WO2001064865A1

WO2001064865A1 - Promoteurs ameliores et utilisation de ceux-ci

Info

Publication number: WO2001064865A1
Application number: PCT/JP2001/001376
Authority: WO
Inventors: Toshio Fujii; Toshiya Ogawa; Masaharu Yoshioka; Kanji Mamiya; Toshihiro Toguri
Original assignee: Kirin Beer Kabushiki Kaisha
Priority date: 2000-03-03
Filing date: 2001-02-23
Publication date: 2001-09-07
Also published as: CN100402647C; EP1264886A4; DE60142892D1; JP3782013B2; EP1264886B1; US20030177519A1; EP1264886A1; US20060277623A1; US7115420B2; CN1427890A; US7385048B2; KR20020079962A; ATE478951T1; CA2401554A1

Description

明細書改良されたプロモーターおよびその使用技術分野

本発明は、改良プロモーター及びその使用に関し、より詳細には、形質転換生物の作出に際して、メチル化を受けにくいよう改良したプロモーター、及びその使用に関するものである。

背景技術

所望の形質転換植物を作出する上で、重要な要素のひとつとして高発現プロモータ —がある。プロモータ一配列は植物細胞内での遺伝子の転写レベルを決定する主要な因子であり、一般に、転写活性の強いプロモータ一配列を用いることにより目的とする外来遺伝子の発現レベルを上げることが可能である。また、マーカ一遺伝子の発現レベルの上昇により、形質転換植物の取得は著しく容易になるので、高発現プロモ一ターは、形質転換植物を作製するための薬剤耐性遺伝子マ一カーの発現にも重要である。

このような背景から、植物における高発現プロモーターの取得が、これまでに数多く報告されてきた。代表的な例としては、カリフラワーモザイクウィルス（CaMV) の 3 5 Sプロモータ一ゃァグロバクテリゥムのイソペンテニルトランスフェラーゼ（ip t) 遺伝子ゃノパリン合成酵素（nos) 遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。更に、形質転換宿主の対象となる植物のゲノムから高発現遺伝子のプロモータ一を取得し、それを利用する例も見受けられる（Genschikら、 Gene, 148 (1994) 195-202)。近年になリ、これらのプロモータ一を複数個組み合わせたキメラ型プロモータ一の中から、プロモータ一活性が著しく上昇したものを取得できることが示されている。一例を挙げれば、 Min Ni らは、ァグロパクテリゥム由来のォクトピン合成酵素（ocs ) 遺伝子とマンノピン（man) 合成酵素遺伝子のプロモータ一を組み合わせることによって、タバコにおいて高発現を示すプロモーターが取得できることを示している（ Plant Journal, 7 (1995) 66卜 676)。しかしながら、これらの高発現プロモーターを用いても、すべての植物において、必要なレベルの外来遺伝子の発現個体が得られるわけではない。その理由の 1つとして、各々の植物細胞に存在する R N Aポリメラーゼの違いに基づく特異性が存在することが挙げられる。また別の理由として、植物が外来遺伝子の発現を抑制する機構を持っていることが推察されている。この遺伝子の不活化、あるいは発現抑制の機構に関与する代表的な因子として、ゲノム D N Aにおけるシトシンのメチル化が考えられる（Meyerと Saedler、 Annu. Rev. Plant Physiol . Plant Mol . Biol. , 47 (1996) 2 3 - 48)。

このシトシンのメチルイ匕は、 CG及び CNG ( は任意の塩基）という塩基配列が回文状の構造をなしている 2本鎖 D N A配列において顕著に起きることが知られている

(Matzkeと Matzke、 Plant Phys iol . 107 (1995) 679-685) が、他の D NA配列中のシトシンにおいてもメチル化が起こることが知られている（Meyerら、 EMBO Journal ,

13 (1994) 2084-2088)。シトシンがメチル化を受けると、遺伝子の発現が抑制されることが多くの生物において知られており（Razin、 EMBO Journal, 17 (1998) 4905-

4908)、また、植物のゲノムでは、他の生物と比べてメチル化されているシトシンの割合が高いため、メチル化が遺伝子の不活化に密接に関連しているという報告がされてきた（Meyerと Saedler、 Annu. Rev. Plant Physiol . Plant Mol. Biol . , 47 (199

6) 23-48)。特に、遺伝子操作等によって導入された外来遺伝子の発現が抑制される現象、すなわち「ジーン 'サイレンシング」の原因については、 D NAのメチル化による不活化も関係していると推測されている。

しかしながら、これまで、プロモーターのメチル化を制御することにより遺伝子の発現を向上させたという報告はなされていなかった。僅かに、 CaMVの 3 5 Sプロモ一ターと^一ダルク口ニダ一ゼ（Gus) 遺伝子を繋いだ遺伝子構築物を、試験管内で強制的にメチル化させることによって、遺伝子の一過的な発現が低下する旨の報告が 1 例あるのみである（Hohn ら、 Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 93 (1996) 8334-8339)。但し、該報告の実験においても、生体内でどの塩基配列がメチル化を受け、その結果、発現が低下するに至ったの力は検証されていない。また、 Hohnらは、プロモータ一のみならず、構造遺伝子部分のシトシンのメチル化も Gus遺伝子の発現低下をもたらすことを観察し、構造遺伝子部分がメチル基による修飾を受けないことも高発現のためには重要であると結論付けており、脱メチル化プロモーターの利用による高発現化にはむしろ否定的ともいえる。

従って、プロモーターのメチル化を回避することにより、遺伝子発現レベルを向上させる具体的方法は不明であった。また、メチルイヒを回避し、より高発現の形質転換宿主を得るために、プロモータ一活性を損なわないようにプロモータ一部分、又はプ口モータ一部分を含む DN A鎖のどこの CG及び CNG配列を具体的にどのような他の塩基に改変すればよ、のかも不明であつた。発明の開示

本発明は、構造遺伝子の 5' 側に置いた場合、この構造遺伝子の発現を活性化するプロモータ一の提供をその目的としている。また、本発明は、前記プロモータ一を含んでなる DNA鎖の提供をその目的としている。さらに、本発明は、前記 DNA鎖で形質転換された宿主、及び該宿主を利用した構造遺伝子を高発現させる方法の提供をその目的としている。

本発明者らは、以上の観点から、プロモータ一の 2本鎖 DNA配列中の CG及び CN Gからなる DNAの回文状の配列を、プロモータ一活性を損なわないように、 CG及び CNG配列が生じない他の塩基に改変してメチル化を受けにくくすることにより、高発現プロモータ一を作製できると考えた。この考えに基づき、鋭意研究を重ねた結果、新規にデザインしたプロモータ一を翻訳ェンハンサ一、構造（レポ一タ一）遺伝子、翻訳終止コドン、ターミネータ一等の構成要素等と繋ぎ、これを用いてキク植物体を形質転換することにより、該キク植物体において外来遺伝子の発現レベルを飛躍的に向上し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、以下の（a) 又は（b) に示される DNAを提供する。

( a ) 配列番号 1で表わされる塩基配列中の第 7〜 272塩基からなる塩基配列を含む DNA。

( b ) 配列番号 1で表わされる塩基配列中の第 7〜 272塩基からなる塩基配列において、第 41〜42塩基、第 59〜60塩基、第 73〜75塩基、第 77〜78塩基、第 80〜82塩基、第 109〜 1 10塩基、第 1 19〜 120塩基、第 1 34〜 1 35塩基、第 145〜 146塩基、第 1 8 1〜； I 83塩基、第 1 85〜 1 86塩基、第 1 97〜198塩基、及び第 217〜21 8塩基を除く部位にて 1個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中に CG、 CAG、 CTG、 CCG及び CGGで表わされる連続配列を含まず、かつ、プロモータ —活性を有する DNA。

さらに、本発明は、以下の（c) 又は（d) に示される DNAを提供する。

(c) 配列番号 1で表わされる塩基配列を含む DNA。

(d) 配列番号 1で表わされる塩基配列において、第 41〜42塩基、第 59〜60 塩基、第 73〜75塩基、第 77〜78塩基、第 80〜82塩基、第 109〜 1 10 塩基、第 1 19〜 1 20塩基、第 134〜 1 35塩基、第 145〜 146塩基、第 1 81〜 183塩基、第 185〜； I 86塩基、第 197〜 198塩基、及び第 21 7〜 218塩基を除く部位にて 1個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中に CG、 CAG、 CTG、 CCG及び CGGで表わされる連続配列を含まず、かつ、プロモーター活性を有する DNA。

さらに、本発明は、以下の（e) 又は（f ) に示される DNAを提供する。

( e ) 配列番号 2で表わされる塩基配列中の第 7〜 272塩基からなる塩基配列を含む DNA。

( f ) 配列番号 2で表わされる塩基配列中の第 7〜 272塩基からなる塩基配列において、第 41〜42塩基、第 59〜60塩基、第 73〜75塩基、第 77〜78塩基、第 80〜82塩基、第 109〜 1 10塩基、第 1 19〜 120塩基、第 1 34〜 1

35塩基、第 145〜 146塩基、第 1 81〜 183塩基、第 1 83〜 188塩基、第 195〜200塩基、及び第 2 17〜21 8塩基を除く部位にて 1個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中に CG、 CAG、 CTG、 CCG及び CGGで表わされる連続配列を含まず（但し、第 1 85〜

186塩基及び第 1 97〜198塩基はそれぞれ CGである）、かつ、プロモータ一活性を有する DNA。

さらに、本発明は、以下の（g) 又は（h) に示される DNAを提供する。

(g) 配列番号 2で表わされる塩基配列を含む DNA。

(h) 配列番号 2で表わされる塩基配列において、第 41〜42塩基、第 59〜60 塩基、第 73〜75塩基、第 77〜78塩基、第 80〜82塩基、第 109〜 1 10 塩基、第 1 1 9〜： I 20塩基、第 1 34〜 1 35塩基、第 145〜 146塩基、第 1 8 1〜 1 83塩基、第 1 83〜 1 88塩基、第 1 95〜200塩基、及び第 2 1 Ί〜 2 1 8塩基を除く部位にて 1個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は揷入された塩基配列中に CG、 CAG、 CTG、 CCG及び CGGで表わされる連続配列を含まず（但し、第 1 85〜 1 86塩基及び第 1 97〜1 98塩基はそれぞれ CGである）、かつ、プロモータ一活性を有する DNA。

さらに、本発明は、以下の（i ) 又は U) に示される DNAを提供する。

( i ) 配列番号 3で表わされる塩基配列中の第？〜 322塩基からなる塩基配列を含む DNA。

( j ) 配列番号 3で表わされる塩基配列中の第 7〜 322塩基からなる塩基配列において、第 41〜42塩基、第 59〜60塩基、第 73〜75塩基、第 77〜78塩基、第 80〜82塩基、第 1 09〜 1 1 0塩基、第 1 1 9〜 1 20塩基、第 1 34〜 1 35塩基、第 145〜； I 46塩基、第 1 8 1〜 1 83塩基、第 1 85〜 1 86塩基、第 1 97〜 1 98塩基、第 2 1 7〜2 1 8塩基、第 23 1〜233塩基、第 235〜 236塩基、第 247〜248塩基、及び第 267〜 268塩基を除く部位にて 1個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は揷入された塩基配列中に CG、 CAG、 CTG、 CCG及び CGGで表わされる連続配列を含まず、かつ、プロモータ一活性を有する DNA。

さらに、本発明は、以下の（k) 又は（ 1 ) に示される DNAを提供する。

(k) 配列番号 3で表わされる塩基配列を含む DNA。

( 1 ) 配列番号 3で表わされる塩基配列において、第 41〜42塩基、第 59〜60 塩基、第 73〜75塩基、第 77〜78塩基、第 80〜82塩基、第 109〜 1 1 0 塩基、第 1 1 9〜 1 20塩基、第 1 34〜 1 35塩基、第 145〜 146塩基、第 1 8 1〜： I 83塩基、第 1 85〜1 86塩基、第 1 97〜1 98塩基、第 2 1 7〜2 1 8塩基、第 23 1〜233塩基、第 235〜236塩基、第 247〜248塩基、及び第 267〜268塩基を除く部位にて 1個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中に CG、 CAG、 CTG、 CCG及び CGGで表わされる連続配列を含まず、かつ、プロモーター活性を有する DNA。さらに、本発明は、以下の（m) 又は（n) に示される DNAを提供する。 (m) 配列番号 4で表わされる塩基配列中の第？〜 422塩基からなる塩基配列を含む DNA。

(n) 配列番号 4で表わされる塩基配列中の第？〜 422塩基からなる塩基配列において、第 41〜42塩基、第 59〜60塩基、第 73〜75塩基、第 77〜78塩基、第 80〜82塩基、第 109〜 1 10塩基、第 1 1 9〜 120塩基、第 1 34〜 1 35塩基、第 145〜 146塩基、第 1 8 1〜 183塩基、第 1 85〜 1 86塩基、第 1 97〜 198塩基、第 217〜218塩基、第 231〜233塩基、第 235〜 236塩基、第 247〜248塩基、第 267〜268塩基、第 281〜283塩基、第 285〜286塩基、第 297〜298塩基、第 317〜318塩基、第 331 〜333塩基、第335〜336塩基、第34 ?〜348塩基、及び第 367〜36 8塩基を除く部位にて 1個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中に CG、 CAG、 CTG、 CCG及び CGGで表わされる連続配列を含まず、かつ、プロモーター活性を有する DNA。

さらに、本発明は、以下の（o) 又は（p) に示される DNAを提供する。

(o) 配列番号 4で表わされる塩基配列を含む DNA。

(p) 配列番号 4で表わされる塩基配列において、第 41〜42塩基、第 59〜60 塩基、第 73〜75塩基、第 77〜78塩基、第 80〜82塩基、第 109〜 1 10 塩基、第 1 19〜 120塩基、第 134〜 1 35塩基、第 145〜 146塩基、第 1

81〜 183塩基、第 185〜 1 86塩基、第 197〜 198塩基、第 217〜21

8塩基、第 231〜233塩基、第 235〜236塩基、第 247〜248塩基、第

267〜268塩基、第 281〜283塩基、第 285〜286塩基、第 297〜2

98塩基、第 3 17〜 31 8塩基、第 331〜 333塩基、第 335〜 336塩基、第 347〜348塩基、及び第 367〜368塩基を除く部位にて 1個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中に CG、 CAG、 CTG、 CCG及び CGGで表わされる連続配列を含まず、かつ、プロモータ

—活性を有する DNA。

また、本発明は、上記のいずれかの DN Aを含んでなる DN A鎖を提供する。このような DNA鎖は、構造遺伝子 DNAと、該構造遺伝子が発現するような様式で該構造遺伝子 D N Aの 5，部位に組み込まれた上記の、ずれかの DNAとを含んでなることが好ましい。これらの DNA鎖は、さらに翻訳ェンハンサ一、翻訳終止コドン、タ —ミネ一ター、及びそれらの組み合わせからなる群よリ選択される構成要素を含んでもよい。さらにまた、本発明は、上記 DNA鎖で形質転換された宿主を提供する。該宿主は、好ましくは植物細胞である。

さらにまた、本発明は、上記 DNA鎖で形質転換された植物細胞を構造遺伝子が発現可能なように培養又は栽培することを特徴とする、植物で構造遺伝子を発現させる方法を提供する。この方法において、構造遺伝子は外来遺伝子であってもよい。さらに、本発明は、上記 DNA鎖で形質転換された宿主を用いて、該プロモーター活性を有する D N Aにより転写が活性化される又は発現が促進される構造遺伝子の発現産物である蛋白質を製造する方法を提供する。

さらに、本発明は、上記 DNA鎖で形質転換された植物細胞から再生により得られる形質転換植物を提供する。

さらに、本発明は、選択マーカー遺伝子 DNAと、該選択マーカー遺伝子が発現するような様式で該選択マ一力一遺伝子 DN Aの 5，部位に組み込まれた上記のいずれかの DNAとを含んでなる DNA鎖を提供する。さらに、本発明は、該 DNA鎖で宿主を形質転換処理し、得られた宿主を、前記選択マーカー遺伝子が発現可能であり、かつ、該選択マーカ一遺伝子を発現する宿主とこれを発現しない宿主とを識別し得る条件下で培養することを特徴とする、形質転換宿主を選択する方法を提供する。該宿主は、好ましくは植物細胞である。

本明細書は、本願において主張する優先権の基礎である日本国特許出願第 2000 -59276号の明細書及び Z又は図面に記載される内容を包含する。配列表の説明

配列番号 1〜4 ：プロモータ一配列を含む合成 DNA。

配列番号 5〜 24 ：プライマー。図面の簡単な説明

図 1A及び図 1 Bは、本発明によるプロモータ一： MF— 48の DNA配列（図 1 A) 及び MF_ 18の DNA配列（図 1 B) (上段）と、 pBI121に含まれる 35Sプロモータ一の DN A配列（下段）との比較を示す図である。

図 2は、プラスミド pKT81 (A)、 pKT83 (B)、 pMF-28 (C) 及び pKTll (D) の構造の一部を示す図である。

図 3は、プラスミド pMF-48- Gus、並びにその誘導体 pMF— 48- 2及び pMF- 48- 4の概略を示す図である。

図 4は、 4種類のベクタ一で形質転換したキクの葉における、 Gus遺伝子の発現量の平均値（1 0個体以上）を、対照としての pBI121 で形質転換した組換えタバコでの Gus遺伝子の発現量への相対値で表した図である。

図 5は、それぞれ 3種類のベクターで形質転換したキクの葉における、 Gus遺伝子の発現量の相対値（対照は PBI121 で形質転換した組換えタバコ）の個体別の分布を示した図である。発明を実施するための最良の形態

( 1) プロモーター

本発明の DNAは、配列番号 1〜4で表わされる塩基配列を含む DNA又はこれらのプロモータ一活性を有する部分であり、これらの DNAは、 CaMVの 35 Sプロモ一ターをもとにその塩基配列中の一部の塩基を改変したものである。

CaMVの 35 Sプロモータ一の転写開始点より上流 250bp中には 1 3個の CG又は CN Gが存在し、これらの塩基配列は、植物体中でそれぞれ CGメチル化酵素及び CNGメチル化酵素によリメチル化を受けていることが推察される。そこで、これらの配列を、メチル化を受けないような配列に置換したのが、配列番号 1で表わされる塩基配列を含む DNAである。配列番号 1中において、プロモーター活性を有する部分は、第 7 〜272塩基の部分である。

さらに、配列番号 1で表わされる塩基配列を含む DN A (プロモーター）のメチル化フリーという特徴を生かしつつ、特に有効と思われるさらなる改変として、プロモ一ターの ocs領域又は as- 1領域と呼ばれる約 20塩基からなる領域（Ellisら、 Pla nt J., 4 (1993) 433-443; Lam ら、 Pro Natl. Acad. Sci. USA, 86 (1989) 7890-7

894) の改変が考えられる。そこで、該 ocs領域の中の CG配列を残しつつ、 6塩基の回文状構造（GACGTC) を形成するように改変したものが、配列番号 2で表わされる塩基配列を含む D N Aである。配列番号 2中において、プロモーター活性を有する部分は、第 7〜2 7 2塩基の部分である。

配列番号 1及び 2で表わされる塩基配列（転写開始点より上流）と、植物の遺伝子操作で通常最もよく用いられるベクタ一 PBI 121 (クロンテック社製）に含まれる 3 5 Sプロモーターの配列との比較を、それぞれ図 1 A及び図 1 Bに示す。

また、上記 ocs領域に関する改変として、プロモータ一中の ocs領域を重複させるように合成することが考えられ、これによリプロモータ一活性が増強されると考えられる。そこで、上記配列番号 1において、 2つの ocs領域を反復させたのが、配列番号 3で表わされる塩基配列を含む D N Aである。配列番号 3中において、プロモータ —活性を有する部分は、第？〜 3 2 2塩基の部分である。さらに、上記配列番号 1において、 4つの ocs領域を反復させたのが、配列番号 4で表わされる塩基配列を含む D NAである。配列番号 4中において、プロモータ一活性を有する部分は、第 7〜4 2 2塩基の部分である。

上記のような本発明の D N Aは、核酸合成の方法に従つて化学合成することにより得ることができる。

また、本発明の D NAには、上記の D NAの塩基配列において 1以上の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、かつプロモータ一活性を有する D N A (変異体）も含まれる。ここで、欠失、付加又は揷入されてもよい塩基の数は特に限定されないが、好ましくは 1個〜数個、より好ましくは 1個〜 3個、最も好ましくは 1個である。さらに、本発明の D NAには、上記の D N Aの塩基配列と 8 0 %以上、好ましくは 9 0 %以上、より好ましくは 9 4 %以上、最も好ましくは 9 9 %以上の相同性を有する塩基配列を含み、かつプロモーター活性を有する D NA (変異体）も含まれる。ここで、このような相同性の数値は、塩基配列比較用プログラム： DNASIS-Mac v3. 7を用いて、デフォルト（初期設定）のパラメータ一により算出されるものである。このように、上記変異体は、配列番号 1〜4で表わされる塩基配列とは部分的に異なる塩基配列を含むが、この場合において、上述の CaMV 3 5 Sプロモータ一からの改変部位はそのまま保存されている必要がある。すなわち、配列番号 1において、第 4 1〜4 2塩基、第 5 9〜6 0塩基、第 7 3〜7 5塩基、第 7 7〜7 8塩基、第 8 0〜

8 2塩基、第 1 0 9〜 1 1 0塩基、第 1 1 9〜 1 2 0塩基、第 1 3 4〜 1 3 5塩基、第 145〜 146塩基、第 1 81〜 183塩基、第 185〜 1 86塩基、第 197〜 198塩基、及び第 217〜21 8塩基では変異しない。同様に、配列番号 2において、第 41〜42塩基、第 59〜 60塩基、第 73〜 75塩基、第 77〜78塩基、第 80〜82塩基、第 109〜 1 10塩基、第 1 19〜 120塩基、第 134〜 1 3 5塩基、第 145〜146塩基、第 181〜183塩基、第 1 83〜188塩基、第 195〜200塩基、及び第 217〜218塩基では変異しない。また、配列番号 3 において、第 41〜42塩基、第 59〜60塩基、第 73〜75塩基、第 77〜78 塩基、第 80〜82塩基、第 109〜1 10塩基、第 1 19〜120塩基、第 1 34 〜 1 35塩基、第 145〜 146塩基、第 181〜 1 83塩基、第 185〜； I 86塩基、第 197〜 198塩基、第 217〜218塩基、第 231〜233塩基、第 23 5〜236塩基、第 247〜 248塩基、及び第 267〜 268塩基では変異しない。さらに、配列番号 4において、第 41〜42塩基、第 59〜 60塩基、第 73〜7 5塩基、第 77〜78塩基、第 80〜82塩基、第 109〜 1 10塩基、第 1 1 9〜 120塩基、第 134〜1 35塩基、第 145〜146塩基、第 181〜183塩基、第 185〜 186塩基、第 197〜 198塩基、第 217〜 218塩基、第 23 1 〜233塩基、第 235〜236塩基、第 247〜248塩基、第 267〜268塩基、第 281〜 283塩基、第 285〜 286塩基、第 297〜 298塩基、第 3 1 7〜 318塩基、第 331〜 333塩基、第 335〜 336塩基、第 347〜 348 塩基、及び第 367〜368塩基では変異しない。

また、上記変異体の塩基配列は、 CG、 CAG、 CTG、 CCG及び CGGで表わされる連続配列を含まないことが必要である。但し、配列番号 2における第 185〜186塩基及び第 197〜 198塩基は、例外的に、それぞれ CGである。

このような配列番号 1〜4で表わされる塩基配列を含む DNA又はその部分の変異体は、プロモータ一活性を有していればよく、その活性の高さは特に限定されないが、それぞれ、配列番号 1〜4で表わされる塩基配列を含む DNA又はその部分のプ口モータ—活性を実質的に保持することが好ましい。ここで、これらの DNA又はその部分の「プロモータ一活性を実質的に保持する」とは、プロモーター活性を利用した実際の使用態様において、これらの DN A又はその部分と、同一の条件でほぼ同様の利用が可能な程度の活性が維持されていることをいう。また、ここでいうプロモ一タ一活性は、好ましくは植物細胞における活性、より好ましくはキク植物体における活' 14、最も好ましくはキク栽培品種レーガン（ rysanthemum mo i fo— l ium cv. Reaga n Xii Dendranthema grandif lorum cv. Reagan) (こお（ナる活' 14をヽう。

このような変異体は、配列番号 1〜4で表わされる塩基配列を参照すれば、 Molecu lar Cloning (Sambrook ら編集（1989) Cold Spring Harbor Lab. Press, New York) 等の文献の記載に従って、当業者であれば格別の困難性なしに選択し、製造することができることは明らかである。さらに当業者であれば、上述した配列番号 1〜4で表わされる塩基配列を基にして、当該塩基配列から 1以上の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を人為的に行う技術（部位特異的突然変異誘発）については、 Proc. Natl . Ac ad. Sci . USA 81 (1984)5662-5666、 W085/00817、 Nature 316(1985)601-605、 Gene 34 (1985)3 - 323、 Nucleic Acids Res. 13(1985)4431-4442、 Proc. Natl. Acad. Sci . USA 79(1982)6409-6413、 Science 224(1984) 1431-1433 等に記載の技術に従って変異体を取得し、これを利用することができる。

上記のように取得した変異体がプロモータ一としての活性を有するか否か、さらには、配列番号 1〜4で表わされる塩基配列を含む D NA又はその部分のプロモーター活性を実質的に保持するか否かは、以下のようなプロモーター活性測定のための手法により確認することができる。

上記変異体のプロモータ一活性は、好ましくは種々のレポ一ター遺伝子、例えばべ一タグルクロニダ一ゼ（Gus；)、ルシフェラーゼ（Luc)、クロラムフエニコ一ルァセチルトランスフェラーゼ（Cat)、ベータガラクトシダ一ゼ（Gal)、ノパリン合成酵素（ nos)、ォクトピン合成酵素 (ocs) 等の遺伝子 ("Plant genetic transformation and gene expression; a laboratory manual 、 Draper, J. et. al.編， Blackwel 1 Scie nti fic Publ ication, 1988) を新規プロモーターの下流域に連結したベクターを作製し、当該べクタ一を用いて従来から周知慣用されている種々の形質転換法（後述）により植物細胞のゲノムに挿入した後、当該レポーター遺伝子の発現量を測定することにより算出することができるが、この方法に何等限定されることはない。その中の一例として、レポ一ター遺伝子が Gusの場合には、宿主細胞内でのプロモーター活性は、（ i )ヒストケミカルな Gus染色による方法、及び/又は（i i)蛍光基質を用いる方法

(いずれの方法も、 Plant Molecular Biology Manual, C2 (1994) 1-32 (Ed. ) Gelvi nと Schi lperoort, Kluwer Academic Publ ishers) に従って Gus活性を測定し、さらに、例えば Bradford の方法（Anal. Biochem. 72 (1976) 248-254) に従ってタンパク質量を測定して、 Gus活性をタンパク量当たりに換算する（例えば、 pmoleMU/mi n/mg proteinとして算出する）ことにより、それぞれ測定することができる。

本発明の D N Aが好ましく利用される宿主細胞は、様々な植物の細胞、例えば、ィネ、ムギ、トウモロコシ、ネギ、ユリ、ラン等の単子葉植物、ダイス'、ナタネ、トマト、バレイショ、キク、バラ、カーネーション、ペチュニア、カスミソゥ、シクラメン等の双子葉植物などの細胞である。特に好ましい具体例としては、染色体の倍数性が高いキク等の植物細胞などが挙げられる。その理由は、植物は相同遺伝子の不活化のために遺伝子をメチル化すると考えられており、倍数性の高い植物は、多数の相同遺伝子を持っために、強力なメチル化の機構により遺伝子の不活化を行っていると推察されるからである（Lei tchと BenneU、 Trends in Plant Sci .， 2 (1997) 470-476 )。また、ゲノムの GC含量（Thomas と Sherratt, Biochem. J.， 62 (1956) 1-4) が高いためにメチル化反応の標的配列に富む等の植物細胞なども好ましい候補に挙げられる。

( 2 ) D NA鎖

本発明によれば、本発明の D N Aを含んでなる D N A鎖が提供される。このような D N A鎖は任意の遺伝子を転写するために用いることができ、使用にあたっては、所望の遺伝子が、発現し得る形で該 D NA鎖中に組み込まれる。そのような遺伝子は、典型的には構造遺伝子である。従って、本発明はさらに、構造遺伝子 D NAと、該構造遺伝子が発現するような様式で該構造遺伝子 D N Aの 5 ' 部位に組み込まれた本発明の D N Aとを含んでなる D N A鎖を提供する。

本発明による D N A鎖の具体的形態は、例えばプラスミド又はファージ D N A中の構成要素の一部として、本発明の D NAが揷入された形態であってよい。

このような D NA鎖中に構造遺伝子 D N Aを組み込む場合には、その構造遺伝子が発現し得るように、本発明の D N A及び該構造遺伝子 D N Aを配置することができる

。構造遺伝子 D NAとしては、 ^ -ダルカンエリシター受容体（Umemoto ら、 Pro

Nat l. Acad. Sci . USA 94 (1997) 1029 - 1034)、 p a c 1 (Sano ら、 Natl. Biotechn ol. 15 (1997) 1290 - 1294)、及び 2 _ 5 A a s eや R N a s e L (Ogawa ら、 Natl. Biotechnol. 14 (1996) 1566-1569) をコードする DNA等を挙げることができるが、何等これらに限定されることはない。

本発明の DN A鎖はさらに、翻訳ェンハンサ一、翻訳終止コドン、ターミネータ一等の構成要素を含むことができる。翻訳ェンハンサ一、翻訳終止コドン及びタ一ミネ —タ一としては、公知のものを適宜組み合わせて用いることができる。ウィルス起源の翻訳ェンハンサ一としては、例えば、タバコモザイクウィルス、アルフアルファモザイクウィルス RNA4、ブロモモザイクウィルス RNA3、ポテトウィルス X、タバコエッチウィルスなどの配列が挙げられる（Gallie ら、 NIK:. Acids Res., 15 (19 87) 8693-8711)。また、植物起源の翻訳ェンハンサ一として、ダイズの β— 1， 3グルカナーゼ（Glu) 由来の配列（石田功、三沢典彦著、講談社サイェンティフイク編、細胞工学実験操作入門、講談社、 P.119、 1992) やタバコのフェレドキシン結合性サブユニット（PsaDb) 由来の配列（Yamamoto ら、 J. Biol. Chem. , 270 (1995) 1246 6-12470) などが挙げられる。ターミネータ一としては、例えば、 nos遺伝子のタ一ミネ一タ一、 ocs 遺伝子のタ一ミネ一ターなどが挙げられる（Annu. Rev. Plant Physio 1. Plant Mol. Biol., 44 (1993) 985 - 994、 "Plant genetic transformation and ge ne expression; a laboratory manual"前出)。また、プロモータ一中の車云写ェンノヽンサ一として、 35S のェンハンサ一部分が同定され、それらを複数個並べて繋げることにより、活性を高めることが報告されており（Plant Cell, 1 (1989) 14卜 150)、この部分を DNA鎖の一部として用いることも可能である。これらの各種構成要素は、その性質に応じて、それぞれが機能し得る形で DNA鎖中に組み込まれることが好ましい。そのような操作は、当業者であれば適切に行うことができる。

本発明の DNA (プロモータ一）は、転写開始点以降にダイズの Glu遺伝子由来の翻訳ェンハンサ一を含んでいる（該配列番号 1又は 2の 2 7 9番目以降、或いは該配列番号 3の 3 2 9番目以降、或いは該配列番号 4の 4 2 9番目以降で示される）。この配列はメチル化フリーによる転写促進には直接関与していないが、目的とする遺伝子の発現をさらに促進することができる。この翻訳ェンハンサーに関しては、本発明で使用したダイズの G 1 u遺伝子由来のものに限らず、これまで報告されているような上記のような他の翻訳ェンハンサ一に置き換えても同様な効果が期待できる。さらに

、本発明のように、この翻訳ェンハンサ一の CG配列につき、他の塩基に置換することも可能である。また他の翻訳ェンハンサ一に関して、 CG配列以外に CNG配列がある場合には、該配列についても CG配列と同様に他の塩基に置換することも可能である。当業者であれば、そのような改変は適切に行うことができる。

上記 D N A鎖は、遺伝子工学の分野で慣用されている手法を用いることにより、当業者であれば容易に製造することができる。また、本発明の D NA鎖は、人工的な構築物に限定されるものではなく、上記のような構造を有するものであれば、天然の供給源から単離されたものであってもよい。該 D NA鎖は、周知慣用されている核酸合成の方法に従って合成する事により、得ることができる。

( 3 ) 形質転換

本発明のプロモータ一活性を有する D N Aを含む D N A鎖によって宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養又は栽培することにより、構造遺伝子の発現を誘導することができ、又は該構造遺伝子を高い効率で発現させることができる。前記構造遺伝子は外来遺伝子であつてもよい。

形質転換後の本発明の鎖は、プラスミド、ファージ又はゲノム D NAの中に挿入された形で、微生物（特に細菌)、ファージ粒子又は植物の中に存在することができる。ここで、細菌としては、典型的には、大腸菌、ァグロパクテリゥム等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明の好ましい実施形態では、本発明の D N A鎖は、タンパク質を発現させようとしている構造遺伝子が、植物体中で安定に発現し得るように、本発明の D NA (プ口モータ—）、翻訳ェンハンサ—、構造遺伝子 D N A、翻訳終止コドン、及びターミネーター等とがー体に結合して、これがゲノムに揷入された形態で植物中に存在する

宿主の好ましい例としては、イネ、ムギ、トウモロコシ、ネギ、ユリ、ラン等の単子葉植物、ダイズ、ナタネ、トマト、バレイショ、キク、バラ、カーネーション、ぺチュニァ、カスミソゥ、シクラメン等の双子葉植物などの細胞が挙げられ、特に好ましい具体例としては、染色体の倍数性が高いキク等の植物細胞などが挙げられる。また、具体的な植物材料としては、例えば、生長点、苗条原基、分裂組織、葉片、茎片、根片、塊茎片、葉柄片、プロトプラスト、カルス、葯、花粉、花粉管、花柄片、花茎片、花弁、がく片等が挙げられる。宿主に外来遺伝子を導入する方法としては、既に報告され、確立されている種々の方法を適宜利用することができる。その好ましい例として、例えば、生物学的方法としては、ウィルス、ァグロパクテリゥムの T iプラスミド、 R iプラスミド等をべクタ一として用いる方法が挙げられ、物理学的方法としては、エレクト口ポレーシヨン、ポリエチレングリコール、パーティクルガン、マイクロインジェクション（"Plant genetic transformation and gene expression; a laboratory manual 目 'j出)、シリコンニトリドウイスカー、シリコンカーバイドゥイスカー（Euphytica 85( 1995)75-8 0、 In Vi tro Cel l . Dev. Biol. 31 (1995) 10卜 104、 Plant Science 132(1998)31-43 ) によって遺伝子を導入する方法等が挙げられる。該導入方法については、当業者であれば適宜選択し、使用することができる。

さらに、本発明の D NA鎖で形質転換された植物細胞を再生させることにより、導入された遺伝子がその細胞内で発現する形質転換植物を作製することができる。このような操作は、植物細胞から植物体への再生方法として一般的に知られている方法により、当業者であれば容易に行うことができる。植物細胞から植物体への再生については、例えば、「植物細胞培養マニュアル」（山田康之編著、講談社サイェンティフィク、 1984) 等の文献を参照されたい。

発現誘導又は高発現された遺伝子の発現産物は、それ自体を単離して利用したい場合には、培養物からその発現産物に適した方法によつて単離精製することができる。さらに、発現産物の存在により宿主細胞の成長又は生育、さらにはその細胞の性質が改質される場合には、そのような宿主を培養し、若しくは該宿主が脱分化した植物体である場合には、その植物体を栽培することで、目的とする構造遺伝子の発現産物を高発現させることができる。

また、本発明にょリ開示された高発現のプロモーターによって、例えばカナマイシン耐性（例えば、 NPTI I ) 遺伝子の選択マ一力一を発現させた D N A鎖を用いることにより、植物体の形質転換効率を著しく高めることができる。これは、選択マーカー遺伝子 D N Aと、該選択マ一カー遺伝子が発現するような様式で該選択マーカ一遺伝子 D N Aの 5，部位に組み込まれた上記のいずれかの D NAとを含んでなる D N A鎖を用いることにより行うことができる。その具体的手順は特に限定されないが、例えば、該 D N A鎖で宿主を形質転換処理し、得られた宿主を、前記選択マーカ一遺伝子が発現可能であり、かつ、該選択マ一力一遺伝子を発現する宿主とこれを発現しない宿主とを識別し得る条件下で培養することにより行うことができる。該宿主は植物細胞以外のものであってもよく、特に限定されないが、好ましくは植物細胞である。ここで使用し得る選択マ一力一遺伝子はいかなるものであってもよく、特に限定されないが、好ましくは薬剤耐性遺伝子、例えば、 NPTI I 遺伝子（カナマイシン耐性遺伝子 )、 Hygr遺伝子（ハイグロマイシン耐性遺伝子）等を用いることができる。この場合には、選択マーカー遺伝子を発現する宿主とこれを発現しない宿主とを識別し得る条件は、その遺伝子が耐性を有する薬剤を含有する培地を用いて培養を行うことにより達成することができる。選択マ一カー遺伝子として NPTI I遺伝子を使用する場合に用いる薬剤としては、カナマイシン（Km) が挙げられる力これに何等限定されることはなく、 G418やパロモマイシンも適宜選択して使用することができる。また、例えばハイダロマイシン耐性（例えば、 Hygr) 遺伝子の選択マーカーを発現させた D NA鎖を用いた場合にも同様の効果が期待できる。この場合に用いる薬剤としては、ハイグロマイシンを挙げることができる。

この場合においても、該 D NA鎖を宿主細胞に導入して形質転換された植物体を得る方法としては、上記のような任意の方法を用いることができ、該植物体の発現確認には、例えばレポ一タ一遺伝子が Gusの場合には、上記の（ i )ヒストケミカルな Gus 染色による方法により、及び又は（i i )蛍光基質を用いる方法（Plant Molecular Bi o logy Manual , C2 (1994) 1-32、前出）等によって確認することができる。

一般に、細胞の分化に伴って、メチル化による遺伝子の不活化が起こることが知られており、本発明によって開示されたプロモータ一は、形質転換時のカルス等の未分化な植物細胞のみならず、植物体においても目的遺伝子を高発現させることが期待される。産業上の利用可能性

本発明によれば、従来から植物用の高発現プロモータ一とされてきたカリフラワーモザイクウィルスの 3 5 Sプロモータ一による構造遺伝子の発現が弱い植物、例えばキクにおいても、該発現効率を向上させることができる。実施例

以下に本発明を実施例によって説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

〔実施例メチル化フリープロモータ一の作製

CaMVの 35 Sプロモーターの mRNA (転写）開始点より上流 250bp中には 1 3個の CG若しくは CNGが存在し、これらの塩基配列は植物体中で、それぞれ CGメチルイ匕酵素及び CNG メチル化酵素によリメチル化を受けていることが推察される。そこで、これらの配列をメチル化を受けないような配列に置換した DN Aを全合成した（MF -48 ：配列番号 1)。また、転写活性に特に大きな影響を持つと思われる ocs領域については、その中の CG配列を残しつつ、 6塩基の回文状構造（GACGTC) になるように改変したものを作製した（MF— 1 8 ：配列番号 2)。 MF— 48及び MF— 1 8の配列（転写開始点より上流）と、植物の遺伝子操作で通常最もよく用いられるべクタ一 ρΒΠ21に含まれる 35 Sプロモーターの配列との比較を、それぞれ図 1 A及び図 1 Bに示した。図 1 A及び図 1 Bにおいて、下線部はメチル化の標的と言われる C G及び CNG配列を表す。

上記のものとは別に、 Friedrich Miescher-Institut (スイス国）のホーン博士よリ、 35 Sプロモーターのメチル化標的部位を改変した遺伝子（プラスミド名は pSa n9： Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (1996) 8334-8339、前出）の譲渡を受けた。この遺伝子は、 mRNAの転写開始点の上流約 250塩基対のプロモーター部分と、その下流に CaMVの 35 S遺伝子の約 50塩基対の 5' 非翻訳配列（該プロモーター部分及び該 5' 非翻訳配列を併せて、以下「MF— 28」という）、さらに下流に Gu sの構造（レポ一ター）遺伝子と 35 Sのターミネータ一を含む Gus遺伝子発現カセットから構成されている。

〔実施例 2〕メチル化フリープロモータ一を有するベクタ一の作製

このようにして作製した MF— 48、 MF- 18及び MF— 28の効果を形質転換された植物体で検証するため、発現べクタ一を構築した。以下の発現べクタ一はすべて、ボーダー配列に挟まれた領域内に Gus遺伝子及び ΝΡΤΠ遺伝子の発現ュニットが

、転写方向が反対になるように構成されている。これらの発現カセットを、ァグロバクテリアと大腸菌で増幅可能なバイナリ一型べクタ一、 pKTllを基本べクタ一として、 Gus遺伝子及び NPTII遺伝子のプロモーターを置き換えることにより、 pKT81、 ρΚΤ83 及び pMF-28を構築した。

上記バイナリ一型ベクター pKTllは、ァグロバクテリア A 281の RB領域である、 Xhol- EcoRI約 250 b p、 Gus遺伝子の発現ュニット部分である、 Hindi 11- EcoRI約 3. 5 kb pの部分（5，側から順に、 CaMVの 35 Sプロモータ一、タバコの PsaDb の翻訳ェンハンサ一、トウゴマの力タラ一ゼ遺伝子のイントロンを含む Gus遺伝子、 nos遺伝子のターミネ一ターを連結)、 ΝΡΤΠ遺伝子の発現ユニット部分である、 Hind III-Kpnl約 1. 7 k b pの部分（nos遺伝子のプロモーターで駆動される植物体で働く NPTII遺伝子、 nos遺伝子のターミネ一ター）、及び pBI121由来のレフトボーダー領域とァグロバクテリアと大腸菌で増幅可能な複製起点を持つ部分の Kpnl- Xhol約 5 . 5 k b pから構成されているベクターであり、さらに、ダイズ由来の Glu遺伝子の翻訳ェンハンサ一を接続したプロモータ一により、 Gus遺伝子を発現させたベクターである（図 2D)。

実施例 1で作製した DNA断片（プロモーター）をァガロースゲルにより精製し、プラスミド pKTllの 35 Sプロモーター領域（Hindlll- Xbal) と置換し、プラスミド PKT81、及び ρΚΤ83を作製した（図 2 )。

PKT81及び ρΚΤ83はそれぞれ、 MF— 48及び MF— 18の下流に、翻訳効率を高める目的で、ダイズ由来の Glu遺伝子の翻訳ェンハンサ一を接続し、更に下流に、レポーター遺伝子である Gus遺伝子、 nos遺伝子のタ一ミネ一ターを繋げた発現ュニットを持つ。同時に、 ipt遺伝子のプロモーター、ダイズ由来の Glu遺伝子の翻訳ェンハンサー、 NPTII遺伝子、及び nos遺伝子のターミネータ一を接続した発現ユニットを含んでいる。

pMF-28は、 pSan9の Gus遺伝子発現カセット全体を、 pKTllの Gus発現カセットと交換したものである。

MF-48と MF— 18のプロモータ一、及び MF— 28により Gus遺伝子をそれぞれ発現するベクター pKT81、 ρΚΤ83及び pMF- 28の制限酵素地図を、それぞれ図 2 A、 B及び Cに、ベースとなる pKTllを図 2 Dに示す。

また、 ocs領域を増加させたプロモーターを作製するため、 MF— 48プロモータ

—の ocsを含む領域である、制限酵素 BamHI と Bglllの切断地点までの間の配列を、本プロモータ一を BamHIで切断した断片へ揷入し、この配列が同じ向きで 2コピー直列に並んだプロモータ一（M F— 4 8— 2 ：配列番号 3 ) 、並びにこの配列が同じ向きで 4コピ一直列に並んだプロモータ一（M F— 4 8— 4 ：配列番号 4 ) をそれぞれ作製した（図 3 )。

〔実施例 3〕 Gus遺伝子を発現するキクカルスの作製

M F - 4 8及び M F— 1 8のプロモータ一により Gus遺伝子を発現するべクタ一 pK T81及び ρΚΤ83、並びに対照として pKTl l をエレクトロポレーシヨン法により、ァグロバクテリゥム ·ッメファシエンス L B A 4 4 0 4株に導入し、これを下記の YEB-K m培地 3 ml に接種し、 28°Cで 16時間、暗所で培養した後、遠心によリ集菌し、下記の感染培地 10ml に懸濁して、これを感染液とした。 YEB-Km培地及び感染培地の培地組成は、以下の通りである。

YEB- Km培地； 5g/ lビーフエキス、 lg/1酵母エキス、 5g ペプトン、 5g/ lスクロ一ス、 2mM硫酸マグネシウム（pH7.2)、 50mg/lカナマイシン。

感染培地； 1/2濃度の MS (Murashige & Skoog, Physiol. Plant. , 15 (1962) 473- 497)培地の無機塩及びビタミン類、 15g/lスクロ—ス、 lOg/1ダルコ—ス、 ΙΟπιΜ MES( pH5.4)₀

キクの栽培品種である、レ—ガン (Chrysanthemum mori fol ium cv. Reagan又は De ndranthema grandif lorum cv. Reagan) の無菌個体の葉を 5- 7腿角に切断し、それぞれ各種べクタ一： ρΚΤ11、 ρΚΤ81及び ρΚΤ83を導入したァグロパクテリゥム感染液に 1 0分間浸し、過剰な感染液を濾紙上で拭き取った後、下記の共存培地に移植して 25°C の暗所で培養した。 3 日間培養した後、下記の選択培地に移植して 3週間培養することにょリ、 Km耐性のカルスを得た。選択培地での培養は 25°C、 16時間照明（光密度 3 2A6 E/m² s ) / 8時間無照明の条件下で行った。得られた Km耐性のカルスを含む葉片各 4枚ずつ、計 1 2枚を、 Gus遺伝子の発現確認のため、 Gus活性測定に用いた。

共存培地； MS培地の無機塩及びビタミン類、 30g スクロース、 lmg ナフタレン酢酸、 2mg ベンジルアデニン、 8g 寒天、 5mM MES(pH5.8)、 200μ Μァセトシリンゴン。

選択培地； MS培地の無機塩及びビタミン類、 30g/ 1スクロース、 lmg/ 1ナフタレン酢酸、 2mg べンジルアデニン、 8g/ l寒天、 5raM MES(pH5.8)、 25mg カナマイシン、 300mg/lセフォタキシム。

該測定の反応溶液（lOOmM リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0)、 ImM EDTA、 0.1% Tri ton X- 100、ジチオスレィトール（DTT) ImM) 200 l中に該葉片を移し、氷冷しながら十分に破砕した。懸濁液を遠心して上清を回収し、これを粗酵素液とした。 Gu s 活性の測定は、既報 (Plant Molecular Biology Manual, C2 (1994) ト 32、前出）に基づいて行った。即ち、反応溶液 145 zl に粗酵素液 5μ1及び基質として 2.8mg/m 1の 4-メチルゥンベリフェリル- /9-D-ダルクロニド 50μ 1を添加し、発生する蛍光を測定して行った。タンパク質量の測定はバイオラッド社のプロテインアツセィキット IIを用いて行い、タンパク質量あたりの Gus活性を求めた。下記の表 1に ρΚΠ1、 ρΚ T81及び ρΚΤ83によりそれぞれ形質転換されたカルスの Gus活性を示す。 pKT81及び ρ ΚΤ83によリ形質転換された力ルスは、 ρΚΤ 11 により形質転換されたカルスよりも約 4 〜5倍高い Gus活性を示したことから、メチル化フリープロモーター： MF— 48及び M F— 1 8が高発現性であることが確認された。表 1

各種プロモータ一によるキクカルス中での

β一ダルクロニダーゼ遺伝子の発現

MF-48— 2及び MF— 48— 4についても、 pBI121の 3 5 Sプロモーターと置き換えたベクタ一を作製し、上記同様、キク葉片を材料にした形質転換を行い、 Km耐性のカルスを得た。それらのカルスを用いて、 Plant Molecular Biology Manual, C2 (1994) 1-32 (前出）に記載の方法に従って、 Gus 活性による組織染色を行ったところ、 pBI121では、発色が観察されなかったのに比べ、 MF— 48— 2及び MF— 48 一 4では、著しく強い青色の発色が観察された。即ち、定性的な発現強度は、 PBI121 では—であったのに比べ、 MF— 48— 2と MF— 48— 4では、 +から + +であつた。

〔実施例 4〕 Gus遺伝子を発現するキク植物体の作製

植物の形質転換において、しばしばカルスのような未分化な細胞中で高発現するプ口モータ一が、生長した植物体においては、ごく一部の細胞でしか高発現しない現象が見受けられる。この現象の 1つの原因として、植物細胞が分化する際に、不要な遺伝子の発現を抑制するため遺伝子のメチル化が促進されることが考えられる。以上の観点から、本発明によって開示されたメチル化フリープロモータ一は生長した植物体においても高発現するのではないかと考え、これを検証した。

pKT81、 ρΚΤ83及び pMF-28を含むァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス LBA4 404株を、実施例 3の方法に従って形質転換して得られた Km耐性のカルスから Km を含む MS培地（再生培地；実施例 3の選択培地と同じ組成）で、植物体を再生させた。さらに、発根を促進するために、再生培地から植物生長調節物質（ナフタレン酢酸、ベンジルアデニン）を除いた発根促進培地で生長させた。

生長した植物体の中から外来遺伝子として NPT 11遺伝子を含有する個体を、 P C R を行うことによって検出し、該再分化植物体が形質転換体であることを確認した。ここで、 NPTII 遺伝子特有の配列を特異的に増幅するプライマ一として、 TAAAGCACGAGG AAGCGGT (配列番号 5)、及び GCACAACAGACAATCGGCT (配列番号 6 ) を用いた。 PCR の反応条件は、 94°Cで 5分間の加熱後、 94°C (30秒） — 55°C ( 1分） —72 °C (1分）のサイクルを 30回行い、最後に 72 °Cで 1 0分間反応させた。この反応では、酵素として ExTaqポリメラ一ゼ（宝酒造社製）を用いた。

それら植物体の葉各 3枚、各遺伝子あたり 10個体ずつについて、 Km耐性のカルスと同様に活性を測定した平均値を、図 4に示す。対照として、実施例 3の形質転換法に従って、 ΡΒΠ21 をキク及びタバコ（品種：キサンチ（Xanthi)) に導入する実験も実施した。また、 PKT81 (MF— 48)、 pKT83 (MF— 1 8)、及び pMF-28 (MF -28) を導入したキク形質転換体の葉での Gus遺伝子の発現量を、個体別に測定したヒストグラムを図 5に示す。

結果は、 pKT81 (MF- 48)、 pKT83 (MF- 1 8) 及び pMF- 28 (MF- 28) を導入したキクでは、 pBI121に比べて、より高い Gus遺伝子の発現が観察された。とは言え、 pMF-28の発現量は、高発現プロモーターの例としてよく知られているタバコでの発現量には及ばなかった。ところが、驚くべきことに、 pKT81 と pKT83ではタバコにおける PBI121 (3 5 S) の発現量を、はるかに凌駕していた。その中で pKT81 (MF — 48) と pKT83 (MF- 1 8) を比較すると、 pKT83 (MF— 1 8) の個体の方が、 Gus遺伝子の発現が、より高い傾向があった（図 4)。また、キクでの発現量を個体別に見てみると、例えば Gus遺伝子の発現量は、 3倍以上を示す個体は、. MF— 48及び MF— 1 8に限定されていた。全体的には MF— 1 8の方が、 MF— 48に比べ、高発現個体数がより多い傾向にあった（図 5)。

〔実施例 5〕形質転換されたキクでの外来遺伝子のメチル化の解析

導入した遺伝子が生体内でどのようにメチル化をされているかを知るために、導入遺伝子の配列中のメチル化されているシトシンの位置を測定した。分析法は、 Meyer らのシトシン 'デァミネ一シヨン一 PCR法（EMBO Journal, 13 (1994) 2084-2088 ) に従った。その方法の概略は、まず、実施例 4で得られた形質転換キクより CTAB 法によって DNAを抽出し、制限酵素 EcoRIで切断後、変換バッファ一（3M Na-biss ulfate, 0.5mMヒドロキノン， pH5.3) に懸濁し、窒素気相中、 50°Cで 20時間反応させた。透析による脱塩後、 DNAを 0.3Nの NaOHでアルカリ変性した後、エタノールによって DNAを沈殿させて回収した。次に、塩基配列を決定する部位を挟み込むように設定した DNAプライマーを用いて PC R反応を行った。ここで用いた PC R プライマーを以下に示す。

<35S領域メチル化解析用 primer〉

1回目の PCR

35S-8： GAATGTTAATTTATAGATGGTTAGAGAGGTTTATGTAGTAGG (配列番号 7 )

35S-8： CCATATTCTCTCCAAATAAAATAAAC (配列番号 8 )

2回目の PCR

35S-9： AGTAATAATTTTAGGAAATTAAATATTTTTTTAAGAAGG (配列番号 9 )

35S-14： TATTCTCTCCAAATAAAATAAACTTC (配列番号 1 0 )

<35S相補鎖のメチル化解析用 primer〉

1回目の PCR 35S-C-1： CTATTCCAATATAAACAATTCAAAACTTAC (配列番号 1 1 )

35S-C-4： TGAAATGAATTTTTTTATATAGAGGAAGGGTTTTGTG (配列番号 1 2 )

2回目の PCR

35S-C-2： CAACATAATAAAACACAACACACTTATCTAC (配列番号 1 3 )

35S-C-3： ATGAATTTTTTTATATAGAGGAAGGGTTTTGTGAAG (配列番号 1 4 )

1回目の PCR

35S-16： GAAGAAATTTTTGTTAATATGGTGGAGTATGATATG (配列番号 1 5 )

TO- 100： CCAATCAACAAACACATAATTACAATCTTACACAACATACATC (配列番号 1 6 )

2回目の PCR

35S-17： GGGATGATGTATAATTTTATTATTTTTTGTAAGA (配列番号 1 7 )

T0-101： CATAACATCAACTTCAAATAACATATAACCACCCTAATAC (配列番号 1 8 )

1回目の PCR

35S-16： GAAGAAATTTTTGTTAATATGGTGGAGTATGATATG (配列番号 1 5 )

pacl-7： CTTCAATAACAAATTCATTTTAACAATCATACC (配列番号 1 9 )

2回目の PCR

35S-17： GGGATGATGTATAATTTTATTATTTTTTGTAAGA (配列番号 1 7 )

pacl-8： ACAAATTCATTTTAACAATCATACCTTAACT (配列番号 2 0 )

<MF メチル化解析用 primer〉

1回目の PCR

TO- 103： GAGGATTTAAAAGGAAGGTGGTTTTTATAAATGTTATTATTG (配列番号 2 1 )

TO- 105： CCACAATTTTCACAATCCAAACTAAATACCCACAAACC (配列番号 2 2 ) ： GUS gene 5，領域

2回目の PCR

TO- 104： GGATTTAAAAGGAAGGTGGTTTTTATAAATGTTATTATTGTG (配列番号 2 3 ) TO- 106： CAATTTTCACAATCCAAACTAAATACCCACAAACCATC (配列番号 2 4 ) ： GUS gene 5，領域

上記 P C Rの反応条件はすべて、 1回目は 94°Cで 5分間の加熱後、 94°C ( 3 0秒） -65°C ( 1分） — 72°C ( 1分）のサイクルを 30回行い、最後に 72°Cで 10分間反応させた。 2回目は、 1回目の P C R産物からの 1 1 を用いて、 94°Cで 5分間の加熱の後、 94°C ( 3 0秒）一 60°C ( 1分） _ 72°C ( 1分）のサイクルを 3 0回行い、最後に 72°Cで 1 0分間反応させた。

この反応で、酵素は ExTaqポリメラーゼ（宝酒造社製）を用い、 P C Rの合成産物を pT7blueにクローニングして、元の D N Aについて、それぞれ約 5クローンの D N A配列を決定した。これらの一連の変換反応によって、シトシンはゥリジンに変換され、メチル化シトシンはそのままシトシンとして読まれるため、メチル基の有無が区別できる。塩基配列の差異は、 DNASIS- Mac v 3. 7により解析した。

実施例 4により得られたキク形質転換体を約 1 0個体分析した結果、 Gus 遺伝子が高発現しているキク形質転換体では、 3 5 Sプロモータ一中で、メチル化されたシトシンは比較的少なく、かつ約 5クローン中でのメチル化されている割合も低かつた。一方、 Gus遺伝子の発現が検出できない個体では、 3 5 Sプロモーター中で、 CGと C NGを含む、ほぼ全てのシトシンが高い割合でメチル化されていた。ここで、対照実験として、同じ遺伝子を導入したタバコ（品種：キサンチ（Xanthi ) ) についても、 Gus 遺伝子の高発現個体を調査したところ、シトシンのメチル化は全く検出されなかった。なお、キクで 3 5 Sプロモーターの D N Aの相補鎖についてもシトシンのメチル化程度を調査したところ、メチル化シトシンが散在していたが、特定のシトシンが修飾されることはなく、また Gus遺伝子の発現との相関もなかった。一方、構造遺伝子のメチル化についても調査したが、少なくとも翻訳開始点（ATG) から約 6 0 0塩基までにはシトシンの修飾は、発現の強弱に関わらず、ほとんど見られなかった。以上のようなシトシンのメチル化と発現量の関係は、 Gus遺伝子ばかりでなく、 2本鎖 R N A特異的 R N a s e遺伝子（Nature Biotechno logy, 15， 1290-1297、前出）を 3 5 Sプロモーターの下流に繋いだ構造をキクに導入した場合にも観察された。

次に、 ρΚΤ81 を導入し、 Gus遺伝子を高発現しているキクについても、同様にメチル化の調査を行った。その結果、形質転換体によって、全くメチル化を受けない個体と、回文状構造以外の部位のシトシンが、プロモーターから Gus遺伝子にかけて、強くメチルイヒを受けている個体があった。しかし、いずれの群の個体も Gus遺伝子を強く発現していた事から、回文状構造（CG及び CNG) 以外のシトシン残基のメチル化につレ、ては、遺伝子発現への影響は少ないと考えられた。

従って、構造遺伝子の発現を上げる方法の一つとして、導入遺伝子のプロモータ一部位の、 CG及び CNGの回文状構造をなす塩基配列を変換することが重要と考えられた。なお、回文状構造の中でも、 PKT83では、所謂 ocs配列と呼ばれる短い配列中の CG 配列（配列番号 2の 1 8 5及び1 9 7番目にあるシトシン塩基）については、変換しない配列になっているが、この部位の効果に関しては、実施例 3 (図 4及び図 5 ) の結果では PKT81よりも活性が高い傾向にあるので、高発現プロモーターの作製に当たつては、この ocs配列の回文状構造を変換しない方が、生体内でのより高い発現が達成できることが示された。

〔実施例 6〕カーネーションの形質転換

メチル化フリープロモータ一で NPTI I遺伝子の発現量を増加させ、マ一カーでの選抜効率を向上させることを目的に、 NPTI Iの発現カセットの Nosプロモータ一をメチル化フリープロモータ一に変更した。簡単に説明すると、カセット中の Nosプロモーターと M F— 4 8プロモーターを、 Hindl l lから Xbalの D NA断片で置換し、 M F— 4 8プロモータ一 · ΝΡΤΠ · Nosターミネータ一のカセットを作製した。これと pKT-1 1中の NPTI I発現カセット（Hindl l lから Kpnl) と置換することにより、 Gusの発現カセットと連結されたバイナリ一ベクタ一として、 PKT74を作製した。

この pKT74、及び対照として pKTll をエレクト口ポレーシヨン法により、ァグロバクテリゥム ·ッメファシエンス L B A 4 4 0 4株に導入し、これを下記の YEB- Km培地 3 ml に接種し、 28°Cで 16時間、暗所で培養した後、遠心によリ集菌し、下記の感染培地 10ml に懸濁して、これを感染液とした。 YEB- Km培地及び感染培地の培地組成は、以下の通リである。

YEB-Km培地； 5g/lビーフエキス、 lg/1酵母エキス、 5g ペプトン、 5g スクロ一ス、 2mM硫酸マグネシウム（pH7.2)、 50mg カナマイシン。

感染培地； 1/2濃度の MS (Murashige & Skoog, Physiol. Plant. , 15 (1962) 473-

497)培地の無機塩及びビタミン類、 15g/lスクロース、 lOg/ 1グルコース、 10mM MES( pH5.4)₀

力一ネーシヨンの栽培品種であるスケニア (Dianthus caryophyllus L) の無菌個体から葉の基部を切断し、それぞれ pKTll及び pKT74を導入したァグロパクテリゥム感染液に 10分間浸し、過剰な感染液を濾紙上で拭き取った後、下記の共存培地に移植して 25°Cの暗所で培養した。 3日間培養した後、下記の選択培地に移植して 3週間培養することにより、 G418耐性のカルスを得た。選択培地での培養は 25°C、 16時間照明（光密度

S ) / 8時間無照明の条件下で行った。

共存培地； MS培地の無機塩及びビタミン類、 30g/lスクロース、 0.5mg/lィンド一ル酪酸、 0.22mg チジァズロン、 8g 寒天、 5mM MES(pH5.8)、 lOOmg/1ァセトシリンゴン。

選択培地； MS培地の無機塩及びビタミン類、 30g/lスクロース、 0.5mg/lインド一ル酪酸、 0.22mg チジァズロン、 8g/l寒天、 5mM MES(pH5.8)、 25mg/l G418、 300mg/ 1セフォタキシム。

〔実施例 7〕カーネーション形質転換体の選抜

pKTll及び pKT74を含むァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス L ΒΑ4404株を、実施例 6の方法に従って形質転換して得られた G418耐性の幼植物から、 G418を含み、植物生長調節物質（インド一ル酪酸、チジァズロン）を含まない MS培地で、植物体を再生させた。

生長した植物体の中から外来遺伝子として NPT 11遺伝子を含有する個体を、 P C R を行うことによって検出し、該再分化植物体が形質転換体であることを確認した。ここで、 NPTII 遺伝子特有の配列を特異的に増幅するプライマ一として、 TAAAGCACGAGG AAGCGGT (配列番号 5)、及び GCACAACAGACAATCGGCT (配列番号 6 ) を用いた。 PCR の反応条件は、 94 °Cで 5分間の加熱後、 94°C (30秒） — 55°C ( 1分） — 7 2 °C ( 1分）のサイクルを 30回行い、最後に 7 2 °Cで 1 0分間反応させた。この反応では、酵素として ExTaqポリメラ一ゼ（ま酒造社製）を用いた。

PCRにより NPTII遺伝子が検出された個体を形質転換体とした。 pKTll及び pKT7

4のそれぞれについて、使用した葉片あたりの形質転換体の数として形質転換効率を算出したところ、 pKTll では 5%以下であつたのに対し、 pKT74では 25%以上の効率を示した。なお、 Gus 活性については、実施例 3と同様に測定し、組換え体がすべて Gus遺伝子を発現していることを確認した。

以上の結果から、選択マーカー遺伝子を発現させる上でも、 M F— 4 8プロモータ一は極めて有効に機能するものと考えられた。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、参照によりその全体を本明細書に組み入れるものとする。

Claims

請求の範囲

1. 以下の（a) 又は（b) に示される DNA。

(a) 配列番号 1で表わされる塩基配列中の第 7〜 272塩基からなる塩基配列を含む DNA。

(b) 配列番号 1で表わされる塩基配列中の第 7〜 272塩基からなる塩基配列において、第 41〜42塩基、第 59〜60塩基、第 73〜75塩基、第 77〜78 塩基、第 80〜82塩基、第 109〜1 10塩基、第 1 1 9〜120塩基、第 1 34〜 135塩基、第 145〜 146塩基、第 181〜 183塩基、第 185〜 1 86塩基、第 197〜 198塩基、及び第 217〜218塩基を除く部位にて 1個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中に CG、 CAG、 CTG、 CCG及び CGGで表わされる連続配列を含まず、かつ、プロモータ一活性を有する DNA。

2. 以下の（c) 又は（d) に示される DNA。

(c) 配列番号 1で表わされる塩基配列を含む DNA。

(d) 配列番号 1で表わされる塩基配列において、第 41〜42塩基、第 59〜60 塩基、第 73〜75塩基、第 77〜78塩基、第 80〜82塩基、第 109〜 1 10塩基、第 1 19〜 120塩基、第 134〜 1 35塩基、第 145〜 146塩基、第 181〜 183塩基、第 185〜 1 86塩基、第 1 97〜 198塩基、及び第 217〜218塩基を除く部位にて 1個〜数個の塩基が欠失、付加又は揷入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中に CG、 CAG、 CT G、 CCG及び CGGで表わされる連続配列を含まず、かつ、プロモーター活性を有する DNA。

3. 以下の（e) 又は（f ) に示される DNA。

(f ) 配列番号 2で表わされる塩基配列中の第 7〜 272塩基からなる塩基配列において、第 41〜42塩基、第 59〜60塩基、第 73〜75塩基、第 77〜78 塩基、第 80〜82塩基、第 109〜1 10塩基、第 1 19〜120塩基、第 1 34〜 135塩基、第 145〜 146塩基、第 181〜 183塩基、第 183〜 188塩基、第 195〜200塩基、及び第 217〜218塩基を除く部位にて 1個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は揷入された塩基配列中に CG、 CAG、 CTG、 CCG及び CGGで表わされる連続配列を含まず（但し、第 1 85〜1 86塩基及び第 1 97〜 198塩基はそれぞれ CG である）、かつ、プロモータ一活性を有する DNA。

4. 以下の（g) 又は（h) に示される DNA。

(g) 配列番号 2で表わされる塩基配列を含む DNA。

(h) 配列番号 2で表わされる塩基配列において、第 41〜42塩基、第 59〜60 塩基、第 73〜75塩基、第 77〜78塩基、第 80〜82塩基、第 109〜1 10塩基、第 1 19〜 120塩基、第 1 34〜 135塩基、第 145〜； I 46塩基、第 18 1〜 183塩基、第 183〜 188塩基、第 1 95〜200塩基、及び第 217〜218塩基を除く部位にて 1個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中に CG、 CAG、 CT G、 CCG及び CGGで表わされる連続配列を含まず（但し、第 185〜186塩基及び第 197〜198塩基はそれぞれ CGである）、かつ、プロモータ一活性を有する DNA。

5. 以下の（ i ) 又は（j ) に示される DNA。

( i ) 配列番号 3で表わされる塩基配列中の第 7〜 322塩基からなる塩基配列を含む DNA。

( j ) 配列番号 3で表わされる塩基配列中の第 7〜 322塩基からなる塩基配列において、第 41〜42塩基、第 59〜60塩基、第 73〜75塩基、第 77〜78 塩基、第 80〜82塩基、第 109〜1 10塩基、第 1 1 9〜120塩基、第 1

34〜 135塩基、第 145〜 146塩基、第 181〜 1 83塩基、第 185〜

186塩基、第 197〜； I 98塩基、第 217〜218塩基、第 231〜233 塩基、第235〜236塩基、第 247〜248塩基、及び第 267〜268塩基を除く部位にて 1個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み

、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中に CG、 CAG、 CTG、 CCG及び CGGで表わされる連続配列を含まず、かつ、プロモーター活性を有する DNA。

6. 以下の（k) 又は（ 1 ) に示される DNA。

( i ) 配列番号 3で表わされる塩基配列を含む DNA。

( 1 ) 配列番号 3で表わされる塩基配列において、第 41〜42塩基、第 59〜60 塩基、第 73〜75塩基、第 77〜78塩基、第 80〜82塩基、第 109〜1 10塩基、第 1 19〜 120塩基、第 1 34〜 135塩基、第 145〜 146塩基、第 181〜 183塩基、第 1 85〜 186塩基、第 1 97〜 198塩基、第 217〜218塩基、第 23 1〜233塩基、第 235〜236塩基、第 247 〜248塩基、及び第 267〜268塩基を除く部位にて 1個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中に CG、 CAG、 CTG、 CCG及び CGGで表わされる連続配列を含まず、かつ、プロモ —ター活性を有する DNA。

7. 以下の（m) 又は（n) に示される DNA。

(m) 配列番号 4で表わされる塩基配列中の第 7〜422塩基からなる塩基配列を含む DNA。

( n ) 配列番号 4で表わされる塩基配列中の第 7〜 422塩基からなる塩基配列において、第 41〜42塩基、第 59〜60塩基、第 73〜75塩基、第 77〜78 塩基、第 80〜82塩基、第 109〜1 10塩基、第 1 1 9〜120塩基、第 1

34〜 135塩基、第 145〜 146塩基、第 181〜 183塩基、第 185〜 186塩基、第 197〜 1 98塩基、第 217〜218塩基、第 231〜233 塩基、第 235〜 236塩基、第 247〜 248塩基、第 267〜 268塩基、第 281〜283塩基、第 285〜286塩基、第 297〜298塩基、第 31 7〜318塩基、第 331〜333塩基、第 335〜336塩基、第 347〜3

48塩基、及び第 367〜368塩基を除く部位にて 1個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中に CG、 CAG、 CTG、 CCG及び CGGで表わされる連続配列を含まず、かつ、プロモータ一活性を有する DNA。

8. 以下の（o) 又は（p) に示される DNA。

( 0) 配列番号 4で表わされる塩基配列を含む DNA。

(p) 配列番号 4で表わされる塩基配列において、第 41〜42塩基、第 59〜60 塩基、第 73〜75塩基、第 77〜78塩基、第 80〜82塩基、第 109〜1 10塩基、第 1 1 9〜 120塩基、第 134〜 135塩基、第 145〜 146塩基、第 181〜 183塩基、第 185〜 186塩基、第 197〜 198塩基、第 217〜218塩基、第 23 1〜233塩基、第 235〜236塩基、第 247 〜 248塩基、第 267〜 268塩基、第 281〜 283塩基、第 285〜 28 6塩基、第 297〜298塩基、第 3 17〜318塩基、第 331〜 333塩基、第335〜336塩基、第 347〜348塩基、及び第 367〜 368塩基を除く部位にて 1個〜数個の塩基が欠失、付加又は挿入された塩基配列を含み、該欠失、付加又は挿入された塩基配列中に CG、 CAG、 CTG、 CCG及び CGGで表わされる連続配列を含まず、かつ、プロモータ一活性を有する DNA。

9. 請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載の DNAを含んでなる DNA鎖。

10. 構造遺伝子 DNAと、該構造遺伝子が発現するような様式で該構造遺伝子 DN Aの 5' 部位に組み込まれた請求項 1 ~ 8のいずれか 1項に記載の DN Aとを含んでなる請求項 9記載の DN A鎖。

1 1. 請求項 9又は 10記載の DNA鎖で形質転換された宿主。

1 2. 宿主が植物細胞である、請求項 1 1記載の宿主。

1 3. 請求項 1 1記載の宿主を前記構造遺伝子が発現可能なように培養又は栽培することを特徴とする、植物で構造遺伝子を発現させる方法。

14. 構造遺伝子が外来遺伝子である請求項 13記載の方法。

1 5. 請求項 1 1記載の宿主を用いて、該プロモーター活性を有する DNAにより転写が活性化される又は発現が促進される構造遺伝子の発現産物である蛋白質を製造する方法。

16. 請求項 12記載の宿主から再生により得られる形質転換植物。

17. 選択マ一カー遺伝子 DNAと、該選択マ一カー遺伝子が発現するような様式で該選択マ一カー遺伝子 D N Aの 5，部位に組み込まれた請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載の DN Aとを含んでなる請求項 9記載の DN A鎖。

18. 請求項 17記載の DN A鎖で宿主を形質転換処理し、得られた宿主を、前記選択マーカ一遺伝子が発現可能であり、かつ、該選択マ一力一遺伝子を発現する宿主とこれを発現しない宿主とを識別し得る条件下で培養することを特徴とする、形質転換宿主を選択する方法。

. 宿主が植物細胞である、請求項 1 8記載の方法。