮＡ塩基配列と相同性が低い外来プロモーター、ｒｂｓ配列、対象植物体の色素体ゲノム内に存在するＤＮＡ塩基配列と相同性が低い外来ターミネーターを順次に含む、色素体形質転換用組換え発現ベクターを提供する。前記組換え発現ベクターは、色素体内の二次組換えを防止することで、外来遺伝子が安全に形質転換して正常に形質転換植物体内で発現することができるようにする。

前記組換え発現ベクターにおいて、外来プロモーターは前記対象植物体の色素体ゲノム内に存在するＤＮＡ塩基配列と相同性が低い外来プロモーターなら、いずれのものを使用してもかまわない。前記プロモーターの塩基配列は、１００ヌクレオチド以上に構成された連続されたＤＮＡ断片を意味し、前記外来プロモーターは、前記の塩基配列と９０％以下の相同性を有することが好ましく、８０％以下の相同性を有することがより好ましく、７０％以下の相同性を有することがさらに好ましく、５０％以下の相同性を有することが最も好ましいが、これに限定されるものではない。本発明者らは、稲に由来したｃｌｐプロモーターを使用し、前記ｃｌｐプロモーターは配列番号１の配列であることが好ましいが、これに限定されるものではなく、対象植物の葉緑体プロモーターと相同性が低いいずれの原核生物類型のプロモーター配列でも、本発明の組換え発現ベクターに含ませることができる。ここで、対象植物体から稲は除く。

前記組換え発現ベクターにおいて、外来ターミネーターは前記対象植物体の色素体ゲノム内に存在するポリヌクレオチド配列と相同性が低い外来ターミネーターならいずれのものでも使用してもかまわない。前記ターミネーターの塩基配列は、１００ヌクレオチド以上に構成された連続したＤＮＡ断片を意味し、前記外来ターミネーターは前記ターミネーター塩基配列と９０％以下の相同性を有することが好ましく、８０％以下の相同性を有することがより好ましく、７０％以下の相同性を有することがさらに好ましく、５０％以下の相同性を有することが最も好ましいが、これに限定されるものではない。また、前記ターミネーターは、原核生物から由来したものが好ましく、大膓菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＨＣＥ１９に由来したｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーター（配列番号２）であることがさらに好ましいが、これに限定されるものではなく、対象植物体の色素体ゲノム内のＤＮＡと塩基配列と低い相同性を有するすべてのターミネーターを本発明の組換え発現ベクターに含ませることができる。

前記発現ベクターにおいて、追加的に形質転換後植物体選別のために選別遺伝子を含ませることができる。前記選別遺伝子としては、ａａｄＡまたはｇｆｐなどがあるが、これに限定されるのではなく、当業界の当業者に公知された配列を有し、外来遺伝子の発現に影響を及ぼさない遺伝子なら選別遺伝子に使用することができる。

前記発現ベクターの対象植物体は、タバコ、緑豆、インゲン豆、エンドウ、じゃがいも、カッサバ、さつま芋、大豆、菜の花、ひまわり、綿、トマト、茄子、にんじん、唐辛子、白菜、大根、すいか、きゅうり、メロン、春菊、ほうれんそう、キャベツ、いちご、菊、バラ、カーネーション、ペチュニアまたはシロイヌナズナであることが好ましいが、これに限定されるのではなく、当業界の当業者に公知されたすべての植物体を対象に本発明の組換え発現ベクターを使用することができる。

また本発明は、前記発現ベクターを使用した外来遺伝子形質転換植物体の製造方法を提供する。

前記製造方法は、下記の工程を含む。
１）本発明の色素体形質転換用組換え発現ベクターに外来遺伝子配列を挿入する工程、
２）工程１）の外来遺伝子を挿入した色素体形質転換用組換え発現ベクターを植物体の葉に形質転換する工程、
３）工程２）の植物体の葉を選抜培地を使用して抵抗性幼い芽（ｓｈｏｏｔ）を誘導する工程、
４）工程３）の幼い芽を再分化して再誘導する工程、
５）工程４）の再誘導された幼い芽からＤＮＡを抽出して外来遺伝子導入を確認して選別する工程、及び
６）工程５）の選別された形質転換植物体を栽培する工程。

前記製造方法において、工程５）の外来遺伝子導入確認方法としては、ＰＣＲ、ノーザンブロット、サザンブロット方法を使用することができるが、これらに限定されるのではなく、当業界の当業者に知られた外来遺伝子導入確認方法ならすべて使用可能である。ＰＣＲ方法の場合、プライマーは当業者に知られたプライマーデザインプログラムを使用して製作して、前記確認方法に使用することができる。ノーザンブロットとサザンブロットの場合、プローブは前記発現ベクターに存在する選別遺伝子または外来遺伝子の配列を使用して製作することができる。

併せて、本発明は前記製造方法によって外来遺伝子が形質転換されたことを特徴とする形質転換植物体を提供する。

前記外来遺伝子は、当業界の当業者が目的とするすべての外来タンパク質の配列が使用可能であり、例えば、人体血清アルブミン、抗細菌ペプチド、人体インターフェロンアルファ、人体インターフェロンガンマなどの医薬用高付加価値タンパク質、コレラワクチン、破傷風ワクチン、炭疽菌ワクチン、動物ワクチンを含むワクチン及び抗体の配列を使用することができるが、これらに限定されるものではない。

また、前記植物体は、タバコ、緑豆、インゲン豆、エンドウ、じゃがいも、カッサバ、さつま芋、大豆、菜の花、ひまわり、綿、トマト、茄子、にんじん、唐辛子、白菜、大根、すいか、きゅうり、メロン、春菊、ほうれんそう、キャベツ、いちご、菊、バラ、カーネーション、ペチュニアまたはシロイヌナズナであることが好ましいが、これらに限定されるものではない。

本発明の色素体形質転換用組換え発現ベクターは、既存のタバコ由来プロモーター／ターミネーター（ｒｒｎプロモーター／ｐｓｂＡターミネーター）の代りに稲のｃｌｐプロモーターと大膓菌のｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーターを含む。このようなベクターは、植物の色素体形質転換時、既存のタバコ由来プロモーター／ターミネーターと比べて同等な程度に外来タンパク質を効果的に大量生産することができると同時に、色素体内の二次組換えを防止することができる。

以下、本発明を実施例によってさらに詳しく説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであり、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。

一般的な葉緑体形質転換ベクターを使用した色素体形質転換植物体での二次組換えの確認
本発明者らは、アメリカのダニエル（Ｄａｎｉｅｌｌ）教授研究室から分譲を受けた葉緑体形質転換ベクターＣｔＶ２（Ｇｕｄａ Ｇ，Ｌｅｅ ＳＢ，Ｄａｎｉｅｌｌ Ｈ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ，２０００年、第１９巻，２５７−２６頁）を変形して、ｐＴＩＧ ベクター（Ｊｅｏｎｇ ＳＷ，Ｊｅｏｎｇ ＷＪ，Ｗｏｏ ＪＷ，Ｃｈｏｉ ＤＷ，Ｐａｒｋ ＹＩ，Ｌｉｕ ＪＲ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ，２００４年，第２２巻，７４７−７５１頁）と同じ方法でＧＦＰを有する典型的な葉緑体形質転換ベクターＣｔＶＧを対照として製作（図８ｂ）し、葉緑体形質転換を遂行して対照色素体形質転換植物体を生産した。二次組換えが発生したことを調査するために、下記のような実験を遂行した。

色素体形質転換植物体で分離した１０〜１００ｎｇのゲノミックＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを遂行した。ＰＣＲ条件は下記に示す。ｅｘＴａｑ酵素（Ｔａｋａｒａ，日本）とＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）ＰＣＲ ｐｒｅｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ，韓国）を使用して、９４℃で５分間の前−変性反応以後、９４℃で１分間変性反応、５５℃で１分間プライマー結合反応、７２℃で１〜５分間伸長反応を３０回反復した後、７２℃で１０分間伸長反応を遂行した。

サザンブロット分析のためのすべてのＤＮＡは、植物用ＤＮＡ抽出キット（ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮＥ，ドイツ）を使用して抽出した。抽出したＤＮＡ４μｇをＢａｍＨＩ、Ｂｇｌ ＩＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素でそれぞれ処理して、１％アガロースゲルで電気泳動して分離した。以後、ブロッティング膜（Ｚｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ ＧＴ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，米国）にブロッティングした。プローブの準備は、下記のように遂行した。ａａｄＡプローブは、ａａｄ５プライマー（配列番号１６）とａａｄ３プライマー（配列番号１７）を使用して、ベクターにあるａａｄＡ遺伝子を鋳型にＰＣＲで合成して分離したバンドを［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。ｔｒｎＡプローブは、ｔｒｎＡＦ１プライマー（配列番号１９）とｔｒｎＡＲ１プライマー（配列番号２０）を使用してベクターにあるｔｒｎＡ遺伝子を鋳型にＰＣＲで合成して分離したバンドを［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。ｔｒｎＩプローブは、ｔｒｎＩＦ３プライマー（配列番号１４）とｔｒｎＩＲ４プライマー（配列番号１８）を使用し、ベクターにあるｔｒｎＩ遺伝子を鋳型にＰＣＲで合成して分離したバンドを［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識して準備した。予備混成化（Ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）及び混成化（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）過程は、７％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を使用して６５℃でひと晩遂行した。反応が終わった膜は、５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含んだ２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ：ｐＨ７．２）で６５℃で３０分間洗浄して３時間露出させた。

既存のタバコ由来プロモーター／ターミネーターを有する外来遺伝子発現ベクターを使用して形質転換された色素体で、二次組換えによって２１ｋｂと１３９ｋｂの異なる大きさの色素体ゲノムが生成されるモデルを図１で示している。まず、葉緑体形質転換ベクターによって外来遺伝子が色素体ゲノムに挿入された以後、ｐｓｂＡターミネーター部位と、導入した外来遺伝子に存在するｐｓｂＡターミネーターとの間の単一交差によってお互いに異なる大きさの色素体ゲノムが生成される過程を説明した（図１）。このような二次組換えは、導入遺伝子のプロモーター（ｒｒｎプロモーター）と色素体ゲノムに元来存在するｒｒｎプロモーター部位、導入遺伝子のターミネーター（ｐｓｂＡターミネーター）と色素体ゲノムに元々存在するｐｓｂＡターミネーター部位によっても起きるので、前記二次組換えによって、１５４ｋｂ、１３９ｋｂ、２１ｋｂ、１８ｋｂ、２．８ｋｂの小さな大きさの色素体ゲノムが作られ得る。このように二次組換えが起きることで、導入遺伝子が異なる所に移されて、２１ｋｂ、１３９ｋｂ、２．８ｋｂが生成されたことを示すＰＣＲ、塩基配列分析及びサザンブロットを通じて確認した（図２ないし図７）。

図３では、予想される遺伝子配列を参照して、Ｉプライマー（配列番号５）とＨプライマー（配列番号６）、ＲＲ１６プライマー（配列番号８）とＨプライマー（配列番号６）、ＲＲ１６プライマー（配列番号８）とＲＰ２プライマー（配列番号７）でそれぞれＰＣＲを遂行した結果、野生種（ＷＴ）では存在しないが、二次組換えが発生した色素体形質転換体でのみ、ＰＣＲバンドが生成された。

図４では、ＰＡＦ１（ｐｓｂＡ）プライマー（配列番号１０）とＡ（ｔｒｎＡ）プライマー（配列番号９）によって生成されたＰＣＲバンドの場合、正常な組換えによって作られ、ＰＡＦ１プライマー（配列番号１０）とＨプライマー（配列番号６）によって生成されたＰＣＲバンドは、二次組換えによって外来遺伝子が色素体ゲノム内で移動したことを塩基配列を分析して証明した。

図５では、色素体形質転換植物体のＤＮＡを分離後、Ｂａｍ ＨとＢｇｌＩＩで切った後、ａａｄＡ遺伝子をプローブ（ｐｒｏｂｅ）にしてサザンブロットを遂行した結果、正常な形質転換バンドである９．３ｋｂと６．５ｋｂが主バンドで現われたが、４．９ｋｂと８．９ｋｂの弱いバンドもみられ、これが２１ｋｂを示すものである（図２）。

図６のａでは、予想される遺伝子配列を参照してＡプライマー（配列番号９）とＰＡＦ１プライマー（配列番号１０）によって生成されたＰＣＲバンドが、二次組換えによって外来遺伝子が色素体ゲノム内で移動したことを塩基配列を分析して証明した。図６のｂでは、Ａプライマー（配列番号９）とｐＡＲ１プライマー（配列番号１１）によって生成されたＰＣＲバンドであり、図６のｃでは、ＲＲ２３プライマー（配列番号１２）とＭＫプライマー（配列番号１３）によって生成されたＰＣＲバンドとして１３９ｋｂが生成されたことをＰＣＲで証明したものである。図６のｄでは、このような１３９ｋｂが生成されたことを示したサザンブロット結果として、制限酵素ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩを処理した場合、正常色素体野生型の場合、約０．５ｋｂのｔｒｎＩ−ｔｒｎＡ部位を示し、形質転換された色素体ゲノムの場合、２．２ｋｂの正常バンドを示して、約１．９ｋｂのバンドも現われる。これは、二次組換えによって１３９ｋｂのゲノムが生成されたことを示している（図６）。

図７のａでは、二次組換えによって生成される２．８ｋｂ ｃｉｒｃｕｌａｒ ＤＮＡを図式化したものであり、図７のｂでは、ｔｒｎＩＦ３プライマー（配列番号１４）とｒｒｎ１６Ｒ１プライマー（配列番号１５）によって生成されたＰＣＲバンドとして２．８ｋｂのＤＮＡｃｉｒｃｌｅが存在することを証明したものである。図７のｃでは、このような２．８ｋｂが生成されたことを示すサザンブロット結果として、制限酵素ＥｃｏＲＩを処理した場合、正常色素体野生型の場合には見えない２．８ｋｂのバンドが見えて、制限酵素を処理しない場合、１〜２ｋｂの間にバンドが見えて、２．８ｋｂのゲノムが生成されたことを示している（図７）。

稲（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）ｃｌｐプロモーターと大膓菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーターを含む色素体形質転換ベクターの製作
稲（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）の染色体ＤＮＡを鋳型にｒｃｌｐＰ５プライマー（配列番号３）とｒｃｌｐＰ３プライマー（配列番号４）を使用して下記の方法でＰＣＲ増幅した後、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）でクローニングした。ＰＣＲは、ｅｘＴａｑ酵素（タカラ，日本）を使用して、１０〜１００ｎｇの稲ゲノミックＤＮＡを鋳型にして、９４℃で５分間前変性反応以後、９４℃で１分間変性過程、５５℃で１分間プライマー結合過程、７２℃で１分間伸長過程を３０回反復した後、７２℃で１０分間伸長過程を遂行した。ｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーターは、日本のタカラ社の常用大膓菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＨＣＥ１９から８００ｂｐのｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーターをＰｓｔＩ／ＨｉｎｃＩＩで分離して使用した（配列番号２）。稲のｃｌｐプロモーターは、塩基配列を配列決定して確認した（配列番号１）。

以後、１０〜１００ｎｇのタバコゲノミックＤＮＡをＩ−Ｌ１プライマー（配列番号２１）とＩ−Ｒ２プライマー（配列番号２２）を使用してＰＣＲを遂行して、１．９５ｋｂのｔｒｎＩ−ｔｒｎＡ ｂｏａｒｄｅｒＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ条件は下記のとおりである。ｅｘＴａｑ酵素（タカラ，日本）を使用して、９４℃で５分間前変性過程以後、９４℃で１分間変性過程、５５℃で１分間プライマー結合過程、７２℃で２分間伸長反応を３０回反復した後、７２℃で１０分間伸長反応を遂行した。以後、これをＸｂａＩ／ＫｐｎＩで切断してクレノウ酵素にブロッティングしてｐｕｃ１８ベクター（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，米国）のＰｖｕＩＩ位置に導入して、ｐＴＩＡバックボーンベクター（図８ｃ）を完成した。そして、ｐＴＩＧベクターから分離したａａｄＡ−ＧＦＰＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国）にＳａｌＩ／ＰｓｔＩで導入して、これをＢａｍＨＩ／ＳｍａＩで切断してブロッティングした後、そこに前記ｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーターＤＮＡ断片を導入した。以後、ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ位置にｒｃｌｐプロモーターを導入してｐＲｃｌＰＡＤＧＨＴベクター（図８ｄ）を製作した。以後、ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩでｒｃｌｐ−ａａｄＡ−ｇｆｐ−ｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーターＤＮＡ断片を分離して、Ｋｌｅｎｏｗ酵素でブロッティングした後、ｐＴＩＡバックボーンベクターのＰｖｕＩＩ位置に導入して、稲（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）ｃｌｐプロモーターと大膓菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーターとを含む色素体形質転換ベクターｐＴＩＡ−ＲｃｌＰＡＤＧＨＴを完成した（図８ｅ）。

稲（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）ｃｌｐプロモーターと大膓菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーターを含む色素体形質転換ベクターを使用した色素体形質転換タバコ植物体の製作
実施例２で製作したベクターを使用して色素体形質転換実験を下記のように遂行した。ここで、対照に従来から使用されているｒｒｎプロモーター／ｐｓｂＡターミネーターを有したＣｔＶＧベクターを使用した。

野生型タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ，Ｓａｍｓｕｎ）植物体の種子を培養器内で８週間芽生えさせた後、幼植物体の葉を分離して１ｍｇ／ｌ ＢＡＰ、０．１ｍｇ／ｌ ＮＡＡが添加されたＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ Ｔ，Ｓｋｏｏｇ Ｆ，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ，１９６２年，第１５巻，４７３−４９頁）で置床して色素体形質転換に使用した。外来遺伝子としてＧＦＰ遺伝子が挿入された色素体形質転換用ベクターＤＮＡをＣａＣｌ_２とスペルミジン（ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）を使用して直径０．６μｍの金粒子（ｇｏｌｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ）にコーティングした後、遺伝子伝達システム（ＰＤＨ−１０００／Ｈｅ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）器機（Ｂｉｏｒａｄ，米国）を使用して１，１００ｐｓｉの加速度、９ｃｍの目標距離、２８ｉｎ／Ｈｇの真空条件で色素体形質転換を遂行した。

処理されたタバコ葉は、以後２５℃、２，０００ｌｕｘの明条件で２日間培養してタバコ葉を大きさ２〜５ｍｍの切片に分けて、１ｍｇ／ｌ ＢＡＰ、０．１ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、５００ｍｇ／ｌスペクチノマイシンが添加されたＭＳ培地で６〜７週培養して抵抗性幼い芽（ｓｈｏｏｔ）を誘導した。スペクチノマイシン（Ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）抵抗性ＭＳ培地で誘導された幼い芽（ｓｈｏｏｔ）は、３ｍｍ×３ｍｍの大きさに切断して同じ選抜培地で再分化を通じて抵抗性幼い芽を再び誘導した。このように選抜培地で再分化を繰り返して導入された遺伝子のホモプラスミー（ｈｏｍｏｐｌａｓｍｙ）を高めた。

色素体形質転換タバコ植物体のサザンブロット分析
形質転換植物体での外来遺伝子の導入有無、ホモプラスミー水準及び二次組換えによって生成されたゲノムの存在有無を確認するために、ａａｄＡ、ｔｒｎＡまたはｔｒｎＩ遺伝子をプローブに使用してサザンブロット分析を遂行した。サザンブロット分析のためのすべての染色体ＤＮＡは、植物用ＤＮＡ抽出キット（ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮＥ，ドイツ）を使用して抽出した。形質転換植物体の制限酵素処理及びＰＣＲ、制限酵素処理等を通じたプローブの準備など、サザンブロットのすべての方法は前記実施例１と同一の方法で遂行した。

ｃｌｐプロモーター及びｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーターを有するベクターで形質転換後に得られた色素体形質転換体のＤＮＡをＢｇｌ ＩＩで処理して、ａａｄＡプローブでサザンブロットを遂行した結果（図９）、野生型ではＤＮＡバンドが検出されず、ｒｒｎプロモーター及びｐｓｂＡターミネーターを含むベクターで形質転換された対照形質転換体（レーンＣ）は、６．５ｋｂの主バンドとともに、８．９ｋｂの弱いバンドも同時に検出され、２１ｋｂの二次組換えによるゲノムの変化が確認された。それに比べて、本発明のｃｌｐプロモーター及びｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーターを含むベクターで形質転換後に得られた色素体形質転換体は、３個レーン（レーン１〜３）すべてで約７．２ｋｂの主バンドのみが見られるだけで他のバンドは現われなかった（図９ａ）。

ｔｒｎＡプローブを使用したサザンブロットの場合（図９ｂ）には、野生型の場合４．４７ｋｂのバンドが見られ、ｒｒｎプロモーター及びｐｓｂＡターミネーターを含むベクターに形質転換された対照形質転換体（レーンＣ）は、６．５ｋｂの主バンドとともに、１．９ｋｂの弱いバンドも同時に検出されて、１３９ｋｂの二次組換えによるゲノムの存在が確認された。それに比べて、ｃｌｐプロモーター及びｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーターを含むベクターで形質転換後に得られた色素体形質転換体は、３個レーン（レーン１〜３）すべてで約７．２ｋｂの株バンドのみが見られるだけで他のバンドは現われなかった。野生型を除き、４．４７ｋｂのバンドがほとんど検出されなかった。これは、再分化された形質転換植物体の葉緑体ゲノム全体が外来遺伝子が導入された状態に転換されたホモプルラスミー状態であることを確認した（図９ｂ）。

前記結果を通じて、本発明の色素体形質転換用組換え発現ベクターを使用すると、二次組換えによって生成される２１ｋｂ及び１３９ｋｂのような非正常的ゲノムが生成されないことが分かった。

色素体形質転換タバコ植物体で二次組換え有無を確認するためのＰＣＲ分析
本発明者らは、稲ｃｌｐプロモーター及びｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーターを含むベクターで形質転換して得られた色素体形質転換体で、二次組換えによる非正常ゲノムが存在するのかどうかを確認するためにＰＣＲを遂行した。ＰＣＲ条件は、実施例１と同一な方法を使用した。Ｉプライマー（配列番号５）とＡプライマー（配列番号９）を使用した結果、すべての独立形質転換体に遺伝子が正常に導入されたことを確認した（図１０ａ）。また、Ｉプライマー（配列番号５）とＨプライマー（配列番号６）を使用した結果、対照のみでＰＣＲバンドが現われて、ｃｌｐプロモーター及びｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーターを使用した１０個形質転換体すべてでバンドが検出されなかった（図１０ｂ）。以後、ＲＲ２３プライマー（配列番号１２）とＭＫプライマー（配列番号１３）を使用した場合にも、対照のみでＰＣＲバンドが検出された。前記結果を通じて、稲ｃｌｐプロモーター及びｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーターを含むベクターで形質転換して得られたすべての色素体形質転換体では、二次組換えによる非正常的ゲノムが生成されないことを確認した。

色素体形質転換タバコ植物体でのＧＦＰ発現観察
ＧＦＰ発現ベクターで形質転換された植物体でＧＦＰが正常に発現しているのかどうかを直接観察するために、葉切片から表皮細胞を分離して蛍光顕微鏡でＧＦＰの発現を調査した。

その結果、本発明の稲由来ｃｌｐプロモーターとｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーターを含む色素体形質転換ベクターを使用して作った形質転換植物体の葉緑体でも、既存に使用されていたプロモーターのように外来遺伝子であるＧＦＰが正常に発現されていることを観察することができた（図１１）。

色素体形質転換タバコ植物体のノーザンブロット分析
本発明者らは、稲ｃｌｐプロモーター及びｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーターを含むベクターで形質転換して得られた色素体形質転換体で、外来遺伝子の発現を形質転換体の葉からＲＮＡを分離してノーザンブロットを遂行して確認した。ノーザンブロット分析のためのすべてのＲＮＡは、植物用ＲＮＡ分離キット（ＲＮＡｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮＥ，ドイツ）を使用して抽出した。抽出したＲＮＡ５μｇを１％アガロースゲルで電気泳動して分離した後、ブロッティング膜（Ｚｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ ＧＴ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，米国）にブロッティングした。プローブは、ｇｆｐ遺伝子を使用し、ＧＦＰ（Ｆ）プライマー（配列番号２３）とＧＦＰ（Ｒ）プライマー（配列番号２４）を使用して実施例１と同一な条件でＰＣＲを遂行して準備した。予備混成化と混成化過程は、７％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を使用して、６５℃でひと晩遂行した。反応が終わった膜は、５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含んだ２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で６５℃で３０分間洗浄して、１時間露出させた。

その結果、本発明の稲由来ｃｌｐプロモーターとｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーターで構成された色素体形質転換ベクターを使用して作った形質転換植物体の葉緑体でも、既存に使用されたプロモーターのようにＧＦＰがよく発現されていることを観察することができた（図１２）。

本発明の色素体形質転換用組換え発現ベクターは、色素体で既存のタバコ由来プロモーター／ターミネーターと比べて同等な程度に外来タンパク質を効果的に大量生産することができると同時に、色素体内の二次組換えを防止することができるので、目的とする外来遺伝子を安全かつ正常に形質転換して外来タンパク質を発現する形質転換植物体を製造するのに有用に使用することができる。

タバコ色素体形質転換ベクターのｒｒｎプロモーターとｐｓｂＡターミネーター使用時に現われる二次組換えを説明する模式図である。 二次組換えが起きることで外来遺伝子が異なる所に移されて、２１ｋｂのベクターに生成されることを示した模式図である。 二次組換えが起きることで外来遺伝子が異なる所に移されて、２１ｋｂのベクターに生成されることを示したＰＣＲ結果である。 二次組換えが起きることで外来遺伝子が異なる所に移されて、２１ｋｂのベクターに生成されることを示した塩基配列分析結果である。 二次組換えが起きることで外来遺伝子が異なる所に移されて、２１ｋｂのベクターに生成されることを示したサザンブロット結果である。 二次組換えが起きることで外来遺伝子が異なる所に移されて、１３９ｋｂのベクターに生成されることを示したＰＣＲ、塩基配列分析及びサザンブロット結果である。 二次組換えが起きることで新たに２．８ｋｂの小さなプラスミドが生成されることを示したＰＣＲ及びサザンブロット結果である。 稲のｃｌｐプロモーターと大膓菌のｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーターを含む色素体形質転換用組換え発現ベクターの模式図である。（ａ）：タバコ色素体ゲノムで外来遺伝子が導入する部位であるｔｒｎＩ−ＴｒｎＡ部位、（ｂ）：タバコのｒｒｎプロモーター及びｐｓｂＡターミネーターを使用した一般的な色素体形質転換用組換え発現ベクター、（ｃ）：タバコのｔｒｎＩ−ｔｒｎＡを含む色素体形質転換ベクター製作のバックボーンベクターｐＴＩＡ、（ｄ）：稲ｃｌｐプロモーターとａａｄＡ遺伝子、ｇｆｐ遺伝子及びｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーターが順次に連結されたｐＲｃｌＰＡＤＧＨＴベクター、及び（ｅ）：稲ｃｌｐプロモーターとａａｄＡ遺伝子、ｇｆｐ遺伝子及びｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーターを含む色素体形質転換用組換え発現ベクター。 本発明の色素体形質転換用組換え発現ベクターで色素体形質転換されたタバコ植物体のサザンブロット結果である。（ａ）ａａｄＡプローブ、及び（ｂ）ｔｒｎＡプローブ。 本発明の色素体形質転換用組換え発現ベクターで色素体形質転換されたタバコ植物体のＰＣＲ結果である。（ａ）Ｉ／Ａプライマー使用、（ｂ）Ｉ／Ｈプライマー使用、及び（ｃ）ＲＲ２３／ＭＫプライマー使用。 外来遺伝子ＧＦＰが挿入された色素体形質転換用組換え発現ベクターで色素体形質転換された、タバコ植物体の細胞の葉緑体でＧＦＰ発現を観察した写真である。 外来遺伝子ＧＦＰが挿入された色素体形質転換用組換え発現ベクターで色素体形質転換された、タバコ植物体を対象にしたノーザンブロット結果を示した写真である。

配列番号１は、稲（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）のｃｌｐプライマー配列である。

配列番号２は、大膓菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーター配列である。

配列番号３は、ｒｃｌｐＰ５プライマー配列である。

配列番号４は、ｒｃｐｌＰ３プライマー配列である。

配列番号５は、Ｉプライマー配列である。

配列番号６は、Ｈプライマー配列である。

配列番号７は、ＲＰ２プライマー配列である。

配列番号８は、ＲＰ１６プライマー配列である。

配列番号９は、Ａプライマー配列である。

配列番号１０は、ＲＡＦ１プライマー配列である。

配列番号１１は、ｐＡＲ１プライマー配列である。

配列番号１２は、ＲＰ２３プライマー配列である。

配列番号１３は、ＭＫプライマー配列である。

配列番号１４は、ｔｒｎＩＦ３プライマー配列である。

配列番号１５は、ｔｒｎ１６Ｒ１プライマー配列である。

配列番号１６は、ａａｄ５プライマー配列である。

配列番号１７は、ａａｄ３プライマー配列である。

配列番号１８は、ｔｒｎＩＲ４プライマー配列である。

配列番号１９は、ｔｒｎＡＦ１プライマー配列である。

配列番号２０は、ｔｒｎＡＲ１プライマー配列である。

配列番号２１は、Ｉ−Ｌ１プライマー配列である。

配列番号２２は、Ｉ−Ｒ２プライマー配列である。

配列番号２３は、ＧＦＰ（Ｆ）プライマー配列である。

配列番号２４は、ＧＦＰ（Ｒ）プライマー配列である。

Claims (11)

1. 対象植物体の色素体ゲノム内に存在するＤＮＡ塩基配列と相同性が低い外来プロモーター、リボソーム結合部位配列、対象植物体の色素体ゲノム内に存在するＤＮＡヌクレオチド配列と相同性が低い外来ターミネーターを順次に含む、色素体形質転換用組換え発現ベクター。
2. 前記外来プロモーターが、稲（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に由来したｃｌｐプロモーターであり、前記対象植物体が、稲を含まないことを特徴とする、請求項１に記載の発現ベクター。
3. 前記外来プロモーターが、原核生物由来または対象植物と異なる植物由来の葉緑体プロモーターであることを特徴とする、請求項１に記載の発現ベクター。
4. 前記外来ターミネーターが、ｐＨＣＥ１９ベクターから由来したｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーターであることを特徴とする、請求項１に記載の発現ベクター。
5. 前記外来ターミネーターが、原核生物由来または対象植物と異なる植物由来の葉緑体ターミネーターであることを特徴とする、請求項１に記載の発現ベクター。
6. 追加的に選別遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１に記載の発現ベクター。
7. 前記選別遺伝子が、ａａｄＡまたはｇｆｐ遺伝子であることを特徴とする、請求項６に記載の発現ベクター。
8. １）請求項１に記載の色素体形質転換用組換え発現ベクターに外来遺伝子配列を挿入する工程、
   ２）工程１）の外来遺伝子を挿入した色素体形質転換用組換え発現ベクターを対象植物体の葉に形質転換する工程、
   ３）工程２）の植物体の葉から選抜培地を使用して抵抗性幼い芽（ｓｈｏｏｔ）を誘導する工程、
   ４）工程３）の幼い芽を再分化して再誘導する工程、
   ５）工程４）の再誘導された幼い芽からＤＮＡ及び／又はＲＮＡを抽出して外来遺伝子導入を確認して選別する工程、及び
   ６）工程５）の選別された形質転換植物体を栽培する工程
   を含む色素体形質転換植物体製造方法。
9. 工程５）の外来遺伝子導入確認方法が、ＰＣＲ、ノーザンブロット、又はサザンブロットを使用することを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
10. 請求項８に記載の製造方法によって作製されたことを特徴とする形質転換植物体。
11. 前記植物体が、タバコ、緑豆、インゲン豆、エンドウ、じゃがいも、カッサバ、さつまいも、大豆、菜の花、ひまわり、綿、トマト、茄子、にんじん、唐辛子、白菜、大根、すいか、きゅうり、メロン、春菊、ほうれんそう、キャベツ、いちご、菊、バラ、カーネーション、ペチュニアおよびシロイヌナズナからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の形質転換植物体。

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