KR20020079962A

KR20020079962A - 개량된 프로모터 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20020079962A
Application number: KR1020027011192A
Authority: KR
Inventors: 후지이토시오; 오가와토시야; 요시오카마사하루; 마미야칸지; 토구리토시히로
Original assignee: 기린 비루 가부시키가이샤
Priority date: 2000-03-03
Filing date: 2001-02-23
Publication date: 2002-10-21
Also published as: JP3782013B2; US7385048B2; ATE478951T1; DE60142892D1; EP1264886A1; CN1427890A; US20030177519A1; CA2401554A1; US20060277623A1; EP1264886A4; EP1264886B1; CN100402647C; WO2001064865A1; US7115420B2

Abstract

본 발명은 개량 프로모터 및 그의 사용에 관한 것이고, 보다 상세하게는 형질전환체를 제조하는 동안 메틸화되기 어렵도록 개량된 프로모터 및 그의 사용에 관한 것이다.

본 발명의 개량 프로모터는 이하의 (1) 또는 (2)에 나타내는 DNA이다:

(1) 서열번호 1 내지 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA; (2) 서열번호 1 내지 4로 표시되는 염기서열에 있어서 특정의 부위를 제외한 부위에 1 내지 수개의 염기가 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열을 포함하고, 상기 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열중에 CG, CAG, CTG, CCG 및 CGG 등으로 표시되는 연속서열을 포함하지 않고 또 프로모터 활성을 갖는 DNA.

본 발명에 의하면, 종래부터 식물용의 고발현 프로모터로 되어온 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터에 의한 구조유전자의 발현이 약한 식물, 예컨대 국화에 있어서도 상기 발현효율을 향상시킬 수 있다.

Description

개량된 프로모터 및 그의 용도{Improved promoters and utilization thereof}

소망하는 형질전환체를 제조하는 경우, 중요한 요소의 하나로서 고발현 프로모터가 있다. 프로모터 서열은 식물세포내에서의 유전자의 전사 레벨을 결정하는 주요한 인자이고, 일반적으로 전사활성이 강한 프로모터 서열을 사용하는 것에 의해 목적으로 하는 외래유전자의 발현 레벨을 높일 수 있다. 또한 마커 유전자의 발현 레벨을 상승시키는 것에 의해 형질전환 식물을 현저히 용이하게 취득할 수 있기 때문에 고발현 프로모터는 형질전환 식물을 제조하기 위한 약제 내성 유전자 마커의 발현에도 중요하다.

이와 같은 배경에서 식물에 있어서 고발현 프로모터의 취득이 지금까지 다수 보고되어왔다. 대표적인 예로서는 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터 및 아그로박테륨(Agrobacterium)의 이소펜텐일 트랜스퍼라제(ipt) 유전자 및 노팔린 합성효소(nos) 유전자의 프로모터 등을 들 수 있다. 또한 형질전환 숙주의 대상으로되는 식물의 게놈으로부터 고발현 유전자의 프로모터를 취득하고 이것을 이용하는 예도 보고되어 있다(Genschik 등, Gene, 148 (1994) 195-202).

최근들어 이들 프로모터를 복수개 조합한 키메라형 프로모터 중 프로모터 활성이 현저하게 상승된 것을 취득할 수 있는 것이 밝혀졌다. 일례를 들면, Min Ni 등은 아그로박테륨 유래의 옥토핀 합성효소(ocs) 유전자와 만노핀(man) 합성효소 유전자의 프로모터를 조합하는 것에 의해 담배에서 고발현을 나타내는 프로모터를 얻을 수 있다는 것을 나타내고 있다 (Plant Journal, 7 (1995) 661-676).

그러나, 이들 고발현 프로모터를 사용하여도 모든 식물에서 필요한 레벨의 외래 유전자를 발현할 수 있는 식물을 얻을 수 있는 것은 아니다. 그 이유의 하나로서 각각의 식물 세포에 존재하는 RNA 폴리머라제의 상이함에 기초한 특이성의 존재를 들 수 있다. 또한 다른 이유로서 식물이 외래 유전자의 발현을 억제하는 기능을 가지고 있는 것으로 추정되고 있다. 이러한 유전자의 불활성화 또는 발현억제 기구에 관여하는 대표적인 인자로서 게놈 DNA에서 시토신의 메틸화를 고려할 수 있다 (Meyer와 Saedler, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 47 (1996) 23-48).

이 시토신의 메틸화는 CG 및 CNG (N은 임의의 염기) 염기서열이 회문상의 구조를 형성하고 있는 2중쇄 DNA 서열에서 현저하게 일어나는 것이 알려져 있지만 (Matzke 와 Matzke, Plant Physiol. 107 (1995) 679-685), 다른 DNA 서열중의 시토신에서도 메틸화가 일어나는 것이 알려져 있다 (Meyer 등, EMBO Journal, 13 (1994) 2084-2088). 시토신이 메틸화를 받으면, 유전자의 발현이 억제되는 것은 많은 생물에서도 알려져 있고 (Razin, EMBO Journal, 17 (1998) 4905-4908), 또한 식물의 게놈에서는 다른 생물과 비교하여 메틸화되어 있는 시토신의 비율이 높기 때문에 메틸화가 유전자의 불활성화에 밀접하게 관련되어 있다는 보고가 되어 왔다 (Meyer 와 Saedler, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 47 (1996) 23-48). 특히 유전자 조작 등에 의해 도입된 외래 유전자의 발현이 억제되는 현상, 즉 "진 사이런싱(gene silencing)"의 원인에 관해서는 DNA의 메틸화에 의한 불활성화도 관련되어 있다고 추측되고 있다.

그러나, 지금까지 프로모터의 메틸화를 억제하는 것에 의해 유전자의 발현을 향상시킨다는 보고는 되어 있지 않았다. CaMV의 35S 프로모터와 β-글루쿠로니다제 (Gus) 유전자를 결찰시킨 유전자 구축물을 시험관내에서 강제적으로 메틸화시키는 것에 의해 유전자의 일시적인 발현이 저하된다는 보고가 1회 있을 뿐이다 (Hohn 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (1996) 8334-8339). 다만, 상기 보고의 실험에 있어서도 생체내에서 어떤 염기서열이 메틸화를 받고, 그 결과 발현이 저하되는가는 검증되어 있지 않다. 또한 Hohn 등은 프로모터 뿐만 아니라 구조유전자 부분의 시토신의 메틸화도 Gus 유전자의 발현 저하를 유발하는 것으로 관찰하고, 구조유전자 부분이 메틸화에 의해 수식되지 않은 것도 고발현을 위하여 중요한 것으로 결론짓고 있어, 탈메틸화 프로모터의 이용에 의한 고발현화에는 오히려 부정적이라고 말할 수 있다.

따라서, 프로모터의 메틸화를 회피하는 것에 의해 유전자 발현 레벨을 향상시키는 구체적인 방법은 불명이었다. 또한 메틸화를 회피하고, 보다 고발현의 형질전환 숙주를 얻기 위하여 프로모터의 활성을 손상하지 않도록 프로모터 부분, 또는 프로모터 부분을 포함하는 DNA쇄의 어느 CG 및 CNG 서열을 구체적으로 어떻게 다른 염기로 개변하면 좋은가도 불명이었다.

본 발명은 개량 프로모터 및 그의 용도에 관한 것이고, 보다 상세하게는 형질전환체를 제조하는 동안 메틸화되기 어렵도록 개량된 프로모터 및 그의 용도에 관한 것이다.

도1A 및 도1B는 본 발명에 의한 프로모터:MF-48의 DNA서열(도1A) 및 MF-18의 DNA서열(도1B)(상단)과 pBI121에 포함되는 35S 프로모터의 DNA서열(하단)의 비교를 도시하는 도,

도2는 플라스미드 pKT81(A), pKT83(B), pMF-28(C) 및 pKT11(D)의 구조의 일부를 도시하는 도,

도3은 플라스미드 pMF-48 Gus 및 그 유도체 pMF-48-2 및 pMF-48-4의 개략을 도시하는 도,

도4는 4종류의 벡터로 형질전환시킨 국화의 잎에서 Gus 유전자의 발현양의 평균치(10개체 이상)를, 대조로서 pBI121로 형질전환시킨 형질전환 담배에서의 Gus 유전자의 발현량에 대한 상대치로 표시한 도,

도5는 각각 3종류의 벡터로 형질전환시킨 국화의 잎에서 Gus 유전자의 발현양의 상대치(대조는 pBI121로 형질전환시킨 재조합 담배)의 개체별 분포를 도시한 도.

발명의 개시

본 발명은 구조유전자의 5'측에 배치된 경우, 이 구조유전자의 발현을 활성화하는 프로모터의 제공을 그 목적으로 하고 있다. 또한 본 발명은 상기 프로모터를 포함하는 DNA쇄의 제공을 그 목적으로 하고 있다. 또한 본 발명은 상기 DNA 쇄로 형질전환된 숙주, 및 이 숙주를 이용한 구조유전자를 고발현시키는 방법의 제공을 그 목적으로 하고 있다.

본 발명자들은 이상의 관점으로부터, 프로모터의 2중쇄 DNA 서열중의 CG 및 CNG로된 DNA의 회문상의 서열을 프로모터 활성을 손상하지 않도록 CG 및 CNG 서열이 생기지 않는 다른 염기로 개변시켜 메틸화를 받기 어렵도록 하는 것에 의해 고발현 프로모터를 작제할 수 있을 것으로 생각하였다. 이 생각을 기초로하여, 연구를 계속한 결과, 신규하게 디자인한 프로모터를 번역 인헨서, 구조(리포터) 유전자, 번역종지 코돈, 터미네이터 등의 구성 요소 등과 결찰시키고, 이것을 이용하여 국화 식물체를 형질전환하는 것에 의해 상기 국화 식물체에서 외래 유전자의 발현 레벨을 비약적으로 향상시킬 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하의 (a) 또는 (b)에 나타낸 DNA를 제공한다.

(a) 서열번호 1로 표시되는 염기서열중의 제7 내지 272 염기로된 염기서열을 포함하는 DNA,

(b) 서열번호 1로 표시되는 염기서열중의 제7 내지 272 염기로된 염기서열에 있어서 제41 내지 42 염기, 제59 내지 60 염기, 제73 내지 75 염기, 제77 내지 78 염기, 제80 내지 82 염기, 제109 내지 110 염기, 제119 내지 120 염기, 제134 내지 135 염기, 제145 내지 146 염기, 제181 내지 183 염기, 제185 내지 186 염기, 제197 내지 198 염기 및 제217 내지 218 염기를 제외한 부위에서 1개 내지 수개의 염기가 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열을 포함하고, 상기 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열중에 CG, CAG, CTG, CCG 및 CGG 등으로 표시되는 연속서열을 포함하지 않으며 또 프로모터 활성을 갖는 DNA.

또한 본 발명은 하기 (c) 또는 (d)에 나타낸 DNA를 제공한다.

(c) 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA,

(d) 서열번호 1로 표시되는 염기서열에 있어서, 제41 내지 42 염기, 제59 내지 60 염기, 제73 내지 75 염기, 제77 내지 78 염기, 제80 내지 82 염기, 제109 내지 110 염기, 제119 내지 120 염기, 제134 내지 135 염기, 제145 내지 146 염기, 제181 내지 183 염기, 제185 내지 186 염기, 제197 내지 198 염기 및 제217 내지 218 염기를 제외한 부위에서 1개 내지 수개의 염기가 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열을 포함하고, 상기 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열중에 CG, CAG, CTG, CCG 및 CGG 등으로 표시되는 연속서열을 포함하지 않으며 또 프로모터 활성을 갖는 DNA.

또한 본 발명은 하기 (e) 또는 (f)에 나타낸 DNA를 제공한다.

(e) 서열번호 2로 표시되는 염기서열중의 제7 내지 272 염기로된 염기서열을 포함하는 DNA,

(f) 서열번호 2로 표시되는 염기서열중의 제7 내지 272 염기로된 염기서열에 있어서 제41 내지 42 염기, 제59 내지 60 염기, 제73 내지 75 염기, 제77 내지 78 염기, 제80 내지 82 염기, 제109 내지 110 염기, 제119 내지 120 염기, 제134 내지 135 염기, 제145 내지 146 염기, 제181 내지 183 염기, 제183 내지 188 염기, 제195 내지 200 염기 및 제217 내지 218 염기를 제외한 부위에서 1개 내지 수개의 염기가 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열을 포함하고, 상기 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열중에 CG, CAG, CTG, CCG 및 CGG 등으로 표시되는 연속서열을 포함하지 않고(단, 제185 내지 186 염기 및 제197 내지 198 염기는 각각 CG이다) 또 프로모터 활성을 갖는 DNA.

또한 본 발명은 하기 (g) 또는 (h)에 나타낸 DNA를 제공한다.

(g) 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA,

(h) 서열번호 2로 표시되는 염기서열에 있어서, 제41 내지 42 염기, 제59 내지 60 염기, 제73 내지 75 염기, 제77 내지 78 염기, 제80 내지 82 염기, 제109 내지 110 염기, 제119 내지 120 염기, 제134 내지 135 염기, 제145 내지 146 염기, 제181 내지 183 염기, 제183 내지 188 염기, 제195 내지 200 염기 및 제217 내지 218 염기를 제외한 부위에서 1개 내지 수개의 염기가 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열을 포함하고, 상기 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열중에 CG, CAG, CTG, CCG및 CGG 등으로 표시되는 연속서열을 포함하지 않고(단, 제185 내지 186 염기 및 제197 내지 198 염기는 각각 CG이다) 또 프로모터 활성을 갖는 DNA.

또한 본 발명은 하기 (i) 또는 (j)에 나타낸 DNA를 제공한다.

(i) 서열번호 3으로 표시되는 염기서열중의 제7 내지 322 염기로된 염기서열을 포함하는 DNA,

(j) 서열번호 3으로 표시되는 염기서열중의 제7 내지 322 염기로된 염기서열에 있어서 제41 내지 42 염기, 제59 내지 60 염기, 제73 내지 75 염기, 제77 내지 78 염기, 제80 내지 82 염기, 제109 내지 110 염기, 제119 내지 120 염기, 제134 내지 135 염기, 제145 내지 146 염기, 제181 내지 183 염기, 제185 내지 186 염기, 제197 내지 198 염기, 제217 내지 218 염기, 제231 내지 233 염기, 제235 내지 236 염기, 제247 내지 248 염기 및 제267 내지 268 염기를 제외한 부위에서 1개 내지 수개의 염기가 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열을 포함하고, 상기 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열중에 CG, CAG, CTG, CCG 및 CGG 등으로 표시되는 연속서열을 포함하지 않고 또 프로모터 활성을 갖는 DNA.

또한 본 발명은 하기 (k) 또는 (l)에 나타낸 DNA를 제공한다.

(k) 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA,

(l) 서열번호 3으로 표시되는 염기서열에 있어서, 제41 내지 42 염기, 제59 내지 60 염기, 제73 내지 75 염기, 제77 내지 78 염기, 제80 내지 82 염기, 제109 내지 110 염기, 제119 내지 120 염기, 제134 내지 135 염기, 제145 내지 146 염기, 제181 내지 183 염기, 제185 내지 186 염기, 제197 내지 198 염기, 제217 내지 218염기, 제231 내지 233 염기, 제235 내지 236 염기, 제247 내지 248 염기 및 제267 내지 268 염기를 제외한 부위에서 1개 내지 수개의 염기가 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열을 포함하고, 상기 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열중에 CG, CAG, CTG, CCG 및 CGG 등으로 표시되는 연속서열을 포함하지 않고 또 프로모터 활성을 갖는 DNA.

또한 본 발명은 하기 (m) 또는 (n)에 나타낸 DNA를 제공한다.

(m) 서열번호 4로 표시되는 염기서열중의 제7 내지 422 염기로된 염기서열을 포함하는 DNA,

(n) 서열번호 4로 표시되는 염기서열중의 제7 내지 422 염기로된 염기서열에 있어서 제41 내지 42 염기, 제59 내지 60 염기, 제73 내지 75 염기, 제77 내지 78 염기, 제80 내지 82 염기, 제109 내지 110 염기, 제119 내지 120 염기, 제134 내지 135 염기, 제145 내지 146 염기, 제181 내지 183 염기, 제185 내지 186 염기, 제197 내지 198 염기, 제217 내지 218 염기, 제231 내지 233 염기, 제235 내지 236 염기, 제247 내지 248 염기, 제267 내지 268 염기, 제281 내지 283 염기, 제285 내지 286 염기, 제297 내지 298 염기, 제317 내지 318 염기, 제331 내지 333 염기, 제335 내지 336 염기, 제347 내지 348 염기 및 제367 내지 368 염기를 제외한 부위에서 1개 내지 수개의 염기가 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열을 포함하고, 상기 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열중에 CG, CAG, CTG, CCG 및 CGG 등으로 표시되는 연속서열을 포함하지 않고 또 프로모터 활성을 갖는 DNA.

또한 본 발명은 하기 (o) 또는 (p)에 나타낸 DNA를 제공한다.

(o) 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA,

(p) 서열번호 4로 표시되는 염기서열에 있어서, 제41 내지 42 염기, 제59 내지 60 염기, 제73 내지 75 염기, 제77 내지 78 염기, 제80 내지 82 염기, 제109 내지 110 염기, 제119 내지 120 염기, 제134 내지 135 염기, 제145 내지 146 염기, 제181 내지 183 염기, 제185 내지 186 염기, 제197 내지 198 염기, 제217 내지 218 염기, 제231 내지 233 염기, 제235 내지 236 염기, 제247 내지 248 염기, 제267 내지 268 염기, 제281 내지 283 염기, 제285 내지 286 염기, 제297 내지 298 염기, 제317 내지 318 염기, 제331 내지 333 염기, 제335 내지 336 염기, 제347 내지 348 염기 및 제367 내지 368 염기를 제외한 부위에서 1개 내지 수개의 염기가 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열을 포함하고, 상기 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열중에 CG, CAG, CTG, CCG 및 CGG 등으로 표시되는 연속서열을 포함하지 않고 또 프로모터 활성을 갖는 DNA.

또한 본 발명은 상기 어느 DNA를 포함하는 DNA쇄를 제공한다. 이와 같은 DNA쇄는 구조유전자 DNA와 상기 구조유전자가 발현하도록 하는 양식으로 상기 구조유전자 DNA의 5' 부위에 조립된 상기 어느 하나의 DNA를 포함하여 구성되는 것이 바람직하다. 이들 DNA쇄는 또한 번역 인헨서, 번역종지코돈, 터미네이터 및 이들의 조합으로 구성된 군에 의해 번역되는 구성요소를 포함하여도 좋다. 또한, 본 발명은 상기 DNA쇄로 형질전환된 숙주를 제공한다. 상기 숙주는 바람직하게는 식물세포이다.

또한 본 발명은 상기 DNA쇄로 형질전환된 식물세포를 구조유전자가 발현가능하도록 배양 또는 재배하는 것을 특징으로 하는, 식물에서 구조 유전자를 발현시키는 방법을 제공한다. 이 방법에서, 구조유전자는 외래유전자이어도 좋다. 또한, 본 발명은 상기 DNA쇄로 형질전환된 숙주를 사용하여 상기 프로모터 활성을 갖는 DNA에 의해 전사가 활성화되는 또는 발현이 촉진되는 구조유전자의 발현 산물인 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 DNA쇄로 형질전환된 식물세포로부터 재생에 의해 수득할 수 있는 형질전환식물을 제공한다.

또한 본 발명은 선택 마커 유전자 DNA와 이 선택마커 유전자가 발현하게하는 양식으로 상기 선택 마커 유전자 DNA의 5' 부위에 조합된 상기 어느 하나의 DNA를 포함하여 구성되는 DNA쇄를 제공한다. 또한 본 발명은 상기 DNA쇄로 숙주를 형진전환처리하고, 수득한 숙주를 상기 선택 마커 유전자가 발현가능하고 또 상기 선택 마커 유전자를 발현하는 숙주와 이들을 발현하지 않는 숙주를 식별할 수 있는 조건하에서 배양하는 것을 특징으로하는, 형질전환 숙주를 선택하는 방법을 제공한다. 상기 숙주는 바람직하게는 식물세포이다.

본 명세서는 본원에서 주장하는 우선권의 기초인 일본국 특허출원 제2000-59276호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.

서열표의 설명

서열번호 1 내지 4: 프로모터 서열을 포함하는 합성 DNA

서열번호 5 내지 24: 프라이머

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

(1) 프로모터

본 발명의 DNA는 서열번호 1 내지 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA 또는 이들 프로모터 활성을 갖는 부분이고, 이들 DNA는 CaMV의 35S 프로모터를 기초로 그의 염기서열중의 일부 염기를 개변시킨 것이다.

CaMV의 35S 프로모터의 전사개시점으로부터 상류 250 bp중에는 13개의 CG 또는 CNG가 존재하고, 이들의 염기서열은 식물체중에서 각각 CG 메틸화 효소 및 CNG 메틸화 효소에 의해 메틸화되어 있는 것이 관찰된다. 따라서, 이들 서열을 메틸화되지 않는 서열로 치환시킨 것이 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA이다. 서열번호 1에서, 프로모터 활성을 갖는 부분은 제7 내지 272 염기 부분이다.

또한 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA (프로모터)의 메틸화 프리(free) 특징을 살리면서 특히 유효한 것으로 고려되는 개변으로서는 프로모터의 ocs 영역 또는 as-1 영역으로 불리는 약 20염기로된 영역(Ellis 등, Plant J., 4(1993) 433-443; Lam 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 (1989) 7890-7894)의 개변이 고려된다. 상기 ocs 영역중의 CG 서열을 남기면서 6염기의 회문상 구조(GACGTC)를 형성하도록 개변시킨 것이 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA이다. 서열번호 2중에서 프로모터 활성을 갖는 부분은 제7 내지 272 염기 부분이다.

서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열(전사개시점으로부터 상류)과 식물의 유전자 조작으로 통상 가장 널리 사용되는 벡터 pBI121(클론테크사제)에 포함되는 35S 프로모터의 서열과의 비교를 각각 도1A 및 도1B에 나타낸다.

또한 상기 ocs 영역에 관한 개변으로서, 프로모터중의 ocs 영역을 중복시키도록 합성하는 것을 고려할 수 있고, 그에 의해 프로모터 활성이 증강되는 것으로 고려된다. 그래서 상기 서열번호 1에서 2개의 ocs 영역을 반복시킨 것이 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA이다. 서열번호 3중에서 프로모터 활성을 갖는 부분은 제7 내지 322 염기 부분이다. 또한 상기 서열번호 1에서 4개의 ocs 영역을 반복시킨 것이 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA이다. 서열번호 4중에서 프로모터 활성을 갖는 부분은 제7 내지 422 염기 부분이다.

상기와 같은 본 발명의 DNA는 핵산합성의 방법을 따라서 화학합성하는 것에 의해 얻을 수 있다.

또한 본 발명의 DNA는 상기 DNA의 염기서열에서 1이상의 염기가 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열을 포함하고 또 프로모터 활성을 갖는 DNA (변이체)도 포함된다. 여기서, 결실, 부가 또는 삽입되어도 좋은 염기의 수는 특히 한정되지 않지만, 바람직하게는 1개 내지 수개, 바람직하게는 1개 내지 3개, 가장 바람직하게는 1개이다. 또한 본 발명의 DNA에는 상기 DNA의 염기서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 94% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 포함하고 또 프로모터 활성을 갖는 DNA (변이체)도 포함된다. 여기서, 이와 같은 상동성의 수치는 염기서열비교용 프로그램: DNASIS-Mac v3.7을 사용하여 디폴트(초기설정)의 파라미터에 의해 산출되는 것이다.

이와같이, 상기 변이체는 서열번호 1 내지 4로 표시되는 염기서열과는 부분적으로 상이한 염기서열을 포함하지만, 이 경우에서 상술한 CaMV 35S 프로모터로부터의 개변분위는 그대로 보존될 필요가 있다. 즉, 서열번호 1에서 제41 내지 42염기, 제59 내지 60염기, 제73 내지 75염기, 제77 내지 78염기, 제80 내지 82 염기, 제109 내지 110 염기, 제119 내지 120염기, 제134 내지 135염기, 제145 내지 146 염기, 제181 내지 183염기, 제185 내지 186염기, 제197 내지 198염기 및 제217 내지 218염기에서는 변이되지 않는다. 마찬가지로, 서열번호 2에 있어서도 제41 내지 42염기, 제59 내지 60염기, 제73 내지 75염기, 제77 내지 78염기, 제80 내지 82 염기, 제109 내지 110 염기, 제119 내지 120염기, 제134 내지 135염기, 제145 내지 146 염기, 제181 내지 183염기, 제183 내지 188염기, 제195 내지 200염기 및 제217 내지 218염기에서는 변이되지 않는다. 또한 서열번호 3에서는, 제41 내지 42염기, 제59 내지 60염기, 제73 내지 75염기, 제77 내지 78염기, 제80 내지 82 염기, 제109 내지 110 염기, 제119 내지 120염기, 제134 내지 135염기, 제145 내지 146 염기, 제181 내지 183염기, 제185 내지 186염기, 제197 내지 198염기, 제217 내지 218염기, 제231 내지 233염기, 제235 내지 236 염기, 제247 내지 248염기 및 제267 내지 268 염기에서는 변이되지 않는다. 또한 서열번호 4에서는, 제41 내지 42염기, 제59 내지 60염기, 제73 내지 75염기, 제77 내지 78염기, 제80 내지 82 염기, 제109 내지 110 염기, 제119 내지 120염기, 제134 내지 135염기, 제145 내지 146 염기, 제181 내지 183염기, 제185 내지 186염기, 제197 내지 198염기, 제217 내지 218염기, 제231 내지 233염기, 제235 내지 236 염기, 제247 내지 248염기, 제267 내지 268 염기, 제281 내지 283염기, 제285 내지 286염기, 제297 내지 298염기, 제317 내지 318 염기, 제331 내지 333 염기, 제335 내지 336 염기, 제347 내지 348염기 및 제367 내지 368 염기에서는 변이되지 않는다.

또한 상기 변이체의 염기서열은 CG, CAG, CTG, CCG 및 CGG로 표시되는 연속서열을 포함하지 않을 필요가 있다. 단, 서열번호 2에서 제185 내지 186염기 및 제197 내지 198염기는 예외적으로 각각 CG 이다.

이와 같은 서열번호 1 내지 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA 또는 그 부분의 변이체는 프로모터 활성을 갖고 있어도 좋고, 그 활성 강도는 특히 한정되지 않지만, 각각 서열번호 1 내지 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA 또는 그의 부분의 프로모터 활성을 실질적으로 유지하는 것이 바람직하다. 여기서, 이들 DNA 또는 그의 부분의 "프로모터 활성을 실질적으로 유지하는"이라는 것은 동일한 조건하에서 거의 동일하게 이용할 수 있는 정도의 활성이 유지되는 것을 지칭한다. 또한 여기서 말하는 프로모터 활성은 바람직하게는 식물세포에 있어서 활성, 보다 바람직하게는 국화 식물체에 있어서 활성, 가장 바람직하게는 국화 재배품종 레간(Chrysanthemum morifoliumcv. Reagan 또는Dendranthema grandiflorumcv. Reagan)에 있어서 활성을 말한다.

이와같은 변이체는 서열번호 1 내지 4로 표시되는 염기서열을 참조하면 Molecular Cloning (Sambrook 등 편집(1989) Cold Spring Harbor Lab. Press, New York) 등의 문헌의 기재에 따라서 당업자라면 각별의 곤란성없이 선택하여 제조할 수 있는 것은 명확하다. 또한 당업자라면 상술한 서열번호 1 내지 4로 표시되는 염기서열을 기초로하여 상기 염기서열로부터 1 이상의 염기의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 인위적으로 실시하는 기술(부위특이적 돌연변이유발)에 관해서는 Proc.Natl. Acad. Sci. USA 81(1984) 5662-5666, WO85/00817, Nature 316 (1985) 601-605, Gene 34 (1985) 315-323, Nucleic Acids Res. 13(1985) 4431-4442, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79(1982) 6409-6413, Science 224(1984) 1431-1433 등에 기재된 기술에 의해 변이체를 취득하고 이것을 이용할 수 있다.

상술한 바와 같이 취득한 변이체가 프로모터로서의 활성을 갖는지 여부, 또는 서열번호 1 내지 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA 또는 그의 부분의 프로모터 활성을 실질적으로 유지하는지 여부는 이하와 같은 프로모터 활성측정을 위한 수법에 의해 확인할 수 있다.

상기 변이체의 프로모터 활성은 바람직하게는 각종 리포터 유전자, 예컨대 베타글루쿠로니다제(Gus), 루시페라제(Luc), 클로람페니콜아세틸트랜스퍼라제(Cat), 베타갈락토시다제(Gal), 노팔린 합성효소(nos), 옥토핀 합성효소(ocs) 등의 유전자("Plant genetic transformation and gene expression; a laboratory manual", Draper, J. 등 편집, Blackwell Scientific Publication, 1988)을 신규 프로모터의 하류지역에 연결시킨 벡터를 작제하고, 상기 벡터를 사용하여 종래부터 주지관용되고 있는 각종 형질전환법(후술)에 의해 식물세포의 게놈에 삽입시킨 후, 상기 리포터 유전자의 발현양을 측정하는 것에 의해 산출할 수 있지만, 이 방법에 전혀 한정되지 않는다. 그중의 일례로서, 리포터 유전자가 Gus인 경우에는 숙주세포내에서의 프로모터 활성은 (i) 히스토케미칼 Gus 염색법 및/또는 (ii) 형광기질을 사용하는 방법[어떤 방법도 Plant Molecular Biology Manual, C2 (1994) 1-32 (Ed.) Gelvin과 Schilperort, KluwerAcademic Publishers]에 의해 Gus 활성을 측정하고, 이어 예컨대 Bradford의 방법(Anal. Biochem. 72 (1976) 248-254)에 의해 단백질양을 측정하여, Gus 활성을 단백질량 당으로 환산(예컨대 pmoleMU/분/mg 단백질로서 산출된다)하는 것에 의해, 각각 측정할 수 있다.

본 발명의 DNA가 바람직하게 이용되는 숙주세포는 각각 식물 세포, 예컨대 벼, 보리, 옥수수, 양파, 백합, 난초 등의 단자엽식물, 콩, 평지, 토마토, 감자, 국화, 장미, 카아네이션, 페투니아, 대나물(gypsophila), 시클라멘 등의 쌍자엽식물식물 등의 세포이다. 특히 바람직한 구체예로서는 염색체의 배수성이 높은 국화 등의 식물세포를 들 수 있다. 그 이유는 식물은 상동유전자의 불활성화를 위하여 유전자를 메틸화하는 것으로 추정되며 배수성이 높은 식물은 다수의 상동유전자를 가지기 위하여 강력한 메틸화 기구에 의해 유전자의 불활성화를 실시하는 것으로 추정되고 있기 때문이다(Leitch와 Bennett, Trends in Plant Sci., 2 (1997) 470-476). 또한 게놈의 GC 함량(Thomas와 Sherratt, Biochem. J., 62(1956) 1-4)이 높기 위하여 메틸화 반응의 표시 서열이 풍부한 등의 식물세포 등도 바람직한 후보로 들 수 있다.

(2)DNA쇄

본 발명에 의하면, 본 발명의 DNA를 포함하여 구성된 DNA쇄가 제공된다. 이와 같은 DNA쇄는 임의의 유전자를 전사하기 위하여 사용할 수 있고, 사용함에 있어서 소망하는 유전자가 발현할 수 있는 형으로 상기 DNA쇄중에 조합된다. 이와 같은 유전자는 전형적으로는 구조유전자이다. 따라서, 본 발명은 또한 구조유전자 DNA와상기 구조유전자가 발현하는 양식으로 상기 구조유전자 DNA의 5'부위에 조합된 본 발명의 DNA를 포함하여 구성된 DNA쇄를 제공한다.

본 발명에 의한 DNA쇄의 구체적 형태는 예컨대 플라스미드 또는 파아지 DNA중의 구성요소의 일부로서 본 발명의 DNA가 삽입된 형태이어도 좋다.

이와 같은 DNA쇄중에 구조유전자 DNA를 조합하는 경우에는 그 구조유전자가 발현할 수 있도록 본 발명의 DNA 및 상기 구조유전자 DNA를 배치할 수 있다. 구조 유전자 DNA로서는 β-글루칸 엘리시터(elicitor) 수용체 (Umemoto 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 1029-1034), pac1 (Sano 등, Natl. Biotechnol. 15 (1997) 1290-1294) 및 2-5 Aase 및 RNaseL (Ogawa 등, Natl. Biotechnol. 14 (1996) 1566-1569)를 코드하는 DNA 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 DNA쇄는 또한 번역 인헨서, 번역종지코돈, 터미네이터 등의 구성요소를 포함할 수 있다. 번역인헨서, 번역종지코돈 및 터미네이터로서는 공지의 것을 적절히 조합하여 사용할 수 있다. 바이러스 기원의 번역 인헨서로서는 예컨대 담배 모자이크 바이러스, 알팔파 모자이크 바이러스 RNA4, 브로모 모자이크 바이러스 RNA3, 감자 바이러스 X, 담배 에치 바이러스 등의 서열을 들 수 있다(Gallie 등, Nuc. Acids Res., 15 (1987) 8693-8711). 또한 식물기원의 번역인헨서로서는 콩 β-1,3-글루카나제 (Glu)(Isao ISHIDA, Norihiko MISAWA, 코단샤 사이언티픽 편집, 세포공학실험조작입문, 고단샤, p.119, 1992) 및 담배의 페레독신 결합성 서브유닛(PasDb) 유래의 서열(Yamato 등, J. Biol. Chem., 270 (1995) 12466-12470) 등을 들 수 있다. 터미네이터로서는 예컨대 nos 유전자의 터미네이터, ocs 유전자의 터미네이터 등을 들 수 있다(Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 44 (1993) 985-994, "Plant genetic transformation and gene expression; a laboratory manual" 상기 참조). 또한 프로모터중의 전사 인헨서로서는 35S 인헨서 부분이 확인되며, 이들을 복수개 일렬로 결찰하는 것에 의해 활성을 높이는 것이 보고되어 있다(Plant Cell, 1(1989) 141-150), 이 부분을 DNA쇄의 일부로서 사용할 수 있다. 이들의 각종 구성요소는 그 성질에 따라서 각각이 기능할 수 있는 형으로 DNA쇄중에 조합되는 것이 바람직하다. 이와같은 조작은 당업자라면 적절히 실시할 수 있다.

본 발명의 DNA (프로모터)는 전사개시점 이후에 콩의 Glu 유전자 유래의 번역 인헨서를 포함하고 있다(상기 서열번호 1 또는 2의 279번째 이후, 또는 상기 서열번호 3의 329번째 이후, 혹은 상기 서열번호 4의 429번째이후로 표시된다). 이 서열은 메틸화 프리에 의한 전사촉진에는 직접 관여하고 있지 않지만, 목적으로하는 유전자의 발현을 더욱 촉진할 수 있다. 이 번역 인헨서에 관해서는 본 발명에서 사용한 콩의 Glu 유전자 유래의 것에 한정되지 않고, 지금까지 보고되어 있는 것과 같은 상술한 바와 같은 다른 번역 인헨서로 치환하여도 동일한 효과를 기대할 수 있다. 또한 본 발명과 같이, 이 번역 인헨서의 CG 서열 다음에 다른 염기로 치환하는 것도 가능하다. 또 다른 번역 인헨서에 관해서는 CG 서열 이외에 CNG 서열이 있는 경우에는 상기 서열에 관해서도 CG 서열과 동일하게 다른 염기로 치환할 수 있다. 당업자라면 그와 같은 개변은 적절하게 실시할 수 있다.

상기 DNA쇄는 유전자공학분야에서 관용적으로 실시되는 수법을 이용하는 것에 의해 당업자라면 용이하게 제조할 수 있다. 또한 본 발명의 DNA쇄는 인공적인 구축물에 한정되는 것은 아니고, 상기와 같은 구조를 갖는 것이라면 천연의 공급원으로부터 분리된 것이어도 좋다. 상기 DNA쇄는 주지관용되고 있는 핵산합성 방법에 따라서 합성하는 것에 의해 얻을 수 있다.

(3)형질전환

본 발명의 프로모터 활성을 갖는 DNA를 포함하는 DNA쇄에 의해 숙주를 형질전환하고, 얻은 형질전환체를 배양 또는 재배하는 것에 의해 구조유전자의 발현을 유도할 수 있고, 또는 구조유전자를 높은 효율로 발현시킬 수 있다. 상기 구조유전자는 외래유전자이어도 좋다.

형질전환후의 본 발명의 쇄는 플라스미드, 파아지 또는 게놈 DNA 중에 삽입된 형태로 미생물(특히 세균), 파아지 입자 또는 식물 중에 존재할 수 있다. 여기서, 세균으로서는 전형적으로는 대장균, 아그로박테륨 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 실시형태에서는 본 발명의 DNA쇄는 단백질을 발현시키려하는 구조유전자가 식물체중에서 안정하게 발현할 수 있도록 본 발명의 DNA(프로모터), 번역인헨서, 구조유전자 DNA, 번역종지코돈 및 터미네이터 등이 일체로 결합되어 이것이 게놈에 삽입된 형태로 식물중에 존재한다.

숙주의 바람직한 예로서는 벼, 보리, 옥수수, 양파, 백합, 난초 등의 단자엽 식물, 콩, 평지, 토마토, 감자, 국화, 장미, 카아네이션, 페투니아,대나물(gypsophila), 시클라멘 등의 쌍자엽식물식물 등의 세포를 들 수 있고, 특히 바람직한 구체예로서는 염색체의 배수성이 높은 국화 등의 식물세포 등을 들 수 있다. 또한 구체적인 식물재료로서는 예컨대 생장점, 새싹원기(primordia), 분열조직, 엽편, 경편, 근편, 괴경편, 엽병편, 프로토플라스트, 캘러스, 꽃밥, 화분, 화분관, 화병(꽃자루)편, 화경편, 꽃잎, 꽃받침 등을 들 수 있다.

숙주에 외래유전자를 도입하는 방법으로서는 이미 보고되어 있고, 확립되어 있는 각종 방법을 적절히 이용할 수 있다. 바람직한 예로서, 예컨대 생물학적 방법으로서는 바이러스, 아그로박테륨의 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드 등을 벡터로서 사용하는 방법을 들 수 있고, 물리학적 방법으로서는 엘렉트로포레이션, 폴리에틸렌글리콜, 파티클 건(particle gun), 미량주입법("Plant genetic transformation and gene expression; a laboratory manual" 상기 참조), 실리콘 니트리드 휘스커, 실리콘 카아바이드 휘스커 (Euphytica 85 (1995) 75-80, In Vitro Cell. Dev. Biol. 31 (1995) 101-104, Plant Science 132 (1998) 31-43)에 의해 유전자를 도입하는 방법을 들 수 있다. 상기 도입방법에 관해서는 당업자이면 적절히 선택하여 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 DNA쇄로 형질전환된 식물세포를 재생하는 것에 의해 도입된 유전자가 그 세포내에서 발현하는 형질전환식물을 작제할 수 있다. 이와 같은 조작은 식물세포로부터 식물체로의 재생방법으로서 일반적으로 알려져 있는 방법에 의해 당업자라면 용이하게 실시할 수 있다. 식물세포로부터 식물체로의 재생에 관해서는 예컨대 「식물세포배양 매뉴얼」(야마다 야스유키 편저, 고담샤 사이언티픽,1984) 등의 문헌을 참조하기 바람.

발현유도 또는 고발현된 유전자의 발현산물은 그 자체를 분리하여 이용하고 싶은 경우에는 배양물로부터 그 발현산물에 적합한 방법에 의해 분리정제할 수 있다. 또한 발현산물의 존재에 의해 숙주세포의 성장 또는 생육, 또는 그의 세포의 성질이 개질되는 경우에는 그와 같은 숙주를 배양하고 또는 상기 숙주가 탈분화된 식물체인 경우에는 그 식물체를 재배하는 것에 의해 목적으로하는 구조유전자의 발현산물을 고발현시킬 수 있다.

또한 본 발명에 의해 개시된 고발현 프로모터에 의해 예컨대 카나마이신 내성(예컨대 NPTII) 유전자의 선택 마커를 발현시킨 DNA쇄를 사용하는 것에 의해, 식물체의 형질전환 효율을 현저하게 높일 수 있다. 이것은 선택 마커 유전자 DNA와 상기 선택 마커 유전자가 발현하는 양식으로 상기 선택 마커 유전자 DNA의 5' 부위에 재조합된 상기 어느 하나의 DNA를 포함하여 구성된 DNA쇄를 사용하는 것에 의해 실시할 수 있다. 그 구체적 방법은 특히 한정되지 않지만, 예컨대 상기 DNA쇄로 숙주를 형질전환처리시키고, 수득한 숙주를 상기 선택 마커 유전자가 발현가능하고, 또 상기 선택 마커 유전자를 발현하는 숙주와 이것을 발현하지 않는 숙주를 식별할 수 있는 조건하에서 배양하는 것에 의해 실시할 수 있다. 상기 숙주는 식물세포 이외의 것이어도 좋고, 특히 한정되지 않지만 바람직하게는 식물세포이다. 여기서 사용할 수 있는 선택 마커 유전자는 어떠한 것이어도 좋고, 특히 한정되지 않지만, 바람직하게는 약제내성 유전자, 예컨대 NPTII 유전자 (카나마이신 내성 유전자),Hyg^r유전자 (하이그로마이신 내성 유전자) 등을 사용할 수 있다. 이 경우에는 선택 마커 유전자를 발현하는 숙주와 이것을 발현하지 않는 숙주를 식별할 수 있는 조건은 그 유전자가 내성을 갖는 약제를 함유하는 배지를 사용하여 배양하는 것에 의해 달성할 수 있다. 선택 마커 유전자로서 NPTII 유전자를 사용하는 경우에 이용되는 약제로서는 카나마이신(Km)을 들 수 있지만, 이것에 전혀 한정되지 않으며, G418 및 파로모마이신도 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 또한 예컨대 하이그로마이신 내성(예컨대 Hyg^r) 유전자의 선택 마커를 발현시킨 DNA쇄를 사용한 경우에도 동일한 효과를 기대할 수 있다. 이 경우에 사용하는 약제로서는 하이그로마이신을 들 수 있다.

이 경우에 있어서도 상기 DNA쇄를 숙주세포에 도입하여 형질전환시킨 식물체를 취득하는 방법으로서는 상기와 같은 임의의 방법을 이용할 수 있고, 상기 식물체의 발현확인에는 예컨대 리포터 유전자가 Gus인 경우에는 상기의 (i) 히스토케미컬 Gus 염색에 의한 방법에 의해 및/또는 (ii) 형광기질을 사용하는 방법(Plant Molecular Biology Manual, C2(1994) 1-32, 상기 참조) 등에 의해 확인할 수 있다.

일반적으로, 세포의 분화에 따라서, 메틸화에 의한 유전자의 불활성화가 일어나는 것이 알려져 있고, 본 발명에 의해 개시된 프로모터는 형질전환시의 캘러스 등의 미분화 식물세포뿐만 아니라 식물체에 있어서도 목적 유전자를 고발현시킬 수 있는 것이 기대된다.

이하에 본 발명을 실시예에 의해 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되지 않는다.

[실시예 1] 메틸화 프리(free) 프로모터의 제조

CaMV의 35S 프로모터의 mRNA (전사)개시점으로부터 상류 250 bp중에는 13개의 CG 또는 CNG가 존재하고, 이들의 염기서열은 식물체중에서 각각 CG 메틸화 효소 및 CNG 메틸화효소에 의해 메틸화되어 있는 것이 관찰된다. 그래서 이들 서열을 메틸화되지 않는 서열로 치환시킨 DNA를 전합성하였다(MF-48: 서열번호 1). 또한 전사활성에 특히 큰 영향을 갖는 것으로 생각되는 ocs 영역에 관해서는 그중의 CG 서열을 남긴채 6염기의 회문상 구조(GACGTC)로 되도록 개변시킨 것을 작성하였다(MF-18: 서열번호 2). MF-48 및 MF-18의 서열(전사개시점으로부터 상류)와 식물의 유전자조작에서 통상 가장 널리 사용되는 벡터 pBI121에 포함되는 35S 프로모터의 서열과의 비교를 각각 도1A 및 도1B에 나타내었다. 도1A 및 도1B에서, 하선부는 메틸화의 표시로 불리는 CG 및 CNG 서열을 나타낸다.

상기한 것과는 별도로, Friedrich Miescher-Institut (스위스)의 혼 박사로부터, 35S 프로모터의 메틸화 표시부위를 개변시킨 유전자(플라스미드 명칭은 pSan9: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(1996) 8334-8339, 상기 참조)의 양도를 받았다. 이 유전자는 mRNA의 전사개시점의 상류 약 250 염기쌍의 프로모터 부분과, 그 하류에 CaMV의 35S 유전자의 약 50 염기쌍의 5' 비번역서열(상기 프로모터 부분 및 5' 비번역서열을 모두 이하 "MF-28"이라 칭함), 또한 하류에 Gus 구조(리포터) 유전자와 35S의 터미네이터를 포함하는 Gus 유전자 발현 카세트로부터 구성되어 있다.

[실시예 2]메틸화 프리 프로모터를 갖는 벡터의 제조

이와같이 하여 제조한 MF-48, MF-18 및 MF-28의 효과를 형질전환된 식물체에서 검증하기 위해, 발현 벡터를 구축하였다. 이하의 발현 벡터는 모두 보더(boarder) 서열에 끼워진 영역내에 Gus 유전자 및 NPTII 유전자의 발현 유닛이, 전사방향이 반대로되도록 구성되어 있다. 이들 발현 카세트를, 아그로박테리아와 대장균에서 증폭가능한 바이나리형 벡터, pKT11을 기본 벡터로하고, Gus 유전자 및 NPT11 유전자의 프로모터를 치환하는 것에 의해 pKT81, pKT83 및 pMF-28을 구축하였다.

상기 바이너리형 벡터 pKT11은 아그로박테리아 A281의 RB영역인 XhoI-EcoRI 약 250 bp, Gus 유전자의 발현 유닛 부분인 HindIII-EcoRI 약 3.5 kbp의 부분(5'측으로부터 순서대로, CaMV의 35S 프로모터, 담배의 PsaDb의 번역 인헨서, 아주까리의 카탈라제 유전자의 인트론을 포함하는 Gus 유전자, nos 유전자의 터미네이터를 결찰), NPTII 유전자의 발현 유닛 부분인 HindIII-KpnI 약 1.7 kbp의 부분(nos 유전자의 프로모터로 구동되는 식물체에서 작용하는 NPTII 유전자, nos 유전자의 터미네이터) 및 pBI121 유래의 왼쪽 보더(boarder) 영역과 아그로박테리아와 대장균에서 증폭가능한 복제기점을 가진 부분인 KpnI-XhoI 약 5.5 kbp로 구성되어 있는 벡터이고, 또한 콩 유래의 Glu 유전자의 번역 인헨서를 접속시킨 프로모터에 의해 Gus 유전자를 발현시킨 벡터이다(도2D).

실시예 1에서 제조한 DNA 단편(프로모터)을 아가로오스 겔에 의해 정제하고, 플라스미드 pKT11의 35S 프로모터 영역(HindIII-XbaI)과 치환하여 플라스미드 pKT81 및 pKT83을 제조하였다(도2).

pKT81 및 pKT83은 각각 MF-48 및 MF-18의 하류에 번역효율을 높이는 목적으로 콩 유래의 Glu 유전자의 번역 인헨서를 결찰하고, 또한 하류에 리포터 유전자인 Gus 유전자, nos 유전자의 터미네이터를 결찰시킨 발현 유닛을 갖는다. 동시에 ipt 유전자의 프로모터, 콩 유래의 Glu 유전자의 번역인헨서, NPTII 유전자 및 nos 유전자의 터미네이터를 결찰시킨 발현 유닛을 포함하고 있다.

pMF-28은 pSan9의 Gus 유전자 발현 카세트 전체를, pKT11의 Gus 발현 카세트와 교환한 것이다.

MF-48과 MF-18의 프로모터 및 MF-28에 의해 Gus 유전자를 각각 발현하는 벡터 pK81, pK83 및 pMF-28의 제한효소지도를 각각 도2A, 도2B 및 도2C에 나타내고, 베이스로되는 pKT11을 도2D에 나타낸다.

또한 ocs 영역을 증가시킨 프로모터를 제조하기 위하여 MF-48 프로모터의 ocs를 포함하는 영역인 제한효소 BamHI와 BglII의 절단지점까지의 서열을, 본 프로모터를 BamHI으로 절단시킨 단편에 삽입하고, 이 서열이 동일방향으로 2 카피 직렬배열된 프로모터(MF-48-2: 서열번호3) 및 이 서열이 동일방향으로 4 카피 직렬 배열된 프로모터(MF-48-4: 서열번호4)를 각각 제조하였다(도3).

[실시예 3]Gus 유전자를 발현하는 국화 캘러스의 제조

MF-48 및 MF-18의 프로모터로부터 Gus 유전자를 발현하는 벡터 pKT81 및 pKT83 및 대조로서 pKT11을 엘렉트로포레이션법에 의해 아그로박테륨 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404주에 도입하고, 이것을 하기의 YEB-Km 배지 3 ml에 접종하며, 28℃에서 16시간, 암소에서 배양시킨 후, 원심분리에 의해 집균하고, 하기의 감염배지 10ml에 현탁시키고 이것을 감염액으로 하였다. YEB-Km 배지 및 감염배지의 배지조성은 이하와 같다.

YEB-Km 배지: 5g/l 쇠고기 추출물, 1g/l 효모 추출물, 5g/l 펩톤, 5g/l 수크로오스, 2mM 황산마그네슘 (pH 7.2) 및 50 mg/l 카나마이신

감염배지: 1/2 농도의 MS (Murashige & Skoog, Physiol. Plant., 15 (1962) 473-497) 배지의 무기염 및 비타민류, 15g/l 수크로오스, 10g/l 글루코오스, 10 mM MES(pH 5.4).

국화의 재배품종인 레간(Chrysanthemum morifoliumcv. Reagan 또는Dendranthema grandiflorumcv. Reagan)의 무균 개체의 잎을 5-7 mm 각으로 절단하고, 각각 각종 벡터: pKT11, pKT81 및 pKT83을 도입시킨 아그로박테륨 감염액에 10분간 침지시키고, 과량의 감염액을 여과지로 제거한 후 하기의 공존배지로 이식하여 25℃의 암소에서 배양하였다. 3일간 배양한 후, 하기 선택배지로 이식하여 3주간 배양하는 것에 의해 Km 내성의 캘러스를 얻었다. 선택배지에서의 배양은 25℃, 16시간 조명(광밀도 32 μE/m²s)/8시간 무조명의 조건하에서 실시하였다. 수득한 Km 내성의 캘러스를 포함하는 엽편 각 4매씩, 합계 12매를 Gus 유전자의 발현 확인을 위해 Gus 활성측정에 이용하였다.

공존배지: MS 배지의 무기염 및 비타민류, 30g/l 수크로오스, 1mg/l 나프탈렌아세트산, 2 mg/l 벤질아데닌, 8g/l 한천, 5mM MES (pH 5.8) 및 200 μM 아세토시린곤.

선택배지: MS 배지의 무기염 및 비타민류, 30g/l 수크로오스, 1mg/l 나프탈렌아세트산, 2 mg/l 벤질아데닌, 8 g/l 한천, 5 mM MES (pH 5.8), 25 mg/l 카나마이신 및 300 mg/l 세포탁심.

상기 측정의 반응용액(100mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0), 1mM EDTA, 0.1%Triton X-100, 디티오트레이톨(DTT) 1mM) 200 ㎕중에 상기 엽편을 이식하고, 얼음냉각시키면서 충분하게 파쇄하였다. 현탁액을 원심분리하여 상층액을 회수하고, 이것을 조효소액으로 하였다. Gus 활성의 측정은 공지 보고(Plant Molecular Biology Manual, C2 (1994) 1-32, 상기 참조)를 기초로하여 실시하였다. 즉 반응용액 145 ㎕에 조효소액 5㎕ 및 기질로서 2.8 mg/ml의 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루쿠로니드 50 ㎕를 첨가하여 발생하는 형광을 측정하여 실시하였다. 단백질양의 측정은 바이오라드사의 프로테인 에세이 키트 II를 이용하여 실시하여 단백질량당 Gus 활성을 산출하였다. 하기 표 1에 pKT11, pKT81 및 pKT83에 의해 각각 형질전환된 캘러스의 Gus 활성을 나타낸다. pKT81 및 pKT83에 의해 형질전환된 캘러스는 pKT11에 의해 형질전환된 캘러스보다도 약 4 내지 5배 높은 Gus 활성을 나타내는 것으로부터, 메틸화 프리 프로모터: MF-48 및 MF-18이 고발현성이라는 것이 확인되었다.

MF-48-2 및 MF-48-4에 관해서도, pBI121의 35S 프로모터와 치환시킨 벡터를 제조하고, 상기와 동일하게 국화 엽편을 재료로한 형질전환을 실시하여, Km 내성의 캘러스를 수득하였다. 이들 캘러스를 사용하여 Plant Molecular Biology Manual,C2 (1994) 1-32 (상기참조)에 기재된 방법에 따라서 Gus 활성에 의한 조직감염을 실시한 경우, pBI121에서는 발색이 관찰되지 않았음에 비하여, MF-48-2 및 MF-48-4에서는 현저하게 강한 청색 발색이 관찰되었다. 즉, 정성적인 발현강도는 pBI121에서는 (-)이었음에 비하여, MF-48-2와 MF-48-4에서는 (+) 내지 (++)이었다.

[실시예 4]Gus 유전자를 발현하는 국화 식물체의 제조

식물의 형질전환에 있어서, 오랫동안 캘러스와 같은 미분화 세포중에서 고발현하는 프로모터가 생장된 식물에서는 극히 일부의 세포에서만 고발현되지 않는 현상이 발견된다. 이 현상의 1개 원인으로서 식물세포가 분화할 때 필요하지 않은 유전자의 발현을 억제하기 위해 유전자의 메틸화가 촉진되는 것을 고려할 수 있다. 이상의 관점으로부터, 본 발명에 의해 전시된 메틸화 프리 프로모터는 생장한 식물체에서도 고발현되는 것이 아닌가하여 다음을 검증하였다.

pKT81, pKT83 및 pMF-28을 포함하는 아그로박테륨 튜메파시엔스 LBA4404주를 실시예 3의 방법에 따라서 형질전환시켜 수득한 Km 내성의 캘러스로부터 Km을 포함하는 MS 배지(재생배지; 실시예 3의 선택배지와 동일 조성)에서 식물체를 재생시켰다. 또한 발근(rooting)을 촉진하기 위하여, 재생배지로부터 식물생장조절물질(나프탈렌아세트산, 벤질아데닌)을 제외한 발근촉진배지에서 생장시켰다.

생장한 식물체중으로부터 외래유전자로서 NPTII 유전자를 함유하는 개체를, PCR을 실시하는 것에 의해 검출하고, 상기 재분화 식물체가 형질전환체인 것을 확인하였다. 여기서, NPTII 유전자 특유의 서열을 특이적으로 증폭하는 프라이머로서 TAAAGCACGAGGAAGCGGT (서열번호 5) 및 GCACAACAGACAATCGGCT (서열번호 6)을 사용하였다. PCR의 반응조건은 94℃에서 5분간 가열한 후, 94℃(30초)-55℃ (1분)- 72℃ (1분)의 주기를 30회 실시하고, 최후에 72℃에서 10분간 반응시켰다. 이 반응에서는 효소로서 ExTaq 폴리머라제 (다카라스조사제)를 사용하였다.

이들 식물체의 잎 각 3매, 각 유전자당 10개체씩에 대하여 Km 내성 캘러스와 동일하게 활성을 측정한 평균치를 도4에 나타낸다. 대조로서, 실시예3의 형질전환법에 따라서 pBI121을 국화 및 담배(품종: 크산티(Xanthi))에 도입하는 실험도 실시하였다. 또한 pKT81(MF-48), pKT83 (MF-18) 및 pMF-28 (MF-28)을 도입한 국화 형질전환체의 잎에서의 Gus 유전자의 발현양을 개체별로 측정한 히스토그램을 도5에 나타낸다.

결과는, pKT81 (MF-48), pKT83 (MF-18) 및 pMF-28 (MF-28)을 도입한 국화에서는 pBI121에 비하여 보다 높은 Gus 유전자의 발현이 관찰되었다. 그러나, pMF-28의 발현양은 고발현 프로모터의 예로서 보다 널리 알려져있는 담배에서의 발현양에는 미치지않았다. 그러나, 놀랍게도, pKT81과 pKT83으로는 담배에서 pBI121(35S)의 발현양을 훨씬 초과하고 있었다. 그중에서 pKT81 (MF-48)과 pKT83 (MF-18)을 비교하면, pKT83 (MF-18) 개체 쪽이 Gus 유전자의 발현이 보다 높은 경향을 나타내었다(도4). 또한 국화에서의 발현양을 개체별로 보면, 예컨대 Gus 유전자의 발현양은, 3배 이상을 나타내는 개체는 MF-48 및 MF-18에 한정되어 있었다. 전체적으로 MF-18 쪽이 MF-48에 비하여 고발현 개체수가 보다 많은 경향이었다(도5).

[실시예 5]형질전환된 국화에서의 외래유전자의 메틸화의 분석

도입한 유전자가 생체내에서 어느 정도 메틸화되어 있는가를 알기 위해서 도입 유전자의 서열중의 메틸화되어 있는 시토신의 위치를 측정하였다. 분석법은 Meyer 등의 시토신· 데아미네이션 PCR법(EMBO Journal, 13 (1994) 2084-2088)에 따랐다. 그 방법의 개략은 먼저 실시예 4에서 수득한 형질전환 국화로부터 CTAB법에 의해 DNA를 추출하고, 제한효소 EcoRI으로 절단한 후, 변환 완충액(3M Na-비술페이트, 0.5 mM 히드로퀴논, pH3.5)에 현탁하고, 질소분위기중, 50℃에서 20시간 반응시켰다. 투석에 의한 탈염후, DNA를 0.3N의 NaOH로 알칼리성 변성시킨 후 에탄올에 의해 DNA를 침전시켜 회수하였다. 이어, 염기서열을 결정하는 부위를 측면에 두게 고안된 DNA 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 실시하였다. 여기서 사용된 PCR 프라이머를 이하에 나타낸다.

<35S 영역 메틸화 분석용 프라이머>

1회째의 PCR

35S-8:(서열번호 7)

35S-8:(서열번호 8)

2회째의 PCR

35S-9:(서열번호 9)

35S-14:(서열번호 10)

<35S 상보쇄의 메틸화 분석용 프라이머>

1회째의 PCR

35S-C-1:(서열번호 11)

35S-C-4:(서열번호 12)

2회째의 PCR

35S-C-2:(서열번호 13)

35S-C-3:(서열번호 14)

1회째의 PCR

35S-16:(서열번호 15)

T0-100:(서열번호 16)

2회째의 PCR

35S-17:(서열번호 17)

T0-101:(서열번호 18)

1회째의 PCR

35S-16:(서열번호 15)

pac1-7:(서열번호 19)

2회째의 PCR

35S-17:(서열번호 17)

pac1-8:(서열번호 20)

1회째의 PCR

T0-103:(서열번호 21)

T0-105:(서열번호 22): GUS 유전자 5' 영역

2회째의 PCR

T0-104:(서열번호 23)

T0-106:(서열번호 24): GUS 유전자 5' 영역

상기 PCR의 반응조건은 모두 1회째는 94℃에서 5분간 가열한 후, 94℃(30초)-65℃(1분)-72℃(1분)의 주기를 30회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰다. 2회째는 1회째의 PCR 산물로부터의 1 ㎕를 사용하여 94℃에서 5분간 가열한 후 94℃(30초)-60℃(1분)-72℃(1분)의 주기를 30회 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰다.

이 반응에서, 효소는 ExTaq 폴리머라제(다카라스조사제)를 사용하며, PCR의 합성산물을 pT7blue에 클로닝하여 원래의 DNA에 관하여 각각 약 5 클론의 DNA 서열을 결정하였다. 이들 일련의 변환반응에 의해 시토신은 우리딘으로 변환되며, 메틸화 시토신은 그대로 시토신으로 판독되기 때문에 메틸기의 유무를 구별할 수 있다. 염기서열의 차이는 DNASIS-Mac v3.7에 의해 해석하였다.

실시예 4에 의해 수득할 수 있는 국화 형질전환체를 약 10개체 분석한 결과, Gus 유전자가 고발현하고 있는 국화 형질전환체에서는 35S 프로모터중에서 메틸화된 시토신은 비교적 적고 또 약 5 클론중에서의 메틸화되어있는 비율도 낮았다. 반면에, Gus 유전자의 발현이 검출되지 않는 개체에서는 35S 프로모터중에서 CG와 CNG를 포함하는 거의 모든 시토신이 높은 비율로 메틸화되어 있었다. 여기서, 대조 실험으로서, 동일 유전자를 도입한 담배(품종: 크산티(Xanthi)에 관해서도 Gus 유전자의 고발현 개체를 조사하면 시토신의 메틸화는 전혀 검출되지 않았다. 또한 국화에서 35S 프로모터의 DNA의 상보쇄에 관해서도 시토신의 메틸화 정도를 조사하면, 메틸화 시토신이 산재되어 있지만, 특정 시토신이 수식되는 일이 없으며, 또한 Gus 유전자의 발현과도 상관이 없었다. 한편, 구조유전자의 메틸화에 관해서도 조사하였지만, 적어도 번역개시점(ATG)으로부터 약 600 염기 까지에는 시토신의 수식은 발현의 강약에 상관없이 거의 발견되지 않았다. 이상과 같은 시토신의 메틸화와 발현양과의 관계는 Gus 유전자 뿐만 아니라 2중쇄 RNA 특이적 RNase 유전자(Nature Biotechnology, 15, 1290-1297, 상기 참조)를 35S 프로모터 하류에 결찰시킨 구조를 국화에 도입한 경우에도 관찰되었다.

이어, pKT81을 도입하고, Gus 유전자를 고발현하고 있는 국화에 관해서도 동일하게 메틸화 조사를 실시하였다. 그 결과, 형질전환에 의해 전혀 메틸화되지 않는 개체와 회문상 구조 이외의 부위의 시토신이 프로모터로부터 Gus 유전자에 걸쳐 강하게 메틸화되어 있는 개체가 있었다. 그러나, 어떤 군의 개체도 Gus 유전자를 강하게 발현하고 있는 점에서, 회문상 구조(CG 및 CNG) 이외의 시토신 잔기의 메틸화에 관해서는 유전자 발현에 대한 영향은 적은 것으로 생각된다.

따라서, 구조유전자의 발현을 상승시키기 위한 방법의 하나로서 도입유전자의 프로모터 부위의 CG 및 CNG의 회문상 구조를 형성하는 염기서열을 변환하는 것이 중요한 것으로 생각된다. 또한 회문상 구조중에서도 pKT83에서는 수위 ocs 서열로 불리우는 짧은 서열중의 CG 서열(서열번호 2의 185 및 197번째에 있는 시토신 염기)에 관해서는 변환되지 않은 서열로 되어 있지만, 이 부위의 효과에 관해서는 실시예 3(도4 및 도5)의 결과에서는 pKT81 보다도 활성이 높은 경향이 있기 때문에 고발현 프로모터를 제조하기 위하여 이 ocs 서열의 회문상구조를 변환하지 않는 편이 생체내에서의 보다 높은 발현이 달성될 수 있음이 밝혀졌다.

[실시예 6]카네이션의 형질전환

메틸화 프리 프로모터로 NPTII 유전자의 발현양을 증가시켜 마커에서의 선택효율을 향상시킬 목적으로, NPTII의 발현 카세트의 Nos 프로모터를 메틸화 프리 프로모터로 변경하였다. 간단하게 설명하면, 카세트중의 Nos 프로모터와 MF-48 프로모터를 HindIII로부터 XbaI의 DNA 단편으로 치환하고, MF-48 프로모터·NPTII·Nos 터미네이터의 카세트를 제조하였다. 이것과 pKT-11중의 NPTII 발현 카세트(HindIII로부터 KpnI)와 치환하는 것에 의해 Gus의 발현 카세트와 결찰된 바이너리 벡터로서 pKT74를 제조하였다.

이 pKT74 및 대조로서 pKT11을 엘렉트로포레이션법에 의해 아그로박테륨 튜메파시엔스 LBA4404주에 도입하고, 이것을 하기한 YEB-Km 배지 3 ml에 접종하며, 28℃에서 16시간, 암소에서 배양한 후, 원심분리에 의해 집균하고, 하기한 감염배지 10 ml에 현탁시키며 이것을 감염액으로 하였다. YEB-Km 배지 및 감염배지의 배지 조성은 이하와 같다.

카네이션의 재배품종인 스케니아(Dianthus caryophyllusL)의 무균 개체로부터 잎의 기부(Leaf stems)를 절단하고, 이것을 각각 pKT11 및 pKT74를 도입한 아그로박테륨 감염액에 10분간 침지시키고, 과량의 감염액을 여과지로 제거한 후 하기의 공존배지로 이식하여 25℃의 암소에서 배양하였다. 3일간 배양한 후, 하기 선택배지로 이식하여 3주간 배양하는 것에 의해 G418 내성인 캘러스를 얻었다. 선택배지에서의 배양은 25℃, 16시간 조명(광밀도 32 μE/m²s)/8시간 무조명의 조건에서 실시하였다.

[실시예 7]카네이션 형질전환체의 선택

pKT11 및 pKT74를 포함하는 아그로박테륨 튜메파시엔스 LBA4404주를, 실시예 6의 방법에 따라서 형질전환시켜 수득한 G418 내성인 묘목으로부터 G418을 포함하고 식물생장조절물질(인돌부티르산, 티아디아주론)을 포함하지 않는 MS 배지에서 식물체를 재생시켰다.

생장시킨 식물체중으로부터 외래 유전자로서 NPTII 유전자를 함유하는 개체를 PCR을 실시하는 것에 의해 검출하고, 이 재분화 식물체가 형질전환체인 것을 확인하였다. 여기서, NPTII 유전자 특유의 서열을 특이적으로 증폭하는 프라이머로서 TAAAGCACGAGGAAGCGGT (서열번호 5) 및 GCACAACAGACAATCGGCT (서열번호 6)을 사용하였다. PCR의 반응조건은 94℃에서 5분간 가열한 후, 94℃(30초)-55℃(1분)-72℃(1분)의 주기를 30회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰다. 이 반응에서는 효소로서 ExTaq 폴리머라제 (다카라스조사제)를 사용하였다.

PCR에 의해 NPTII 유전자가 검출된 개체를 형질전환체로 하였다. pKT11 및 pKT74의 각각에 관해서는 사용한 엽편당 형질전환체의 개수로서 형질전환효율을 산출한 경우, pKT11에서는 5% 이하이었음에 비하여, pKT74에서는 25% 이상의 효율을 나타내었다. 또한 Gus 활성에 관해서는 실시예 3과 동일하게 측정하며, 재조합체가 모두 Gus 유전자를 발현하고 있는 것을 확인하였다.

이상의 결과로부터, 선택 마커 유전자를 발현하는 이외에도 MF-48 프로모터는 극히 유효하게 작용하는 것으로 생각할 수 있다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 참고문헌으로서 그 전체를 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.

본 발명에 의하면, 종래부터 식물용의 고발현 프로모터로 간주되어온 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터에 의한 구조유전자의 발현이 약한 식물, 예컨대 국화에 있어서도 발현효율을 향상시킬 수 있다.

Claims

(a) 서열번호 1로 표시되는 염기서열중의 제7 내지 272 염기로된 염기서열을 포함하는 DNA; 또는

(b) 서열번호 1로 표시되는 염기서열중의 제7 내지 272 염기로된 염기서열에 있어서 제41 내지 42 염기, 제59 내지 60 염기, 제73 내지 75 염기, 제77 내지 78 염기, 제80 내지 82 염기, 제109 내지 110 염기, 제119 내지 120 염기, 제134 내지 135 염기, 제145 내지 146 염기, 제181 내지 183 염기, 제185 내지 186 염기, 제197 내지 198 염기 및 제217 내지 218 염기를 제외한 부위에서 1개 내지 수개의 염기가 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열을 포함하고, 상기 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열중에 CG, CAG, CTG, CCG 및 CGG 등으로 표시되는 연속서열을 포함하지 않으며 또 프로모터 활성을 갖는 DNA로 표시되는 DNA.
(c) 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA; 또는

(d) 서열번호 1로 표시되는 염기서열에 있어서 제41 내지 42 염기, 제59 내지 60 염기, 제73 내지 75 염기, 제77 내지 78 염기, 제80 내지 82 염기, 제109 내지 110 염기, 제119 내지 120 염기, 제134 내지 135 염기, 제145 내지 146 염기, 제181 내지 183 염기, 제185 내지 186 염기, 제197 내지 198 염기 및 제217 내지 218 염기를 제외한 부위에서 1개 내지 수개의 염기가 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열을 포함하고, 상기 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열중에 CG, CAG, CTG, CCG및 CGG 등으로 표시되는 연속서열을 포함하지 않으며 또 프로모터 활성을 갖는 DNA로 표시되는 DNA.
(e) 서열번호 2로 표시되는 염기서열중의 제7 내지 272 염기로된 염기서열을 포함하는 DNA; 또는

(f) 서열번호 2로 표시되는 염기서열중의 제7 내지 272 염기로된 염기서열에 있어서 제41 내지 42 염기, 제59 내지 60 염기, 제73 내지 75 염기, 제77 내지 78 염기, 제80 내지 82 염기, 제109 내지 110 염기, 제119 내지 120 염기, 제134 내지 135 염기, 제145 내지 146 염기, 제181 내지 183 염기, 제183 내지 188 염기, 제195 내지 200 염기 및 제217 내지 218 염기를 제외한 부위에서 1개 내지 수개의 염기가 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열을 포함하고, 상기 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열중에 CG, CAG, CTG, CCG 및 CGG 등으로 표시되는 연속서열을 포함하지 않고(단, 제185 내지 186 염기 및 제197 내지 198 염기는 각각 CG이다) 또 프로모터 활성을 갖는 DNA로 표시되는 DNA.
(g) 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA; 또는

(h) 서열번호 2로 표시되는 염기서열에 있어서, 제41 내지 42 염기, 제59 내지 60 염기, 제73 내지 75 염기, 제77 내지 78 염기, 제80 내지 82 염기, 제109 내지 110 염기, 제119 내지 120 염기, 제134 내지 135 염기, 제145 내지 146 염기, 제181 내지 183 염기, 제183 내지 188 염기, 제195 내지 200 염기 및 제217 내지218 염기를 제외한 부위에서 1개 내지 수개의 염기가 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열을 포함하고, 상기 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열중에 CG, CAG, CTG, CCG 및 CGG 등으로 표시되는 연속서열을 포함하지 않고(단, 제185 내지 186 염기 및 제197 내지 198 염기는 각각 CG이다) 또 프로모터 활성을 갖는 DNA로 표시되는 DNA.
(i) 서열번호 3으로 표시되는 염기서열중의 제7 내지 322 염기로된 염기서열을 포함하는 DNA; 또는

(j) 서열번호 3으로 표시되는 염기서열중의 제7 내지 322 염기로된 염기서열에 있어서 제41 내지 42 염기, 제59 내지 60 염기, 제73 내지 75 염기, 제77 내지 78 염기, 제80 내지 82 염기, 제109 내지 110 염기, 제119 내지 120 염기, 제134 내지 135 염기, 제145 내지 146 염기, 제181 내지 183 염기, 제185 내지 186 염기, 제197 내지 198 염기, 제217 내지 218 염기, 제231 내지 233 염기, 제235 내지 236 염기, 제247 내지 248 염기 및 제267 내지 268 염기를 제외한 부위에서 1개 내지 수개의 염기가 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열을 포함하고, 상기 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열중에 CG, CAG, CTG, CCG 및 CGG 등으로 표시되는 연속서열을 포함하지 않고 또 프로모터 활성을 갖는 DNA로 표시되는 DNA.
(i) 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA; 또는

(l) 서열번호 3으로 표시되는 염기서열에 있어서, 제41 내지 42 염기, 제59내지 60 염기, 제73 내지 75 염기, 제77 내지 78 염기, 제80 내지 82 염기, 제109 내지 110 염기, 제119 내지 120 염기, 제134 내지 135 염기, 제145 내지 146 염기, 제181 내지 183 염기, 제185 내지 186 염기, 제197 내지 198 염기, 제217 내지 218 염기, 제231 내지 233 염기, 제235 내지 236 염기, 제247 내지 248 염기 및 제267 내지 268 염기를 제외한 부위에서 1개 내지 수개의 염기가 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열을 포함하고, 상기 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열중에 CG, CAG, CTG, CCG 및 CGG 등으로 표시되는 연속서열을 포함하지 않고 또 프로모터 활성을 갖는 DNA로 표시되는 DNA.
(m) 서열번호 4로 표시되는 염기서열중의 제7 내지 422 염기로된 염기서열을 포함하는 DNA; 또는

(n) 서열번호 4로 표시되는 염기서열중의 제7 내지 422 염기로된 염기서열에 있어서 제41 내지 42 염기, 제59 내지 60 염기, 제73 내지 75 염기, 제77 내지 78 염기, 제80 내지 82 염기, 제109 내지 110 염기, 제119 내지 120 염기, 제134 내지 135 염기, 제145 내지 146 염기, 제181 내지 183 염기, 제185 내지 186 염기, 제197 내지 198 염기, 제217 내지 218 염기, 제231 내지 233 염기, 제235 내지 236 염기, 제247 내지 248 염기, 제267 내지 268 염기, 제281 내지 283 염기, 제285 내지 286 염기, 제297 내지 298 염기, 제317 내지 318 염기, 제331 내지 333 염기, 제335 내지 336 염기, 제347 내지 348 염기 및 제367 내지 368 염기를 제외한 부위에서 1개 내지 수개의 염기가 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열을 포함하고, 상기결실, 부가 또는 삽입된 염기서열중에 CG, CAG, CTG, CCG 및 CGG 등으로 표시되는 연속서열을 포함하지 않고 또 프로모터 활성을 갖는 DNA로 표시되는 DNA.
(o) 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA; 또는

(p) 서열번호 4로 표시되는 염기서열에 있어서, 제41 내지 42 염기, 제59 내지 60 염기, 제73 내지 75 염기, 제77 내지 78 염기, 제80 내지 82 염기, 제109 내지 110 염기, 제119 내지 120 염기, 제134 내지 135 염기, 제145 내지 146 염기, 제181 내지 183 염기, 제185 내지 186 염기, 제197 내지 198 염기, 제217 내지 218 염기, 제231 내지 233 염기, 제235 내지 236 염기, 제247 내지 248 염기, 제267 내지 268 염기, 제281 내지 283 염기, 제285 내지 286 염기, 제297 내지 298 염기, 제317 내지 318 염기, 제331 내지 333 염기, 제335 내지 336 염기, 제347 내지 348 염기 및 제367 내지 368 염기를 제외한 부위에서 1개 내지 수개의 염기가 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열을 포함하고, 상기 결실, 부가 또는 삽입된 염기서열중에 CG, CAG, CTG, CCG 및 CGG 등으로 표시되는 연속서열을 포함하지 않고 또 프로모터 활성을 갖는 DNA로 표시되는 DNA.
제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 기재된 DNA를 포함하는 DNA쇄.
제9항에 있어서, 구조유전자 DNA와 상기 구조유전자가 발현하는 양식으로 상기 구조유전자 DNA의 5' 부위에 조립된 제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 기재된DNA를 포함하는 DNA쇄.
제9항 또는 제10항에 기재된 DNA쇄로 형질전환된 숙주.
제11항에 있어서, 숙주가 식물세포인 숙주.
제11항에 기재된 숙주를 상기 구조유전자가 발현가능하도록 배양 또는 재배하는 것을 특징으로 한느 식물에서 구조유전자를 발현시키는 방법.
제13항에 있어서, 구조유전자가 외래유전자인 방법.
제11항에 기재된 숙주를 사용하여 상기 프로모터 활성을 갖는 DNA에 의해 전사가 활성화되는 또는 발현이 촉진되는 구조유전자의 발현산물인 단백질을 제조하는 방법.
제12항에 기재된 숙주로부터 재생에 의해 얻을 수 있는 형질전환식물.
제9항에 있어서, 선택마커 유전자 DNA와, 상기 선택 마커 유전자가 발현하는 양식으로 상기 선택마커 유전자의 5' 부위에 조립된 제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 기재된 DNA를 포함하는 DNA쇄.
제17항에 기재된 DNA쇄로 숙주를 형질전환처리시키고, 수득한 숙주를 상기 선택마커 유전자가 발현가능하며 또 상기 선택마커 유전자를 발현하는 숙주와 이것을 발현하지 않는 숙주를 식별할 수 있는 조건하에서 배양하는 것을 특징으로 하는 형질전환 숙주를 선택하는 방법.
제18항에 있어서, 숙주가 식물세포인 방법.