JPH06276872A - マーカー遺伝子の除去方法 - Google Patents
マーカー遺伝子の除去方法Info
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- JPH06276872A JPH06276872A JP7380293A JP7380293A JPH06276872A JP H06276872 A JPH06276872 A JP H06276872A JP 7380293 A JP7380293 A JP 7380293A JP 7380293 A JP7380293 A JP 7380293A JP H06276872 A JPH06276872 A JP H06276872A
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- Japan
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- gene
- plant
- hph
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】それぞれが異種プラスミド由来の外来遺伝子お
よびマーカー遺伝子を有する形質転換植物体の次世代以
降の子孫を育種して外来遺伝子のみを有する品種を選抜
することによりマーカー遺伝子を除去する。また、外来
遺伝子を有するプラスミドおよびマーカー遺伝子を有す
るプラスミドからなる複数異種のプラスミドを植物組織
または植物組織に由来する細胞に共存導入して形質転換
し、該形質転換体から再生した植物体の次世代以降の子
孫を育種することによりマーカー遺伝子の除去された形
質転換植物を作出する。 【効果】本発明によれば、意図的に選択マーカー遺伝子
を除去できるので、微生物由来の選択マーカー遺伝子を
持たない、食用作物では好適な形質転換植物が得られ
る。
よびマーカー遺伝子を有する形質転換植物体の次世代以
降の子孫を育種して外来遺伝子のみを有する品種を選抜
することによりマーカー遺伝子を除去する。また、外来
遺伝子を有するプラスミドおよびマーカー遺伝子を有す
るプラスミドからなる複数異種のプラスミドを植物組織
または植物組織に由来する細胞に共存導入して形質転換
し、該形質転換体から再生した植物体の次世代以降の子
孫を育種することによりマーカー遺伝子の除去された形
質転換植物を作出する。 【効果】本発明によれば、意図的に選択マーカー遺伝子
を除去できるので、微生物由来の選択マーカー遺伝子を
持たない、食用作物では好適な形質転換植物が得られ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、農業生産、特に作物育
種上有用な形質転換植物から、実用上は不要な主として
微生物に由来する遺伝子を除去する方法、およびかかる
方法を用いて形質転換植物を作出する方法に関する。
種上有用な形質転換植物から、実用上は不要な主として
微生物に由来する遺伝子を除去する方法、およびかかる
方法を用いて形質転換植物を作出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】現在
では農業上重要な作物を含む広い範囲の植物種で、数々
の形質転換植物が得られている。これらの形質転換植物
の中には人類にとって有用な形質が導入された例が少な
くない。通常、形質転換植物の作出の過程では、目的と
する有用形質を発現するカルスまたは再生植物を効率よ
く選抜するために、目的とする外来遺伝子の他に選抜の
指標となるマーカー遺伝子を導入する。一般的に用いら
れているマーカー遺伝子は、例えばハイグロマイシン、
カナマイシン等の抗生物質に対して耐性を示す遺伝子や
ビアラフォス、バスタ等の除草剤に耐性を示す遺伝子で
あり、すべて微生物由来である。これら微生物由来の耐
性遺伝子等のマーカー遺伝子はカルス等を選抜する際の
みに必要とされるものであり、得られた植物体では必要
とされない。むしろ、食用とされる作物ではマーカー遺
伝子が除去された方が好ましい。にもかかわらず、現在
効果的なマーカー遺伝子除去の技術は知られていないた
め、全ての形質転換植物はマーカー遺伝子を持っている
のが現状であった。
では農業上重要な作物を含む広い範囲の植物種で、数々
の形質転換植物が得られている。これらの形質転換植物
の中には人類にとって有用な形質が導入された例が少な
くない。通常、形質転換植物の作出の過程では、目的と
する有用形質を発現するカルスまたは再生植物を効率よ
く選抜するために、目的とする外来遺伝子の他に選抜の
指標となるマーカー遺伝子を導入する。一般的に用いら
れているマーカー遺伝子は、例えばハイグロマイシン、
カナマイシン等の抗生物質に対して耐性を示す遺伝子や
ビアラフォス、バスタ等の除草剤に耐性を示す遺伝子で
あり、すべて微生物由来である。これら微生物由来の耐
性遺伝子等のマーカー遺伝子はカルス等を選抜する際の
みに必要とされるものであり、得られた植物体では必要
とされない。むしろ、食用とされる作物ではマーカー遺
伝子が除去された方が好ましい。にもかかわらず、現在
効果的なマーカー遺伝子除去の技術は知られていないた
め、全ての形質転換植物はマーカー遺伝子を持っている
のが現状であった。
【０００３】実験的には、細胞でのＤＮＡ組換え機構
を利用し導入遺伝子を除去する方法（Ｄａｌｅ ｅｔ
ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８８，１０５５８−１０５６２，１９９１）、植
物由来のマーカー遺伝子を探索し利用する方法（Ｌｉ
ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１００，
６６２−６６８，１９９２）が試みられてはいるもの
の、実用段階には至っていない。
を利用し導入遺伝子を除去する方法（Ｄａｌｅ ｅｔ
ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８８，１０５５８−１０５６２，１９９１）、植
物由来のマーカー遺伝子を探索し利用する方法（Ｌｉ
ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１００，
６６２−６６８，１９９２）が試みられてはいるもの
の、実用段階には至っていない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、形質転換
植物よりマーカー遺伝子を除去する目的で検討を重ねた
結果、共存導入法を用いた形質転換法を用いることによ
り、マーカー遺伝子が除去されることを初めて見出し、
本発明を完成するに至った。即ち本発明の要旨は、それ
ぞれが異種プラスミド由来の外来遺伝子およびマーカー
遺伝子を有する形質転換植物体の次世代以降の子孫を育
種して外来遺伝子のみを有する品種を選抜することを特
徴とするマーカー遺伝子の除去方法、およびかかる方法
を用いて形質転換植物を作出する方法に存する。
植物よりマーカー遺伝子を除去する目的で検討を重ねた
結果、共存導入法を用いた形質転換法を用いることによ
り、マーカー遺伝子が除去されることを初めて見出し、
本発明を完成するに至った。即ち本発明の要旨は、それ
ぞれが異種プラスミド由来の外来遺伝子およびマーカー
遺伝子を有する形質転換植物体の次世代以降の子孫を育
種して外来遺伝子のみを有する品種を選抜することを特
徴とするマーカー遺伝子の除去方法、およびかかる方法
を用いて形質転換植物を作出する方法に存する。
【０００５】以下、本発明につき詳細に説明する。共存
導入法とは、複数の異種プラスミドをカルス、プロトプ
ラスト等の植物由来の細胞または組織に、同時に導入す
る方法である。植物の形質転換法はＴｉプラスミドを
用いる方法、直接導入法に大別できるが、イネ科植物
等の一部の植物においてはの方法が利用できないの
で、本発明ではの直接導入法が用いられる。直接導入
法は、植物由来のプロトプラスト、培養細胞、組織等
に、組換えＤＮＡプラスミドを、エレクトロポレーショ
ン法、ポリエチレングリコール法、パーティクルボンバ
ードメント法等の方法で、直接に導入する方法である。
導入法とは、複数の異種プラスミドをカルス、プロトプ
ラスト等の植物由来の細胞または組織に、同時に導入す
る方法である。植物の形質転換法はＴｉプラスミドを
用いる方法、直接導入法に大別できるが、イネ科植物
等の一部の植物においてはの方法が利用できないの
で、本発明ではの直接導入法が用いられる。直接導入
法は、植物由来のプロトプラスト、培養細胞、組織等
に、組換えＤＮＡプラスミドを、エレクトロポレーショ
ン法、ポリエチレングリコール法、パーティクルボンバ
ードメント法等の方法で、直接に導入する方法である。
【０００６】複数の遺伝子の導入方法としては、複合
プラスミドによる方法、共存導入法が知られている。
は目的とする外来遺伝子やマーカー遺伝子等の複数の
遺伝子を単一のベクターに組み込み、得られた単一の組
換えＤＮＡプラスミドを導入する方法であるのに対し、
は目的とする外来遺伝子やマーカー遺伝子を組み込ん
だ、複数の組換えＤＮＡプラスミドを用意し、それらを
同時に導入する方法であり、複数の遺伝子を発現する形
質転換植物が得られる。これら複数の遺伝子は再生植物
において独立に遺伝することが期待され、その場合、外
来遺伝子のみを発現しマーカー遺伝子を持たない形質転
換植物が得られる。よって本発明においては、の共存
導入法が用いられる。
プラスミドによる方法、共存導入法が知られている。
は目的とする外来遺伝子やマーカー遺伝子等の複数の
遺伝子を単一のベクターに組み込み、得られた単一の組
換えＤＮＡプラスミドを導入する方法であるのに対し、
は目的とする外来遺伝子やマーカー遺伝子を組み込ん
だ、複数の組換えＤＮＡプラスミドを用意し、それらを
同時に導入する方法であり、複数の遺伝子を発現する形
質転換植物が得られる。これら複数の遺伝子は再生植物
において独立に遺伝することが期待され、その場合、外
来遺伝子のみを発現しマーカー遺伝子を持たない形質転
換植物が得られる。よって本発明においては、の共存
導入法が用いられる。
【０００７】本発明において対象となる植物は特に制限
はされないが、農業生産上有用な作物ということで、イ
ネ、ムギ、トウモロコシ、シバ等の単子葉植物が好まし
く、特にイネ科の植物であることが好ましい。本発明に
おいて導入される外来遺伝子は、対象とする植物を形質
転換し得るものであれば特に制限はされない。例えばイ
ネを形質転換の対象とする場合、イネ縞葉枯ウイルス外
被タンパク質（ＲＳＶ−ＣＰ）遺伝子、イネでんぷん合
成酵素（Ｗｘ）遺伝子、β−グルキュロニダーゼ（ＧＵ
Ｓ）遺伝子のｃＤＮＡあるいはゲノミックＤＮＡ等が挙
げられる。
はされないが、農業生産上有用な作物ということで、イ
ネ、ムギ、トウモロコシ、シバ等の単子葉植物が好まし
く、特にイネ科の植物であることが好ましい。本発明に
おいて導入される外来遺伝子は、対象とする植物を形質
転換し得るものであれば特に制限はされない。例えばイ
ネを形質転換の対象とする場合、イネ縞葉枯ウイルス外
被タンパク質（ＲＳＶ−ＣＰ）遺伝子、イネでんぷん合
成酵素（Ｗｘ）遺伝子、β−グルキュロニダーゼ（ＧＵ
Ｓ）遺伝子のｃＤＮＡあるいはゲノミックＤＮＡ等が挙
げられる。
【０００８】またマーカー遺伝子としては、目的とする
コロニーを選択する際に有効ないわゆる選択マーカー遺
伝子であれば特に制限はされないが、具体的にはハイグ
ロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ（ｈｐｈ）遺
伝子、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝
子、（ｈｐｔＩＩ）クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子（ｃａｔ）、β−グルキュロニダ
ーゼ遺伝子等が挙げられる。本発明においては、かかる
マーカー遺伝子として、ハイグロマイシンフォスフォト
ランスフェラーゼ遺伝子を使用することが好ましい。
コロニーを選択する際に有効ないわゆる選択マーカー遺
伝子であれば特に制限はされないが、具体的にはハイグ
ロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ（ｈｐｈ）遺
伝子、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝
子、（ｈｐｔＩＩ）クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子（ｃａｔ）、β−グルキュロニダ
ーゼ遺伝子等が挙げられる。本発明においては、かかる
マーカー遺伝子として、ハイグロマイシンフォスフォト
ランスフェラーゼ遺伝子を使用することが好ましい。
【０００９】例えばイネにＲＳＶ−ＣＰ遺伝子を導入す
る場合、イネ縞葉枯ウイルスのＲＮＡ３の外被タンパク
質コーディング領域のｃＤＮＡを用いる（Ｚｈｕ ｅｔ
ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，７６３−７
６７，１９９１）。またイネにＷｘ遺伝子を導入する場
合は、Ｗｘ遺伝子の翻訳領域のＮ末にはトランジットペ
プタイドがありアミロプラストへのターゲッティングシ
グナルとなっている（Ｋｌｏｓｇｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１７，１５５−１６
１，１９８９；Ｋｌｏｓｇｅｎ ａｎｄ Ｗｅｉｌ，Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２５，２９７−３０
４、１９９１）ので、導入した遺伝子からＷｘタンパク
質を作らせアミロプラストに蓄積させるためにはインタ
クトなＷｘタンパク質が翻訳されるように全翻訳域を用
いる必要がある。従って、Ｗｘタンパク質のオープンリ
ーディングフレーム全域を含む２．７ｋｂ ＷｘｃＤＮ
Ａを用いる。
る場合、イネ縞葉枯ウイルスのＲＮＡ３の外被タンパク
質コーディング領域のｃＤＮＡを用いる（Ｚｈｕ ｅｔ
ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，７６３−７
６７，１９９１）。またイネにＷｘ遺伝子を導入する場
合は、Ｗｘ遺伝子の翻訳領域のＮ末にはトランジットペ
プタイドがありアミロプラストへのターゲッティングシ
グナルとなっている（Ｋｌｏｓｇｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１７，１５５−１６
１，１９８９；Ｋｌｏｓｇｅｎ ａｎｄ Ｗｅｉｌ，Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２５，２９７−３０
４、１９９１）ので、導入した遺伝子からＷｘタンパク
質を作らせアミロプラストに蓄積させるためにはインタ
クトなＷｘタンパク質が翻訳されるように全翻訳域を用
いる必要がある。従って、Ｗｘタンパク質のオープンリ
ーディングフレーム全域を含む２．７ｋｂ ＷｘｃＤＮ
Ａを用いる。
【００１０】更に、イネにＧＵＳ遺伝子を導入する場
合、大腸菌由来のβ−グルキュロニダーゼ遺伝子の全翻
訳領域を用いる。これら外来遺伝子を導入する際に、同
時に上述のマーカー遺伝子を導入する。例えば、ハイグ
ロマイシンに耐性を示すｈｐｈ遺伝子を導入する場合、
大腸菌由来のｈｐｈ遺伝子の全翻訳領域を用いる。
合、大腸菌由来のβ−グルキュロニダーゼ遺伝子の全翻
訳領域を用いる。これら外来遺伝子を導入する際に、同
時に上述のマーカー遺伝子を導入する。例えば、ハイグ
ロマイシンに耐性を示すｈｐｈ遺伝子を導入する場合、
大腸菌由来のｈｐｈ遺伝子の全翻訳領域を用いる。
【００１１】次に上記の遺伝子を導入した発現ベクター
を構築する。例えばイネ植物体でかかる遺伝子を十分量
発現させるためには、ベクター構築の際に特異的なプロ
モーターを用いることが重要となる。現在、イネでの発
現が確認されているプロモーターとして、カリフラワー
モザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Ｔｅｒａｄａａ
ｎｄ Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔ．，２２０，３８９−３９２，１９９０）、イネＷｘ
プロモーター（Ｈｉｒａｎｏ ａｎｄ Ｓａｎｏ，Ｐｌ
ａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３２，９８９−
９９７，１９９１）、トウモロコシＡｄｈ１プロモータ
ー（Ｋｙｏｚｕｋａ，Ｍｏｌ，Ｇｅｎ．，Ｇｅｎｅ
ｔ．，２２８，４０−４８，１９９１）、イネＲｂｃＳ
プロモーター（Ｋｙｏｚｕｋａ ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｎ
ｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．ｉｎ ｐｒｅｓｓ，１９９３）が
あげられる。
を構築する。例えばイネ植物体でかかる遺伝子を十分量
発現させるためには、ベクター構築の際に特異的なプロ
モーターを用いることが重要となる。現在、イネでの発
現が確認されているプロモーターとして、カリフラワー
モザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Ｔｅｒａｄａａ
ｎｄ Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔ．，２２０，３８９−３９２，１９９０）、イネＷｘ
プロモーター（Ｈｉｒａｎｏ ａｎｄ Ｓａｎｏ，Ｐｌ
ａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３２，９８９−
９９７，１９９１）、トウモロコシＡｄｈ１プロモータ
ー（Ｋｙｏｚｕｋａ，Ｍｏｌ，Ｇｅｎ．，Ｇｅｎｅ
ｔ．，２２８，４０−４８，１９９１）、イネＲｂｃＳ
プロモーター（Ｋｙｏｚｕｋａ ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｎ
ｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．ｉｎ ｐｒｅｓｓ，１９９３）が
あげられる。
【００１２】また、遺伝子の発現効率を上げるためある
いはＲＮＡの安定性を上げるために各植物で機能するイ
ントロンを連結させることも効果的である。イントロン
の発現に及ぼす影響については例えば、トウモロコシＡ
ｄｈ１のイントロン１がトウモロコシで有効（Ｃａｌｌ
ｉｓ，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１，１１
８３−１２００，１９８７）であるだけでなく、イネで
も効果的であること（Ｋｙｏｚｕｋａ ｅｔ ａｌ，Ｍ
ａｙｄｉｃａ，３５，３５３−３５７，１９９０）や、
ヒマ カタラーゼのイントロンがイネで有効に働くこと
（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒ
ｅｓ．，１８，６７６７−６７７０，１９９０）などの
報告がある。
いはＲＮＡの安定性を上げるために各植物で機能するイ
ントロンを連結させることも効果的である。イントロン
の発現に及ぼす影響については例えば、トウモロコシＡ
ｄｈ１のイントロン１がトウモロコシで有効（Ｃａｌｌ
ｉｓ，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１，１１
８３−１２００，１９８７）であるだけでなく、イネで
も効果的であること（Ｋｙｏｚｕｋａ ｅｔ ａｌ，Ｍ
ａｙｄｉｃａ，３５，３５３−３５７，１９９０）や、
ヒマ カタラーゼのイントロンがイネで有効に働くこと
（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒ
ｅｓ．，１８，６７６７−６７７０，１９９０）などの
報告がある。
【００１３】更に効率よく遺伝子の転写を終結させまた
ＲＮＡを安定させるために、ターミネーターが用いられ
る。具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子ＮＯＳのター
ミネーター（ｐＢＩ２２１，Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，ＥＭ
ＢＯ Ｊ．，６，３９０１−３９０７，１９８７）ある
いはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（１９Ｓ）Ｒ
ＮＡターミネーター（ｐＧＬ２，Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ
ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３３８，２７４−２７６，
１９８９）等が挙げられる。
ＲＮＡを安定させるために、ターミネーターが用いられ
る。具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子ＮＯＳのター
ミネーター（ｐＢＩ２２１，Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，ＥＭ
ＢＯ Ｊ．，６，３９０１−３９０７，１９８７）ある
いはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（１９Ｓ）Ｒ
ＮＡターミネーター（ｐＧＬ２，Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ
ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３３８，２７４−２７６，
１９８９）等が挙げられる。
【００１４】組換え作業においては、ｐＵＣ系列（Ｙａ
ｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ｅｔａｌ，Ｇｅｎｅ，３
３，１０３−１１９，１９８５）のプラスミド等が好適
に用いられる。本発明においては目的とする外来遺伝子
を有するプラスミドとマーカー遺伝子を有するプラスミ
ドを別々に構築し、これら異種プラスミドを同時に植物
組織または植物組織に由来する細胞に導入する。
ｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ｅｔａｌ，Ｇｅｎｅ，３
３，１０３−１１９，１９８５）のプラスミド等が好適
に用いられる。本発明においては目的とする外来遺伝子
を有するプラスミドとマーカー遺伝子を有するプラスミ
ドを別々に構築し、これら異種プラスミドを同時に植物
組織または植物組織に由来する細胞に導入する。
【００１５】例えば、ＲＳＶ−ＣＰ遺伝子発現用ベクタ
ーとｈｐｈ発現用ベクターを同時にイネプロトプラスト
に導入することにより、ＲＳＶ−ＣＰ遺伝子とｈｐｈ遺
伝子を両方発現する個体が得られ、それらは独立に遺伝
することにより自殖後の後代ではＲＳＶ−ＣＰ遺伝子の
み発現し、ｈｐｈ遺伝子を持たない個体が得られる。ま
た、Ｗｘ遺伝子発現用ベクターとｈｐｈ遺伝子発現用ベ
クターを同時にイネプロトプラストに導入することによ
り、Ｗｘ遺伝子とｈｐｈ遺伝子を両方発現する個体が得
られ、それらは独立に遺伝することにより自殖後の後代
ではＷｘ遺伝子のみ発現し、ｈｐｈ遺伝子を持たない個
体が得られる。
ーとｈｐｈ発現用ベクターを同時にイネプロトプラスト
に導入することにより、ＲＳＶ−ＣＰ遺伝子とｈｐｈ遺
伝子を両方発現する個体が得られ、それらは独立に遺伝
することにより自殖後の後代ではＲＳＶ−ＣＰ遺伝子の
み発現し、ｈｐｈ遺伝子を持たない個体が得られる。ま
た、Ｗｘ遺伝子発現用ベクターとｈｐｈ遺伝子発現用ベ
クターを同時にイネプロトプラストに導入することによ
り、Ｗｘ遺伝子とｈｐｈ遺伝子を両方発現する個体が得
られ、それらは独立に遺伝することにより自殖後の後代
ではＷｘ遺伝子のみ発現し、ｈｐｈ遺伝子を持たない個
体が得られる。
【００１６】更に、ＧＵＳ遺伝子発現用ベクターとｈｐ
ｈ発現用ベクターを同時にイネプロトプラストに導入す
ることにより、ＧＵＳ遺伝子とｈｐｈ遺伝子を両方発現
する個体が得られ、それらは独立に遺伝することにより
自殖後の後代ではＧＵＳ遺伝子のみ発現し、ｈｐｈ遺伝
子を持たない個体が得られる。このことにより不要にな
った選択マーカー遺伝子は除去される。
ｈ発現用ベクターを同時にイネプロトプラストに導入す
ることにより、ＧＵＳ遺伝子とｈｐｈ遺伝子を両方発現
する個体が得られ、それらは独立に遺伝することにより
自殖後の後代ではＧＵＳ遺伝子のみ発現し、ｈｐｈ遺伝
子を持たない個体が得られる。このことにより不要にな
った選択マーカー遺伝子は除去される。
【００１７】イネ科植物由来のプロトプラストは次の様
にして調製することができる。即ち、キヌヒカリ、日本
晴等の栽培イネの完熟種子に由来するカルスを通常使用
され得る液体培地で培養した後、常法に従い、例えばセ
ルラーゼやマセロザイム等の細胞壁分解酵素を含む酵素
液中２５〜３０℃、３〜１６時間程度酵素処理する。酵
素処理終了後ろ過して未消化物を除き、ろ液に２〜５倍
量のＫＭＣ液（塩化カリウム０．１１８Ｍ、塩化マグネ
シウム０．０８１７Ｍ、塩化カルシウム０．０８５Ｍ、
ｐＨ６．０）（Ｈａｒｍｓ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅｏｒ．
Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，５３，５７−６３，１９７
８）等を加え遠心分離し、精製されたプロトプラストを
得ることができる。 本発明においてはイネ栽培種（キ
ヌヒカリ、日本晴等の粳種あるいは祝糯、むさしもち等
の糯種）由来プロトプラスト、例えば（２〜１０）×１
０6 個／ｍｌに対しては、上記のようにして調製したＲ
ＳＶ−ＣＰ遺伝子、Ｗｘ遺伝子、ＧＵＳ遺伝子等の外来
遺伝子発現用ベクター、例えば１〜１００μｇ／ｍｌ
と、各々に対してｈｐｈ遺伝子等のマーカー遺伝子発現
用ベクター（ｐＧＬ２：Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａ
ｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３３８，２７４−２７６，１９８
９）、例えば１〜１００μｇ／ｍｌを３０〜２００ｍＭ
塩化カリウム、０〜５０ｍＭ 塩化マグネシウム、
０．２〜０．６Ｍ マニトールを含む緩衝液等の液体媒
体中に懸濁し、これに電気パルスを印加してプラスミド
をプロトプラスト中に導入する。電気パルス処理は、１
００〜１０００μＦのコンデンサーを用いて得られる２
００〜１０００Ｖ／ｃｍの初期電圧の直流パルスで、パ
ルス幅１〜３０ｍｓｅｃ程度の条件で印加するのが好適
である（特開平１−１８１７９１号公報参照）。
にして調製することができる。即ち、キヌヒカリ、日本
晴等の栽培イネの完熟種子に由来するカルスを通常使用
され得る液体培地で培養した後、常法に従い、例えばセ
ルラーゼやマセロザイム等の細胞壁分解酵素を含む酵素
液中２５〜３０℃、３〜１６時間程度酵素処理する。酵
素処理終了後ろ過して未消化物を除き、ろ液に２〜５倍
量のＫＭＣ液（塩化カリウム０．１１８Ｍ、塩化マグネ
シウム０．０８１７Ｍ、塩化カルシウム０．０８５Ｍ、
ｐＨ６．０）（Ｈａｒｍｓ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅｏｒ．
Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，５３，５７−６３，１９７
８）等を加え遠心分離し、精製されたプロトプラストを
得ることができる。 本発明においてはイネ栽培種（キ
ヌヒカリ、日本晴等の粳種あるいは祝糯、むさしもち等
の糯種）由来プロトプラスト、例えば（２〜１０）×１
０6 個／ｍｌに対しては、上記のようにして調製したＲ
ＳＶ−ＣＰ遺伝子、Ｗｘ遺伝子、ＧＵＳ遺伝子等の外来
遺伝子発現用ベクター、例えば１〜１００μｇ／ｍｌ
と、各々に対してｈｐｈ遺伝子等のマーカー遺伝子発現
用ベクター（ｐＧＬ２：Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａ
ｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３３８，２７４−２７６，１９８
９）、例えば１〜１００μｇ／ｍｌを３０〜２００ｍＭ
塩化カリウム、０〜５０ｍＭ 塩化マグネシウム、
０．２〜０．６Ｍ マニトールを含む緩衝液等の液体媒
体中に懸濁し、これに電気パルスを印加してプラスミド
をプロトプラスト中に導入する。電気パルス処理は、１
００〜１０００μＦのコンデンサーを用いて得られる２
００〜１０００Ｖ／ｃｍの初期電圧の直流パルスで、パ
ルス幅１〜３０ｍｓｅｃ程度の条件で印加するのが好適
である（特開平１−１８１７９１号公報参照）。
【００１８】上述のようにして電気パルス処理したプロ
トプラストを、例えばＲ2 培地（Ｏｈｉｒａ ｅｔ ａ
ｌ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１４，
１１１３，１９７３）の無機成分とＢ５培地（Ｇａｍｂ
ｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，５０，１５１，１９６８）のビ
タミン混合液を含む液体培地（Ｒ2 ／Ｂ５）、好ましく
は窒素源として硝酸カリウムを０．２〜０．５％含有す
る培地に懸濁し、これを１．０〜３．０％程度のアガロ
ースを含むＲ2 ／Ｂ５培地と等量ずつ混ぜ、速やかにシ
ャーレ中に広げてうすく固める。この時のプロトプラス
トの密度は約（５〜５０）×１０5 個／ｍｌとなるよう
にし、またアガロースの厚さは平均０．７ｍｍ程度とな
るようにするのがよい。
トプラストを、例えばＲ2 培地（Ｏｈｉｒａ ｅｔ ａ
ｌ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１４，
１１１３，１９７３）の無機成分とＢ５培地（Ｇａｍｂ
ｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，５０，１５１，１９６８）のビ
タミン混合液を含む液体培地（Ｒ2 ／Ｂ５）、好ましく
は窒素源として硝酸カリウムを０．２〜０．５％含有す
る培地に懸濁し、これを１．０〜３．０％程度のアガロ
ースを含むＲ2 ／Ｂ５培地と等量ずつ混ぜ、速やかにシ
ャーレ中に広げてうすく固める。この時のプロトプラス
トの密度は約（５〜５０）×１０5 個／ｍｌとなるよう
にし、またアガロースの厚さは平均０．７ｍｍ程度とな
るようにするのがよい。
【００１９】固化したアガロースゲルを５〜２０ｍｍ程
度の大きさに切り、上記液体培地中で培養する。その
際、イネ科植物由来のプロトプラストを使用した場合に
は、好ましくは培地中にイネ培養細胞を１００〜３００
ｍｇＦＷ／シャーレ程度共存させ、２０〜５０ｒ．ｐ．
ｍの回転でゆっくり振とうしながら、暗条件下２７〜３
３℃で培養する。
度の大きさに切り、上記液体培地中で培養する。その
際、イネ科植物由来のプロトプラストを使用した場合に
は、好ましくは培地中にイネ培養細胞を１００〜３００
ｍｇＦＷ／シャーレ程度共存させ、２０〜５０ｒ．ｐ．
ｍの回転でゆっくり振とうしながら、暗条件下２７〜３
３℃で培養する。
【００２０】培養後３〜４週間で、０．５〜１ｍｍφ程
度のコロニーが形成される。その際、例えばマーカー遺
伝子としてｈｐｈ遺伝子を導入しておいた場合、培養開
始後７〜２０日にハイグロマイシンを１０〜５０μｇ／
ｍｌ程度培養液中に添加し、更に培養を続けることで形
質転換細胞の一次選択を効率よく行うことができる。次
いでこのコロニーを増殖培地、例えばＮ６基本培地（Ｃ
ｈｕ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉ．Ｓｉｎ．，１６，６５９−
６８８，．１９７５）に植物ホルモン、例えば２，４−
ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を２ｍｇ／リッ
トル程度、アガロースを０．１〜１．０％加えた寒天培
地上で２〜４週間、照明下（１０００〜４０００ｌｕ
ｘ）、２７〜３３℃で培養し、３〜６ｍｍφのカルスを
得る。このカルスの一部からゲノムＤＮＡを、例えば、
Ｗａｌｂｏｔ ａｎｄ Ｗａｒｒｅｎ、Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２１１、２７−３４、１９８８に準
じて単離し、このゲノムＤＮＡ約１００ｎｇを、次のＰ
ＣＲ法に供することで、目的とする外来遺伝子、例えば
ＲＳＶ−ＣＰ遺伝子、Ｗｘ遺伝子、ＧＵＳ遺伝子のとり
込まれた形質転換カルスを二次選択することができる。
度のコロニーが形成される。その際、例えばマーカー遺
伝子としてｈｐｈ遺伝子を導入しておいた場合、培養開
始後７〜２０日にハイグロマイシンを１０〜５０μｇ／
ｍｌ程度培養液中に添加し、更に培養を続けることで形
質転換細胞の一次選択を効率よく行うことができる。次
いでこのコロニーを増殖培地、例えばＮ６基本培地（Ｃ
ｈｕ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉ．Ｓｉｎ．，１６，６５９−
６８８，．１９７５）に植物ホルモン、例えば２，４−
ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を２ｍｇ／リッ
トル程度、アガロースを０．１〜１．０％加えた寒天培
地上で２〜４週間、照明下（１０００〜４０００ｌｕ
ｘ）、２７〜３３℃で培養し、３〜６ｍｍφのカルスを
得る。このカルスの一部からゲノムＤＮＡを、例えば、
Ｗａｌｂｏｔ ａｎｄ Ｗａｒｒｅｎ、Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２１１、２７−３４、１９８８に準
じて単離し、このゲノムＤＮＡ約１００ｎｇを、次のＰ
ＣＲ法に供することで、目的とする外来遺伝子、例えば
ＲＳＶ−ＣＰ遺伝子、Ｗｘ遺伝子、ＧＵＳ遺伝子のとり
込まれた形質転換カルスを二次選択することができる。
【００２１】ＰＣＲ法（Ｓａｉｋｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２３９，４８７−４９１，１９８８）は、鋳型の熱変
性、プライマーと鋳型とのアニーリング及び耐熱性ポリ
メラーゼによる伸長方法からなる工程を繰り返すことに
より、標的ＤＮＡ領域を増幅する方法である。本発明に
おいては、上記で得られたゲノムＤＮＡを９４℃、１分
程度で熱変性して＋鎖と−鎖の１本鎖に解離し、導入さ
れた目的遺伝子の一部に相補的なプライマーを、例えば
ＲＳＶ−ＣＰ遺伝子では３５Ｓプロモーター領域とＲＳ
Ｖ−ＣＰコーディング領域に相補的なプライマーを、ま
たＷｘ遺伝子やＧＵＳ遺伝子ではアミノ酸コーディング
領域の２ヶ所に相補的なプライマーを、それぞれアニー
リングした後、耐熱性ポリメラーゼにより相補鎖ＤＮＡ
を合成（７２℃、３分程度）するという工程を２０〜３
０回繰り返して該相補鎖ＤＮＡを増幅する。
２３９，４８７−４９１，１９８８）は、鋳型の熱変
性、プライマーと鋳型とのアニーリング及び耐熱性ポリ
メラーゼによる伸長方法からなる工程を繰り返すことに
より、標的ＤＮＡ領域を増幅する方法である。本発明に
おいては、上記で得られたゲノムＤＮＡを９４℃、１分
程度で熱変性して＋鎖と−鎖の１本鎖に解離し、導入さ
れた目的遺伝子の一部に相補的なプライマーを、例えば
ＲＳＶ−ＣＰ遺伝子では３５Ｓプロモーター領域とＲＳ
Ｖ−ＣＰコーディング領域に相補的なプライマーを、ま
たＷｘ遺伝子やＧＵＳ遺伝子ではアミノ酸コーディング
領域の２ヶ所に相補的なプライマーを、それぞれアニー
リングした後、耐熱性ポリメラーゼにより相補鎖ＤＮＡ
を合成（７２℃、３分程度）するという工程を２０〜３
０回繰り返して該相補鎖ＤＮＡを増幅する。
【００２２】ＰＣＲ法により目的遺伝子の導入が確認さ
れたカルスを再生培地、例えばＮ６基本培地（Ｃｈｕ
ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉ．Ｓｉｎ．，１６，６５９−６８
８，１９７５）に植物ホルモン、例えばインドール酢酸
（ＩＡＡ）を０．５ｍｇ／リットル程度、ゼアチン１ｍ
ｇ／リットル程度、アガロース０．６〜１．５％加えた
寒天培地上で２〜８週間、照明下（１０００〜４０００
ｌｕｘ）、２７〜３３℃で培養し再生植物を得る。次い
で幼植物を馴化後、温室にて育成することで３〜６ヶ月
後に種子を形成する。
れたカルスを再生培地、例えばＮ６基本培地（Ｃｈｕ
ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉ．Ｓｉｎ．，１６，６５９−６８
８，１９７５）に植物ホルモン、例えばインドール酢酸
（ＩＡＡ）を０．５ｍｇ／リットル程度、ゼアチン１ｍ
ｇ／リットル程度、アガロース０．６〜１．５％加えた
寒天培地上で２〜８週間、照明下（１０００〜４０００
ｌｕｘ）、２７〜３３℃で培養し再生植物を得る。次い
で幼植物を馴化後、温室にて育成することで３〜６ヶ月
後に種子を形成する。
【００２３】目的遺伝子の発現はウェスタン解析あるい
は特定の物質に対する化学的反応等の、目的遺伝子に応
じた方法で確認できる。例えば、ＲＳＶ−ＣＰ遺伝子の
発現は公知のウェスタン解析により行われる。植物体の
葉、より好ましくは幼植物体の葉を、例えば０．１％ヨ
ード酢酸及び１％ＳＤＳを含むトリス緩衝液中で粉砕
し、直ちに熱処理を加える。遠心分離した後にその上清
を１％ＳＤＳを含む、１２．５〜１５．０％ポリアクリ
ルアミドゲルで電気泳動し、植物体の全タンパク質を分
離精製する。これを電気的にナイロン膜（イモビロン）
にブロットし、ナイロン膜をＲＳＶ−ＣＰに特異的な抗
体と反応させることによりＲＳＶ−ＣＰ遺伝子の発現を
確認できる。
は特定の物質に対する化学的反応等の、目的遺伝子に応
じた方法で確認できる。例えば、ＲＳＶ−ＣＰ遺伝子の
発現は公知のウェスタン解析により行われる。植物体の
葉、より好ましくは幼植物体の葉を、例えば０．１％ヨ
ード酢酸及び１％ＳＤＳを含むトリス緩衝液中で粉砕
し、直ちに熱処理を加える。遠心分離した後にその上清
を１％ＳＤＳを含む、１２．５〜１５．０％ポリアクリ
ルアミドゲルで電気泳動し、植物体の全タンパク質を分
離精製する。これを電気的にナイロン膜（イモビロン）
にブロットし、ナイロン膜をＲＳＶ−ＣＰに特異的な抗
体と反応させることによりＲＳＶ−ＣＰ遺伝子の発現を
確認できる。
【００２４】また、Ｗｘ遺伝子の発現は公知のヨード染
色によるアミロース検出法により行われる。花粉あるい
は種子を例えば７．１ｍＭのヨウ素、３．４ｍＭのヨウ
化カリウムを含む、ヨード液中におくことで、粳米やそ
の花粉は濃紫色から黒褐色、糯米やその花粉は淡紫色か
ら白色を呈する。かかる呈色反応を指標としてアミロー
ス含量を推定しＷｘ遺伝子の発現を確認することができ
る。また、種子でんぷん中に含まれるＷｘタンパク質を
ゲル電気泳動法により検出することもできる。
色によるアミロース検出法により行われる。花粉あるい
は種子を例えば７．１ｍＭのヨウ素、３．４ｍＭのヨウ
化カリウムを含む、ヨード液中におくことで、粳米やそ
の花粉は濃紫色から黒褐色、糯米やその花粉は淡紫色か
ら白色を呈する。かかる呈色反応を指標としてアミロー
ス含量を推定しＷｘ遺伝子の発現を確認することができ
る。また、種子でんぷん中に含まれるＷｘタンパク質を
ゲル電気泳動法により検出することもできる。
【００２５】更に、ＧＵＳ遺伝子の発現はｘ−Ｇｌｕｃ
で染色した場合の発色程度の差により確認することがで
きる。染色に供試するのは植物組織片でも種子でも良
く、これらを、例えば１０ｍＭのｘ−Ｇｌｕｃ水溶液で
染色する。ＧＵＳ遺伝子が発現している組織もしくは細
胞では濃紺色を呈する。かかる呈色反応によりＧＵＳ遺
伝子の発現が確認できる。また、ＭＵＧを基質とするこ
とで組織抽出液中のＧＵＳ酵素活性を量的に測定するこ
ともできる。
で染色した場合の発色程度の差により確認することがで
きる。染色に供試するのは植物組織片でも種子でも良
く、これらを、例えば１０ｍＭのｘ−Ｇｌｕｃ水溶液で
染色する。ＧＵＳ遺伝子が発現している組織もしくは細
胞では濃紺色を呈する。かかる呈色反応によりＧＵＳ遺
伝子の発現が確認できる。また、ＭＵＧを基質とするこ
とで組織抽出液中のＧＵＳ酵素活性を量的に測定するこ
ともできる。
【００２６】マーカー遺伝子の発現は特定の薬剤、多く
は抗生物質や除草剤に対する耐性を検定することにより
検定できる。例えばｈｐｈ遺伝子をマーカー遺伝子とし
て選んだ場合、形質転換植物の種子を、例えば２０μｇ
／ｍｌのハイグロマイシンを含むＲ2 培地で発芽させ、
ｈｐｈ遺伝子の発現を確認できる。あるいはマーカー遺
伝子の有無は、上述のＰＣＲ法により検定してもよい。
は抗生物質や除草剤に対する耐性を検定することにより
検定できる。例えばｈｐｈ遺伝子をマーカー遺伝子とし
て選んだ場合、形質転換植物の種子を、例えば２０μｇ
／ｍｌのハイグロマイシンを含むＲ2 培地で発芽させ、
ｈｐｈ遺伝子の発現を確認できる。あるいはマーカー遺
伝子の有無は、上述のＰＣＲ法により検定してもよい。
【００２７】得られた形質転換個体の自殖次世代（Ｒ1
世代）で、目的遺伝子と選択マーカー遺伝子の発現を検
定することにより、目的とする遺伝子のみを発現し、選
択マーカー遺伝子を持たない個体を得ることができる。
更に望ましくはその様な形質転換個体の自殖第二世代
（Ｒ2 世代）において、目的遺伝子と選択マーカー遺伝
子の発現を再度検定することにより、目的とする遺伝子
のみを発現し、選択マーカー遺伝子を持たない目的遺伝
子に関してホモ系統を得ることができる。
世代）で、目的遺伝子と選択マーカー遺伝子の発現を検
定することにより、目的とする遺伝子のみを発現し、選
択マーカー遺伝子を持たない個体を得ることができる。
更に望ましくはその様な形質転換個体の自殖第二世代
（Ｒ2 世代）において、目的遺伝子と選択マーカー遺伝
子の発現を再度検定することにより、目的とする遺伝子
のみを発現し、選択マーカー遺伝子を持たない目的遺伝
子に関してホモ系統を得ることができる。
【００２８】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、
本発明はその要旨を越えない限り本例に制約されるもの
ではない。 （実施例１）ＲＳＶ−ＣＰ遺伝子とｈｐｈ遺伝子を共存
導入した形質転換イネからのｈｐｈ遺伝子の除去 Ｉ．ベクター ＲＳＶのＣＰコーディング領域の５’末端より１１３８
塩基のｃＤＮＡが挿入されたＲＳＶ−ＣＰ発現用ベクタ
ー、ｐＬＡＮ１５０（Ｈａｙａｋａｗａ ｅｔａｌ，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，
９８６５−９８６９，１９９２）及びｈｐｈ発現用ベク
ター、ｐＧＬ２（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏｅｔ ａｌ，Ｎａ
ｔｕｒｅ，３３８，２７４−２７６，１９８９）を用い
た。
本発明はその要旨を越えない限り本例に制約されるもの
ではない。 （実施例１）ＲＳＶ−ＣＰ遺伝子とｈｐｈ遺伝子を共存
導入した形質転換イネからのｈｐｈ遺伝子の除去 Ｉ．ベクター ＲＳＶのＣＰコーディング領域の５’末端より１１３８
塩基のｃＤＮＡが挿入されたＲＳＶ−ＣＰ発現用ベクタ
ー、ｐＬＡＮ１５０（Ｈａｙａｋａｗａ ｅｔａｌ，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，
９８６５−９８６９，１９９２）及びｈｐｈ発現用ベク
ター、ｐＧＬ２（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏｅｔ ａｌ，Ｎａ
ｔｕｒｅ，３３８，２７４−２７６，１９８９）を用い
た。
【００２９】II．形質転換とＲＳＶ−ＣＰ遺伝子の導入
されたカルスの選択、再生 キヌヒカリの完熟種子由来カルスより作成したサスペン
ションは７日ごとに２０ｍｌのＲ2 培地で植え継ぎ維持
したものを用いた。サスペンション１本分に由来する細
胞（湿重ＦＷ約５ｇ）を２０ｍｌの酵素液（４％ セル
ラーゼＲＳ、１％ マセロザイムＲ１０、０．４Ｍ マ
ニトール、ｐＨ５．６）で４〜６時間、３０℃で処理
し、２０μｍのメッシュで濾過した液を１．５容のＫＭ
Ｃ液（１１８ｍＭ塩化カリウム、８１ｍＭ塩化マグネシ
ウム、８５ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ６．０）で希釈
し、遠心分離してプロトプラストを得た。これをＫＭＣ
液で２回洗浄し、ＥＰ３液（７０ｍＭ 塩化カリウム、
５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．４Ｍ マニトール、
０．１％ ＭＥＳ、ｐＨ５．８）でさらに１回洗って細
胞密度８×１０4 個／ｍｌとなるようにＥＰ３液に懸濁
した。
されたカルスの選択、再生 キヌヒカリの完熟種子由来カルスより作成したサスペン
ションは７日ごとに２０ｍｌのＲ2 培地で植え継ぎ維持
したものを用いた。サスペンション１本分に由来する細
胞（湿重ＦＷ約５ｇ）を２０ｍｌの酵素液（４％ セル
ラーゼＲＳ、１％ マセロザイムＲ１０、０．４Ｍ マ
ニトール、ｐＨ５．６）で４〜６時間、３０℃で処理
し、２０μｍのメッシュで濾過した液を１．５容のＫＭ
Ｃ液（１１８ｍＭ塩化カリウム、８１ｍＭ塩化マグネシ
ウム、８５ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ６．０）で希釈
し、遠心分離してプロトプラストを得た。これをＫＭＣ
液で２回洗浄し、ＥＰ３液（７０ｍＭ 塩化カリウム、
５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．４Ｍ マニトール、
０．１％ ＭＥＳ、ｐＨ５．８）でさらに１回洗って細
胞密度８×１０4 個／ｍｌとなるようにＥＰ３液に懸濁
した。
【００３０】キヌヒカリプロトプラスト懸濁液５００μ
ｌ（４×１０6 個）に対しては、上述のＲＳＶ−ＣＰ発
現用ベクター（ｐＬＡＮ１５０）２０μｇとｈｐｈ発現
用ベクター（ｐＧＬ２）２０μｇを加え電気パルスを印
加した（ＰＲＯＭＥＧＡ Ｘ−ＣｅｌｌTM Ｅｌｅｃｔ
ｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、１０００μＦコ
ンデンサ、初期電圧５００Ｖ／ｃｍ、パルス幅２５ｍｓ
ｅｃ、直流減衰波形）。パルス印加前に２０分、印加後
に２０分サンプルを氷中にて冷却し、等量のＲ2 ／Ｂ５
プロトプラストアガロース培地（Ｋｙｏｚｕｋａ ｅｔ
ａｌ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０６，４０
８，１９８７）と混合し、３５ｍｍφのシャーレで固化
させた。これを４分割し６０ｍｍφのシャーレにいれ、
Ｒ2 ／Ｂ５プロトプラスト液体培地５ｍｌとＯＣサスペ
ンション細胞（ナース細胞）約１００ｍｇとを加えて３
０℃暗下で振とう培養した（５０ｒｐｍ）。１０〜１４
日後、２０細胞程度に分裂したときにナース細胞をＫＭ
Ｃ液で洗浄除去し新たなＲ 2 ／Ｂ５プロトプラスト液体
培地５ｍｌを加え、さらにハイグロマイシンＢ３０μｇ
／ｍｌを加えて選抜を開始した。これから３週間後、ア
ガロースビーズをハイグロマイシン３０μｇ／ｍｌを含
むＲ2 増殖培地（Ｋｙｏｚｕｋａ ｅｔ ａｌ，Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０６，４０８，１９８
７）に移し、２週間培養するとアガロース表面に耐性カ
ルスが出現した。このカルスを個別にとり、再びハイグ
ロマイシン３０μｇ／ｍｌを含むＲ2 増殖培地で選抜を
行い、増殖のよい黄色カルスを「耐性カルス」として選
んだ。
ｌ（４×１０6 個）に対しては、上述のＲＳＶ−ＣＰ発
現用ベクター（ｐＬＡＮ１５０）２０μｇとｈｐｈ発現
用ベクター（ｐＧＬ２）２０μｇを加え電気パルスを印
加した（ＰＲＯＭＥＧＡ Ｘ−ＣｅｌｌTM Ｅｌｅｃｔ
ｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、１０００μＦコ
ンデンサ、初期電圧５００Ｖ／ｃｍ、パルス幅２５ｍｓ
ｅｃ、直流減衰波形）。パルス印加前に２０分、印加後
に２０分サンプルを氷中にて冷却し、等量のＲ2 ／Ｂ５
プロトプラストアガロース培地（Ｋｙｏｚｕｋａ ｅｔ
ａｌ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０６，４０
８，１９８７）と混合し、３５ｍｍφのシャーレで固化
させた。これを４分割し６０ｍｍφのシャーレにいれ、
Ｒ2 ／Ｂ５プロトプラスト液体培地５ｍｌとＯＣサスペ
ンション細胞（ナース細胞）約１００ｍｇとを加えて３
０℃暗下で振とう培養した（５０ｒｐｍ）。１０〜１４
日後、２０細胞程度に分裂したときにナース細胞をＫＭ
Ｃ液で洗浄除去し新たなＲ 2 ／Ｂ５プロトプラスト液体
培地５ｍｌを加え、さらにハイグロマイシンＢ３０μｇ
／ｍｌを加えて選抜を開始した。これから３週間後、ア
ガロースビーズをハイグロマイシン３０μｇ／ｍｌを含
むＲ2 増殖培地（Ｋｙｏｚｕｋａ ｅｔ ａｌ，Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０６，４０８，１９８
７）に移し、２週間培養するとアガロース表面に耐性カ
ルスが出現した。このカルスを個別にとり、再びハイグ
ロマイシン３０μｇ／ｍｌを含むＲ2 増殖培地で選抜を
行い、増殖のよい黄色カルスを「耐性カルス」として選
んだ。
【００３１】ハイグロマイシン耐性カルスの一部からゲ
ノムＤＮＡを調製し、ＲＳＶ−ＣＰ遺伝子の一部をプラ
イマーとしたＰＣＲを行うことでＲＳＶ−ＣＰ遺伝子の
導入されたカルスをさらに選抜した。ゲノムＤＮＡはＭ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１１，２７−３４，１
９８８に準じて次のように調製する。ハイグロマイシン
耐性カルス５０〜１００ｍｇを緩衝液（１５％ ショ
糖、５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ
ＮａＥＤＴＡ、５００ｍＭ塩化ナトリウム）中で摩砕
し、核分画を遠心分離する。これを界面活性剤（１．５
％ ＳＤＳ、２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、
１０ｍＭ ＥＤＴＡ）で処理し、遊離した核内成分を
０．６容のイソプロパノールで沈澱させて核酸を得、こ
れを７０％エタノールで洗浄後乾燥させてゲノム分画と
する。この分画１００ｎｇをＰＣＲ法に供した。この
時、プライマーはｐＬＡＮ１５０の３５Ｓプロモーター
領域の１７塩基（５’−ＣＴＣＡＧＡＡＧＡＣＣＡＡＡ
ＧＧＧ−３’：配列表の配列番号１）とＲＳＶ−ＣＰ領
域の１７塩基（５’−ＴＣＴＴＣＣＡＧＧＧＡＧＡＴＡ
ＴＧ−３’：配列表の配列番号２）の相補鎖配列を用い
た（Ｈａｙａｋａｗａ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，９８６５−９８
６９，１９９２）。
ノムＤＮＡを調製し、ＲＳＶ−ＣＰ遺伝子の一部をプラ
イマーとしたＰＣＲを行うことでＲＳＶ−ＣＰ遺伝子の
導入されたカルスをさらに選抜した。ゲノムＤＮＡはＭ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１１，２７−３４，１
９８８に準じて次のように調製する。ハイグロマイシン
耐性カルス５０〜１００ｍｇを緩衝液（１５％ ショ
糖、５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ
ＮａＥＤＴＡ、５００ｍＭ塩化ナトリウム）中で摩砕
し、核分画を遠心分離する。これを界面活性剤（１．５
％ ＳＤＳ、２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、
１０ｍＭ ＥＤＴＡ）で処理し、遊離した核内成分を
０．６容のイソプロパノールで沈澱させて核酸を得、こ
れを７０％エタノールで洗浄後乾燥させてゲノム分画と
する。この分画１００ｎｇをＰＣＲ法に供した。この
時、プライマーはｐＬＡＮ１５０の３５Ｓプロモーター
領域の１７塩基（５’−ＣＴＣＡＧＡＡＧＡＣＣＡＡＡ
ＧＧＧ−３’：配列表の配列番号１）とＲＳＶ−ＣＰ領
域の１７塩基（５’−ＴＣＴＴＣＣＡＧＧＧＡＧＡＴＡ
ＴＧ−３’：配列表の配列番号２）の相補鎖配列を用い
た（Ｈａｙａｋａｗａ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，９８６５−９８
６９，１９９２）。
【００３２】ＰＣＲ法はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃ
ｅｔｕｓ社のＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ機
を用い、同社のＧｅｎｅ−Ａｍｐ ｋｉｔのプロトコー
ルにより試薬を混和し、反応液１００μｌを、熱変性９
４℃、１分、アニーリング６１℃、２分、耐熱性ポリメ
ラーゼによる伸長反応７２℃、３分のサイクルを３０回
繰り返すことで行った。反応後１／１０量をアガロース
ゲル電気泳動で分析し増幅したバンドを検出した。ＲＳ
Ｖ−ＣＰ遺伝子の導入が確認されたカルスを、Ｒ2 再生
培地（Ｋｙｏｚｕｋａ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．
Ｇｅｎｅｔ．，２０６，４０８，１９８７）におき、２
週間毎に培地を交換しながら培養することで、４〜８週
間後に不定胚経由の再生植物を得た。
ｅｔｕｓ社のＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ機
を用い、同社のＧｅｎｅ−Ａｍｐ ｋｉｔのプロトコー
ルにより試薬を混和し、反応液１００μｌを、熱変性９
４℃、１分、アニーリング６１℃、２分、耐熱性ポリメ
ラーゼによる伸長反応７２℃、３分のサイクルを３０回
繰り返すことで行った。反応後１／１０量をアガロース
ゲル電気泳動で分析し増幅したバンドを検出した。ＲＳ
Ｖ−ＣＰ遺伝子の導入が確認されたカルスを、Ｒ2 再生
培地（Ｋｙｏｚｕｋａ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．
Ｇｅｎｅｔ．，２０６，４０８，１９８７）におき、２
週間毎に培地を交換しながら培養することで、４〜８週
間後に不定胚経由の再生植物を得た。
【００３３】この植物の葉より全タンパク質を精製し、
ウェスタン解析によりＲＳＶ−ＣＰ遺伝子の発現を検定
した。幼植物の葉を、０．１％ヨード酢酸及び１％ＳＤ
Ｓを含むトリス緩衝液中で粉砕し、直ちに熱処理を５分
間行った。遠心分離後、その上清を１％ＳＤＳを含む、
１２．５または１５．０％ポリアクリルアミドゲルで電
気泳動した。ナイロン膜（イモビロン）に電気的にブロ
ットし、Ｐｅｒｂａｌの方法（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ７９２−７
９４，１９８８）に従って、アルカリフォスファターゼ
を用い、ナイロン膜をＲＳＶ−ＣＰに特異的な抗体（植
物防疫協会より入手）と反応させることによりＲＳＶ−
ＣＰ遺伝子の発現を確認できる。
ウェスタン解析によりＲＳＶ−ＣＰ遺伝子の発現を検定
した。幼植物の葉を、０．１％ヨード酢酸及び１％ＳＤ
Ｓを含むトリス緩衝液中で粉砕し、直ちに熱処理を５分
間行った。遠心分離後、その上清を１％ＳＤＳを含む、
１２．５または１５．０％ポリアクリルアミドゲルで電
気泳動した。ナイロン膜（イモビロン）に電気的にブロ
ットし、Ｐｅｒｂａｌの方法（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ７９２−７
９４，１９８８）に従って、アルカリフォスファターゼ
を用い、ナイロン膜をＲＳＶ−ＣＰに特異的な抗体（植
物防疫協会より入手）と反応させることによりＲＳＶ−
ＣＰ遺伝子の発現を確認できる。
【００３４】ハイグロマイシン耐性カルスより得られた
再生個体１９個体中１３個体でＲＳＶ−ＣＰ遺伝子の発
現を確認した。これらＲＳＶ−ＣＰ遺伝子の発現が確認
された幼植物をバーミキュライトと水稲育苗用培土を混
合したものに移植し、馴化した後、温室で育成した。３
〜６ヶ月後に成熟したイネになり種子（Ｒ1 種子）を形
成した。
再生個体１９個体中１３個体でＲＳＶ−ＣＰ遺伝子の発
現を確認した。これらＲＳＶ−ＣＰ遺伝子の発現が確認
された幼植物をバーミキュライトと水稲育苗用培土を混
合したものに移植し、馴化した後、温室で育成した。３
〜６ヶ月後に成熟したイネになり種子（Ｒ1 種子）を形
成した。
【００３５】III．Ｒ1 世代及びＲ2 世代でのＲＳＶ−
ＣＰ遺伝子及びｈｐｈ遺伝子の確認（表１） 上述の方法で得られた形質転換イネのＲ1 種子を、トリ
フミン乳剤（０．０５％ トリフミゾール）で２４〜４
８時間種子消毒し、常法に従い、発芽育苗し、幼植物で
上述したＰＣＲ法によりＲＳＶ−ＣＰ遺伝子とｈｐｈ遺
伝子の存在を検定した。
ＣＰ遺伝子及びｈｐｈ遺伝子の確認（表１） 上述の方法で得られた形質転換イネのＲ1 種子を、トリ
フミン乳剤（０．０５％ トリフミゾール）で２４〜４
８時間種子消毒し、常法に従い、発芽育苗し、幼植物で
上述したＰＣＲ法によりＲＳＶ−ＣＰ遺伝子とｈｐｈ遺
伝子の存在を検定した。
【００３６】ＲＳＶ−ＣＰ遺伝子のＰＣＲには上述した
プライマーを用いて、また、ｈｐｈ遺伝子のＰＣＲに
は、プライマーとして３５Ｓプロモーター領域の１７塩
基（５’−ＧＣＡＡＧＴＧＧＡＴＴＧＡＴＧＴＧ−
３’：配列表の配列番号３）とｈｐｈ遺伝子コーディン
グ領域の１７塩基（５’−ＧＧＴＧＡＧＴＴＣＡＧＧＣ
ＴＴＴＴ−３’：配列表の配列番号４）の相補鎖配列を
用いた（Ｉｚａｗａ ｅｔａｌ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎｅｔ．，２２７，３９１−３９６，１９９１）。
プライマーを用いて、また、ｈｐｈ遺伝子のＰＣＲに
は、プライマーとして３５Ｓプロモーター領域の１７塩
基（５’−ＧＣＡＡＧＴＧＧＡＴＴＧＡＴＧＴＧ−
３’：配列表の配列番号３）とｈｐｈ遺伝子コーディン
グ領域の１７塩基（５’−ＧＧＴＧＡＧＴＴＣＡＧＧＣ
ＴＴＴＴ−３’：配列表の配列番号４）の相補鎖配列を
用いた（Ｉｚａｗａ ｅｔａｌ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎｅｔ．，２２７，３９１−３９６，１９９１）。
【００３７】その結果、７系統でＲＳＶ−ＣＰ遺伝子と
ｈｐｈ遺伝子が独立に遺伝し、ＲＳＶ−ＣＰ遺伝子が検
出されるがｈｐｈ遺伝子は検出されなかった個体を見い
だした。これらＲ1 個体を温室にて育成し、Ｒ2 種子を
得た。ＲＳＶ−ＣＰ遺伝子の発現はウェスタン解析によ
り確認した。即ち、上述した方法で得られたＲ2 世代の
幼植物５０個体を、上述した方法でウェスタン解析した
ところ、ＲＳＶ−ＣＰ遺伝子がＰＣＲ法で検出されたＲ
1 個体由来のＲ2 系統では、５０個体すべてがＲＳＶ−
ＣＰ遺伝子を発現している系統、一部の個体で発現して
いる系統が得られた。また、ＲＳＶ−ＣＰ遺伝子が検出
できなかったＲ 1 由来のＲ2 系統ではＲＳＶ−ＣＰ発現
個体は認められなかった。
ｈｐｈ遺伝子が独立に遺伝し、ＲＳＶ−ＣＰ遺伝子が検
出されるがｈｐｈ遺伝子は検出されなかった個体を見い
だした。これらＲ1 個体を温室にて育成し、Ｒ2 種子を
得た。ＲＳＶ−ＣＰ遺伝子の発現はウェスタン解析によ
り確認した。即ち、上述した方法で得られたＲ2 世代の
幼植物５０個体を、上述した方法でウェスタン解析した
ところ、ＲＳＶ−ＣＰ遺伝子がＰＣＲ法で検出されたＲ
1 個体由来のＲ2 系統では、５０個体すべてがＲＳＶ−
ＣＰ遺伝子を発現している系統、一部の個体で発現して
いる系統が得られた。また、ＲＳＶ−ＣＰ遺伝子が検出
できなかったＲ 1 由来のＲ2 系統ではＲＳＶ−ＣＰ発現
個体は認められなかった。
【００３８】次に上述のＲＳＶ−ＣＰ遺伝子のウェスタ
ン解析に用いたものとは別の５０粒のＲ2 種子を用いて
ハイグロマイシン耐性試験を行った。ｈｐｈ遺伝子の発
現は種子をハイグロマイシン２０μｇ／ｍｌ含むＲ2 基
本倍地で発芽させることにより、ｈｐｈ遺伝子を発現し
ている個体のみが健全に発芽・成長することにより、容
易に判定できる（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｎ
ａｔｕｒｅ，３３８，２７４−２７６，１９８９）。
ン解析に用いたものとは別の５０粒のＲ2 種子を用いて
ハイグロマイシン耐性試験を行った。ｈｐｈ遺伝子の発
現は種子をハイグロマイシン２０μｇ／ｍｌ含むＲ2 基
本倍地で発芽させることにより、ｈｐｈ遺伝子を発現し
ている個体のみが健全に発芽・成長することにより、容
易に判定できる（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｎ
ａｔｕｒｅ，３３８，２７４−２７６，１９８９）。
【００３９】本方法を用いてＲ2 種子を検定したとこ
ろ、ｈｐｈ遺伝子がＰＣＲ法により確認されたＲ1 由来
のＲ2 系統では全個体あるいは一部の個体がハイグロマ
イシン耐性を示し、ｈｐｈ遺伝子の確認されなかったＲ
1 由来のＲ2 系統では全個体でハイグロマイシン耐性は
示さなかった。このことより、ＲＳＶ−ＣＰ遺伝子とｈ
ｐｈ遺伝子を共存導入法により導入した形質転換イネの
自殖次世代でＲＳＶ−ＣＰ遺伝子のみを持ち、ｈｐｈ遺
伝子を持たない個体が得られ、このような個体の自殖次
世代（Ｒ2 世代）でＲＳＶ−ＣＰ遺伝子を発現し、かつ
ｈｐｈ遺伝子を持たない系統が得られたことは明らかで
ある。
ろ、ｈｐｈ遺伝子がＰＣＲ法により確認されたＲ1 由来
のＲ2 系統では全個体あるいは一部の個体がハイグロマ
イシン耐性を示し、ｈｐｈ遺伝子の確認されなかったＲ
1 由来のＲ2 系統では全個体でハイグロマイシン耐性は
示さなかった。このことより、ＲＳＶ−ＣＰ遺伝子とｈ
ｐｈ遺伝子を共存導入法により導入した形質転換イネの
自殖次世代でＲＳＶ−ＣＰ遺伝子のみを持ち、ｈｐｈ遺
伝子を持たない個体が得られ、このような個体の自殖次
世代（Ｒ2 世代）でＲＳＶ−ＣＰ遺伝子を発現し、かつ
ｈｐｈ遺伝子を持たない系統が得られたことは明らかで
ある。
【００４０】
【表１】 表１ ＲＳＶ−ＣＰ遺伝子とｈｐｈ遺伝子を共存導入した形質転換イネの自殖 後代でのＲＳＶ−ＣＰ遺伝子とｈｐｈ遺伝子の分離 ──────────────────────────────────── Ｒ0 Ｒ1 Ｒ1世代 Ｒ2世代 個体番号 個体番号 ＣＰ ｈｐｈ ＣＰ ｈｐｈ Ｒ2 系統名 ──────────────────────────────────── １ １− １ ＋ − ５０／５０1) ０／５０ １− ２ ＋ − ３５／５０ ０／５０ １− ３ ＋ ＋ ５０／５０ ５０／５０ １− ４ ＋ ＋ ４０／５０ ５０／５０ １− ５ ＋ ＋ ５０／５０ ３５／５０ １− ６ ＋ ＋ ３８／５０ ３５／５０ １− ７ − − ０／５０ ０／５０ １− ８ − − ０／５０ ０／５０ １− ９ − − ０／５０ ０／５０ １−１０ − ＋ ０／５０ ５０／５０ ──────────────────────────────────── ２ ２− １ ＋ − ５０／５０ ０／５０ ２− ２ ＋ − ５０／５０ ０／５０ ２− ３ ＋ − ２６／５０ ０／５０ ２− ４ ＋ − ３９／５０ ０／５０ ２− ５ ＋ ＋ ５０／５０ ５０／５０ ２− ６ ＋ ＋ ４０／５０ ５０／５０ ２− ７ ＋ ＋ ５０／５０ ３５／５０ ２− ８ ＋ ＋ ３８／５０ ３５／５０ ２− ９ − − ０／５０ ０／５０ ２−１０ − ＋ ０／５０ ５０／５０ ──────────────────────────────────── ３ ３− １ ＋ − ５０／５０ ０／５０ ３− ２ ＋ − ５０／５０ ０／５０ ３− ３ ＋ − ３３／５０ ０／５０ ３− ４ ＋ ＋ ５０／５０ ５０／５０ ３− ５ ＋ ＋ ４０／５０ ２９／５０ ３− ６ − − ０／５０ ０／５０ ３− ７ − − ０／５０ ０／５０ ３− ８ − ＋ ０／５０ ５０／５０ ３− ９ − ＋ ０／５０ ５０／５０ ３−１０ − ＋ ０／５０ ３３／５０ ──────────────────────────────────── １） （遺伝子発現個体数）／（供試個体数） 注） １−１、２−１，２−２、３−１、３−２ではＲ
ＳＶ−ＣＰ遺伝子のみを持ちｈｐｈ遺伝子は除去されて
いる。 （実施例２）Ｗｘ遺伝子とｈｐｈ遺伝子を共存導入した
形質転換イネからのｈｐｈ遺伝子の除去 Ｉ．ベクターの構築（ｐＷｓｅｎｓｅＣＷ） このベクターはＷｘタンパク質を発現しているうるち米
あるいは発現していないもち米に、品種名ラベルのＷｘ
タンパク質を作らせる構造をしており、Ｗｘプロモータ
ーの下流にＷｘセンスｃＤＮＡ、ＮＯＳターミネーター
を持つ。
ＳＶ−ＣＰ遺伝子のみを持ちｈｐｈ遺伝子は除去されて
いる。 （実施例２）Ｗｘ遺伝子とｈｐｈ遺伝子を共存導入した
形質転換イネからのｈｐｈ遺伝子の除去 Ｉ．ベクターの構築（ｐＷｓｅｎｓｅＣＷ） このベクターはＷｘタンパク質を発現しているうるち米
あるいは発現していないもち米に、品種名ラベルのＷｘ
タンパク質を作らせる構造をしており、Ｗｘプロモータ
ーの下流にＷｘセンスｃＤＮＡ、ＮＯＳターミネーター
を持つ。
【００４１】まず、Ｗｘプロモーターについて説明す
る。Ｗｘ遺伝子全域をカバーするＨｉｎｄIII １５ｋ
ｂ断片（Ｏｋａｇａｋｉ ａｎｄ Ｗｅｎｌｅｒ，Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ，１２０，１１３７−１１４３，１９８８
の図４）を制限酵素を用いて分析すると、転写領域をも
つＥｃｏＲＩ ６ｋｂ断片の５’側に隣接してＥｃｏＲ
Ｉ ３ｋｂ断片があることがわかる。この断片にＷｘ遺
伝子のプロモーターがあることは容易に推察できるが、
我々の実験によれば、この断片をＧＵＳレポーター遺伝
子、ＮＯＳターミネーターと連結したプラスミド（Ｊｅ
ｆｆｅｒｓｏｎｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ，６，３９０
１−３９０７，１９８７；ｐＢ１２２１の３５Ｓプロモ
ーターをＷｘプロモーターと置換することで得られる）
は、イネプロトプラストを用いたトランジェントアッセ
イにおいてプロモーターとして機能することを確認して
いる。そこでこのＥｃｏＲＩ断片をプロモーターとして
用いることとした。この断片はＨｉｎｄIII １５ｋｂ
断片を持つｐＵＣプラスミドをＥｃｏＲＩで切断すれば
３ｋｂのバンドとして得られる。
る。Ｗｘ遺伝子全域をカバーするＨｉｎｄIII １５ｋ
ｂ断片（Ｏｋａｇａｋｉ ａｎｄ Ｗｅｎｌｅｒ，Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ，１２０，１１３７−１１４３，１９８８
の図４）を制限酵素を用いて分析すると、転写領域をも
つＥｃｏＲＩ ６ｋｂ断片の５’側に隣接してＥｃｏＲ
Ｉ ３ｋｂ断片があることがわかる。この断片にＷｘ遺
伝子のプロモーターがあることは容易に推察できるが、
我々の実験によれば、この断片をＧＵＳレポーター遺伝
子、ＮＯＳターミネーターと連結したプラスミド（Ｊｅ
ｆｆｅｒｓｏｎｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ，６，３９０
１−３９０７，１９８７；ｐＢ１２２１の３５Ｓプロモ
ーターをＷｘプロモーターと置換することで得られる）
は、イネプロトプラストを用いたトランジェントアッセ
イにおいてプロモーターとして機能することを確認して
いる。そこでこのＥｃｏＲＩ断片をプロモーターとして
用いることとした。この断片はＨｉｎｄIII １５ｋｂ
断片を持つｐＵＣプラスミドをＥｃｏＲＩで切断すれば
３ｋｂのバンドとして得られる。
【００４２】ＮＯＳターミネーターは、ｐＣａＭＶｎｅ
ｏ（Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３１９，
７１９−７９３，１９８６）１０μｇをＰｓｔＩとＨｉ
ｎｄIIIで切断（ＴＯＹＯＢＯの処方２０μｌ ３７℃
１時間）し、アガロースゲルで分画すれば０．２７ｋ
ｂのバンドとして得ることができるので、これをプラス
ミドｐＵＣ１９のＰｓｔＩ−ＨｉｎｄIII部位に挿入し
た。
ｏ（Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３１９，
７１９−７９３，１９８６）１０μｇをＰｓｔＩとＨｉ
ｎｄIIIで切断（ＴＯＹＯＢＯの処方２０μｌ ３７℃
１時間）し、アガロースゲルで分画すれば０．２７ｋ
ｂのバンドとして得ることができるので、これをプラス
ミドｐＵＣ１９のＰｓｔＩ−ＨｉｎｄIII部位に挿入し
た。
【００４３】ＮＯＳターミネーターの５’上流にあるＥ
ｃｏＲＩ部位に前述のＥｃｏＲＩ３ｋｂ断片を順方向に
挿入しＷｘプロモーターとＮＯＳターミネーターとを連
結した。このプラスミドにはＥｃｏＲＩ部位が２カ所あ
るので、このプラスミド１０μｇを１００μｌの系でＥ
ｃｏＲＩ １０μを加えて１、２、５、１０分反応させ
てＥｃｏＲＩによる部分分解物を得、エタノール沈澱の
後Ｋｌｅｎｏｗフラグメント（ＴＯＹＯＢＯの処方）で
修復して自己環化させ、トランスフォーマントの中か
ら、Ｗｘ−ＮＯＳの間にだけＥｃｏＲＩ部位を残したプ
ラスミドを得た（ｐＷａｎｔｉＣＷ’）。
ｃｏＲＩ部位に前述のＥｃｏＲＩ３ｋｂ断片を順方向に
挿入しＷｘプロモーターとＮＯＳターミネーターとを連
結した。このプラスミドにはＥｃｏＲＩ部位が２カ所あ
るので、このプラスミド１０μｇを１００μｌの系でＥ
ｃｏＲＩ １０μを加えて１、２、５、１０分反応させ
てＥｃｏＲＩによる部分分解物を得、エタノール沈澱の
後Ｋｌｅｎｏｗフラグメント（ＴＯＹＯＢＯの処方）で
修復して自己環化させ、トランスフォーマントの中か
ら、Ｗｘ−ＮＯＳの間にだけＥｃｏＲＩ部位を残したプ
ラスミドを得た（ｐＷａｎｔｉＣＷ’）。
【００４４】一方、Ｗｘ遺伝子のｃＤＮＡは以下のよう
にして調製した。イネアメリカ長粒種ラベルの開花後６
〜８日のミルキーな胚乳１０ｇからフェノールＳＤＳ法
（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）により全ＲＮＡをと
り、ファルマシアｍＲＮＡピューリフィケイションキッ
トを用いてｍＲＮＡを精製した。その５μｇを鋳型にし
てファルマシアｃＤＮＡ合成キットを用いてｃＤＮＡを
得て、これをｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位に挿入してつ
くったｃＤＮＡライブラリに対して、トウモロコシのＷ
ｘ遺伝子プローブ（Ｏｋａｇａｋｉ ａｎｄ Ｗｅｎｌ
ｅｒ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２０，１１３７−１１４
３，１９８８の図３−＃２）を用いてスクリーニングを
行い（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、２．７
ｋｂのＷｘ ｃＤＮＡを得た。このクローンはＷｘ遺伝
子の全翻訳領域を持ち、０．４５ｋｂのリーダー配列を
もつ。
にして調製した。イネアメリカ長粒種ラベルの開花後６
〜８日のミルキーな胚乳１０ｇからフェノールＳＤＳ法
（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）により全ＲＮＡをと
り、ファルマシアｍＲＮＡピューリフィケイションキッ
トを用いてｍＲＮＡを精製した。その５μｇを鋳型にし
てファルマシアｃＤＮＡ合成キットを用いてｃＤＮＡを
得て、これをｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位に挿入してつ
くったｃＤＮＡライブラリに対して、トウモロコシのＷ
ｘ遺伝子プローブ（Ｏｋａｇａｋｉ ａｎｄ Ｗｅｎｌ
ｅｒ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２０，１１３７−１１４
３，１９８８の図３−＃２）を用いてスクリーニングを
行い（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、２．７
ｋｂのＷｘ ｃＤＮＡを得た。このクローンはＷｘ遺伝
子の全翻訳領域を持ち、０．４５ｋｂのリーダー配列を
もつ。
【００４５】上述したプラスミドｐＷａｎｔｉＣＷ’を
ＥｃｏＲＩで線状化し、Ｗｘ ｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ断
片（２．７ｋｂ）を順方向に連結することで、Ｗｘ遺伝
子発現用ベクターｐＷｓｅｎｓｅＣＷが得られる。 II．形質転換とＷｘ遺伝子の導入されたカルスの選抜、
再生 糯米（祝糯、むさしもち）の完熟種子由来カルスより作
製したサスペンションからプロトプラストを調製し、上
述したＷｘ遺伝子発現用ベクター、ｐＷｓｅｎｓｅＣＷ
と、実施例１で述べたｈｐｈ遺伝子発現用ベクターｐＧ
Ｌ２を、実施例１と同様に、同時にイネプロトプラスト
に導入し、ハイグロマイシン耐性カルスを得た。
ＥｃｏＲＩで線状化し、Ｗｘ ｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ断
片（２．７ｋｂ）を順方向に連結することで、Ｗｘ遺伝
子発現用ベクターｐＷｓｅｎｓｅＣＷが得られる。 II．形質転換とＷｘ遺伝子の導入されたカルスの選抜、
再生 糯米（祝糯、むさしもち）の完熟種子由来カルスより作
製したサスペンションからプロトプラストを調製し、上
述したＷｘ遺伝子発現用ベクター、ｐＷｓｅｎｓｅＣＷ
と、実施例１で述べたｈｐｈ遺伝子発現用ベクターｐＧ
Ｌ２を、実施例１と同様に、同時にイネプロトプラスト
に導入し、ハイグロマイシン耐性カルスを得た。
【００４６】Ｗｘ遺伝子の組み込まれたカルスの検出の
ためにＰＣＲを行うが、このプライマーとしてＷｘ ｃ
ＤＮＡの＋鎖の第２、第３エクソンにまたがる１８塩基
（５’−ＧＣＣＡＴＧＧＣＴ／ＧＣＧＡＡＴＧＧＣ−
３’：配列表の配列番号５）と、−鎖の第４、第５エク
ソンにまたがる１７塩基（５’−ＴＣＣＣＣＡＡＡＣ／
ＣＴＴＣＴＣＣＡ−３’：配列表の配列番号６）を用い
た。また、再生体の葉より（Ｗａｌｂｏｔ ａｎｄ Ｗ
ａｒｒｅｎ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１１，
２７−３４，１９８８）の方法に準じて抽出したゲノミ
ックＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、Ｗｘ遺伝子のｃＤＮ
Ａをプローブにしてサザン解析を行い、導入した２．７
ｋｂのバンドを検出した。以下、実施例１と同様に処理
し、成熟イネを育成し、Ｒ1 種子を得た。
ためにＰＣＲを行うが、このプライマーとしてＷｘ ｃ
ＤＮＡの＋鎖の第２、第３エクソンにまたがる１８塩基
（５’−ＧＣＣＡＴＧＧＣＴ／ＧＣＧＡＡＴＧＧＣ−
３’：配列表の配列番号５）と、−鎖の第４、第５エク
ソンにまたがる１７塩基（５’−ＴＣＣＣＣＡＡＡＣ／
ＣＴＴＣＴＣＣＡ−３’：配列表の配列番号６）を用い
た。また、再生体の葉より（Ｗａｌｂｏｔ ａｎｄ Ｗ
ａｒｒｅｎ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１１，
２７−３４，１９８８）の方法に準じて抽出したゲノミ
ックＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、Ｗｘ遺伝子のｃＤＮ
Ａをプローブにしてサザン解析を行い、導入した２．７
ｋｂのバンドを検出した。以下、実施例１と同様に処理
し、成熟イネを育成し、Ｒ1 種子を得た。
【００４７】III．Ｒ1 種子でのＷｘ遺伝子とｈｐｈ遺
伝子の発現の分離 Ｒ1 種子を長軸短軸方向に垂直面で切断し、胚を含まな
い胚乳部分と胚を含む胚及び胚乳部分に分割した。胚乳
部分より得られた切片（１ｍｍ幅）を、ヨード液中にお
き浸透させた。５分後糯米では白色、粳米では黒紫色を
呈するのに対し、Ｗｘ遺伝子の導入された個体では、糯
米型の白色以外に粳米型の黒紫色及び両者の中間型を呈
するものが確認された。
伝子の発現の分離 Ｒ1 種子を長軸短軸方向に垂直面で切断し、胚を含まな
い胚乳部分と胚を含む胚及び胚乳部分に分割した。胚乳
部分より得られた切片（１ｍｍ幅）を、ヨード液中にお
き浸透させた。５分後糯米では白色、粳米では黒紫色を
呈するのに対し、Ｗｘ遺伝子の導入された個体では、糯
米型の白色以外に粳米型の黒紫色及び両者の中間型を呈
するものが確認された。
【００４８】また、胚及び胚乳部分を用いてハイグロマ
イシン耐性試験を行った。胚及び胚乳部分は１．２％次
亜塩素酸で殺菌し、ハイグロマイシンを２０μｇ／ｍｌ
含むＲ2 培地で常法通りに発芽させた。１０日後にはｈ
ｐｈ遺伝子の発現している健全に発芽する個体が確認さ
れた。また同時にｈｐｈ遺伝子の存在の有無は実施例１
と同様にＰＣＲ法でも確認した。
イシン耐性試験を行った。胚及び胚乳部分は１．２％次
亜塩素酸で殺菌し、ハイグロマイシンを２０μｇ／ｍｌ
含むＲ2 培地で常法通りに発芽させた。１０日後にはｈ
ｐｈ遺伝子の発現している健全に発芽する個体が確認さ
れた。また同時にｈｐｈ遺伝子の存在の有無は実施例１
と同様にＰＣＲ法でも確認した。
【００４９】上述の方法により、同一個体のＷｘ遺伝子
とｈｐｈ遺伝子の発現を調査したところ表２に示すよう
に、Ｗｘ遺伝子のみを有し、ｈｐｈ遺伝子を持たない個
体が確認され、マーカー遺伝子は除去された。
とｈｐｈ遺伝子の発現を調査したところ表２に示すよう
に、Ｗｘ遺伝子のみを有し、ｈｐｈ遺伝子を持たない個
体が確認され、マーカー遺伝子は除去された。
【００５０】
【表２】 表２ Ｗｘ遺伝子とｈｐｈ遺伝子を共存導入した形質転換イネの自殖 後代でのＷｘ遺伝子とｈｐｈ遺伝子の分離 ────────────────────────── Ｒ0 Ｒ1 Ｒ1世代 個体番号 個体番号 Ｗｘ ｈｐｈ ────────────────────────── １ １− １ ＋ − １− ２ ＋ − １− ３ ＋ − １− ４ ＋ − １− ５ ＋ ＋ １− ６ ＋ ＋ １− ７ ＋ ＋ １− ８ ＋ ＋ １− ９ ＋ ＋ １−１０ ＋ ＋ １−１１ ＋ ＋ １−１２ ＋ ＋ １−１３ ＋ ＋ １−１４ − − １−１５ − − １−１６ − − １−１７ − ＋ １−１８ − ＋ １−１９ − ＋ １−２０ − ＋ ────────────────────────── ２ ２− １ ＋ − ２− ２ ＋ − ２− ３ ＋ − ２− ４ ＋ ＋ ２− ５ ＋ ＋ ２− ６ ＋ ＋ ２− ７ ＋ ＋ ２− ８ ＋ ＋ ２− ９ ＋ ＋ ２−１０ ＋ ＋ ２−１１ ＋ ＋ ２−１２ ＋ ＋ ２−１３ − − ２−１４ − − ２−１５ − − ２−１６ − ＋ ２−１７ − ＋ ２−１８ − ＋ ２−１９ − ＋ ２−２０ − ＋ ────────────────────────── （実施例３）ＧＵＳ遺伝子とｈｐｈ遺伝子を共存導入し
た形質転換イネからのｈｐｈ遺伝子の除去 Ｉ．ベクター ＧＵＳ遺伝子としては大腸菌由来のβ−グルキュロニダ
ーゼ遺伝子の全翻訳領域を含む断片にカリフラワーモザ
イクウイルス３５Ｓプロモーター、ＮＯＳターミネータ
ーを連結したｐＢＩ２２１（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ
ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ，６，３９０１−３９０７，１９
８７）を用いた。
た形質転換イネからのｈｐｈ遺伝子の除去 Ｉ．ベクター ＧＵＳ遺伝子としては大腸菌由来のβ−グルキュロニダ
ーゼ遺伝子の全翻訳領域を含む断片にカリフラワーモザ
イクウイルス３５Ｓプロモーター、ＮＯＳターミネータ
ーを連結したｐＢＩ２２１（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ
ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ，６，３９０１−３９０７，１９
８７）を用いた。
【００５１】このＧＵＳ遺伝子発現用ベクターｐＢＩ２
２１を実施例１同様に、日本晴由来プロトプラストに、
ｈｐｈ遺伝子発現用ベクターｐＧＬ２と同時に共存導入
し、ハイグロマイシン耐性カルスを得た。以下、実施例
１同様にＲ1 種子を得た。 II．Ｒ1 種子でのＧＵＳ遺伝子とｈｐｈ遺伝子の発現の
分離 Ｒ1 種子を長軸短軸方向に垂直面で切断し、胚を含まな
い胚乳部分と胚を含む胚及び胚乳部分に分割した。
２１を実施例１同様に、日本晴由来プロトプラストに、
ｈｐｈ遺伝子発現用ベクターｐＧＬ２と同時に共存導入
し、ハイグロマイシン耐性カルスを得た。以下、実施例
１同様にＲ1 種子を得た。 II．Ｒ1 種子でのＧＵＳ遺伝子とｈｐｈ遺伝子の発現の
分離 Ｒ1 種子を長軸短軸方向に垂直面で切断し、胚を含まな
い胚乳部分と胚を含む胚及び胚乳部分に分割した。
【００５２】胚乳部分より得られた切片（１ｍｍ幅）
を、ｘ−Ｇｌｕｃを１０ｍＭ含む水溶液中におき３７℃
でインキュベートした。１６時間後濃紺色を呈するＧＵ
Ｓ遺伝子の発現している個体を確認した。また、胚及び
胚乳部分を用いて実施例２同様にハイグロマイシン耐性
試験及びハイグロマイシン耐性遺伝子の有無を実施例１
と同様にＰＣＲ法で確認した。
を、ｘ−Ｇｌｕｃを１０ｍＭ含む水溶液中におき３７℃
でインキュベートした。１６時間後濃紺色を呈するＧＵ
Ｓ遺伝子の発現している個体を確認した。また、胚及び
胚乳部分を用いて実施例２同様にハイグロマイシン耐性
試験及びハイグロマイシン耐性遺伝子の有無を実施例１
と同様にＰＣＲ法で確認した。
【００５３】上述の方法により、同一個体のＧＵＳ遺伝
子とｈｐｈ遺伝子の発現を調査したところ表３に示すよ
うに、ＧＵＳ遺伝子のみ発現し、ｈｐｈ遺伝子を発現し
ていない個体が確認され、マーカー遺伝子は除去され
た。
子とｈｐｈ遺伝子の発現を調査したところ表３に示すよ
うに、ＧＵＳ遺伝子のみ発現し、ｈｐｈ遺伝子を発現し
ていない個体が確認され、マーカー遺伝子は除去され
た。
【００５４】
【表３】 表３ ＧＵＳ遺伝子とｈｐｈ遺伝子を共存導入した形質転換 イネの自殖後代でのＧＵＳ遺伝子とｈｐｈ遺伝子の分離 ────────────────────────── Ｒ0 Ｒ1 Ｒ1世代 個体番号 個体番号 ＧＵＳ ｈｐｈ ────────────────────────── １ １− １ ＋ − １− ２ ＋ − １− ３ ＋ − １− ４ ＋ ＋ １− ５ ＋ ＋ １− ６ ＋ ＋ １− ７ ＋ ＋ １− ８ ＋ ＋ １− ９ ＋ ＋ １−１０ ＋ ＋ １−１１ ＋ ＋ １−１２ ＋ ＋ １−１３ ＋ ＋ １−１４ ＋ ＋ １−１５ − − １−１６ − − １−１７ − − １−１８ − ＋ １−１９ − ＋ １−２０ − ＋ ────────────────────────── ２ ２− １ ＋ − ２− ２ ＋ − ２− ３ ＋ − ２− ４ ＋ − ２− ５ ＋ − ２− ６ ＋ ＋ ２− ７ ＋ ＋ ２− ８ ＋ ＋ ２− ９ ＋ ＋ ２−１０ ＋ ＋ ２−１１ ＋ ＋ ２−１２ ＋ ＋ ２−１３ ＋ ＋ ２−１４ ＋ ＋ ２−１５ ＋ ＋ ２−１６ − − ２−１７ − − ２−１８ − ＋ ２−１９ − ＋ ２−２０ − ＋ ────────────────────────── ３ ３− １ ＋ − ３− ２ ＋ − ３− ３ ＋ − ３− ４ ＋ ＋ ３− ５ ＋ ＋ ３− ６ ＋ ＋ ３− ７ ＋ ＋ ３− ８ ＋ ＋ ３− ９ ＋ ＋ ３−１０ ＋ ＋ ３−１１ ＋ ＋ ３−１２ ＋ ＋ ３−１３ − − ３−１４ − − ３−１５ − − ３−１６ − ＋ ３−１７ − ＋ ３−１８ − ＋ ３−１９ − ＋ ３−２０ − ＋ ──────────────────────────
【００５５】
【発明の効果】本発明の方法によれば、形質転換植物か
ら不要なマーカー遺伝子を容易に除去することが可能と
なり、かかる方法を用いてマーカー遺伝子が除去された
形質転換植物を作出することができる。
ら不要なマーカー遺伝子を容易に除去することが可能と
なり、かかる方法を用いてマーカー遺伝子が除去された
形質転換植物を作出することができる。
【００５６】
配列番号：１ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTCAGAAGAC CAAAGGG 17
【００５７】配列番号：２ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCTTCCAGGG AGATATG 17
【００５８】配列番号：３ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCAAGTGGAT TGATGTG 17
【００５９】配列番号：４ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGTGAGTTCA GGCTTTT 17
【００６０】配列番号：５ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCCATGGCTG CGAATGGC 18
【００６１】配列番号：６ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：ＹＥＳ 配列 TCCCCAAACC TTCTCCA 17
Claims (2)
- 【請求項１】 それぞれが異種プラスミド由来の外来遺
伝子およびマーカー遺伝子を有する形質転換植物体の次
世代以降の子孫を育種して外来遺伝子のみを有する品種
を選抜することを特徴とするマーカー遺伝子の除去方
法。 - 【請求項２】 外来遺伝子を有するプラスミドおよびマ
ーカー遺伝子を有するプラスミドからなる複数異種のプ
ラスミドを植物組織または植物組織に由来する細胞に共
存導入して形質転換し、該形質転換体から再生した植物
体の次世代以降の子孫を育種することを特徴とするマー
カー遺伝子の除去された形質転換植物の作出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7380293A JPH06276872A (ja) | 1993-03-31 | 1993-03-31 | マーカー遺伝子の除去方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7380293A JPH06276872A (ja) | 1993-03-31 | 1993-03-31 | マーカー遺伝子の除去方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06276872A true JPH06276872A (ja) | 1994-10-04 |
Family
ID=13528672
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7380293A Pending JPH06276872A (ja) | 1993-03-31 | 1993-03-31 | マーカー遺伝子の除去方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06276872A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0716147A2 (en) | 1994-11-09 | 1996-06-12 | Nippon Paper Industries Co., Ltd. | Methods for producing transgenic plants |
| KR101330031B1 (ko) * | 2011-11-17 | 2013-11-15 | 대한민국 | 합성 재조합효소 유전자 및 이를 이용한 선발표지 유전자 제거용 식물형질전환 벡터 |
-
1993
- 1993-03-31 JP JP7380293A patent/JPH06276872A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0716147A2 (en) | 1994-11-09 | 1996-06-12 | Nippon Paper Industries Co., Ltd. | Methods for producing transgenic plants |
| KR101330031B1 (ko) * | 2011-11-17 | 2013-11-15 | 대한민국 | 합성 재조합효소 유전자 및 이를 이용한 선발표지 유전자 제거용 식물형질전환 벡터 |
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