KR101330031B1 - 합성 재조합효소 유전자 및 이를 이용한 선발표지 유전자 제거용 식물형질전환 벡터 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 새로운 합성 재조합효소 유전자 및 이를 이용한 선발표지 유전자 제거용 식물형질전환 벡터에 관한 것이다. 본 발명에 따른 선발표지 제거용 식물형질전환 벡터 pCMF는 미생물에서 벡터의 안정성이 증가한 반면 식물체에서의 활성은 유지되며, 목표 유전자의 도입과 벡터의 변형이 용이하여 폭넓은 작물 및 다양한 유전자를 이용한 선발표지 제거(marker-free) GM작물 개발에 이용될 수 있을 것이다.

Description

합성 재조합효소 유전자 및 이를 이용한 선발표지 유전자 제거용 식물형질전환 벡터{Modified site-specific recombinase and plant transformation vector for eliminating selective marker gene}
본 발명은 새로운 재조합효소 유전자 및 이러한 재조합효소 유전자를 포함하는 선발표지 유전자 제거용 식물 형질전환 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 벡터를 이용하는 식물의 형질전환 방법 및 상기 방법에 따라 제조된 식물 및 이의 종자에 관한 것이다.
부위-특이적 재조합(site-specific recombination)은 원핵생물과 하등 진핵생물의 삽입, 카피 숫자 유지 등과 관련된 기작에서 관찰되는 일반적 현상이다. 부위 특이적 재조합효소는 특이적 DNA 염기서열을 인식하여 두 개의 인식부위가 존재할 때 DNA의 재조합을 촉매하며, 일부 재조합효소는 다른 효소의 도움이 없어도 인식부위의 방향성(정방향 또는 역방향)에 따라 DNA를 절단시키거나 역위(invert)시키는 기능을 가지고 있어 넓은 활용성을 가진다.
부위 특이적 재조합효소 시스템을 사용하여 무선발표지 식물체를 만드는 기본방법은 목표유전자와 함께 사용된 선발표지를 제거하기 위하여 교배나 재형질전환의 과정이 필요하다. 또한 Cre 재조합 효소의 일시적 발현과 음성 선발표지를 같이 사용하는 방법은 선발표지 제거 효율이 낮고 식물 종에 따른 음성 선발표지의 저항성차이로 폭넓은 식물체에 적용하기 어렵다. 이러한 문제를 극복하기 위한 대체 방안으로 자가-절단 방법이 개발되었다. 자가-절단 방법은 재조합효소 유전자를 선발표지와 함께 T-DNA 내의 두 재조합효소 인식부위 사이에 위치시켜 식물체내로 도입하는 방법이다.
자가-절단 방법의 개발초기에는 식물체에서 재조합효소를 발현시킬 목적으로 꽃양배추모자이크 바이러스 유래의 CaMV 35S 프로모터(Califlower mosaic virus 35S promoter)가 많이 사용되었다. 그러나 재조합효소가 항시발현 프로모터에 의해 같은 양으로 계속 발현되면 식물체에서 완전히 선발표지 유전자가 제거되지 않아 선발표지 유전자가 남아있는 세포와 혼재되는 키메릭(chimeric) 현상이 발생할 수 있으며(Coppoolse et al., Plant Mol Biol 51:263-279, 2003), 미생물에서 벡터를 조작하는 클로닝단계 및 벡터의 유지/보관 단계에서 원하지 않는 재조합효소의 생산으로 심각한 재조합 현상이 발생되게 된다. 따라서 이를 해결하고자 유도성 프로모터나 조직 특이적 프로모터를 사용하여 형질전환 단계나 식물의 특정분화 세포 단계에서 재조합효소의 발현이 일어나 선발표지가 제거되도록 하는 연구가 수행되었다. Heat shock promoter에 의한 Cre 재조합효소의 발현을 이용한 선발표지 제거연구는 담배를 이용해 성공적으로 수행되었다. 그러나 유도성 프로모터의 사용에도 불구하고 E. coli나 A. tumefaciens에서의 재조합에 의한 불안정성은 여전히 심각하게 발견되었다(Wang et al ., Transgenic Res 14:605-614, 2005).
최근에 개발된 스트레스 유도성 FLP 발현 시스템은 형질전환 과정에 발생하는 스트레스나 화합물(hydrogen peroxide) 처리에 의해 선택적으로 선발표지를 제거할 수 있어 선발표지 제거 과정이 간편하고 영양번식식물에도 사용할 수 있다(한국공개특허공보 공개번호 제10-2010-0011173호). 스트레스 유도성 FLP 발현 시스템이 성공적으로 작물에 적용되었지만 목표유전자의 도입을 위한 제한효소 자리가 부족하여 다양한 목표유전자의 적용은 쉽지 않다. 또한 보다 넓은 작물에 적용하기 위해서는 다양한 선발표지 유전자의 교환도 가능해야 한다.
부위-특이적 재조합 시스템을 식물체에 적용하여 선발표지를 제거방법은 매우 효율적이나 미생물(예를 들어, E. coli)에서의 벡터의 불안정성(instability)은 개선되어야 할 사항이며, 식물형질전환 벡터는 목적유전자의 도입이 용이해야 한다. 또한 유전자의 종류에 따라 프로모터의 종류가 달라지며 작물 종에 따라 선발표지(selective marker) 사용으로 인한 형질전환 효율이 크게 달라질 수 있다. 본 발명은 이러한 문제 해결을 위해 미생물에서 안정하고, 목적유전자의 도입이 용이하며, 프로모터와 선발표지의 교환이 가능한 선발표지 제거용 식물 형질전환 벡터를 개발하고자 하였다.
본 발명은 스트레스 유도성 FLP 발현 시스템의 단점을 보완하기 위한 방안으로 재조합효소 유전자를 변형시킨 mFLP를 이용하여 미생물에서의 자가절단 벡터의 안정성을 증진하고, 목표유전자의 도입 용이 및 T-DNA내 각 부분의 교환이 가능한 자가절단 벡터를 제조하여 다양한 목표유전자 및 작물에 활용 가능하도록 하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 먼저 본 발명에서는 대장균 등의 미생물 내에서의 벡터 안정성을 개선할 수 있는, 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 부위-특이 재조합효소 유전자(mFLP)를 제공한다. 본 발명에서는 미생물에서의 발현을 낮추고 식물에서의 발현이 높이도록 효모 유래의 FLP 부위-특이적 재조합효소 유전자의 염기서열을 식물의 codon usage에 따라 변형하였다.
본 발명의 상기 부위-특이 재조합효소 유전자인 mFLP에는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열과 상동성이 매우 높은 염기 서열을 갖는 서열번호 1의 서열 변이체가 포함된다. 구체적으로 상기 서열 변이체는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열이 포함될 수 있다.
본 발명에서의 용어, "상동성"이란 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 염기 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 서열번호 1의 재조합효소 유전자 mFLP를 포함하는 식물의 형질전환용 벡터를 제공한다.
본 발명에서의 용어, "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서의 용어, "발현 벡터"는 목적한 암호화 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다. 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다. 적합한 재조합 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 재조합 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선발표지를 포함하고, 복제 가능한 재조합 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseo세포주) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacteriumtumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 공지되어 있다.
보다 바람직하게, 본 발명의 벡터는 스트레스 유도성 프로모터 및 상기 재조합효소인 mFLP의 인식 부위를 포함하며, 스트레스에 의해 mFLP의 발현이 유도되어 자가절단을 수행함으로써 선발표지를 제거할 수 있는 것을 특징으로 하는 식물의 형질전환용 벡터이다.
바람직하게, 본 발명의 식물 형질전환용 벡터는 또한 새로운 합성 재조합효소 유전자인 mFLP의 발현을 위해 고구마 엽록체의 스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 바람직하게, 본 발명의 벡터는 목표 유전자 (형질전환용 유용 유전자)의 삽입이 용이하도록 멀티-클로닝 부위(MCS)를 포함하며, 이러한 MCS 영역은 HindIII, PstI, SalI, BamHI, KpnI, XmaI ( SmaI ), EcoRI 등의 제한효소 부위를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게, 본 발명의 식물 형질전환용 벡터는 프로모터와 선발표지의 교환이 용이하도록 해당 서열의 경계에 제한효소 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 유전자의 종류에 따라 유용한 프로모터의 종류가 달라지며, 작물 종에 따라 선발표지의 종류로 인한 형질전환 효율이 크게 달라질 수 있으므로 프로모터 및 선발표지의 교환이 용이한 벡터는 매우 유용하다.
본 발명에서의 용어, "프로모터"는 정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, 작동 가능하게 연결된다(operably linked)는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy, 7:24-30, 2000), CaMV 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell, 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol.Biol. 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제 5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다.
상기 선발표지(selective marker, 또는 선택 마커)는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 염기 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포와 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 예컨대, 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
종합하면, 바람직하게, 본 발명은 도 3의 모식도로 표현되는 pCMF라고 명명된 선발표지 유전자 제거용 식물 형질전환 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명자들은 상기 식물 형질전환벡터의 바람직한 일 예를 경기 수원시 권선구 서둔동 88-16번지에 소재한 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2011년 11월 7일자 수탁번호 KACC95113P로 기탁하였다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 식물의 형질전환용 벡터를 이용하여 식물을 형질전환시키고, 선발표지 유전자를 제거하는 것을 특징으로 하는 식물의 형질전환 방법을 제공한다.
본 발명에서 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method)를 이용할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 선발표지를 제거할 수 있는 형질전환 방법은 (1) 식물체의 잎을 절단하고; (2) 본 발명에 따른 아그로박테리움 속 미생물을 감염시키고; (3) 과산화수소 (hydrogen peroxide) 등의 스트레스 부여 물질이 첨가된 선발배지를 사용하여 재분화를 유도하고; (4) 뿌리를 유도하여 순화하고; 및 (5) 유전자의 형질전환을 분석하는 과정으로 이루어진다.
또한 형질전환에 사용될 수 있는 미생물로는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)가 가능하나 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게, 본 발명에 따른 벡터로 형질전환되어 식물 운반체로 사용되는 미생물은 아그로박테리움 속 (Agrobacterium sp.) 미생물이며, 더욱 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 (Agrobacterium tumefaciens LBA4404)이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 벡터를 이용하여 형질전환된, 선발표지를 제거할 수 있는 형질전환 식물체를 제공하며, 이러한 형질전환 식물체는 식물 또는 식물세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다. 또한, 상기 식물체는 자가 수정 및 타가 수정할 수 있는 식물체를 모두 포함한다.
선발표지 제거용 식물형질전환 벡터 pCMF는 미생물에서 안정하여, 목표 유전자의 도입과 벡터의 변형이 용이하여 폭넓은 작물 및 다양한 유전자를 이용한 선발표지 제거(marker-free) GM작물 개발에 이용될 수 있을 것이다.
도 1. 마커프리 형질전환 식물체 생산용 선발표지 제거 벡터(pHWMF)의 T-DNA
RB: 오른쪽 경계 (right border); 35S: 칼리플라워 모자익 바이러스 프로모터 (Cauliflower mosaic virus promoter); hpt: 하이그로마이신 저항성 유전자; Ppod: 고구마 엽록체의 퍼옥시다제 프로모터; FLP: 위치 특이적 재조합효소 유전자; bar: 제초제 저항성 유전자; MCS: 멀티-클로닝 부위; LB: 왼쪽 경계 (left border).
도 2. FLP 유전자(FLP)와 변형 FLP 유전자(mFLP)의 서열 비교(N-말단 부위)
도 3. 선발표지 제거용 pHWMF 벡터의 T-DNA 모식도 및 제작과정
RB: 오른쪽 경계 (right border); 35S: 칼리플라워 모자익 바이러스 프로모터 (Cauliflower mosaic virus promoter); hpt: 하이그로마이신 저항성 유전자; Ppod: 고구마 엽록체의 퍼옥시다제 프로모터; mFLP: 본 발명에 따른 변형된 서열을 갖는 위치 특이적 재조합효소 유전자; MCS: 멀티-클로닝 부위; LB: 왼쪽 경계 (left border).
도 4. mFLP 사용에 의한 대장균 세포내 선발마커제거 벡터의 안정성 분석
도 5. Callus에서의 재조합에 의한 자가절단 확인을 위한 PCR 결과
이하 본 발명의 이해를 돕기 위해 하기 실시예를 제시한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되는 것은 아니다.
참고로 하기 실시예에서 구체적으로 설명되지 않은 실험 방법은 한국공개특허공보 공개번호 제10-2010-0011173호에 언급된 실험 방법과 동일 또는 유사하게 실시하였다.
<실시예 1> 자가절단 벡터 pHWMF의 제조
스트레스 유도성 자가절단형 식물형질전환 벡터(pHPFB) 시스템은 식물체내에서 화합물(H2O2)또는 캘러스 상태에서 자연발생적 산화 스트레스에 의해 선발마커를 제거할 수 있어 매우 효율적이나 유용 가능한 제한효소자리의 부족으로 유전자 및 프로모터 부위의 치환이 어렵다. 이러한 단점을 해결하기 위한 자가 절단형 식물형질전환 벡터를 제작하였다.
자가 절단형 벡터의 설계는 pHPFB 내의 유전자 및 프로모터 부위에 존재하는 제한효소 자리를 없애고, 유용유전자의 삽입이 용이하도록 Multi-Cloning Site(MCS)를 만들었으며 프로모터와 선발마커 유전자들의 치환 가능하도록 하였고, FLP 유전자의 제한효소 변형은 식물의 유전자 사용빈도에 맞춰 단백질 합성에 영향을 주지 않도록 하였고, 프로모터 등에 사용된 유전자변형은 변형을 최소화 하도록 하였다(도 1).
T-DNA 부분의 유전자 합성은 Bio Basic Inc.(캐나다)에 의뢰하여 제조하였고 염기서열 분석으로 정확하게 유전자의 염기서열이 변경된 것을 확인 한 후 high copy 벡터인 pCAMBIA binary 벡터의 backbone 유전자와 제한효소 SacI 과 HindIII 부위를 이용하여 접합하여 pHWMF를 제조하였다.
<실시예 2> FLP 재조합 유전자의 변형
대장균(E. coli) 내에서 선발표지 제거벡터의 불안정화 개선을 위해 FLP (Flippase recombination enzyme) 재조합 유전자의 염기서열 변형을 실시하였다. 유전자의 변형은 전체 1.2kb FLP 염기서열을 식물 사용빈도가 높은 코돈의 염기서열로 변형되도록(표 1) Bio Basic Inc.(캐나다)에 의뢰하여 수행하였으며 염기서열 분석으로 정확하게 유전자의 염기서열이 변경된 것을 확인하였다. 하기 표 1에 유전자변형을 위해 사용된 codon usage (Bold: 유전자변형을 위해 사용된 식물고빈도 codon, * : E. coli의 고빈도 codon)를 나타내었다.
Amino Acid Codon Amino Acid Codon Amino Acid Codon
Ala GCA Ser AGC* His CAC
GCC AGU CAU*
GCG* UCA Gln CAA
GCU UCC CAG*
Cys UGC* UCG Glu GAA*
UGU UCU GAG
Asp GAC Tyr UAC Phe UUC
GAU* UAU* UUU*
Pro CCA Val GUA Ile AUA
CCC GUC AUC
CCG* GUG* AUU*
CCU GUU Gly GGA
Lys AAA* Thr ACA GGC *
AAG ACC * GGG
Asn AAC * ACG GGU
AAU ACU Asp GAC
Leu CUA Arg AGA GAU*
CUC AGG Phe UUC
CUG* CGA UUU*
CUU CGC * Tyr UAC
UUA CGG UAU*
UUG CGU*
유전자 변형의 결과로 전체 FLP 유전자 중 30%가 변형되었으며, GC content는 37%에서 61%로 증가시켜 미생물에서의 안정성 증가 및 식물에서의 발현 증가를 유도하였다(도 2).
<실시예 3> m FLP 를 이용한 자가절단 벡터 pCMF의 제조
변형된 FLP 유전자(mFLP)는 클로닝 벡터 내에서의 클로닝 및 증폭과정을 거쳐 상기의 식물형질전환 벡터인 pHWMF 내의 제한효소 자리 BglII를 이용하여 치환하였고 pCMF라고 명명하였다(도 3).
mFLP가 치환된 자가 절단형 식물형질전환용 pCMF는 high copy plasmid임에도 불구하고 균주 (E. coli)내에서의 플라스미드 안정성이 매우 향상되었다. 도 4와 같이 FLP가 사용된 pHWMF는 균주 내에서의 재조합 현상이 매우 심각하며 세대에 따라 재조합 현상이 심해지는 반면 mFLP를 사용한 pCMF는 균주 내에서 비교적 안정하게 유지되었다.
<실시예 4> 식물 세포에서의 자가절단에 의한 선발표지 제거 확인
목표유전자 gfp, NtTC 및 Cry1ac 유전자를 pCMF의 MCS 내의 제한효소 자리를 이용하여 도입한 후 아그로박테리움(LBA4404)에 형질전환 하였다. 각각의 벡터를 가지는 아그로박테리움은 화영벼 완숙종자에서 유도된 callus에 3일간 공동배양 한 후 하이그로마이신(50㎍/L)이 첨가된 2N6-CH 배지에서 4주간 암 배양하여 형질전환된 callus의 생장을 유도하였다. 3일간 공동배양 후의 callus와 4주간 하이그로마이신 배지에서 생육된 callus를 3차례 멸균 증류수로 세척한 후 액체질소로 분쇄하고 전체 핵 DNA를 추출하였다. DNA의 추출은 DNeasy mini kit (Qiagen)을 사용하여 추출하였으며, 추출된 핵 DNA를 이용하여 하기 도 5A에 표시된 각각의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 실시하고 1% agarose gel 상에서 전기영동으로 분리한 후 ethidium bromide로 염색하여 확인하였다. 도 5B와 같이 3일간의 공동배양 후의 callus에서는 재조합에 의한 자가 절단은 관찰되지 않았다. 그러나 4주간 배양한 callus에서는 자가 절단에 의해 선발표지가 제거된 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과는 자가 절단형 식물형질전환 벡터 pCMF가 식물 세포 내에서 재조합효소의 발현으로 선발표지 제거 활성이 그대로 유지됨을 보여주는 것이다.
농업유전자원센터 KACC95113 20111107
서열목록 전자파일 첨부

Claims (13)

  1. 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 부위-특이 재조합효소 유전자.
  2. 제 1항 재조합효소 유전자를 포함하는 식물의 형질전환용 벡터.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 벡터는 스트레스 유도성 프로모터 및 상기 재조합효소 인식 부위를 포함하며, 스트레스에 의해 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 부위-특이 재조합효소 유전자의 발현이 유도되어 자가절단을 하여 선발표지를 제거할 수 있는 것을 특징으로 하는 식물의 형질전환용 벡터.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 벡터는 멀티-클로닝 부위(MCS)를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물의 형질전환용 벡터.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 부위-특이 재조합효소 유전자의 발현을 위해 고구마 엽록체의 스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물의 형질전환용 벡터.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 벡터는 프로모터와 선발표지의 교환이 용이하도록 해당 서열의 경계에 제한효소 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 식물의 형질전환용 벡터.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 벡터는 도 3의 하단에 나타낸 벡터인 것을 특징으로 하는 식물의 형질전환용 벡터.
  8. 제 4항에 있어서, 상기 벡터는 기탁번호 KACC95113P로 기탁된 벡터인 것을 특징으로 하는 식물의 형질전환용 벡터.
  9. 제 2항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 벡터를 이용하여 식물의 형질전환을 하는 방법.
  10. 제 2항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 벡터로 형질전환되어 식물 운반체로 사용되는 아그로박테리움 속 (Agrobacterium sp.) 미생물.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 미생물은 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 (Agrobacterium tumefaciens LBA4404)인 것을 특징으로 하는 미생물.
  12. 제 2항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 벡터를 이용하여 형질전환된, 선발표지를 제거할 수 있는 형질전환 식물체.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 식물체는 담배인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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