NL1009369C2 - Werkwijze voor het onderdrukken van de expressie van een gen. - Google Patents

Description

Werkwijze voor het onderdrukken van de expressie van een gen

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het onderdrukken van de expressie van een gen onder gebruikmaking van een DNA-omvattende vector welke in een gastheercel wordt gebracht.

5 Er zijn in het vak enkele van dergelijke werkwijzen bekend. Volgens een eerste techniek, anti-sense suppressie, wordt een DNA-volgorde in de gastheercel gebracht, welke DNA-volgorde een promotor en een coderende volgorde omvat. Door transcriptie van de DNA-volgorde wordt mRNA gevormd dat 10 complementair is met het mRNA van het te onderdrukken gen.

Hierdoor komt het te onderdrukken gen op eiwit-niveau niet of in verminderde mate tot expressie. Met deze techniek wordt slechts in een gering percentage van de gevallen een afdoende suppressie bereikt. Volgens een tweede techniek, co-suppres-15 sie, worden meer kopieën van het te onderdrukken gen in de gastheer gebracht. Een promotor is niet noodzakelijk. Weer wordt slechts in een paar procent van de gevallen een afdoende onderdrukking van de expressie bereikt. Volgens een derde techniek, virus-gemedieerde suppressie, wordt een transgeen 20 virus in de gastheercel gebracht, waarbij het virus een kopie van het gen bevat. Het ingebrachte virus zet de gastheercel aan tot transcriptie van het ingebrachte gen, waardoor expressie zeer doelmatig blijkt te kunnen worden onderdrukt (English et al. 1996; Plant Cell blz. 179-188).

25 Alle bekende technieken kampen met belangrijke nadelen. In het bijzonder wordt hetzij veelal geen afdoende onderdrukking van de expressie bereikt, hetzij gebruik gemaakt van genetisch gemanipuleerd materiaal dat zich zou kunnen verspreiden, wat maatschappelijk onaanvaardbaar is.

30 De onderhavige uitvinding beoogt een werkwijze van de in de aanhef genoemde soort te verschaffen, waarbij enerzijds met een hoge doelmatigheid een te onderdrukken gen kan worden onderdrukt, en anderzijds geen gebruik wordt gemaakt van genetisch materiaal dat zichzelf kan vermenigvuldigen. In 35 het bijzonder heeft de onderhavige uitvinding tot doel de mogelijkheid te verschaffen dat een gen meer blijvend wordt 1009369 2 uitgeschakeld. Onder de term 'meer blijvend uitgeschakeld' wordt in de onderhavige uitvinding verstaan dat als het gen eenmaal is uitgeschakeld, het gen ook uitgeschakeld blijft als de ingebrachte dubbelstrengs DNA-omvattende vector zich 5 niet langer in de gastheercel bevindt of anderszins inactief is. Derhalve beoogt de uitvinding in het bijzonder een werkwijze te verschaffen waarmee meiotische stabiliteit wordt verschaft. Ten slotte heeft de uitvinding tot doel een goed reguleerbare werkwijze te verschaffen.

10 Hiertoe wordt de werkwijze volgens de uitvinding gekenmerkt doordat als de DNA-omvattende vector een vector wordt gebruikt die een ten minste 15 basenparen lange met het gen homologe eerste volgorde omvat, welke eerste volgorde is gelegen tussen een tweede volgorde en een derde volgorde, 15 welke tweede en derde volgorde in direct repeat zijn gelegen en onder invloed van het recombinatie-eiwit kunnen recom-bineren, de DNA-omvattende vector in de gastheercel wordt gebracht, en de expressie van het gen door recombinatie van de tweede en derde volgorde wordt onderdrukt.

20 De tweede en derde volgorde vormen een lus. Zonder aan enige theorie gebonden te zijn, meent aanvraagster dat de lus via een nog onbegrepen mechanisme ertoe bijdraagt dat het uit te schakelen gen wordt onderdrukt. Een van de hypothesen is dat de lus wordt uitgesneden en in die vorm zorg 25 draagt voor suppressie. Hierbij treedt regulatie in 100 % van de nakomelingen op, en is er dus geen sprake van uit-segregatie. Volgorde twee en drie zullen in de praktijk, uit oogpunt van gemak, veelal identiek zijn.

In de onderhavige aanvrage wordt onder een recombi-30 natie-eiwit een transposase, integrase of recombinase verstaan.

Volgens een gunstige uitvoeringsvorm is de eerste volgorde een ten minste 50, bij voorkeur ten minste 100 en met de meeste voorkeur ten minste 200 basenparen lange volg-3 5 orde.

Aldus wordt een snelle en afdoende suppressie verzekerd.

¥ 1009369 3

Volgens een verdere gunstige uitvoeringsvorm geschiedt de recombinatie van de tweede en derde volgorde door een endogeen recombinatie-eiwit van de gastheercel.

Volgens een voorkeursuitvoering is het recombinatie-5 eiwit het product van een in de gastheercel gebracht hetero-loog gen.

Met een dergelijk in de gastheercel tot expressie gebracht, heteroloog gen wordt de onderdrukking verzekerd, ook als de gastheercel niet over een adequaat autoloog recora-10 binatie-eiwit beschikt.

Volgens een zeer gunstige uitvoeringsvorm omvat het gen voor het recombinatie-eiwit een extern reguleerbare promotor.

Door gebruik te maken van een extern reguleerbare 15 promotor, kan de suppressie precies op het gewenste moment worden geregeld. In het bijzonder kan dit geschieden door het in werkzaam contact brengen van de gastheercel met een inductor. De promotor is in een dergelijk geval bijvoorbeeld een Safener™-induceerbare promotor of de ethanol-induceerbare 20 promotor. Door de gastheer met Saf ener™ of ethanol in contact te brengen wordt de promotor geïnduceerd.

Afhankelijk van de gewenste toepassing kan de promotor ock met voordeel een weefsel-specifieke of ontwikkelings-specifieke promotor zijn, waardoor de suppressie afhankelijk 25 van het soort weefsel of afhankelijk van het ontwikkelingsstadium kan worden geïnduceerd.

Het recombinatie-eiwit is geschikt een recombinase, zoals geschikt het recombinase RecA van E^_ coli is.

Volgens een eerste uitvoeringsvorm omvatten de 30 tweede en derde volgorde elk ten minste 20 baseparen en is het recombinase een homologe volgorden herkennend plaats-specifiek recombinase.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm is het recombinase gekozen uit de groep bestaande uit l) Cre van Escheri-35 chia. coli, 2) FLP van Saccharomyces cerevisiae en 3) R van Zyoosaccharomvces rouxii. waarbij de tweede en derde volgorde beide bij voorkeur worden gevormd door respectievelijk de lox volgorde, FRT volgorde en de RS volgorde (Kilby et al.,

Trends in Genetics j?, blz. 413-421 (1993)).

1009369 4

Met al deze uitvoeringsvormen kan doelmatig suppressie worden bewerkstelligd, onder gebruikmaking van goed gekarakteriseerde en eenvoudig verkrijgbare recombinase-genen.

5 Het spreekt voor zich dat wanneer in de onderhavige uitvinding wordt gesproken over een recombinatie-eiwit, dat daarmee tevens alle biologisch actieve afgeleiden daarvan binnen het kader van de uitvinding vallen. Evenzo geldt dat afgeleiden van specifiek herkende DNA-volgorden, welke afge-10 leiden eveneens kunnen worden herkend, binnen het kader van de uitvinding vallen.

Volgens een gunstige uitvoeringsvorm van de werkwij-ze volgens de uitvinding bevindt de eerste volgorde die zich tussen de tweede en derde volgorde bevindt zich op een eerste 15 vector en bevindt een voor het recombinase coderend gen zich op een tweede vector.

Dit vereenvoudigt het uitschakelen van verschillende genen in verschillende gastheren, aangezien dan telkens slechts een afwijkende eerste vector vereist is, terwijl in 20 meer diverse gevallen van de ongewijzigde tweede vector gebruik gemaakt kan worden.

Volgens een voorkeursuitvoering bevinden de eerste vector en de tweede vector zich in twee verschillende gastheercellen, en worden de eerste vector en de tweede vector 25 door kruising bijeen gebracht.

Op deze wijze kan worden verzekerd dat alleen in aldus gevormde hybride gastheercellen beide voor suppressie benodigde volgorden aanwezig zijn en de gewenste suppressie kan worden bereikt.

30 Geschikt is de gastheercel een plantencel.

Niet alleen heeft aanvraagster de werkwijze voor plantencellen bewezen, de door de onderhavige uitvinding opgeheven nadelen speelden juist voor agrarische toepassingen bijzonder zwaar.

35 Verder is volgens een voorkeursuitvoering het gen een embryo-ontwikkeling uitschakelend gen en wordt het recombinase, dat onder controle staat van een reguleerbare promotor, tot expressie gebracht na de vorming van zaad.

1009369 .

5

Een dergelijke ontregeling van een ontwikkelingsgen voor een embryo kan worden bereikt door het door kruisen samenbrengen van een transgen en een recombinase waardoor bij het nageslacht van de eerste generatie (Fl) wèl zaad (dat 5 bijvoorbeeld het gewenste produkt is) wordt gevormd, maar uit dit zaad geen nakomelingen kunnen ontstaan doordat de normale embryo-ontwikkeling wordt geblokkeerd. Dit is mogelijk door het recombinase onder de controle van een promotor te plaatsen die in een embryo niet actief is. Zodra tijdens het 10 opgroeien van de Fl het recombinase tot expressie komt, wordt het ontwikkelingsgen uitgeschakeld waardoor wordt verhinderd dat zaad van de Fl kan uitgroeien. Aldus kan, bijvoorbeeld, worden verzekerd dat het door de volgende generatie ontwikkelde zaad niet kan ontkiemen, waardoor een mogelijke ver-15 spreiding van transgenen in de natuur wordt uitgesloten. Als laatste toepassing wordt hier de ontregeling van de biosyn-these van ethyleen genoemd, bijvoorbeeld door suppressie van het gen dat codeert voor ACC-synthase of EFE (ethyleen-vor-mend enzym). Dit kan geschieden door inductie van het recom-20 binase vlak voor de aanvang van de vruchtrijping.

Overigens kan het onder andere omstandigheden gunstig zijn als zowel de voor het recombinase coderende volgorde welke onder controle staat van een extern induceerbare promotor en de eerste, tweede en derde volgorde op dezelfde 25 vector liggen. Dit maakt kruisen of een fusie van gastheren overbodig.

Tenslotte heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een meercellig organisme opgegroeid uit een volgens een werkwijze volgens één van de conclusies 1-12 verkregen gast-30 heercel, alsmede generatieve en vegetatieve nakomelingen daarvan.

De werkwijze volgens de uitvinding kan op diverse gebieden op het gebied van de plantenbiotechnologie worden toegepast. Hierbij kan worden gedacht aan het onderdrukken 35 van de bloei en zaadontwikkeling; onderdrukking van dominante genen waardoor recessieve eigenschappen niet tot uitdrukking komen, hierbij kan worden gedacht aan onderdrukking van genen zoals Mlo, dat verband houdt met resistentie tegen echte meeldauw; onderdrukking van genen betrokken bij de 'carbon- 1009369 b sink/source' verdeling; inductie van mannelijke en/of vrouwelijke steriliteit; onderdrukking van de door een parasiet, bijvoorbeeld een nematode, beïnvloede ontwikkeling van de plant; en onderdrukking van plantontwikkeling na stekken, 5 waardoor kan worden vermeden dat derden planten vegetatief vermeerderen. Afhankelijk van de gewenste toepassing is de onderdrukking van gen-expressie bijvoorbeeld zaad-specifiek, embryo-specifiek, bloem-specifiek, pollen-specifiek, eicel-specifiek, wortel-specifiek, meristeem-specifiek of tapetum-10 specifiek.

De onderhavige uitvinding zal thans worden toegelicht aan de hand van het navolgende voorbeeld. Ofschoon dit voorbeeld is gericht op het onderdrukken van de expressie van een gen in een plantencel, is het voor de deskundige duide-15 lijk dat plasmide pMH2626 op algemeen bekende wijze in dierlijke cellen, die van micro-organismen enz. kan worden geïntroduceerd. Hetzelfde geldt voor een verder plasmide dat de eerste, tweede en derde volgorde omvat.

Voorbeeld 20 Voor het onderdrukken van de expressie van een gen in een plant kan gebruik worden gemaakt van het plasmide pMH2626 in de Eh_ coli stam JM101, welke is gedeponeerd onder aanwinstnummer CBS 100943 van het Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS, Oosterstraat 1, 3740 AG Baarn, Nederland). 25 Het plasmide pMH2626 bevat het Cre-gen afkomstig van Eh. coli bacteriofaag PI. Een kaart van pMH2626 is weergegeven in fig. 1. Het Cre-gen is volgens de door Stuurman J. et al (Plant. Mol. Biol. 32., blz, 901-913 (1996)) beschreven wijze in de HindlII- en Sail knipplaatsen van de vector pBIN19 geclo-30 neerd. Het plasmide pMH2626 kan volgens algemeen bekende werkwijzen (Sambrook et al. Molecular cloning, a laboratory manual, 2e druk. Cold Spring Harbor, New York 1989. Hierna aangeduid als "Maniatis") worden geïsoleerd en in Agrobacte-rium tumefaciens worden gebracht. Met behulp van deze bacte-35 rie kan op algemeen bekende wijze een plantencel worden getransformeerd zodat het T (transfer)-DNA-gedeelte van de vector in het genoom van de plant wordt geïncorporeerd. De aanwezigheid van de vector kan worden vastgesteld door de aanwezigheid van een kanamycineresistentiegen (nptll-gen).

1009369 7

Een geschikte concentratie kanamycine in het groeimedium is bijvoorbeeld 25 mg/1.

Een plant waarin het Cre-gen tot expressie komt, zoals kan worden vastgesteld met Northern analyse voor de 5 detectie van mRNA (Maniatis), kan worden gebruikt voor ver-volgexperimenten.

De lox-sequenties, zoals beschreven door Kilby et al (ibid.) kunnen synthetisch worden bereid en volgens algemeen bekende moleculair biologische technieken (Maniatis) kan een 10 vector worden geconstrueerd waarin een ten minste 15 basepa-ren lang met het uit te schakelen gen homologe eerste volgorde zich bevindt tussen twee in direct-repeat gelegen volgorden. De eerste volgorde met de daaromheen gelegen lox-volgorden kan in de poly-linker van de vector pBIN19 kanamycine 15 worden gedoneerd en worden gebruikt om een plantencel te transformeren.

Na opkweken van de twee soorten getransformeerde planten uit de respectivelijke plantencellen worden de planten met elkaar gekruist (sexuele hybridisatie), waardoor 20 beide constructen in dezelfde plant terecht komen. Onder invloed van het Cre-eiwit zal dan recombinatie optreden tussen de twee lox-plaatsten en zal de expressie van het gen waarmee de eerste volgorde homologie vertoont worden onderdrukt .

1009369

Claims (14)

1. Werkwijze voor het onderdrukken van de expressie van een gen onder gebruikmaking van een DNA-omvattende vector welke in een gastheercel wordt gebracht, met het kenmerk, dat als de DNA-omvattende vector een vector wordt gebruikt die 5 een ten minste 15 basenparen lange met het gen homologe eerste volgorde omvat, welke eerste volgorde is gelegen tussen een tweede volgorde en een derde volgorde, welke tweede en derde volgorde in direct repeat zijn gelegen en onder invloed van een recombinatie-eiwit kunnen recombineren, 10 de DNA-omvattende vector in de gastheercel wordt gebracht, en de expressie van het gen door recombinatie van de tweede en derde volgorde wordt onderdrukt,

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de eerste volgorde een ten minste 50, bij voorkeur ten 15 minste 100 en met de meeste voorkeur ten minste 200 basenparen lange volgorde is.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de recombinatie van de tweede en derde volgorde geschiedt door een endogeen recombinatie-eiwit in de gast- 20 heercel.

4. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat het recombinatie-eiwit het product is van een in de gastheercel gebracht heteroloog gen.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, 25 dat het gen voor het recombinatie-eiwit een extern reguleer- bare promotor omvat.

6. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het recombinatie-^iwit een recombinase is .

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat het recombinase RecA van E_^ coli is.

8. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat de tweede en derde volgorde elk ten minste 20 baseparen omvatten en het recombinase een homologe volgorden herkennend 35 plaats - specifiek recombinase is. 1009369

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat het recombinase is gekozen uit de groep bestaande uit 1) Cre van Escherichia, coli, 2) FLP van Saccharomvces cerevisi-ae en 3) R van Zvgosaccharomvces rouxii. waarbij de tweede en 5 derde volgorde beide bij voorkeur worden gevormd door respectievelijk de lox volgorde, FRT volgorde en de RS volgorde.

10. Werkwijze volgens één van de conclusies 3 tot 9, met het kenmerk, dat de eerste volgorde die zich tussen de tweede en derde volgorde bevindt zich op een eerste vector 10 bevindt en een voor het recombinase coderend gen zich op een tweede vector bevindt.

11. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat de eerste vector en de tweede vector zich in twee verschillende gastheercellen bevinden, en de eerste vector en de 15 tweede vector door kruising bijeen worden gebracht.

12. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de gastheercel een plantencel is.

13. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat het gen een embryo-ontwikkeling uitschakelend gen is en 20 het recombinase, dat onder controle staat van een reguleer-bare promotor, tot expressie wordt gebracht na de vorming van zaad.

14. Meercellig organisme opgegroeid uit een volgens een werkwijze volgens één van de conclusies 1-12 verkregen 25 gastheercel, alsmede generatieve en vegetatieve nakomelingen daarvan. 1009369