JP3377508B2 - 植物細胞中のｄｎａの部位特異的組み換え - Google Patents

植物細胞中のｄｎａの部位特異的組み換え

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【関連出願の相互参照】この出願は１９８９年１２月２
２日提出の米国特許出願第０７／４５５，２２１号の一
部継続出願である。
【０００２】
【発明の分野】本発明は、植物の中のＤＮＡの部位特異
的組み換え（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｃｏｍｂ
ｉｎａｔｉｏｎ）を生成する方法、および組み換え系の
ｌｏｘおよびｃｒｅ成分を導入しかつ発現するために使
用する新規な組み換えＤＮＡ構成体、ならびにトランス
ジェニックｌｏｘおよびｃｒｅを含有する植物およびそ
れらの種子に関する。
【０００３】
【発明の背景】種々の材料、系および有機体は系を導入
してＤＮＡを操作するための遺伝子工学の主題である。
【０００４】アブレムスキ（Ａｂｒｅｍｓｋｉ）ら、細
胞（Ｃｅｌｌ）、３２：１３０１−１３１１（１９８
３）は、バクテリオファージＰ１の部位特異的組み換え
を開示している。この系はｌｏｘＰと表示する組み換え
部位およびＣｒｅと表示する組み換え酵素から成る。ス
ーパーコイルの切り込み円形または直線ＤＮＡ上のｌｏ
ｘＰの間の組み換えは、Ｃｒｅの存在下に起こる。
【０００５】サウエル（Ｓａｕｅｒ）、分子および細胞
の生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｒ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、７：２０８７−２０９６（１
９８７）は、ｌｏｘＰ−ｃｒｅ組み換え系が酵母菌サッ
カロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の中で機能することを開示
している。この系を使用して、酵母菌のゲノムの中に導
入された２つのｌｏｘ部位の間の遺伝子を切除した。Ｃ
ｒｅは誘導可能な酵母菌ＧＡＬ１プロモーターから発現
され、そしてこのｃｒｅ遺伝子は自律的に複製する酵母
菌ベクター上に位置した。
【０００６】サウエル（Ｓａｕｅｒ）およびヘンダーソ
ン（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ）、プロシーディングス・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８５：
５１６６−５１７０（１９８８）は、ｌｏｘＰ−ｃｒｅ
組み換え系が組織培養においてマウス細胞の中で一時的
方法で機能することを開示している。Ｃｒｅは誘導可能
な雄性不捻性のメタロチオネインプロモーターから発現
され、ｃｒｅ遺伝子は乳頭腫ウイルスのレプリコンを含
有するベクター上に位置する。細胞の中に一時的に導入
されたプラスミド上の２つのｌｏｘ部位の間に位置する
遺伝子の切除、あるいはヘルペスウイルスのベクターの
遺伝子の中のインサートの切除は実証された。
【０００７】サウエル（Ｓａｕｅｒ）およびヘンダーソ
ン（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ）、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、１７：１４７−１６１
（１９８９）は、ｌｏｘＰ−ｃｒｅ組み換え系が安定に
形質転換されたマウスの組織培養の細胞系の中で機能す
ることを開示している。ラウス肉腫ウイルスのプロモー
ターから発現されたＣｒｅは、マウス細胞のゲノムの中
に組み込まれた２つのｌｏｘ部位の間に位置する遺伝子
の切除を引き起こした。
【０００８】ガッツ（Ｇａｔｚ）およびクアイル（Ｑｕ
ａｉｌ）、プロシーディングス・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８５：１３９４−１３９
７（１９８８）は、一時的方法を培養における植物の原
形質体中のバクテリアｔｅｔリプレッサータンパク質の
発現が、付加されたｔｅｔオペレーター配列を有しかつ
また原形質体の中に一時的に存在するＣａＭＶ３５Ｓプ
ロモーターを調節することを開示している。
【０００９】ベイカー（Ｂａｋｅｒ）ら、プロシーディ
ングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）Ｕ
ＳＡ、８３：４８４４−４８４８（１９８６）は、トウ
モロコシから誘導される「アクチベーター」と呼ぶコン
トロール要素が、タバコのゲノムの中に導入された後、
それじたい切除されることができることを開示してい
る。ラスナー（Ｌａｓｓｎｅｒ）、モレキュラー・アン
ド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．
Ｇｅｎｅｔ．）、２１８：２５−３２（１９８９）は、
「アクチベーター」要素が２つの機能的成分に分離する
ことができることを開示している：ｉ）大きい内部の欠
失をもつ要素、およびｉｉ）切除することができない末
端の欠失をもつ要素、要素ｉ）の内部の欠失はそれ自体
切除することができないが、要素ｉｉ）により切除する
ことができる。これらの２つの成分はトマト植物の中に
別々に形質転換され、遺伝的交雑を生じ、そしていくつ
かの細胞において第１成分の切除を生ずることが示され
ている。この実験が示すように、１つの植物のゲノムか
らの要素は異種植物細胞における組み換えに導くことが
できるが、組み換え部位の活性に要求されるＤＮＡ配列
は定められない。
【００１０】本発明の１つの目的は、外因性ＤＮＡがい
ったん植物細胞の中に存在するとき、それを操作して、
操作された植物の中の特性発現をコントロールできる能
力を増強することである。本発明の１つの特徴は、植物
細胞の中のＤＮＡの部位特異的組み換えを生成するここ
において開示する方法が、広範な種類の応用に対して有
用であるように、融通性をもつことである。これらの目
的および他の目的、特徴および利点は、ここにおける本
発明の記述を参照すると明らかとなるであろう。
【００１１】
【発明の概要】本発明は、植物細胞の中のＤＮＡの部位
特異的組み換えを生成する方法を提供する。方法（１）
は、 ｉ）第１ｌｏｘ部位からなる第１ＤＮＡ配列および第２
ｌｏｘ部位からなる第２ＤＮＡ配列を植物細胞の中に導
入し、そして ｉｉ）前記ｌｏｘ部位をＣｒｅと接触させ、これにより
部位特異的組み換えを産生する、ことからなる。
【００１２】好ましい実施態様において、ｃｒｅ遺伝子
からなる第３ＤＮＡ配列を、また、細胞の中に導入す
る。この第３ＤＮＡ配列は、さらに、植物細胞の中で活
性であるプロモーターからなり、そしてｃｒｅ遺伝子の
発現はプロモーターの指令により生成される。本発明の
他の方法は、第１ＤＮＡ配列および第２ＤＮＡ配列が２
つの異なるＤＮＡ分子の中に導入され、そして部位特異
的組み換えがｌｏｘ部位の近位のＤＮＡセグメントの相
互交換である、方法（１）である。
【００１３】本発明は、また、トランスジェニック植物
における外因性遺伝子またはＤＮＡセグメントを切除す
る方法を提供する。この方法は、 １）第１ｌｏｘ部位、前記第１ｌｏｘ部位と同一向きの
第２ｌｏｘ部位、およびそれの間の遺伝子またはＤＮＡ
配列からなるＤＮＡ配列をトランスジェニック植物の細
胞の中に導入し、そして ２）前記ｌｏｘ部位をＣｒｅと接触させ、これにより異
種遺伝子またはＤＮＡ配列を切除する、ことからなる。
遺伝子は望ましくないマーカーまたは特性遺伝子である
ことができる。
【００１４】さらに、少なくとも１つのｌｏｘ部位から
なるＤＮＡ配列、またはｃｒｅ解読領域で形質転換され
た植物細胞をここにおいて特許請求する。また、種々の
植物、例えば、ｃｒｅ解読領域で形質転換された細胞を
含有し、好ましくは耕種学的または園芸学的実用性を有
する植物を特許請求する。少なくとも１つのｌｏｘ部
位、植物細胞の中の遺伝子の発現に影響を及ぼす遺伝
子、解読領域およびＤＮＡ配列から成る群より選択され
る前以て選択したＤＮＡセグメントを有するプラスミド
を特許請求する。同様に、ＤＮＡ配列、例えば、少なく
とも１つのｌｏｘ部位、および植物細胞の中の遺伝子の
発現に影響を及ぼす遺伝子、解読領域およびＤＮＡ配列
から成る群より選択される前以て選択したＤＮＡセグメ
ントからなる配列を特許請求する。
【００１５】本発明において問題の典型的な特性遺伝子
は、次の特性を付与する酵素または他のタンパク質をエ
ンコードする遺伝子を包含する：種子の中の変更した油
組成；変更した種子タンパク質組成；種子の中の変更し
た炭水化物組成；果実の中の変更した炭水化物組成；変
更した花粉発育性質；除草剤に対する抵抗性；殺菌剤に
対する抵抗性；殺虫剤に対する抵抗性など。
【００１６】典型的なマーカー遺伝子は、ヒグロマイシ
ン抵抗性、カナマイシン抵抗性、ブレオマイシン抵抗
性、スルホニル尿素抵抗性、ストレプトマイシン抵抗性
またはホスフィノトリシン抵抗性を付与するもの；また
はβ−グルクロニダーゼを包含する。
【００１７】遺伝子、例えば、ＲＮアーゼ、制限エンド
ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、リボチーム、またはアン
チセンスＲＮＡは、それを発現する細胞の分裂を引き起
こすことがある。
【００１８】問題のＤＮＡセグメントは、隣接する遺伝
子の発現を減少またはブロックするもの、例えば、ポリ
アデニル化ヌクレオチド配列またはその中に１または２
以上のＡＴＧ配列をもつものを含有する。
【００１９】ＤＮＡセグメントは、植物の遺伝子の発現
に影響を及ぼすことができ、これらは次のものを包含す
るが、これらに限定されない：ヌクレオチド配列；プロ
モーター；調節ヌクレオチド配列；解読領域；リボチー
ム；およびアンチセンスＲＮＡ配列。
【００２０】本発明は、次の図面を参照すると、いっそ
う完全に評価および理解されるであろう。
【００２１】図１は、植物の形質転換のためにアグロバ
クテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）との交配に
おいて使用するプラスミドの地図を示す。構成体をつく
るとき使用する制限部位は、次のようにマークを付け
る：Ｂ：ＢａｍＨＩ、Ｃ：ＣｌａＩ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ、
Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｐ：ＰｓｔＩ、Ｓ：ＳａｌＩ、
Ｘ：ＸｂａＩ。
【００２２】図１の（Ａ）は、Ｃｒｅ／Ｈｐｔ−Ａプラ
スミドを表す。
【００２３】図１の（Ｂ）は、Ｃｒｅ／Ｈｐｔ−Ｂプラ
スミドを表す。
【００２４】図１の（Ｃ）は、ｌｏｘＰ／ＮｐｔＩＩ／
Ｈｒａプラスミドを表す。
【００２５】図２〜図４は、Ｃｒｅ／Ｈｐｔ−Ｂベクタ
ーを収容するアグロバクテリウム・ツメファシエンス
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓ）で再形質転換されたｌｏｘＰ植物における部位特異
的組み換えを例示する。
【００２６】図２は、カルス誘導アッセイからの結果で
ある。
【００２７】図３は、ｌｏｘＰ／ＮｐｔＩＩ／Ｈｒａベ
クターのｌｏｘ領域の地図である。
【００２８】図４は、再形質転換された植物のサザンプ
ロット分析を示す。
【００２９】図５は、ホモ接合性親からのｌｏｘＰ×Ｃ
ｒｅハイブリッドにおけるカナマイシン抵抗性を示す。
【００３０】図６は、アグロバクテリウム・ツメファシ
エンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓ）の中に導入され、次いで植物の中に導入され
たプラスミドｐＺ４ＬｏｘＡＧの地図を示す。
【００３１】図７は、アグロバクテリウム・ツメファシ
エンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓ）の中に導入され、次いで植物の中に導入され
たプラスミドｐＢＳＣｒｅ１０３の地図を示す。
【００３２】３つのＤＮＡを使用する本発明の方法にお
いて、第１ＤＮＡ配列および第２ＤＮＡ配列を前以て選
択したＤＮＡセグメントで接続して細胞の中に導入する
ことができる。このような場合において、第１ｌｏｘ部
位および第２ｌｏｘ部位は同一の向きを有することがで
き、そしてＤＮＡの部位特異的組み換えは前以て選択し
たＤＮＡセグメントは前以て選択したＤＮＡセグメント
の欠失である。ｃｒｅ解読領域はバクテリオファージＰ
１から誘導することができ、そして第１ｌｏｘ部位およ
び第２ｌｏｘ部位はｌｏｘＰまたはその誘導体であるこ
とができる。前以て選択したＤＮＡセグメントは、植物
細胞における遺伝子の発現に影響を及ぼす遺伝子、解読
領域およびＤＮＡ配列から成る群より選択される。ある
いは、セグメントは望ましくないマーカーまたは特性遺
伝子であることができる。第１ｌｏｘ部位および第２ｌ
ｏｘ部位は反対向きを有するように選択することがで
き、そして部位特異的組み換えは前以て選択したＤＮＡ
セグメントのヌクレオチド配列の逆位であることができ
る。このような場合において、ｃｒｅ解読領域、ｌｏｘ
部位および前以て選択したＤＮＡセグメントは、前に言
及したのと同じように選択することが好ましい。同様
に、ＤＮＡ配列を２つの異なるＤＮＡ分子の中に導入す
る前述の手順において、ｃｒｅ解読領域およびｌｏｘ部
位の前に言及した選択はまた好ましい。本発明の植物細
胞は、Ｃｒｅタンパク質を含有することができるか、あ
るいは少なくとも１つのｌｏｘ部位からなるＤＮＡ配列
で形質転換することができる。後者の場合において、こ
のような植物において、ＤＮＡ配列は２つのｌｏｘ部位
および１つのｃｒｅ解読領域からなることができ、そし
て好ましくは耕種学的または園芸学的実用性を示す。本
発明によるプラスミドは、少なくとも１つのｌｏｘ部位
および植物細胞の中の遺伝子の発現に影響を及ぼすＤＮ
Ａ配列を有することができる。この型のプラスミドにつ
いて、ＤＮＡ配列はリブロースビスホスフェートカルボ
キシラーゼ［ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）］の小さいサ
ブユニットの遺伝子から誘導されたポリアデニル化ヌク
レオチド配列であることができる。あるいは、ＤＮＡ配
列はプロモーター、または調節ヌクレオチド配列であ
る。プラスミドにおいて、ＤＮＡ配列は選択マーカーで
あることができる。ｃｒｅ解読領域および植物細胞の中
で活性であるプロモーターを有するプラスミドは、とく
に重要である。問題の特定のプラスミドは、次のものを
包含する：プラスミドＣｒｅ／Ｈｐｔ−Ａ（図１の
（Ａ）に示す制限酵素地図することによって特性決定さ
れる、またはその誘導体）、Ｃｒｅ／Ｈｐｔ−Ｂ（図１
の（Ｂ）に示す制限酵素地図により特性決定される、ま
たはその誘導体）、ｌｏｘＰ／ＮｐｔＩＩ／Ｈｒｅ（図
１の（Ｃ）に示す制限酵素地図により特性決定される、
またはその誘導体）およびｐＺ４ｌｏｘＡＧ（図６に示
す制限地図により特性決定される、またはその誘導
体）。種なし農産物の生産における本発明の方法の使用
はとくに重要である。
【００３３】ここで使用するとき、表現「部位特異的組
み換え」は次の３つの事象を包含することを意図する： １．ｌｏｘ部位によりフランキングされた前以て選択し
たＤＮＡセグメントの欠失、 ２．ｌｏｘ部位によりフランキングされた前以て選択し
たＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列の逆位、および ３．異なるＤＮＡ分子上に位置するｌｏｘ部位に対して
近位のＤＮＡセグメントの相互交換。 ＤＮＡセグメントのこの相互交換の組み込みの事象を生
ずることができることを理解すべきである。
【００３４】この開示に関して、ある数の用語を利用す
る。
【００３５】表現「ヌクレオチド配列」は、一本鎖また
は二本鎖であることができ、ＤＮＡまたはＲＮＡポリマ
ーの中に組み込むことができる合成、自然以外のまたは
変更したヌクレオチドを必要に応じて含有する、ＤＮＡ
またはＲＮＡのポリマーを意味する。
【００３６】「ＤＮＡセグメント」は、任意の源から誘
導することができる。一本鎖または二本鎖のデオキシリ
ボ核酸（ＤＮＡ）の線状の断片を意味する。表現「植物
細胞中のＤＮＡ」は、植物細胞の中に存在するすべての
ＤＮＡを包含する。ここで使用するとき、「遺伝子」は
当業者が遺伝子と通常見なすＤＮＡセグメントを意味す
ることを意図する。
【００３７】「解読領域」は、調節分子または任意のポ
リペプチドをエンコードするＤＮＡセグメントを呼ぶ。
【００３８】表現「調節分子」は、リボ核酸（ＲＮ
Ａ）、例えば、アンチセンスＲＮＡまたはリボチームの
ポリマー、あるいは遺伝子産生物の発現を増強または阻
害することができるポリペプチドを意味する。
【００３９】「遺伝子産生物」は、選択したＤＮＡセグ
メントの転写、翻訳、および、必要に応じて、後翻訳処
理から生ずるポリペプチドを意味する。
【００４０】用語「発現」は、ここで使用するとき、遺
伝子産生物の配列をコードする遺伝子から遺伝子産生物
への翻訳を意味する。発現において、遺伝子産生物の配
列をコードするＤＮＡ鎖を、まず、メッセンジャーＲＮ
Ａと呼ぶ相補的ＲＮＡに転写し、次いで、こうして転写
されたメッセンジャーＲＮＡを前述の遺伝子産生物に翻
訳する。
【００４１】ここで使用するとき、用語「プロモーター
領域」は、通常解読領域の上流（５′）の、ＤＮＡの配
列を呼び、この配列はＲＮＡポリメラーゼのための認識
および／または正しい部位における転写に要求される他
の因子を提供することによって、解読領域の発現をコン
トロールする。「プロモーター断片」は、プロモーター
領域から成るＤＮＡ配列を構成する。
【００４２】プロモーター領域は、生理学的条件に応答
して転写の開始の有効性をコントロールする１または２
以上の領域、および転写開始配列を包含することができ
る。
【００４３】「組織特異的プロモーター」は、ここで使
用するとき、特定の組織、例えば、根、葉、茎、雌ず
い、葯、花弁または表皮層における遺伝子の発現を主と
して指令するプロモーターである。転写の刺激因子、エ
ンハンサーまたはアクチベーターを組織特異的プロモー
ターの中に組み込んで、高いレベルの活性をもち、組織
特異性を保持するプロモーターをつくることができる。
【００４４】「調節ヌクレオチド配列」は、ここで使用
するとき、解読領域に対して近位に位置するヌクレオチ
ド配列を呼び、その転写は細胞の遺伝子の発現装置と組
み合わせて調節ヌクレオチド配列によりコントロールさ
れる。一般に、調節ヌクレオチド配列は解読領域に対し
て５′に位置する。プロモーターは１または２以上の調
節ヌクレオチド配列を含むことができる。
【００４５】「ポリアデニル化ヌクレオチド配列」また
は「ポリアデニル化ヌクレオチド領域」は、通常解読領
域に対して３′に位置し、細胞の遺伝子の発現装置と組
み合わせて解読領域から転写されたＲＮＡへのポリアデ
ニル酸の付加をコントロールするヌクレオチド配列を呼
ぶ。
【００４６】「植物細胞の中の遺伝子の発現に影響を及
ぼすＤＮＡセグメント」は、解読領域、プロモーター、
調節ヌクレオチド配列、ポリアデニル化ヌクレオチド配
列、または当業者により遺伝子の発現に影響を及ぼすと
見なされる他のＤＮＡ配列を包含することができる。
【００４７】ここで使用するとき、「形質転換」は、細
胞／組織／植物に転移された核酸分子上にエンコードさ
れた性質を細胞／組織／植物が獲得するプロセスを意味
する。「転移」は、ＤＮＡを細胞の中に転移する方法を
意味し、この方法は次のものを包含するが、これらに限
定されない：マイクロインジェクション、細胞壁を種々
の物理学的処理（例えば、エレクトロポレイション）ま
たは化学的処理（例えば、ポリエチレングリコール、Ｐ
ＥＧ）による浸透化、高い速度の微小投射体の衝突、ま
た、バイオリスチックス（ｂｉｏｌｓｔｉｃｓ）と呼
ぶ、あるいはアグロバクテリウム・ツメファシエンス
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓ）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａ．ｒｈ
ｉｚｏｇｅｎｅｓ）による感染。ここで使用するとき、
「形質転換体」は、形質転換として知られているプロセ
スの間に細胞の転移された核酸分子上にエンコードされ
た性質を獲得した植物を意味する。ここで使用すると
き、「再形質転換」は、それら自体形質転換体である細
胞／組織／植物の形質転換を意味する。
【００４８】ここで使用するとき、「有性ハイブリダイ
ゼーション」は、遺伝的に異なる２つの植物、例えば、
それらのゲノムの中に組み込まれた異なるＤＮＡ配列を
有する植物を交雑育種することによって、子孫を産生す
ることを意味する。
【００４９】ここで使用するとき、「組み込まれた」
は、転移されたＤＮＡを植物のゲノムの中に組み込むこ
とを意味する。
【００５０】ここで使用するとき、表現「ｌｏｘ部位」
は、ここにおいてＣｒｅと呼ぶｃｒｅ遺伝子の遺伝子産
生物が部位特異的組み換えを触媒することができるヌク
レオチド配列を意味する。ｌｏｘＰ部位は、この分野に
おいて知られている方法によりバクテリオファージＰ１
から分離することができる３４塩基対のヌクレオチド配
列である。バクテリオファージＰ１からｌｏｘＰ部位を
分離する１つの方法は、ヘス（Ｈｏｅｓｓ）ら、プロシ
ーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．）ＵＳＡ、７９：３３９８（１９８２）に開示され
ている。ｌｏｘＰ部位は、８塩基対のスペーサーにより
分離された２つの１３塩基対の逆向き反復から成る。逆
向き反復およびスペーサー領域のヌクレオチド配列は次
の通りである：ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡ ＡＴＧＴ
ＡＴＧＣ ＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴタバコのルビス
コ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）の小さいサブユニットの遺伝子か
ら誘導されたポリアデニル化ヌクレオチド配列の両側
に、２つのｌｏｘ部位を有するプラスミドｌｏｘＰ／Ｎ
ｐｔＩＩ／Ｈｒａで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉは、ブ
ダペスト条約の規定に従いＡＴＣＣに寄託され、そして
受託受け入れ番号６８１７７を有する。これおよび他の
受託物はこの特許が登録されたとき一般に入手可能であ
る。しかしながら、受託物の入手可能性は政府の行為に
より登録された特許権の適用制約において主題の発明を
実施するためのライセンスを構成しないことを理解すべ
きである。ｌｏｘ部位および介在する領域は、プラスミ
ドｌｏｘＰ／ＮｐｔＩＩ／Ｈｒａから、制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩＩで切除することができる。さらに、前以て選択
したＤＮＡセグメントは、この分野において知られてい
る技術により、ｌｏｘＰ／ＮｐｔＩＩ／ＨｒａにＢａｍ
ＨＩ制限酵素部位に挿入することができる。他の適当な
ｌｏｘ部位は、Ｅ．ｃｏｌｉから分離されたヌクレオチ
ド配列である、ｌｏｘＢ、ｌｏｘＬおよびｌｏｘＲ部位
を包含する。これらの配列は、ヘス（Ｈｏｅｓｓ）ら、
プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、７９：３３９８（１９８２）に開示
および記載されている。ｌｏｘ部位は、また、この分野
において知られている、種々の合成技術により生成する
ことができる。例えば、ｌｏｘ部位を生成する合成技術
はイトウ（Ｉｔｏ）ら、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、１０：１７５５（１９８２）
およびオギルビエ（Ｏｇｉｌｖｉｅ）ら、サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２１４：２７０（１９８１）に開
示されている。
【００５１】ＤＮＡ配列を植物細胞の中に導入する方法
はこの分野において知られている。核酸は、一般に、膜
の透過性を変更するために知られているエレクトロポレ
イション、ポリエチレングリコールまたは他の方法を使
用するか、あるいは使用しないで、植物の原形質体の中
に導入することができる。核酸の構成体は、また、Ｔｉ
−またはＲｉ−プラスミド、植物のウイルス、または自
律的に複製する配列の一部分からなるベクターを使用し
て、植物の中に導入することができる。核酸の構成体
は、また、マイクロインジェクションによるか、あるい
は直接種々の植物部分の中への、高い速度の微小投射
体、また「粒子衝突」または「バイオリスチクス（ｂｉ
ｏｌｉｓｔｉｃｓ）」［サンフォード（Ｓａｎｆｏｒ
ｄ）、Ｊ．Ｃ．、Ｔｏｂｔｅｃｈ ６：２９９（１９８
８）］により、植物の中に導入することができる。核酸
断片を植物の中に導入する好ましい手段は、ディスアー
ムド（ｄｉｓａｒｍｅｄ）Ｔｉ−プラスミド（すなわ
ち、腫瘍発生のための遺伝子が欠失されているＴｉ−プ
ラスミド）上の、あるいはディスアームドＴｉ−プラス
ミドに対するイントランスのバイナリーベクターの中
の、Ｔ−ＤＮＡ境界の間に核酸断片を含有するアグロバ
クテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓ）の使用を包含する。アグロバクテリウム（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は、組織外植体、例えば、
茎、根、または葉のディスクの接種によるか、あるいは
植物の原形質体との同時培養によるか、あるいは種子ま
たは傷付けた植物の部分の接種により、植物を形質転換
するために使用することができる。
【００５２】外来遺伝子を導入することができる作物種
の領域は組織培養として急速に増加しつつあり、そして
形質転換法は改良し、そして選択可能なマーカーとして
入手可能となる。こうして、本発明は広い範囲の耕種学
的または園芸学的に有用な植物に適用可能である。ＤＮ
Ａ配列を選択可能な植物細胞の中に導入するために使用
する特定の方法は、好ましい実施態様において、ＤＮＡ
配列は、本質的にホーシュ（Ｈｏｒｓｃｈ）ら、サイエ
ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２７：１２２９−１２３１
（１９８５）に記載されているように、保護培養を省略
して、葉ディスクをアグロバクテリウム・ツメファシエ
ンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）とともに同時培養
することによって、植物細胞の中に導入される。
【００５３】本発明の方法において、ｌｏｘ部位をＣｒ
ｅと接触させ、これにより部位特異的組み換えを生成す
る。１つの実施態様において、Ｃｒｅまたはｃｒｅメッ
センジャーは、マイクロインジェクション、バイオリス
チクス、あるいは他のタンパク質またはＲＮＡの導入手
順により、細胞の中に直接導入される。好ましい実施態
様において、ｃｒｅ解読領域は、植物細胞の中で活性で
あるプロモーターのコントロール下に、植物細胞の中に
導入される。適当な調節ヌクレオチド配列はこの分野に
おいて知られている。選択された植物細胞とともに使用
するプロモーターは、本発明の方法に対して重要ではな
い。適当なプロモーターの部分的リストは、次のものを
包含する：オウデル（ＯｄｅｌＩ）ら、ネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ）、３１３：８１０−８１２（１９８５）に
記載されているカリフラワーのモザイクウイルスの３５
Ｓプロモーター；デピッカー（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ）ら、
ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・アプライド
・ジェネティクス（Ｊ．ｏｆ Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅ
ｎｅｔ．）、１：５６１−５７３（１９８２）に記載さ
れているアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のノパリンシンターゼ遺伝子
からのプロモーター；マズル（Ｍａｚｕｒ）およびチュ
イ（Ｃｈｕｉ）、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．）、１３：２３７３−２３８６（１９８
５）に記載されているルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）の小
さいサブユニットの遺伝子からのプロモーター；ベンテ
ン（Ｖｅｌｔｅｎ）ら、ＥＭＢＯ ジャーナル
（Ｊ．）、１２：２７２３−２７３０（１９８４）に記
載されているアグロバクテリウム・ツメファシエンス
（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴＲ−ＤＮＡからの
１′または２′プロモーター；ヅンッスムイル（Ｄｕｎ
ｓｍｕｉｒ）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・ア
ンド・アプライド・ジェネティクス（Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐ
ｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．）、２：２８５−３００（１９８
３）に記載されているクロロフィルａ／ｂ結合性タンパ
ク質遺伝子のプロモーター；チェン（Ｃｈｅｎ）ら、プ
ロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．）ＵＳＡ、８３：８５６０−８５６４（１９８
６）に記載されているダイズ種子貯蔵タンパク質遺伝子
のプロモーター；およびマルコッテ（Ｍａｒｃｏｔｔ
ｅ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３３５；４５４
−４５７（１９８８）に記載されているコムギＥＭ遺伝
子からのプロモーター。ｃｒｅは一般に発育のすべての
段階におけるすべての細胞の中で植物を通して発現させ
ることができるか、あるいはｃｒｅの発現は限定された
発現特性を有するプロモーターまたは調節ヌクレオチド
配列を使用してより特別にヌクレオチド配列コントロー
ルすることができる。ｃｒｅは組織特異的方法で、例え
ば、根、葉、またはある種の花の部分においてのみ、発
現させることができる。ｃｒｅは、発育の特別の期間に
おいて、例えば、種子形成の間または生殖細胞の形成の
間にのみ、発現させることができる。ｃｒｅの発現は、
また、誘導因子の適用により調節することができるプロ
モーターのコントロール下に配置することができる。こ
の場合において、外部の誘導因子を適用するまで、ｃｒ
ｅの発現は起こらないか、あるいは非常に低い。植物細
胞の中で活性であるプロモーターが記載され、これらは
次の因子により誘導することができる：熱衝撃［グルレ
イ（Ｇｕｒｌｅｙ）ら、モレキュラー・アンド・セルラ
ー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、
６：５５９−５６５（１９８６）］、エチレン［ブログ
リイ（Ｂｒｏｇｌｉｅ）ら、植物細胞（Ｐｌａｔ Ｃｅ
ｌｌ）、１：５９９−６０７（１９８９）］、オーキシ
ン［ハガン（Ｈａｇａｎ）およびグイフォイル（Ｇｕｉ
ｌｆｏｙｌｅ），モレキュラー・アンド・セルラー・バ
イオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、５：１
１９７−１２０３（１９８５）］、アブシジン酸［マル
コッテ（Ｍａｒｃｏｔｔｅ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）、３３５：４５４−４５７（１９８８）］、サリ
チル酸（ＥＰＯ３３２１０４Ａ２およびＥＰＯ３３７５
３２Ａ１）、および置換されたベンゼンスルホンアミド
のセイフナー（ｓａｆｅｎｅｒ）（ＷＯ９０／１１３６
１）。セイフナー誘導可能なプロモーター２−２、また
はその誘導体によるｃｒｅ発現のコントロールは、誘導
性化学物質を適用しそして環境または植物ホルモンの刺
激に応答しないときにのみ、発現を可能とする。こうし
て、ｃｒｅの発現は植物のライフサイクルの任意の所望
の時に開始することができる。好ましくは、調節ヌクレ
オチド配列は３５Ｓプロモーターまたは２−２プロモー
ターである。
【００５４】ｃｒｅ解読領域の遺伝子産生物は、ｌｏｘ
部位においてＤＮＡの部位特異的組み換えを行う組み換
え酵素であり、ここで［Ｃｒｅ］と表示する。ここで使
用するとき、表現「ｃｒｅ解読領域」は、ｌｏｘ部位に
おいてＤＮＡの部位特異的組み換えを行う遺伝子産生物
をコードするヌクレオチド配列を意味する。１つのｃｒ
ｅ解読領域は、この分野において知られている方法によ
り、バクテリオファージＰ１から分離することができ
る。バクテリオファージＰ１からｃｒｅ解読領域を分離
する１つの方法は、アブレンスキ（Ａｂｒｅｍｓｋｉ）
ら、細胞（Ｃｅｌｌ）、３２：１３０１−１３１１（１
９８３）に開示されている。天然に存在するｃｒｅ解読
領域は、ウィルズビッキ（Ｗｉｅｒｚｂｉｃｋｉ）ら、
ジャーナル・オブ・モレキューラ・バイオロジー（Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１９５：７８５−７９４（１９
８７）に記載されているように、突然変位により変更し
て、変更された性質をもつＣｒｅタンパク質を産生する
ことができる。これらの変更されたＣｒｅタンパク質
は、Ｃｒｅとしてそれらの同一性を保持する。
【００５５】Ｃｒｅ／Ｈｐｔ−Ａで形質転換されたＥ．
ｃｏｌｉおよびＣｒｅ／Ｈｐｔ−Ｂで形質転換された
Ｅ．ｃｏｌｉ、両者はバクテリオファージＰ１から分離
したｃｒｅ解読領域およびカリフラワーのモザイクウイ
ルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターを有する、は、Ａ
ＴＣＣに寄託され、そして、それぞれ、受託受け入れ番
号６８１７６および６８１７５を有する。ｃｒｅ解読領
域がプラスミドＣｒｅ／Ｈｐｔ−Ｂから、制限酵素Ｋｐ
ｎｌおよびＳａｌＩで分離することができる。
【００５６】１つの実施態様において、第１ＤＮＡ配
列、第２ＤＮＡ配列、および必要に応じて、第３ＤＮＡ
配列を１つの植物の中に１工程または２または３連続工
程における形質転換により導入する。あるいは、第１Ｄ
ＮＡ配列および第２ＤＮＡ配列を１つの植物の中に導入
し、そして第３ＤＮＡ配列を異なる植物の中に導入す
る。次いで、２つの植物を有性ハイブリダイゼーション
して、すべての３つのＤＮＡ配列を有する子孫を産生す
る。他の実施態様において、第１ＤＮＡ配列、第２ＤＮ
Ａ配列および第３ＤＮＡ配列の各々を別々に１つの植物
の中に導入し、そして３つを有性ハイブリダイゼーショ
ンにより一緒にする。
【００５７】最も好ましくは、プロモーターおよびｃｒ
ｅ解読領域からなるＤＮＡ配列を導入するためのプラス
ミドはＣｒｅ／Ｈｐｔ−ＡまたはＣｒｅ／Ｈｐｔ−Ｂで
あり、そしてｌｏｘ部位からなるＤＮＡ配列を導入する
ためのプラスミドは、第１および第２のｌｏｘ部位の間
に位置するルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）の小さいサブユ
ニットのポリアデニル化ヌクレオチド配列以外に、ある
いはそれに加えて、前以て選択したＤＮＡセグメントを
有するｌｏｘＰ／ＮｐｔｌＩ／Ｈｒａまたはその誘導体
である。これらのプラスミドを使用して、当業者による
か、あるいはこの出願に教示されているように、ｃｒｅ
またはｌｏｘを有する植物を発生させることができる。
Ｃｒｅ植物およびｌｏｘ植物を有性ハイブリダイゼーシ
ョンして、ｃｒｅ解読領域およびｌｏｘ部位を含有する
ハイブリッドの子孫植物を産生することができる。
【００５８】ｌｏｘ部位は非対称のヌクレオチド配列で
あるので、同一分子上のｌｏｘは互いに関して同一また
は反対向きを有することができる。同一向きのｌｏｘ部
位の間の組み換えは、２つのｌｏｘ部位の間に位置する
ＤＮＡセグメントの欠失およびもとのＤＮＡ分子の生ず
る末端の間の接続を生ずる。欠失されたＤＮＡセグメン
トはＤＮＡの円形の分子を形成する。もとのＤＮＡ分子
および生ずる円形分子の各々は単一のｌｏｘ部位を含有
する。同一ＤＮＡ分子上の反対向きのｌｏｘ部位の間の
組み換えは、２つのｌｏｘ部位の間に位置するＤＮＡセ
グメントのヌクレオチド配列の逆位を生ずる。さらに、
２つの異なるＤＮＡ分子上に位置するｌｏｘ部位に対し
て近位のＤＮＡセグメントの相互交換が起こる。これら
の組み換え事象のすべてはｃｒｅ解読領域の産生物によ
り触媒される。
【００５９】本発明の好ましい実施態様において、第１
ＤＮＡ配列および第２ＤＮＡ配列は前以て選択したＤＮ
Ａセグメントにより接続されて植物細胞の中に導入され
る。セグメントは相同性、異種または合成由来のデオキ
シヌクレオチドの遺伝子または任意の他の配列であるこ
とができる。好ましくは、前以て選択したＤＮＡセグメ
ントは構造調製、酵素または調節分子のための遺伝子；
または植物細胞の中の遺伝子の発現に影響を及ぼすＤＮ
Ａ配列、例えば、調節ヌクレオチド配列、プロモータ
ー、またはポリアデニル化ヌクレオチド配列である。第
１ｌｏｘ部位および第２ｌｏｘ部位が同一向きを有する
場合、Ｃｒｅとの接触は前以て選択したＤＮＡセグメン
トの欠失である。第１ｌｏｘ部位および第２ｌｏｘ部位
が反対向きを有する場合、Ｃｒｅとの接触は前以て選択
したＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列の逆位（「フ
リッピング」）を生成する。
【００６０】ｌｏｘＰ−ｃｒｅ系のフリッピングモード
を使用して、遺伝子の発現の活性化を実証する努力がな
された。スルホニル尿素抵抗性ＡＬＳ遺伝子からの解読
領域およびポリアデニル化領域が、互いに関して逆向き
である２つの合成ｌｏｘＰ部位の間に配置された構成体
がつくられた。このｌｏｘＰ結合断片は、それが発現さ
れないように３５Ｓプロモーターに対して逆向きで配置
された。完全に中断された遺伝子を、カナマイシン抵抗
性選択マーカーを含むバイナリーベクターの中に入れ、
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅ
ｆａｃｉｅｎｓ）の中に導入し、次いでタバコ植物の中
に導入した。期待するように、カナマイシン抵抗性形質
転換体はクロロスルフロン（スルホニル尿素の１種）に
対して抵抗性ではなく、逆向き解読領域が発現されない
ことが実証された。組織を選択した形質転換体から取
り、そして−／ＨｐｔまたはＣｒｅ／Ｈｐｔ−Ｂを含有
するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）を使用して再形質転換した（実施例４）。選択した
Ｃｒｅを受け取ったヒグロマイシン選択した植物細胞は
クロロスルフロンに対するそれらの選択的を保持し、ス
ルホニル尿素抵抗性ＡＬＳ遺伝子が活性化されないこと
が示された。ＡＬＳ遺伝子は、ｌｏｘＰ結合断片が植物
の中でフリッピングしなかったので、活性化されなかっ
た。これはサザンブロットで植物ＤＮＡを分析すること
によって決定された：もとのｌｏｘ構成体を表すバンド
が検出されたが、フリッピングしたｌｏｘＰ結合断片を
表すバンドは検出されなかった。次いで、ｌｏｘＰ結合
断片は精製したＣｒｅを使用する試験管内反応において
フリッピングすることができないことが表示された。こ
うして、この特定の構成体は多少のなお決定されない面
において欠陥を有した。完全に予測されるように、ｌｏ
ｘＰ結合断片が試験管内反応においてフリッピングする
ことができた場合、それはＣｒｅを含有する植物の中で
フリッピングし、そしてＡＬＳ遺伝子活性化されるであ
ろう。
【００６１】
【実用性】本発明は、次の方法のいずれかにおいて導入
されたｌｏｘ部位の点におけるＤＮＡの部位特異的組み
換えを可能とする： （ａ）；部位特異的組み換えによりフランキングしたＤ
ＮＡセグメントの欠失（切除）； （ｂ）ｌｏｘ部位によりフランキングされたＤＮＡセグ
メントのヌクレオチド配列の逆向き（フリッピング）；
または （ｃ）異なる分子上に位置するｌｏｘ部位に対して近位
のＤＮＡセグメントの相互交換（交換）。
【００６２】モード（ａ）、切除、は、ｌｏｘ部位が同
一ＤＮＡ分子上で同様な向きにあるとき、起こる。この
事象の１つの例は、トランスジェニック植物において、
望ましくないマーカー遺伝子、例えば、抗生物質抵抗性
または除草剤抵抗性を付与するもの、の除去を可能とす
ることである。マーカーの除去は、また、トランスジェ
ニック植物の第２形質転換において同一マーカーの使用
を可能とするであろう。また、特定の組織においてある
いはある種の発育時間において望ましくない特性遺伝子
を切除することができる。また、遺伝子の発現に影響を
及ぼすＤＮＡ配列を切除して、その遺伝子の発現を増加
または減少させることができる。当業者は認識するよう
に、切除の逆転（すなわち、組み込み）は、また、実施
することができる。
【００６３】モード（ｂ）、フリッピング、は、ｌｏｘ
部位が同一のＤＮＡ分子上の逆向きにあるとき、起こ
る。この事象はｃｒｅ調節した遺伝子の発現の新規な方
法を提供する。遺伝子の発現は、プロモーターまたは調
節ヌクレオチド配列の方向を解読領域に関して不活性か
ら活性の向きに変化させることによって開始できる。ま
た、解読領域の向きをプロモーターに関して変化するこ
とは、その発現を変更するであろう。遺伝子の発現を停
止することは、アンチセンスＲＮＡまたはリボチームを
不活性から活性の向きフリッピングすることを包含す
る。
【００６４】モード（ｃ）、交換、は、植物ＤＮＡの組
み換えのための有用な道具を提供することができる。
【００６５】本発明の１つの応用は、ハイブリッド作物
を産生する方法における雄の受精のコントロールにおい
てであるる作物のハイブリダイゼーションは、２つの異
なる系統を交雑して、ハイブリッド種子を産生し、これ
から作物の植物を成長させる。ハイブリッド作物は、所
望の特性のよりおおくを産生植物の中に導入できること
において、よりすぐれる。例えば、品質の特性、例え
ば、油含量、除草剤抵抗性、病気抵抗性、環境条件に対
して適合可能性などを子孫の中でハイブリダイゼーショ
ンし、こうして子孫をその植物の最も望ましい特性が授
けられる。さらに、ハイブリッド交雑からの子孫は、２
つの親の型の組み合わせから生ずる新しい品質、例え
ば、雑種強勢から生ずる収量の増大を有することができ
る。ハイブリッド種子を産生するコントロールされた交
雑受精は、ほとんどの作物植物において起こる、競争す
る自家受精のために、困難であった。現在、ハイブリッ
ド種子の生産は、次の手段の１つのにより実施される：
雄器官を機械的に除去または覆って自家受精を防止し、
次いで雄不能化植物を植物を、交雑に所望の１または２
以上の特性を含有する雄器官をもつ植物に暴露する；
（ｂ）遺伝的に雄不捻の植物を、交雑に所望の特性を含
有する繁殖能力のある雄器官をもつ植物の存在下に、成
長させるか；あるいは（ｃ）雄器官を選択的に不捻化す
る化学的交雑化剤（ＣＨＡ）で植物を処理し、次いで交
雑に所望の特性を含有する繁殖能力のある雄器官をもつ
植物に雄不能化植物を暴露する。これらの方法の各々に
対するいくつかの欠点は、次のものを包含する：（ａ）
ほんのわずかの作物、例えば、トウモロコシに対する適
用可能性、ここで雄および雌の器官はよく分離される；
そしてそれは労力が強くかつ経費がかかる；（ｂ）遺伝
的に雄不捻の系統は維持が面倒であり、回復系統との交
雑を必要とする；（ｃ）すべてのＣＨＡはある程度の一
般に植物毒性および雌受精の減少を示す。また、ＣＨＡ
は、しばしば、異なる作物種に対して、あるいはなお同
一種内の異なる変種に対してさえ、異なる有効度を示
す。
【００６６】広い範囲の作物に適用可能でありかつ遺伝
的雄不捻性を包含する、ハイブリッド作物の生産に対し
て新しい分子遺伝的にアプローチは、プラント・ジネテ
ィック・システムス（Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ）により開発された。欧州特許出願（ＥＰ
−Ａ）第８９−３４４０２９号に記載されているよう
に、この系は葯の芽胞嚢組織においてのみ発現される細
胞分裂遺伝子を導入し、これにより発育する花粉を破壊
することを包含する。生ずる遺伝的に雄不捻の植物は、
交雑において雌の親として働いてハイブリッド種子を産
生する。この系は高度に有効であるかつ望ましい。しか
しながら、１つの欠点は次の通りである。すなわち、雄
不捻の親は優生特性として作用する不捻遺伝子について
ヘテロ接合性であるので、ハイブリッド種子から成長し
た植物の５０％のみが繁殖能力があり、残りは不捻遺伝
子を保持する。この場合は生産の畑における花粉の発生
を減少させ、これは種子の結実および収量の減少に導く
ことがある。このハイブリッド法へのｌｏｘＰ−ｃｒｅ
技術の付加は生産の畑における植物の非常に高い百分率
に受精を回復させ、ならびに細胞分裂遺伝子を排除する
ことができる。ｌｏｘ部位の間に雄不捻遺伝子を配置す
ると、雄の親からハイブリッドにＣｒｅを導入した後、
その遺伝子を欠失することができる。
【００６７】本発明の他の応用は種なし農産物の生産に
おいてである。種なしは、便利さおよび味のために、消
費される産生物において望ましい。現在、販売されてい
る「種なし」スイカは、実際には、多少の発育した種子
およびある数の未熟の種子を含有し、これらの未熟の種
子は完全に成熟した種子の大きさまで変化する大きさを
有する。これらのスイカを生産するために、まず、四倍
体母系の親と二倍体受粉体（ｐｏｌｌｉｎａｔｏｒ）と
の間でハイブリッド交雑をつくる。生ずる三倍体の種子
は、二倍体の受粉体と交雑して種なし果実を産生する自
家不育の植物を産生する［Ｈ．キハラ（Ｋｉｈａｒ
ａ）、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．８５：２
１７−２３０（１９５１）］。この産生法は次の問題を
有する：（ｉ）四倍体の植物をつくり、これは染色体の
重複により達成され、困難である。また、果実当たり種
子の数は低くなくてはならない。なぜなら、これは最終
の産生物において種子の数と積極的相関関係を有するか
らである［Ｄ．Ｆ．アンドラス（Ａｎｄｒｕｓ）、種な
しスイカの生産（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｅ
ｄｌｅｓｓ Ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎｓ）、ＵＳＤＡ Ｔ
ｅｃｎ．Ｂｕｌｌ．Ｎｏ．１４４２５（１９７１）］。
（ｉｉ）二倍体の受粉体および四倍体の植物のすぐれた
組み合わせられた能力の達成は困難である［Ｗ．Ｒ．ヘ
ンダーソン（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ）、ジャーナル・オブ
・アメリカン・ソサアティ・フオー・ホーティカルチュ
ラル・サイエンス（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．
Ｓｃｉ．）、１０２：２９３−２９７（１９７７）］。
（ｉｉｉ）三倍体の種子は成長力および発芽力において
正規の二倍体の種子より非常に劣る［Ｄ．Ｎ．マイナー
ド（Ｍｙｎａｒｄ）、ホート・サイエンス（Ｈｏｒｔ．
Ｓｃｉ．）、２４：６０３−６０４（１９８９）］。こ
れらの問題は、最終産生物における不完全な種なしと一
緒に、種なしスイカの発育を遅くかつ困難とする。種な
し性に対してこの倍数性に基づくアプローチは、四倍体
および二倍体の植物の生活可能である、わずかの種にお
いてのみ可能である。
【００６８】ｌｏｘＰ−ｃｒｅを包含する種なし性に対
する分子遺伝学のアプローチは、非常にいっそう効率的
であり、より信頼性のある種なし産生物を生じ、そして
倍数性の変化を含まない。こうして、それは広い範囲の
種に一般に応用可能である。種子特異的プロモーターに
より調節されたｌｏｘ／ポリＡ活性化細胞分裂遺伝子は
植物の中に導入する。この植物がＣｒｅを発現する植物
に交雑するとき、分裂遺伝子は活性化され、そして種子
の中で発現され、これにより種子の発育を分裂する。全
種子の発育中断に導く内乳の欠乏（細胞分裂遺伝子産生
物により引き起こされる）の必然性は非常に高い。大部
分の双子葉植物において、内乳は初期の胚の発育に必要
な栄養を供給する。内乳の発育中断は必ず種子の発育中
断に導く［Ｒ．Ａ．ブリンク（Ｂｒｉｎｋ）およびＤ．
Ｃ．クーパー（Ｃｏｏｐｅｒ）、ボタニカル・リビュー
（Ｂｏｔ．Ｒｅｖ．）、８：４２３−５４１（１９４
７）］。
【００６９】使用する種子特異的プロモーターは、発育
している種子の胚および／または内乳、最も望ましくは
内乳の中の発現を指令することが知られているプロモー
ターの群から選択される。種子特異的プロモーターの例
は、種子貯蔵タンパク質のプロモーターを包含するが、
これらに限定されない。種子貯蔵タンパク質は厳格に調
節され、ほとんど独占的に種子の中で高度に組織特異的
および段階特異的な方法で発現される［ヒギンス（Ｈｉ
ｇｇｉｎｓ）ら、 Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ．３５：１９１−２２１（１９８４）］；ゴ
ールドバーグ（Ｂｏｌｄｂｅｒｇ）ら、細胞（Ｃｅｌ
ｌ）、５６；１４９−１６０（１９８９）］。また、異
なる種子貯蔵タンパク質を種子発育の異なる段階におい
てかつ種子の異なる部分において発現することができ
る。
【００７０】トランスジェニック双子葉植物において、
種子貯蔵タンパク質遺伝子の種子特異的発現の多数の例
が存在する。これらは次の双子葉植物からの遺伝子を包
含する：マメのβ−ファゼオリン［セングプターゴプラ
ラン（Ｓｅｎｇｕｐｕｔａ−Ｇｏｐｌａｌａｎ）ら、プ
ロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．）ＵＳＡ、８２：３３２０−３３２４（１９８
５）およびホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）ら、プラント・
モレキュラー・バイオロジー（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．）、１１：７１７−７２９（１９８８）］、マ
メのレクチン［ベルカー（Ｖｅｌｋｅｒ）ら、ＥＭＢＯ
ジャーナル（Ｊ．）、６：３５７１−３５７７（１９
８７）］、ダイズのレクチン［オカムロ（Ｏｃａｍｕｒ
ｏ）ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８３：６２４０−８３４４
（１９８６）］、ダイズのクニツ（ｋｕｎｉｔｚ）トリ
プシン阻害因子［ペレズーグラウ（Ｐｅｒｚ−Ｇｒａ
ｕ）およびゴールドバーグ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ）、植物
細胞（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ）、１：１０９５−１１０
９）１９８９）］、ダイスのβ−コングリシニン［ビー
チイ（Ｂｅａｃｈｙ）ら、ＥＭＢＯ ジャーナル
（Ｊ．）、４：３０４７−３０５３（１９８５）、バー
カー（Ｂｅｒｋｅｒ）ら、プロシーディングス・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８５：４
５８−４６２（１９８８）、チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｅ
ＭＢＯ ジャーナル（Ｊ．）、７：２９７−３０２（１
９８８）、チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅ
ｔ．１０：１１２−１２２（１９８９）、ナイトウ（Ｎ
ａｉｔｏ）ら、プラント・モレキュラー・バイオロジー
（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１１：６８３−
６９５（１９８８）］、エンドウのビシリン［ヒギンス
（Ｈｉｇｇｉｎｓ）ら、プラント・モレキュラー・バイ
オロジー（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１１：
１０９−１２３（１９８８）、エンドウのコンビシリン
［ニュービギン（Ｎｅｗｂｉｇｉｎ）ら、プランタ（Ｐ
ｌａｎｔａ）、１８０：４６１（１９９０）］、エンド
ウのレグミン［シルサト（Ｓｈｉｒｓａｔ）ら、モレキ
ュラー・アンド、ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ，Ｇｅｎｅｔ．）、２１５：３２６（１９８
９）、菜種のナピン［ラドケ（Ｒａｄｋｅ）ら、セオリ
ティカル・アンド・アプライド・ジェンテティクス（Ｔ
ｈｅｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．）、７５：６８５−６
９４（１９８８）］、ならびに単子葉植物からの遺伝
子、例えば、トウモロコシの１５ｋｄのゼイン［ホフマ
ン（Ｈｏｆｆｍａｎ）ら、ＥＭＢＯ ジャーナル
（Ｊ．）、６：３２１３−３２２１（１９８７）］、オ
オミギのβ−ホルデイン［マリスら、プラント・モレキ
ュラー・バイオロジー（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．）、１０：３５９−３６６（１９８８）］、および
コムギのグルテニン［コロット（Ｃｏｌｏｔ）ら、ＥＭ
ＢＯ ジャーナル（Ｊ．）、６：３５５９−３５６４
（１９８７）］。そのうえ、キメラ遺伝子の構成体の中
の異種解読領域に操作的に連鎖した種子特異的遺伝子の
プロモーターは、また、トランスジェニック植物におい
てそれらの一時的および空間的発現のパターンを維持す
る。このような例は、次のものを包含する：アラビドプ
シス（Ａｒａｂｉｄｐｓｉｓ）およびブラシカ・ナプス
（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）の中でエンケファリ
ンのペプチドを発現させるアラビドプシス・タリアナ
（Ａｒａｂｉｄｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）２５種子
貯蔵タンパク質遺伝子のプロモーター［バンデケルコホ
ウブ（Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ）ら、バイオ／テ
クノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、７：９
２９−９３２（１９８９）］、ルシフェラーゼを発現す
るマメのレクチンおよびマメのβ−ファゼオリンのプロ
モーター［リッグス（Ｒｉｇｇｓ）ら、植物科学（Ｐｌ
ａｎｔ Ｓｃｉ，）、６３：４７−５７（１９８
９）］、およびクロランフェニコールアセチルトランン
スフェーラーゼを発現するコムギのグルテニンのプロモ
ーター［コロト（Ｃｏｌｏｔ）ら、ＥＭＢＯジャーナル
（Ｊ．）、６：３５５９−３５６４（１９８７）］。内
乳発育において初期に発現されたプロモーターはこの応
用において最も有効である。種子の発育において内乳お
よび胚の中で初期に発現される、ダイズのβ−コングリ
シジン遺伝子のａ′サブユニットからのプロモーター
［ワリング（Ｗａｌｌｉｎｇ）ら、プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、
８３：２１２３−２１２７（１９８６）］はとくに重要
である。
【００７１】使用する細胞分裂遺伝子は、細胞の正常の
機能を分裂させる生成物をエンコードする遺伝子の群か
ら選択される。自然以外の場合において発現されると
き、細胞に対して毒性である多数のタンパク質が存在す
る。例は次のものを包含する：制限酵素ＥｃｏＲＩのた
めの遺伝子［バーンズ（Ｂａｒｎｅｓ）およびライン
（Ｒｉｎｅ）、プロシーディングス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８２：１３５４−１
３５８（１９８５）］、ジフテリアの毒素Ａ［ヤマイズ
ミら、細胞（Ｃｅｌｌ）、１５：２４５−２５０（１９
８７）］、ストレプトアビジン［サノおよびカンター
（Ｃａｎｔｏｒ）、プロシーディングス・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８７：１４２−
１４６（１９９０）］、およびバーナーゼ（ｂａｒｎａ
ｓｅ）［パツドン（Ｐａｄｄｏｎ）およびハートレイ
（Ｈａｒｔｌｅｙ）、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、５３：１１
−１９（１９８７）］。植物細胞の機能を分裂するとき
高度に有効であることが示されたバーナーゼの解読領域
は、この系のために最も好ましい（欧州特許出願（ＥＰ
−Ａ）第８９−３４４０２９号）。
【００７２】高度に望ましい種なし系は、完全に繁殖能
力のあるＦ１種子が発育し、次いで種なし果実のみを産
生する植物に成長することができる系である。この系は
経済的に好適であり、各交雑受粉のために、多数の種な
し果実が生ずる：１つの交雑からのＦ１種子の数×Ｆ１
植物上に産生した果実の数。この方法において、また、
より価値ある特性およびハイブリッドの成長力の組み合
わせを包含する、ハイブリッドの作物を成長するという
利点が得られる。これは前述と同一の方法で達成される
が、ただしｌｏｘ／ポリＡ不活性化分裂遺伝子が種皮特
異的プロモーターから発現される。種皮は外皮、厳格に
母系の組織、の発芽後成長である。したがって、ｃｒｅ
遺伝子と一緒にｌｏｘ／ポリＡ不活性化分裂遺伝子を生
ずるハイブリッド交雑はこの種皮組織を含まない。Ｆ１
種子の種皮はｌｏｘまたはｃｒｅであり、それに依存し
て雌の親として使用し、こうしてＦ１種子は正常に発育
する。Ｆ１種子が果実を有するＦ１植物を生じた後、す
べての栄養細胞（種皮細胞を包含する）は胚からｌｏｘ
およびｃｒｅの両者を遺伝する。こうして、Ｆ１遺伝子
の種皮は活性化された細胞分裂遺伝子を有する。
【００７３】種皮は種子の発育および発芽性のために必
須の組織である。種子完全に成熟したとき、種皮は種子
の内部の部分に対する保護層として働く。種子の発育の
間に、種皮は発育する胚のために必要かくべからざる栄
養付与組織である。種子は母植物に対して栄養的に「寄
生的」である。種子の成長のためのすべての原材料は移
入しなくてはならない。双子葉植物の種子において、珠
柄組織は原形質連絡を通して種子の中に入り、次いで種
皮組織の中の吻腔の中に入る。種皮と胚との間の珠柄組
織の接続または維管の結合は存在しない。したがって、
発育する種子の中に送られるすべての栄養の溶質は種皮
に内側に供給され、次いで拡散により胚へ動かなくては
ならない。種皮の中の栄養の組成を研究する［フス（Ｈ
ｓｕ）ら、プラント・フィジオロジー（Ｐｌａｎｔ Ｐ
ｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）、７５：１８１（１９８４）；ソ
ーン（Ｔｈｏｒｎｅ）およびアインバード（Ｒａｉｎｂ
ｉｒｄ）、プラント・フィジオロジー（Ｐｌａｎｔ Ｐ
ｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）、７２：２６８（１９８３）；パ
トリック（Ｐａｔｒｉｃｈ）、ジャーナル・オブ・プラ
ント・フィジオロジー（Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．）、１１５：２９７（１９８４）；ウォルスウィン
ケル（Ｗｏｌｓｗｉｎｋｅｌ）およびアンマーラーン
（Ａｍｍｅｒｌａａｎ）、ジャーナル・オブ・イクスペ
リメタル・ボタニー（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．）、３６：
３５９（１９８５）］、およびまた溶質の供給の詳細な
細胞のメカニズムを研究する［オフラー（Ｏｆｆｌｅ
ｒ）およびパトリック（Ｐａｔｒｉｃｋ）、オーストリ
アン・ジャーナル・プラント・フィジオロジー（Ａｕｓ
ｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）、１１：
７９（１９８４）；パトリック（Ｐａｔｒｉｃｋ）、プ
ラント・フィジオロジー（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ
ｏｇｙ）、７８：２９８（１９９０）］ために、いくつ
かの技術が開発されてきている。この必要かくべからざ
る栄養を集中する組織は種子の発育中断を引き起こすこ
とは明らかである。
【００７４】
【実施例】（植物において部位特異的組み換え） （材料および方法） （分子の技術）バクテリアを培養し、ＤＮＡを調製し、
そしてＤＮＡを操作する方法は、特記しない限り、マニ
アチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、分子クローニング：実
験室のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）［コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、
ニユーヨーク（１９８２）］に記載された。ＤＮＡ操作
において使用した制限酵素および他の酵素は、ニュー・
イングランド・バイオラブス・インコーポレーテッド
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎ
ｃ．）（米国マサチュセッツ州ベバーリイ）、ベーリン
ガー・マンヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ）（米国インジアナ州インジアナポリス）、また
はベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｉｅｓ）
（米国マリイランド州ガイサーバーグ）から入手し、そ
して本質的に製造業者の規格に従い使用した。
【００７５】（植物のＲＮＡおよびＤＮＡの分離および
分析）ＲＮＡおよびＤＮＡの両者は、各々の抽出法を組
み合わせることによって、同一の葉の試料から抽出し
た。１〜５ｇの葉組織を液体窒素の中で凍結し、そして
粉砕した。凍結した組織を１５ｍｌの抽出緩衝液［１０
０ミリモルのトリズマ（Ｔｒｉｚｍａ）塩酸塩（Ｔｒｉ
ｓ）ｐＨ８．０、５０ミリモルのＥＤＴＡ ｐＨ８．
０、１００ミリモルのＮａＣｌ、１％のドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）、２００μｇ／ｍｌのプロイテイナ
ーゼＫ］に添加し、そして６５℃に１０分間加熱した。
５ｍｌの５モルの酢酸カリウムを添加し、そして土を氷
上に２０分間配置した。試料を２５Ｋ×ｇで２０分間遠
心し、そして上澄み液をチーズクロスを通して、１ｍｌ
の５モルの酢酸ナトリウムおよび１０ｍｌのイソプロパ
ノールを含有する管の中に注いだ。管を−２０℃におい
て一夜放置した。ＲＮＡ／ＤＮＡを２０Ｋ×ｇで１５分
間遠心することによって沈澱させた。沈澱を１０ｍｌの
水の中に再懸濁させ、そして等しい体積の４モルの塩化
リチウムを添加した。溶液を氷上に１〜２時間配置し、
次いで２０Ｋ×ｇで２０分間遠心した。上澄み液を集
め、そして等しい体積のイソプロパノールを添加した。
−２０℃において一夜インキュベーションした後、ＤＮ
Ａを沈澱させ、そして１０ｍｌのＴｒｉｓおよび１ミリ
モルのＥＤＴＡの溶液ｐＨ８．０（ＴＥ）の中に再懸濁
させた。試料を等しい体積のＴｒｉｓ ｐＨ８．０緩衝
化フェノールで抽出し、そして０．１体積の３モルの酢
酸ナトリウムおよび２．５体積のエタノールの添加によ
り沈澱させた。サザンブロット分析のために、ＤＮＡを
制限酵素で抽出し、そして生ずる断片をゲル電気泳動に
より分離し、ゼータープローブ（Ｚｅｔａ−Ｐｒｏｂ
ｅ）フィルター［バイオ・ラド・ラボラトリーズ（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ．）、米国カリフォルニア州リッチ
モンド）に移し、そしてニック翻訳したプローブとハイ
ブリダイゼーションさせた。
【００７６】塩化リチウムの沈澱をもとの体積の１／２
の水の中に再懸濁させ、等しい体積の塩化リチウムを添
加し、そしてこの混合物を氷上にさらに１時間配置し
た。ＲＮＡを遠心により沈澱させ、水の中に再懸濁さ
せ、緩衝化フェノールで抽出し、そして０．１体積の３
モルの酢酸ナトリウムおよび２体積のエタノールで沈澱
させた。ノザンブロット分析のために、レイブ（Ｒａｖ
ｅ）ら、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．）、６：３５５９−３５６９（１９７９）に記載
されているようにホルムアルデヒドの中のゲル電気泳動
によりＲＮＡを分離し、ゼータープローブのフィルター
に移し、そしてニック翻訳したプローブにハイブリダイ
ゼーションさせた。
【００７７】（トランスジェニック植物の世代）キメラ
ｃｒｅ遺伝子を含有するコインテグレイト（ｃｏｉｎｔ
ｅｇｒａｔｅ）のバイナリーＴｉプラスミドおよびｌｏ
ｘＰ部位を含有するものを、実施例８に記載するよう
に、葉のディスクの形質転換によりタバコの中に、そし
て根の形質転換によりアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏ
ｐｓｉｓ）の中に導入した。無菌の培地および異種生物
を混じない植物／バクテリアの培養物を操作する標準の
無菌の技術に従い、これらの技術はすべての転移のため
に層状流れのフードの使用を包含した。タバコのための
培地の処方を表２に記載する。葉のディスクの感染のた
めにポットに植えたタバコ植物を、成長チャンバーの中
で日中２４℃に１０時間、夜２０℃に１０時間維持し
て、ほぼ８０％の相対湿度で、混合した冷たい白色蛍光
および白熱光の下で成長させた。タバコの葉のディスク
の感染は、本質的にホーシュ（Ｈｏｒｓｃｈ）ら、サイ
エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２７、１２２９−１２３
１（１９８５）の方法により、保護培養を省略して実施
した。
【００７８】完全には拡張しない、ほぼ３〜５インチの
長さの、健康な若い葉を、ほぼ４〜６週齢のタバコ植物
［ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂ
ａｃｕｍ）ｖａｒ．Ｘａｎｔｈｉ］から収穫した。葉は
１０％の商用漂白剤および０．１％のドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）を含有する溶液の中に浸漬することに
よって表面滅菌した。間欠的混合で滅菌後２０分に、葉
を無菌の脱イオン水の中に連続的に３回移して葉をよく
すすぎ、次いでおだやかに震盪して過剰の水を除去し
た。直径８ｍｍの葉のディスクを葉全体から無菌の紙用
パンチで調製した。
【００７９】バイナリーまたはコインテグレイトのプラ
スミドを含有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ）の培養物を、適当な抗生物室を有する５
ｍｌのＹＥＢまたはＹＥＰブロス（表１および表８）の
中で成長させた。培養物は、２８℃に維持したニュー・
ブルンスウィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）プラ
ットフォームの震盪機の中の１８ｍｍのガラス培養管の
中でほぼ１７〜２０時間成長させた。葉のディスクを一
夜のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）の培養物の１：２０希釈物の２０ｍｌの中に数分間
沈めることによって、葉のディスクを接種した。
【００８０】接種後、．１Ｎ１Ｂ寒天培地（表２）を含
有するペトリ皿の中に葉のディスクを配置した。ペトリ
皿をパラフィンでシールし、そして混合した蛍光および
「グロ・アンド、ショウ（Ｇｒｏ ａｎｄ Ｓｈｏ）」
植物用光」ゼネラル・エレクトック（Ｇｅｎｅｒｒａｌ
Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）］の下に、ほぼ２５℃に維持した
培養室内で２〜３日間インキュベーションした。
【００８１】葉のディスクからアグロバクテリウム（Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を除去しそして形質転換さ
れたタバコ細胞の成長について選択するために、５００
ｍｇ／１のセファタクシムおよび１０〜３０ｍｇ／１の
ヒグロマイシン、最も好ましくは３０ｍｇ／１のヒグロ
マイシン、２０〜５０ｐｐｄのクロロスルフロン、最も
好ましくは２５ｐｐｄのクロロスルフロン、または１０
０〜３００ｍｇ／１のカナマイシン、最も好ましくは１
００ｍｇ／１のカナマイシンを含有する新鮮な、１Ｎ１
Ｂ寒天培地に葉のディスクを移した。セファタクシムを
凍結したｍｇ／ｍｌの原溶液として保持し、そしてオー
トクレープ処理後培地に無菌的に（０．４５μｍのフィ
ルターを通して濾過滅菌して）添加した。ヒグロマイシ
ン、クロロスルフロンまたはカナマイシンの新鮮なスト
ックを各使用のためにつくり、濾過滅菌してオートクレ
ープ処理した培地の中に入れた。
【００８２】葉のディスクを前述の成長条件下に２〜３
週間インキュベーションし、次いで同一組成の新鮮な培
地に、あるいは適当な抗生物質をもつＭＸ− に移し
た。
【００８３】ほぼ３〜４週後、ヒグロマイシン、クロロ
スルフロンまたはカナマイシンを含有する培地上で発育
するシュートを無菌のメスで切除し、そして２００〜５
００ｍｇ／ｌのセファタクシム、最も好ましくは２５０
ｍｇ／ｌのセファタクシムを含有するＭＸ-培地（表
２）の中に、１０〜３０ｍｇ／ｌのヒグロマイシン、最
も好ましくは３０ｍｇ／ｌのヒグロマイシン、２０〜３
０ｐｐｄのクロロスルフロン、最も好ましくは２５ｐｐ
ｄのクロロスルフロンの存在下に植えた。根の形成は３
週以内に記録された。
【００８４】葉を根を形成した切除したシュートから除
去して、選択的培地上のカルス誘導アッセイにおいて、
ヒグロマイシン、クロロスルフロンまたはカナマイシン
に対する抵抗性のレベルを決定した。カルスの減少を減
少するために、葉を切除し、そして無菌の紙用パンチを
使用して直径８ｍｍの葉のディスクを作り、そして２０
〜５０ｍｇ／ｌのヒグロマイシン、最も好ましくは３０
ｍｇ／ｌのヒグロマイシン、５〜２５ｐｐｄのクロロス
ルフロン、最も好ましくは２５ｐｐｄのクロロスルフロ
ン、または５０〜１００ｍｇ／ｌのカナマイシン、最も
好ましくは１００ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有するカ
ルス誘発培地上に植えた。選択的培地または非選択的培
地上のカルスの成長を３週以内に記録した。
【００８５】 表１ アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の成長培地 ＹＥＢ培地 １リットル当たり バクトビーフエキス ０．５ｇ バクト酵母エキス １．０ｇ ペプトン ５．０ｇ スクロース ５．０ｇ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ 寒天（任意） １５．０ｇ ｐＨ７．２ ＭＩＮ Ａスクロースプレートを使用する １リットル当たり 水 ９４８ｍｌ 寒天 １５ｇ 混合およびオートクレーブ処理する 最小Ａ塩類： ２００ｍｌ：Ｋ2ＨＰＯ4 ５２．５ｇ ＫＨ2ＰＯ4 ２２．５ｇ （ＮＨ4）2ＳＯ4 ５ｇ クエン酸Ｎａ・２Ｈ2Ｏ ２．５ｇ ２０％のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｍｌ １％のチアミン塩酸塩 ０．５ｍｌ ２０％のスクロース １０
【００８６】 表２ タバコ組織の培地 カルス誘導培地 １リットル当たり ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）最小有機培地 １パッケージ ＧＩＢＣＯ＃５１０−１１１８ （３％のスクロースを含有する） １００×ビタミン補給： １０ｍｌ １０ｍｇ／ｌのチアミン ５０ｍｇ／ｌのピリドキシン ５０ｍｇ／ｌのニコチン酸 １ｍｇ／ｍｌのナフタレンスルホン酸 １ｍｌ （ＮＡＡ）ストック １ｍｇ／ｍｌの６−ベンジルアミノプリン ０．２ｍｌ （ＢＡＰ）ストック 寒天 ８．０ｇ ｐＨ５．８シュート誘導培地（．１Ｎ１Ｂ） １リットル当たり ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）最小有機培地 １パッケージ ＧＩＢＣＯ＃５１０−１１１８ （３％のスクロースを含有する） １００×ビタミン補給： １０ｍｌ １０ｍｇ／ｌのチアミン ５０ｍｇ／ｌのピリドキシン ５０ｍｇ／ｌのニコチン酸 １ｍｇ／ｍｌのＮＡＡ（ナフタレンスルホン酸） ０．１ｍｌ ストック １ｍｇ／ｍｌのＢＡＰのストック １．０ｍｌ 寒天 ８．０ｇ ｐＨ５．８根誘導培地（ＭＸ- ） １リットル当たり ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）最小有機培地 １パッケージ ＧＩＢＣＯ＃５１０−１１１８ （３％のスクロースを含有する） １００×ビタミン補給： １０ｍｌ １０ｍｇ／ｌのチアミン ５０ｍｇ／ｌのピリドキシン ５０ｍｇ／ｌのニコチン酸 寒天 ８．０ｇ ｐＨ５．８ （Ａ．植物細胞の中のｃｒｅ解読領域の組み込みおよび発現のためのプラス ミドの構成） （実施例１）Ｃｒｅ／Ｈｐｔ−Ａみら構成のために出発
材料は、リン（Ｌｉｎ）ら、プラント・フィジオロジー
（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）、８４：８５６
−８６１（１９８７）に記載されているプラスミドｐＫ
３５ＣＡＴであり、そしてＡＴＣＣに寄託され、そして
受け入れ番号６８１７４を有した。このプラスミドは、
クロランフエニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）解読領域および引き続くナパリンシンターゼ（Ｎ
ＯＳ）遺伝子ポリアデニル化ヌクレオチド配列（ＮＯＳ
３′）の発現を指令するＣａＭＶ３５Ｓプロモーター
（３５Ｓ／Ｏ）を含有する。ｐＫ３５ＣＡＴはｐＫ３５
Ｋから誘導し、後者はｐＫＮＫから誘導された。ｐＫＮ
ＫはＡＴＣＣに受託され、そして受け入れ番号６７２８
４を有する。ｐＫＮＫはｐＢＲ３２２に基づくベクター
であり、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ
（ＮｐｔＩＩ）プロモーター断片、ノパリンシンターゼ
（ＮＯＳ）プロモーター断片、ＮｐｔＩＩの解読領域お
よびＮＯＳ遺伝子からのポリアデニル化領域を含有す
る。このプラスミドの地図は、リン（Ｌｉｎ）ら、プラ
ント・フィジオロジー（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏ
ｇｙ）、８４：８５６−８６１（１９８７）に示されて
いる。ＮｐｔＩＩプロモーターを含有するｐＫＮＫの中
の３０２ｂｐのＣｌａＩ−ＢｇｌＩ断片は、ベック（Ｂ
ｅｃｋ）ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１９：３２７−３３６
（１９８２）に記載されているトランスボゾンＴｎ５の
ＮｐｔＩＩ遺伝子から、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ断
片として得られた。ＨｉｎｄＩＩＩ部位をリンカーの付
加によりＣｌａＩ部位に転化した。ＮｐｔＩＩプロモー
ター断片に引き続いて２９６ｂｐのＳａｕ３Ａ−Ｐｓｔ
Ｉ ＮＯＳプロモーター（ＮＯＳ／Ｐ）断片が存在し、
この断片は、デピッカー（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ）ら、ジャ
ーナル・オブ・アプライド・ジェネティックス（Ｊ．Ａ
ｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．）１：５６１−５７４（１９８
２）に記載されているＮＯＳ遺伝子の、転写開始部位に
関して。ヌクレオチド−２６３−＋３３に相当する。
３′末端におけるＰｓｔＩ部位はＮＯＳ遺伝子の翻訳開
始コドンにおいてつくられた。ＮＯＳ／Ｐに引き続いて
ＮｐｔＩＩ解読領域を含有する９９８ｂｐのＨｉｎｄＩ
ＩＩ−ＢａｍＨＩ配列が存在し、この配列はトランスボ
ゾンＴｎ５［ベック（Ｂｅｃｋ）ら、遺伝子（Ｇｅｎ
ｅ）１９：３２７−３３６（１９８２）］からヌクレオ
チド１５４０および２５１８に、それぞれ、ＨｉｎｄＩ
ＩＩおよびＢａｍＨをつくることによって得られる。次
いで、ＮｐｔＩＩ解読領域に引き続いて、ヌクレオチド
８４８−１５５０を含むノパリンシンセターゼ遺伝子の
３′末端を含有する７０２ｂｐのＢａｍＨＩ−ＣｌａＩ
断片が存在する［デピッカー（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ）ら、
ジャーナル・オブ・アプライド・ジェネティックス
（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．）１：５６１−５７４
（１９８２）］。ｐＫＮＫの残部はｐＢＲ３２２配列２
９−４３６１から成る。
【００８７】ｐＫＮＫは、ＮｐｔＩＩおよびＮＯＳプロ
モーターを除去し、そしてそれらをＣａＭＶ３５Ｓプロ
モーターで置換することによって、ｐＫ３５Ｋに転化し
た。ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ３５Ｓプロモーター
断片は、ＡＴＣＣに受託されたそして受け入れ番号６７
２８５を有するｐＵＫ３５Ｋの中に含有されるものと同
一である。３５Ｓプロモーター断片は次のようにして、
かつオウデル（Ｏｄｅｌｌ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）３１３：８１０−８１３（１９８５）に記載され
ているように調製したが、ただしこの断片の３′末端は
転写開始部位に関して＋２１へのＣａＭＶ配列を含む。
３５Ｓ転写開始部位に関して−９４１および＋２０８の
間の領域を含有するＣａＭＶゲノムの１．１５ｋｂのＢ
ｇｌＩＩセグメントを、プラスミドｐＵＣ１３のＢａｍ
ＨＩ部位においてクローニングした。このプラスミドを
ＣａＭＶ断片に対して３′に位置するポリリンカーの中
のＳａｌＩ部位において直線化し、そしてこの断片の
３′末端をヌクレアーゼＢａｌ３１で消化することによ
って短縮した。分離したクローンのヌクレオチド配列の
分析から、３′欠失断片を＋２１に位置するＨｉｎｄＩ
ＩＩリンカーで選択した。ｐＫ３５Ｋをつくるために、
この３５Ｓプロモーター断片をＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ断片として分離し、ＥｃｏＲＩ部位はｐＵＣ１３の
ポリリンカーから来る、そしてＥｃｏＲＩおよびＨｉｎ
ｄＩＩＩで消化したｐＮＫＮに結合し、ＥｃｏＲＩ部位
はｐＢＲ３２２の中のＣｌａＩ部位に対して５′に存在
した。
【００８８】ｐＫ３５Ｋは、リン（Ｌｉｎ）ら、プラン
ト・フィジオロジー（ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇ
ｙ）、８４：８５６−８６１（１９８７）にマッピング
されかつ記載されているように、ＮｐｔＩＩ回動領域を
ドロツピングアウトしそしてそれをクロランフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の解読領域と
置換することによってｐＫ３５ＣＡＴに転化した。ＣＡ
Ｔ解読領域はｐＢＲ３２５から９７５ｂｐのＳａｕ３Ａ
断片として得られた。末端をフィルインし、そしてこの
断片をｐＧＥＭ２のフィルインしたＳａｌＩ部位の中に
結合した。クローンｐＧＣＡＴ９を選択し、このクロー
ンはポリリンカーのＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ部
位がＣＡＴ解読領域に対して、それぞれ、５′および
３′に位置するように向いたインサートを含有した。Ｃ
ＡＴ解読領域はＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ消化に
よりこのクローンから分離し、そしてＨｉｎｄＩＩＩお
よびＢａｍＨＩ消化したｐＫ３５Ｋの中に結合した。生
ずる構成体、ｐＫ３５ＫＣＡＴと呼び、は、また、ｐＫ
ＮＫのｐＫ３５Ｋへの転化、そして最終的にｐＫ３５Ｃ
ＡＴへの転化において未変更のままであるＮＯＳ３′断
片を含有する。
【００８９】全体のｃｒｅ遺伝子は、本来、スターバー
グ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ）およびハミルトン（Ｈａｍｉ
ｌｔｏｎ）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１５０：４６７−
４８６（１９８１）に記載されているように、ＥｃｏＲ
Ｉ断片上にバクテリオファージＰ１のゲノムから得られ
た。ｃｒｅ解読領域は、スターバーグ（Ｓｔｅｒｎｂｅ
ｒｇ）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１８７：１９７−２
１２（１９８６）に記載されているように、プラスミド
ｐＲＨ１０３Δ６の中のＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片とし
て調製した。ＸｈｏＩ部位はｃｒｅ解読領域に対して
５′の配列のＢａｌ３１欠失後にリンカーとして付加
し、翻訳開始ＡＴＧに対してほぼ５０ｂｄ５′のＸｈｏ
Ｉ部位の配置を生じた。ＥｃｏＲＩ部位はｃｒｅ解読領
域に対して３′の配列のＢａｌ３１欠失後のリンカーと
して付加し、翻訳停止コドンに対してほぼ１００ｂｐ
３′のＸｈｏＩ部位の配置を生じた。次いで３′Ｅｃｏ
ＲＩ部位を、サウエル（Ｓａｕｅｒ）、モレキュラー・
アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．）、７：２０８７−２０９６（１９８７）に
記載されているように、ＳａｌＩ部位と置換してｐＢＳ
７を発生させ、こうしてｃｒｅの解読領域をＸｈｏＩ−
ＳａｌＩ断片として分離することができた。このｃｒｅ
解読断片は、ＡＴＣＣに受託されたそして受け入れ番号
５３２５５を有するプラスミドｐＢＳ３９の中に存在す
るものと同一である。ＸｈｏＩ−ＳａｌＩｃｒｅ解読領
域を分離し、ＨｉｎｄＩＩＩリンカーを末端に付加し、
そしてそれをＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＫ３５ＣＡＴと
結合して、ｐＫ３５ＣｒｅＣＡＴを発生させた。このプ
ラスミドはキメラの３５Ｓ／Ｐ−ｃｒｅ−ＣＡＴ−ＮＯ
Ｓ３′遺伝子を含有する。
【００９０】Ｃｒｅ／Ｈｐｔ−Ａを構成するために、ｐ
Ｋ３５ＣＡＴをＢａｍＨＩで消化し、末端をフング（Ｈ
ｕｎｇ）およびウェンシング（Ｗｅｎｓｉｎｋ）、核酸
の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１
２：１８６３−１８７４（１９８４）の方法に従いｄＧ
ＴＰおよびｄＡＴＰで部分的にフィルインし、次いでＨ
ｉｎｄＩＩＩで消化してＣＡＴ解読領域を除去した。ｃ
ｒｅ解読領域を含有するＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ Ｄ
ＮＡ断片をｐＫ３５ＣｒｅＣＡＴから分離し、その構成
は前の節に記載されており、そしてＳａｌＩ部位をその
調製の間にｄＣＴＰおよびｄＴＴＰでフィルインした。
次いで、この解読領域の断片をｐＫ３５ＣＡＴから誘導
された調製されたベクターの中に結合し、キメラの３５
Ｓプロモーター−ｃｒｅ解読領域−ＮＯＳ３′遺伝子を
含有するプラスミドｐＫ３５Ｃｒｅをつくった。
【００９１】（実施例２）次に、キメラのＮＯＳ／Ｐ−
Ｈｐｔ−ＮＯＳの３′遺伝子（Ｈｐｔ＝ヒグロマイシン
ホスホトランスフェラーゼ）およびＮｃｏＩ遺伝子（ネ
オマイシンホスホトランスフェラーゼＩ）を含有するＣ
ｌａＩ−ＳａｌＩ断片を、ファン・デン・エンゼン（ｖ
ａｎ ｄｅｒ Ｅｌｚｅｎ）ら、プラント・モレキュラ
ー・バイオロジー（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）
５：２９９−３０２（１９８５）に記載されているｐＡ
ＧＳ１２０に類似するｐＡＧＳ１２２から分離した。Ｓ
ａｌＩリンカーをその断片のＣｌａＩ末端に付加し、そ
してそれをＳａｌＩ消化したｐＫ３５Ｃｒｅま中に結合
して、図１の（Ａ）に示すプラスミドＣｒｅ／Ｈｐｔ−
Ａをつくった。
【００９２】ボックスはキメラの３５Ｓ／Ｐ−ｃｒｅ−
ＮＯＳ ３′およびＮＯＳ／Ｈｐｔ−ＮＯＳ ３′キメ
ラ遺伝子を表す。矢印はこれらのキメラ遺伝子により発
現される転写体を表す。ＮｐｔＩ遺伝子をＴｎ９０３か
ら誘導する。これらの遺伝子をｐＢＲ３２２ベクターの
中に組み込む。
【００９３】（実施例３）Ｃｒｅ／Ｈｐｔ−Ｂの構成の
ための出発材料は、ピートルザク（Ｐｉｅｔｒｚａｋ）
ら、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．）１４：５８５７−５８６８（１９８６）に記載さ
れているプラスミドｐＤＨ５１であった。このプラスミ
ドはＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含有し、このプロモ
ーターは、ＸｂａＩを包含する、いくつかの制限酵素部
位により分離された、７４３９および７６３２の間の配
列を包含するＣａＭＶゲノムおよびＣａＭＶポリアデニ
ル化ヌクレオチド配列の６９０９および７４３７の間の
配列を含む。ｐＤＨ５１の中のＣａＭＶプロモーター断
片は、ＣａＭＶゲノムの６９０９におけるＮｃｏＩ部位
に対して５′にＥｃｏＲＩリンカーを付加し、そして７
４３７におけるＨｐｈＩ部位にＫｐｎＩリンカーを付加
することによって調製した。ポリアデニル化領域の断片
は、７４３９におけるＨｐｈＩにＳａｌＩリンカーを付
加し、そしてｐＵＣ１８の中のクローニング工程の間に
位置７６３２上に付加されたＫｐｎＩ，ＳｓｔＩおよび
ＥｃｏＲＩ部位の後にＨｉｎｄＩＩＩリンカーを付加す
ることによって調製した。これらの断片の両者をそれら
の末端上に位置する制限部位を使用してｐＵＣ１８の中
にクローニングして、ｐＤＨ５１を発生させた。生ずる
プラスミドにおいて、ＥｃｏＲＩ部位はＣａＭＶプロモ
ーターおよび３′領域の外側のいずれかの末端に位置す
る。ｐＤＨ５１をＸｂａＩで消化し、そして末端をｄＣ
ＴＰおよびｄＴＴＰで部分的にフィルインした。ｃｒｅ
解読領域を含有するＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断片をｐｋ
３５ＣｒｅＣＡＴから分離し、そして末端をｄＡＴＰお
よびｄＧＴＰで部分的にフィルインし、次いで調製され
たｐＤＨ５１ベクターの中に結合した。発現のために適
切な向きにＨｉｎｄＩＩＩｃｒｅ断片をもつプラスミド
ど同定するために、所望のプラスミドをＳａｌＩで消化
した。なぜなら、ｃｒｅ断片の３′末端におけるＳａｌ
Ｉ部位はＣａＭＶ３′領域の５′末端におけるＳｓｔＩ
に隣接するからである。ＢａｍＨＩ消化は正しい向きを
確証した：ｃｒｅ解読領域内の３５Ｓ／Ｐ領域の３′末
端におけるＢａｍＨＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間に４
３０ｂｐの断片が存在した。生ずるｐＤＨ５１Ｃｒｅプ
ラスミドは、キメラの３５Ｓプロモーター−ｃｒｅ解読
領域−ＣａＭＶ ３′遺伝子を含有する。
【００９４】（実施例４）次に、全体のキメラ遺伝子を
ｐＪＪ２６４４の中にクローニングした。このｐＪＪ２
６４４はアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の
形質転換のためのバイナリーベクターであり、キメラの
１′／Ｐ−Ｈｐｔ−ＮＯＳ ３′遺伝子、テトラサイク
リン抵抗性遺伝子、複製の広い宿主範囲の由来、および
Ｔ−ＤＮＡの境界を有する。ｐＪＪ２６４４はＡＴＣＣ
に受託されたそして受け入れ番号６８１７８を有し、そ
して次のようにして構成した。ディッタ（Ｄｉｔｔａ）
ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブサイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、７７：７３４７−７３５１（１
９８０）に記載されている、広い宿主範囲のプラスミド
ｐＲＫ２９０は、基本的ベクターとして働いた。このプ
ラスミドはＥｃｏＲＩで切断し、末端を充填し、そして
それをｐＡＧＳ１１１から分離した末端部位充填Ｅｃｏ
ＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片に結合して、ｐＪＪ１８８１
をつくった。ｐＡＧＳ１１１からの断片は、キメラのＮ
ｐｔＩＩのいずれかの側に位置するアグロバクテリウム
・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｔ−ＤＮＡからの左および右の
境界断片を含有し、そしてその構成はファン・デン・エ
ンゼル（ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｌｚｅｎ）ら、プラント・
モレキュラー・バイオロジー（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．）５：１４９−１５４（１９８５）に記載され
ている。ＣｌａＩ−ＢａｍＨＩキメラＮｐｔＩＩ遺伝子
の断片をｐＢＲ３２２からのＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ断片
と置換し、これによりＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加した。
ｐＪＪ２５０１をつくるために、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃｌ
ａＩ断片を付加し、この断片はキメラ１′・Ｐ−Ｈｐｔ
−ＮＯＳ ３′遺伝子を含有し、この遺伝子はベルテン
（Ｖｅｌｔｅｎ）ら、ＥＭＢＯ ジャーナル（Ｊ．）１
２：２７２３−２７３０（１９８４）に記載されている
１′プロモーター、ファン・デン・エンゼル（ｖａｎ
ｄｅｒ Ｅｌｚｅｎ）ら、プラント・モレキュラー・バ
イオロジー（ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．）５：２９
９−３０２（１９８５）に記載されているＨｐｔ解読領
域、これから翻訳開始ＡＴＧに対してちょうど５′に位
置するＡＴＧ配列が除去されている、およびＮＯＳ
３′領域から成る。次に、Ｔ−ＤＮＡ境界の外側に位置
するＸｈｏＩ部位を欠失した。キメラＨｐｔ遺伝子に対
して３′に位置する、ＢａｍＨＩおよびＨｐｈＩ部位の
間に、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｘｈｏ
Ｉ、ＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩを含むリンカーを付加し
てｐＪＪ２６４４をつくった。
【００９５】このベクターをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、
そしてキメラｃｒｅ遺伝子を含有するｐＤＨ５１Ｃｒｅ
からのＨｉｎｄＩＩＩリンカードＥｃｏＲＩ断片に結合
した。生ずるプラスミドは、図１の（Ｂ）に示すＣｒｅ
／Ｈｐｔ−Ｂである。ボックスはキメラ３５Ｓ／Ｐ−ｃ
ｒｅ−ＣａＭＶ ３′および１′／Ｐ−Ｈｐｔ−ＮＯＳ
３′遺伝子を表す。Ｔ−ＤＮＡの左および右の境界は
充填したボックスとしてマークされている。スラッシュ
は、テトラサイクリン抵抗性遺伝子（ｔｅｔ）を含む、
バイナリーベクターｐＪＪ２６４４の表されなかった配
列を示す。
【００９６】対照として使用するプラスミドは−／Ｈｐ
ｔ−Ｂと呼び、そしてキメラｃｒｅ遺伝子が付加されて
いないｐＪＪ２６４４ベクターである。サウエル（Ｓａ
ｕｅｒ）およびヘダーソン［核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１７：１４７−１６１：１
４７−１６１（１９８９）］に記載されているように、
ｌｏｘＰ部位を含有する８０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｓ
ｓｔＩ断片をｌｏｘＰ部位を含有する５０ｂｐのＨｉｎ
ｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片で置換することによって、ｐＢ
Ｓ６９をｐＢＳ３０から発生させた。これはＡＴＧ翻訳
開始コドンを含有する８０ｂｐの断面の中の余分の配列
を除去するために実施した。こうしてｐＢＳ６９は酵母
菌Ｌｅｕ２遺伝子を取り囲む、２つの一直線に向いた５
０ｂｐのｌｏｘＰ含有断片を有する。
【００９７】Ｌｅｕ２遺伝子内に位置するＥｃｏＲＩ部
位およびｌｏｘＰ部位に隣接するＢａｍＨＩ部位を使用
して、Ｌｅｕ２遺伝子の一部分を除去し、そしてマズル
（Ｍａｚｕｒ）およびチュイ（Ｃｈｕｉ）［核酸の研究
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、１３：２
３７３−２３８６（１９８５）］に記載されているタバ
コのルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）の小さいサブユニット
の遺伝子から誘導されたポリアデニル化ヌクレオチド配
列（ｐｏｌＡ）で置換した。この参考文献はこの遺伝子
のクローニングおよび配列決定を記載している。１９５
０および２２８９の間の配列領域を含有するＢａｍＨＩ
−ＸｂａＩ断片を分離し、ＸｈｏＩはその調製の間にフ
ィルインされた。ｐＢＳ６９をＥｃｏＲＩで消化し、末
端をフィルインし、次いでＢａｍＨＩで消化した。これ
らの２つのＤＮＡの結合はプラスミドｐＢＳ６９ｐｏｌ
Ａを生じた。
【００９８】（実施例６）次に、ｌｏｘＰ−ｐｏｌＡ−
ｌｏｘＰ領域を含有するＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩを分
離し、そしてＨｉｎｄＩＩＩリンカーをＸｈｏＩ末端に
付加した。この断片をＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＫＮＫ
の中に結合した。ｐＫＮＫの構成は実施例１に記載され
ており、そしてそれはカナマイシン抵抗性を植物細胞に
付与するキメラ遺伝子を生ずるＨｉｎｄＩＩＩ部位によ
りＮｐｔＩＩ解読領域に接合されたＮＯＳプロモーター
を含有する。ｌｏｘＰ−ｐｏｌＡ−ｌｏｘＰ Ｈｉｎｄ
ＩＩＩインサートの向きは、ＢａｍＨＩによる消化によ
り決定した。ＨｉｎｄＩＩＩ断片をもつプラスミドはｐ
ｏｌＡ部位がＮＯＳ／Ｐと同じ向きであるように挿入さ
れ、そしてＮｐｔＩＩ解読領域をｐＫＮＫｌｏｘＰと呼
んだ。ＮＯＳ／ＰおよびＮｐｔＩＩ解読領域の間に位置
するポリアデニル化ヌクレオチド配列は生存しうるＮｐ
ｔＩＩ転写体の産生をブロックし、これにより形質転換
された細胞にそれらのカナマイシン感受性を保持させる
ことが予測された。
【００９９】次に、ＰｓｔＩ断片を付加し、この断片は
リー（Ｌｅｅ）ら［ＥＭＢＯ ジャーナル（Ｊ．）７：
１２４１−１２４８（１９８８）］に記載されているｐ
ＡＬＳ０３２ＢＶから誘導されたＨｒａ（スルホニル尿
素抵抗性アセトラクテートシンセターゼ）遺伝子を含有
しそして、また、Ｒ１００．１プラスミドから誘導され
そしてプレントキ（Ｐｒｅｎｔｋｉ）およびクリッシ
（Ｋｒｉｓｃｈ）、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、２９：３０３
−３１３（１９８４）を含有した。この断片は分離され
たｓｔｒｅｐ／ｓｐｅｃ断片のＨｉｎｄＩＩＩ末端にＳ
ｓｔＩリンカーを付加し、そしてそれをｐＡＬＳ０３２
ＢＶのＨｒａ遺伝子に隣接するＳｓｔＩ部位の中に結合
した。次いでＰｓｔＩ断片を分離し、末端をフィルイン
し、そしてそれをＳｓｔＩ消化しそしてフィルインした
ｐＫＮＫｌｏｘＡの中に結合した。ｌｏｘＰ／ＮｐｔＩ
Ｉ／Ｈｒａと呼ぶ生ずるプラスミドを図１の（Ｃ）に示
す。
【０１００】図１の（Ｃ）において、開いたボックスは
キメラＮＯＳ／Ｐ−ＮｐｔＩＩ−ＮＯＳ ３’遺伝子を
表し、この遺伝子は、点描ボックスとして示すように、
プロモーターと解読領域との間がルビスコ（Ｒｕｂｉｓ
ｃｏ）の小さいサブユニットの遺伝子のポリアデニル化
領域により中断されており、これは矢印で表されている
２つのｌｏｘＰ部位により取り囲まれており、ｌｏｘＰ
部位が同一向きであることを示している。星印はポリア
デニル化部位をマークする。このプラスミドは、ｐＢＲ
３２２ベクターの中に組み込まれた、Ｈｒａと呼ぶスル
ホニル尿素抵抗性ＡＬＳ遺伝子およびストレプトマイシ
ンおよびスペクチノマイシン抵抗性マーカーを包含す
る。ＰｓｔＩインサートの向きは決定されなかった。
【０１０１】（Ｃ．ｃｒｅ解読領域をもつタバコの形質
転換）タバコの葉のディスクをアグロバクテリウム・ツ
メファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ）で感染することによって、キメラ３
５Ｓ／Ｐ−Ｃｒｅ−ＮＯＳ ３’遺伝子、実施例１およ
び２に記載されている、をタバコの中に導入した。一次
的形質転換体分析して、タバコの細胞の中のｃｒｅ解読
領域の存在およびｃｒｅ ｍＲＮＡの発現、ならびにヒ
グロマイシン抵抗性を付与する連鎖したＨｐｔの発現を
実証した。
【０１０２】プラスミドＣｒｅ／Ｈｐｔ−Ａをアグロバ
クテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓ）の中に３法交配を包含する方法により転移し、
この方法はフレイレイ（Ｆｒａｌｅｙ）ら［プロシーデ
ィングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）
ＵＳＡ、８０：４８０３−４８０７（１９８３）］によ
り本質的に記載されており、ただし次の点を除外した。
Ｃｒｅ／Ｈｐｔ−Ａをアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ）菌株ＧＶ３８５０の中に交配し、こ
の菌株はザンブリスキ（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ）ら［ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・アンド・アプライド・ジ
ェネティクス（Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅ
ｔ．）、１：３６１−３７０（１９８２）］により記載
された。Ｃｒｅ／Ｈｐｔ−Ａの交配からのコロニーを、
１００μｇ／ｍｌのリファンピシンおよび２５μｇ／ｍ
ｌのカナマイシンを含有するＬＰプレート上で選択し
た。選択したコロニーは、サザンブロット分析によりＴ
ｉプラスミドの中のＣｒｅ／Ｈｐｔ−Ａプラスミドのコ
インテグレイトとして確証された。
【０１０３】無菌の培地および異種生物を混じない植物
／バクテリア培養物の操作のための標準の無菌的技術に
従い、これらの技術はすべての転移のために層状流れの
フードの使用を包含した。葉のディスクの感染のために
ポットに植えたタバコ植物を、日中２４℃で１４時間、
夜２０℃で１０時間のサイクルで維持した成長チャンバ
ーの中で、ほぼ８０％の相対湿度において、混合した冷
たい白色蛍光および白熱性光の下で成長させた。タバコ
の葉のディスクの感染は、本質的にホーシュ（Ｈｏｒｓ
ｃｈ）ら［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２７：１
２２９−１２３１（１９８５）］の方法により、保護培
養を省略して、後述するように実施した。
【０１０４】健康な若いタバコの葉を、材料および方法
において記載したように、収穫し、表面滅菌し、そして
すすいだ。無菌の紙用ポンチを使用して葉全体から、直
径８ｍｍの葉のディスクを調製した。
【０１０５】コインテグレイトのＣｒｅ／Ｈｐｔ−Ａ
Ｔｉプラスミドを収容するアグロバクテリウム（Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の一夜の培養物の１：２０の希
釈物の２０ｍｌの中に、葉のディスクを数分間沈めるこ
とによって、葉のディスクを接種した。５ｍｌのＹＥＢ
プロス（表１）を単一のバクテリアのコロニーで接種す
ることによって、培養を開始した。培養物は２８℃に維
持したニュー・ブルンスウィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓ
ｗｉｃｋ）プラットホーム震盪機により１８ｍｍのガラ
ス培養管の中でほぼ１７〜２０時間成長させた。
【０１０６】接種後、葉のディスクをペトリ皿の中の、
１Ｎ１Ｂ寒天培地（表２）上に配置し、次いでこれをパ
ラフィルムでシールした。ペトリ皿を混合した蛍光およ
び「グロ・アンド・ショウ（Ｇｒｏ ａｎｄ Ｓｈ
ｏ）」植物光［ゼネラル・エレクトリック（Ｇｅｎｅｒ
ａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）］下に、ほぼ２５℃に維持し
た培養室内で２〜３日間インキュベーションした。
【０１０７】アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）を葉のディスクから除去しかつ形質転換され
たタバコ細胞の成長について選択するために、５００ｍ
ｇ／ｌのセファタクシムおよび１０〜２０ｍｇ／ｌのヒ
グロマイシンを含有する新鮮な、１Ｎ１Ｂ寒天培地に転
移した。セファタクシムを凍結した２００ｍｇ／ｍｌの
原溶液として保持し、そしてオートクレーブ処理後の培
地に無菌的に（０．４５μｍのフィルターを通して濾過
滅菌して）添加した。新鮮なヒグロマイシンのストック
（２０ｍｇ／ｍｌ）を各使用のためにつくり、そして濾
過滅菌してオートクレーブ処理した培地の中に入れた。
葉のディスクを前述の成長条件下に３週間インキュベー
ションし、次いで同一組成の新鮮な培地に移す。
【０１０８】ほぼ１月後、ヒグロマイシンを含有する培
地上で発育するシュートを無菌のメスで切除し、そして
２００ｍｇ／ｌのセファタクシムおよび１０ｍｇ／ｌの
ヒグロマイシンを含有するＭＸ-培地の中に植えた。根
の形成を３週以内に記録した。
【０１０９】葉を根を形成した切除したシュートから除
去して、選択的培地上のカルスの誘導アッセイにおいて
ヒグロマイシンに対する抵抗性のレベルを決定した。カ
ルスの形成を誘導するために、葉を切除し、そして直径
８ｍｍの葉のディスクを無菌の紙用ポンチを使用して作
り、そして２０および５０ｍｇ／ｌのヒグロマイシンを
含有するカルス誘導培地上に植えた。選択的および非選
択的培地上のカルスの成長を３週以内に記録した。
【０１１０】表３に示す結果が示すように、タバコの形
質転換は、ヒグロマイシン抵抗性カルスの産生に基づい
て、Ｃｒｅ／Ｈｐｔ−Ａ Ｔｉプラスミドを収容するア
グロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を使
用して達成された。すべての１０の試験した形質転換体
はヒグロマイシンに対して抵抗性であった。一次形質転
換体を分子技術により分析して、ｃｒｅ ｍＲＮＡ配列
の存在を評価した。Ｃｒｅ／Ｈｐｔ−Ａで形質転換した
７つの独立のタバコ植物を、材料および方法に記載され
ているように、ノザンブロットによりキメラｃｒｅ遺伝
子の発現についてアッセイした。各植物から調製したＲ
ＮＡを含有するフィルターに対してハイブリダイゼーシ
ョンするために使用するプローブはＢａｍＨＩ−Ｃｌａ
Ｉ ＤＮＡ断片であり、この断片は両者とも実施例１に
記載されているｐＫ３５ＫおよびｐＫＮＫプラスミドか
ら分離した。この断片は、非翻訳転写配列の領域を含む
ＮＯＮポリアデニル化ヌクレオチド配列を含有する。３
５Ｓ／Ｐ−ｃｃ−ＮＯＮ３’およびＮＯＮ／Ｐ−Ｈｐｔ
−ＮＯＮ ３’の両者の遺伝子はこのプローブに対する
相同性を有するので、各遺伝子からの転写体はこの実験
において検出される。ｃｒｅ遺伝子からの期待される
２．０ｋｂの転写体およびＨｐｔからの期待される１．
５ｋｂの転写体はノザンフィルター上に検出された。ア
ッセイした植物のすべては、１つのを除外して、植物細
胞の中のキメラｃｒｅ遺伝子の存在および発現を示すＣ
ｒｅ転写体の検出可能なレベルを産生した。
【０１１１】ヒグロマイシン抵抗性を示す植物を土に移
し、そして前述したように成長チャンバーの中で成熟に
成長した。個々の花序をバッグでカバーして、交雑受粉
なしに、自家受精を可能とした。成熟した種子を収穫
し、そして子孫の試験を実施して導入されたＣｒｅ／Ｈ
ｐｔ ＤＮＡの遺伝を決定した。ヒグロマイシン抵抗性
の特性を追跡して、遺伝をモニターした。
【０１１２】種子を１０％の商用漂白剤および１％のＳ
ＤＳの中で間欠的に混合しながら３０分間表面滅菌し、
無菌の脱イオン水で３〜５回すすぎ、乾燥し、そして５
０ｍｇ／ｌのヒグロマイシンの存在または不存在下にＭ
Ｘ-培地上に植えた。感受性種子は発芽したが、それ以
上発育しなかった。３つの抵抗性の子孫／１つの感受性
の分離比は形質転換体のゲノムの中へのヒグロマイシン
抵抗性遺伝子の組み込みの単一の部位の存在を示し、次
いでこれはその子孫により遺伝された。これは８つの独
立の試験した形質転換体のうちの７つにおいて見られ
た。第８の形質転換体は３：１より大きい比を示し、１
より多い組み込み部位の存在を示した。
【０１１３】 表３ ヒグロマイシン上のカルスの成長 ＩＤ 重量（ｇ） ヒグロマイシンの濃度 0 mg/l 20 mg/l 50 mg/l U1 9.02 4.55 3.36 U2a 8.88 2.34 2.43 U2b 7.72 3.77 2.88 U2c 3.69 1.32 0.85 Cl=U3a1 4.43 2.42 1.28 C2=U3b1 8.32 3.63 2.02 U4a1 6.21 2.52 1.15 C3=U4b 5.80 2.94 2.82 U5 4.23 3.28 2.49 U6a1 5.79 2.16 2.00 C4=U6b 5.52 2.40 1.42 U6c 11.37 2.56 2.10 C5=U7a 8.41 2.78 2.16 C6=U7b 5.22 4.66 4.23 U7c 8.52 3.38 2.88 U8 4.38 5.15 2.09 WT 3.55 0.68 0.36 1 重量（ｇ）は同一形質転換体を使用して実施した２つ
のカルスの誘導アッセイからの結果の平均である。
【０１１４】（Ｄ．ゲノムの中に組み込まれた２つのｌ
ｏｘＰ部位をもつ植物細胞および植物の生産）実施例５
および６に記載するｌｏｘＰ−ｐｏｌＡ−ｌｏｘＰ Ｄ
ＮＡ配列は、材料および方法に記載するように、タバコ
の葉のディスクのアグロバクテリウム・ツメファシエン
ス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓ）の感染によりタバコの中に導入した。一次形質転
換体を分析して、タバコの細胞の中のｌｏｘＰ−ｐｏｌ
Ａ ＤＮＡ配列の存在ならびにクロロスルフロンに対す
る抵抗性を付与する連鎖したＨｒａ遺伝子の発現を実証
した。
【０１１５】プラスミドｌｏｘＰ／ＮｐｔＩＩ／Ｈｒａ
を、本質的にフレイレイ（Ｆｒａｌｅｙ）ら［プロシー
ディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．）ＵＳＡ、８０。４８０３−４８０７（１９８
３）］に記載されているように、２法交配を包含する方
法により、次の点を除外して、アグロバクテリウム・ツ
メファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の中に
転移した。ザンブリスキ（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ）ら［ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・アプライド・
ジェネティクス（Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅ
ｔ．）、１：３６１−３７０（１９８２）］に記載され
ているアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）菌株ＧＶ３８５０の中に、ｌｏｘＰ／ＮｐｔＩＩ／
Ｈｒａを交配した。ｌｏｘＰ／ＮｐｔＩＩ／Ｈｒａの交
配からのコロニーを、１００μｇ／ｍｌのリファンピシ
ンおよび１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンおよび
ストレプトマイシンの各々の存在下に選択した。選択し
たコロニーは、サザンブロット分析によりＴｉプラスミ
ドの中へのｌｏｘＰ／ＮｐｔＩＩ／Ｈｒａプラスミドの
コインテグレイトとして確証された。
【０１１６】タバコの葉のディスクが得られ、コインテ
グレイトｌｏｘＰ／ＮｐｔＩＩ／Ｈｒａプラスミドを収
容するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）で接種し、そして材料および方
法に記載されているように、１Ｎ１Ｂ寒天培地上でイン
キュベーションした。
【０１１７】アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）の葉のディスクから除去しかつ形質転換され
たタバコ細胞の成長について選択するために、５００ｍ
ｇ／ｌのセファタクシムおよび１０〜２００ｐｐｂのク
ロロスルフロンを含有する新鮮な、１Ｎ１Ｂ寒天培地に
転移した。セファタクシムを凍結した２００ｍｇ／ｍｌ
の原溶液として保持し、そしてオートクレーブ処理後の
培地に無菌的に（０．４５μｍのフィルターを通して濾
過滅菌して）添加した。新鮮なクロロスルフロンのスト
ックを各使用のために、まず０．０１Ｎ ＮＨ4ＯＨ中
の０．２ｍｇ／ｍｌの溶液をつくり、次いでこれを蒸留
水で１：１０に希釈し、そして濾過滅菌してオートクレ
ーブ処理した培地の中に入れた。葉のディスクを前述の
成長条件下に３週間インキュベーションし、次いで同一
組成の新鮮な培地に移す。
【０１１８】ほぼ１月後、２０〜５０ｐｐｂのクロロス
ルフロンを含有する培地上で発育するシュートを無菌の
メスで切除し、そして２００ｍｇ／ｌのセファタクシム
および２０ｍｇ／ｌのクロロスルフロンを含有するＭＸ
-培地の中に植えた。根の形成を３週以内に記録した。
【０１１９】葉を根を形成した切除したシュートから除
去して、選択的培地上のカルスの誘導アッセイにおいて
クロロスルフロンおよびカナマイシンに対する抵抗性の
レベルを決定した。カルスの形成を誘導するために、葉
を切除し、そして直径８ｍｍの葉のディスクを無菌の紙
用ポンチを使用して作り、そして５、１０または２０ｐ
ｐｂのクロロスルフロンを含有するカルス誘導培地上で
および１００ｍｇ／ｌのカルス誘導培地上に植えた。選
択的および非選択的培地上のカルスの成長を３週以内に
記録した。試験した２１の独立の形質転換体はクロロス
ルフロンに対して抵抗性であった。１つを除外してすべ
てはカナマイシンに対して感受性であった。
【０１２０】表４に示す結果が示すように、タバコの形
質転換は、クロロスルフロン抵抗性カルスの産生に基づ
いて、ｌｏｘＰ／ＮｐｔＩＩ／Ｈｒａ Ｔｉプラスミド
を収容するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）を使用して達成された。細胞は一般にカナマイ
シン抵抗性に止まるので、これらのデータが示唆するよ
うに、ＮｐｔＩＩ配列を含有する生存しうる転写体は産
生されない。ｌｏｘＰ／ＮｐｔＩＩ／Ｈｒａで形質転換
された９つの個々のタバコ植物を、材料および方法に記
載されているように、ｌｏｘＰ−ｐｏｌＡ ＤＮＡ領域
についてアッセイした。各植物から調製したＢａｍＨＩ
消化したＤＮＡを含有するフィルターに対してハイブリ
ダイゼーションするために使用するプローブは、ｐＫ３
５Ｋプラスミドから分離したＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨ
Ｉ消化ＤＮＡ断片であった。この断片はＮｐｔＩＩのた
めの解読領域を含有し、そして図３に線図で示す。アッ
セイした９つのｌｏｘＰ植物の各々のＤＮＡにおいて、
図３に線図で示すように、ポリアデニル化ヌクレオチド
配列およびｌｏｘＰ部位を含有する２．４ｋｂのＢａｍ
ＨＩ断片を図４、レーン１および６に示すように検出さ
れた。ｌｏｘＰ植物は図３に示す５．７ｋｂの断片を有
し、これらの一次形質転換体の中に切除を検出できない
ことを示した。
【０１２１】図３において、もとのＢａｍＨＩ部位とｌ
ｏｘＰ部位との間の距離は上に示す。ｌｏｘＰ部位の間
の組み換え後の期待される立体配置の地図を下に示し、
ＢａｍＨＩ部位の損失および残りのＢａｍＨＩ部位の間
の距離の生ずる変化を示す。ボールドフェースでしるす
２．４ｋｂおよび５．７ｋｂの断片は、碁盤縞模様のボ
ックスとして示すプローブにより検出されるものであ
る。
【０１２２】クロロスルフロン抵抗性を示す植物を土に
移し、そして前述したように成長チャンバーの中で成熟
に成長した。個々の花序をバッグでカバーして、交雑受
粉なしに、自家受粉を可能とした。成熟した種子を収穫
し、そして子孫の試験を実施して挿入したＤＮＡ断片の
遺伝を決定した。連鎖したクロロスルフロン抵抗性の特
性を追跡して、遺伝をモニターした。
【０１２３】種子を前述したように３０分間表面滅菌
し、乾燥し、そしてクロロスルフロンまたはカナマイシ
ンの存在または不存在下にＭＸ-培地上でプレンディン
グした。カナマイシンを使用して、不活性化されたＮｐ
ｔＩＩ遺伝子の安定性についてアッセイした。感受性種
子は発芽したが、それ以上発育しなかった。３つの抵抗
性の子孫／１つの感受性の分離比は形質転換体のゲノム
の中のＨｒａ遺伝子の組み込みの単一の部位の存在を示
し、次いでこれはその子孫により遺伝された。これは２
０の独立の試験した形質転換体のうちの６つにおいて見
られた。抵抗性／感受性のより高い比は、２０の形質転
換体のうちの１４が示し、ゲノムの中の多数の位置にお
ける挿入を示した。例えば、１５／１の比は２つの非連
鎖の位置における挿入の存在を示し、そして２５５／１
比は形質転換体の中の４つの非位置における挿入を示
す。
【０１２４】 表４ クロロスルフロンおよびカナマイシン上のカルスの成長 ＩＤ 重量（ｇ） No 10 mg/l 100 mg/l 選択 クロロスルフロン カナマイシン Q1 6.99 4.93 0.31 L1=Q3 8.19 3.54 0.48 L2=Q8 4.18 2.41 0.28 Q9 2.58 5.78 0.32 L3=Q10 6.09 6.04 0.42 Q11 9.87 10.19 0.40 Q12 3.60 4.13 0.31 Q14 7.57 3.15 0.36 L4=Q15 4.69 13.98 0.27 Q16 3.98 4.92 0.36 L5=Q17 4.92 8.12 0.38 Q23 5.75 4.94 0.33 Q25 8.32 8.75 0.31 Q26 5.30 11.60 1.10 Q27 5.33 7.38 0.31 L6=Q29 13.28 4.86 0.41 Q30 6.48 6.52 0.35 Q31 7.66 12.35 0.31 Q32 14.41 7.62 0.37 WT 15.48 0.50 0.90 （Ｅ．ｃｒｅ解読領域をもつｌｏｘＰ植物の再形質転換） 実施例４に記載するバイナリーベクターのプラスミドＣ
ｒｅ／Ｈｐｔ−Ｂを、ゲノム中に既に組み込まれた２つ
のｌｏｘ部位を有する、トランスジェニックタバコ植物
の中に、ｌｏｘＰ一次形質転換体からのタバコの葉のデ
ィスクのアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の感染により導入する。再形
質転換した植物を分析して、ｌｏｘＰ部位における部位
特異的組み換えを実証した。
【０１２５】材料および方法に記載されている手順に従
ったが、ただし健康な葉はマゼンタ（Ｍａｇｅｎｔａ）
ＧＡ７容器［マゼンタ・コーポレーション（Ｍａｇｅｎ
ｔａＣｏｒｐ．）、米国イリノイ州シカゴ］の中で成長
するトランスジェニックｌｏｘＰタバコ植物から収穫し
た。これらの植物を節Ｄにおけるように生産された。形
質転換されたタバコの細胞の成長について選択しかつ葉
のディスクからのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ）を除去するために、葉のディスクの他の
群を１００ｍｇ／ｌのカナマイシンおよび５００ｍｇ／
ｌのセファタクシムを含有する、１Ｎ１Ｂ寒天培地に移
した。セファタクシムを凍結した２００ｍｇ／ｍｌの原
溶液として保持し、そしてオートクレーブ処理後の培地
に無菌的に（０．４５μｍのフィルターを通して濾過滅
菌して）添加した。新鮮なヒグロマイシンのストック
（５０ｍｇ／ｌ）を各使用のためにつくり、そして濾過
滅菌してオートクレーブ処理した培地の中に入れた。葉
のディスクを前述の成長条件下に３週間インキュベーシ
ョンし、次いで同一組成の新鮮な培地に移した。
【０１２６】ほぼ１月後、ヒグロマイシンを含有する培
地上で発育するシュートを無菌のメスで切除し、そして
マゼンタ（Ｍａｇｅｎｔａ）ＧＡ７容器の中の２００ｍ
ｇ／ｌのセファタクシムおよび１０ｍｇ／ｌのヒグロマ
イシンを含有するＭＸ-培地の中に植えた。根の形成を
３週以内に記録した。カナマイシンを含有する培地上で
発育するシュートを無菌のメスで切除し、そしてマゼン
タ（Ｍａｇｅｎｔａ）ＧＡ７容器の中の２００ｍｇ／ｌ
のセファタクシムおよび１０ｍｇ／ｌのヒグロマイシン
を含有するＭＸ-培地の中に植えた。
【０１２７】葉を根を形成した切除したシュートから除
去して、選択的培地上のカルスの誘導アッセイにおいて
ヒグロマイシンおよびカナマイシンに対する抵抗性のレ
ベルを決定した。カルスの形成を誘導するために、葉を
切除し、そして直径８ｍｍの葉のディスクを無菌の紙用
ポンチを使用して作り、そして５、１０または２０ｐｐ
ｂのヒグロマイシンを含有するカルス誘導培地上でおよ
び１００ｍｇ／ｌのカルス誘導培地上に植えた。選択的
および非選択的培地上のカルスの成長を３週以内に記録
した。
【０１２８】図２が示すように、タバコのゲノムの中の
ｌｏｘＰ部位のＣｒｅ仲介部位特異的組み換えは、カナ
マイシン抵抗性カルスの産生に基づいて、Ｃｒｅ／Ｈｐ
ｔ−Ｂプラスミドを収容するアグロバクテリウム（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）でｌｏｘＰ植物を再形質転換
後に達成された。ＮＯＳ／ＰおよびＮｐｔＩＩ解読領域
の間に位置するｐｏｌＡ部位の切除を生ずる組み換え
は、細胞にカナマイシン抵抗性を付与する生存しうるＮ
ｐｔＩＩ転写体の産生を可能とする。Ｃｒｅ／Ｈｐｔ−
Ｂベクターで再形質転換したｌｏｘＰ植物からの葉のデ
ィスクのみは、カナマイシンを含有する培地上にカルス
を形成した。−／Ｈｐｔ−ＢまたはＣｒｅ／Ｈｐｔ−Ｂ
による野生型タバコの形質転換からの植物は、すべてカ
ナマイシン感受性であった。−／Ｈｐｔ−Ｂ接種からの
３つのｌｏｘＰ再形質転換体は、また、カナマイシン感
受性であった。
【０１２９】図２において、各棒は５０ｍｇ／ｌのカナ
マイシンを含有するカルス誘導培地（表２）上で成長し
た５つの葉のディスクの合計重量を表す。重量は、０．
４ｇまでになる、もとの葉のディスクの重量を含む。デ
ィスクはｌｏｘＰ植物の再形質転換から生ずるカナマイ
シン選択した植物から取った：Ｌ１およびＬ２または非
形質転換タバコ植物：ＷＴ、ｃｒｅ遺伝子をもつ：Ｃｒ
ｅ／Ｈｐｔ−Ｂベクター（すなわち、Ｌ１＊Ｃ／Ｈまた
はＬ２＊Ｃ／Ｈ）、またはｃｒｅ遺伝子をもたない：−
／Ｈｐｔ−Ｂベクター（すなわち、Ｌ１＊−／Ｈまたは
Ｌ２＊／Ｈ）。すべての植物はヒグロマイシン上の成長
を示した。
【０１３０】Ｃｒｅ／Ｈｐｔ−ＢによるｌｏｘＰ植物組
織の再形質転換から生ずる植物をサザンブロットにより
分析して組み換えを検出した。節Ｄに記載する同一のＮ
ｐｔＩＩ断片プローブを、再形質転換体から分離したＢ
ａｍＨＩ消化ＤＮＡを含有するフィルターに対してハイ
ブリダイゼーションさせた。分析した５つのｌｏｘＰ＊
Ｃｒｅ再形質転換植物のうちで、１つはｌｏｘＰ一次形
質転換体の中で検出された２．４ｋｂの断片を保持し、
そして他の４つにおいて、図４、レーン４、８、９およ
び１０に示すように、新しい５．７ｋｂの断片が検出さ
れた。この断片において、レーンは（Ａ）に記載する同
一植物からのほぼ１０μｇのＢａｍＨＩ消化したＤＮＡ
を、同一順序で、含有するが、ただし１および６は、そ
れぞれ、もとのＬ１およびＬ２からの追加の試料を含有
する。（ｂ）に記載するように、ＮｐｔＩＩプローブで
検出された２．４ｋｂおよび５．７ｋｂのバンドの位置
をマークする。３つの再形質転換体における２．４ｋｂ
の断片の不存在および５．７ｋｇの断片の存在が示すよ
うに、組み換えは図３に線図で示すように２つのｌｏｘ
Ｐ部位の間において起こった：切除は２つのｌｏｘＰ部
位の間に位置するＢａｍＨＩ部位の損失を生ずるので、
隣接するＢａｍＨＩ部位の間の距離は増加する。図４、
レーン２に示すように、２．４ｋｂの断片を保持する１
つのｌｏｘＰ＊Ｃｒｅ再形質転換体は、また、図２に示
すように、カナマイシンに対する感受性を保持し、サザ
ンブロット分析と表現型の応答との間の一致を実証し
た。−／Ｈｐｔで再形質転換した２つの対照ｌｏｘＰ植
物からのＤＮＡは、図４、レーン３および７に示すよう
に、２．４ｋｂの非組み換え断片を含有し、組み換えが
Ｃｒｅの存在に依存することを示す。野生型対照植物
は、図４、レーン５に示すように、プローブに対するハ
イブリダイゼーションを示さなかった。
【０１３１】（Ｆ．ヘテロ接合体のｌｏｘＰおよびＣｒ
ｅ植物の遺伝的交雑）切除の組み換え産生に利用した方
法は、ｌｏｘＰおよびＣｒｅ植物の有性ハイブリダイゼ
ーションにより、植物のゲノムの中に組み込まれる、ｌ
ｏｘＰ−ｐｏｌＡ−ｌｏｘＰ ＤＮＡ配列でＣｒｅ組み
換え酵素を遺伝的に結合することであった。この実施例
において、節ＣおよびＤに記載するように、タバコの葉
のディスクの形質転換により得られた一次形質転換を利
用した。
【０１３２】一次形質転換体を土に移し、そして日中２
４℃で１４時間、夜中２０℃で１０時間のサイクルに維
持した成長チャンバーの中で、ほぼ８０％の相対湿度
で、混合した冷たい白色蛍光および白熱性光の下で成長
させた。植物を成熟に成長させ、そして手の授粉はワー
ンスマン（Ｗｅｒｎｓｍａｎ）、Ｅ．Ａ．およびＤ．
Ｆ．マトジンガー（Ｍｔｚｉｎｇｅｒ）［作物植物のハ
イブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｐｌａｎｔｓ）、Ｗ．Ｒ．フェール
（Ｆｅｈｒ）およびＨ．Ｈ．ハドレイ（Ｈａｄｌｅｙ）
編、ｐｐ．６５７−６６８（１９８０）］により手順の
わずかの変更を使用して実施した。簡単に述べると、Ｃ
ｒｅ植物からの花を開花の前日選択した；花冠を縦方向
に割り、葯を除去し、そして植物上でまたは水のビーカ
ーの中で一夜開花させたｌｏｘＰ植物の花からの花粉で
柱頭を授粉した。汚染する花粉が柱頭に到達するのを防
止するために、４ｃｍの長さのカクテルの攪拌後、１端
を塑像用粘土を詰めた、を柱頭および花柱の上にすべら
せ、そして花冠により所定位置に保持した。各花に標識
をつけた。朔を成熟に成長させ、次いで収穫した。
【０１３３】ヘテロ接合体の親の間の交雑において使用
した４つのｌｏｘＰ植物は、３またはそれ以上の独立の
位置の存在を示唆する分離比を有した。使用したＣｒｅ
植物は、唯一の遺伝子座におけるｃｒｅ遺伝子の挿入を
示す分離比を有した。ｌｏｘＰおよびＣｒｅの両者の親
はヘテロ接合体であったので、Ｃｒｅ植物からの除雄し
た花の柱頭上へのｌｏｘＰ花粉の手による授粉から産生
した種子は外来ＤＮＡの挿入をもたないか、両者を有す
るか、あるいは１つを有することができたであろう。し
たがって、交雑受粉から生ずる種子を２つのマーカー遺
伝子についてスクリーニングし、次いでカナマイシン抵
抗性：部位特異的組み換えの発現についてアッセイし
た。両者のマーカーを有する交雑受粉からの子孫のみを
同定するために、各交雑から１００〜１５０の種子をま
ず発芽アッセイにおいてクロロスルフロンの存在下にス
クリーニングした。次いで、クロロスルフロンに対して
抵抗性の実生のシュートの切断物をヒグロマイシンを含
有する培地の中の根の形成について試験した。自家交雑
したＣｒｅおよびｌｏｘＰ植物からの種子を各工程にお
いて対照として使用した。Ｃｒｅ×Ｃｒｅ種子はクロロ
スルフロンの存在下に白くなった実生のみを産生し、除
草剤感受性を示した。ｌｏｘＰ×ｌｏｘＰ実生のいずれ
もヒグロマイシンの存在下に根を形成しなかった。
【０１３４】両者の化合物に対して抵抗性である選択し
た実生を、対照と一緒に、カルス成長アッセイを使用し
てカナマイシン抵抗性について試験した。６つの異なる
Ｃｒｅおよび４つの異なるｌｏｘＰの親を含む８つの交
雑からの９０の実生のうちで合計８３（９２％）は、カ
ナマイシン抵抗性であることが発見された。表５は、各
交雑についてのカナマイシン抵抗性であった実生の数を
示す。これらの交雑のうちで６つにおいて、試験した植
物のすべてはカナマイシン抵抗性であった（５３／５
３）。２つの交雑からの子孫は約８０％のカナマイシン
抵抗性の子孫を生じた（２０／２４および１０／１
３）。ｌｏｘＰ植物およびＣｒｅ植物の自家交雑からの
試験した６３の固体のすべては、カナマイシンに対して
抵抗性であった。
【０１３５】 表５ ヘテロ接合体のＣｒｅおよびｌｏｘＰの親の間の交雑からの カナマイシン抵抗性の子孫の数 雄 雌 L3a L4 L5 L6 self 0/5 0/5 0/5 C1b 0/9c 13/13 C2 0/9 5/5 C3 0/7 2/2 4/4 16/16 C4 0/9 20/24 C5 0/5 13/13 C6 10/13 a Ｌ３−Ｌ６は花粉の親として使用した独立のヘテロ接
合体のｌｏｘＰ形質転換体である。
【０１３６】bＣ１−Ｃ６は雌の親として使用した異な
るヘテロ接合体のＣｒｅ形質転換体である。
【０１３７】cカナマイシン抵抗性を示す子孫の数／試
験した子孫の数。抵抗性は試験した３枚の葉のうちで少
なくとも２枚における≧０．５ｇのカルスの成長として
定義した。ディスクは植物の先端、中央および基部の部
分から葉を取って、植物を通して抵抗性について試験し
た。
【０１３８】ヘテロ接合体のｌｏｘＰ植物およびＣｒｅ
植物の遺伝的交雑から生ずるカナマイシン抵抗性植物を
サザンブロットによりアッセイして、組み換えを検出し
た。節Ｄに記載する同一のＮｐｔＩＩ断片のプローブ
は、ｌｏｘＰおよびＣｒｅ植物の子孫から分離したＢａ
ｍＨＩ消化ＤＮＡを含有するフィルターに対してハイブ
リダイゼーションした。２つのｌｏｘＰ植物および４つ
のＣｒｅ植物を含む４つの異なる交雑から誘導した、分
析した６つの子孫のＤＮＡのうちで、すべては５．７ｋ
ｂの断片を含有し、そして２．５ｋｂの断片を含有しな
かった。ｌｏｘＰ植物からの自殖から生ずる対照であっ
た子孫のＤＮＡは２．４ｋｂの断片を保持し、Ｃｒｅが
組み換えのために要求されることを実証する。他のプロ
ーブを使用して、２つのｌｏｘＰ部位の間に位置するＤ
ＮＡが交雑の子孫において切除されることを評価した。
タバコのルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）の小さいサブユニ
ットの遺伝子のポリアデニル化ヌクレオチド配列を含有
するＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片、すなわち、実施例５に
記載しそして図１の（Ｃ）に線図で示す断片、を標識
し、そして、洗浄して第１プローブを除去した後、同一
フィルターに対してハイブリダイゼーションさせた。自
殖したｌｏｘＰ植物の子孫のＤＮＡは２．４ｋｂの断片
を含有し、ｐｏｌＡ配列の存在を示したが、Ｃｒｅおよ
びｌｏｘＰ植物の交雑の子孫のＤＮＡはこのプローブへ
のハイブリダイゼーションを示さず、切除が起こったこ
とを確証した。
【０１３９】したがって、表現型および分子の両者の証
拠はＣｒｅ仲介の部位特異的組み換えがこれらのハイブ
リッドのタバコの実生において起こったことを示し、そ
して表現型のデータは組み換えが子孫の８０％〜１００
％において起こったことを示唆する。
【０１４０】（Ｇ．ヘテロ接合体のｌｏｘＰおよびＣｒ
ｅ植物の遺伝的交雑後の植物細胞における部位特異的組
み換え）切除の組み換えの生成に利用した方法は、ホモ
接合性のｌｏｘＰおよびＣｒｅ植物の有性ハイブリダイ
ゼーションにより、植物のゲノムの中に組み込まれた、
ｌｏｘＰ−ｐｏｌＡ−ｌｏｘＰ ＤＮＡ断片とＣｒｅ組
み換え酵素を遺伝的に結合することであった。ホモ接合
性親を使用して交雑授粉は、すべての子孫の中の両者の
ｌｏｘＰおよびｃｒｅのＤＮＡの挿入の存在を保証す
る。ｌｏｘＰ−ｐｏｌＡ−ｌｏｘＰに連鎖したマーカー
遺伝子についてホモ接合性の植物およびｃｒｅに連鎖し
たマーカー遺伝子についてホモ接合性の植物は、同定し
そして２つのｌｏｘＰ部位の間の部位特異的組み換えの
生成に利用した。
【０１４１】種子発芽アッセイにおいてヒグロマイシン
抵抗性の３：１の分離により測定して、単一の部位に組
み込まれたＨｐｔマーカー遺伝子およびｃｒｅを有する
９つのトランスジェニックタバコ植物を、それ以上の交
雑のために選択した。Ｒ１種子を２０〜５０ｍｇ／ｌの
ヒグロマイシンを含有するＭＸ-培地上に植えて、転移
したヒグロマイシン抵抗性遺伝子を含有する植物につい
て選択した。ヒグロマイシンを含有する培地上で発育で
きる実生を土に移し、日中２４℃で１４時間、夜中２０
℃で１０時間のサイクルに維持した成長チャンバーの中
で、ほぼ８０％の相対湿度で、混合した冷たい白色蛍光
および白熱性光の下で成熟に成長させた。バッグを個々
の花序の上に配置して自家受精させた。個々の形質転換
体（Ｒ０）から誘導されたいくかの植物（Ｒ１）の種子
（Ｒ２）を集め、そして５０ｍｇ／ｌのヒグロマイシン
を含有するＭＸ-培地上にプレイティングすることによ
って分離の分析にかけた。ヘテロ接合性のＲ１植物は
３：１の比でヒグロマイシン抵抗性子孫を産生すること
が期待されるであろう。他方において、ホモ接合性のＲ
１植物は自家受精後１００％のヒグロマイシン抵抗性子
孫を生ずるであろう。この手順を使用して、選択した形
質転換体の各々のホモ接合性種子のストックを同定し
た。
【０１４２】種子発芽アッセイにおいてクロロスルフロ
ン抵抗性の３：１分離により測定して、単一の部位に組
み込まれた抵抗性ＡＬＳマーカー遺伝子およびｌｏｘＰ
−ｐｏｌＡ−ｌｏｘＰを有した５つのトランスジェニッ
クタバコ植物を、それ以上の交雑のために選択した。転
移したクロロスルフロン抵抗性遺伝子を含有する植物に
ついて選択するための１００〜３００ｍｇ／ｌのクロロ
スルフロンを含有するＭＸ-培地上に、Ｒ１種子を植え
た。クロロスルフロンを含有する培地上で発育すること
ができる実生を土に移し、そして前述の条件下に成長チ
ャンバーの中で成熟に成長させた。前述したように、バ
ッグを個々の花序の上に配置して自家受精させた。個々
の形質転換体（Ｒ０）から誘導したいくつかの植物（Ｒ
１）の種子（Ｒ２）を集め、そして３００ｍｇ／ｌのク
ロロスルフロンを含有するＭＸ-培地上にプレイティン
グすることによって分離の分析にかけた。ヘテロ接合性
のＲ１植物は３：１の比でクロロスルフロン抵抗性子孫
を産生することが期待されるであろう。他方において、
ホモ接合性のＲ１植物は自家受精後１００％のクロロス
ルフロン抵抗性子孫を生ずるであろう。この手順を使用
して、選択した形質転換体の各々のホモ接合性種子のス
トックを同定した。
【０１４３】１つのホモ接合性Ｃｒｅ植物から、ならび
に１つのＷＴ植物からの花粉を使用して、各々が独立の
一次形質転換体から誘導した、３つのホモ接合性ｌｏｘ
Ｐ植物を授粉した。ハイブリッド種子が両者のマーカー
を有することを保証するために、ｌｏｘＰ×Ｃｒｅ交雑
からの種子をクロロスルフロンおよびヒグロマイシンの
存在下に、別々におよび一緒に、発芽させた。発芽した
実生のすべては真の葉および根を有し、両者の選択に対
する１００％の抵抗性を示した。期待したように、ｌｏ
ｘＰ×ＷＴ交雑の子孫のすべてはクロロスルフロン抵抗
性であったが、ヒグロマイシン感受性であった。
【０１４４】上で試験した同一のストックからのハイブ
リッドｌｏｘＰ×Ｃｒｅ種子は、ＭＸ-培地（表２）上
で発芽しそして成長した。第１〜第３の葉の葉からの組
織を吸水後２５日にカルス誘導アッセイにおいてカナマ
イシンの存在下の成長について試験し、そして第４〜第
６の葉からの組織を吸水後４０日に試験した。カルスの
成長の３週後、葉のディスクの合計重量を図５に示す。
試験したすべての７つのｌｏｘＰ×ＷＴ対照の子孫はカ
ナマイシンに対して感受性であった。ホモ接合性ｌｏｘ
Ｐ×Ｃｒｅ交雑からの２８の子孫は大部分はカナマイシ
ン抵抗性であった。２つの交雑において、子孫の１００
％は６枚の試験した葉の少なくとも５枚におけるカナマ
イシン抵抗性であった（それぞれ、８／８および４／
４）。他の交雑において１６の子孫のうちで１５は、試
験した６枚の葉のうちで少なくとも４枚においてカナマ
イシン抵抗性であった。カナマイシン感受性である思わ
れた２つの植物は、対照より多いカルスを産生したが、
抵抗性に関連するカルスの成長の程度を示さなかった
（図５）。
【０１４５】図５において、Ｃ７、Ｌ７およびＬ８は、
それぞれ、Ｃ３、Ｌ１およびＬ２の一次形質転換体から
誘導された、単一部位のホモ接合性植物である。Ｌ９
は、前の実験において使用しなかった一次形質転換体か
ら誘導されたホモ接合性ｌｏｘＰ植物である。各棒は個
々の子孫からの４枚のディスクの重量を表し、３週間の
カルス誘導培地（表２）上でインキュベーション後にお
ける、１つは最初の２枚の葉の各々からであり、そして
２つのディスクは第３の葉からである。約０．２ｇはも
との葉のディスクにより寄与される。星印はカナマイシ
ン感受性を示す２つの子孫をマークする。
【０１４６】部位特異的組み換えが起こったハイブリッ
ドの子孫の数を決定するために、１つの交雑からの９４
の実生からの第１、第２および第３の葉をカナマイシン
抵抗性について試験した。９４の実生のうちで７０は試
験したすべての３枚の葉においてカナマイシン抵抗性で
あり、組み換えが子孫の７５％において発育の初期に起
こったことを示した。しかしながら、組み換えは、ま
た、発育の後期において起こったように思われ、実生の
９０％（８５／９４）は第３の葉において抵抗性を示し
た。自発的カナマイシン抵抗性の発生を評価するため
に、１４の自家交雑したｌｏｘＰおよび１３の自家交雑
したＣｒｅの実生および１６のｌｏｘＰ×ＷＴの子孫を
カルス誘導アッセイにおいて試験した；いずれも抵抗性
ではなかった。これは再び確証するように、ｌｏｘＰ構
成体は、それを有する植物が有性ハイブリダイゼーショ
ンするときでさえ、減数分裂により有することを保証す
るために、ｌｏｘＰ×Ｃｒｅ交雑からの種子をクロロス
ルフロンおよびヒグロマイシンの存在下に、別々におよ
び一緒に、発芽させた。発芽した実生のすべては真の葉
および根を有し、両者の選択に対する１００％の抵抗性
を示した。期待したように、ｌｏｘＰ×ＷＴ交雑の子孫
のすべてはクロロスルフロン抵抗性であったが、ヒグロ
マイシン感受性であった。
【０１４７】上で試験した同一のストックからのハイブ
リッドｌｏｘＰ×Ｃｒｅ種子は、ＭＸ-培地（表２）上
で発芽しそして成長した。第１〜第３の葉の葉からの組
織を吸水後２５日目にカルス誘導アッセイにおいてカナ
マイシンの存在下の成長について試験し、そして第４〜
第６の葉からの組織を吸水後４０日に試験した。カルス
の成長の３週後、葉のディスクの合計重量を図５に示
す。試験したすべての７つのｌｏｘＰ×ＷＴ対照の子孫
はカナマイシンに対して感受性であった。ホモ接合性ｌ
ｏｘＰ×Ｃｒｅ交雑からの２８の子孫の大部分はカナマ
イシン抵抗性であった。２つの交雑において、子孫の１
００％は６枚の試験した葉の少なくとも５枚におけるカ
ナマイシン抵抗性であった（それぞれ、８／８および４
／４）。他の交雑において１６の子孫のうちで１５は、
試験した６枚の葉のうちで少なくとも４枚においてカナ
マイシン抵抗性であった。カナマイシン感受性である思
われた２つの植物は、対照より多いカルスを産生した
が、抵抗性に関連するカルスの成長の程度を示さなかっ
た（図５）。
【０１４８】図５において、Ｃ７、Ｌ７およびＬ８は、
それぞれ、Ｃ３、Ｌ１およびＬ２の一次形質転換体から
誘導された、単一部位のホモ接合性植物である。Ｌ９
は、前の実験において使用しなかった一次形質転換体か
ら安定である。
【０１４９】（Ｈ．ｌｏｘＰ−ｃｒｅ系を使用するトラ
ンスジェニックタバコからのスルホニル尿素抵抗性アセ
トラクテートシンセターゼ（ＡＬＳ）の欠失） （実施例７）スルホニル尿素（ＳＵ）抵抗性マーカー遺
伝子をトランスジェニックタバコ植物から排除し、ゲノ
ムの中にキメラ３５Ｓ／Ｐ−ＧＵＳ（ＧＵＳ＝β−グル
クロニダーゼ）遺伝子を残した。一直線に向いたｌｏｘ
Ｐ部位の間に位置する抵抗性ＡＬＳ遺伝子を含有するプ
ラスミドを構成した。ベクターｐＴＺ１９Ｒ［ファーマ
シア・インコーポレーテッド（Ｐｈａｍａｃｉａ，Ｉｎ
ｃ．）、ニュージャージイ州ピスカタウェイ］をＨｉｎ
ｄＩＩＩで消化し、非機能的ＨｉｎｄＩＩＩ末端および
ＸｈｏＩ、ＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｓｐ７１
８部位をもつ合成ヌクレオチドリンカーを付加した。こ
のプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしていずれ
かの末端上に一直線に向いたｌｏｘＰ部位を有する実施
例６に記載するｐＫＮＫｌｏｘＡからＨｉｎｄＩＩＩ断
片と結合して、ｐＴＺｌｏｘ２をつくった。生ずるプラ
スミドをＸｂａＩで消化し、この部位はｌｏｘＰ部位の
間に位置し、そしてキメラＳＵ抵抗性ＡＬＳ遺伝子を含
有するＸｂａＩ断片を付加した。このキメラＳＵ抵抗性
ＡＬＳ遺伝子はｐＭＨＰ３５と呼ぶｐＴＺベクターの中
にＸｂａＩ断片として存在する。それは、ハープスター
（Ｈａｒｐｓｔｅｒ）ら［モレキュラー・アンド・ジェ
ネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔ．）２１２：１８２−１９０（１９８８）］に記載さ
れているＣａＭＶ３５Ｓプロモーター／Ｃａｂ２２Ｌ
ＢｇＩＩＩ−ＮｃｏＩ断片、およびマズル（Ｍａｚｕ
ｒ）ら［プラント・フィジオロジー（Ｐｌａｎｔ Ｐｈ
ｙｓｉｏｌｏｇｙ）８５：１１１０−１１１７（１９８
７）］に記載されているアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄ
ｐｓｉｓ）ＡＬＳ解読および３’領域、これはそれがＡ
ＬＳのＳＵ抵抗性の形態をエンコードするように突然変
異されていた、を含有する。部位特異的突然変異誘発に
より導入された突然変異は、リー（Ｌｅｅ）ら、［ＥＭ
ＢＯ ジャーナル（Ｊ．）５：１２４１−１２４８（１
９８８）］に記載されているタバコＳ抵抗性Ｈｒａ遺伝
子の中に存在するものである。ＳＵ抵抗性ＡＬＳ遺伝子
がｌｏｘＰ部位の間に存在する生ずるプラスミドをｐＴ
Ｘｌｏｘ２２ＦＡと呼ぶ。次に、全体のｌｏｘ−ＡＬＳ
−ｌｏｘ断片をＳａｌＩおよびＡｓｐ７１８で消化後分
離し、そして同一酵素で消化したバイナリーベクターｐ
ＺＳ９４の中にクローニングしてｐＺ４ｌｏｘＡをつく
った。
【０１５０】ｐＴＸは複製起源およびＥ．ｃｏｌｉの中
の維持および選択のためのｐＢＲ３２２からのアンピシ
リン抵抗性遺伝子を含有する。それは、イトウ（Ｉｔｏ
ｈ）ら［プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）１１：２０６−
２２０（１９８４）］に記載され、アグロバクテリウム
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の中のプラスミドの複
製および維持のために要求される、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のプラスミドｐ
ＶＳ１の複製および安定性領域を含有する。また、ファ
ン・デル・エルゼン（ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｌｚｅｎ）ら
［プラント・モレキュラー・バイオロジー（Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）５：１４９−１５４（１９８
５）］に記載されている、オクトパインＴｉプラスミド
ｐＴｉＡ６のＴ−ＤＮＡの左の境界断片およびＴｉＡｃ
ｈ５から誘導された右の境界断片が含有されている。こ
れらの境界の間に、ｌａｃＺ遺伝子およびｐＵＣ１８か
ら誘導された独特制限部位ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩ、
ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、Ａｓｐ７１８およびＥｃｏＲＩ
が存在する。ｐＺ４ｌｏｘＡをＳａｌＩで消化し、そし
てキメラ３５Ｓ／ｐ−ＧＵＳ遺伝子を含有するＳａｌＩ
断片を付加した。このキメラＧＵＳ遺伝子は前述の３５
Ｓプロモーター／Ｃａｂ２２ｌ断片、クローンテク（Ｃ
ｌｏｎｅｔｅｃｈ）から入手可能なＧＵＳ解読領域、お
よび実施例１に記載するＮｏｓ３’領域を含有する。生
ずるプラスミドをｐＺ４ｌｏｘＡＧと呼び、そして図６
に示す。
【０１５１】図６において、ｐＺＳ９４バイナリーベク
ターは、一直線に向いたｌｏｘＰ部位により境界される
キメラ３５Ｓ／Ｐ−ＡＬＳ遺伝子、およびキメラ３５Ｓ
／Ｐ−ＧＵＳ−Ｎｏｓ３’遺伝子を含有する。ｌｏｘＰ
部位は矢印で示されている。
【０１５２】ｐＺ４ｌｏｘＡＧは、植物分子生物学のマ
ニュアル（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ）［ＳＢゲルビン（Ｇｅｌｖｉ
ｎ）ら編、Ｋｕｌｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ ＰＭＡＮ−Ａ３／７、（１９８８）］に記載されて
いる手順に従い、直接ＤＮＡ吸収により、アグロバクテ
リウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓ）のＬＢＡ４４０４の中に転移した。１００ｍｇ／ｍ
ｌのカルベニシリンを含有するスクロース（参照、表
１）を有する最小Ａ培地上で選択したアグロバクテリウ
ム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のコロニーの中のバ
イナリーベクターの存在を、ミニプレプＤＮＡの制限消
化により評価した。生ずるアグロバクテリウム（Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌株を使用して、材料および方
法に記載されているように、下に詳述するように、形質
転換体の選択のために２５ｐｐｂのクロロスルフロンに
対する抵抗性を使用して、タバコの形質転換体を得た。
【０１５３】葉のディスクをアグロバクテリウム（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の一夜の培養物の１：２０希
釈物の中に数分間沈めることによって、葉のディスクを
接種した。１００ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含有する
ＹＥＰ培地（表８）の５ｍｌを単一のバクテリアのコロ
ニーで接種することによって、培養を開始した。２８℃
に維持したニュー・ブルンスウィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕ
ｎｓｗｉｃｋ）のプラットフォームの振盪機の中ガラス
培養管中で、培養物をほぼ７２〜２０時間成長させた。
【０１５４】接種後、葉のディスクを、１Ｎ１Ｂ寒天培
地（表２）を含有するペトリ皿の中に入れ、そしてパラ
フィルムでシールした。ペトリ皿を、ほぼ２５℃に維持
した培養室内で、混合した蛍光および「グロ・アンド・
ショウ（Ｇｒｏ ａｎｄ Ｓｈｏ）」植物光［ゼネラル
・エレクトリック（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉ
ｃ）］下にインキュベーションした。
【０１５５】葉のディスクからアグロバクテリウム（Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を除去しかつ形質転換され
たタバコ細胞の成長について選択するために、５００ｍ
ｇ／ｌのセファタクシムおよび２５ｐｐｂのクロロスル
フロンを含有する新鮮な、１Ｎ１Ｂ寒天培地に葉のディ
スクを移した。セファタクシムは凍結した２００ｍｇ／
ｍｌの原溶液として保持し、そしてオートクレーブ処理
後の培地に無菌的に（０．４５μｍのフィルターを通し
て濾過滅菌して）添加した。凍結したクロロスルフロン
原溶液は、まず０．０１ＮのＮＨ4ＯＨ中の０．２ｍｇ
／ｍｌの溶液を調製し、次いでこれを脱イオン水で１：
１０に希釈し、そしてオートクレーブ処理した培地の中
に濾過滅菌して入れた。葉のディスクを前述の成長条件
下に１８日間インキュベーションし、次いで同一組成の
新鮮な培地に移した。
【０１５６】１５日後、２５ｂｐのクロロスルフロンを
含有する培地上で発育するシュートを無菌のメスで切除
し、そして５００ｍｇ／ｌのセファタクシムおよび２５
ｐｐｂのクロロスルフロンを含有するＭＸ-培地の中に
植えた。根の形成を２週以内に記録した。
【０１５７】完全なＧＵＳ／ｌｏｘＰ／Ｈｒａ ＤＮＡ
配列の植物のゲノムの中への組み込みは、クロロスルフ
ロン抵抗性についてのカルス誘導アッセイおよびＧＵＳ
酵素活性アッセイにより評価した。ほぼ０．２ｃｍ2の
大きさの葉片を、いくつかの選択した根を形成した切除
したシュートの各々から取って、ＧＵＳ活性を試験し
た。１ｍｇ／ｍｌのＸ−Ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリル−β−グルクロニド）を含有する
溶液（表６）の中で各葉片を粉砕しそしてこの組織を３
７℃において１〜１６時間インキュベーションすること
によって、ＧＵＳ活性の存在を決定した。青色の沈澱の
形成はＧＵＳ活性の存在を示した。
【０１５８】 表６ Ｘ−Ｇｌｕｃのための溶液 原溶液 体積（ｍｌ） ０．２モルのＮａＰＯ4緩衝液、ｐＨ７．０ ２５．０ （０．２モルのＮａ2ＨＰＯ4：６２ｍｌ ０．２モルのＮａＨ2ＰＯ4：３８ｍｌ） 脱イオン水 ２４．０ ０．１モルのＫ3［Ｆｅ（ＣＮ）6］ ０．２５ ０．１モルのＫ4［Ｆｅ（ＣＮ）6］・３Ｈ2Ｏ ０．２５ １．０モルのＮａ2ＥＤＴＡ ０．５０ ＧＵＳ活性を示す５つの選択した植物からの葉を根を形
成した切除したシュートから取り、選択培地上でカルス
誘導アッセイによりクロロスルフロンに対する抵抗性の
レベルを決定した。カルスの形成を誘導するために、葉
を切除し、そして直径８ｍｍの１０枚の葉のディスクを
無菌の紙用ポンチを使用して作り、そして２５ｐｐｂの
クロロスルフロンおよび２５０μｇ／ｌのセファタクシ
ムを含有するカルス誘導培地上にプレイティングした。
野生型を対照として使用した。葉のディスクおよび関連
するカルスを秤量した；すべての５つの形質転換体は、
表７に示すように、クロロスルフロンに対する抵抗性を
示した。
【０１５９】ＡＬＳマーカー遺伝子の切除について試験
するために、ＧＵＳ活性を示す５つのクロロスルフロン
抵抗性の独立の形質転換体を再形質転換してｃｒｅ遺伝
子を次のようにして導入した。健康な葉を、これらの５
つのトランスジェニックタバコ植物およびマゼンタ（Ｍ
ａｇｅｎｔａ）ＧＡ７容器［マゼンタ・コーポレーショ
ン（Ｍａｇｅｎｔａ Ｃｏｒｐ．）、米国イリノイ州シ
カゴ］の中で成長する野生型植物から収穫した。葉のデ
ィスクをこれらの異種生物を混じない葉から無菌の紙用
ポンチを使用して調製し、−／ＨｐｔまたはＣｒｅ／Ｈ
ｐｔ−Ｂプラスミド（実施例４）を収容するアグロバク
テリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で接種し、１
Ｎ１Ｂ上で３日間インキュベーションし、５００ｍｇ／
ｌのセファタクシムおよび３０ｍｇ／ｌのヒグロマイシ
ンを含有する。１Ｎ１Ｂ培地上に配置し、そして１週間
インキュベーションした。次いで、葉のディスクを同一
組成の新鮮な培地に２週間移し、次いでシュートの形成
のために５００ｍｇ／ｌのセファタクシムおよび３０ｍ
ｇ／ｌのヒグロマイシンを含有するＭＸ-培地に移し
た。シュートが現れたとき、それらを葉のディスクから
切除し、そして５００ｍｇ／ｌのセファタクシムおよび
３０ｍｇ／ｌのヒグロマイシンを含有するＭＸ -培地の
中に入れた。シュートを異なる葉のディスクから取っ
て、それらが独立の形質転換の事象を生ずることを保証
した。根を形成したシュートを、前述したようにＸ−Ｇ
ｌｕｃを使用してＧＵＳ活性についてアッセイした。試
験した６３のシュートはＧＵＳ酵素活性を有したが、３
つはＧＵＳ活性を示さなかった。これらの形質転換体の
親のｐＺ４ｌｏｘＡＧ植物はＧＵＳの発現についてキメ
ラであると思われる。
【０１６０】葉のディスクを各植物から取り、そして前
述したようにカルス誘導アッセイにおいて試験した。結
果を表７に示す。期待するように、Ｃｒｅ組み換え酵素
は導入されなかったので、−／Ｈｐｔによる再形質転換
から生ずるすべての植物の９１％はクロロスルフロン抵
抗性に止まった。Ｃｒｅ／Ｈｐｔ−ＢによるｐＺ４Ｌｏ
ｘＡＧ植物の再形質転換を生ずる植物の９５％はクロロ
スルフロンに対する感受性を示した；３８植物のうちの
わずかに２つはクロロスルフロンに対して抵抗性に止ま
った。これらのデータが示すように、スルホニル尿素抵
抗性ＡＬＳ遺伝子はｃｒｅ解読領域を受け取った植物の
大部分においてもはや機能せず、それがｌｏｘＰ部位に
おいてｃｒｅ仲介組み換えにより切除されていることを
示唆する。
【０１６１】切除が起こったことを評価するために、再
形質転換体から調製したＤＮＡをサザンブロットで分析
した。ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化した後、ゲル電気泳動
にかけ、そしてフィルターに移した。３５Ｓプロモータ
ーから成る断片を調製し、放射線標識し、そしてブロッ
トした植物ＤＮＡにハイブリダイゼーションさせた。６
ｋｂのバンドがｃｒｅを受け取らなかった再形質転換体
において検出された。このバンドは、ＧＵＳ解読領域に
対して３’に位置するＥｃｏＲＩ部位からＡＬＳ解読領
域内に位置するＥｃｏＲＩ部位まで伸長するＤＮＡ断片
を表す（参照、図６）。それはＧＵＳ解読領域、ＧＵＳ
の発現を調節する３５Ｓプロモーター、ＡＬＳの発現を
調節する３５ＳプロモーターおよびＡＬＳ解読領域の一
部分を含む。３．２ｋｂのバンドは、ｃｒｅを受け取っ
た植物からのＤＮＡの中に検出された。このバンドは、
ＧＵＳ解読領域に対して３’に位置するＥｃｏＲＩ部位
から、末端のｌｏｘＰ部位のちょうど外側に位置するＥ
ｃｏＲＩ部位まで伸長するＤＮＡ断片を表す。それはＧ
ＵＳ解読領域およびＧＵＳの発現を調節する３５Ｓプロ
モーターを含む。６ｋｂから３．２ｋｂの検出された断
片のシフトは、ＡＬＳ解読領域を含む、ｌｏｘＰ部位の
間に位置するＤＮＡセグメント、およびその発現を調節
する３５Ｓプロモーターの切除を評価する。
【０１６２】 表７ カルス誘導アッセイにより決定した−／ＨｐｔおよびＣｒｅ／Ｈｐｔ−Ｂで再 形質転換後に回収されたクロロスルフロン抵抗性および感受性1 植物の数 もとの形質 再形質転換体 転換体 Hpt/- Cre/Hpt-B ＃ ＃ ＃ ＃ ID 抵抗性？ 抵抗性 感受性 抵抗性 感受性 D1 あり 7 0 2 11 D2 あり 4 0 0 5 D3 あり 9 0 0 8 D4 あり 6 0 0 8 D5 あり 42 2 0 4 WT なし 0 11 抵抗性は平均重量／葉のディスク≧１．０ｇとして定
義し、そして感受性は平均重量／葉のディスク≦０．２
ｇとして定義する。
【０１６３】2これらの形質転換体の１つは１つの実験
において抵抗性であり、そして他の実験において感受性
であった。
【０１６４】（実施例８） （ｌｏｘＰ−ｃｒｅ系を使用するトランスジェニックア
ラビドプシスからのＳＵ抵抗性ＡＬＳマーカーの欠失）
スルホニル尿素（ＳＵ）抵抗性マーカー遺伝子をトラン
スジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓ）植物から排除し、キメラ３５Ｓ／Ｐ−ＧＵＳ遺伝子
をゲノムの中に残した。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のプラスミドの構成および形質転
換は実施例７に記載されている。
【０１６５】すべての転移のために層状流れのフードを
使用する、無菌の培地および異種生物を混じない植物／
バクテリアの培養物の操作のための標準無菌的技術に従
った。培地の組成を表８に記載する。特記しない限り、
２５×１００ｍｍのペトリのプレート、フィルターテー
プでシールされた［カロリナ・バイオロジカル・サプラ
イ・カンパニー（Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ ＳｕｐｐｌｙＣｏ．）、ノースカロライナ州バー
リントン］を植物組織の培養のために使用した。植物組
織のインキュベーションは、特記しない限り、混合した
蛍光および「グロ・アンド・ショウ（Ｇｒｏ ａｎｄ
Ｓｈｏ）」植物［ゼネラル・エレクトリック（Ｇｅｎｅ
ｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）」光で一定に照明して２３
℃において実施した。
【０１６６】外植体源は、アラビドプシス・タリアナ
（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）
（Ｌ．）、へい（Ｈｅｙｎｈ）、ジオグラフィック・レ
ース・ワシレウシジャ（ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｒａｃ
ｅ Ｗａｓｓｉｌｅｗｓｈｉｊａ）の試験管内成長した
根であった。種子を５０％の商用漂白剤および０．１％
のＳＤＳの溶液の中で１０分間滅菌し、無菌の水で３〜
５回すすぎ、無菌の濾紙上でよく乾燥し、次いで２〜３
個の種子を２５０ｍｌのベルコ（Ｂｅｌｃｏ）フラスコ
内の５０ｍｌの液体のガンボーグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）の
Ｂ５培地（Ｇｉｂｃｏ＃５６０−１１５３）の中に撒い
た。フラスコにふたをし、７０〜８０ｒｐｍの回転振盪
機上に配置し、そして３〜４数週インキュベーションし
た。
【０１６７】アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）で接種する前に、根組織をカルス誘導培地
（ＭＳＫｉｇ、下を参照）上で培養した。ベルコフラス
コから根の塊と取り出し、それをペトリ皿の中に入れ、
ピンセットを使用し、根の塊から根の小さい束を引き、
そしてそれらをＭＳＫｉｇ培地上に配置した。ペトリ皿
をフィルターテープでシールし、そして４日間インキュ
ベーションした。
【０１６８】バイナリープラスミドｐＺ４ｌｏｘＡＧを
含有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）細胞の培養物を、前述したように、１００ｍｇ／
ｌのカルボニシリンを含有するＹＥＰ培地の５ｍｌの中
で成長させた。バイナリーｐｌｍＣｒｅ／Ｈｐｔ−Ｂ
（実施例３）を含有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞の培養物を、５ｍｇ／ｌのテ
トラサイクリンを含有するＹＥＰ培地の５ｍｌの中で成
長させた。培養物を、２８℃に維持したニュー・ブルン
スウィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）のプラット
フォームの振盪機（２２５ｒｐｍ）の中のガラス培養管
中でほぼ１７〜２０時間成長させた。前以て培養した根
を０．５ｃｍのセグメントに切断し、そしてトリーポウ
ア（Ｔｒｉ−Ｐｏｕｒ）ビーカー［ＶＷＲサイエンティ
フィック（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、米国カリフォルニ
ア州サンフランシスコ］およびワイヤメッシュから作ら
れ、ペトリ皿の中のセットした、１００μｍのフィルタ
ーの中に配置した。根のセグメントを、一夜のアグロバ
クテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）培養物の
１：２０希釈物の３０〜５０ｍｌの中で周期的に混合し
ながら、数分間接種した。接種した根を無菌の濾紙に移
して、液体の大部分を吸い取った。いくつかの根のセグ
メントから成る、根の小さい束を、１００μモルのアセ
トシリンゴン［３’，５’−ジメトキシ−４’−ヒドロ
キシアセト−フェノン、アルドリッヒ・ケミカル・カン
パニー（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．）、米国ウイスコンシン州ミルウォーキー］を含有
するＭＳＫｉｇ培地上に配置した。ペトリプレートをパ
ラフィルムまたはフィルターテープでシールし、そして
２〜３日間インキュベーションした。
【０１６９】感染後、根のセグメントをすすぎ、そして
後述するように抗生物質を有するシュート誘導培地に移
した。根の束を１００μｍのフィルターユニット（前述
の）の中に配置し、そして３０〜５０ｍｌの液体ＭＳＫ
ｉｇ培地ですすいだ。フィルターを溶液の中で激しく振
盪してアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）の除去を促進し、きれいなペトリ皿に移し、そして
再びすすいだ。根を無菌の濾紙上にブロットし、そして
根の束を５００ｍｇ／ｌのバンコマイシンおよび２５ｐ
ｐｂのクロロスルフロン（ｐＺ４ｌｏｘＡＧ）または１
５ｍｇ／ｌのヒグロマイシン（Ｃｒｅ／Ｈｐｔおよび−
／Ｈｐｔ）を含有するＭＳｇ（下を参照）培地上に配置
した。プレートをフィルターテープでシールし、そして
１２〜１４日間インキュベーションした。
【０１７０】緑の根粒および小さいシュートの原器は約
２〜３週に可視であった。外植体は完全に放置したか、
あるいは多数の片に破壊しそしてそれを以上のシュート
の発育のために２００〜３００ｍｇ／ｌのバンコマイシ
ンおよび２５ｐｐｂのクロロスルフロン（ｐＺ４ｌｏｘ
ＡＧ）または１０ｍｇ／ｌのヒグロマイシン（Ｃｒｅ／
Ｈｐｔおよび−／Ｈｐｔ）を含有するＧＭ培地上に配置
した。それらが発育するとき、個々のシュートをカルス
から分離し、そして１００ｍｇ／ｌのバンコマイシンお
よび２５ｐｐｂのクロロスルフロン（ｐＺ４ｌｏｘＡ
Ｇ）または１０ｍｇ／ｌのヒグロマイシン（Ｃｒｅ／Ｈ
ｐｔおよび−／Ｈｐｔ）を含有するＭＳＲｇ培地上に配
置した。皿を前述したようにシールし、そして数〜７日
間インキュベーションした。次いで、シュートを２５×
１００ペトリ皿または（Ｍａｇｅｎｔａ）ＧＡ７容器の
中の１００〜２００ｍｇ／ｌのバンコマイシンを含有す
るＧＭ培地に移した。個々の容器に移した多数の一次形
質転換体（Ｔ１）は種子（Ｔ２）を結んだ。
【０１７１】Ｔ２種子を選択した推定上の形質転換体か
ら収穫し、そして２５ｐｐｂのクロロスルフロン（ｐＺ
４ｌｏｘＡＧ）または１０〜３０ｍｇ／ｌのヒグロマイ
シン（Ｃｒｅ／Ｈｐｔおよび−／Ｈｐｔ）を含有するＧ
Ｍ培地上にまいた。プレートを４℃において２日または
それ以上の間冷時処理し、次いで前述の一定の照明下に
２３℃において１０〜２０日間インキュベーションし
た。実生を抵抗性（緑色、真の葉は発育する）および感
受性（真の葉は発育しない）としてスコアをつけた。
【０１７２】選択したクロロスルフロンまたはヒグロマ
イシン抵抗性のＴ２固体を土に移し、そして６０〜８０
％の相対湿度において２３℃において日中（１４時
間）、１８℃において夜中（１０時間）成熟に成長させ
た。
【０１７３】Ｃｒｅ／Ｈｐｔ−Ｂ植物（ヒグロマイシン
抵抗性）およびｐＺ４ｌｏｘＡＧ（クロロスルフロン抵
抗性）の遺伝的交雑を実施し、そして生ずる種子を成熟
に成長させた。種子を集め、滅菌し、３０ｍｇ／ｌのヒ
グロマイシンを含有するＧＭ（表８）上に配置し、そし
て実生からの組織を前に記載したようにＸ−ｇｌｕｃで
ＧＵＳ活性について試験した。ヒグロマイシン抵抗性お
よびＧＵＳ活性の両者を示す（それらはｃｒｅおよびｌ
ｏｘＰ構成体の両者を受け取ったことを示す）実生を、
茎組織がカルス誘導アッセイのために得ることができる
まで、成長させた。茎組織を選択した形質転換体から取
り、そして２５ｍｇ／ｌのクロロスルフロンを含むか、
あるいは含まないＭＳＫｉｇ培地上に配置した。カルス
の成長を３週以内に記録した。ｐＺ４ｌｏｘＡＧの植物
を自家受粉させ、種子を集め、滅菌し、２５ｐｐｂのク
ロロスルフロンを含有するＧＭ上に配置し、そして対照
として使用した（参照、結果について表９）。Ｃｒｅ／
Ｈｐｔ−Ｂ植物とｐＺ４ｌｏｘＡＧ植物との間の交雑を
生ずるＧＵＳ陽性の実生の大部分におけるクロロスルフ
ロンに対する感受性は、これらの実生において、ＳＵ抵
抗性ＡＬＳマーカー遺伝子がもはや機能しないことを示
し、それがｌｏｘＰ部位の間にＣｒｅ仲介組み換えによ
り切除されていることを示唆する。
【０１７４】クロロスルフロン感受性植物を土の中に配
置し、そして成熟させる。Ｔ３を集め、滅菌し、そして
３０ｍｇ／ｌのヒグロマイシンまたは２５〜１００ｐｐ
ｂのクロロスルフロンを含むか、あるいは含まないＧＭ
培地上で発芽させた。プレートをフィルターテープでシ
ールし、４℃において２日またはそれ以上の間冷時処理
し、次いで前述の一定の照明下に２３℃において１０〜
２０日間インキュベーションした。実生を抵抗性および
感受性としてスコアをつけ、そして結果を記録した。代
表的な実生をＧＵＳ活性についてスクリーニングした。
いくつかの実生はＧＵＳ活性を示すが、クロロスルフロ
ンに対して抵抗性でなく、ＳＵ抵抗性ＡＬＳマーカー遺
伝子がもはや機能せず、それがｌｏｘＰ部位の間にＣｒ
ｅ仲介組み換えにより切除されていることを示唆する。
【０１７５】切除が起こったことを評価するために、こ
れらの植物から調製したＤＮＡをサザンブロットで分析
した。ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、次いでゲル電気泳
動にかけ、そしてフィルターに移した。３５Ｓプロモー
ターから成るＤＮＡ断片を調製し、放射線標識し、そし
てブロットした植物ＤＮＡに対してハイブリダイゼーシ
ョンさせた。６ｋｂのバンドをｃｒｅを受け取らなかっ
た再形質転換の中で検出される。このバンドは、ＧＵＳ
解読領域に対して３’位置するＥｃｏＲＩ部位から、Ａ
ＬＳ解読領域内に位置するＥｃｏＲＩ部位へ伸長するＤ
ＮＡ断片を表す（参照、図６）。それはＧＵＳ解読領
域、ＧＵＳの発現を調節する３５Ｓプロモーター、ＡＬ
Ｓの発現を調節する３５Ｓプロモーター、およびＡＬＳ
解読領域の一部分を含む。３．２ｋｂのバンドはｃｒｅ
を受け取った植物からのＤＮＡの中で検出される。この
バンドは、ＧＵＳ解読領域に対して３’に位置するＥｃ
ｏＲＩ部位から、末端のｌｏｘＰ部位のちょうど外側に
位置するＥｃｏＲＩ部位へ伸長するＤＮＡ断片を表す。
それはＧＵＳ解読領域およびＧＵＳの発現を調節する３
５Ｓプロモーターを含む。６ｋｂ〜３．２ｋｂの検出さ
れた断片の大きさのシフトは、ＡＬＳ解読領域およびそ
の発現を調節する３５Ｓプロモーターを含む、ｌｏｘＰ
部位の間に位置するＤＮＡセグメントの切除を評価す
る。
【０１７６】 表８ 培地の組成 ＹＥＰ培地 １リットル当たり バクトペプトン １０．０ｇ バクト酵母エキス １０．０ｇ ＮａＣｌ ５．０ｇ 寒天（任意） １５．０ｇ ｐＨ７．０基本的培地 １ｐｋｇのスクロースを含まないムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）およびスク ッグ（Ｓｋｏｏｇ）の最小有機培地（Ｇｉｂｃｏ ＃５１０およびＳｉｇｍａ ＃Ｍ６８９９） １０ｍｌのビタミンの補充液 ０．０５％のＭＥＳ ０．５ｇ／ｌ ０．８％の寒天 ８ｇ／ｌ ｐＨ５．８ビタミン補充液 −１００×原溶液 １０ｍｇ／ｌのチアミン ５０ｍｇ／ｌのピリドキシン ５０ｍｇ／ｌのニコチン酸ＧＭ ＝発芽培地 基本的培地 １％のスクロース １０ｇ／ｌＭＳＫｉｇ ＝カルス誘導培地 基本的培地 ２％のグルコース ２０ｇ／ｌ ０．５ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ ２．３μモル ０．３μモルのカイネチン １．４μモル ５ｍｇ／ｌのＩＡＡ ２８．５μモルＭＳｇ ＝シュート誘導培地 基本的培地 ２％のグルコース ２０ｇ／ｌ ０．１５ｍｇ／ｌのインドール−３−酢酸（ＩＡＡ） ０．８６μモル ５．０ｍｇ／ｌのＮ6−（Δ2イソペンテニル） ２４．６μモル −アデニン ２ｉＰＭＳＲｇ ＝シュート誘導培地 基本的培地 ２％のグルコース ２０ｇ／ｌ １２ｍｇ／ｌのインドール−３−酢酸（ＩＢＡ） ５８．８μモル ０．１ｍｇ／ｌのカイネチン ０４６μモル
【０１７７】 表９ ｐＺ４ｌｏｘＡＧおよびＣｒｅ／Ｈｐｔ−Ｂアラビドプシス 植物の間の交雑から生ずる実生のアッセイの結果 ＃クロロスルフロン感受性実生／ ＃ＧＵＳ陽性、ヒグロマイシン抵抗性 雌 雄 試験した実生 E1 B6 42/42 E2 B4 0/5 E3 B3 4/4 E4 B5 7/7 E5 B3 1/1 （実施例９） （化学的に調節されたトウモロコシのプロモーターＩｎ
２−２からのＣｒｅの発現）キメラ遺伝子：Ｉｎ２−２
／Ｐ−ｃｒｅ−Ｎｏｓ３’を構成することによって、Ｎ
−（アミノカルボニル）−２−クロロベンゼンスルホン
アミドにより誘発される、Ｉｎ２−２プロモーターのコ
ントロール下にＣｒｅの発現を配置した。この構成する
ために出発材料は、実施例１および２に記載する、プラ
スミドＣｒｅ／Ｈｐｔ−Ａであった。Ｃｒｅ／Ｈｐｔ−
ＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで消化し、そしてｃ
ｒｅ解読領域およびＮｏｓ３’を含有するＤＮＡ断片を
分離した。このＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ断片を、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで消化しそして脱リン酸化し
たベクターブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）
ＳＫ（＋）［ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）、カタログ＃２１２２０５］の中にサブクローニン
グし、ｐＢＳＣｒｅと表示するプラスミドを産生した。
【０１７８】ｐＢＳＣｒｅへのＩｎ２−２プロモーター
の付加は、ＷＯ９０／１１３６１に記載されているプラ
スミドＨＰＨ４６３ｄａｍ（−）および２−２（３．
９）を使用して達成した。プラスミド２−２（３．９）
は、２−２遺伝子を含有するゲノムのクローンから誘導
された３．９ｋｂのＳａｌＩ断片を含有するｐＵＣ１８
プラスミドである。３．９ｋｂの断片は、転写開始部位
の５’に位置する３．６ｋｂのプロモーター配列および
２−２タンパク質のための１８０ｂｐの解読領域を含
む。プラスミドｐＨＰＨ４６３ｄａｍ（−）は、トウモ
ロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）１−１
Ｓアルレからの５’未翻訳リーダーに接合した１３６ｂ
ｐの２−２プロモーターを有するキメラプロモーターを
含有するブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）Ｓ
／Ｋ（＋）［デンニス（Ｄｅｎｎｉｓ）ら、核酸の研究
（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１２：３９８３−
４０００（１９８４）］である、翻訳開始コドンにＮｃ
ｏＩ部位が組み込まれている。ＨＰＨ４６３ｄａｍ
（−）をＣｌａＩで消化し、そして生ずる５’オーバー
ハングをクレノーでフィルインした。次いで生ずるＤＮ
ＡをＸｂａＩで消化し、そして２−２プロモーターの
３’部分およびトウモロコシＡＤＨリーダーを含有する
ＣｌａＩプラント−ＸｂａＩ断片を分離した。プラスミ
ドｐＢＳＣｒｅをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして生ず
る５’オーバーハングをクレノーでブラントとした。次
いで、このｐＢＳＣｒｅのＤＮＡをＸｂａＩ（ポリリン
カーの中に位置する）で完全消化し、そして仔ウシ腸ホ
スファターゼを使用して脱リン酸化した。次いで、ＨＰ
Ｈ４６３ｄｍａ（−）から誘導されたＣｌａＩブランド
−ＸｂａＩ断片および脱リン酸化したｐＢＳＣｒｅを一
緒に結合して、ｐＢＳＣｒｅ１０１と表示するプラスミ
ドを生じた。この構成体は、トウモロコシＡＤＨ遺伝子
からの５’未翻訳リーダー配列を含む修飾した２−２プ
ロモーターの転写コントロール下に、ｃｒｅ解読領域を
含有する。
【０１７９】次に、Ｉｎ２−２プロモーターの５’末端
部分をｐＢＳＣｒｅ１０１に付加した。前述のプラスミ
ド２−２（３．９）をＸｂａＩおよびＡａｔＩＩで完全
に消化し、そして１．２ｋｂの２−２プロモーターを含
有する断片を分離した。プラスミドｐＢＳＣｒｅ１０１
をＸｂａＩおよびＡａｔＩＩで消化した。生ずる構成体
をｐＢＳＣｒｅ１０２と表示した。
【０１８０】次にｐＢＳＣｒｅ１０２をＸｂａＩおよび
ＸｈｏＩで消化し、そして全体のＩｎ２−２／Ｐ−ｃｒ
ｅ−Ｎｏｓ３’キメラ遺伝子を含有する断片を、Ｘｂａ
ＩおよびＸｈｏＩで消化しそして脱リン酸化したｐＪＪ
２６４４に結合し、ｐＢＳ１０３を生成した。ｐＢＳ１
０３は、図７に示されており、アグロバクテリウム・ツ
メファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の中に
形質転換し、そして生ずる菌株を使用して材料および方
法に記載されているようにタバコの形質転換体を得た；
３０ｍｇ／ｌのヒグロマイシンを選択のために使用し、
そして葉のディスクを２〜３週毎に新鮮な培地上に配置
した。
【０１８１】独立の一次形質転換体をマゼンタボックス
の中で成長させ、若い葉を収穫し、そして液体窒素の中
で凍結した。最初の収穫後１週に、シュートの先端を収
穫し、そして２００ｍｇ／ｌのＮ−（アミノカルボニ
ル）−２−クロロベンゼンスルホンアミドを含有する
０．５×ホーグランド（Ｈｏａｇｌａｎｄ）溶液（表１
１）を充填した１５ｍｌのファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）
管の中に配置した。植物がほぼ２４時間の間誘導因子を
吸収させた。次いで誘導したシュートを収穫し、液体窒
素の中で凍結し、そして−８０℃において貯蔵した。
【０１８２】合計のＲＮＡを、コルバート（Ｃｏｌｂｅ
ｒｔ）ら［プロシーディングス・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８０：２２４８−２２５
２（１９８３）］に記載されているように、両者の組の
試料から分離した。誘導されないおよび誘導された形質
転換された植物からの反復実験のＲＮＡ試料をニトロセ
ルロースのフィルターに移し、そしてニック翻訳したｐ
ＢＳＣｒｅでプロービングした。２６の一次形質転換体
は非誘導状態でｃｒｅ ｍＲＮＡをわずかにもつか、あ
るいはまったくもたず、そしてＮ−（アミノカルボニ
ル）−２−クロロベンゼンスルホンアミドで処理後、強
いハイブリダイゼーションするｃｒｅ ＲＮＡシグナル
を有した。この結果が実証するように、ｃｒｅ遺伝子の
発現は、Ｉｎ２−２プロモーターのコントロール下にあ
るとき、首尾よく調節された。
【０１８３】表１０ ０．５×ホーグランド栄養溶液 １．０ミリモルのリン酸アンモニウム、１塩基性 ４．０ミリモルの硝酸カリウム ４．０ミリモルの硝酸カルシウム ２．０ミリモルの硫酸マグネシウム １．０ミリモルの硝酸アンモニウム ５．０ｐｐｂのセクエストレン（Ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｅ
ｎｅ） ９．２μモルの塩化マンガン ４６．０μモルのホウ酸 ０．７７μモルの硫酸亜鉛 ０．３２μモルの硫酸第二銅 ０．１１μモルのモリブデン酸 （実施例１０） （ｌｏｘＰ−ｃｒｅ仲介組み換えの化学的調節） 実施例９に記載するＮ−（アミノカルボニル）−２−ク
ロロベンゼンスルホンアミドによる誘導に応答するＩｎ
２−２／Ｐ−ｃｒｅ−Ｎｏｓ３’遺伝子を含有する形質
転換体を、節Ｆに記載されているように、節Ｇに記載す
るホモ接合性ｌｏｘＰ植物と交雑した。生ずる種子をヒ
グロマイシンの存在下に発芽させて、ｃｒｅ遺伝子を受
け取る子孫を選択した。すべての子孫はホモ接合性親か
らｌｏｘＰ構成体を受け取る。葉のディスクを選択した
子孫から取り、そして前述したようにカナマイシン培地
上のカルスに誘導される。カルスの形成の欠如は、カナ
マイシン抵抗性遺伝子がｌｏｘＰ−ｐｏｌＡ−ｌｏｘＰ
断片の挿入のために非機能的である、ｌｏｘ構成体が完
全に止まること、および組み換えが起こらなかったこと
を示す。Ｃｒｅの発現は、また、Ｎ−（アミノカルボニ
ル）−２−クロロベンゼンスルホンアミドまたは関係す
る誘導性化学物質で、噴霧により、シュートの先端また
は葉の切断しそして珠柄系を通して吸収させることによ
るか、あるいは誘導因子を含有する培地上に組織の外植
体を配置することによって、子孫において誘導させる。
誘導後、葉のディスクを再びカナマイシンの存在下にカ
ルスの成長についてアッセイする。この組織の成長は、
ｌｏｘＰ部位におけるＣｒｅ仲介組み換えがｐｏｌＡ断
片を切除し、そしてカナマイシン抵抗性遺伝子の機能を
回復することを示す。こうして、Ｉｎ２−２／Ｐ−ｃｒ
ｅ−Ｎｏｓ３’およびｌｏｘＰ構成体を含有する植物に
誘導性化学物質を適用した後のみ、組み換えは起こる。
【０１８４】（実施例１１）（ハイブリッド種子の生産
に対して分子遺伝学的アプローチにおける捻性の回復）
雄性不捻性を引き起こす他のプロモーター−細胞分裂キ
メラ遺伝子をハイブリッド植物のゲノムから欠失して、
受精の回復を生ずる。使用するＡ／Ｐ−ＣＤ遺伝子は、
欧州特許出願（ＥＰＡ）第８９−３４４０２９号に記載
されているように、ＴＡ２９のプロモーター、バーナー
ゼ解読領域、およびＮＯＳ３’末端から成る。一直線に
反復するｌｏｘＰ部位によりフランキングされたＡ／Ｐ
−ＣＤ遺伝子、および、左および右のＴ−ＤＮＡ境界配
列の間に、カナマイシン抵抗性選択遺伝子として、キメ
ラＮｐｔＩＩ遺伝子から成るバイナリーベクターを構成
する。バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡの線図を下に示
す：
【外１】
【０１８５】このプラスミドを、Ｌｏｘ／ＡＤと呼び、
前述したように、アグロバクテリウム・ツメファシエン
ス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４の中
に転移し、そして生ずる菌株を使用してタバコ形質転換
体を得る。生ずるＬｏｘ／ＡＤを含有する形質転換体を
成熟に成長させ、そしてＡ／Ｐ−ＣＤ遺伝子の正しい発
現を示す雄性不捻性について試験する。雄性不捻性Ｌｏ
ｘ／ＡＤ植物は、自殖のとき種子を生産しないおよび／
または花粉を生産する植物として同定される。これらの
植物を、節Ｃにおいて得られた、ホモ接合性３５Ｓ／Ｐ
−Ｃｒｅ植物からの花粉で受精させ、そして種子を前述
したように収穫する。種子を滅菌し、そしてカナマイシ
ンの存在下にＭＸ− 培地上に植える。カナマイシンに
対して抵抗性であり、したがってＬｏｘ／ＡＤ構成体を
受け取った実生を、成熟に成長させ、そして雄性捻性に
ついて試験する。捻性の回復を花粉を発育させ、そして
自殖のとき種子を産生する能力により同定する。捻性の
回復は、Ａ／Ｐ−ＣＤ遺伝子がＣｒｅタンパク質とｌｏ
ｘＰ部位との相互作用のために欠失されることを示す。
【０１８６】（実施例１２） （Ｆ１種子の発育のＣｒｅ−ｌｏｘ仲介分裂）ｌｏｘＰ
−Ｃｒｅ系を使用して種子分裂遺伝子を活性化すること
によって、Ｆ１種子を発育中断させる。種子分裂遺伝子
の１つの成分は、種子の中でのみ発現されるプロモータ
ーである。この型のプロモーターは、その発現が自然に
胚および／または内乳に関連する遺伝子から誘導するこ
とができる。使用に望ましいプロモーターは、胚発現の
ファゼオリンのβ−サブユニット（β−Ｐｈ）から誘導
されるか、あるいは内乳および胚における種子の発育の
初期に高度に発現される、ダイスのβ−コングリシニン
のａ’サブユニット（ａ’−β−ＣＧ）から誘導され
る。これらの２つの遺伝子はドイル（Ｄｏｙｌｅ）ら
［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２６１：９２２８−９
２３８（１９８６）］に記載されている。
【０１８７】種子分裂遺伝子の第２成分は、正常の細胞
の機能を分裂するタンパク質を産生する解読領域であ
る。１つの例は、ハートレイ（Ｈａｒｔｌｅｙ）［ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．）、２０２：９１３−９１５（１９８
８）］によりクローニングされかつ特性決定され、そし
て欧州特許出願（ＥＰＡ）第８９−３４４０２９号にお
いて使用された、バチルス・アミロリクエファシエンス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｈｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅ
ｎｓ）から誘導されたバーナーゼの解読領域である。第
３成分はポリアデニル化シグナル配列領域であり、これ
は植物細胞の中で機能的であるほとんどの任意の遺伝子
３’末端から誘導することができる。この実施例におい
て、われわれはマメのファゼオリンの遺伝子からの３’
領域を使用する［チー（Ｃｈｅｅ）ら、遺伝子（Ｇｅｎ
ｅ）４１：４５７（１９８６）］。種子分裂遺伝子は、
実施例５においてＮＯＳ／Ｐ−ＮｐｔＩＩ遺伝子につい
て記載したようにプロモーターと解読領域との間にｌｏ
ｘＰ−ｐｏｌＡ−ｌｏｘＰのＤＮＡ断片を配置すること
によって、不活性の形態にする。β−Ｐｈまたはａ’−
β−ＣＧプロモーター、バーナーゼ解読領域（ｂａ
ｒ）、およびファゼオリン３’領域（Ｐｈ３’）を含有
する不活性および活性（対照）のキメラ遺伝子を次のよ
うにして構成する。
【０１８８】それぞれ、ｐＵＣ１８ｐｖＰｐｖＳおよび
ｐＵＣ１８ｇｍＰｐｖＳと呼ぶ、β−Ｐｈプロモーター
およびＰｈ３’またはａ’−β−ＣＧプロモーターおよ
びＰｈ３’を含有するプラスミドを、アプジョン・カン
パニー（Ｕｐｊｏｉｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）のジェリイ・
スライトム（Ｊｅｒｒｙ Ｓｌｉｇｈｔｏｍ）博士から
入手した。これらの２つのプラスミドの中に含有される
プラスミドおよび３’領域を、ドイル（Ｄｏｙｌｅ）ら
［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２６１：９２２８−９
２３８（１９８６）］に記載されている遺伝子から、サ
イキ（Ｓａｉｋｉ）ら［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）、２３９：４８７−４９１（１９８７）］に記載さ
れているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順を使用し
て合成した。ＰＣＲ手順の間に、ＮｃｏＩ部位を翻訳開
始ＡＴＧおよびＰｈ３’配列に対して５’に、ＮｃｏＩ
制限部位認識配列を適当な合成オリゴヌクレオチドプラ
イマーの中に組み込むことによって付加した。同様に、
ＨｉｎｄＩＩＩ部位をプロモーター断片の５’末端に付
加した。合成プロモーターおよび３’領域の断片を導入
したＮｃｏＩ部位において接合し、そしてｐＵＣ１８の
ＨｉｎｄＩＩＩ部位の中に結合した（ＨｉｎｄＩＩＩ部
位は自然にＰｈ３’断片の末端に生ずる）。生ずるプラ
スミドｐＵＣ１８ｐｖＰｐｖＳおよびｐＵＣ１８ｇｍＰ
ｐｖＳの各をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、末端
をクレノー酵素でフィルインし、そして再結合してＥｃ
ｏＲＩとＳａｌＩとの間に位置するポリリンカー部位を
欠失した。生ずるプラスミドを、それぞれ、ＣＷ１０４
およびＣＷ１０５と命名した。次いでこれらのプラスミ
ドの各々をＮｃｏＩで消化し、そして制限部位：Ｎｃｏ
Ｉ、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩおよび不完全Ｎｐｔ
Ｉをもつ合成オリゴヌクレオチドを添加した。生ずるプ
ラスミドをＣＷ１０８およびＣＷ１０９と命名した。
【０１８９】バルナーゼ酵素の細胞に対して致死的であ
るので、バルスターと呼ぶバルナーゼの阻害因子を同一
細胞の中で発現させる。バチルス・アミロリクエファシ
エンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｈｌｏｌｉｑｕｅｆａ
ｃｉｅｎｓ）から分離したバルスター遺伝子およびバル
ナーゼ遺伝子を含有するｐＭＴ４２０プラスミドを、ロ
バート・ハートレイ（Ｒｏｂｅｒｔ Ｈａｔｌｅｙ）博
士ＮＩＨから入手した。これらの遺伝子はハートレイ
（Ｈａｔｌｅｙ）［ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、２０２：９
１３−９１５（１９８８）］に記載されている。バルス
ター遺伝子をｐＭＴ４２０からＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ断片として分離し、そしてＰｓｔＩ（独特ＰａｓＩポ
リリンカー部位はＰｈ３’の断片３’末端におけるＨｉ
ｎｄＩＩＩ部位の後に存在する）およびＨｉｎｄＩＩＩ
消化したＣＷ１０８の中に結合した。ＨｉｎｄＩＩＩ
β−ＰｈプロモーターおよびＰｈ３’断片を保持しそし
てバルスター遺伝子を含有するプラスミドを同定し、そ
して１０８Ｂと命名した。Ｐｈ３’およびバルスターを
含有するＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ断片を分離し、そしてＮｃ
ｏＩおよびＰｓｔＩ消化したＣＷ１０９に結合して１０
９Ｂをつくった。
【０１９０】完全なバルナーゼタンパク質は、分泌に関
係するプレ配列（ｐｒｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、フォル
ディングに関係するプロ配列（ｐｒｏ−ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ）、および酵素活性を含有する成熟タンパク質配列を
含む。成熟タンパク質配列のみの発現が植物細胞の分裂
において最も有効であると、われわれは提案する。欧州
特許出願（ＥＰＡ）第８９−３４４０２９号は植物細胞
分裂タンパク質としてバルナーゼを使用するが、それは
植物細胞の中の発現のためのバルナーゼ遺伝子の構成に
ついて詳細に開示していない。発現されるバルナーゼ解
読領域の部分についての情報は与えられていない。
【０１９１】成熟バルナーゼタンパク質（ｂａｒ）につ
いて解読領域を含有するＤＮＡ断片を調製するために、
バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓａｍｈｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＤＮＡをサイ
キ（Ｓａｉｋｉ）ら［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、
２３９：４８１−４９１（１９８７）］に記載されてい
るＰＣＲ手順のための鋳型として使用した。成熟タンパ
ク質の解読領域の５’末端にインフレームの翻訳開始Ａ
ＴＧを含む、ＮｃｏＩ部位および翻訳停止コドンの後に
ＸｂａＩ部位を付加した合成プライマーを作った。増幅
したＤＮＡ断片をＮｃｏＩおよびＸｂａＩで消化し、そ
してＮｃｏＩおよびＸｂａＩ消化１０８Ｂに結合して１
０８ＢＢをつくり、そのときこれは活性形態の種子分裂
遺伝子を含有する。同様に、１０９ＢＢを構成する。
【０１９２】不活性形態の種子分裂遺伝子を調製するた
めに、まずプロモーター断片の３’末端におけるＮｃｏ
Ｉ部位を、前述のＣＷ１０８およびＣＷ１０９から、各
プラスミドをＮｃｏＩで消化しそしてＳ１ヌクレアーゼ
で処理することによって除去した。Ｓ１処理したＣＷ１
０８を再結合し、ＮｃｏＩを失ったプラスミドを制限マ
ッピングおよびＤＮＡ配列決定により同定し、そして１
０８Ｎと命名した。Ｓ１処理したＣＷ１０９をＳｍａＩ
（この部位はＮｃｏＩ部位に隣接する）で消化しそして
再結合した。ＮｃｏＩ部位を失ったプラスミド制限マッ
ピングおよびＤＮＡ配列決定により同定し、そして１０
９Ｎ１と命名した。１０９Ｎ１をＡｓｐ７１８およびＸ
ｂａＩで消化し、そして部位Ａｓｐ７１８、ＸｈｏＩ、
ＮｃｏＩおよびＸｂａＩをもつ合成オリゴヌクレオチド
リンカーを付加した。生ずるプラスミドを１０９Ｎ１Ｘ
と命名し、これをＸｈｏＩおよびＮｃｏＩで消化し、そ
してＸｈｏＩ−ＮｃｏＩ ｌｏｘＰ−ｐｏｌＡ−ｌｏｘ
Ｐ ＤＮＡ断片を添加した。この断片はｐ６９ｓｓＮで
あり、これは実施例５に記載されているｐＢＳ６９ｐｏ
１Ａの誘導体であった。ｐ６９ｓｓＮを作るために、ｐ
ＢＳ６９ｐｏｌＡを１つのｌｏｘＰ部位の外側に位置す
るＨｉｎｄＩＩＩ部位において消化し、末端をフィルイ
ンし、そしてＮｃｏＩリンカーを添加した。ｌｏｘＰ−
ｐｏｌＡ−ｌｏｘＰ断片を含有する１０９Ｎ１Ｘを１０
９ｌｏｘ２と呼んだ。このプラスミドをＮｃｏＩおよび
ＰｓｔＩで消化し、そしてｂａｒ、Ｐｈ３’およびバル
スターを含有する１０９ＢＢから調製したＮｃｏＩ−Ｐ
ｓｔＩ断片を添加して１０９ｌｏｘ２ＢＢをつくる。こ
のプラスミドは不活性の種子分裂遺伝子を含有する。１
０８ＮをＡｓｐ７１８およびＰｓｔＩで消化し、そして
１０９８ｌｏｘ２ＢＢから調製したＡｓｐ７１８−Ｐｓ
ｔＩ断片を添加する。生ずるプラスミドを１０８ｌｏｘ
２ＢＢと命名し、そしてこれは不活性の種子分裂遺伝子
を含有する。
【０１９３】不活性および活性の細胞分裂遺伝子の各々
はバイナリーベクターの中に動き、ＮｐｔＩＩ遺伝子は
境界内に存在しそして付加したバルスター遺伝子はＴ−
ＤＮＡ境界の外側に存在する。生ずるプラスミドをｐＺ
１０８ｌｏｘ２ＢＢ、ｐＺ１０９ｌｏｘ２ＢＢ、ｐＺ１
０８ＢＢおよびｐＺ１０９ＢＢと呼ぶ。これらのプラス
ミドはディスアームドアグロバクテリウム・ツメファシ
エンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の中に転移さ
せ、そして生ずる菌株を使用して、前述したようにして
形質転換体を得る。
【０１９４】ｃｒｅ解読領域の発現は、同一の発育的に
コントロールしたプロモーターを使用するか、あるいは
高度に活性な３５Ｓプロモーターを使用して、いっそう
効果的である。ｃｒｅ解読領域は、キメラＳＰ−ｃｒｅ
−Ｐｈ３’遺伝子：１０８Ｃｒｅおよび１０９Ｃｒｅを
構成する分裂遺伝子のために使用した同一の種子プロモ
ーターのコントロール下にある。これらの遺伝子をバイ
ナリーベクターの中にＴ−ＤＮＡ境界の中に、キメラス
ルホニル尿素抵抗性溶離マーカー遺伝子と一緒にクロー
ニングして、ｐＺ１０８ＣｒｅおよびｐＺ１０９Ｃｒｅ
プラスミドをつくった。これらのプラスミドをディスア
ームドアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の中に転移させ、そして生ずる
菌株を使用して、前述したようにしてタバコまたはアラ
ビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の形質転換体を
得る。ホモ接合性単一部位の植物を、前述したようにし
て一次形質転換体から誘導する。
【０１９５】ｐＺ１０８ｌｏｘ２ＢＢまたはｐＺ１０９
ｌｏｘ２ＢＢ形質転換されたホモ接合性植物を、ｐＺ１
０８ＣｒｅまたはｐＺ１０９Ｃｒｅを含有するホモ接合
性植物と交雑させ、そして節Ｃまたは実施例９に記載す
るホモ接合性Ｃｒｅ植物と交雑させる。種子のさやまた
は長角果を種子の不存在について検査し、種子分裂遺伝
子がｌｏｘＰ−ｃｒｅ系により活性化されることを示
す。
【０１９６】（実施例１３） （Ｆ２種子の発育のＣｒｅ−ｌｏｘ仲介分裂）Ｆ１種子
の発育は通常であり、そしてＦ２種子の発育はｌｏｘＰ
−ｃｒｅ系を使用する種皮分裂遺伝子を活性化すること
によって発育中断させる。前述の成熟バルナーゼ解読領
域および種皮特異的遺伝子から分離されたプロモーター
領域から成る、種皮分裂遺伝子を作る。種皮特異的遺伝
子は、次の工程を使用して分離する。種皮を未熟のスイ
カの種子から切り裂き、そして全体の細胞のＲＮＡを、
ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのグアジ
ニウムイソチオシアネート抽出手順および引き続くアウ
スベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら［分子生物学において現在
のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、４８１
−４８３（１９８７）］に記載されているＬｉＣｌ沈殿
を使用して調製する。葉の全体のＲＮＡのベイカー（Ｂ
ａｋｅｒ）ら［バイオテクニークス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ）９（３）、２６３−２７２（１９９０）］
に記載されている方法により分離した。次に、ポリアデ
ニル化（ｐｏｌＡ＋）ＲＮＡ分画を、ファーマシア（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）からのオリゴ（ｄＴ）−セルロース
のスピンカラムの２ラウンドの親和クロマトグラフィー
により、製造業者の手順に従い調製した。このｐｏｌＡ
＋ＲＮＡ調製のために作ったｃＤＮＡライブラリーはス
トラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から入手した。
このライブラリーのプレートから作った二重反復試験の
フィルター、あるいはコンクリング（Ｃｏｎｋｌｉｎ
ｇ）ら［プラント・フィジオロジー（Ｐｌａｎｔ Ｐｈ
ｙｓｉｏｌｏｇｙ）９３、１２０３−１２１１（１９９
０）］に従い調製した各個々のクローンから作ったＤＮ
Ａを含有する二重反復試験のスロットブロットを、サー
ジェント（Ｓａｔｇｅｎｔ）［分子クローニング技術に
対する案内（Ｃｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、バーガー
（Ｂｅｒｇｅｒ）およびキンメル（Ｋｉｍｍｅｌ）編、
４２３−４３２（１９８７）］に従い、種皮ｐｏｌＡ＋
ＲＮＡからまたは葉ｐｏｌＡ＋ＲＮＡから作った３２Ｐ
標識ｃＤＮＡプローブを使用して示差的にスクリーニン
グした。種皮のプローブのみに対してハイブリダイゼー
ションしたクローンを同定した。クリーニングしたｃＤ
ＮＡ配列を使用して、バイオラド（ＢｉｏＲａｄ）のプ
ロトコルに記載されているように、異なる植物組織から
作られたＲＮＡを使用して調製したノザンブロットをプ
ロービングすることによって、クローニングしたｃＤＮ
Ａ配列は種子特異的ＲＮＡから誘導されるとして評価さ
れる。特異的ＤＮＡを使用して、ＮＥＮからのキットお
よび含まれるプロトコルを使用して作られたスイカのＤ
ＮＡから作られた、ゲノムのライブラリーをプロービン
グし、そしてｃＤＮＡにより表される種子特異的ＲＮＡ
をエンコードする遺伝子を同定する。ゲノムのクローン
をマッピングして所望の遺伝子を位置決定する。転写体
の５’末端を、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら［分子
生物学において現在のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ）、４８１−４８３（１９８７）］に記載され
ているプライマー伸長実験により位置決定する。転写開
始部位の上流の約１ｋｂの配列を含むプロモーター領域
をＤＮＡ断片として調製する。この種皮プロモーター
を、上の実施例１３に記載されているように、バルナー
ゼ解読領域および引き続くファゼオリン３’領域に結合
して、ＳＣＰ−ｂａｒ−Ｐｈ３’と呼ぶキメラ遺伝子を
つくる。
【０１９７】このキメラ種皮分裂遺伝子を、実施例５に
おいてＮＯＳ／Ｐ−ＮｐｔＩＩ遺伝子について記載する
ように、プロモーターと解読領域との間にｌｏｘＰ−ｐ
ｏｌＡ−ｌｏｘＰ ＤＮＡ断片を付加することによっ
て、不活性の形態にする。不活性のＳＣＰ−ｂａｒ−Ｐ
ｈ３’遺伝子をバイナリーベクターの中に、Ｔ−ＤＮＡ
の間に、キメラのカナマイシン抵抗性選択マーカー遺伝
子と一緒にクローニングする。バイナリーベクターのＴ
−ＤＮＡの線図を下に示す。
【０１９８】
【外２】
【０１９９】このプラスミドは、ｌｏｘ／ＳＣＰＢ／Ｎ
ｐｔＩＩと呼び、ディスアームドアグロバクテリウム・
ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の中
に転移させ、そして生ずる菌株を使用して、前述したよ
うにしてタバコまたはアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏ
ｐｓｉｓ）の形質転換を得る。
【０２００】ｃｒｅ解読領域の発現は、同一の発育的に
コントロールしたプロモーターを使用するか、あるいは
高度に活性な３５Ｓプロモーターを使用して、いっそう
効果的である。ｃｒｅ解読領域は、キメラＳＰ−ｃｒｅ
−Ｐｈ３’遺伝子を構成する分裂遺伝子のために使用し
た同一の種子プロモーターのコントロール下にある。こ
の遺伝子をバイナリーベクターの中にＴ−ＤＮＡ境界の
間に、キメラスホニル尿素抵抗性溶離マーカー遺伝子と
一緒にクローニングして、ＳＣＰＣｒｅ／ＡＬＳｐプラ
スミドをつくる。このプラスミドをディスアームドアグ
ロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓ）の中に転移させ、そして生ずる菌株を使用
して、前述したようにしてタバコまたはアラビドプシス
（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の形質転換体を得る。
【０２０１】ｌｏｘ／ＳＣＰＢ／ＮｐｔＩＩを含有する
一次形質転換体を、ＳＣＰＣｒｅ／ＡＬＳを含有する一
次形質転換体と、および節Ｇおよび実施例８に記載され
ているホモ接合性Ｃｒｅ植物（キメラ３５Ｓ−Ｃｒｅ遺
伝子を含有する）と交雑する。一次形質転換体はヘテロ
接合性であるので、それらの交雑から生産される種子は
外来ＤＮＡの挿入をもつことができないか、両者または
いずれか１つをもつことができるであろう。したがっ
て、クロロスルフロンおよびカナマイシンの両者を含有
する培地上で種子を発芽させることによって、子孫を２
つのマーカー遺伝子、ＡＬＳおよびＮｐｔＩＩの存在に
ついてスクリーニングする。不活性の種皮分裂遺伝子お
よびキメラのｃｒｅ遺伝子の両者を有する抵抗性子孫は
成熟に成長しそして自殖する。種子のさやを種子の不存
在について検査して、種皮の分裂遺伝子がｌｏｘＰ−ｃ
ｒｅ系により活性化され、これによりＦ２種子の産生を
分裂することを示す。
【０２０２】ｌｏｘ／ＳＣＰＢ／ＮｐｔＩＩ植物とホモ
接合性３５Ｓ−Ｃｒｅ植物との交雑において、すべての
子孫はキメラのＣｒｅ遺伝子を受け取るので、種皮の分
裂遺伝子をまた含有する子孫を同定するためにカナマイ
シン選択のみが必要である。選択した植物は成熟に成長
させそして自殖させる。種子のさやを種子不存在につい
て検査し、種皮の分裂遺伝子は活性化されそしてＦ２種
子の産生において有効であることを示す。
【０２０３】ｌｏｘ／ＳＣＰＢ／ＮｐｔＩＩおよびＳＣ
ＰＣｒｅ／ＡＬＳ植物のホモ接合性系統を前述したよう
に生産し、そして交雑させる。種子のさやを種子の産生
について検査し、そして種子の生存可能性を発芽アッセ
イにおいて試験する。生存しうる種子の存在は、予測さ
れるように、不活性の種皮の分裂遺伝子が発育するＦ１
種子の種皮の中でその不活性状態を維持することを示
す。子孫を成熟に成長させそして自殖させる。種子のさ
やを種子不存在について検査し、種皮の分裂遺伝子は活
性化されそしてＦ２種子の産生において有効であること
を示す。ホモ接合性ｌｏｘ／ＳＣＰＢ／ＮｐｔＩＩ植物
とホモ接合性３５Ｓ−Ｃｒｅ植物と交雑させ、そして生
存しうるＦ１種子の産生を試験する。子孫を成熟に成長
させ、自殖させ、そしてＦ２種子の不存在が観察され
る。
【０２０４】いくつかの変更は本発明の精神および範囲
から逸脱しないで変化および変更が可能であることを理
解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】植物の形質転換のためにアグロバクテリウム
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）との交配において使用
するプラスミドの地図である。
【図２】Ｃｒｅ／Ｈｐｔ−Ｂベクターを収容するアグロ
バクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）で再形質転換され
たｌｏｘＰ植物における部位特異的組み換えを例示する
ものであって、カルス誘導アッセイからの結果を示す図
である。
【図３】Ｃｒｅ／Ｈｐｔ−Ｂベクターを収容するアグロ
バクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）で再形質転換され
たｌｏｘＰ植物における部位特異的組み換えを例示する
ものであって、ｌｏｘＰ／ＮｐｔＩＩ／Ｈｒａベクター
のｌｏｘ領域の地図である。
【図４】Ｃｒｅ／Ｈｐｔ−Ｂベクターを収容するアグロ
バクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）で再形質転換され
たｌｏｘＰ植物における部位特異的組み換えを例示する
ものであって、再形質転換された植物のサザンプロット
分析を示す図である。
【図５】ホモ接合性親からのｌｏｘＰ×Ｃｒｅハイブリ
ッドにおけるカナマイシン抵抗性を示す図である。
【図６】アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の
中に導入され、次いで植物の中に導入されたプラスミド
ｐＺ４ＬｏｘＡＧの地図である。
【図７】アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の
中に導入され、次いで植物の中に導入されたプラスミド
ｐＢＳＣｒｅ１０３の地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ラツセル，サンドラ・ホフ アメリカ合衆国ペンシルベニア州19311 エイボンデイル・クツクコート９ (72)発明者 ザウアー，ブライアン・リー アメリカ合衆国デラウエア州19805ウイ ルミントン・レツドスタートコート2514 (72)発明者 スー，フランシス・チユオ アメリカ合衆国デラウエア州19711ニユ ーアーク・コールドスプリングラン434 (56)参考文献 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ．，Ｖｏｌ．17，Ｎｏ．１，Ｐ．147 −161 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 A01H 5/00 C12N 5/10 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 植物細胞中でＤＮＡの部位特異的組換え
    を生じせしめる方法であって、 ｉ）第１のｌｏｘ部位、該第１のｌｏｘ部位と同じ向き
    の第２のｌｏｘ部位、およびそれらの間の前以て選択さ
    れたＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ配列を植物細胞中に
    導入し、そして ｉｉ）前記ｌｏｘ部位をＣｒｅと接触させ、これにより
    前記前以て選択されたＤＮＡセグメントを切り出すこと
    により前記部位特異的組換えを生じせしめる、ことを特
    徴とする方法。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法に用いる植物細胞
    であって、第１のｌｏｘ部位、該第１のｌｏｘ部位と同
    じ向きの第２のｌｏｘ部位、およびそれらの間の前以て
    選択されたＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ配列で形質転
    換されたことを特徴とする植物細胞。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載の方法に用いる植物細胞
    であって、Ｃｒｅタンパク質を含有することを特徴とす
    る植物細胞。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載の方法に用いる植物細胞
    であって、ｃｒｅコード領域で形質転換されたことを特
    徴とする植物細胞。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載の方法に用いる双子葉植
    物であって、第１のｌｏｘ部位、該第１のｌｏｘ部位と
    同じ向きの第２のｌｏｘ部位、およびそれらの間の前以
    て選択されたＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ配列で形質
    転換された細胞を含有することを特徴とする双子葉植
    物。
  6. 【請求項６】 請求項１に記載の方法に用いる双子葉植
    物であって、ｃｒｅコード領域で形質転換された細胞を
    含有することを特徴とする双子葉植物。
  7. 【請求項７】 請求項１に記載の方法に用いるためのＤ
    ＮＡであって、第１のｌｏｘ部位、該第１のｌｏｘ部位
    と同じ向きの第２のｌｏｘ部位、および植物細胞中での
    遺伝子発現に影響を及ぼす、遺伝子、コード領域および
    ＤＮＡ配列からなる群より選択される前以て選択された
    ＤＮＡセグメントを含むことを特徴とするＤＮＡ。
  8. 【請求項８】 前記遺伝子が特性遺伝子であり、前記Ｄ
    ＮＡ配列がポリアデニル化ヌクレオチド配列、選択マー
    カー、プロモーター、および調節ヌクレオチド配列から
    なる群から選択されることを特徴とする請求項８に記載
    のＤＮＡ。
  9. 【請求項９】 請求項７または８に記載の前記ＤＮＡを
    含むことを特徴とするプラスミド。
  10. 【請求項１０】 請求項１に記載の方法に用いるための
    ＤＮＡであって、ｃｒｅコード領域および植物細胞中で
    活性であるプロモーターを含むことを特徴とするＤＮ
    Ａ。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の前記ＤＮＡを含む
    ことを特徴とするプラスミド。
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