JP3782013B2 - 改良されたプロモーターおよびその使用 - Google Patents
改良されたプロモーターおよびその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3782013B2 JP3782013B2 JP2001564348A JP2001564348A JP3782013B2 JP 3782013 B2 JP3782013 B2 JP 3782013B2 JP 2001564348 A JP2001564348 A JP 2001564348A JP 2001564348 A JP2001564348 A JP 2001564348A JP 3782013 B2 JP3782013 B2 JP 3782013B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- bases
- gene
- promoter
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
Description
技術分野
本発明は、改良プロモーター及びその使用に関し、より詳細には、形質転換生物の作出に際して、メチル化を受けにくいよう改良したプロモーター、及びその使用に関するものである。
背景技術
所望の形質転換植物を作出する上で、重要な要素のひとつとして高発現プロモーターがある。プロモーター配列は植物細胞内での遺伝子の転写レベルを決定する主要な因子であり、一般に、転写活性の強いプロモーター配列を用いることにより目的とする外来遺伝子の発現レベルを上げることが可能である。また、マーカー遺伝子の発現レベルの上昇により、形質転換植物の取得は著しく容易になるので、高発現プロモーターは、形質転換植物を作製するための薬剤耐性遺伝子マーカーの発現にも重要である。
このような背景から、植物における高発現プロモーターの取得が、これまでに数多く報告されてきた。代表的な例としては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターやアグロバクテリウムのイソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子やノパリン合成酵素（ｎｏｓ）遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。更に、形質転換宿主の対象となる植物のゲノムから高発現遺伝子のプロモーターを取得し、それを利用する例も見受けられる（Ｇｅｎｓｃｈｉｋら、Ｇｅｎｅ，１４８（１９９４）１９５−２０２）。
近年になり、これらのプロモーターを複数個組み合わせたキメラ型プロモーターの中から、プロモーター活性が著しく上昇したものを取得できることが示されている。一例を挙げれば、Ｍｉｎ Ｎｉらは、アグロバクテリウム由来のオクトピン合成酵素（ｏｃｓ）遺伝子とマンノピン（ｍａｎ）合成酵素遺伝子のプロモーターを組み合わせることによって、タバコにおいて高発現を示すプロモーターが取得できることを示している（Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，７（１９９５）６６１−６７６）。
しかしながら、これらの高発現プロモーターを用いても、すべての植物において、必要なレベルの外来遺伝子の発現個体が得られるわけではない。その理由の１つとして、各々の植物細胞に存在するＲＮＡポリメラーゼの違いに基づく特異性が存在することが挙げられる。また別の理由として、植物が外来遺伝子の発現を抑制する機構を持っていることが推察されている。この遺伝子の不活化、あるいは発現抑制の機構に関与する代表的な因子として、ゲノムＤＮＡにおけるシトシンのメチル化が考えられる（ＭｅｙｅｒとＳａｅｄｌｅｒ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７（１９９６）２３−４８）。
このシトシンのメチル化は、ＣＧ及びＣＮＧ（Ｎは任意の塩基）という塩基配列が回文状の構造をなしている２本鎖ＤＮＡ配列において顕著に起きることが知られている（ＭａｔｚｋｅとＭａｔｚｋｅ、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０７（１９９５）６７９−６８５）が、他のＤＮＡ配列中のシトシンにおいてもメチル化が起こることが知られている（Ｍｅｙｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１３（１９９４）２０８４−２０８８）。シトシンがメチル化を受けると、遺伝子の発現が抑制されることが多くの生物において知られており（Ｒａｚｉｎ．ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１７（１９９８）４９０５−４９０８）、また、植物のゲノムでは、他の生物と比べてメチル化されているシトシンの割合が高いため、メチル化が遺伝子の不活化に密接に関連しているという報告がされてきた（ＭｅｙｅｒとＳａｅｄｌｅｒ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７（１９９６）２３−４８）。特に、遺伝子操作等によって導入された外来遺伝子の発現が抑制される現象、すなわち「ジーン・サイレンシング」の原因については、ＤＮＡのメチル化による不活化も関係していると推測されている。
しかしながら、これまで、プロモーターのメチル化を制御することにより遺伝子の発現を向上させたという報告はなされていなかった。僅かに、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターとβ−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）遺伝子を繋いだ遺伝子構築物を、試験管内で強制的にメチル化させることによって、遺伝子の一過的な発現が低下する旨の報告が１例あるのみである（Ｈｏｈｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３（１９９６）８３３４−８３３９）。但し、該報告の実験においても、生体内でどの塩基配列がメチル化を受け、その結果、発現が低下するに至ったのかは検証されていない。また、Ｈｏｈｎらは、プロモーターのみならず、構造遺伝子部分のシトシンのメチル化もＧｕｓ遺伝子の発現低下をもたらすことを観察し、構造遺伝子部分がメチル基による修飾を受けないことも高発現のためには重要であると結論付けており、脱メチル化プロモーターの利用による高発現化にはむしろ否定的ともいえる。
従って、プロモーターのメチル化を回避することにより、遺伝子発現レベルを向上させる具体的方法は不明であった。また、メチル化を回避し、より高発現の形質転換宿主を得るために、プロモーター活性を損なわないようにプロモーター部分、又はプロモーター部分を含むＤＮＡ鎖のどこのＣＧ及びＣＮＧ配列を具体的にどのような他の塩基に改変すればよいのかも不明であった。
発明の開示
本発明は、構造遺伝子の５’側に置いた場合、この構造遺伝子の発現を活性化するプロモーターの提供をその目的としている。また、本発明は、前記プロモーターを含んでなるＤＮＡ鎖の提供をその目的としている。さらに、本発明は、前記ＤＮＡ鎖で形質転換された宿主、及び該宿主を利用した構造遺伝子を高発現させる方法の提供をその目的としている。
本発明者らは、以上の観点から、プロモーターの２本鎖ＤＮＡ配列中のＣＧ及びＣＮＧからなるＤＮＡの回文状の配列を、プロモーター活性を損なわないように、ＣＧ及びＣＮＧ配列が生じない他の塩基に改変してメチル化を受けにくくすることにより、高発現プロモーターを作製できると考えた。この考えに基づき、鋭意研究を重ねた結果、新規にデザインしたプロモーターを翻訳エンハンサー、構造（レポーター）遺伝子、翻訳終止コドン、ターミネーター等の構成要素等と繋ぎ、これを用いてキク植物体を形質転換することにより、該キク植物体において外来遺伝子の発現レベルを飛躍的に向上し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるＤＮＡを提供する。
（ａ）配列番号１で表わされる塩基配列中の第７〜２７２塩基からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１で表わされる塩基配列中の第７〜２７２塩基からなる塩基配列において、第４１〜４２塩基、第５９〜６０塩基、第７３〜７５塩基、第７７〜７８塩基、第８０〜８２塩基、第１０９〜１１０塩基、第１１９〜１２０塩基、第１３４〜１３５塩基、第１４５〜１４６塩基、第１８１〜１８３塩基、第１８５〜１８６塩基、第１９７〜１９８塩基、及び第２１７〜２１８塩基を除く部位にて１個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中にＣＧ、ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＣＧ及びＣＧＧで表わされる連続配列を含まず、かつ、プロモーター活性を有するＤＮＡ。
さらに、本発明は、以下の（ｃ）又は（ｄ）に示されるＤＮＡを提供する。
（ｃ）配列番号１で表わされる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１で表わされる塩基配列において、第４１〜４２塩基、第５９〜６０塩基、第７３〜７５塩基、第７７〜７８塩基、第８０〜８２塩基、第１０９〜１１０塩基、第１１９〜１２０塩基、第１３４〜１３５塩基、第１４５〜１４６塩基、第１８１〜１８３塩基、第１８５〜１８６塩基、第１９７〜１９８塩基、及び第２１７〜２１８塩基を除く部位にて１個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中にＣＧ、ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＣＧ及びＣＧＧで表わされる連続配列を含まず、かつ、プロモーター活性を有するＤＮＡ。
さらに、本発明は、以下の（ｅ）又は（ｆ）に示されるＤＮＡを提供する。
（ｅ）配列番号２で表わされる塩基配列中の第７〜２７２塩基からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｆ）配列番号２で表わされる塩基配列中の第７〜２７２塩基からなる塩基配列において、第４１〜４２塩基、第５９〜６０塩基、第７３〜７５塩基、第７７〜７８塩基、第８０〜８２塩基、第１０９〜１１０塩基、第１１９〜１２０塩基、第１３４〜１３５塩基、第１４５〜１４６塩基、第１８１〜１８３塩基、第１８３〜１８８塩基、第１９５〜２００塩基、及び第２１７〜２１８塩基を除く部位にて１個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中にＣＧ、ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＣＧ及びＣＧＧで表わされる連続配列を含まず（但し、第１８５〜１８６塩基及び第１９７〜１９８塩基はそれぞれＣＧである）、かつ、プロモーター活性を有するＤＮＡ。
さらに、本発明は、以下の（ｇ）又は（ｈ）に示されるＤＮＡを提供する。
（ｇ）配列番号２で表わされる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｈ）配列番号２で表わされる塩基配列において、第４１〜４２塩基、第５９〜６０塩基、第７３〜７５塩基、第７７〜７８塩基、第８０〜８２塩基、第１０９〜１１０塩基、第１１９〜１２０塩基、第１３４〜１３５塩基、第１４５〜１４６塩基、第１８１〜１８３塩基、第１８３〜１８８塩基、第１９５〜２００塩基、及び第２１７〜２１８塩基を除く部位にて１個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中にＣＧ、ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＣＧ及びＣＧＧで表わされる連続配列を含まず（但し、第１８５〜１８６塩基及び第１９７〜１９８塩基はそれぞれＣＧである）、かつ、プロモーター活性を有するＤＮＡ。
さらに、本発明は、以下の（ｉ）又は（ｊ）に示されるＤＮＡを提供する。
（ｉ）配列番号３で表わされる塩基配列中の第７〜３２２塩基からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｊ）配列番号３で表わされる塩基配列中の第７〜３２２塩基からなる塩基配列において、第４１〜４２塩基、第５９〜６０塩基、第７３〜７５塩基、第７７〜７８塩基、第８０〜８２塩基、第１０９〜１１０塩基、第１１９〜１２０塩基、第１３４〜１３５塩基、第１４５〜１４６塩基、第１８１〜１８３塩基、第１８５〜１８６塩基、第１９７〜１９８塩基、第２１７〜２１８塩基、第２３１〜２３３塩基、第２３５〜２３６塩基、第２４７〜２４８塩基、及び第２６７〜２６８塩基を除く部位にて１個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中にＣＧ、ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＣＧ及びＣＧＧで表わされる連続配列を含まず、かつ、プロモーター活性を有するＤＮＡ。
さらに、本発明は、以下の（ｋ）又は（ｌ）に示されるＤＮＡを提供する。
（ｋ）配列番号３で表わされる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｌ）配列番号３で表わされる塩基配列において、第４１〜４２塩基、第５９〜６０塩基、第７３〜７５塩基、第７７〜７８塩基、第８０〜８２塩基、第１０９〜１１０塩基、第１１９〜１２０塩基、第１３４〜１３５塩基、第１４５〜１４６塩基、第１８１〜１８３塩基、第１８５〜１８６塩基、第１９７〜１９８塩基、第２１７〜２１８塩基、第２３１〜２３３塩基、第２３５〜２３６塩基、第２４７〜２４８塩基、及び第２６７〜２６８塩基を除く部位にて１個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中にＣＧ、ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＣＧ及びＣＧＧで表わされる連続配列を含まず、かつ、プロモーター活性を有するＤＮＡ。
さらに、本発明は、以下の（ｍ）又は（ｎ）に示されるＤＮＡを提供する。
（ｍ）配列番号４で表わされる塩基配列中の第７〜４２２塩基からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｎ）配列番号４で表わされる塩基配列中の第７〜４２２塩基からなる塩基配列において、第４１〜４２塩基、第５９〜６０塩基、第７３〜７５塩基、第７７〜７８塩基、第８０〜８２塩基、第１０９〜１１０塩基、第１１９〜１２０塩基、第１３４〜１３５塩基、第１４５〜１４６塩基、第１８１〜１８３塩基、第１８５〜１８６塩基、第１９７〜１９８塩基、第２１７〜２１８塩基、第２３１〜２３３塩基、第２３５〜２３６塩基、第２４７〜２４８塩基、第２６７〜２６８塩基、第２８１〜２８３塩基、第２８５〜２８６塩基、第２９７〜２９８塩基、第３１７〜３１８塩基、第３３１〜３３３塩基、第３３５〜３３６塩基、第３４７〜３４８塩基、及び第３６７〜３６８塩基を除く部位にて１個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中にＣＧ、ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＣＧ及びＣＧＧで表わされる連続配列を含まず、かつ、プロモーター活性を有するＤＮＡ。
さらに、本発明は、以下の（ｏ）又は（ｐ）に示されるＤＮＡを提供する。
（ｏ）配列番号４で表わされる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｐ）配列番号４で表わされる塩基配列において、第４１〜４２塩基、第５９〜６０塩基、第７３〜７５塩基、第７７〜７８塩基、第８０〜８２塩基、第１０９〜１１０塩基、第１１９〜１２０塩基、第１３４〜１３５塩基、第１４５〜１４６塩基、第１８１〜１８３塩基、第１８５〜１８６塩基、第１９７〜１９８塩基、第２１７〜２１８塩基、第２３１〜２３３塩基、第２３５〜２３６塩基、第２４７〜２４８塩基、第２６７〜２６８塩基、第２８１〜２８３塩基、第２８５〜２８６塩基、第２９７〜２９８塩基、第３１７〜３１８塩基、第３３１〜３３３塩基、第３３５〜３３６塩基、第３４７〜３４８塩基、及び第３６７〜３６８塩基を除く部位にて１個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中にＣＧ、ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＣＧ及びＣＧＧで表わされる連続配列を含まず、かつ、プロモーター活性を有するＤＮＡ。
また、本発明は、上記のいずれかのＤＮＡを含んでなるＤＮＡ鎖を提供する。このようなＤＮＡ鎖は、構造遺伝子ＤＮＡと、該構造遺伝子が発現するような様式で該構造遺伝子ＤＮＡの５’部位に組み込まれた上記のいずれかのＤＮＡとを含んでなることが好ましい。これらのＤＮＡ鎖は、さらに翻訳エンハンサー、翻訳終止コドン、ターミネーター、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される構成要素を含んでもよい。さらにまた、本発明は、上記ＤＮＡ鎖で形質転換された宿主を提供する。該宿主は、好ましくは植物細胞である。
さらにまた、本発明は、上記ＤＮＡ鎖で形質転換された植物細胞を構造遺伝子が発現可能なように培養又は栽培することを特徴とする、植物で構造遺伝子を発現させる方法を提供する。この方法において、構造遺伝子は外来遺伝子であってもよい。さらに、本発明は、上記ＤＮＡ鎖で形質転換された宿主を用いて、該プロモーター活性を有するＤＮＡにより転写が活性化される又は発現が促進される構造遺伝子の発現産物である蛋白質を製造する方法を提供する。
さらに、本発明は、上記ＤＮＡ鎖で形質転換された植物細胞から再生により得られる形質転換植物を提供する。
さらに、本発明は、選択マーカー遺伝子ＤＮＡと、該選択マーカー遺伝子が発現するような様式で該選択マーカー遺伝子ＤＮＡの５’部位に組み込まれた上記のいずれかのＤＮＡとを含んでなるＤＮＡ鎖を提供する。さらに、本発明は、該ＤＮＡ鎖で宿主を形質転換処理し、得られた宿主を、前記選択マーカー遺伝子が発現可能であり、かつ、該選択マーカー遺伝子を発現する宿主とこれを発現しない宿主とを識別し得る条件下で培養することを特徴とする、形質転換宿主を選択する方法を提供する。該宿主は、好ましくは植物細胞である。
本明細書は、本願において主張する優先権の基礎である日本国特許出願第２０００−５９２７６号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
配列表の説明
配列番号１〜４：プロモーター配列を含む合成ＤＮＡ。
配列番号５〜２４：プライマー。
発明を実施するための最良の形態
（１）プロモーター
本発明のＤＮＡは、配列番号１〜４で表わされる塩基配列を含むＤＮＡ又はこれらのプロモーター活性を有する部分であり、これらのＤＮＡは、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターをもとにその塩基配列中の一部の塩基を改変したものである。
ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターの転写開始点より上流２５０ｂｐ中には１３個のＣＧ又はＣＮＧが存在し、これらの塩基配列は、植物体中でそれぞれＣＧメチル化酵素及びＣＮＧメチル化酵素によりメチル化を受けていることが推察される。そこで、これらの配列を、メチル化を受けないような配列に置換したのが、配列番号１で表わされる塩基配列を含むＤＮＡである。配列番号１中において、プロモーター活性を有する部分は、第７〜２７２塩基の部分である。
さらに、配列番号１で表わされる塩基配列を含むＤＮＡ（プロモーター）のメチル化フリーという特徴を生かしつつ、特に有効と思われるさらなる改変として、プロモーターのｏｃｓ領域又はａｓ−１領域と呼ばれる約２０塩基からなる領域（Ｅｌｌｉｓら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．，４（１９９３）４３３−４４３；Ｌａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６（１９８９）７８９０−７８９４）の改変が考えられる。そこで、該ｏｃｓ領域の中のＣＧ配列を残しつつ、６塩基の回文状構造（ＧＡＣＧＴＣ）を形成するように改変したものが、配列番号２で表わされる塩基配列を含むＤＮＡである。配列番号２中において、プロモーター活性を有する部分は、第７〜２７２塩基の部分である。
配列番号１及び２で表わされる塩基配列（転写開始点より上流）と、植物の遺伝子操作で通常最もよく用いられるベクターｐＢＩ１２１（クロンテック社製）に含まれる３５Ｓプロモーターの配列との比較を、それぞれ図１Ａ及び図１Ｂに示す。
また、上記ｏｃｓ領域に関する改変として、プロモーター中のｏｃｓ領域を重複させるように合成することが考えられ、これによりプロモーター活性が増強されると考えられる。そこで、上記配列番号１において、２つのｏｃｓ領域を反復させたのが、配列番号３で表わされる塩基配列を含むＤＮＡである。配列番号３中において、プロモーター活性を有する部分は、第７〜３２２塩基の部分である。さらに、上記配列番号１において、４つのｏｃｓ領域を反復させたのが、配列番号４で表わされる塩基配列を含むＤＮＡである。配列番号４中において、プロモーター活性を有する部分は、第７〜４２２塩基の部分である。
上記のような本発明のＤＮＡは、核酸合成の方法に従って化学合成することにより得ることができる。
また、本発明のＤＮＡには、上記のＤＮＡの塩基配列において１以上の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ（変異体）も含まれる。ここで、欠失、付加又は挿入されてもよい塩基の数は特に限定されないが、好ましくは１個〜数個、より好ましくは１個〜３個、最も好ましくは１個である。さらに、本発明のＤＮＡには、上記のＤＮＡの塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９４％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列を含み、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ（変異体）も含まれる。ここで、このような相同性の数値は、塩基配列比較用プログラム：ＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ ｖ３．７を用いて、デフォルト（初期設定）のパラメーターにより算出されるものである。
このように、上記変異体は、配列番号１〜４で表わされる塩基配列とは部分的に異なる塩基配列を含むが、この場合において、上述のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターからの改変部位はそのまま保存されている必要がある。すなわち、配列番号１において、第４１〜４２塩基、第５９〜６０塩基、第７３〜７５塩基、第７７〜７８塩基、第８０〜８２塩基、第１０９〜１１０塩基、第１１９〜１２０塩基、第１３４〜１３５塩基、第１４５〜１４６塩基、第１８１〜１８３塩基、第１８５〜１８６塩基、第１９７〜１９８塩基、及び第２１７〜２１８塩基では変異しない。同様に、配列番号２において、第４１〜４２塩基、第５９〜６０塩基、第７３〜７５塩基、第７７〜７８塩基、第８０〜８２塩基、第１０９〜１１０塩基、第１１９〜１２０塩基、第１３４〜１３５塩基、第１４５〜１４６塩基、第１８１〜１８３塩基、第１８３〜１８８塩基、第１９５〜２００塩基、及び第２１７〜２１８塩基では変異しない。また、配列番号３において、第４１〜４２塩基、第５９〜６０塩基、第７３〜７５塩基、第７７〜７８塩基、第８０〜８２塩基、第１０９〜１１０塩基、第１１９〜１２０塩基、第１３４〜１３５塩基、第１４５〜１４６塩基、第１８１〜１８３塩基、第１８５〜１８６塩基、第１９７〜１９８塩基、第２１７〜２１８塩基、第２３１〜２３３塩基、第２３５〜２３６塩基、第２４７〜２４８塩基、及び第２６７〜２６８塩基では変異しない。さらに、配列番号４において、第４１〜４２塩基、第５９〜６０塩基、第７３〜７５塩基、第７７〜７８塩基、第８０〜８２塩基、第１０９〜１１０塩基、第１１９〜１２０塩基、第１３４〜１３５塩基、第１４５〜１４６塩基、第１８１〜１８３塩基、第１８５〜１８６塩基、第１９７〜１９８塩基、第２１７〜２１８塩基、第２３１〜２３３塩基、第２３５〜２３６塩基、第２４７〜２４８塩基、第２６７〜２６８塩基、第２８１〜２８３塩基、第２８５〜２８６塩基、第２９７〜２９８塩基、第３１７〜３１８塩基、第３３１〜３３３塩基、第３３５〜３３６塩基、第３４７〜３４８塩基、及び第３６７〜３６８塩基では変異しない。
また、上記変異体の塩基配列は、ＣＧ、ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＣＧ及びＣＧＧで表わされる連続配列を含まないことが必要である。但し、配列番号２における第１８５〜１８６塩基及び第１９７〜１９８塩基は、例外的に、それぞれＣＧである。
このような配列番号１〜４で表わされる塩基配列を含むＤＮＡ又はその部分の変異体は、プロモーター活性を有していればよく、その活性の高さは特に限定されないが、それぞれ、配列番号１〜４で表わされる塩基配列を含むＤＮＡ又はその部分のプロモーター活性を実質的に保持することが好ましい。ここで、これらのＤＮＡ又はその部分の「プロモーター活性を実質的に保持する」とは、プロモーター活性を利用した実際の使用態様において、これらのＤＮＡ又はその部分と、同一の条件でほぼ同様の利用が可能な程度の活性が維持されていることをいう。また、ここでいうプロモーター活性は、好ましくは植物細胞における活性、より好ましくはキク植物体における活性、最も好ましくはキク栽培品種レーガン（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ ｃｖ．Ｒｅａｇａｎ又はＤｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ ｃｖ．Ｒｅａｇａｎ）における活性をいう。
このような変異体は、配列番号１〜４で表わされる塩基配列を参照すれば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）等の文献の記載に従って、当業者であれば格別の困難性なしに選択し、製造することができることは明らかである。さらに当業者であれば、上述した配列番号１〜４で表わされる塩基配列を基にして、当該塩基配列から１以上の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を人為的に行う技術（部位特異的突然変異誘発）については、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１（１９８４）５６６２−５６６６、ＷＯ８５／００８１７、Ｎａｔｕｒｅ ３１６（１９８５）６０１−６０５、Ｇｅｎｅ ３４（１９８５）３１５−３２３、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３（１９８５）４４３１−４４４２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９（１９８２）６４０９−６４１３、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４（１９８４）１４３１−１４３３等に記載の技術に従って変異体を取得し、これを利用することができる。
上記のように取得した変異体がプロモーターとしての活性を有するか否か、さらには、配列番号１〜４で表わされる塩基配列を含むＤＮＡ又はその部分のプロモーター活性を実質的に保持するか否かは、以下のようなプロモーター活性測定のための手法により確認することができる。
上記変異体のプロモーター活性は、好ましくは種々のレポーター遺伝子、例えばベータグルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃａｔ）、ベータガラクトシダーゼ（Ｇａｌ）、ノパリン合成酵素（ｎｏｓ）、オクトピン合成酵素（ｏｃｓ）等の遺伝子（”Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”、Ｄｒａｐｅｒ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．編，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，１９８８）を新規プロモーターの下流域に連結したベクターを作製し、当該ベクターを用いて従来から周知慣用されている種々の形質転換法（後述）により植物細胞のゲノムに挿入した後、当該レポーター遺伝子の発現量を測定することにより算出することができるが、この方法に何等限定されることはない。その中の一例として、レポーター遺伝子がＧｕｓの場合には、宿主細胞内でのプロモーター活性は、（ｉ）ヒストケミカルなＧｕｓ染色による方法、及び／又は（ｉｉ）蛍光基質を用いる方法（いずれの方法も、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃ２（１９９４）１−３２（Ｅｄ．）ＧｅｌｖｉｎとＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に従ってＧｕｓ活性を測定し、さらに、例えばＢｒａｄｆｏｒｄの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２（１９７６）２４８−２５４）に従ってタンパク質量を測定して、Ｇｕｓ活性をタンパク量当たりに換算する（例えば、ｐｍｏｌｅＭＵ／ｍｉｎ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎとして算出する）ことにより、それぞれ測定することができる。
本発明のＤＮＡが好ましく利用される宿主細胞は、様々な植物の細胞、例えば、イネ、ムギ、トウモロコシ、ネギ、ユリ、ラン等の単子葉植物、ダイズ、ナタネ、トマト、バレイショ、キク、バラ、カーネーション、ペチュニア、カスミソウ、シクラメン等の双子葉植物などの細胞である。特に好ましい具体例としては、染色体の倍数性が高いキク等の植物細胞などが挙げられる。その理由は、植物は相同遺伝子の不活化のために遺伝子をメチル化すると考えられており、倍数性の高い植物は、多数の相同遺伝子を持つために、強力なメチル化の機構により遺伝子の不活化を行っていると推察されるからである（ＬｅｉｔｃｈとＢｅｎｎｅｔｔ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．，２（１９９７）４７０−４７６）。また、ゲノムのＧＣ含量（ＴｈｏｍａｓとＳｈｅｒｒａｔｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，６２（１９５６）１−４）が高いためにメチル化反応の標的配列に富む等の植物細胞なども好ましい候補に挙げられる。
（２）ＤＮＡ鎖
本発明によれば、本発明のＤＮＡを含んでなるＤＮＡ鎖が提供される。このようなＤＮＡ鎖は任意の遺伝子を転写するために用いることができ、使用にあたっては、所望の遺伝子が、発現し得る形で該ＤＮＡ鎖中に組み込まれる。そのような遺伝子は、典型的には構造遺伝子である。従って、本発明はさらに、構造遺伝子ＤＮＡと、該構造遺伝子が発現するような様式で該構造遺伝子ＤＮＡの５’部位に組み込まれた本発明のＤＮＡとを含んでなるＤＮＡ鎖を提供する。
本発明によるＤＮＡ鎖の具体的形態は、例えばプラスミド又はファージＤＮＡ中の構成要素の一部として、本発明のＤＮＡが挿入された形態であってよい。
このようなＤＮＡ鎖中に構造遺伝子ＤＮＡを組み込む場合には、その構造遺伝子が発現し得るように、本発明のＤＮＡ及び該構造遺伝子ＤＮＡを配置することができる。構造遺伝子ＤＮＡとしては、β−グルカンエリシター受容体（Ｕｍｅｍｏｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４（１９９７）１０２９−１０３４）、ｐａｃｌ（Ｓａｎｏら、Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（１９９７）１２９０−１２９４）、及び２−５ＡａｓｅやＲＮａｓｅＬ（Ｏｇａｗａら、Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（１９９６）１５６６−１５６９）をコードするＤＮＡ等を挙げることができるが、何等これらに限定されることはない。
本発明のＤＮＡ鎖はさらに、翻訳エンハンサー、翻訳終止コドン、ターミネーター等の構成要素を含むことができる。翻訳エンハンサー、翻訳終止コドン及びターミネーターとしては、公知のものを適宜組み合わせて用いることができる。ウイルス起源の翻訳エンハンサーとしては、例えば、タバコモザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルスＲＮＡ４、ブロモモザイクウイルスＲＮＡ３、ポテトウイルスＸ、タバコエッチウイルスなどの配列が挙げられる（Ｇａｌｌｉｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５（１９８７）８６９３−８７１１）。また、植物起源の翻訳エンハンサーとして、ダイズのβ−１，３グルカナーゼ（Ｇｌｕ）由来の配列（石田功、三沢典彦著、講談社サイエンティフィク編、細胞工学実験操作入門、講談社、ｐ．１１９、１９９２）やタバコのフェレドキシン結合性サブユニット（ＰｓａＤｂ）由来の配列（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（１９９５）１２４６６−１２４７０）などが挙げられる。ターミネーターとしては、例えば、ｎｏｓ遺伝子のターミネーター、ｏｃｓ遺伝子のターミネーターなどが挙げられる（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４４（１９９３）９８５−９９４、”Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”前出）。また、プロモーター中の転写エンハンサーとして、３５Ｓのエンハンサー部分が同定され、それらを複数個並べて繋げることにより、活性を高めることが報告されており（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１（１９８９）１４１−１５０）、この部分をＤＮＡ鎖の一部として用いることも可能である。これらの各種構成要素は、その性質に応じて、それぞれが機能し得る形でＤＮＡ鎖中に組み込まれることが好ましい。そのような操作は、当業者であれば適切に行うことができる。
本発明のＤＮＡ（プロモーター）は、転写開始点以降にダイズのＧｌｕ遺伝子由来の翻訳エンハンサーを含んでいる（該配列番号１又は２の２７９番目以降、或いは該配列番号３の３２９番目以降、或いは該配列番号４の４２９番目以降で示される）。この配列はメチル化フリーによる転写促進には直接関与していないが、目的とする遺伝子の発現をさらに促進することができる。この翻訳エンハンサーに関しては、本発明で使用したダイズのＧｌｕ遺伝子由来のものに限らず、これまで報告されているような上記のような他の翻訳エンハンサーに置き換えても同様な効果が期待できる。さらに、本発明のように、この翻訳エンハンサーのＣＧ配列につき、他の塩基に置換することも可能である。また他の翻訳エンハンサーに関して、ＣＧ配列以外にＣＮＧ配列がある場合には、該配列についてもＣＧ配列と同様に他の塩基に置換することも可能である。当業者であれば、そのような改変は適切に行うことができる。
上記ＤＮＡ鎖は、遺伝子工学の分野で慣用されている手法を用いることにより、当業者であれば容易に製造することができる。また、本発明のＤＮＡ鎖は、人工的な構築物に限定されるものではなく、上記のような構造を有するものであれば、天然の供給源から単離されたものであってもよい。該ＤＮＡ鎖は、周知慣用されている核酸合成の方法に従って合成する事により、得ることができる。
（３）形質転換
本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡを含むＤＮＡ鎖によって宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養又は栽培することにより、構造遺伝子の発現を誘導することができ、又は該構造遺伝子を高い効率で発現させることができる。前記構造遺伝子は外来遺伝子であってもよい。
形質転換後の本発明の鎖は、プラスミド、ファージ又はゲノムＤＮＡの中に挿入された形で、微生物（特に細菌）、ファージ粒子又は植物の中に存在することができる。ここで、細菌としては、典型的には、大腸菌、アグロバクテリウム等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の好ましい実施形態では、本発明のＤＮＡ鎖は、タンパク質を発現させようとしている構造遺伝子が、植物体中で安定に発現し得るように、本発明のＤＮＡ（プロモーター）、翻訳エンハンサー、構造遺伝子ＤＮＡ、翻訳終止コドン、及びターミネーター等とが一体に結合して、これがゲノムに挿入された形態で植物中に存在する。
宿主の好ましい例としては、イネ、ムギ、トウモロコシ、ネギ、ユリ、ラン等の単子葉植物、ダイズ、ナタネ、トマト、バレイショ、キク、バラ、カーネーション、ペチュニア、カスミソウ、シクラメン等の双子葉植物などの細胞が挙げられ、特に好ましい具体例としては、染色体の倍数性が高いキク等の植物細胞などが挙げられる。また、具体的な植物材料としては、例えば、生長点、苗条原基、分裂組織、葉片、茎片、根片、塊茎片、葉柄片、プロトプラスト、カルス、葯、花粉、花粉管、花柄片、花茎片、花弁、がく片等が挙げられる。
宿主に外来遺伝子を導入する方法としては、既に報告され、確立されている種々の方法を適宜利用することができる。その好ましい例として、例えば、生物学的方法としては、ウィルス、アグロバクテリウムのＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド等をベクターとして用いる方法が挙げられ、物理学的方法としては、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコール、パーティクルガン、マイクロインジェクション（”Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”前出）、シリコンニトリドウイスカー、シリコンカーバイドウイスカー（Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ ８５（１９９５）７５−８０、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３１（１９９５）１０１−１０４、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １３２（１９９８）３１−４３）によって遺伝子を導入する方法等が挙げられる。該導入方法については、当業者であれば適宜選択し、使用することができる。
さらに、本発明のＤＮＡ鎖で形質転換された植物細胞を再生させることにより、導入された遺伝子がその細胞内で発現する形質転換植物を作製することができる。このような操作は、植物細胞から植物体への再生方法として一般的に知られている方法により、当業者であれば容易に行うことができる。植物細胞から植物体への再生については、例えば、「植物細胞培養マニュアル」（山田康之編著、講談社サイエンティフィク、１９８４）等の文献を参照されたい。
発現誘導又は高発現された遺伝子の発現産物は、それ自体を単離して利用したい場合には、培養物からその発現産物に適した方法によって単離精製することができる。さらに、発現産物の存在により宿主細胞の成長又は生育、さらにはその細胞の性質が改質される場合には、そのような宿主を培養し、若しくは該宿主が脱分化した植物体である場合には、その植物体を栽培することで、目的とする構造遺伝子の発現産物を高発現させることができる。
また、本発明により開示された高発現のプロモーターによって、例えばカナマイシン耐性（例えば、ＮＰＴＩＩ）遺伝子の選択マーカーを発現させたＤＮＡ鎖を用いることにより、植物体の形質転換効率を著しく高めることができる。これは、選択マーカー遺伝子ＤＮＡと、該選択マーカー遺伝子が発現するような様式で該選択マーカー遺伝子ＤＮＡの５’部位に組み込まれた上記のいずれかのＤＮＡとを含んでなるＤＮＡ鎖を用いることにより行うことができる。その具体的手順は特に限定されないが、例えば、該ＤＮＡ鎖で宿主を形質転換処理し、得られた宿主を、前記選択マーカー遺伝子が発現可能であり、かつ、該選択マーカー遺伝子を発現する宿主とこれを発現しない宿主とを識別し得る条件下で培養することにより行うことができる。該宿主は植物細胞以外のものであってもよく、特に限定されないが、好ましくは植物細胞である。ここで使用し得る選択マーカー遺伝子はいかなるものであってもよく、特に限定されないが、好ましくは薬剤耐性遺伝子、例えば、ＮＰＴＩＩ遺伝子（カナマイシン耐性遺伝子）、Ｈｙｇｒ遺伝子（ハイグロマイシン耐性遺伝子）等を用いることができる。この場合には、選択マーカー遺伝子を発現する宿主とこれを発現しない宿主とを識別し得る条件は、その遺伝子が耐性を有する薬剤を含有する培地を用いて培養を行うことにより達成することができる。選択マーカー遺伝子としてＮＰＴＩＩ遺伝子を使用する場合に用いる薬剤としては、カナマイシン（Ｋｍ）が挙げられるが、これに何等限定されることはなく、Ｇ４１８やパロモマイシンも適宜選択して使用することができる。また、例えばハイグロマイシン耐性（例えば、Ｈｙｇｒ）遺伝子の選択マーカーを発現させたＤＮＡ鎖を用いた場合にも同様の効果が期待できる。この場合に用いる薬剤としては、ハイグロマイシンを挙げることができる。
この場合においても、該ＤＮＡ鎖を宿主細胞に導入して形質転換された植物体を得る方法としては、上記のような任意の方法を用いることができ、該植物体の発現確認には、例えばレポーター遺伝子がＧｕｓの場合には、上記の（ｉ）ヒストケミカルなＧｕｓ染色による方法により、及び／又は（ｉｉ）蛍光基質を用いる方法（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃ２（１９９４）１−３２、前出）等によって確認することができる。
一般に、細胞の分化に伴って、メチル化による遺伝子の不活化が起こることが知られており、本発明によって開示されたプロモーターは、形質転換時のカルス等の未分化な植物細胞のみならず、植物体においても目的遺伝子を高発現させることが期待される。
産業上の利用可能性
本発明によれば、従来から植物用の高発現プロモーターとされてきたカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターによる構造遺伝子の発現が弱い植物、例えばキクにおいても、該発現効率を向上させることができる。
実施例
以下に本発明を実施例によって説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕メチル化フリープロモーターの作製
ＣａＭＶの３５ＳプロモーターのｍＲＮＡ（転写）開始点より上流２５０ｂｐ中には１３個のＣＧ若しくはＣＮＧが存在し、これらの塩基配列は植物体中で、それぞれＣＧメチル化酵素及びＣＮＧメチル化酵素によりメチル化を受けていることが推察される。そこで、これらの配列をメチル化を受けないような配列に置換したＤＮＡを全合成した（ＭＦ−４８：配列番号１）。また、転写活性に特に大きな影響を持つと思われるｏｃｓ領域については、その中のＣＧ配列を残しつつ、６塩基の回文状構造（ＧＡＣＧＴＣ）になるように改変したものを作製した（ＭＦ−１８：配列番号２）。ＭＦ−４８及びＭＦ−１８の配列（転写開始点より上流）と、植物の遺伝子操作で通常最もよく用いられるベクターｐＢＩ１２１に含まれる３５Ｓプロモーターの配列との比較を、それぞれ図１Ａ及び図１Ｂに示した。図１Ａ及び図１Ｂにおいて、下線部はメチル化の標的と言われるＣＧ及びＣＮＧ配列を表す。
上記のものとは別に、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ Ｍｉｅｓｃｈｅｒ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ（スイス国）のホーン博士より、３５Ｓプロモーターのメチル化標的部位を改変した遺伝子（プラスミド名はｐＳａｎ９：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３（１９９６）８３３４−８３３９、前出）の譲渡を受けた。この遺伝子は、ｍＲＮＡの転写開始点の上流約２５０塩基対のプロモーター部分と、その下流にＣａＭＶの３５Ｓ遺伝子の約５０塩基対の５’非翻訳配列（該プロモーター部分及び該５’非翻訳配列を併せて、以下「ＭＦ−２８」という）、さらに下流にＧｕｓの構造（レポーター）遺伝子と３５Ｓのターミネーターを含むＧｕｓ遺伝子発現カセットから構成されている。
〔実施例２〕メチル化フリープロモーターを有するベクターの作製
このようにして作製したＭＦ−４８、ＭＦ−１８及びＭＦ−２８の効果を形質転換された植物体で検証するため、発現ベクターを構築した。以下の発現ベクターはすべて、ボーダー配列に挟まれた領域内にＧｕｓ遺伝子及びＮＰＴＩＩ遺伝子の発現ユニットが、転写方向が反対になるように構成されている。これらの発現カセットを、アグロバクテリアと大腸菌で増幅可能なバイナリー型ベクター、ｐＫＴ１１を基本ベクターとして、Ｇｕｓ遺伝子及びＮＰＴＩＩ遺伝子のプロモーターを置き換えることにより、ｐＫＴ８１、ｐＫＴ８３及びｐＭＦ−２８を構築した。
上記バイナリー型ベクターｐＫＴ１１は、アグロバクテリアＡ２８１のＲＢ領域である、ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ約２５０ｂｐ、Ｇｕｓ遺伝子の発現ユニット部分である、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ約３．５ｋｂｐの部分（５’側から順に、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーター、タバコのＰｓａＤｂの翻訳エンハンサー、トウゴマのカタラーゼ遺伝子のイントロンを含むＧｕｓ遺伝子、ｎｏｓ遺伝子のターミネーターを連結）、ＮＰＴＩＩ遺伝子の発現ユニット部分である、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ約１．７ｋｂｐの部分（ｎｏｓ遺伝子のプロモーターで駆動される植物体で働くＮＰＴＩＩ遺伝子、ｎｏｓ遺伝子のターミネーター）、及びｐＢＩ１２１由来のレフトボーダー領域とアグロバクテリアと大腸菌で増幅可能な複製起点を持つ部分のＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ約５．５ｋｂｐから構成されているベクターであり、さらに、ダイズ由来のＧｌｕ遺伝子の翻訳エンハンサーを接続したプロモーターにより、Ｇｕｓ遺伝子を発現させたベクターである（図２Ｄ）。
実施例１で作製したＤＮＡ断片（プロモーター）をアガロースゲルにより精製し、プラスミドｐＫＴ１１の３５Ｓプロモーター領（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ）と置換し、プラスミドｐＫＴ８１、及びｐＫＴ８３を作製した（図２）。
ｐＫＴ８１及びｐＫＴ８３はそれぞれ、ＭＦ−４８及びＭＦ−１８の下流に、翻訳効率を高める目的で、ダイズ由来のＧｌｕ遺伝子の翻訳エンハンサーを接続し、更に下流に、レポーター遺伝子であるＧｕｓ遺伝子、ｎｏｓ遺伝子のターミネーターを繋げた発現ユニットを持つ。同時に、ｉｐｔ遺伝子のプロモーター、ダイズ由来のＧｌｕ遺伝子の翻訳エンハンサー、ＮＰＴＩＩ遺伝子、及びｎｏｓ遺伝子のターミネーターを接続した発現ユニットを含んでいる。
ｐＭＦ−２８は、ｐＳａｎ９のＧｕｓ遺伝子発現カセット全体を、ｐＫＴ１１のＧｕｓ発現カセットと交換したものである。
ＭＦ−４８とＭＦ−１８のプロモーター、及びＭＦ−２８によりＧｕｓ遺伝子をそれぞれ発現するベクターｐＫＴ８１、ｐＫＴ８３及びｐＭＦ−２８の制限酵素地図を、それぞれ図２Ａ、Ｂ及びＣに、ベースとなるｐＫＴ１１を図２Ｄに示す。
また、ｏｃｓ領域を増加させたプロモーターを作製するため、ＭＦ−４８プロモーターのｏｃｓを含む領域である、制限酵素ＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩの切断地点までの間の配列を、本プロモーターをＢａｍＨＩで切断した断片へ挿入し、この配列が同じ向きで２コピー直列に並んだプロモーター（ＭＦ−４８−２：配列番号３）、並びにこの配列が同じ向きで４コピー直列に並んだプロモーター（ＭＦ−４８−４：配列番号４）をそれぞれ作製した（図３）。
〔実施例３〕Ｇｕｓ遺伝子を発現するキクカルスの作製
ＭＦ−４８及びＭＦ−１８のプロモーターによりＧｕｓ遺伝子を発現するベクターｐＫＴ８１及びｐＫＴ８３、並びに対照としてｐＫＴ１１をエレクトロポレーション法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株に導入し、これを下記のＹＥＢ−Ｋｍ培地３ｍｌに接種し、２８℃で１６時間、暗所で培養した後、遠心により集菌し、下記の感染培地１０ｍｌに懸濁して、これを感染液とした。ＹＥＢ−Ｋｍ培地及び感染培地の培地組成は、以下の通りである。
ＹＥＢ−Ｋｍ培地；５ｇ／ｌビ−フエキス、１ｇ／ｌ酵母エキス、５ｇ／ｌペプトン、５ｇ／ｌスクロ−ス、２ｍＭ硫酸マグネシウム（ｐＨ７．２）、５０ｍｇ／ｌカナマイシン。
感染培地；１／２濃度のＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ Ｓｋｏｏｇ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，１５（１９６２）４７３−４９７）培地の無機塩及びビタミン類、１５ｇ／ｌスクロ−ス、１０ｇ／ｌグルコ−ス、１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．４）。
キクの栽培品種である、レ−ガン（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ ｃｖ．Ｒｅａｇａｎ又はＤｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ ｃｖ．Ｒｅａｇａｎ）の無菌個体の葉を５−７ｍｍ角に切断し、それぞれ各種ベクター：ｐＫＴ１１、ｐＫＴ８１及びｐＫＴ８３を導入したアグロバクテリウム感染液に１０分間浸し、過剰な感染液を濾紙上で拭き取った後、下記の共存培地に移植して２５℃の暗所で培養した。３日間培養した後、下記の選択培地に移植して３週間培養することにより、Ｋｍ耐性のカルスを得た。選択培地での培養は２５℃、１６時間照明（光密度３２μＥ／ｍ２ｓ）／８時間無照明の条件下で行った。得られたＫｍ耐性のカルスを含む葉片各４枚ずつ、計１２枚を、Ｇｕｓ遺伝子の発現確認のため、Ｇｕｓ活性測定に用いた。
共存培地；ＭＳ培地の無機塩及びビタミン類、３０ｇ／ｌスクロ−ス、１ｍｇ／ｌナフタレン酢酸、２ｍｇ／ｌベンジルアデニン、８ｇ／ｌ寒天、５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．８）、２００μＭアセトシリンゴン。
選択培地；ＭＳ培地の無機塩及びビタミン類、３０ｇ／ｌスクロ−ス、１ｍｇ／ｌナフタレン酢酸、２ｍｇ／ｌベンジルアデニン、８ｇ／ｌ寒天、５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．８）、２５ｍｇ／ｌカナマイシン、３００ｍｇ／ｌセフォタキシム。
該測定の反応溶液（１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）１ｍＭ）２００μｌ中に該葉片を移し、氷冷しながら十分に破砕した。懸濁液を遠心して上清を回収し、これを粗酵素液とした。Ｇｕｓ活性の測定は、既報（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃ２（１９９４）１−３２、前出）に基づいて行った。即ち、反応溶液１４５μｌに粗酵素液５μｌ及び基質として２．８ｍｇ／ｍｌの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド５０μｌを添加し、発生する蛍光を測定して行った。タンパク質量の測定はバイオラッド社のプロテインアッセイキットＩＩを用いて行い、タンパク質量あたりのＧｕｓ活性を求めた。下記の表１にｐＫＴ１１、ｐＫＴ８１及びｐＫＴ８３によりそれぞれ形質転換されたカルスのＧｕｓ活性を示す。ｐＫＴ８１及びｐＫＴ８３により形質転換されたカルスは、ｐＫＴ１１により形質転換されたカルスよりも約４〜５倍高いＧｕｓ活性を示したことから、メチル化フリープロモーター：ＭＦ−４８及びＭＦ−１８が高発現性であることが確認された。
ＭＦ−４８−２及びＭＦ−４８−４についても、ｐＢＩ１２１の３５Ｓプロモーターと置き換えたベクターを作製し、上記同様、キク葉片を材料にした形質転換を行い、Ｋｍ耐性のカルスを得た。それらのカルスを用いて、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃ２（１９９４）１−３２（前出）に記載の方法に従って、Ｇｕｓ活性による組織染色を行ったところ、ｐＢＩ１２１では、発色が観察されなかったのに比べ、ＭＦ−４８−２及びＭＦ−４８−４では、著しく強い青色の発色が観察された。即ち、定性的な発現強度は、ｐＢＩ１２１では−であったのに比べ、ＭＦ−４８−２とＭＦ−４８−４では、＋から＋＋であった。
〔実施例４〕 Ｇｕｓ遺伝子を発現するキク植物体の作製
植物の形質転換において、しばしばカルスのような未分化な細胞中で高発現するプロモーターが、生長した植物体においては、ごく一部の細胞でしか高発現しない現象が見受けられる。この現象の１つの原因として、植物細胞が分化する際に、不要な遺伝子の発現を抑制するため遺伝子のメチル化が促進されることが考えられる。以上の観点から、本発明によって開示されたメチル化フリープロモーターは生長した植物体においても高発現するのではないかと考え、これを検証した。
ｐＫＴ８１、ｐＫＴ８３及びｐＭＦ−２８を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株を、実施例３の方法に従って形質転換して得られたＫｍ耐性のカルスからＫｍを含むＭＳ培地（再生培地；実施例３の選択培地と同じ組成）で、植物体を再生させた。さらに、発根を促進するために、再生培地から植物生長調節物質（ナフタレン酢酸、ベンジルアデニン）を除いた発根促進培地で生長させた。
生長した植物体の中から外来遺伝子としてＮＰＴＩＩ遺伝子を含有する個体を、ＰＣＲを行うことによって検出し、該再分化植物体が形質転換体であることを確認した。ここで、ＮＰＴＩＩ遺伝子特有の配列を特異的に増幅するプライマーとして、ＴＡＡＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧＴ（配列番号５）、及びＧＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＡＡＴＣＧＧＣＴ（配列番号６）を用いた。ＰＣＲの反応条件は、９４℃で５分間の加熱後、９４℃（３０秒）−５５℃（１分）−７２℃（１分）のサイクルを３０回行い、最後に７２℃で１０分間反応させた。この反応では、酵素としてＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いた。
それら植物体の葉各３枚、各遺伝子あたり１０個体ずつについて、Ｋｍ耐性のカルスと同様に活性を測定した平均値を、図４に示す。対照として、実施例３の形質転換法に従って、ｐＢＩ１２１をキク及びタバコ（品種：キサンチ（Ｘａｎｔｈｉ））に導入する実験も実施した。また、ｐＫＴ８１（ＭＦ−４８）、ｐＫＴ８３（ＭＦ−１８）、及びｐＭＦ−２８（ＭＦ−２８）を導入したキク形質転換体の葉でのＧｕｓ遺伝子の発現量を、個体別に測定したヒストグラムを図５に示す。
結果は、ｐＫＴ８１（ＭＦ−４８）、ｐＫＴ８３（ＭＦ−１８）及びｐＭＦ−２８（ＭＦ−２８）を導入したキクでは、ｐＢＩ１２１に比べて、より高いＧｕｓ遺伝子の発現が観察された。とは言え、ｐＭＦ−２８の発現量は、高発現プロモーターの例としてよく知られているタバコでの発現量には及ばなかった。ところが、驚くべきことに、ｐＫＴ８１とｐＫＴ８３ではタバコにおけるｐＢＩ１２１（３５Ｓ）の発現量を、はるかに凌駕していた。その中でｐＫＴ８１（ＭＦ−４８）とｐＫＴ８３（ＭＦ−１８）を比較すると、ｐＫＴ８３（ＭＦ−１８）の個体の方が、Ｇｕｓ遺伝子の発現が、より高い傾向があった（図４）。また、キクでの発現量を個体別に見てみると、例えばＧｕｓ遺伝子の発現量は、３倍以上を示す個体は、ＭＦ−４８及びＭＦ−１８に限定されていた。全体的にはＭＦ−１８の方が、ＭＦ−４８に比べ、高発現個体数がより多い傾向にあった（図５）。
〔実施例５〕形質転換されたキクでの外来遺伝子のメチル化の解析
導入した遺伝子が生体内でどのようにメチル化をされているかを知るために、導入遺伝子の配列中のメチル化されているシトシンの位置を測定した。分析法は、Ｍｅｙｅｒらのシトシン・デアミネーションーＰＣＲ法（ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１３（１９９４）２０８４−２０８８）に従った。その方法の概略は、まず、実施例４で得られた形質転換キクよりＣＴＡＢ法によってＤＮＡを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、変換バッファー（３Ｍ Ｎａ−ｂｉｓｓｕｌｆａｔｅ，０．５ｍＭヒドロキノン，ｐＨ５．３）に懸濁し、窒素気相中、５０℃で２０時間反応させた。透析による脱塩後、ＤＮＡを０．３ＮのＮａＯＨでアルカリ変性した後、エタノールによってＤＮＡを沈殿させて回収した。次に、塩基配列を決定する部位を挟み込むように設定したＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ここで用いたＰＣＲプライマーを以下に示す。
＜３５Ｓ領域メチル化解析用ｐｒｉｍｅｒ＞
１回目のＰＣＲ
２回目のＰＣＲ
＜３５Ｓ相補鎖のメチル化解析用ｐｒｉｍｅｒ＞
１回目のＰＣＲ
２回目のＰＣＲ
＜ＧＵＳ ｇｅｎｅメチル化解析用ｐｒｉｍｅｒ＞
１回目のＰＣＲ
２回目のＰＣＲ
＜Ｐａｃｌ ｇｅｎｅメチル化解析用ｐｒｉｍｅｒ＞
１回目のＰＣＲ
２回目のＰＣＲ
＜ＭＦメチル化解析用ｐｒｉｍｅｒ＞
１回目のＰＣＲ
２回目のＰＣＲ
上記ＰＣＲの反応条件はすべて、１回目は９４℃で５分間の加熱後、９４℃（３０秒）−６５℃（１分）−７２℃（１分）のサイクルを３０回行い、最後に７２℃で１０分間反応させた。２回目は、１回目のＰＣＲ産物からの１μｌを用いて、９４℃で５分間の加熱の後、９４℃（３０秒）−６０℃（１分）−７２℃（１分）のサイクルを３０回行い、最後に７２℃で１０分間反応させた。
この反応で、酵素はＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）を用い、ＰＣＲの合成産物をｐＴ７ｂｌｕｅにクローニングして、元のＤＮＡについて、それぞれ約５クローンのＤＮＡ配列を決定した。これらの一連の変換反応によって、シトシンはウリジンに変換され、メチル化シトシンはそのままシトシンとして読まれるため、メチル基の有無が区別できる。塩基配列の差異は、ＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ ｖ３．７により解析した。
実施例４により得られたキク形質転換体を約１０個体分析した結果、Ｇｕｓ遺伝子が高発現しているキク形質転換体では、３５Ｓプロモーター中で、メチル化されたシトシンは比較的少なく、かつ約５クローン中でのメチル化されている割合も低かった。一方、Ｇｕｓ遺伝子の発現が検出できない個体では、３５Ｓプロモーター中で、ＣＧとＣＮＧを含む、ほぼ全てのシトシンが高い割合でメチル化されていた。ここで、対照実験として、同じ遺伝子を導入したタバコ（品種：キサンチ（Ｘａｎｔｈｉ））についても、Ｇｕｓ遺伝子の高発現個体を調査したところ、シトシンのメチル化は全く検出されなかった。なお、キクで３５ＳプロモーターのＤＮＡの相補鎖についてもシトシンのメチル化程度を調査したところ、メチル化シトシンが散在していたが、特定のシトシンが修飾されることはなく、またＧｕｓ遺伝子の発現との相関もなかった。一方、構造遺伝子のメチル化についても調査したが、少なくとも翻訳開始点（ＡＴＧ）から約６００塩基までにはシトシンの修飾は、発現の強弱に関わらず、ほとんど見られなかった。以上のようなシトシンのメチル化と発現量の関係は、Ｇｕｓ遺伝子ばかりでなく、２本鎖ＲＮＡ特異的ＲＮａｓｅ遺伝子（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，１２９０−１２９７、前出）を３５Ｓプロモーターの下流に繋いだ構造をキクに導入した場合にも観察された。
次に、ｐＫＴ８１を導入し、Ｇｕｓ遺伝子を高発現しているキクについても、同様にメチル化の調査を行った。その結果、形質転換体によって、全くメチル化を受けない個体と、回文状構造以外の部位のシトシンが、プロモーターからＧｕｓ遺伝子にかけて、強くメチル化を受けている個体があった。しかし、いずれの群の個体もＧｕｓ遺伝子を強く発現していた事から、回文状構造（ＣＧ及びＣＮＧ）以外のシトシン残基のメチル化については、遺伝子発現への影響は少ないと考えられた。
従って、構造遺伝子の発現を上げる方法の一つとして、導入遺伝子のプロモーター部位の、ＣＧ及びＣＮＧの回文状構造をなす塩基配列を変換することが重要と考えられた。なお、回文状構造の中でも、ｐＫＴ８３では、所謂ｏｃｓ配列と呼ばれる短い配列中のＣＧ配列（配列番号２の１８５及び１９７番目にあるシトシン塩基）については、変換しない配列になっているが、この部位の効果に関しては、実施例３（図４及び図５）の結果ではｐＫＴ８１よりも活性が高い傾向にあるので、高発現プロモーターの作製に当たっては、このｏｃｓ配列の回文状構造を変換しない方が、生体内でのより高い発現が達成できることが示された。
〔実施例６〕カーネーションの形質転換
メチル化フリープロモーターでＮＰＴＩＩ遺伝子の発現量を増加させ、マーカーでの選抜効率を向上させることを目的に、ＮＰＴＩＩの発現カセットのＮｏｓプロモーターをメチル化フリープロモーターに変更した。簡単に説明すると、カセット中のＮｏｓプロモーターとＭＦ−４８プロモーターを、ＨｉｎｄＩＩＩからＸｂａＩのＤＮＡ断片で置換し、ＭＦ−４８プロモーター・ＮＰＴＩＩ・Ｎｏｓターミネーターのカセットを作製した。これとｐＫＴ−１１中のＮＰＴＩＩ発現カセット（ＨｉｎｄＩＩＩからＫｐｎＩ）と置換することにより、Ｇｕｓの発現カセットと連結されたバイナリーベクターとして、ｐＫＴ７４を作製した。
このｐＫＴ７４、及び対照としてｐＫＴ１１をエレクトロポレーション法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株に導入し、これを下記のＹＥＢ−Ｋｍ培地３ｍｌに接種し、２８℃で１６時間、暗所で培養した後、遠心により集菌し、下記の感染培地１０ｍｌに懸濁して、これを感染液とした。ＹＥＢ−Ｋｍ培地及び感染培地の培地組成は、以下の通りである。
ＹＥＢ−Ｋｍ培地；５ｇ／ｌビ−フエキス、１ｇ／ｌ酵母エキス、５ｇ／ｌペプトン、５ｇ／ｌスクロ−ス、２ｍＭ硫酸マグネシウム（ｐＨ７．２）、５０ｍｇ／ｌカナマイシン。
感染培地；１／２濃度のＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ ＳＫｏｏｇ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，１５（１９６２）４７３−４９７）培地の無機塩及びビタミン類、１５ｇ／ｌスクロ−ス、１０ｇ／ｌグルコ−ス、１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．４）。
カーネーションの栽培品種であるスケニア（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ Ｌ）の無菌個体から葉の基部を切断し、それぞれｐＫＴ１１及びｐＫＴ７４を導入したアグロバクテリウム感染液に１０分間浸し、過剰な感染液を濾紙上で拭き取った後、下記の共存培地に移植して２５℃の暗所で培養した。３日間培養した後、下記の選択培地に移植して３週間培養することにより、Ｇ４１８耐性のカルスを得た。選択培地での培養は２５℃、１６時間照明（光密度３２μＥ／ｍ２ｓ）／８時間無照明の条件下で行った。
共存培地；ＭＳ培地の無機塩及びビタミン類、３０ｇ／ｌスクロ−ス、０．５ｍｇ／ｌインドール酪酸、０．２２ｍｇ／ｌチジアズロン、８ｇ／ｌ寒天、５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．８）、１００ｍｇ／ｌアセトシリンゴン。
選択培地；ＭＳ培地の無機塩及びビタミン類、３０ｇ／ｌスクロ−ス０．５ｍｇ／ｌインドール酪酸、０．２２ｍｇ／ｌチジアズロン、８ｇ／ｌ寒天、５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．８）、２５ｍｇ／ｌ Ｇ４１８、３００ｍｇ／ｌセフォタキシム。
〔実施例７〕 カーネーション形質転換体の選抜
ｐＫＴ１１及びｐＫＴ７４を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株を、実施例６の方法に従って形質転換して得られたＧ４１８耐性の幼植物から、Ｇ４１８を含み、植物生長調節物質（インドール酪酸、チジアズロン）を含まないＭＳ培地で、植物体を再生させた。
生長した植物体の中から外来遺伝子としてＮＰＴＩＩ遺伝子を含有する個体を、ＰＣＲを行うことによって検出し、該再分化植物体が形質転換体であることを確認した。ここで、ＮＰＴＩＩ遺伝子特有の配列を特異的に増幅するプライマーとして、ＴＡＡＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧＴ（配列番号５）、及びＧＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＡＡＴＣＧＧＣＴ（配列番号６）を用いた。ＰＣＲの反応条件は、９４℃で５分間の加熱後、９４℃（３０秒）−５５℃（１分）−７２℃（１分）のサイクルを３０回行い、最後に７２℃で１０分間反応させた。この反応では、酵素としてＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いた。
ＰＣＲによりＮＰＴＩＩ遺伝子が検出された個体を形質転換体とした。ｐＫＴ１１及びｐＫＴ７４のそれぞれについて、使用した葉片あたりの形質転換体の数として形質転換効率を算出したところ、ｐＫＴ１１では５％以下であったのに対し、ｐＫＴ７４では２５％以上の効率を示した。なお、Ｇｕｓ活性については、実施例３と同様に測定し、組換え体がすべてＧｕｓ遺伝子を発現していることを確認した。
以上の結果から、選択マーカー遺伝子を発現させる上でも、ＭＦ−４８プロモーターは極めて有効に機能するものと考えられた。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、参照によりその全体を本明細書に組み入れるものとする。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１Ａ及び図１Ｂは、本発明によるプロモーター：ＭＦ−４８のＤＮＡ配列（図１Ａ）及びＭＦ−１８のＤＮＡ配列（図１Ｂ）（上段）と、ｐＢＩ１２１に含まれる３５ＳプロモーターのＤＮＡ配列（下段）との比較を示す図である。
図２は、プラスミドｐＫＴ８１（Ａ）、ｐＫＴ８３（Ｂ）、ｐＭＦ−２８（Ｃ）及びｐＫＴ１１（Ｄ）の構造の一部を示す図である。
図３は、プラスミドｐＭＦ−４８−Ｇｕｓ、並びにその誘導体ｐＭＦ−４８−２及びｐＭＦ−４８−４の概略を示す図である。
図４は、４種類のベクターで形質転換したキクの葉における、Ｇｕｓ遺伝子の発現量の平均値（１０個体以上）を、対照としてのｐＢＩ１２１で形質転換した組換えタバコでのＧｕｓ遺伝子の発現量への相対値で表した図である。
図５は、それぞれ３種類のベクターで形質転換したキクの葉における、Ｇｕｓ遺伝子の発現量の相対値（対照はｐＢＩ１２１で形質転換した組換えタバコ）の個体別の分布を示した図である。
本発明は、改良プロモーター及びその使用に関し、より詳細には、形質転換生物の作出に際して、メチル化を受けにくいよう改良したプロモーター、及びその使用に関するものである。
背景技術
所望の形質転換植物を作出する上で、重要な要素のひとつとして高発現プロモーターがある。プロモーター配列は植物細胞内での遺伝子の転写レベルを決定する主要な因子であり、一般に、転写活性の強いプロモーター配列を用いることにより目的とする外来遺伝子の発現レベルを上げることが可能である。また、マーカー遺伝子の発現レベルの上昇により、形質転換植物の取得は著しく容易になるので、高発現プロモーターは、形質転換植物を作製するための薬剤耐性遺伝子マーカーの発現にも重要である。
このような背景から、植物における高発現プロモーターの取得が、これまでに数多く報告されてきた。代表的な例としては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターやアグロバクテリウムのイソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子やノパリン合成酵素（ｎｏｓ）遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。更に、形質転換宿主の対象となる植物のゲノムから高発現遺伝子のプロモーターを取得し、それを利用する例も見受けられる（Ｇｅｎｓｃｈｉｋら、Ｇｅｎｅ，１４８（１９９４）１９５−２０２）。
近年になり、これらのプロモーターを複数個組み合わせたキメラ型プロモーターの中から、プロモーター活性が著しく上昇したものを取得できることが示されている。一例を挙げれば、Ｍｉｎ Ｎｉらは、アグロバクテリウム由来のオクトピン合成酵素（ｏｃｓ）遺伝子とマンノピン（ｍａｎ）合成酵素遺伝子のプロモーターを組み合わせることによって、タバコにおいて高発現を示すプロモーターが取得できることを示している（Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，７（１９９５）６６１−６７６）。
しかしながら、これらの高発現プロモーターを用いても、すべての植物において、必要なレベルの外来遺伝子の発現個体が得られるわけではない。その理由の１つとして、各々の植物細胞に存在するＲＮＡポリメラーゼの違いに基づく特異性が存在することが挙げられる。また別の理由として、植物が外来遺伝子の発現を抑制する機構を持っていることが推察されている。この遺伝子の不活化、あるいは発現抑制の機構に関与する代表的な因子として、ゲノムＤＮＡにおけるシトシンのメチル化が考えられる（ＭｅｙｅｒとＳａｅｄｌｅｒ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７（１９９６）２３−４８）。
このシトシンのメチル化は、ＣＧ及びＣＮＧ（Ｎは任意の塩基）という塩基配列が回文状の構造をなしている２本鎖ＤＮＡ配列において顕著に起きることが知られている（ＭａｔｚｋｅとＭａｔｚｋｅ、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０７（１９９５）６７９−６８５）が、他のＤＮＡ配列中のシトシンにおいてもメチル化が起こることが知られている（Ｍｅｙｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１３（１９９４）２０８４−２０８８）。シトシンがメチル化を受けると、遺伝子の発現が抑制されることが多くの生物において知られており（Ｒａｚｉｎ．ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１７（１９９８）４９０５−４９０８）、また、植物のゲノムでは、他の生物と比べてメチル化されているシトシンの割合が高いため、メチル化が遺伝子の不活化に密接に関連しているという報告がされてきた（ＭｅｙｅｒとＳａｅｄｌｅｒ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７（１９９６）２３−４８）。特に、遺伝子操作等によって導入された外来遺伝子の発現が抑制される現象、すなわち「ジーン・サイレンシング」の原因については、ＤＮＡのメチル化による不活化も関係していると推測されている。
しかしながら、これまで、プロモーターのメチル化を制御することにより遺伝子の発現を向上させたという報告はなされていなかった。僅かに、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターとβ−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）遺伝子を繋いだ遺伝子構築物を、試験管内で強制的にメチル化させることによって、遺伝子の一過的な発現が低下する旨の報告が１例あるのみである（Ｈｏｈｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３（１９９６）８３３４−８３３９）。但し、該報告の実験においても、生体内でどの塩基配列がメチル化を受け、その結果、発現が低下するに至ったのかは検証されていない。また、Ｈｏｈｎらは、プロモーターのみならず、構造遺伝子部分のシトシンのメチル化もＧｕｓ遺伝子の発現低下をもたらすことを観察し、構造遺伝子部分がメチル基による修飾を受けないことも高発現のためには重要であると結論付けており、脱メチル化プロモーターの利用による高発現化にはむしろ否定的ともいえる。
従って、プロモーターのメチル化を回避することにより、遺伝子発現レベルを向上させる具体的方法は不明であった。また、メチル化を回避し、より高発現の形質転換宿主を得るために、プロモーター活性を損なわないようにプロモーター部分、又はプロモーター部分を含むＤＮＡ鎖のどこのＣＧ及びＣＮＧ配列を具体的にどのような他の塩基に改変すればよいのかも不明であった。
発明の開示
本発明は、構造遺伝子の５’側に置いた場合、この構造遺伝子の発現を活性化するプロモーターの提供をその目的としている。また、本発明は、前記プロモーターを含んでなるＤＮＡ鎖の提供をその目的としている。さらに、本発明は、前記ＤＮＡ鎖で形質転換された宿主、及び該宿主を利用した構造遺伝子を高発現させる方法の提供をその目的としている。
本発明者らは、以上の観点から、プロモーターの２本鎖ＤＮＡ配列中のＣＧ及びＣＮＧからなるＤＮＡの回文状の配列を、プロモーター活性を損なわないように、ＣＧ及びＣＮＧ配列が生じない他の塩基に改変してメチル化を受けにくくすることにより、高発現プロモーターを作製できると考えた。この考えに基づき、鋭意研究を重ねた結果、新規にデザインしたプロモーターを翻訳エンハンサー、構造（レポーター）遺伝子、翻訳終止コドン、ターミネーター等の構成要素等と繋ぎ、これを用いてキク植物体を形質転換することにより、該キク植物体において外来遺伝子の発現レベルを飛躍的に向上し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるＤＮＡを提供する。
（ａ）配列番号１で表わされる塩基配列中の第７〜２７２塩基からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１で表わされる塩基配列中の第７〜２７２塩基からなる塩基配列において、第４１〜４２塩基、第５９〜６０塩基、第７３〜７５塩基、第７７〜７８塩基、第８０〜８２塩基、第１０９〜１１０塩基、第１１９〜１２０塩基、第１３４〜１３５塩基、第１４５〜１４６塩基、第１８１〜１８３塩基、第１８５〜１８６塩基、第１９７〜１９８塩基、及び第２１７〜２１８塩基を除く部位にて１個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中にＣＧ、ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＣＧ及びＣＧＧで表わされる連続配列を含まず、かつ、プロモーター活性を有するＤＮＡ。
さらに、本発明は、以下の（ｃ）又は（ｄ）に示されるＤＮＡを提供する。
（ｃ）配列番号１で表わされる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１で表わされる塩基配列において、第４１〜４２塩基、第５９〜６０塩基、第７３〜７５塩基、第７７〜７８塩基、第８０〜８２塩基、第１０９〜１１０塩基、第１１９〜１２０塩基、第１３４〜１３５塩基、第１４５〜１４６塩基、第１８１〜１８３塩基、第１８５〜１８６塩基、第１９７〜１９８塩基、及び第２１７〜２１８塩基を除く部位にて１個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中にＣＧ、ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＣＧ及びＣＧＧで表わされる連続配列を含まず、かつ、プロモーター活性を有するＤＮＡ。
さらに、本発明は、以下の（ｅ）又は（ｆ）に示されるＤＮＡを提供する。
（ｅ）配列番号２で表わされる塩基配列中の第７〜２７２塩基からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｆ）配列番号２で表わされる塩基配列中の第７〜２７２塩基からなる塩基配列において、第４１〜４２塩基、第５９〜６０塩基、第７３〜７５塩基、第７７〜７８塩基、第８０〜８２塩基、第１０９〜１１０塩基、第１１９〜１２０塩基、第１３４〜１３５塩基、第１４５〜１４６塩基、第１８１〜１８３塩基、第１８３〜１８８塩基、第１９５〜２００塩基、及び第２１７〜２１８塩基を除く部位にて１個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中にＣＧ、ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＣＧ及びＣＧＧで表わされる連続配列を含まず（但し、第１８５〜１８６塩基及び第１９７〜１９８塩基はそれぞれＣＧである）、かつ、プロモーター活性を有するＤＮＡ。
さらに、本発明は、以下の（ｇ）又は（ｈ）に示されるＤＮＡを提供する。
（ｇ）配列番号２で表わされる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｈ）配列番号２で表わされる塩基配列において、第４１〜４２塩基、第５９〜６０塩基、第７３〜７５塩基、第７７〜７８塩基、第８０〜８２塩基、第１０９〜１１０塩基、第１１９〜１２０塩基、第１３４〜１３５塩基、第１４５〜１４６塩基、第１８１〜１８３塩基、第１８３〜１８８塩基、第１９５〜２００塩基、及び第２１７〜２１８塩基を除く部位にて１個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中にＣＧ、ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＣＧ及びＣＧＧで表わされる連続配列を含まず（但し、第１８５〜１８６塩基及び第１９７〜１９８塩基はそれぞれＣＧである）、かつ、プロモーター活性を有するＤＮＡ。
さらに、本発明は、以下の（ｉ）又は（ｊ）に示されるＤＮＡを提供する。
（ｉ）配列番号３で表わされる塩基配列中の第７〜３２２塩基からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｊ）配列番号３で表わされる塩基配列中の第７〜３２２塩基からなる塩基配列において、第４１〜４２塩基、第５９〜６０塩基、第７３〜７５塩基、第７７〜７８塩基、第８０〜８２塩基、第１０９〜１１０塩基、第１１９〜１２０塩基、第１３４〜１３５塩基、第１４５〜１４６塩基、第１８１〜１８３塩基、第１８５〜１８６塩基、第１９７〜１９８塩基、第２１７〜２１８塩基、第２３１〜２３３塩基、第２３５〜２３６塩基、第２４７〜２４８塩基、及び第２６７〜２６８塩基を除く部位にて１個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中にＣＧ、ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＣＧ及びＣＧＧで表わされる連続配列を含まず、かつ、プロモーター活性を有するＤＮＡ。
さらに、本発明は、以下の（ｋ）又は（ｌ）に示されるＤＮＡを提供する。
（ｋ）配列番号３で表わされる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｌ）配列番号３で表わされる塩基配列において、第４１〜４２塩基、第５９〜６０塩基、第７３〜７５塩基、第７７〜７８塩基、第８０〜８２塩基、第１０９〜１１０塩基、第１１９〜１２０塩基、第１３４〜１３５塩基、第１４５〜１４６塩基、第１８１〜１８３塩基、第１８５〜１８６塩基、第１９７〜１９８塩基、第２１７〜２１８塩基、第２３１〜２３３塩基、第２３５〜２３６塩基、第２４７〜２４８塩基、及び第２６７〜２６８塩基を除く部位にて１個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中にＣＧ、ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＣＧ及びＣＧＧで表わされる連続配列を含まず、かつ、プロモーター活性を有するＤＮＡ。
さらに、本発明は、以下の（ｍ）又は（ｎ）に示されるＤＮＡを提供する。
（ｍ）配列番号４で表わされる塩基配列中の第７〜４２２塩基からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｎ）配列番号４で表わされる塩基配列中の第７〜４２２塩基からなる塩基配列において、第４１〜４２塩基、第５９〜６０塩基、第７３〜７５塩基、第７７〜７８塩基、第８０〜８２塩基、第１０９〜１１０塩基、第１１９〜１２０塩基、第１３４〜１３５塩基、第１４５〜１４６塩基、第１８１〜１８３塩基、第１８５〜１８６塩基、第１９７〜１９８塩基、第２１７〜２１８塩基、第２３１〜２３３塩基、第２３５〜２３６塩基、第２４７〜２４８塩基、第２６７〜２６８塩基、第２８１〜２８３塩基、第２８５〜２８６塩基、第２９７〜２９８塩基、第３１７〜３１８塩基、第３３１〜３３３塩基、第３３５〜３３６塩基、第３４７〜３４８塩基、及び第３６７〜３６８塩基を除く部位にて１個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中にＣＧ、ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＣＧ及びＣＧＧで表わされる連続配列を含まず、かつ、プロモーター活性を有するＤＮＡ。
さらに、本発明は、以下の（ｏ）又は（ｐ）に示されるＤＮＡを提供する。
（ｏ）配列番号４で表わされる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｐ）配列番号４で表わされる塩基配列において、第４１〜４２塩基、第５９〜６０塩基、第７３〜７５塩基、第７７〜７８塩基、第８０〜８２塩基、第１０９〜１１０塩基、第１１９〜１２０塩基、第１３４〜１３５塩基、第１４５〜１４６塩基、第１８１〜１８３塩基、第１８５〜１８６塩基、第１９７〜１９８塩基、第２１７〜２１８塩基、第２３１〜２３３塩基、第２３５〜２３６塩基、第２４７〜２４８塩基、第２６７〜２６８塩基、第２８１〜２８３塩基、第２８５〜２８６塩基、第２９７〜２９８塩基、第３１７〜３１８塩基、第３３１〜３３３塩基、第３３５〜３３６塩基、第３４７〜３４８塩基、及び第３６７〜３６８塩基を除く部位にて１個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中にＣＧ、ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＣＧ及びＣＧＧで表わされる連続配列を含まず、かつ、プロモーター活性を有するＤＮＡ。
また、本発明は、上記のいずれかのＤＮＡを含んでなるＤＮＡ鎖を提供する。このようなＤＮＡ鎖は、構造遺伝子ＤＮＡと、該構造遺伝子が発現するような様式で該構造遺伝子ＤＮＡの５’部位に組み込まれた上記のいずれかのＤＮＡとを含んでなることが好ましい。これらのＤＮＡ鎖は、さらに翻訳エンハンサー、翻訳終止コドン、ターミネーター、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される構成要素を含んでもよい。さらにまた、本発明は、上記ＤＮＡ鎖で形質転換された宿主を提供する。該宿主は、好ましくは植物細胞である。
さらにまた、本発明は、上記ＤＮＡ鎖で形質転換された植物細胞を構造遺伝子が発現可能なように培養又は栽培することを特徴とする、植物で構造遺伝子を発現させる方法を提供する。この方法において、構造遺伝子は外来遺伝子であってもよい。さらに、本発明は、上記ＤＮＡ鎖で形質転換された宿主を用いて、該プロモーター活性を有するＤＮＡにより転写が活性化される又は発現が促進される構造遺伝子の発現産物である蛋白質を製造する方法を提供する。
さらに、本発明は、上記ＤＮＡ鎖で形質転換された植物細胞から再生により得られる形質転換植物を提供する。
さらに、本発明は、選択マーカー遺伝子ＤＮＡと、該選択マーカー遺伝子が発現するような様式で該選択マーカー遺伝子ＤＮＡの５’部位に組み込まれた上記のいずれかのＤＮＡとを含んでなるＤＮＡ鎖を提供する。さらに、本発明は、該ＤＮＡ鎖で宿主を形質転換処理し、得られた宿主を、前記選択マーカー遺伝子が発現可能であり、かつ、該選択マーカー遺伝子を発現する宿主とこれを発現しない宿主とを識別し得る条件下で培養することを特徴とする、形質転換宿主を選択する方法を提供する。該宿主は、好ましくは植物細胞である。
本明細書は、本願において主張する優先権の基礎である日本国特許出願第２０００−５９２７６号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
配列表の説明
配列番号１〜４：プロモーター配列を含む合成ＤＮＡ。
配列番号５〜２４：プライマー。
発明を実施するための最良の形態
（１）プロモーター
本発明のＤＮＡは、配列番号１〜４で表わされる塩基配列を含むＤＮＡ又はこれらのプロモーター活性を有する部分であり、これらのＤＮＡは、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターをもとにその塩基配列中の一部の塩基を改変したものである。
ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターの転写開始点より上流２５０ｂｐ中には１３個のＣＧ又はＣＮＧが存在し、これらの塩基配列は、植物体中でそれぞれＣＧメチル化酵素及びＣＮＧメチル化酵素によりメチル化を受けていることが推察される。そこで、これらの配列を、メチル化を受けないような配列に置換したのが、配列番号１で表わされる塩基配列を含むＤＮＡである。配列番号１中において、プロモーター活性を有する部分は、第７〜２７２塩基の部分である。
さらに、配列番号１で表わされる塩基配列を含むＤＮＡ（プロモーター）のメチル化フリーという特徴を生かしつつ、特に有効と思われるさらなる改変として、プロモーターのｏｃｓ領域又はａｓ−１領域と呼ばれる約２０塩基からなる領域（Ｅｌｌｉｓら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．，４（１９９３）４３３−４４３；Ｌａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６（１９８９）７８９０−７８９４）の改変が考えられる。そこで、該ｏｃｓ領域の中のＣＧ配列を残しつつ、６塩基の回文状構造（ＧＡＣＧＴＣ）を形成するように改変したものが、配列番号２で表わされる塩基配列を含むＤＮＡである。配列番号２中において、プロモーター活性を有する部分は、第７〜２７２塩基の部分である。
配列番号１及び２で表わされる塩基配列（転写開始点より上流）と、植物の遺伝子操作で通常最もよく用いられるベクターｐＢＩ１２１（クロンテック社製）に含まれる３５Ｓプロモーターの配列との比較を、それぞれ図１Ａ及び図１Ｂに示す。
また、上記ｏｃｓ領域に関する改変として、プロモーター中のｏｃｓ領域を重複させるように合成することが考えられ、これによりプロモーター活性が増強されると考えられる。そこで、上記配列番号１において、２つのｏｃｓ領域を反復させたのが、配列番号３で表わされる塩基配列を含むＤＮＡである。配列番号３中において、プロモーター活性を有する部分は、第７〜３２２塩基の部分である。さらに、上記配列番号１において、４つのｏｃｓ領域を反復させたのが、配列番号４で表わされる塩基配列を含むＤＮＡである。配列番号４中において、プロモーター活性を有する部分は、第７〜４２２塩基の部分である。
上記のような本発明のＤＮＡは、核酸合成の方法に従って化学合成することにより得ることができる。
また、本発明のＤＮＡには、上記のＤＮＡの塩基配列において１以上の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ（変異体）も含まれる。ここで、欠失、付加又は挿入されてもよい塩基の数は特に限定されないが、好ましくは１個〜数個、より好ましくは１個〜３個、最も好ましくは１個である。さらに、本発明のＤＮＡには、上記のＤＮＡの塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９４％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列を含み、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ（変異体）も含まれる。ここで、このような相同性の数値は、塩基配列比較用プログラム：ＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ ｖ３．７を用いて、デフォルト（初期設定）のパラメーターにより算出されるものである。
このように、上記変異体は、配列番号１〜４で表わされる塩基配列とは部分的に異なる塩基配列を含むが、この場合において、上述のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターからの改変部位はそのまま保存されている必要がある。すなわち、配列番号１において、第４１〜４２塩基、第５９〜６０塩基、第７３〜７５塩基、第７７〜７８塩基、第８０〜８２塩基、第１０９〜１１０塩基、第１１９〜１２０塩基、第１３４〜１３５塩基、第１４５〜１４６塩基、第１８１〜１８３塩基、第１８５〜１８６塩基、第１９７〜１９８塩基、及び第２１７〜２１８塩基では変異しない。同様に、配列番号２において、第４１〜４２塩基、第５９〜６０塩基、第７３〜７５塩基、第７７〜７８塩基、第８０〜８２塩基、第１０９〜１１０塩基、第１１９〜１２０塩基、第１３４〜１３５塩基、第１４５〜１４６塩基、第１８１〜１８３塩基、第１８３〜１８８塩基、第１９５〜２００塩基、及び第２１７〜２１８塩基では変異しない。また、配列番号３において、第４１〜４２塩基、第５９〜６０塩基、第７３〜７５塩基、第７７〜７８塩基、第８０〜８２塩基、第１０９〜１１０塩基、第１１９〜１２０塩基、第１３４〜１３５塩基、第１４５〜１４６塩基、第１８１〜１８３塩基、第１８５〜１８６塩基、第１９７〜１９８塩基、第２１７〜２１８塩基、第２３１〜２３３塩基、第２３５〜２３６塩基、第２４７〜２４８塩基、及び第２６７〜２６８塩基では変異しない。さらに、配列番号４において、第４１〜４２塩基、第５９〜６０塩基、第７３〜７５塩基、第７７〜７８塩基、第８０〜８２塩基、第１０９〜１１０塩基、第１１９〜１２０塩基、第１３４〜１３５塩基、第１４５〜１４６塩基、第１８１〜１８３塩基、第１８５〜１８６塩基、第１９７〜１９８塩基、第２１７〜２１８塩基、第２３１〜２３３塩基、第２３５〜２３６塩基、第２４７〜２４８塩基、第２６７〜２６８塩基、第２８１〜２８３塩基、第２８５〜２８６塩基、第２９７〜２９８塩基、第３１７〜３１８塩基、第３３１〜３３３塩基、第３３５〜３３６塩基、第３４７〜３４８塩基、及び第３６７〜３６８塩基では変異しない。
また、上記変異体の塩基配列は、ＣＧ、ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＣＧ及びＣＧＧで表わされる連続配列を含まないことが必要である。但し、配列番号２における第１８５〜１８６塩基及び第１９７〜１９８塩基は、例外的に、それぞれＣＧである。
このような配列番号１〜４で表わされる塩基配列を含むＤＮＡ又はその部分の変異体は、プロモーター活性を有していればよく、その活性の高さは特に限定されないが、それぞれ、配列番号１〜４で表わされる塩基配列を含むＤＮＡ又はその部分のプロモーター活性を実質的に保持することが好ましい。ここで、これらのＤＮＡ又はその部分の「プロモーター活性を実質的に保持する」とは、プロモーター活性を利用した実際の使用態様において、これらのＤＮＡ又はその部分と、同一の条件でほぼ同様の利用が可能な程度の活性が維持されていることをいう。また、ここでいうプロモーター活性は、好ましくは植物細胞における活性、より好ましくはキク植物体における活性、最も好ましくはキク栽培品種レーガン（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ ｃｖ．Ｒｅａｇａｎ又はＤｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ ｃｖ．Ｒｅａｇａｎ）における活性をいう。
このような変異体は、配列番号１〜４で表わされる塩基配列を参照すれば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）等の文献の記載に従って、当業者であれば格別の困難性なしに選択し、製造することができることは明らかである。さらに当業者であれば、上述した配列番号１〜４で表わされる塩基配列を基にして、当該塩基配列から１以上の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を人為的に行う技術（部位特異的突然変異誘発）については、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１（１９８４）５６６２−５６６６、ＷＯ８５／００８１７、Ｎａｔｕｒｅ ３１６（１９８５）６０１−６０５、Ｇｅｎｅ ３４（１９８５）３１５−３２３、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３（１９８５）４４３１−４４４２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９（１９８２）６４０９−６４１３、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４（１９８４）１４３１−１４３３等に記載の技術に従って変異体を取得し、これを利用することができる。
上記のように取得した変異体がプロモーターとしての活性を有するか否か、さらには、配列番号１〜４で表わされる塩基配列を含むＤＮＡ又はその部分のプロモーター活性を実質的に保持するか否かは、以下のようなプロモーター活性測定のための手法により確認することができる。
上記変異体のプロモーター活性は、好ましくは種々のレポーター遺伝子、例えばベータグルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃａｔ）、ベータガラクトシダーゼ（Ｇａｌ）、ノパリン合成酵素（ｎｏｓ）、オクトピン合成酵素（ｏｃｓ）等の遺伝子（”Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”、Ｄｒａｐｅｒ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．編，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，１９８８）を新規プロモーターの下流域に連結したベクターを作製し、当該ベクターを用いて従来から周知慣用されている種々の形質転換法（後述）により植物細胞のゲノムに挿入した後、当該レポーター遺伝子の発現量を測定することにより算出することができるが、この方法に何等限定されることはない。その中の一例として、レポーター遺伝子がＧｕｓの場合には、宿主細胞内でのプロモーター活性は、（ｉ）ヒストケミカルなＧｕｓ染色による方法、及び／又は（ｉｉ）蛍光基質を用いる方法（いずれの方法も、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃ２（１９９４）１−３２（Ｅｄ．）ＧｅｌｖｉｎとＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に従ってＧｕｓ活性を測定し、さらに、例えばＢｒａｄｆｏｒｄの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２（１９７６）２４８−２５４）に従ってタンパク質量を測定して、Ｇｕｓ活性をタンパク量当たりに換算する（例えば、ｐｍｏｌｅＭＵ／ｍｉｎ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎとして算出する）ことにより、それぞれ測定することができる。
本発明のＤＮＡが好ましく利用される宿主細胞は、様々な植物の細胞、例えば、イネ、ムギ、トウモロコシ、ネギ、ユリ、ラン等の単子葉植物、ダイズ、ナタネ、トマト、バレイショ、キク、バラ、カーネーション、ペチュニア、カスミソウ、シクラメン等の双子葉植物などの細胞である。特に好ましい具体例としては、染色体の倍数性が高いキク等の植物細胞などが挙げられる。その理由は、植物は相同遺伝子の不活化のために遺伝子をメチル化すると考えられており、倍数性の高い植物は、多数の相同遺伝子を持つために、強力なメチル化の機構により遺伝子の不活化を行っていると推察されるからである（ＬｅｉｔｃｈとＢｅｎｎｅｔｔ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．，２（１９９７）４７０−４７６）。また、ゲノムのＧＣ含量（ＴｈｏｍａｓとＳｈｅｒｒａｔｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，６２（１９５６）１−４）が高いためにメチル化反応の標的配列に富む等の植物細胞なども好ましい候補に挙げられる。
（２）ＤＮＡ鎖
本発明によれば、本発明のＤＮＡを含んでなるＤＮＡ鎖が提供される。このようなＤＮＡ鎖は任意の遺伝子を転写するために用いることができ、使用にあたっては、所望の遺伝子が、発現し得る形で該ＤＮＡ鎖中に組み込まれる。そのような遺伝子は、典型的には構造遺伝子である。従って、本発明はさらに、構造遺伝子ＤＮＡと、該構造遺伝子が発現するような様式で該構造遺伝子ＤＮＡの５’部位に組み込まれた本発明のＤＮＡとを含んでなるＤＮＡ鎖を提供する。
本発明によるＤＮＡ鎖の具体的形態は、例えばプラスミド又はファージＤＮＡ中の構成要素の一部として、本発明のＤＮＡが挿入された形態であってよい。
このようなＤＮＡ鎖中に構造遺伝子ＤＮＡを組み込む場合には、その構造遺伝子が発現し得るように、本発明のＤＮＡ及び該構造遺伝子ＤＮＡを配置することができる。構造遺伝子ＤＮＡとしては、β−グルカンエリシター受容体（Ｕｍｅｍｏｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４（１９９７）１０２９−１０３４）、ｐａｃｌ（Ｓａｎｏら、Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（１９９７）１２９０−１２９４）、及び２−５ＡａｓｅやＲＮａｓｅＬ（Ｏｇａｗａら、Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（１９９６）１５６６−１５６９）をコードするＤＮＡ等を挙げることができるが、何等これらに限定されることはない。
本発明のＤＮＡ鎖はさらに、翻訳エンハンサー、翻訳終止コドン、ターミネーター等の構成要素を含むことができる。翻訳エンハンサー、翻訳終止コドン及びターミネーターとしては、公知のものを適宜組み合わせて用いることができる。ウイルス起源の翻訳エンハンサーとしては、例えば、タバコモザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルスＲＮＡ４、ブロモモザイクウイルスＲＮＡ３、ポテトウイルスＸ、タバコエッチウイルスなどの配列が挙げられる（Ｇａｌｌｉｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５（１９８７）８６９３−８７１１）。また、植物起源の翻訳エンハンサーとして、ダイズのβ−１，３グルカナーゼ（Ｇｌｕ）由来の配列（石田功、三沢典彦著、講談社サイエンティフィク編、細胞工学実験操作入門、講談社、ｐ．１１９、１９９２）やタバコのフェレドキシン結合性サブユニット（ＰｓａＤｂ）由来の配列（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（１９９５）１２４６６−１２４７０）などが挙げられる。ターミネーターとしては、例えば、ｎｏｓ遺伝子のターミネーター、ｏｃｓ遺伝子のターミネーターなどが挙げられる（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４４（１９９３）９８５−９９４、”Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”前出）。また、プロモーター中の転写エンハンサーとして、３５Ｓのエンハンサー部分が同定され、それらを複数個並べて繋げることにより、活性を高めることが報告されており（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１（１９８９）１４１−１５０）、この部分をＤＮＡ鎖の一部として用いることも可能である。これらの各種構成要素は、その性質に応じて、それぞれが機能し得る形でＤＮＡ鎖中に組み込まれることが好ましい。そのような操作は、当業者であれば適切に行うことができる。
本発明のＤＮＡ（プロモーター）は、転写開始点以降にダイズのＧｌｕ遺伝子由来の翻訳エンハンサーを含んでいる（該配列番号１又は２の２７９番目以降、或いは該配列番号３の３２９番目以降、或いは該配列番号４の４２９番目以降で示される）。この配列はメチル化フリーによる転写促進には直接関与していないが、目的とする遺伝子の発現をさらに促進することができる。この翻訳エンハンサーに関しては、本発明で使用したダイズのＧｌｕ遺伝子由来のものに限らず、これまで報告されているような上記のような他の翻訳エンハンサーに置き換えても同様な効果が期待できる。さらに、本発明のように、この翻訳エンハンサーのＣＧ配列につき、他の塩基に置換することも可能である。また他の翻訳エンハンサーに関して、ＣＧ配列以外にＣＮＧ配列がある場合には、該配列についてもＣＧ配列と同様に他の塩基に置換することも可能である。当業者であれば、そのような改変は適切に行うことができる。
上記ＤＮＡ鎖は、遺伝子工学の分野で慣用されている手法を用いることにより、当業者であれば容易に製造することができる。また、本発明のＤＮＡ鎖は、人工的な構築物に限定されるものではなく、上記のような構造を有するものであれば、天然の供給源から単離されたものであってもよい。該ＤＮＡ鎖は、周知慣用されている核酸合成の方法に従って合成する事により、得ることができる。
（３）形質転換
本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡを含むＤＮＡ鎖によって宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養又は栽培することにより、構造遺伝子の発現を誘導することができ、又は該構造遺伝子を高い効率で発現させることができる。前記構造遺伝子は外来遺伝子であってもよい。
形質転換後の本発明の鎖は、プラスミド、ファージ又はゲノムＤＮＡの中に挿入された形で、微生物（特に細菌）、ファージ粒子又は植物の中に存在することができる。ここで、細菌としては、典型的には、大腸菌、アグロバクテリウム等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の好ましい実施形態では、本発明のＤＮＡ鎖は、タンパク質を発現させようとしている構造遺伝子が、植物体中で安定に発現し得るように、本発明のＤＮＡ（プロモーター）、翻訳エンハンサー、構造遺伝子ＤＮＡ、翻訳終止コドン、及びターミネーター等とが一体に結合して、これがゲノムに挿入された形態で植物中に存在する。
宿主の好ましい例としては、イネ、ムギ、トウモロコシ、ネギ、ユリ、ラン等の単子葉植物、ダイズ、ナタネ、トマト、バレイショ、キク、バラ、カーネーション、ペチュニア、カスミソウ、シクラメン等の双子葉植物などの細胞が挙げられ、特に好ましい具体例としては、染色体の倍数性が高いキク等の植物細胞などが挙げられる。また、具体的な植物材料としては、例えば、生長点、苗条原基、分裂組織、葉片、茎片、根片、塊茎片、葉柄片、プロトプラスト、カルス、葯、花粉、花粉管、花柄片、花茎片、花弁、がく片等が挙げられる。
宿主に外来遺伝子を導入する方法としては、既に報告され、確立されている種々の方法を適宜利用することができる。その好ましい例として、例えば、生物学的方法としては、ウィルス、アグロバクテリウムのＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド等をベクターとして用いる方法が挙げられ、物理学的方法としては、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコール、パーティクルガン、マイクロインジェクション（”Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”前出）、シリコンニトリドウイスカー、シリコンカーバイドウイスカー（Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ ８５（１９９５）７５−８０、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３１（１９９５）１０１−１０４、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １３２（１９９８）３１−４３）によって遺伝子を導入する方法等が挙げられる。該導入方法については、当業者であれば適宜選択し、使用することができる。
さらに、本発明のＤＮＡ鎖で形質転換された植物細胞を再生させることにより、導入された遺伝子がその細胞内で発現する形質転換植物を作製することができる。このような操作は、植物細胞から植物体への再生方法として一般的に知られている方法により、当業者であれば容易に行うことができる。植物細胞から植物体への再生については、例えば、「植物細胞培養マニュアル」（山田康之編著、講談社サイエンティフィク、１９８４）等の文献を参照されたい。
発現誘導又は高発現された遺伝子の発現産物は、それ自体を単離して利用したい場合には、培養物からその発現産物に適した方法によって単離精製することができる。さらに、発現産物の存在により宿主細胞の成長又は生育、さらにはその細胞の性質が改質される場合には、そのような宿主を培養し、若しくは該宿主が脱分化した植物体である場合には、その植物体を栽培することで、目的とする構造遺伝子の発現産物を高発現させることができる。
また、本発明により開示された高発現のプロモーターによって、例えばカナマイシン耐性（例えば、ＮＰＴＩＩ）遺伝子の選択マーカーを発現させたＤＮＡ鎖を用いることにより、植物体の形質転換効率を著しく高めることができる。これは、選択マーカー遺伝子ＤＮＡと、該選択マーカー遺伝子が発現するような様式で該選択マーカー遺伝子ＤＮＡの５’部位に組み込まれた上記のいずれかのＤＮＡとを含んでなるＤＮＡ鎖を用いることにより行うことができる。その具体的手順は特に限定されないが、例えば、該ＤＮＡ鎖で宿主を形質転換処理し、得られた宿主を、前記選択マーカー遺伝子が発現可能であり、かつ、該選択マーカー遺伝子を発現する宿主とこれを発現しない宿主とを識別し得る条件下で培養することにより行うことができる。該宿主は植物細胞以外のものであってもよく、特に限定されないが、好ましくは植物細胞である。ここで使用し得る選択マーカー遺伝子はいかなるものであってもよく、特に限定されないが、好ましくは薬剤耐性遺伝子、例えば、ＮＰＴＩＩ遺伝子（カナマイシン耐性遺伝子）、Ｈｙｇｒ遺伝子（ハイグロマイシン耐性遺伝子）等を用いることができる。この場合には、選択マーカー遺伝子を発現する宿主とこれを発現しない宿主とを識別し得る条件は、その遺伝子が耐性を有する薬剤を含有する培地を用いて培養を行うことにより達成することができる。選択マーカー遺伝子としてＮＰＴＩＩ遺伝子を使用する場合に用いる薬剤としては、カナマイシン（Ｋｍ）が挙げられるが、これに何等限定されることはなく、Ｇ４１８やパロモマイシンも適宜選択して使用することができる。また、例えばハイグロマイシン耐性（例えば、Ｈｙｇｒ）遺伝子の選択マーカーを発現させたＤＮＡ鎖を用いた場合にも同様の効果が期待できる。この場合に用いる薬剤としては、ハイグロマイシンを挙げることができる。
この場合においても、該ＤＮＡ鎖を宿主細胞に導入して形質転換された植物体を得る方法としては、上記のような任意の方法を用いることができ、該植物体の発現確認には、例えばレポーター遺伝子がＧｕｓの場合には、上記の（ｉ）ヒストケミカルなＧｕｓ染色による方法により、及び／又は（ｉｉ）蛍光基質を用いる方法（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃ２（１９９４）１−３２、前出）等によって確認することができる。
一般に、細胞の分化に伴って、メチル化による遺伝子の不活化が起こることが知られており、本発明によって開示されたプロモーターは、形質転換時のカルス等の未分化な植物細胞のみならず、植物体においても目的遺伝子を高発現させることが期待される。
産業上の利用可能性
本発明によれば、従来から植物用の高発現プロモーターとされてきたカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターによる構造遺伝子の発現が弱い植物、例えばキクにおいても、該発現効率を向上させることができる。
実施例
以下に本発明を実施例によって説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕メチル化フリープロモーターの作製
ＣａＭＶの３５ＳプロモーターのｍＲＮＡ（転写）開始点より上流２５０ｂｐ中には１３個のＣＧ若しくはＣＮＧが存在し、これらの塩基配列は植物体中で、それぞれＣＧメチル化酵素及びＣＮＧメチル化酵素によりメチル化を受けていることが推察される。そこで、これらの配列をメチル化を受けないような配列に置換したＤＮＡを全合成した（ＭＦ−４８：配列番号１）。また、転写活性に特に大きな影響を持つと思われるｏｃｓ領域については、その中のＣＧ配列を残しつつ、６塩基の回文状構造（ＧＡＣＧＴＣ）になるように改変したものを作製した（ＭＦ−１８：配列番号２）。ＭＦ−４８及びＭＦ−１８の配列（転写開始点より上流）と、植物の遺伝子操作で通常最もよく用いられるベクターｐＢＩ１２１に含まれる３５Ｓプロモーターの配列との比較を、それぞれ図１Ａ及び図１Ｂに示した。図１Ａ及び図１Ｂにおいて、下線部はメチル化の標的と言われるＣＧ及びＣＮＧ配列を表す。
上記のものとは別に、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ Ｍｉｅｓｃｈｅｒ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ（スイス国）のホーン博士より、３５Ｓプロモーターのメチル化標的部位を改変した遺伝子（プラスミド名はｐＳａｎ９：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３（１９９６）８３３４−８３３９、前出）の譲渡を受けた。この遺伝子は、ｍＲＮＡの転写開始点の上流約２５０塩基対のプロモーター部分と、その下流にＣａＭＶの３５Ｓ遺伝子の約５０塩基対の５’非翻訳配列（該プロモーター部分及び該５’非翻訳配列を併せて、以下「ＭＦ−２８」という）、さらに下流にＧｕｓの構造（レポーター）遺伝子と３５Ｓのターミネーターを含むＧｕｓ遺伝子発現カセットから構成されている。
〔実施例２〕メチル化フリープロモーターを有するベクターの作製
このようにして作製したＭＦ−４８、ＭＦ−１８及びＭＦ−２８の効果を形質転換された植物体で検証するため、発現ベクターを構築した。以下の発現ベクターはすべて、ボーダー配列に挟まれた領域内にＧｕｓ遺伝子及びＮＰＴＩＩ遺伝子の発現ユニットが、転写方向が反対になるように構成されている。これらの発現カセットを、アグロバクテリアと大腸菌で増幅可能なバイナリー型ベクター、ｐＫＴ１１を基本ベクターとして、Ｇｕｓ遺伝子及びＮＰＴＩＩ遺伝子のプロモーターを置き換えることにより、ｐＫＴ８１、ｐＫＴ８３及びｐＭＦ−２８を構築した。
上記バイナリー型ベクターｐＫＴ１１は、アグロバクテリアＡ２８１のＲＢ領域である、ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ約２５０ｂｐ、Ｇｕｓ遺伝子の発現ユニット部分である、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ約３．５ｋｂｐの部分（５’側から順に、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーター、タバコのＰｓａＤｂの翻訳エンハンサー、トウゴマのカタラーゼ遺伝子のイントロンを含むＧｕｓ遺伝子、ｎｏｓ遺伝子のターミネーターを連結）、ＮＰＴＩＩ遺伝子の発現ユニット部分である、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ約１．７ｋｂｐの部分（ｎｏｓ遺伝子のプロモーターで駆動される植物体で働くＮＰＴＩＩ遺伝子、ｎｏｓ遺伝子のターミネーター）、及びｐＢＩ１２１由来のレフトボーダー領域とアグロバクテリアと大腸菌で増幅可能な複製起点を持つ部分のＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ約５．５ｋｂｐから構成されているベクターであり、さらに、ダイズ由来のＧｌｕ遺伝子の翻訳エンハンサーを接続したプロモーターにより、Ｇｕｓ遺伝子を発現させたベクターである（図２Ｄ）。
実施例１で作製したＤＮＡ断片（プロモーター）をアガロースゲルにより精製し、プラスミドｐＫＴ１１の３５Ｓプロモーター領（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ）と置換し、プラスミドｐＫＴ８１、及びｐＫＴ８３を作製した（図２）。
ｐＫＴ８１及びｐＫＴ８３はそれぞれ、ＭＦ−４８及びＭＦ−１８の下流に、翻訳効率を高める目的で、ダイズ由来のＧｌｕ遺伝子の翻訳エンハンサーを接続し、更に下流に、レポーター遺伝子であるＧｕｓ遺伝子、ｎｏｓ遺伝子のターミネーターを繋げた発現ユニットを持つ。同時に、ｉｐｔ遺伝子のプロモーター、ダイズ由来のＧｌｕ遺伝子の翻訳エンハンサー、ＮＰＴＩＩ遺伝子、及びｎｏｓ遺伝子のターミネーターを接続した発現ユニットを含んでいる。
ｐＭＦ−２８は、ｐＳａｎ９のＧｕｓ遺伝子発現カセット全体を、ｐＫＴ１１のＧｕｓ発現カセットと交換したものである。
ＭＦ−４８とＭＦ−１８のプロモーター、及びＭＦ−２８によりＧｕｓ遺伝子をそれぞれ発現するベクターｐＫＴ８１、ｐＫＴ８３及びｐＭＦ−２８の制限酵素地図を、それぞれ図２Ａ、Ｂ及びＣに、ベースとなるｐＫＴ１１を図２Ｄに示す。
また、ｏｃｓ領域を増加させたプロモーターを作製するため、ＭＦ−４８プロモーターのｏｃｓを含む領域である、制限酵素ＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩの切断地点までの間の配列を、本プロモーターをＢａｍＨＩで切断した断片へ挿入し、この配列が同じ向きで２コピー直列に並んだプロモーター（ＭＦ−４８−２：配列番号３）、並びにこの配列が同じ向きで４コピー直列に並んだプロモーター（ＭＦ−４８−４：配列番号４）をそれぞれ作製した（図３）。
〔実施例３〕Ｇｕｓ遺伝子を発現するキクカルスの作製
ＭＦ−４８及びＭＦ−１８のプロモーターによりＧｕｓ遺伝子を発現するベクターｐＫＴ８１及びｐＫＴ８３、並びに対照としてｐＫＴ１１をエレクトロポレーション法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株に導入し、これを下記のＹＥＢ−Ｋｍ培地３ｍｌに接種し、２８℃で１６時間、暗所で培養した後、遠心により集菌し、下記の感染培地１０ｍｌに懸濁して、これを感染液とした。ＹＥＢ−Ｋｍ培地及び感染培地の培地組成は、以下の通りである。
ＹＥＢ−Ｋｍ培地；５ｇ／ｌビ−フエキス、１ｇ／ｌ酵母エキス、５ｇ／ｌペプトン、５ｇ／ｌスクロ−ス、２ｍＭ硫酸マグネシウム（ｐＨ７．２）、５０ｍｇ／ｌカナマイシン。
感染培地；１／２濃度のＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ Ｓｋｏｏｇ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，１５（１９６２）４７３−４９７）培地の無機塩及びビタミン類、１５ｇ／ｌスクロ−ス、１０ｇ／ｌグルコ−ス、１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．４）。
キクの栽培品種である、レ−ガン（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ ｃｖ．Ｒｅａｇａｎ又はＤｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ ｃｖ．Ｒｅａｇａｎ）の無菌個体の葉を５−７ｍｍ角に切断し、それぞれ各種ベクター：ｐＫＴ１１、ｐＫＴ８１及びｐＫＴ８３を導入したアグロバクテリウム感染液に１０分間浸し、過剰な感染液を濾紙上で拭き取った後、下記の共存培地に移植して２５℃の暗所で培養した。３日間培養した後、下記の選択培地に移植して３週間培養することにより、Ｋｍ耐性のカルスを得た。選択培地での培養は２５℃、１６時間照明（光密度３２μＥ／ｍ２ｓ）／８時間無照明の条件下で行った。得られたＫｍ耐性のカルスを含む葉片各４枚ずつ、計１２枚を、Ｇｕｓ遺伝子の発現確認のため、Ｇｕｓ活性測定に用いた。
共存培地；ＭＳ培地の無機塩及びビタミン類、３０ｇ／ｌスクロ−ス、１ｍｇ／ｌナフタレン酢酸、２ｍｇ／ｌベンジルアデニン、８ｇ／ｌ寒天、５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．８）、２００μＭアセトシリンゴン。
選択培地；ＭＳ培地の無機塩及びビタミン類、３０ｇ／ｌスクロ−ス、１ｍｇ／ｌナフタレン酢酸、２ｍｇ／ｌベンジルアデニン、８ｇ／ｌ寒天、５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．８）、２５ｍｇ／ｌカナマイシン、３００ｍｇ／ｌセフォタキシム。
該測定の反応溶液（１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）１ｍＭ）２００μｌ中に該葉片を移し、氷冷しながら十分に破砕した。懸濁液を遠心して上清を回収し、これを粗酵素液とした。Ｇｕｓ活性の測定は、既報（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃ２（１９９４）１−３２、前出）に基づいて行った。即ち、反応溶液１４５μｌに粗酵素液５μｌ及び基質として２．８ｍｇ／ｍｌの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド５０μｌを添加し、発生する蛍光を測定して行った。タンパク質量の測定はバイオラッド社のプロテインアッセイキットＩＩを用いて行い、タンパク質量あたりのＧｕｓ活性を求めた。下記の表１にｐＫＴ１１、ｐＫＴ８１及びｐＫＴ８３によりそれぞれ形質転換されたカルスのＧｕｓ活性を示す。ｐＫＴ８１及びｐＫＴ８３により形質転換されたカルスは、ｐＫＴ１１により形質転換されたカルスよりも約４〜５倍高いＧｕｓ活性を示したことから、メチル化フリープロモーター：ＭＦ−４８及びＭＦ−１８が高発現性であることが確認された。
〔実施例４〕 Ｇｕｓ遺伝子を発現するキク植物体の作製
植物の形質転換において、しばしばカルスのような未分化な細胞中で高発現するプロモーターが、生長した植物体においては、ごく一部の細胞でしか高発現しない現象が見受けられる。この現象の１つの原因として、植物細胞が分化する際に、不要な遺伝子の発現を抑制するため遺伝子のメチル化が促進されることが考えられる。以上の観点から、本発明によって開示されたメチル化フリープロモーターは生長した植物体においても高発現するのではないかと考え、これを検証した。
ｐＫＴ８１、ｐＫＴ８３及びｐＭＦ−２８を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株を、実施例３の方法に従って形質転換して得られたＫｍ耐性のカルスからＫｍを含むＭＳ培地（再生培地；実施例３の選択培地と同じ組成）で、植物体を再生させた。さらに、発根を促進するために、再生培地から植物生長調節物質（ナフタレン酢酸、ベンジルアデニン）を除いた発根促進培地で生長させた。
生長した植物体の中から外来遺伝子としてＮＰＴＩＩ遺伝子を含有する個体を、ＰＣＲを行うことによって検出し、該再分化植物体が形質転換体であることを確認した。ここで、ＮＰＴＩＩ遺伝子特有の配列を特異的に増幅するプライマーとして、ＴＡＡＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧＴ（配列番号５）、及びＧＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＡＡＴＣＧＧＣＴ（配列番号６）を用いた。ＰＣＲの反応条件は、９４℃で５分間の加熱後、９４℃（３０秒）−５５℃（１分）−７２℃（１分）のサイクルを３０回行い、最後に７２℃で１０分間反応させた。この反応では、酵素としてＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いた。
それら植物体の葉各３枚、各遺伝子あたり１０個体ずつについて、Ｋｍ耐性のカルスと同様に活性を測定した平均値を、図４に示す。対照として、実施例３の形質転換法に従って、ｐＢＩ１２１をキク及びタバコ（品種：キサンチ（Ｘａｎｔｈｉ））に導入する実験も実施した。また、ｐＫＴ８１（ＭＦ−４８）、ｐＫＴ８３（ＭＦ−１８）、及びｐＭＦ−２８（ＭＦ−２８）を導入したキク形質転換体の葉でのＧｕｓ遺伝子の発現量を、個体別に測定したヒストグラムを図５に示す。
結果は、ｐＫＴ８１（ＭＦ−４８）、ｐＫＴ８３（ＭＦ−１８）及びｐＭＦ−２８（ＭＦ−２８）を導入したキクでは、ｐＢＩ１２１に比べて、より高いＧｕｓ遺伝子の発現が観察された。とは言え、ｐＭＦ−２８の発現量は、高発現プロモーターの例としてよく知られているタバコでの発現量には及ばなかった。ところが、驚くべきことに、ｐＫＴ８１とｐＫＴ８３ではタバコにおけるｐＢＩ１２１（３５Ｓ）の発現量を、はるかに凌駕していた。その中でｐＫＴ８１（ＭＦ−４８）とｐＫＴ８３（ＭＦ−１８）を比較すると、ｐＫＴ８３（ＭＦ−１８）の個体の方が、Ｇｕｓ遺伝子の発現が、より高い傾向があった（図４）。また、キクでの発現量を個体別に見てみると、例えばＧｕｓ遺伝子の発現量は、３倍以上を示す個体は、ＭＦ−４８及びＭＦ−１８に限定されていた。全体的にはＭＦ−１８の方が、ＭＦ−４８に比べ、高発現個体数がより多い傾向にあった（図５）。
〔実施例５〕形質転換されたキクでの外来遺伝子のメチル化の解析
導入した遺伝子が生体内でどのようにメチル化をされているかを知るために、導入遺伝子の配列中のメチル化されているシトシンの位置を測定した。分析法は、Ｍｅｙｅｒらのシトシン・デアミネーションーＰＣＲ法（ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１３（１９９４）２０８４−２０８８）に従った。その方法の概略は、まず、実施例４で得られた形質転換キクよりＣＴＡＢ法によってＤＮＡを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、変換バッファー（３Ｍ Ｎａ−ｂｉｓｓｕｌｆａｔｅ，０．５ｍＭヒドロキノン，ｐＨ５．３）に懸濁し、窒素気相中、５０℃で２０時間反応させた。透析による脱塩後、ＤＮＡを０．３ＮのＮａＯＨでアルカリ変性した後、エタノールによってＤＮＡを沈殿させて回収した。次に、塩基配列を決定する部位を挟み込むように設定したＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ここで用いたＰＣＲプライマーを以下に示す。
＜３５Ｓ領域メチル化解析用ｐｒｉｍｅｒ＞
１回目のＰＣＲ
１回目のＰＣＲ
１回目のＰＣＲ
１回目のＰＣＲ
１回目のＰＣＲ
この反応で、酵素はＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）を用い、ＰＣＲの合成産物をｐＴ７ｂｌｕｅにクローニングして、元のＤＮＡについて、それぞれ約５クローンのＤＮＡ配列を決定した。これらの一連の変換反応によって、シトシンはウリジンに変換され、メチル化シトシンはそのままシトシンとして読まれるため、メチル基の有無が区別できる。塩基配列の差異は、ＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ ｖ３．７により解析した。
実施例４により得られたキク形質転換体を約１０個体分析した結果、Ｇｕｓ遺伝子が高発現しているキク形質転換体では、３５Ｓプロモーター中で、メチル化されたシトシンは比較的少なく、かつ約５クローン中でのメチル化されている割合も低かった。一方、Ｇｕｓ遺伝子の発現が検出できない個体では、３５Ｓプロモーター中で、ＣＧとＣＮＧを含む、ほぼ全てのシトシンが高い割合でメチル化されていた。ここで、対照実験として、同じ遺伝子を導入したタバコ（品種：キサンチ（Ｘａｎｔｈｉ））についても、Ｇｕｓ遺伝子の高発現個体を調査したところ、シトシンのメチル化は全く検出されなかった。なお、キクで３５ＳプロモーターのＤＮＡの相補鎖についてもシトシンのメチル化程度を調査したところ、メチル化シトシンが散在していたが、特定のシトシンが修飾されることはなく、またＧｕｓ遺伝子の発現との相関もなかった。一方、構造遺伝子のメチル化についても調査したが、少なくとも翻訳開始点（ＡＴＧ）から約６００塩基までにはシトシンの修飾は、発現の強弱に関わらず、ほとんど見られなかった。以上のようなシトシンのメチル化と発現量の関係は、Ｇｕｓ遺伝子ばかりでなく、２本鎖ＲＮＡ特異的ＲＮａｓｅ遺伝子（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，１２９０−１２９７、前出）を３５Ｓプロモーターの下流に繋いだ構造をキクに導入した場合にも観察された。
次に、ｐＫＴ８１を導入し、Ｇｕｓ遺伝子を高発現しているキクについても、同様にメチル化の調査を行った。その結果、形質転換体によって、全くメチル化を受けない個体と、回文状構造以外の部位のシトシンが、プロモーターからＧｕｓ遺伝子にかけて、強くメチル化を受けている個体があった。しかし、いずれの群の個体もＧｕｓ遺伝子を強く発現していた事から、回文状構造（ＣＧ及びＣＮＧ）以外のシトシン残基のメチル化については、遺伝子発現への影響は少ないと考えられた。
従って、構造遺伝子の発現を上げる方法の一つとして、導入遺伝子のプロモーター部位の、ＣＧ及びＣＮＧの回文状構造をなす塩基配列を変換することが重要と考えられた。なお、回文状構造の中でも、ｐＫＴ８３では、所謂ｏｃｓ配列と呼ばれる短い配列中のＣＧ配列（配列番号２の１８５及び１９７番目にあるシトシン塩基）については、変換しない配列になっているが、この部位の効果に関しては、実施例３（図４及び図５）の結果ではｐＫＴ８１よりも活性が高い傾向にあるので、高発現プロモーターの作製に当たっては、このｏｃｓ配列の回文状構造を変換しない方が、生体内でのより高い発現が達成できることが示された。
〔実施例６〕カーネーションの形質転換
メチル化フリープロモーターでＮＰＴＩＩ遺伝子の発現量を増加させ、マーカーでの選抜効率を向上させることを目的に、ＮＰＴＩＩの発現カセットのＮｏｓプロモーターをメチル化フリープロモーターに変更した。簡単に説明すると、カセット中のＮｏｓプロモーターとＭＦ−４８プロモーターを、ＨｉｎｄＩＩＩからＸｂａＩのＤＮＡ断片で置換し、ＭＦ−４８プロモーター・ＮＰＴＩＩ・Ｎｏｓターミネーターのカセットを作製した。これとｐＫＴ−１１中のＮＰＴＩＩ発現カセット（ＨｉｎｄＩＩＩからＫｐｎＩ）と置換することにより、Ｇｕｓの発現カセットと連結されたバイナリーベクターとして、ｐＫＴ７４を作製した。
このｐＫＴ７４、及び対照としてｐＫＴ１１をエレクトロポレーション法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株に導入し、これを下記のＹＥＢ−Ｋｍ培地３ｍｌに接種し、２８℃で１６時間、暗所で培養した後、遠心により集菌し、下記の感染培地１０ｍｌに懸濁して、これを感染液とした。ＹＥＢ−Ｋｍ培地及び感染培地の培地組成は、以下の通りである。
ＹＥＢ−Ｋｍ培地；５ｇ／ｌビ−フエキス、１ｇ／ｌ酵母エキス、５ｇ／ｌペプトン、５ｇ／ｌスクロ−ス、２ｍＭ硫酸マグネシウム（ｐＨ７．２）、５０ｍｇ／ｌカナマイシン。
感染培地；１／２濃度のＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ ＳＫｏｏｇ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，１５（１９６２）４７３−４９７）培地の無機塩及びビタミン類、１５ｇ／ｌスクロ−ス、１０ｇ／ｌグルコ−ス、１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．４）。
カーネーションの栽培品種であるスケニア（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ Ｌ）の無菌個体から葉の基部を切断し、それぞれｐＫＴ１１及びｐＫＴ７４を導入したアグロバクテリウム感染液に１０分間浸し、過剰な感染液を濾紙上で拭き取った後、下記の共存培地に移植して２５℃の暗所で培養した。３日間培養した後、下記の選択培地に移植して３週間培養することにより、Ｇ４１８耐性のカルスを得た。選択培地での培養は２５℃、１６時間照明（光密度３２μＥ／ｍ２ｓ）／８時間無照明の条件下で行った。
共存培地；ＭＳ培地の無機塩及びビタミン類、３０ｇ／ｌスクロ−ス、０．５ｍｇ／ｌインドール酪酸、０．２２ｍｇ／ｌチジアズロン、８ｇ／ｌ寒天、５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．８）、１００ｍｇ／ｌアセトシリンゴン。
選択培地；ＭＳ培地の無機塩及びビタミン類、３０ｇ／ｌスクロ−ス０．５ｍｇ／ｌインドール酪酸、０．２２ｍｇ／ｌチジアズロン、８ｇ／ｌ寒天、５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．８）、２５ｍｇ／ｌ Ｇ４１８、３００ｍｇ／ｌセフォタキシム。
〔実施例７〕 カーネーション形質転換体の選抜
ｐＫＴ１１及びｐＫＴ７４を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株を、実施例６の方法に従って形質転換して得られたＧ４１８耐性の幼植物から、Ｇ４１８を含み、植物生長調節物質（インドール酪酸、チジアズロン）を含まないＭＳ培地で、植物体を再生させた。
生長した植物体の中から外来遺伝子としてＮＰＴＩＩ遺伝子を含有する個体を、ＰＣＲを行うことによって検出し、該再分化植物体が形質転換体であることを確認した。ここで、ＮＰＴＩＩ遺伝子特有の配列を特異的に増幅するプライマーとして、ＴＡＡＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧＴ（配列番号５）、及びＧＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＡＡＴＣＧＧＣＴ（配列番号６）を用いた。ＰＣＲの反応条件は、９４℃で５分間の加熱後、９４℃（３０秒）−５５℃（１分）−７２℃（１分）のサイクルを３０回行い、最後に７２℃で１０分間反応させた。この反応では、酵素としてＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いた。
ＰＣＲによりＮＰＴＩＩ遺伝子が検出された個体を形質転換体とした。ｐＫＴ１１及びｐＫＴ７４のそれぞれについて、使用した葉片あたりの形質転換体の数として形質転換効率を算出したところ、ｐＫＴ１１では５％以下であったのに対し、ｐＫＴ７４では２５％以上の効率を示した。なお、Ｇｕｓ活性については、実施例３と同様に測定し、組換え体がすべてＧｕｓ遺伝子を発現していることを確認した。
以上の結果から、選択マーカー遺伝子を発現させる上でも、ＭＦ−４８プロモーターは極めて有効に機能するものと考えられた。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、参照によりその全体を本明細書に組み入れるものとする。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１Ａ及び図１Ｂは、本発明によるプロモーター：ＭＦ−４８のＤＮＡ配列（図１Ａ）及びＭＦ−１８のＤＮＡ配列（図１Ｂ）（上段）と、ｐＢＩ１２１に含まれる３５ＳプロモーターのＤＮＡ配列（下段）との比較を示す図である。
図２は、プラスミドｐＫＴ８１（Ａ）、ｐＫＴ８３（Ｂ）、ｐＭＦ−２８（Ｃ）及びｐＫＴ１１（Ｄ）の構造の一部を示す図である。
図３は、プラスミドｐＭＦ−４８−Ｇｕｓ、並びにその誘導体ｐＭＦ−４８−２及びｐＭＦ−４８−４の概略を示す図である。
図４は、４種類のベクターで形質転換したキクの葉における、Ｇｕｓ遺伝子の発現量の平均値（１０個体以上）を、対照としてのｐＢＩ１２１で形質転換した組換えタバコでのＧｕｓ遺伝子の発現量への相対値で表した図である。
図５は、それぞれ３種類のベクターで形質転換したキクの葉における、Ｇｕｓ遺伝子の発現量の相対値（対照はｐＢＩ１２１で形質転換した組換えタバコ）の個体別の分布を示した図である。
Claims (13)
- 以下の（ i ）又は（ ii ）に示されるＤＮＡ。
（i）配列番号１で表わされる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ii）配列番号１で表わされる塩基配列中の第７〜２７２塩基からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 - 以下の（ iii ）〜（ viii ）のいずれかに示されるＤＮＡ。
（iii）配列番号２で表わされる塩基配列を含むＤＮＡ。
（iv）配列番号２で表わされる塩基配列中の第７〜２７２塩基からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（v）配列番号３で表わされる塩基配列を含むＤＮＡ。
（vi）配列番号３で表わされる塩基配列中の第７〜３２２塩基からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（vii）配列番号４で表わされる塩基配列を含むＤＮＡ。
（viii）配列番号４で表わされる塩基配列中の第７〜４２２塩基からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 - 請求項１または２に記載のＤＮＡを含んでなるＤＮＡ鎖。
- 構造遺伝子ＤＮＡと、該構造遺伝子が発現するような様式で該構造遺伝子ＤＮＡの５’部位に組み込まれた請求項１又は２に記載のＤＮＡとを含んでなる請求項３記載のＤＮＡ鎖。
- 請求項３又は４記載のＤＮＡ鎖で形質転換された宿主。
- 宿主が植物細胞である、請求項５記載の宿主。
- 請求項５記載の宿主を前記構造遺伝子が発現可能なように培養又は栽培することを特徴とする、植物で構造遺伝子を発現させる方法。
- 構造遺伝子が外来遺伝子である請求項７記載の方法。
- 請求項５記載の宿主を用いて、該プロモーター活性を有するＤＮＡにより転写が活性化される又は発現が促進される構造遺伝子の発現産物である蛋白質を製造する方法。
- 請求項６記載の宿主から再生により得られる形質転換植物。
- 選択マーカー遺伝子ＤＮＡと、該選択マーカー遺伝子が発現するような様式で該選択マーカー遺伝子ＤＮＡの５’部位に組み込まれた請求項１又は２に記載のＤＮＡとを含んでなる請求項３記載のＤＮＡ鎖。
- 請求項１１記載のＤＮＡ鎖で宿主を形質転換処理し、得られた宿主を、前記選択マーカー遺伝子が発現可能であり、かつ、該選択マーカー遺伝子を発現する宿主とこれを発現しない宿主とを識別し得る条件下で培養することを特徴とする、形質転換宿主を選択する方法。
- 宿主が植物細胞である、請求項１２記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000059276 | 2000-03-03 | ||
| PCT/JP2001/001376 WO2001064865A1 (fr) | 2000-03-03 | 2001-02-23 | Promoteurs ameliores et utilisation de ceux-ci |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP3782013B2 true JP3782013B2 (ja) | 2006-06-07 |
Family
ID=18579755
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001564348A Expired - Fee Related JP3782013B2 (ja) | 2000-03-03 | 2001-02-23 | 改良されたプロモーターおよびその使用 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7115420B2 (ja) |
| EP (1) | EP1264886B1 (ja) |
| JP (1) | JP3782013B2 (ja) |
| KR (1) | KR20020079962A (ja) |
| CN (1) | CN100402647C (ja) |
| AT (1) | ATE478951T1 (ja) |
| CA (1) | CA2401554A1 (ja) |
| DE (1) | DE60142892D1 (ja) |
| WO (1) | WO2001064865A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006112034A1 (ja) | 2005-04-15 | 2006-10-26 | Saga University | 形質転換アイスプラントの作出方法 |
| JP5158639B2 (ja) | 2008-04-11 | 2013-03-06 | 独立行政法人農業生物資源研究所 | 植物の内胚乳に特異的に発現する遺伝子および該遺伝子のプロモーター、並びにそれらの利用 |
| JP6371949B2 (ja) * | 2014-07-14 | 2018-08-15 | 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 | 遺伝子組換え食品植物の判定方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5097025A (en) * | 1989-08-01 | 1992-03-17 | The Rockefeller University | Plant promoters |
| GB9028060D0 (en) * | 1990-12-24 | 1991-02-13 | Nickerson Int Seed | Recombinant dna |
| DE19754929A1 (de) | 1997-12-10 | 1999-06-17 | Hoechst Schering Agrevo Gmbh | Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit veränderter 5-Aminolävulinsäure-Biosynthese und Verfahren zur Identifizierung von Effektoren der 5-Aminolävulinsäure Synthese |
| WO1999041393A1 (en) * | 1998-02-17 | 1999-08-19 | Zeneca Limited | Insecticidal peptides |
| TR200403501T2 (tr) | 1999-03-31 | 2005-01-24 | Syngenta Participations Ag | Transgenik bitki ve metotları. |
-
2001
- 2001-02-23 DE DE60142892T patent/DE60142892D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-23 WO PCT/JP2001/001376 patent/WO2001064865A1/ja active Application Filing
- 2001-02-23 AT AT01906273T patent/ATE478951T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-02-23 CN CNB018090117A patent/CN100402647C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-23 KR KR1020027011192A patent/KR20020079962A/ko not_active Application Discontinuation
- 2001-02-23 CA CA002401554A patent/CA2401554A1/en not_active Abandoned
- 2001-02-23 JP JP2001564348A patent/JP3782013B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-23 US US10/220,612 patent/US7115420B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-23 EP EP01906273A patent/EP1264886B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-08-09 US US11/500,877 patent/US7385048B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN100402647C (zh) | 2008-07-16 |
| ATE478951T1 (de) | 2010-09-15 |
| CN1427890A (zh) | 2003-07-02 |
| EP1264886A4 (en) | 2006-09-06 |
| US7385048B2 (en) | 2008-06-10 |
| US20060277623A1 (en) | 2006-12-07 |
| US7115420B2 (en) | 2006-10-03 |
| CA2401554A1 (en) | 2001-09-07 |
| WO2001064865A1 (fr) | 2001-09-07 |
| KR20020079962A (ko) | 2002-10-21 |
| EP1264886B1 (en) | 2010-08-25 |
| US20030177519A1 (en) | 2003-09-18 |
| DE60142892D1 (de) | 2010-10-07 |
| EP1264886A1 (en) | 2002-12-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3052633B1 (en) | Zea mays metallothionein-like regulatory elements and uses thereof | |
| US7385048B2 (en) | Promoters and utilization thereof | |
| JP2001161373A (ja) | 新規のプロモーター配列及びその使用 | |
| AU2014329590A1 (en) | Zea mays metallothionein-like regulatory elements and uses thereof | |
| Kudo et al. | TRANSFORMATION OF CHRYSANTHEMUM (DENDRANTHEMA GRANDI-FLORUM (RAMAT.) KITAMURA) VIA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS | |
| CN112080513A (zh) | 一套编辑范围扩展的水稻人工基因组编辑系统及其应用 | |
| JP4452823B2 (ja) | カルス及び種子胚特異的発現活性を有するプロモーター | |
| US6664384B1 (en) | Duplicated cassava vein mosaic virus enhancers and uses thereof | |
| EP1117812B1 (en) | Plant promoters and plant terminators | |
| JP2004528854A (ja) | 新規構成的植物プロモーター | |
| EP1100876A1 (en) | Agrobacterium-mediated transformation of turfgrass | |
| JP4092110B2 (ja) | プロモーター活性を有するｄｎａ断片およびその利用方法 | |
| CA2359356A1 (en) | An expression silencing system and different uses thereof | |
| JP4505626B2 (ja) | 花粉特異的発現活性を有するプロモーター | |
| KR100740694B1 (ko) | 색소체 게놈 내에 삽입된 외래유전자의 이차 재조합을방지하기 위한 벡터개발 | |
| JP2008212065A (ja) | アルカロイド含量を調節する機能を有する遺伝子、およびそれを利用した形質転換タバコ属植物 | |
| CA2274871C (en) | Plant promoter | |
| JP4505627B2 (ja) | 緑色組織特異的発現活性を有するプロモーター | |
| JP5360960B2 (ja) | 組換え植物における目的遺伝子産物の高生産方法 | |
| JP4359963B2 (ja) | 植物プロモーター | |
| JP2005006599A (ja) | 植物の鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するシスエレメント | |
| JP2005168472A (ja) | 葉特異的発現活性を有するプロモーター |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20051129 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060130 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060221 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20060308 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090317 Year of fee payment: 3 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090317 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100317 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110317 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110317 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120317 Year of fee payment: 6 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |