MXPA01009810A - Planta transgenica resistente a micotoxinas y metodos para producirla. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a una celula de planta que comprende un polinucleotido heterologo que codifica un producto genetico que se expresa en la celula de planta, en donde el producto genetico comprende actividad de resistencia al tricoteceno.

Description

PLANTA TRA?SGÉ?ICA RESISTENTE A MICOTOXINAS Y MÉTODOS PARA PRODUCIRLA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a hospedadores transgénicos particularmente a plantas, tejidos de planta, semillas y células transgénicas que son de resistencia al tricoteceno y métodos de elaboración y uso de las mismas. La presente invención se refiere adicionalmente a métodos de prevención y/o disminución del crecimiento fungal en una planta, tejido de planta, semillas y células de planta. La presente invención se refiere adicionalmente a la prevención y/o reducción de la contaminación de micotoxina de una planta, tejido o semilla de planta. La presente invención adicionalmente se refiere al uso de tricotecenos como agentes selectivos en protocolos de transformación. Numerosos hongos son serias plagas de cultivos agrícolas económicamente importantes. Además, la contaminación de los cultivos por toxinas fúngales es un problema importante para la agricultura a través de todo el mundo. Las micotoxinas son metabolitos fúngales tóxicos, que se encuentran con frecuencia en los productos agrícolas que se caracterizan por su capacidad para ocasionar problemas de salud para los vertebrados. Los tricotecenos son micotoxinas de epóxido de sesquiterpeno producidas por REF: 132604 las especies de Fusarium, Trichotheclum, y Myrothecl um, que actúan como potentes inhibidores de la síntesis de proteína eucariótica. Las especies de Fusarium que producen estos tricotecenos incluyen F. acumínatum, F. crookwellense, F. culmorum, F. equlseti, F. graminearum ( Gibberella zeae) , F. laterltíum, F. poae, F. sambucinum ( G. pulicaris) , y F. sporotrichioid.es (Marasas, .F.O , Nelson, P.E., y Toussoun, T.A. 1984) . Como se describió previamente (A.E. Des ardins y T.M Hohn, Mycotoxins in plant pathogenesis. Mol. Plant-Microbe Interact. 10 (2):147-152, 1997), las icotoxicosis tanto agudas como crónicas en los anímales de granja y en los seres humanos, se han asociado con el consumo de trigo, centeno, cebada, avena, arroz, y maíz contaminados con especies de Fusari um que producen micotoxinas de tricoteceno. Los experimentos con tricotecenos químicamente puros en bajos niveles de dosificación, han reproducido muchas de las características observadas en las toxicosis de grano mohoso en animales, incluyendo anemia e inmunosupresión, hemorragia, emesis, y negación a alimentarse. Los datos históricos y epidemiológicos de las poblaciones humanas indican una asociación entre ciertas epidemias de enfermedad y el consumo de grano infectado con especies de Fusari um que producen tricotecenos. En particular, los brotes de una enfermedad fatal conocida como aleucia tóxica alimentaria, que se ha presentado en Rusia desde el siglo diecinueve, se han asociado con el consumo de granos sobre-invernados contaminados con especies de Fusarium que producen la toxina de tricoteceno T-2. En Japón, los brotes de una enfermedad similar denominada akakabibyo o enfermedad de moho rojo, se han asociado con grano infectado con especies de Fusari um que producen el tricoteceno, desoxinivalenol (posteriormente en la presente "DON") . Los tricotecepos se detectaron en las muestras de grano tóxico responsables de los brotes de enfermedad humana recientes en la India y en Japón. Por consiguiente, existe una necesidad de métodos agrícolas para prevenir, y de cultivos que tengan niveles reducidos de, contaminación por micotoxina. Además, las especies de Fusari um que producen tricoteceno, son patógenos destructivos, y atacan a un amplio rango de especies de plantas. La fitotoxicidad aguda de los tricotecenos y su presentación en tejidos de planta, también sugieren que estas micotoxinas tienen un papel en la patogénesis de Fusarium, en plantas. Esto implica que las micotoxinas tienen un papel en la enfermedad, y por consiguiente, el reducir su toxicidad para la planta, también puede prevenir o reducir la enfermedad en la planta. Además, la reducción en los niveles de enfermedad, puede tener el beneficio adicional de reducir la contaminación por micotoxina en la planta, y particularmente en el grano, en donde la planta sea una planta de cereal. Se han utilizado diferentes métodos para controlar enfermedades en plantas, tales como putrefacción de mazorca de maíz, putrefacción del suministro, o marchitamiento de la testa del trigo, con diferentes grados de éxito. Un método para controlar la enfermedad de las plantas ha sido aplicar un producto químico antimicrobiano a los cultivos. Este método tiene numerosos problemas reconocidos en la materia. De una manera alternativa, un método más reciente involucra el uso de organismos de control biológico ("biocontrol") , que son competidores naturales o inhibidores del organismo de plaga. Sin embargo, es difícil aplicar biocontrol a áreas grandes, y todavía más difícil hacer que estos organismos vivos permanezcan en el área tratada durante un período de tiempo prolongado. Más recientemente, las materias en ADN recombinante han proporcionado la oportunidad de insertar en las células de plantas genes clonados que expresan los compuestos antimicrobianos. Sin embargo, esta tecnología ha dado lugar a preocupaciones acerca de la resistencia microbiana eventual a los antimicrobianos que se presentan naturalmente bien conocidos. Por consiguiente, existe una necesidad continua de identificar agentes antimicrobianos que se presentan naturalmente, tales como proteínas, que puedan ser formados por las células de las plantas directamente mediante la traducción de un solo gen. Una 3-0-acetiltransferasa de tricoteceno que cataliza la acetilación de un número de diferentes tricotecenos de Fusarium, incluyendo DON en el grupo hidroxilo C-3, se ha identificado en Fusarium sporotrichioides. (S.P. McCormick, N.J. Alexander, S.C.

Trapp, y T.M. Hohn. Disruption of TRI101, the gene encoding trichothecene 3-O-acetyltransferase, from Fusari um sporotrichioides . Applied. Environ . Microbiol . 65 (12): 5252-5226, 1999) . La acetilación de tricotecenos en el C3-OH reduce de una manera significativa su toxicidad en vertebrados y plantas, y da como resultado el producto de reacción 3-acetildesoxivalenol (posteriormente en la presente "3AD0N") . Ver Kimura y colaboradores más adelante. La secuencia de los genes estructurales que codifican las 3-0-acetiltransferasas de tricoteceno a partir de Fusarium graminearum Fusarium sporotrichioides, así como las secuencias de otros ortólogos, ya sean publicados. Ver, por ejemplo, Kimura y colaboradores, Biosci. Biotechnol. Biochem., 62 (5) 1033-1036 (1998), y Kumura y colaboradores, FEBS Letters, 435, 163-168 (1998) . Además, se ha especulado que _el gen a partir de Fusarium sporotrichioides que codifica una 3-0-acetiltransferasa de tricoteceno, puede ser útil en el desarrollo de variedades de plantas con mayor resistencia a Fusarium. Ver, por ejemplo, Hohn, T.M. y colaboradores, Molecular Genetics of Host-Specific Toxins in Plant Disease, 17-24 (1998) , y Kimura y colaboradores, J. Biological Chemistry, 273(3) 1654-1661 (1998). Sin embargo, antes de la presente invención, muchas incertidu bres hacían que fuera menos que obvio si la expresión de 3-0-acetiltransferasas de tricoteceno en una planta conduciría a plantas resistentes al tricoteceno. Por ejemplo, la reacción catalizada por la 3-0-acetiltransferasa de tricoteceno de Fusarium sporotrichioides es reversible, y por consiguiente, podría haber fracasado para proteger a las células de la planta de los tricotecenos tales como DON. También era incierto si podría haber esterasas en células de planta que competirían con las actividades de 3-0-acetiltransferasa para generar el DON tóxico a partir de 3-ADON. También era incierta la manera en que el metabolismo del producto de reacción 3-ADON podría afectar a la planta, por ejemplo, si la introducción de la 3-0-acetiltransferasa de tricoteceno alteraría el crecimiento y desarrollo de la planta de maneras que negarían cualquier contribución positiva de la acetiltransferasa, por ejemplo, interfiriendo con los mecanismos de resistencia a las enfermedades naturales de las plantas. Fue también incierto que 3-ADON pudiera ser etabolizado por la planta para formar un nuevo metabolito secundario con efectos tóxicos. También fue incierto, incluso si el DON producido por un hongo invasivo fuera convertido eficientemente a 3-ADON, si esta conversión pudiera producir una resistencia patógena mejorada en la planta. _ Las anteriores son solamente unas cuantas de las incertidumbres en la materia en el momento de la presente invención. Es un objeto de la invención proporcionar una célula o células de planta que comprendan un polinucleótido heterólogo que codifique un producto genético que se exprese en la célula de planta, en donde el producto genético comprenda actividad de resistencia al tricoteceno. Otro objeto de la invención es proporcionar una planta que comprenda a la célula de planta anteriormente descrita, en donde la planta sea resistente a un tricoteceno. Otro objeto de la invención es proporcionar una planta de la invención que sea resistente a un tricoteceno, en donde el tricoteceno comprenda un grupo hidroxilo C-3. Otro objeto de la invención es proporcionar una planta de la invención que sea resistente a un hongo que produce un tricoteceno, preferiblemente un tricoteceno que comprende un grupo hidroxilo C-3. Otro objeto de la invención es proporcionar una planta de la invención que sea resistente a Fusari um, Trichothecium o Myrothecium.

Otro objeto de la invención es proporcionar una planta de la invención que sea resistente a Fusarium, en particular, pero no limitándose a, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusari um sporotrichioides, Fusari um poae, Fusarium sambucinum, Fusari um equiseti, Fusarium acumina tum, Fusari um lateriti um, y Fusari um pseudograminearum. Otro objeto de la invención es proporcionar una planta de la invención, en donde la planta es resistente a Fusarium graminearum. Otro objeto de la invención es proporcionar una planta de la invención que comprende un polinucleótido heterólogo que codifica un producto genético que es expresado en la célula de planta en donde el producto genético que comprende actividad de resistencia al tricoteceno, en donde el polinucleótido heterólogo es un polinucleótido microbiano, preferiblemente una levadura o polinucleótido fungal. Otro objeto de la invención es proporcionar una planta de la invención, en donde el polinucleótido fungal es un polinucleótido Fusari um, preferiblemente es un polinucleótido Fusari um graminearum o Fusari um sporotri chi oides . Otro objeto de la invención es proporcionar una planta de la invención, en donde el polinucleótido heterólogo comprende una secuencia sustancialmente similar a la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 1, 5 ó 7. Otro objeto de la invención es proporcionar una planta de la invención, en donde el polinucleótido heterólogo comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 1, 5 ó 7 o sus homólogos. Otro objeto de la invención es proporcionar una planta de la invención que comprende un polinucleótido heterólogo, que comprende de cuando menos una porción consecutiva de 80 pares de bases en una secuencia idéntica a una porción consecutiva de 80 pares de bases estipulada en las SEC ID NO: 1, 5 ó 7, preferiblemente de .cuando menos una porción consecutiva de 50 pares de bases en una secuencia idéntica a una porción consecutiva de 50 pares de bases estipulada en la SEC ID NO. 1, 5 ó 7, y más preferiblemente de cuando menos una porción consecutiva de 21 pares de bases en una secuencia idéntica a una porción consecutiva de 21 pares de bases estipulada en la SEC ID NO. 1, 5 ó 7, y más preferiblemente una porción consecutiva de 18 pares de bases en una secuencia idéntica a una porción consecutiva de 18 pares de bases estipulada en la SEC ID NO. 1, 5 ó 7. Otro objeto de la invención es proporcionar una planta de la invención resistente a un tricoteceno seleccionado a partir del grupo que consiste en toxina T-2, toxina HT-2 isotricodermol, DAS, 3-desacetilcalonectrina, 3, 15-didesacetilcalonectrina, escirpentriol, neosolaniol; tipo B: 15-acetildesoxinivalenol, nivalenol, 4-acetilnivalenol (fusarenona-X) , 4, 15-díacetilnivalenol, 4, 7, 15-acetilnivalenol, y DON. Otro objeto de la invención es proporcionar una planta de la invención resistente a DAS o DON. Otro objeto de la invención es proporcionar una planta en donde el producto genético es codificado por un polinucleótido de acuerdo a la invención. Otro objeto de la invención es proporcionar una planta de la invención donde el producto genético es una 3- 0-acetiltransferasa . Otro objeto de la invención es proporcionar una planta de la invención donde el producto genético es un polipéptido que comprende una sustancia sustancialmente similar a la SEC ID NO: 2, 6 u 8'. Otro objeto de la invención es proporcionar una semilla de cualquiera de las plantas de la invención. Otro objeto de la invención es proporcionar cualesquiera de las plantas descritas anteriormente en donde la planta es una planta de trigo, maíz, cebada o arroz. Otro objeto de la invención es proporcionar un método para producir una planta resistente al tricoteceno que comprende los pasos de : a) transformar una célula de planta con un gene heterólogo que codifica un producto genético, en donde el producto genético aumenta la resistencia a un tricoteceno; y b) expresar el producto genético a un nivel biológico significativo c) regenera la célula de planta en una planta; y d) seleccionar una planta con resistencia incrementada a un tricoteceno. Otro objeto de la invención es proporcionar un método, como se describió anteriormente, el cual comprenda además la etapa de seleccionar una planta en la que haya un crecimiento reducido de un hongo, en donde el hongo produzca un tricoteceno. Otro objeto de la invención es proporcionar un método, como se describió anteriormente, en donde el hongo sea del género Fusari um. Otro objeto de la invención es proporcionar una planta resistente al tricoteceno obtenida de acuerdo con los métodos anteriormente descritos. Otro objeto de la invención es proporcionar una semilla producida mediante auto-cruza o cruza externa de una planta de la invención, como se describió anteriormente, en donde una planta que crezca a partir de la semilla tenga una mayor resistencia al tricoteceno.

Otro objeto de la invención es proporcionar un método para prevenir la contaminación de cultivos por icotoxina de una planta, incluyendo las semillas de la planta, comprenda hacer crecer una planta de la invención como se describió anteriormente, preferiblemente en un área con infestación fungal moderara a severa, en donde la planta sea preferiblemente una planta de cultivo. Otro objeto de la invención es proporcionar un método para prevenir el desarrollo de un hongo en una planta, preferiblemente el desarrollo de un hongo del género Fusari um que comprende el desarrollo de una planta de la invención producida mediante un _ tricoteceno, preferiblemente un tricoteceno que comprende un grupo hidroxilo C-3, como se describe anteriormente, preferiblemente en un área con infestación fungal moderada a severa en donde la planta es preferiblemente una planta de cultivo. Otro objeto de la invención es proporcionar un método para producir una planta con resistencia fungal que comprende (a) transformar una célula de planta con un gene heterólogo que codifica un producto genético, en donde el producto genético incrementa la resistencia a un tricoteceno; (b) expresar el producto genético en un nivel biológicamente significativo; (c) regenerar ia célula de planta en la planta; y (d) seleccionar una planta con mayor resistencia a un tricoteceno; y (e) opcionalmente, auto-cruzar o cruzar externamente la planta obtenida en la etapa (d) Otro objeto de la invención es proporcionar el método, donde el hongo es del género Fusari um . Otro objeto de la invención es proporcionar un método para producir semillas en donde la planta que crece de las semillas es resistente a los hongos, que comprende cruzar o auto-cruzar externamente la planta de la invención. Otro objeto de la invención es proporcionar el método anterior, en donde las semillas son resistentes al hongo del género Fusari um . Otro objeto de la invención es proporcionar un método para seleccionar las células hospedera transformadas, el método comprende: transformar una célula hospedera con una construcción de ácido nucleico que codifique una 3-0-acetiltransferasa de tricoteceno, y hacer crecer la célula hospedera transformada en la presencia de un agente selectivo de tricoteceno.

Otro objeto de la invención es proporcionar un método para seleccionar células hospederas transformadas, en donde las células hospederas sean células de plantas, o células microbianas, particularmente en donde las células microbianas sean células fúngales. Otro objeto de la invención es proporcionar un método para seleccionar células hospederas transformadas, como se describieron anteriormente en donde las células hospederas sean además transformadas con un polinucleótido secundario de interés. Otro objeto de la invención es proporcionar un método para seleccionar células hospederas transformadas, en donde el tricoteceno se seleccione a partir del grupo que consiste en toxina T-2, toxina HT-2 isotricodermol, DAS, 3-desacetilcalonectrina, 3, 15-didesacetilcalonectrina, escirpentriol, neosolaniol; tipo B: 15-acetildesoxinivalenol, nivalenol, 4-acetilnivalenol (fusarenona-X) , 4, 15-diacetilnivalenol, 4,7,15-acetilnivalenol, y DON. Otro objeto de la invención es proporcionar una planta resistente al tricoteceno obtenible mediante el método de la invención. Otro objeto de la invención es proporcionar una planta con resistencia fungal obtenible mediante el método de la invención.

Otro objeto de la invención es proporcionar una semilla de planta obtenible mediante el método de la invención . Para claridad, de ciertos términos utilizados en la especificación son definidos y presentados como siguen: "Expresión" se refiere a la transcripción y/o traducción de un gen endógeno o un tránsgeno en plantas. En el caso de los constructores antisentido, por ejemplo, la expresión puede referirse a al transcripción de solo el ADN antisentido. "Operablemente unido/asociado" cuando se refiere a una secuencia de ADN reguladora es "operablemente enlazado" o "asociado con" una secuencia de ADN que codifica para un ANR o una proteína se refiere a la segunda secuencia que está situada tal que la secuencia de ADN reguladora afecta la expresión de la secuencia de ADN codificadora. El término "polinucleótido heterólogo" o "ADN heterólogo" como se utiliza en la presente, se refiere cada una se refiere a una molécula de ácido nucleico no naturalmente asociada con una célula hospedera en la que se introduce, incluyendo construcciones genéticas, múltiples copias que no se presenten naturalmente de una molécula de ácido nucleico que se presente naturalmente; y una molécula de ácido nucleico de otra manera homologa operativamente enlazada con una molécula de ácido nucleico no nativa. Así, un gen heterólogo en una célula hospedera incluye un gen que es endógeno a la célula hospedera particular pero pudiéndose modificar a través de, por ejemplo el uso de ADN lento. Así, los términos comprenden un segmento de ADN que es extraño o heterólogo a la célula, o heterólogo a la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula hospedera en donde el elemento no es encontrado ordinario. El término "ácido nucleico" o "polinucleótido" se refiere a desoxiribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en su forma sencilla- o doble-ramificada. A menos que sea específicamente limitado, el término que comprende los ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de los nucleótidos naturales que tienen propiedades de enlace similares como el referido ácido nucleico y siendo metabolizado de una manera similar a los nucleótidos que ocurren naturalmente. A menos que por otra parte se indique, una secuencia de ácido nucleico particular también implícitamente abarca las variantes conservadoramente modificadas de la misma (por ej empl o la sustitución del codon degenerado) y las secuencias complementarias y así como la secuencia explícita indicada. Específicamente, las sustituciones del codon degenerado pueden llevarse a cabo mediante la generación de las secuencias en donde la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) es sustituida con residuos de desoxiinosina (Batzer y ^colaboradores, Nucl eic Acid Res . 19:5081 (1991); Ohtsuka y col aboradores, J. Bi ol . Chem . 260: 2605-2608 (1985); Rossolini y colaboradores Mol . Cell . Probes 8:91-98 (1994)). Los términos "ácido nucleico" o secuencia de ácido nucleico" o "polinucleótido" también pueden utilizarse intercambiablemente con gen, ADNc, y ARNm codificados por un gen. En su sentido más amplio, el término "sustancialmente similar", cuando se utiliza en la presente con respecto a una molécula de ácido nucleico, significa una molécula de ácido nucleico correspondiente a una secuencia de nucleótidos de referencia, en donde la molécula de ácido nucleico correspondiente codifica un polipéptido que tiene sustancialmente la misma estructura y función que el polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de referencia, por ejemplo, en donde solamente se presentan cambios en los aminoácidos que no afecten a la función del polipéptido. Deseablemente, la molécula de ácido nucleico sustancialmente similar codifica el polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de referencia. El término "sustancialmente similar" pretende incluir específicamente moléculas de ácido nucleico en donde la secuencia se ha modificado para optimizar la expresión en células particulares por ejemplo en células de plantas. En porcentaje de identidad entre la molécula de ácido nucleico sustancialmente similar y la secuencia de nucleótidos de referencia deseablemente es cuando menos el 45 por ciento, más deseablemente cuando menos el 65 por ciento, más deseablemente cuando menos el 75 por ciento, de preferencia cuando menos el 85 por ciento, más preferiblemente cuando menos el 90 por ciento, todavía más preferiblemente cuando menos el 95 por ciento, y todavía más preferiblemente cuando menos el 99 por ciento. Preferiblemente, el porcentaje de identidad existe sobre una región de las secuencias que son de cuando menos 50 residuos de longitud, más preferiblemente sobre una región de cuando menos 100 residuos, y más preferiblemente las secuencias son sustancialmente similares de cuando menos 150 residuos. En una modalidad más preferida, las secuencias son sustancialmente similares sobre la longitud total de la regiones codificadas. Se realizan comparaciones de secuencias utilizando un algoritmo de alineamiento de secuencias de Smith Waterman (ver, por ejemplo Waterman, M.S. Introduction to Computational Biology: Maps, sequences and genomes. Chapman & Hall. Londres: 1995. ISBN 0-412-99391-0, o en http: //www. to.use.edu/sofware/seqaln/index. html) . El programa local S, versión 1.16, se utiliza con los siguientes parámetros: acoplamiento: 1, multa por mal acoplamiento: 0.33, multa por hueco abierto: 2, multa por hueco extendido : 2. Otra indicación que es una de las secuencias de ácido nucleico es un ácido nucleico sustancialmente similar de la invención que hibridiza a una molécula de ácido nucleico de la invención bajo condiciones rigurosas. La frase "hibridizando específicamente a" se refiere a la unión, reproducción, o hibridación de una sola molécula a una secuencia de nucleótido particular bajo condiciones rigurosas cuando la secuencia está presente en una mezcla compleja de ADN o ARN (por ejemplo, total celular) . La "unión (es) sustancialmente" se refiere al hibridizado complementario entre un ácido nucleico de prueba y un ácido nucleico blanco y abarca las uniones mal hechas de menor importancia que pueden ser acomodadas reduciendo la severidad del medio de hibridizado para alcanzar la detección deseada de la secuencia de ácido nucleico blanco. Las "condiciones de hibridizado rigurosas" y "condiciones de lavado hibridizado astringentes" en el contexto de los experimentos de hibridizado del ácido nucleico tales como hibridaciones Southern y Northern son dependiente de la secuencia, y son diferentes bajo diversos parámetros ambientales. Las secuencias más largas se hibridizan específicamente a temperaturas más altas. Una guía extensa de hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry y Moecular Biol ogy- Hybridization con Nucleic acid Probes parte I capitulo 2 "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probé assays" Elsevier, New York. Generalmente, las condiciones de hibridizado y lavado altamente rigurosas son seleccionadas para estar aproximadamente a 5°C menos que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica en una fuerza iónica y un pH definidos. Normalmente, bajo "condiciones rigurosas" una prueba hibridizará a su subsequencia blanco, pero a ninguna otra secuencia. El Tm es la temperatura (fuerza iónica y pH definidos más adelante) en la cual el 50° de la secuencia blanco hibridiza a una prueba perfectamente igualada. Las condiciones altamente rigurosas se seleccionan para igualar el Tm para una prueba particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosa para el hibridizado de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 residuos complementarios en un filtro en una mancha Southern o Northern es de formamida al 50% con 1 miligramo de heparina a 42°C, con hibridación realizada durante la noche. Un ejemplo de las condiciones de lavado altamente rigurosas es 0.1 5M de NaCl a 72 °C durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de las condiciones de lavado rigurosas es un lavado de 0.2x SSC a 65°C durante 15 minutos ( ver, Sambrook, infra, para una descripción del amortiguador de SSC) . Frecuentemente, un lavado rigurosamente alto es precedido por un lavado rigurosamente bajo para eliminar la señal de prueba de fondo. Un ejemplo de lavado medio riguroso para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es Ix SSC a 45°C durante 15 minutos. Un ejemplo de lavado riguroso bajo para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 4-6x SSC a 40°C durante 15 minutos. Para pruebas cortas (por ejemplo, aproximadamente 10 a 50 nucleótidos) , las condiciones rigurosas normalmente involucran concentraciones de sal de menos de aproximadamente 1.0 M de Na ion, normalmente de alrededor Na 0.01 a 1.0 M de concentración ion (u otras sales) a pH de 7.0 a 8.3, y la temperatura es normalmente por lo menos aproximadamente 30°C. Las condiciones rigurosas pueden también alcanzarse con la adición de agentes de desestabilización tales como formamida. En -general, una señal para sonido de radio de 2x (o más alta) tanto que se observada para una prueba sin relación en el análisis particular de . hibridación indica la detección de una hibridación específica. Los ácidos nucleicos que no se hibridizan entre sí bajo condiciones rigurosas siguen siendo sustancialmente similares si las proteínas que codifican son sustancialmente similares. Esto ocurre, por ejemplo, cuando una copia de un ácido nucleico se crea utilizando la degeneración máxima del codon permitida por el código genético. Los siguientes son ejemplos de grupos de las condiciones de hibridizado/lavado que se pueden utilizar para identificar las secuencias homologas de nucleótido que son sustancialmente similares con referencia a las secuencias de nucleótido de la presente invención: una secuencia de prueba que hibrida a la secuencia de nucleótido de referencia en dodeciisulfato de sodio al 7 por ciento (SDS), NaP04 0.5 M, EDTA 1 mM a 50°C, con lavado en 2 X SSC, SDS al 0.1 por ciento a 50 °C, más deseablemente en dodeciisulfato de sodio al 7 por _ciento (SDS), NaPOj 0.5 M, EDTA 1 mM al 50 °C, con lavado en 1 X SSC, SDS al 0.1 por ciento _a 50°C, más deseablemente en dodeciisulfato de sodio al 7 por ciento (SDS), NaP04 0.5 M, EDTA 1 mM a 50°C, con lavado en 0.5 X SSC, SDS al 0.1 por ciento a 50 °C, de preferencia en dodeciisulfato de sodio al 7 por ciento (SDS), NaP04 0.5 M, EDTA 1 mM a 50°C, con lavado en 0.1 X SSC, SDS al 0.1 por ciento a 50°C, más preferiblemente en dodeciisulfato de sodio al 7 por ciento (SDS), NaP04 0.5 M, EDTA 1 mM a 50°C, con lavado en 0.1 X SSC, SDS al 0.1 por ciento a 65°C. El polinucleótido de la invención que se hibrida bajo las condiciones anteriores, de preferencia comprende cuando menos 80 pares de bases, más preferiblemente cuando menos 50 pares de bases, y de una manera particular cuando menos 21, y más particularmente 18 pares de bases. Los homólogos de uso en la invención incluyen moléculas de ácido nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 45 por ciento idéntica a la SEC ID NO. 2, 6 u 8 medida utilizando los parámetros descritos más adelante, en donde la secuencia de aminoácidos codificada por el homólogo tiene actividad de resistencia al tricoteceno, por ejemplo actividad de 3-0-acetiltransferasa . El término "sustancialmente similar", cuando se utiliza en la presente con respecto a una proteína, significa una proteína correspondiente a una proteína de referencia, en donde la proteína tiene sustancialmente la misma estructura y función que la proteína de referencia, por ejemplo, en donde solamente se presentan cambios en la secuencia de aminoácidos que no afecten a la función del polipéptido. Cuando se utiliza para una proteína o una secuencia de aminoácidos, el porcentaje de identidad entre la proteina o secuencia de aminoácidos sustancialmente similar y de referencia, deseablemente es una identidad de cuando menos el 45 por ciento, más deseablemente de cuando menos el 65 por ciento, más deseablemente de cuando menos el 75 por ciento, de preferencia de cuando menos el 85 por ciento, más preferiblemente de cuando menos el 90 por ciento, todavía más preferiblemente de cuando menos el 95 por ciento, todavía más preferiblemente de cuando menos el 99 por ciento, utilizando los parámetros de análisis BLAST por omisión y como se describe con más detalle más adelante. Los homólogos preferidos del polipéptido de uso en la invención son aquellos que tienen secuencias de aminoácidos que son cuando menos 45 por ciento idénticas a la SEC ID NO: 2, 6 u 8, en donde la secuencia de aminoácidos codificada por el homologo tiene actividad de resistencia al tricoteceno, por ejemplo actividad de 3-O-acetiltransferasa. La alineación óptima de las secuencias del ácido nucleico o la proteína para comparación se puede conducir según lo descrito anteriormente y, por ejemplo, por el algoritmo local de la homología de Smith & Waterman, Adv. Appl . Math . 2: 482 (1981), por el algoritmo de alineación de la homología de Needleman & Wunsch, J. Mol . Biol . 48: 443 (1970) , mediante la búsqueda para el método similar al de Pearson & Lipman, Proc. Nat 'l . Acad. Sci . USA 85: 2444 (1988) , por aplicaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), o por la inspección visual ( ver generalmente, Ausubel y colaboradores, infra) . Un ejemplo de un algoritmo que es apropiado para determinar la identidad de por ciento de la secuencia y la semejanza de la secuencia es el algoritmo de BLAST, que se describe en Altschul y colaboradores, J. Mol . Bi ol . 215: 403-410 (1990). El conjunto de programas (software) para realizar el análisis de BLAST está públicamente disponible a través del Centro Nacional para la Información de la Biotecnología (http : //ww .nc i.nlm.nih.gov/) . Este algoritmo involucra primero identificar los pares de secuencia de alto registro (HSPs) identificando los términos cortos de longitud W en la secuencia en cuestión, que iguala o satisface algún umbral de valor positivo contando las T cuando está alineado con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. La T se refiere como al umbral de registro de la palabra del vecindario (Altschul y col aboradores , 1990) . Estos aciertos de palabra del vecindario iniciales actúan como semillas para iniciar la búsqueda y encontrar las HSPs mayores que los contienen. Los aciertos de palabra entonces se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde el registro de alineación cumulativo pueda incrementarse. ~ Se calculan los registros cumulativos utilizando, para las secuencias de nucleótido, los parámetros M (registro de retribución para un par de residuos de igualación; siempre > 0) y N (multa de registro para residuos mal igualados; siempre < 0) . Para las secuencias de aminoácidos, una matriz de registro se utiliza para calcular el registro cumulativo. La extensión de aciertos de palabra en cada dirección, se interrumpe cuando el registro cumulativo de alineación cae por la cantidad X de su valor alcanzado máximo, el registro acumulativo va de cero o abajo debido a la acumulación de unas o más alienaciones de residuo de registro negativo, o se alcanza al final de cualquier secuencia. Los parámetros de algoritmo de BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa de BLASTN (para las secuencias de nucleótido) utiliza como faltas una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, un corte de 100, M=5, N=-4, y una comparación de ambas hebras. Para las secuencias de aminoácido, el programa de BLASTP utiliza como fallas una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de registro BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 89: 10915 (1989)). Además para calcular la identidad de secuencia en por ciento, el algoritmo de BLAST también _ realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias ( ver, por ejemplo, Karlin & Altschul, Proc. Na t 'l . Acad.

Sci. USA 90: 5873-57 7 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo de BLAST es la probabilidad sumada más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por lo cual una igualación entre dos nucleótido o secuencias de aminoácido ocurrirá por casualidad. Por ejemplo, se considera una secuencia de ácido nucleico de prueba similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en comparación de la secuencia de ácido nucleico de prueba con la secuencia de ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0.1, preferiblemente menor de aproximadamente 0.01, y más preferiblemente menor de aproximadamente 0.001. Otra indicación adicional de que dos secuencias de ácido nucleico o proteínas son sustancialmente similares es que la proteína codificada por el primer ácido nucleico es reactiva cruzada inmunológicamepte con, " o unida específicamente a, la proteína codificada por el segundo ácido nucleico. Así, una proteína es normalmente de manera sustancial similar a una segunda proteína, por ejemplo, donde las dos proteínas se diferencian solamente por las sustituciones conservadoras. La frase "específicamente (o selectivamente) unido a un anticuerpo" o "específicamente (o selectivamente) immunoreactivo con", cuando se refiere a una proteína o péptido, se refiere a una reacción de enlace que es determinativa de la presencia de la proteína en presencia de - una población heterogénea de proteínas y del otras sustancias biológicas. Así, bajo condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos específicos unidos a una proteína particular y no unidos en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica a un anticuerpo bajo tales condiciones puede requerir un anticuerpo que es seleccionado por su especificidad para una proteína particular. Por ejemplo, los anticuerpos promueven a la proteína con la secuencia del aminoácido codificada por cualesquiera de las secuencias de ácido nucleico de la invención, pudiéndose seleccionar para obtener los anticuerpos específicamente inmunoreactivos con la proteína y no con otras proteínas excepto para las variantes polimórficas. Se puede utilizar una variedad de formatos de inmunoensayo para seleccionar los anticuerpos específicamente immunoreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, se utilizan rutinariamente inmunoensayos de ELISA de fase sólida, transferencia Western o immunohistoquímica para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente immunoreactivos con una proteína. Ver Harlow y Lañe (1988) Antibodies, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Publications, New York "Harlow y Lañe") , para una descripción de formatos y condiciones de inmunoensayo que se pueden utilizar para determinar la immunoreactividad específica. Normalmente una reacción específica o selectiva será de cuando menos dos veces el ruido o signo de fondo y normalmente de más de 10 a 100 veces de fondo. Las "variaciones conservativamente modificadas" de una secuencia particular de ácido nucleico se refieren a las secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias de aminoácido idénticas o esencialmente idénticas, o donde la secuencia de ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácido, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier polipéptido dado. Por ejemplo los codones CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, y AGG todo codifican la arginina de aminoácido. Así, en cada posición donde una arginina es especificada por un codon, el codon se puede alterar a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar la proteína codificada. Las variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas" que son unas especies de "variaciones conservativamente modificadas". Cada secuencia de ácido nucleico descrita en la presente que codifica una proteina también describe cada variación silenciosa posible, a menos que se observé de otra manera.

Un experto reconocerá que cada codon -en un ácido nucleico (excepto ATG, que es ordinariamente el único codon para la metionina) se puede modificar para producir una molécula funcionalmente idéntica por técnicas estándares. Por consiguiente, cada "variación silenciosa" de un ácido nucleico que codifica una proteína está implícita en cada secuencia descrita. Además, un experto reconocerá que las supresiones o adiciones individuales de las sustituciones que alteran, agregan ~o suprimen un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos (normalmente menos de 5 por ciento, más normalmente menos de 1 por ciento) en una secuencia codificada son "variaciones conservativamente modificadas", donde las alteraciones dan lugar a la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservativa que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la materia. Cada uno de los cinco grupos siguientes contiene aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: Alifático: Glicina (G) , Alanina (A), Valina (V), Leucina (L) , Isoleucina (I); Aromático: Fenilalanina (F) , Tirosina (Y), Triptofan (W) ; Con sulfuro: Metionina (M) , Cisteína (C) ; Básico: Arginina (R) , Lisina (K) , Histidina (H) ; Ácido: Ácido aspártico (D) , Ácido glutámico (E) , Asparagina (N) , Glutamina (Q) . Ver también, Creighton (1984) Proteins, W. H. Freeman y Company. Además, las sustituciones, supresiones o adiciones individuales que alteran, agregan o suprimen un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en una secuencia codificada son también "variaciones conservativamente modificadas". Una "subsecuencia" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos que comprenden una parte de una secuencia mayor de ácidos nucleicos o aminoácidos (por ejemplo, proteína) respectivamente. Los ácidos nucleicos son "alargados" cuando los nucleótidos adicionales (u otras moléculas análogas) se incorporan en el ácido nucleico. Más comúnmente posible, esto se realiza con una polimerasa , (por ejemplo, una polimerasa de ADN) , por ejemplo, una polimerasa que agrega secuencias en el términos 3' del ácido nucleico. Se "recombinan" dos ácidos nucleicos cuando las secuencias de cada uno de los dos ácidos nucleicos se combinan con un ácido nucleico de progenie. Se recombinan "directamente" dos secuencias cuando ambos ácidos nucleicos son sustratos para la recombinación. Dos secuencias se "recombinan indirectamente" cuando se recombinan las secuencias utilizando un intermediario tal como un oligonucleótido sobre cruzado. Para la recombinación indirecta, no más de una de las secuencias es un sustrato actual para la recombinación, y en algunos casos, ninguna de las dos secuencias es un sustrato para la recombinación. Una "afinidad de unión específica" entre dos moléculas, por ejemplo, un ligando y un receptor, significa una unión preferencial de una molécula para otra en una mezcla de moléculas. La unión de las moléculas puede considerarse específica si la afinidad de unión es de aproximadamente 1 x 104 M"1 a aproximadamente 1 x 10° M~l o mayor. Sustrato: un sustrato es la molécula que una enzima naturalmente reconoce y convierte a un producto en la trayectoria bioquímica en donde la enzima naturalmente realiza su función, o es una versión modificada de la molécula, que también es reconocida por la enzima y es convertida por la enzima a un producto en una reacción enzimática similar a la reacción que ocurre naturalmente. Transformación: un proceso para introducir el ADN heterólogo en una célula, tejido fino, o insecto. Las células, tejidos finos, o insectos transformados se entenderán que abarcan no únicamente el producto final de un proceso de transformación, sino también la progenie transgénica del mismo. "Transformado", "transgénico", y "recombinante" se refiera a un organismo hospedero tal como una bacteria o una planta en donde se ha introducido una molécula heteróloga de ácido nucleico. La molécula de ácido nucleico se puede integrar estable en el genoma hospedero o la molécula de ácido nucleico puede también presentarse como una molécula extracro osomal. Tal como una molécula extracro osomal que puede auto-replicarse. Las células, tejidos finos, o plantas transformadas se entenderá que abarcan no solamente el producto final de un proceso de transformación, sino también la progenie transgéníca del mismo. Un organismo hospedero "no transformado", "no transgénico", o "no recombinante" se refiere a un organismo del tipo silvestre, por ejemplo, una bacteria o planta, que no contienen la molécula heteróloga de ácido nucleico. La presente invención se relaciona a hospederos transgénicos particularmente, plantas, tejidos finos de planta, semillas de planta, y células transgénicas de planta que comprenden un polinucleótido heterólogo que codifica un producto genético donde el producto genético comprende actividad de resistencia al tricoteceno y métodos de elaborar y utilizar el mismo. La actividad de resistencia al tricoteceno como se utiliza en la presente se refiere a una actividad que reduce o inhibe la fitotoxicidad de un tricoteceno, particularmente a un hongo y/o planta, en una modalidad particular la actividad de resistencia al tricoteceno de la invención se refiere a una actividad que transfiere un acetato a la posición C-3 de un tricoteceno. La presente invención además se relaciona a los hospederos transgénicos, particularmente, plantas, tejidos finos de planta, semillas de planta, y células de planta transgénicos que expresan un polinucleótido heterólogo que codifica un producto genético, el producto genético que tiene actividad de resistencia al tricoteceno, particularmente un producto genético de acetiltransferasa, más particularmente un producto genético de 3-0-acetiltransferasa, más particularmente un producto genético de 3-0-acetiltransferasa y métodos de elaboración y uso del mismo. La expresión del polinucleótido heterólogo de la invención comprende la síntesis del ANR y se puede detectar por análisis de transferencia en mancha. Particularmente, la expresión del polinucleótido heterólogo de la invención puede detectarse donde una prueba de marcado derivada de un nucleótido heterólogo de la invención, en modalidades particulares, de la SEC ID NOS. 1, 5 ó 7, que se hibrida con el ANR aislado de una planta transgénica de la invención en dodeciisulfato de sodio (SDS) al 7 por ciento, fosfato de sodio 0.5 M, pH de 7.0, EDTA 1 mM, 10 miligramos/mililitro de BSA (albúmina de suero bovino) a 65°C con lavado en BSA al 0.5 por ciento (fracción V), SDS al 5 por ciento, fosfato de sodio 40 mM, pH de 7.0, EDTA 1 mM, cloruro de sodio 0.25 M a 65°C, de preferencia en SDS al 1 por ciento, fosfato de sodio 40 mM, pH de 7.0, EDTA 1 M, cloruro de sodio 125 M a 65°C, y de preferencia en SDS al 1 por ciento, fosfato de sodio 40 M, pH de 7.0, EDTA 1 mM a 65°C. La presente invención además se refiere a plantas, tejidos de planta, semillas de planta, y células de planta transgénicas, que expresan un polinucleótido heterólogo de la invención donde la planta, célula de planta, tejido de planta o semilla de planta es resistente al tricoteceno. Las plantas, células de planta, tejidos de planta y semillas de planta resistentes al tricoteceno como se utiliza en la presente son las capaces del metabolismo en presencia de un tricoteceno que puede determinarse según lo descrito en el ejemplo 7 más adelante. En una modalidad particular, las plantas, células de planta, tejidos de planta y semillas de planta resistentes al tricoteceno que tienen una actividad enzimática específica de cuando menos de triacetoxiescirpenol 10 nmol (más adelante "TAS") /microgramo de proteína/incubación 15 minutos a niveles de saturación del sustrato, más particularmente de cuando menos 5 nmol TAS/ icrogramo de proteína/15 minutos, más particularmente de cuando menos 1 nmol TAS/microgramo de proteína/15 minutos, más particularmente de cuando menos 0.8 nmol TAS/microgramo de proteina/15 minuto, más particularmente de cuando menos 0.5 nmol TAS/microgramo de proteína/15 minutos, más particularmente una actividad específica de 0.25 nmol TAS/microgramo de proteína/15 minutos, más particularmente una actividad específica de 0.1 nmol TAS/microgramo de proteína/15 minutos, más particularmente una actividad específica de 0.05 nmol TAS/microgramo de proteína/15 minutos y aun más particularmente una actividad específica de 0.01 nmol TAS/microgramo de proteína/15 minutos sobre los niveles de fondo de la actividad que ocurren naturalmente en un control del tipo silvestre, particularmente como se determinó en un ensayo como se determinó en el Ejemplo 6 más adelante. Las plantas resistentes al tricoteceno de la invención comprenden aquellas de las cuales un mayor porcentaje de la semilla germinan y forman raíces en la presencia de un tricoteceno que la semilla de un control del tipo silvestre donde está presente el tricoteceno en una concentración de cuando menos 5 microgramos/ml, preferiblemente de cuando menos 10 microgramos/ml, preferiblemente de cuando menos 15 microgramos/ml, preferiblemente de cuando menos 20 microgramos/ml y más preferiblemente de cuando menos 25 microgramos/ml. En una modalidad particularmente preferida, las plantas resistentes al tricoteceno de la invención comprenden aquellas de las cuales de cuando menos 10 por ciento más semillas, más preferiblemente de cuando menos 20 por ciento más semillas, más preferiblemente de cuando menos 30 por ciento más aemillas, más preferiblemente de cuando menos 40 por ciento más semillas, más preferiblemente de cuando menos 50 por ciento más semillas, más preferiblemente de cuando menos 60 por ciento más semillas, más preferiblemente de cuando menos 70 por ciento más semillas, más preferiblemente de cuando menos 80 por ciento más semilla y más preferiblemente de cuando menos 90 por ciento más semillas germinen y formen raíces en la presencia de un tricoteceno que la semilla de un control del tipo silvestre. Los tricotecenos se divide con frecuencia en varios grupos estructurales diferentes. Una modalidad particular de la presente invención es describir la resistencia al grupo A y B de tricotecenos. Los grupos A y B comprenden los tricotecenos de Fusari um y son diferenciados principalmente por la ausencia (grupo A) o presencia (grupo B) de un grupo funcional carbonil en la posición C-8. El grupo B de tricoteceno DON, comprende por consiguiente un grupo carbonil en la posición C-8. La presente invención es más particularmente descrita para la resistencia a los tricotecenos, que contienen un hidroxilo de C-3. Los tricotecenos incluyen la toxina T-2, toxina HT-2 isotricodermol, DAS, 3-desacetilcalonectrina, 3, 15-didesacetilcalonectrina, escírpentriol, neosolaniol, 15-acetildesoxinivalenol, nivalenol, 4-acetilnivalenol (fusarenona-X) , 4,15-diacetilnivalenol, 4, 7, 15-acetilnivalenol, y DON y sus varios derivados acetilados. En una modalidad particular, la planta, célula, tejido o semilla resistente al tricoteceno de la misma es resistentes a un tricoteceno que produce el hongo, particularmente un hongo del género Fusari um. La resistencia del hongo como se utiliza en la presente se refiere a ninguna iniciación de infección después de la inoculación fungal o propagación reducida de la infección después de la inoculación fungal comparada a un control del tipo silvestre. En una modalidad preferida, una planta transgénica con resistencia fungal de la presente invención es una planta de cereal y bajo cambios fúngales comprende menos núcleos o semillas infectados comparados a un control del tipo silvestre, preferiblemente de cuando menos a una disminución del 10 por ciento de núcleos o semillas infectadas comparadas al mismo número de núcleos o semillas evaluadas en un control. del tipo silvestre, preferiblemente de cuando menos una disminución del 20 por ciento, preferiblemente de cuando menos una disminución del 40 por ciento y más preferiblemente de cuando menos una disminución del 50 por ciento de los núcleos infectados comparados al mismo número de núcleos o semillas de un control del tipo silvestre. Las plantas de cereal transgénicas con resistencia fungal de la invención comprenden pero no se limitan a maíz, trigo, cebada, arroz, y avena. En trigo, la extensión fungal en la testa se puede evaluar como se describe en el Ejemplo 9 más adelante, contando el número de espiguillas sintomáticas y asintomáticas en cada testa inoculada y calculando el porcentaje de espiguillas en cada testa que son sintomáticas. En una modalidad preferida, el trigo con resistencia fungal de la presente invención comprende, bajo cambios fúngales, menos espiguillas infectadas que el control del tipo silvestre, preferiblemente de cuando menos una disminución del 10 por ciento de las espiguillas infectadas comparadas con el mismo número de espiguillas evaluadas de un control del tipo silvestre, más preferiblemente de cuando menos una disminución del 20 por ciento, de manera más preferiblemente de cuando menos una disminución del 40 por ciento y más preferiblemente de cuando menos una disminución del 50 por ciento de las espiguillas infectadas comparadas con el mismo número de espiguillas de un control del tipo silvestre. En maíz, la extensión fungal en la mazorca se puede evaluar por la estimación visual del porcentaje de núcleos infectados como se describe además en el Ejemplo 9 más adelante. En una modalidad preferida, el maíz con resistencia fungal de la invención, bajo cambios fúngales, comprende menos núcleos infectados que el control del tipo silvestre, preferiblemente de cuando menos una disminución del 10 por ciento de los núcleos infectados comparados al número de núcleos infectados en el mismo número de mazorcas estimadas visiblemente en un control del tipo silvestre, preferiblemente de cuando menos una disminución del 20 por ciento, más preferiblemente de cuando menos una disminución del 30 por ciento, de manera más preferiblemente de cuando menos una disminución del 40 por ciento y más preferiblemente de cuando menos una disminución del 50 por ciento de los núcleos infectados comparados con el mismo número de mazorcas estimadas visiblemente de un control del tipo silvestre. En maíz, la extensión fungal interna en el tallo se puede evaluar visualmente partiendo el tallo y valorando la cantidad de decoloración. En una modalidad preferida de la invención, el maíz transgénico de la invención comprende menos decoloración interna y/o externa del tallo comparado con un control del tipo silvestre. En otra modalidad preferida, las plantas con resistencia fungal de la invención comprenden aquellas de las cuales un mayor porcentaje de la semillas germinan en presencia del cambio fungal que germinan en el control del tipo silvestre. En una modalidad particularmente preferida, las plantas con resistencia fungal de la invención comprenden aquellas de las cuales de cuando menos 10 por ciento más semilla, de manera más preferiblemente de cuando menos el 20 por ciento más semilla, muy preferiblemente de cuando menos el 30 por ciento más semilla, preferiblemente de cuando menos el 40 por ciento más semilla, más preferiblemente de cuando menos el 50 por ciento más semilla, más preferiblemente de cuando menos el 60 por ciento más semilla, más preferiblemente de cuando menos el 70 por ciento más semilla, más preferiblemente de cuando menos el 80 por ciento más semilla y preferiblemente de cuando menos el 90 por ciento más semilla, más preferiblemente de cuando menos el 100 por ciento más semilla, más preferiblemente de cuando menos el 150 por ciento más semilla germinadas en la presencia de Fusari um que la siembra del control del tipo silvestre. En otra modalidad preferida, se proporcionan plantas transgénicas con resistencia fungal que producen la semilla o núcleos que tienen menos micotoxina, por ejemplo contaminación de tricoteceno, que la semilla de un control del tipo silvestre. En una modalidad particularmente preferida las plantas de maíz y más particularmente plantas del cereal que producen la semilla tienen de cuando menos el 10 por ciento menos tricoteceno, más preferiblemente de cuando menos el 20 por ciento menos tricoteceno, de manera más preferiblemente de cuando menos el 30 por ciento menos tricoteceno, muy preferiblemente de cuando menos el 40 por ciento menos tricoteceno, más preferiblemente de cuando menos el 50 por ciento menos tricoteceno, más preferiblemente de cuando menos el 60 por ciento menos tricoteceno, más preferiblemente de cuando menos el 70 por ciento menos tricoteceno y más preferiblemente de cuando menos el 80 por ciento menos contaminación de tricoteceno que un control del tipo silvestre. La contaminación de tricoteceno se puede determinar según lo descrito en el ejemplo 10 más adelante. Los polinucleótidos de uso en la invención incluyen polinucleótidos heterólogos que codifican las acetiltransferasas, particularmente aquellas acetiltransferasas que codifican capaces de conferir la resistencia al tricoteceno, más particularmente aquellas que codifican el 3-O-acetiltransferasas de tricoteceno. En una modalidad particular, el polinucleótido heterólogo de la invención puede derivarse de pero no se limita al origen fungal, más particularmente de origen Fusari um, Trichothecium, y Myrothecium, más particularmente de una especie Fusarium tal como F. acuminatum, F. crookwellense, F. Culmorum, F. equiseti , F. Graminearum, (Gibberella zeae) , F. lateritium, F. poae, F. sa bucinum ( G. pulicaris) , y F. sporotrichioides. Los polinucleótidos heterólogos de uso en la invención incluyen la SEC ID NO. 1, 5 y/o 7 y secuencias sustancialmente similares a la SEC ID NO. 1, 5 y/o 7. Se puede incorporar un polinucleótido de uso en la invención en células hospederas, tales como células de planta, fúngales, o bacterianas, utilizando tecnología de ADN recombinante convencional. En general, esto implica insertar el polinucleótido en un sistema de expresión para el polinucleótido sea heterólogo, utilizando procedimientos de clonación convencionales conocidos en este campo. El vector contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción del polinucleótido de uso en la invención en una célula hospedara que contenga el vector. Se pueden utilizar un gran número de sistemas de vector conocidos en la materia, tales como plásmidos, virus de bacteriófagos, y otros virus modificados. Los componentes del sistema de expresión también se pueden modificar para incrementar la expresión. Por ejemplo, se pueden emplear secuencias truncadas, sustituciones de nucleótidos, optimización de nucleótidos, u otras modificaciones. Se pueden utilizar los sistemas de expresión conocidos en la materia para transformar virtualmente cualquier célula de planta de cultivo bajo condiciones adecuadas. Un polinucleótido heterólogo de la invención de preferencia se transforma establemente, y se integra en el genoma de las células hospederas. En otra modalidad preferida, el polinucleótido heterólogo de la invención se localiza en un vector de auto-replica. Los ejemplos de los vectores de auto-replica son virus, en particular virus Gemini. Las células transformadas se pueden regenerar en plantas enteras, de tal manera que la forma seleccionada del polinucleótido de la invención confiera resistencia al tricoteceno en las plantas transgénicas.

Primero se ensambla un polinucleótido de la invención pretendido para expresarse en plantas transgénicas, en un cásete de expresión detrás de un promotor adecuado que se pueda expresar en plantas. Los casetes de expresión también pueden comprender ~cualesquiera secuencias adicionales requeridas o seleccionadas para la expresión del polinucleótido heterólogo de la invención. Estas secuencias incluyen, pero no están restringidas a, terminadores de transcripción, secuencias extrañas para mejorar la expresión, tales como intrones," secuencias vitales, y secuencias pretendidas para la dirección del producto genético hacia organelos específicos y compartimientos celulares. Entonces estos casetes de expresión se pueden transferir fácilmente a los vectores de transformación en plantas descritos más adelante. La siguiente es una descripción de los diferentes componentes de los casetes de expresión típicos. La selección del promotor utilizado en los casetes de expresión determinara el patrón de expresión espacial y temporal del polinucleótido heterólogo de la invención en la planta transformada. Los promotores seleccionados expresaran polinucleótidos heterólogos de la invención en tipos de células específicos (tales como células epidérmicas de hoja, células de mesofilo, células de corteza de raíz), o en tejidos u órganos específicos (raíces, hojas, o flores, por ejemplo), y la selección reflejará la localización deseada de acumulación del producto genético. De una manera alternativa, el promotor seleccionado puede impulsar la expresión del gen bajo diferentes condiciones de inducción. Los promotores varían en su fuerza, es decir, su capacidad para promover la transcripción. Dependiendo del sistema de célula hospedera utilizado, se puede utilizar cualquiera de un número de promotores adecuados conocidos en este campo. Por ejemplo, para la expresión constitutiva, se puede utilizar el promotor 35S de CaMV, el promotor de actina de arroz, o el promotor de ubiquitina. Para una expresión regulable, se puede utilizar el promotor PR-1 químicamente inducible de tabaco o Arabidopsis (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5, 689,044) . Hay una variedad de terminadores de transcripción disponibles para utilizarse en los casetes de expresión. Estos son responsables de la terminación de la transcripción más allá del polinucleótido heterólogo de la invención y su poliadenilación correcta. Los terminadores de transcripción apropiados son aquellos que se sabe que funcionan en plantas, e incluyen el terminador 35S de CaMV, el terminador tml, el terminador de sintasa de nopalina, y el terminador rbcS E9 de chícharo. Estos se pueden utilizar tanto en plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas.

Se ha encontrado que numerosas secuencias mejoran la expresión genética desde adentro de la unidad de transcripción, y estas secuencias se pueden utilizar en conjunto con los polinucleótidos de esta invención para incrementar su expresión en plantas transgénicas. Por ejemplo, se ha demostrado que diferentes secuencias de intrones, tales como los intrones del gen Adhl de maíz, mejoran la expresión, particularmente en células monocotiledóneas. En adición, también se sabe que un número de secuencias líder no traducidas derivadas a partir de virus, mejoran la expresión, y éstas son particularmente efectivas en células dicotiledóneas. La secuencia de codificación del gen opcionalmente seleccionado se puede diseñar genéticamente mediante la alteración de la secuencia de codificación para la expresión óptima en la especie de cultivo de interés. Los métodos para modificar secuencias de codificación -para lograr una expresión óptima en una especie de cultivo particular son bien conocidos (ver, por ejemplo, Perlak y colaboradores, Proc. Nati . Acad. Sci EUA 88 : 3324 (1991) y Koziel y colaboradores, Bio/ technol . 11:194 (1993)); Fennoy and Bailey-Serres. Nucí . Acids Res. 21: 5294-5300 (1993). Los métodos para modificar secuencias de codificación considerando el uso del codon en genes de planta y en plantas altas, algas verdes, y cianobacteria son bien conocidos (ver tabla 4 en: Murray y colaboradores. Nucí . Acids Res . 17:477-498 (1989); Campbell and Gowri Plant Physiol . 92: 1-11(1990). Se sabe que existen diferentes mecanismos para dirigir los productos genéticos en las plantas, y se han caracterizado con algún detalle las secuencias que controlan el funcionamiento de estos mecanismos. Por ejemplo, la dirección de los productos genéticos hacia el cloroplasto es controlada por una secuencia de señal que se encuentra en el extremo amino-terminal de diferentes proteínas, que se disocia durante la importación al cloroplasto para producir la proteína madura (por ej emplo Comai y colaboradores J. Biol. Chem. 263: 15104-15109 (1988)). Otros productos genéticos se localizan en otros organelos, tales como la mitocondria y el peroxisoma (por ejemplo, Unger y colaboradores, Plant Molec. Biol. 13:411-418 (1989)). Los ADNcs que codifican estos productos, también se pueden manipular para efectuar la direcció de los productos heterólogos codificados por las secuencias de ADN hacia estos organelos. En adición, se han caracterizado secuencias que ocasionan la dirección de los productos codificados por las secuencias de ADN hacia otros compartimientos celulares. Las secuencias amino-terminales son responsables de la dirección al retículo endoplásmico, al apoplasto, y la secreción extracelular desde las células de aleurona (Koehler & Ho, Plant Cell 2:769-783 (1990)). Adicionalmente, las secuencias amino-terminales, en conjunto con las secuencias carboxi-terminales, son responsables de la dirección vacuolar de los productos genéticos (Shinshi y colaboradores Plant Molec. Biol. 14:357-368 (1990)). Mediante la fusión de las secuencias de dirección apropiadas descritas anteriormente hacia un polinucleótido heterólogo de la invención, es posible dirigir un producto resultante hacia cualquier organelo o compartimiento celular. Los expertos ordinarios en las materias de transformación de plantas conocen numerosos vectores de transformación disponibles para la transformación de plantas, y se pueden utilizar los polinucleótidos pertinentes para esta invención en conjunto de cualquiera de esos vectores. La selección del vector dependerá de la materia de transformación preferida y de la especie blanco para la transformación. Para ciertas especies blanco, se pueden preferir diferentes marcadores de selección. Los marcadores de selección utilizados rutinariamente en la transformación incluyen al gen nptll que confiere resistencia a la kanamicina y antibióticos relacionados (Messing & Vierra. Gene 19:259-268 (1982); Bevan y colaboradores, Nature 304 : 184-187 (1983)), el gen bar, que confiere resistencia al herbicida fosfinotricina (White y colaboradores, Nucí. Acids Res 18:1062 (1990), Spencer y colaboradores, Theor. Appl. Genet 7_9: 625-631 (1990)), el gen hph, que confiere resistencia al antibiótico higromicina (Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4:2929-2931), y el gen dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Bourouis y colaboradores, EMBO J. 2(7) : 1099-1104 (1983)), y el gen EPSPS, que confiere resistencia al glifosato (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,940,935 y 5,188,642), el gen de isomerasa de fosfomanosa, manA, que confiere una ventaja metabólica selectiva en la presencia de mañosa (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 5,767,378, la cual se incorpora a la presente como referencia en su totalidad, y Miles & Guest, GENE, 32:41-48 (1984)). El marcador seleccionable PAT, que confiere resistencia a BASTA (Sung H. Park y colaboradores, In Vitro Cell. Dev. Biol. -Plant, 34: 117-121 (1998)). Hay muchos vectores disponibles para la transformación utilizando Agrobacterium tumefaciens . Estos llevan típicamente cuando menos una secuencia limite de ADN-T e incluyen vectores tales como pBIN19 (Bevan, Nucí. Acids Res. (1984)). Los vectores típicos adecuados para la transformación con Agrobacterium incluyen los vectores binarios pCIB200 y pCIB2001, así como el vector binario pCIBlO, y sus derivados de selección de higromicina. ( Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,639,949).

La transformación sin el uso de Agrobacterium tumefaciens circunviene el requerimiento de secuencias de ADN-T en el vector de transformación seleccionado, y en consecuencia, se pueden utilizar los vectores que carezcan de estas secuencias en adición a los vectores tales como aquellos descritos anteriormente, que contienen secuencias de ADN-T. Las técnicas de transformación que no se apoyan en Agrobacteri um incluyen la transformación mediante bombardeo de partículas, recuperación del protoplasto (por ejemplo, PEG y electroporación) , y microinyección. La elección del vector depende en gran parte de la selección preferida para la especie que se este transformando. Los vectores típicos adecuados para la transformación sin Agrobacteri um incluyen pCIB3064, pS0G19, y pSOG35. (Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,639,949. Una vez que se ha clonado el polinucleótido de interés en un sistema de expresión, se transforma en una célula de planta. Los métodos para la transformación y regeneración de las plantas son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, se han utilizado vectores de plásmido Ti para el suministro de ADN extraño, así como recuperación directa del ADN, liposomas, electroporación, microinyección, y microproyectiles. En adición, se pueden utilizar bacterias del género Agrobacterium para transformar células de plantas. Las materias de transformación para dicotiledóneas son bien conocidas en este campo, e incluyen materias basadas en Agrobacterium, y materias que no requieren de Agrobacterium. Las materias sin Agrobacterium involucran la recuperación del material genético exógeno directamente por los protoplastos o las células. Esto se puede realizar mediante recuperación mediada por PEG o electroporación, suministro mediado por bombardeo de partículas, o microinyección. En cada caso, las células transformadas se regeneran hasta plantas enteras utilizando materias convencionales conocidas en la materia. La transformación de la mayoría de las especies monocotiledóneas ahora ha llegado a ser una rutina. Las técnicas preferidas incluyen transferencia genética directa en protoplastos utilizando técnicas de PEG o electroporación, bombardeo de partículas en el tejido de cayo, así como transformación mediada por Agrobacteri um. El tejido blanco puede derivarse de tales fuentes como cultivo de trigo UC703 o genotipo de maíz CG000526. Por ejemplo, la transformación mediada por Agrobacterium de maíz se puede realizar como se describe en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 09/089, 111 la cual se incorpora a la presente como referencia en su totalidad, y que correspondientemente se publicó como la patente WO 98/54961, y de cebada se puede realizar como es descrito por: M. Cho, J. Wong, C. Marx, W. Jiang, P. Lemaux y B. Buchanan (1999) . La sobre-expresión de tiorredoxina h conduce a una mejor actividad de la enzima desramificadora de almidón (pululanasa) en el grano de cebada. PNAS 96:14641-14646; S. Zhang, M. Cho, T. Koprek, R. Yun, P. Bregitzer y P. Lemaux (1999) . Transformación genética de cultivos comerciales de avena (Avena sativa L.), y cebada (Hordeum vulgare L.), utilizando cultivos meristemáticos de retoños in vi tro derivados a partir de plántulas germinadas. Plant Cell Rep. 18:959-966; P. Bregitzer, S. Harlbert y P. Lemaux (1998) . Variación somaclonal en la progenie de cebada transgénica. TAG 96:421-425; M. Cho, W. Jiang y P. Lemaux (1998). Transformación de cultivos de cebada recalcitrantes a través de la mejora de la regenerabilidad y albinismo reducido. Plant sci. 138:229-244; P. Lemaux, M. Cho, S. Zhang, y P. Bregitzer (1998) . Cereales transgénicos: Hordeum vulgare L. - estado actual y prospectos futuros. En: Vasil I, Phillips R. (editores) Molecular I provement of Cereal Crops, Kluwer Academic Publ, Dordrecht, Holanda, páginas 255-316; S. Zhang, R. Williams-Carrier, D. Jackson, y P Lemaux (1998) . Expresión de CDC2Zm y KNOTTED1 durante la proliferación del meristemo de retoño axilar in vi tro, y formación de meristemo de retoño adventicio en maíz ( Zea mays L . ) y cebada (Hordeum vulgare L. ) . Planta 204:542-549; D. McElroy, J. Louwerse, S McElroy y P. Lemaux (1997) . Desarrollo de un simple ensayo transitorio para la actividad Ac/Ds en células de tejido de cebada intacto. Plant J. 11: 157-165; S. Tingay, D. McElroy, R. Kalla, S. Fieg, M. Wang, S. Thornton y R. Brettell (1997). Transformación de cebada mediada por Agrobacterium tumefaciens . The Plant J. 11:1369-1376; J. Qureshi, Z. Basri, R. Singh, R. Burton, M. Dalton, J. Kollmorgen y G. Fincher. 1988. Transformación mediada por Agrobacteri um de dos variedades de cebada (Hordeum vulgare L. ) Proc. 42nd Conference of Australian Society for Biochemistry and Molecular Bíology, 28 de septiembre - 1 de octubre de 1998, Adelaide, Australia; J Qureshi, R. Singh, Z. Basri, R. Stewart, R. Burton, J. Kollmorgen y G. Fincher (1997). Estrategias para la transformación genética de variedades de cebada australianas élite. Proc, >th Aust, Barley Technical symp. Gold Coast, Queensland, 7-12 de septiembre de 1997. 2:8.9-ll;P. Lemaux, M. Cho, J Louwerse, R. Williams e Y. Wan (1996) . Métodos de transformación mediada por bombardeo para cebada. Bio-Rad US/EG Bull 2007: 1-6; T. Koprek, R. Hansch, A. Nerlich, R. Mendel y J. Schulze (1996) . Cebada transgénica fértil de diferentes cultivos obtenida mediante el ajuste de las condiciones de bombardeo a la respuesta del tejido. Plant Sci. 119: 79-91; T Hagio, T. Hirabayashi, H. Machii y H. Tomutsume (1995) .

Producción de cebada transgénica fértil (Hordeum vulgare L . ) utilizando el marcador de resistencia a la higromicina.

Plant Cell JRep. 14:329-334; H. Funatsuki, H. Kuroda, M. Kihara, P. Lazzeri, E. Muller, H. Lorz e I. Kishina i (1995) . Cebada transgénica fértil regenerada mediante transferencia directa del ADN a protoplastos. TAG 91: 707- 712; A. Jahne, D. Becker, R. Brettschneider y H. Lorz (1994) . Regeneración de cebada fértil transgénica derivada de microsporas. TAG 89: 525-533; Y. Wan y P. Lemaux (1994) . Generación de grandes números de plantas de cebada fértiles independientemente transformadas, Plant Physiol. 104: 37-48. Los polinucleótidos de la invención se pueden utilizar para conferir resistencia al tricoteceno a una amplia variedad de células de plantas, incluyendo aquellas de gimnospermas, monocotiledóneas, y dicotiledóneas. Aunque el polinucleótido heterólogo de la invención se puede insertar en cualquier célula de planta que caiga dentro de estas amplias clases, es particularmente útil en células de plantas de cultivo, tales como arroz, trigo, cebada, centeno, maíz, avena, papa, camote, nabo, chayóte, calabaza, calabacín, melón, frijol de soya, y sorgo. Los polinucleótidos de uso en la invención que hacen una planta resistente al tricoteceno, se pueden utilizar en combinación con otras características importantes para la producción y la calidad. Los polinucleótidos de la invención se pueden incorporar en líneas de plantas a través de planteamientos y técnicas de reproducción conocidas en este, campo. Cuando se obtiene un alelo genético resistente al tricoteceno mediante transformación en una planta de cultivo o en un cultivo de células de planta a partir del cual se pueda regenerar una planta de cultivo, se mueve hacia las variedades comerciales utilizando técnicas de reproducción tradicionales para desarrollar un cultivo resistente al tricoteceno, sin la necesidad de diseñar genéticamente el alelo, y transformarlo en la planta. Los varios pasos de producción se caracterizan por la intervención humana bien definida tal como seleccionar las líneas para ser cruzado, rlirigir la polinización de las líneas parentales, o seleccionar las plantas apropiadas descendiente. Dependiendo de las diferentes propiedades deseadas se toman las medidas de producción. Son bien conocidas las técnicas relevantes en el campo e incluyen pero no se limitan a la hibridación, endogamia, producción de retro-cruzado, producción en multilínea, mezcla de variedad, hibrizado interespecífico, técnicas de aneuploide, etcétera. Las técnicas de hibrizado también incluyen la esterilización de plantas para dar las plantas estériles masculina o femenina por medios mecánicos, químicos o bioquímicos. La polinización cruzada con polen de una planta estéril masculina de una línea diferente asegura que el genoma de la planta masculina estéril pero de la femenina fértil obtenga uniformemente las propiedades de ambas líneas parentales. Así, las semillas y plantas transgénicas de acuerdo a la invención se pueden utilizar para la producción de las líneas de planta mejoradas que no muestran o reducen el crecimiento fungal en la planta, tejidos de plantas, o semilla por lo cual se evita y/o reduce la contaminación de micotoxina de la planta, tejido de planta o semilla. La resistencia al tricoteceno diseñada en las semillas y plantas transgénicas mencionada anteriormente es pasada por la reproducción sexual o crecimiento vegetativo y puede mantenerse y propagarse en plantas descendientes. El mantenimiento y la propagación generalmente se hacen usando métodos agrícolas conocidos desarrollados para ajustar los propósitos específicos tales como labranza, siembra o cosecha. Como el crecimiento de la cosecha es vulnerable al ataque y daños causados por insectos o infecciones, se emprenden medidas de controlar de enfermedades de planta, insectos, nemátodos, y otras condiciones adversas para mejorar la producción. Éstas incluyen medidas mecánicas tal como el cultivo del suelo o retiro de plantas infectadas, así como la aplicación de agroquímicos tales como fungicidas, gametocidas, nematicidas, reguladores del crecimiento, agentes de maduración e insecticidas.

En la germinación de producción de semillas la calidad y uniformidad de semillas son características esenciales del producto, mientras que la calidad de la germinación y uniformidad de las semillas cosechadas y vendidas por el granjero no son importantes. Puesto que es difícil mantener una cosecha libre de otra cosecha y semillas de mala hierba, para controlar enfermedades producidas por semillas, y producir una semilla con buena germinación, las prácticas de producción de semilla son bastante extensivas y bien definidas siendo desarrolladas por los productores de semillas, que tienen experiencia en la materia del crecimiento, condiciones y comercialización de la semilla pura. Así, es una práctica común para el agricultor que compre semilla certificada que reúna la calidad específica estándar en vez de usar la semilla cosechada de su propia cosecha. El material de propagación que se utiliza como semillas se trata habitualmente con herbicidas, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, molusquicidas o mezclas de los mismos que comprenden un revestimiento protector. Los revestimientos protectores habitualmente utilizados comprenden compuestos ® tales como captan, carboxma, thira (TMTD ) , metalaxil ® . ® (Apron ) , y pirimifos-metílicos (Actellic ) . Si se desean estos compuestos se formulan junto con otros portadores, surfactantes o adyuvantes que promueven la aplicación empleados habitualmente en la materia de la formulación para proporcionar la protección contra el daño causado por parásitos bacterianos, fúngales o animales. Los revestimientos protectores pueden aplicarse por impregnar el material de propagación con una formulación líquida o cubriendo con una formulación combinada húmeda o seca. Otros métodos de aplicación son también posibles tal como el tratamiento dirigido en los brotes o la fruta. Es un aspecto adicional de la presente invención proporcionar nuevos métodos agrícolas tales como los métodos e emplificados anteriores los cuáles son caracterizados por el uso de plantas transgénicas, material de planta transgénica, o semilla transgénica de acuerdo a la presente invención. En otra modalidad, la presente invención se relaciona a una célula de planta transgénica, tejido, órgano, semilla o partes de planta obtenidas de la planta transgénica. También incluidos dentro de la invención están los descendientes transgénicos de la planta así como las células de planta, tejidos, órganos, semillas y partes de planta transgénicos obtenidos a partir de los descendientes. En otra modalidad, el polinucleótído heterólogo de uso en la invención también se puede utilizar como un marcador seleccionable en procedimientos de transformación. En este aspecto la célula hospedera se transforma con un segundo polinucleótido heterólogo de interés, así como un polinucleótido heterólogo de la invención, que codifica un producto genético que comprenda actividad de resistencia al tricoteceno, utilizando casetes de expresión y técnicas de transformación ejemplificadas anteriormente y conocidas en este campo. Después de la transformación, las células transformadas se seleccionan por su capacidad para sobrevivir cuando se exponen a un tricoteceno, particularmente DAS o DON o toxina T-2. La célula hospedera puede ser una célula hospedera eucariótica o procariótica, utilizando sistemas de transformación y de expresión conocidos en la técnica. La célula hospedera puede ser una célula de planta, una célula fungal, una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula animal, o una célula de insecto. En una modalidad particularmente preferida de la invención, se utiliza un polinucleótido que codifica un producto genético que comprenda actividad de resistencia al tricoteceno como un marcador seleccionable en métodos de transformación de células de plantas. Por ejemplo, las plantas, tejidos de plantas, semillas de plantas, o células de plantas transformadas con cuando menos una segunda secuencia de AD? heteróloga de interés, también se pueden transformar con una secuencia que codifique un polipéptido que comprenda una secuencia sustancialmente similar a aquella de las SEC ID NO. 2, 6 u 8. Las células transformadas se transfieren a un medio que contengan un tricoteceno fitotóxico, particularmente DAS y/o DON y toxina T-2, en una cantidad suficiente para inhibir el crecimiento o la posibilidad de sobrevivencia de las células de planta que no expresen el polipéptído sustancialmente similar a aquel que tenga la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO. 2, 6 u 8, en donde solamente crecerán las células transformadas o no se impida su crecimiento. Las concentraciones de tricoteceno útiles para la selección de plantas que expresan el polipéptido sustancialmente similar al que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO. 2, 6 u 8 en el rango de 1 microgramos/mililitros a 90 microgramos/mililitros. El método es aplicable a cualquier célula de planta capaz de expresar un polinucleótido que comprenda una secuencia de nucleótidos sustancialmente similar a aquella de la SEC ID NO. 1, 5 6 7, y se puede utilizar con cualquier secuencia de ADN heteróloga de interés. La expresión de la segunda secuencia de ADN heteróloga y del polinucleótido heterólogo de la invención, se puede impulsar mediante el mismo promotor funcional en células de planta, o mediante promotores separados.

Descripción de las secuencias: SEC ID NO. 1 es una secuencia de ADNc de Fusari um sporotrichioides que codifica un polipéptido de la invención que tiene actividad de resistencia al tricoteceno. SEC ID NO. es el polipéptido que tiene actividad de resistencia al tricoteceno codificada por la SEC ID NO. 1. SEC ID NO. 3 es un cebador de ADN. SEC ID NO. 4 es un cebador de ADN SEC ID NO. 5 es una de ADN de Fusari um graminearum que codifica un polipéptido de la invención que tiene actividad de resistencia al tricoteceno. SEC ID NO. 6 es el polipéptido que tiene actividad de resistencia al tricoteceno codificado por la SEC ID NO. 3. SEC ID NO. 7 es una secuencia de ADN de Saccharomyces cerevisiae que codifica un polipéptido de la invención que tiene actividad de resistencia al tricoteceno. SEC ID NO. 8 es el polipéptido que tiene actividad de resistencia al tricoteceno codificada por la SEC ID NO. 5. SEC ID NO. 9 es la secuencia de ADN de pCIB9818.

SEC ID NO. 10 es la secuencia de ADN de pAgroTRIr. SEC ID NO. 11 es la secuencia de ADN de pNOV1704.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos describen adicionalmente los materiales y métodos utilizados en la realización de la invención, y los resultados subsecuentes. Se ofrecen a manera de ilustración, y su texto no debe considerarse como una limitación de la invención reivindicada.

EJEMPLO 1: Composición de pNOV1700, pCIB9818, pAgroTRIr y pNov 1704 1. pNOV1700: pNOV1700 fue depositado bajo los términos del Tratado de Budapest el 19 de marzo de 1999, en el Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL) , Northern Regional Research Center, 1815 Northern University Street, Peoría, Illinois 61604, USA y se le asignó el número de acceso NRRL B-30117. De acuerdo con lo anterior, pNOV1700 comprende la SEC ID NO. 1, operativamente unida al promotor de ubiquitina de Z. mays, incluyendo una porción del exón y del intrón, y a la señal de poliadenilación de nopalina sintasa. 2. pCIB9818 El plásmido pCIB9818 es un plásmido circular de 6111 pares de bases que tiene una secuencia de ADN de acuerdo a la SEC ID NO. 9. El promotor de ubiquitina de Z. mays, bases 12 a 1993 de la SEC ID NO. 9, incluyendo una porción del exón, bases 896 a 1011, y del intrón, bases 1047 a 1993, está operativamente unido al marcador seleccionable de fosfato mañosa isomerasa, pares de bases 2090 a 3193, al intrón # 9 invertido PEPC de las bases 3248 a 3355 y a la secuencia de terminación del gen 35S CaMV, bases 3357 a 3434.* 3. pAgroTRIr El plásmido pAgroTRIr es un vector binario circular de 13.737 pares de bases que tiene una secuencia de ADN de acuerdo a la SEC ID NO. 10. De acuerdo con lo anterior, pAgroTRIr comprende un marcador seleccionable operativamente unido a un promotor y una secuencia de terminación, y la región de polinucleótidos de la SEC ID NO. 1 detrás y adentro del marco con el promotor UBI3 de Arabidopsis thaliana (S. Norris, S. Meyer, y J. Callus, Plant Molecular Biology 22:895-906, (1993)) y enfrente de, y adentro del marco con, la señal de poliadenilación. 4. pNovl704 El plásmido pNOV1704 es un vector binario circular de 12949 pares de bases que tiene una secuencia de ADN de acuerdo a la SEC ID NO. 11. El promotor de ubiquitina de Z . mays, bases 11 a 1992 de la SEC ID NO. 11 (incluyendo el exón 1: 895 a 1010, y el intrón 1: 1045 a 1992), está operativamente unido a la secuencia del marcador seleccionable de fosfato mañosa isomerasa, pares de bases 2.089 a 3192 y a la secuencia de terminación de nopalina sintasa, bases 3557 a 3688. El pNOV1704 comprende además el promotor de ubiquitina de Z. mays, bases 9218 a 11218 (incluyendo el exón 1: 10110 a 10224 y el intrón 1: 10225 a 11218) operativamente enlazado a la secuencia del tricoteceno 3-O-acetiltransferasa de la SEC ID NO. 1, en las bases 11234 a 12662 y la secuencia de terminación nos. 12667 a 12935.

EJEMPLO 2: Transformación, selección, y regeneración de trigo Transformación Se disectan embriones zigóticos inmaduros (de 0.75 a 1.25 milímetros) de cariopsas esterilizadas superficialmente del cultivo de trigo (Chlorox X al 10 por ciento durante 10 minutos) , luego se depositan con el escutelo hacia arriba sobre un medio basado en MS (Murashige y Skoog, (1962) Physiol. Plant 15:473-439) complementado con sacarosa al 3 por ciento, 3 miligramos/litro de 2,4-D (ácido diclorofenoxiacético) , 150 miligramos/litro de glutamina, 75 miligramos/litro de asparagina, y se solidifica con fitagar al 0.7 por ciento (medio 3MS3S) . Los embriones se incuban en la oscuridad a 28°C durante 5 a 10 días antes del bombardeo . El tiempo óptimo para el bombardeo es de 6 a 7 días después del deposito. Cuatro horas antes del bombardeo, los embriones se colocan sobre un medio de plasmólisis (el mismo medio descrito anteriormente, pero con maltosa al 15 por ciento agregada en lugar de la sacarosa) , y se arreglan en un circulo con un diámetro de 2.5 centímetros, dando el escutelo hacia arriba. pNOV1700 descrito en el Ejemplo 1 anterior, se digiere con PvuII y Xmnl, y se aisla un fragmento de 4,117 pares de bases que comprende una región de polinucleótido que tiene una secuencia de acuerdo con la SEC ID NO. 1 así como el promotor de ubiquitina y la señal de poliadenilación NOS. pCIB9818, también descrito en el Ejemplo 1 anterior, se digiere con AscI, y se aisla el fragmento de 4,246 pares de bases, que comprende al promotor de maíz UBI, el marcador seleccionable, y la secuencia de terminación 35S de CaMV. Los fragmentos de ADN aislados se precipitan sobre partículas de oro medida de 0.3 mieras utilizando el método de Sanford estándar. Mientras se pone en vórtice continuamente, se agregan 5 microgramos del ADN del fragmento aislado por construcción, 50 microlitros de CaCl_ 2.5 M, y 20 microlitros de espermidina 0.1 M a un tubo Eppendorf que contiene 50 microlitros de glicerol al 50 por ciento, y 3 miligramos de oro. La mezcla de ADN/oro recibe dos lavados con etanol. Después de desechar el sobrenadante del último lavado, se agrega etanol para hacer un volumen final de 70 microlitros. Esto proporción a seis disparos por tubo de oro/ADN. Las placas blanco se disparan dos veces, de tal manera que se da un suministro de aproximadamente 3 microgramos de ADN (si se utilizan 5 microgramos de cada una de las dos construcción es, que usualmente es el caso) y 1.0 miligramos de oro por placa blanco. La presión de ruptura utilizada es de 77 kilogramos/cm2 (1100 psi) . Después del bombardeo, las placas blanco se regresan a la oscuridad durante la noche. Después de aproximadamente 24 horas de plasmolisis, se remueven los embriones a 3MS3S, y se regresan a la oscuridad durante 3 semanas para el inicio del callo. No se hace ningún subcultivo durante este tiempo.

Selección/Regeneración El tejido embriogénico que se desarrolla durante el período de inicio de 3 semanas se disecta del tejido no embriogénico, y se coloca sobre un medio de regeneración/selección. El medio de regeneración básico es 3MS3S sin 2,4-D, pero con 1 miligramo/litro de GA3 (Giberelina A3) , NAA (ácido 1-naftelenacético) , y se agrega NAA en su lugar (denominado medio NG) . Se agregan 10 gramos/litro de mañosa, y 5 gramos/litro de sacarosa (NG1M.5S). El tejido se somete a esta fase inicial de regeneración y selección durante 2 semanas. Por la mayor parte del período de 2 semanas, el tejido está en el cuarto de luz. El desarrollo de retoños y raíces empieza durante esta fase, y después de 2 semanas se lleva todo el tejido a la siguiente etapa. Para la segunda fase de regeneración y selección con selección de mañosa, la mañosa se reduce hasta 5 gramos/litro, y la sacarosa se incrementa hasta 20 gramos/litro (MS2S.5M). El tejido normalmente se queda en estos medios durante aproximadamente 4 semanas, durante cuyo tiempo se presenta un desarrollo adición al del retoño y la raíz. Las plántulas en vigoroso crecimiento con buen color, y desarrollo de raíz y retoños, se remueven de las placas, y se colocan en recipientes más grandes denominados GA7. Esta es la etapa final de selección y regeneración. El medio contiene solamente sales 1/2 MS y 15 gramos/litro de mañosa. El mejor indicador de que una planta se puede transformar, es la observación de un crecimiento activo de la raíz hacia adentro del medio. Se recolecta el tejido de hoja de las plántulas en crecimiento activo, y se hace una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ya sea para gen de interés, o bien para el marcador seleccionable, antes de transferir al invernadero.

EJEMPLO 3: Transformación con Arabidopsis Las construcciones del vector binario pAgroTRIr descritas en el Ejemplo 1 anterior, se transforman en Agrobacterium tumefaciens cepa GV3101 (Bechtold, N. y colaboradores, CR Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie, 316:1194-1193 (1993)) mediante electroporación (Dower, W.J., Mol. Biol. Rep. 1:5 (1987). Un cultivo de 25 mililitros de colonias individuales de Agrobacteri um GV3101 conteniendo plásmidos pAgroTRIr en YEB + Rifampsina 100 y Kanomicina 100, se incuba a 30 grados centígrados durante la noche. Los cultivos grandes se inician mediante la inoculación de 500 mililitros de mismo medio con 5 mililitros del cultivo pequeño, y se incuban durante la noche a 30 grados centígrados. Se determina ei O.D. a 600 nanómetros de los cultivos, y luego los cultivos se centrifugan a 5 K en el rotor . GSA durante 15 minutos. Las células se vuelven a suspender en "medio de infiltración modificado IM" para alcanzar un O.D. final a 600 nanómetros de 0.08. Se agregan 200 microlitros de Silwet por litro de células suspendidas. Tres macetas de Arabidopsis variedad Columbia, con aproximadamente 4 plantas por maceta, se invierten en aproximadamente 500 mililitros de suspensión celular. Las flores se agitan en la suspensión celular para desalojar las burbujas de aire, y las plantas se incuban en la suspensión celular durante 15 minutos. Se coloca un domo sobre la charola para mantener las plantas húmedas durante la noche. Las plantas se dejan crecer durante aproximadamente 3 a 4 semanas, después de lo cual las plantas no se riegan durante hasta 1 semana. Las vainas de semilla se recolectan y se secan en el cuarto de secado durante aproximadamente 1 semana y media. Las semillas se plantan y se dejan crecer durante aproximadamente 2 semanas. La plantas se rocían con el agente de selección, y luego se rocían nuevamente 2 días después y 4 días después. Después de aproximadamente 3 días, las plantas sobrevivientes se pueden transplantar a las nuevas macetas.

EJEMPLO 4: Transformación biolística de maiz Los cultivos de callo embriogénicos tipo I (Green y colaboradores, 1983, Somatic cell genetic systems in corn. A. Fazelahmad, K Downey, J. Schultz, RW Voellmy, editores, Advances in Gene Technology: Molecular Genetics of Plants and Animáis. Miami Winter Symposium Series, Volumen 20. Academic Press, NY) se inician a partir de embriones de maíz inmaduros, que son de 1.5 a 2.0 milímetros de longitud, a partir del material de crecimiento en el invernadero. Los embriones se cortan asépticamente de las mazorcas esterilizadas de manera superficial aproximadamente 14 días después de la polinización. Los embriones se colocan sobre medio de iniciación de callo D (Duncan y colaboradores, (1985) Planta 165: páginas 322-332) con sacarosa al 2 por ciento y 5 miligramos/litro de clorambeno. Los embriones y los cultivos embriogénicos subsecuentemente se cultivan en la oscuridad. Se cortan las respuestas embriogénicas de los explantes después de aproximadamente 14 días. Las respuestas se colocan sobre medio de mantenimiento de callo D con sacarosa al 2 por ciento y 0.5 miligramos/litro de 2,4-D. Después de aproximadamente 6 semanas de subcultivo semanalmente selectivo a medio de mantenimiento fresco, se establecen cultivos embriogénicos compactos de alta calidad. Las piezas de callo embriogénico en crecimiento activo se seleccionan como el tejido blanco para el suministro del gen. Las piezas de callo se depositan sobre placas blanco que contienen medio de mantenimiento con sacarosa al 12 por ciento, aproximadamente 4 horas antes del suministro del gen. Las piezas de callo se arreglan en círculos, con radios de 8 y 10 milímetros desde el centro de la placa blanco . pNOV1700, descrito en el Ejemplo 1 anterior, se digiere con PvuII y Xmnl, y se aisla un fragmento de 4,117 pares de bases que comprende una región de polinucleótido que tiene una secuencia de acuerdo con la SEC ID NO. 1, así como el promotor y la señal de poliadenilación. pCIB98L8, también descrito en el Ejemplo 1 anterior, se digiere con AscI, y se aisla el fragmento de 4,246 pares de bases que comprende el gen marcador, el promotor, y la señal de terminación. Los fragmentos de ADN aislados se precipitan sobre microportadores de oro, como se describe en el manual DuPont Biolistics. Se utilizan de 2 a 3 microgramos (µg) por cada construcción de plásmido en cada preparación de microportador de 6 disparos. Los polinucleótidos de la invención se suministran a las células de tejido blanco utilizando el dispositivo PDS-lOOOHe Biolistics. Las posiciones del dispositivo Biolistics son como sigue: 8 milímetros entre el disco de ruptura y el macroportador, 10 milímetros entre el macroportador y la malla de paro, y 7 centímetros entre la malla de paro y el blanco. Cada placa blanco se dispara dos veces utilizando discos de ruptura de 45.5 kg./cm2 (650psi). Se coloca una malla de acero inoxidable de 200 x 200 (McMaster-Carr, New Brunswick, NJ) entre la malla de paro y el tejido blanco. Siete días después del suministro del gen, las piezas de tejido blanco se transfieren desde el medio altamente osmótico hasta el medio de selección. El tejido blanco se coloca sobre un medio de mantenimiento que no contiene sacarosa, y que contiene mañosa al 1 por ciento. Después de 3 a 5 semanas, las piezas de callo en crecimiento se subcultivan hacia el medio de mantenimiento que no contiene sacarosa y que contiene mañosa al 1.5 por ciento. El callo embriogénico que crece sobre el medio- de selección se subcultiva cada dos semanas durante 6 a 10 semanas, hasta que se produce suficiente callo para generar de 10 a 20 plantas. El- tejido que sobrevive a la selección a partir de una pieza de tejido blanco original se subcultiva como una sola colonia, y se designa como un evento de transformación independiente. Las colonias se transfieren a un medio MS modificado (Murashige y Skoog, 1962 (1962) A revised médium for rapid growth and bioensayos with tobáceo tissue cultures. Physiol. Plant 35:473-497), conteniendo sacarosa al 2 por ciento y mañosa al 1 por ciento (MS2S+1M) con 0.25 miligramos/litro de ancimidol, y 0.5 miligramos/litro de cinetína. Después de 2 semanas, las colonias en regeneración se transfieren entonces a MS2S+1M sin hormonas. Los retoños en regeneración, con o sin raices, de todas las colonias, se transfieren a cajas Magenta que contienen medio- MS3S, y se recuperan las plantas pequeñas con raíces y se transfieren a la tierra en el invernadero.

EJEMPLO 5: Análisis de la expresión de plantas transgénicas Se analiza el tejido de plantas transformadas para determinar la presencia de un polinucleótido que comprenda la secuencia de la SEC ID NO. 1. Se extrae el ADN de la planta transformada, y se realizan análisis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de acuerdo con lo protocolos convencionales. Los cebadores utilizados para la amplificación de las construcciones genéticas son (5'-acgaatcattcaccgaggag-3' ) (SEC ID NO. 3), y (5f-ctcacactctcaggcttacc-3' ) (SEC ID NO. A ) . Se detecta un fragmento de 650 nucleótidos adentro de la secuencia de la SEC ID NO. 1 en trigo obtenido de acuerdo con el Ejemplo 2. b. Análisis Northern Las plantas transformadas se analizan para determinar la presencia de ARN mediante hibridación Northern blot. Para el análisis Northern blot, el ARN extraído del tejido de la planta se separa por tamaños, y se mancha sobre una membrana de nylon. Esta membrana subsecuentemente se hibrida con una sonda radioactiva, derivada a partir del fragmento Styl de 429 nucleótidos, del polinucleótido de acuerdo con la SEC ID NO. 1, y se utiliza como la sonda. El ARN se detecta en plantas de trigo y Arabidopsis transformadas de acuerdo con los Ejemplos 2 y 3 anteriores.

EJEMPLO 6: Ensayo enzimático para determinar la actividad de 3-Q-acetiltransferasa de tricoteceno a . ) Extracción del tejido de la planta para los ensayos enzimáticos : Se seleccionan tres pedazos de 25.4 x 3.175 milímetros de hoja (aproximadamente 50 miligramos) de plantas transgénicas de la invención, incluyendo aquellas transformadas y regeneradas de acuerdo con los Ejemplo 2 a 4. (b) Molino de perlas de Vidrio : El tejido se coloca en un tubo de fondo redondo de 2 mililitros, y se cierra la tapa. El tubo se sumerge en nitrógeno líquido, y se incuba durante la noche a -80 °C. El tubo se agita sobre saws-all durante 24 segundos, y se agregan 0.4 mililitros de amortiguador de fosfato de sodio. El tubo se pone en vórtice durante aproximadamente 10 segundos, y se coloca sobre hielo. El tubo se pone en vórtice durante otros 5 minutos, y luego se centrifuga a 14,000 rpm en un centrifugo Eppendorf durante 5 minutos. El sobrenadante se remueve y se coloca en un tubo limpio . Se mezclan los siguientes componentes: Sustrato de tricoteceno, 2 microlitros de DAS (acetona al 20 por ciento en amortiguador de fosfato de sodio 50 mM, pH de 7.0) . También se puede utilizar DON. Sustrato de asetil-CoA, 2 microlitros de [^C]-acetil-CoA, NEN cat. # NEC313 (60 mCi/milimol y 0.02 mCi/ml) . Amortiguador, hasta un volumen final de 50 microlitros con amortiguador de fosfato de sodio, pH de 7.0. El ensayo se inicia mediante la adición de la siguiente preparación enzimática, y se incuba a 30 °C durante 15 minutos. Preparación enzimática, 10 microlitros de extracto de planta en amortiguador de fosfato de sodio, pH de 7.0. Después de 15 minutos, se agregan 100 microlitros de acetato de etilo, y el tubo se pone en vórtice dos veces durante varios segundos. El tubo se centrifuga durante 2 minutos a 14,000 rpm en un centrifugo Eppendorf. Se remueven 50 microlitros de la fase de acetato de etilo, y se agregan a un frasco que contiene un cóctel de cintilación. El tubo se registro durante 2 minutos utilizando un contador de cintilación. Se identificaron 20 plantas de trigo separadas obtenidas de acuerdo con el Ejemplo 2 anterior, y que tenían actividades específicas de 0.60 a 13.4 nanomoles de producto acetilado/ icrogramo de proteina/15 minutos. Las actividades específicas de las plantas de trigo transformadas son significativamente mayores que el control negativo. El control negativo fue un cultivo de trigo no transformado, que tenía una actividad específica de 0.1 a 0.2 nanomoles de producto acetilado/microgramo de proteína/15 minutos. Se identificaron 5 plantas de Arabidopsis separadas obtenidas de acuerdo con el Ejemplo 3 anterior, y que tenían actividades específicas de 3.8 a 28 nanomoles de producto acetilado/microgramo de proteína/15 minutos. Las actividades específicas de las plantas transformadas son significativamente mayores que aquella del control negativo. El control negativo fue una Arabidopsis thaliana variedad Columbia transformada con una construcción de ácido nucleico para expresar el marcador seleccionable que tenía una actividad específica menor de 0.1 nanomoles de producto acetilado/microgramo de proteína/15 minutos. Se identificaron plantas de maiz de cuando menos dos transformaciones diferentes obtenidos de acuerdo con el Ejemplo 4 anterior, y que tenían actividades específicas que van de 11.1 a 17.9 nanomoles de producto acetilado/microgramo de proteína/15 minutos. Las actividades específicas de las plantas transformadas son significativamente mayores que aquella del control negativo. El control negativo fue un genotipo de maíz no transformado, que tiene una actividad específica menor de 0.2 nanomoles de producto acetilado/microgramo de proteína/15 minutos. Se identificaron plantas de maíz de cuando menos 16 transformantes diferentes obtenidos utilizando transformación mediada por Agrobacterium de pNOV 1704, que tenían actividades específicas que va desde 17 hasta 183 nanomoles/microgramo/15 minutos.

EJEMPLO 7: Bioensayo para determinar la resistencia al tricoteceno en plantas transgénicas Se preparan 250 mililitros de medio CPR que tiene los siguientes componentes, y se ajusta el pH a 6.5 con KOH. 1/2 MS sales 0.54 gramos 1/2 MS vitaminas 1.25 mililitros Sacarosa al 1 por ciento (opcional) 2.50 gramos Se agrega agarosa al medio anterior hasta una concentración del 1 por ciento (2.50 gramos), y el medio se pasa por autoclave. Se agregan 25 mililitros de 50 miligramos/mililitro de rojo de clorofenol al medio pasado por autoclave. Mientras se mantiene el medio a 55°C, se agrega DAS o DON en acetona en diferentes concentraciones (es decir, DON a 4, 8, ó 16 microlitros, 10 miligramos/mililitro, o DAS a 2, 4, ó 6 microlitros, 50 miligramos/mililitro de DAS por 1.7 mililitros). Se hacen alícuotas de aproximadamente 0.5 mililitros del medio en cada pozo de una placa de microtitulación de 48 pozos. Se agregan pedazos de 8.466 x 3.175 milímetros (1/3 x 1/8 pulgadas) de tejido de planta transformado a los pozos de la placa de microtitulación, así como al tejido de control de los controles de tipo silvestre no transformados. Los pedazos de hoja se dejan caer en una caja de Petri, y empujan hacia adentro del medio del pozo de la placa de microtitulación con unas pinzas . Las placas de microtitulación se incuban de 2 a 4 días a 20°C bajo luces. El metabolismo del pedazo de hoja da como resultado un cambio de color (caída en el pH) de rojo a amarillo. La actividad de resistencia al tricoteceno o la sensibilidad reducida a los tricotecenos por los transformantes, da como resultados pozos color amarillo en la presencia de DAS o DON. Se observa un cambio de color desde rojo hasta amarillo, comparándose con el control que permaneció rojo, en las plantas de trigo y maíz de la invención. Además, los pedazos de hoja individuales tienen significativamente menos clorosis que el control correspondiente.

EJEMPLO 8 : Ensayo de Germinación A. Ensayo de Germinación de Resistencia al Tricoteceno Las semillas de plantas transgénicas de la invención se hacen crecer bajo presión selectiva a partir del agente de selección, y se auto-cruzan las plantas resultantes. La semilla resultante se deposita sobre un medio MS3S (MS sales, 4.3 gramos/litro, MS vitaminas 100X, Sacarosa 30 gramos/litro, y fitagar 8 gramos/litro) , y se complementan con DAS o DON (a 20 miligramos/mililitro) , en una densidad de 1,000 a 1,200 semillas/caja de Petri (diámetro de 100 milímetros) . Después de incubación en la luz durante 4 días, se examinan las placas para determinar el crecimiento de las plántulas. Las semillas de Arabidopsis de las plantas obtenidas de acuerdo con el Ejemplo 3 anterior, y cultivadas en el medio que comprendía DAS, tuvieron numerosas plantas, tanto con desarrollo de raíz como de retoños. Aunque las semillas de control (línea de Arabidopsis parental, variedad Columbia) germinaron pobremente, y no se formaron raíces cuando se cultivaron en el medio complementado con DAS. No se observaron diferencia entre las semillas transformadas y de control cultivadas en el mismo medio sin DAS.

B. Ensayo de Germinación de Resistencia Fungal para Detectar la Resistencia al Marchitamiento de la Plántula 1. Ensayo de Germinación de Resistencia Fungal de Trigo: Los ensayos de germinación de resistencia fungal en trigo se realizan sustancialmente como es descrito por R.H. Proctor, T. M. Hohn, y S.P. McCormick. Reduced virulence of Gibberella zeae caused by disruption of a trichothecene toxin biosynthetic gene. Mol . Plant-Microbe Interact . 8(4) : 593-601, 1995), que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad. El inoculo consiste en macroconidias de F. gramiearum diluidas en agua a 1 x 105 conidias por mililitro. El inoculo se prepara lavando las macroconidias de los cultivos de agar de jugo V-8 crecidos bajo luces fluorescentes blanca y casi ultravioleta durante 7 a 10 días. Eñ los ensayos de las plántulas, las semillas de dos eventos de trigo transgénico diferentes del- Ejemplo 2 anterior y el control de tipo silvestre, se esteralizan superficialmente lavando en una solución de blanqueador al 10 por ciento y Tweer al 0.05 por ciento durante aproximadamente 15 minutos, y se enjuagan 5 veces con agua destilada estéril. Las semillas se remojan en una suspensión de macroconidias durante aproximadamente 10 minutos, y luego se siembran en vermiculita contenida en macetas de plástico de 10 centímetros (20 semillas por maceta) . Antes de la siembra, las macetas se llenan a aproximadamente 3/4 partes con vermiculita, y se establecen en 2 a 4 centímetros de agua, hasta que se humedece la parte superior de vermiculita. Después de la siembra, las semillas se cubren con 1 a 2 centímetros adicionales de vermiculita, y las macetas se colocan individualmente en bolsas de plástico, y se incuban en una cámara de crecimiento a 22 °C, con 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad durante una semana. Después de aproximadamente 1 semana, las macetas se remueven de las bolsas, y después de 2 semanas, se evalúa la enfermedad contando el número de plántulas que emergen en cada maceta. Los controles se tratan como se describió anteriormente, excepto que las semillas se remojan en agua estéril, y se utilizan 40 semillas . El 50 por ciento y el 43 por ciento de las semillas de los dos eventos de plantas transgénicas diferentes germinaron, comparándose con las mismas semillas transgénicas tratadas con agua, mientras que el 17 por ciento del control de tipo silvestre germinó comparándose con las mismas semillas tratadas con agua. 2. Ensayo de Geminación de Resistencia Fungal de Maíz : El inoculo se produce a Partir de cultivos de F. graminearum haciéndose crecer en agar de frijol mungo (hecho con licor de frijoles mungos hervidos) bajo ciclos de 12 horas de luz y oscuridad alternadas a 25°C. Las esporas se cosechan inundando primero la placa " con agua estéril, y luego raspando la placa utilizando una varilla de vidrio. La solución se recolecta, y la concentración de esporas se ajusta a 1 x 106 esporas/mililitro con agua estéril doblemente destilada en el día de la inoculación^ La tierra consistente en una mezcla esterilizada de tierra, turba, y vermiculita, se inocula con 1 mililitro de solución de esporas/litro de tierra en planos de 5 litros, y la tierra inoculada se mezcla en una mezcladora de cemento durante 2 minutos por carga. Los tratamientos de control consisten en tierra no infestada. Los planos se plantan con 30 granos de cada una de las semillas transgénicas de la invención o del control de tipo silvestre, y se incuban en cámaras de crecimiento mantenidas a 12.7°C (55°F) bajo condiciones de tierra semisaturada durante hasta 4 semanas. Los niveles de luz son bajo oscuridad de 24 lloras para los 14 días después de plantarse, y luz de 12 horas de 15 a 24 días después de plantarse. Se agregan estacas marcadas a los planos, se mueven los planos a la cámara de crecimiento, y se eleatorizan. Las registros de plantas se inician tan pronto como empieza el surgimiento, y se realizan diariamente o cada tercer día, hasta que ya no hay cambios en el surgimiento de las plantas.

Se determinan los síntomas de decoloración visual y empapamiento del surgimiento de la plántula, y se utilizan para caracterizar el grado de resistencia de la planta, comparándose con los controles de tipo silvestre. Se seleccionan las plantas que tienen menos decoloración visual y/o empapamiento del surgimiento de la plántula que el control de tipo silvestre.

EJEMPLO 9: Ensayo de Resistencia Fungal A. Prueba de plantas de trigo transgénicas Se ocasiona marchitamiento de testa o escara de testa de trigo mediante Fusari um graminearum (teleomorfo: Gibberella zeae) . Los cultivos de F. graminearum se hacen crecer en un medio de agar V-8 (hecho con jugo V-8) , o en agar de frijol mungo (hecho con licor de frijoles ungo hervidos) bajo ciclos de 12 horas alternadas de luz y oscuridad a 25°C. Las esporas se cosechan inundando primero la placa con agua estéril, y luego raspando la placa utilizando una varilla de vidrio. La solución se recolecta, y se ajusta la concentración de esporas a 5 x 104 esporas/mililitro con agua estéril doblemente destilada en el día de la inoculación. Las plantas transgénicas obtenidas como se describe en el Ejemplo 2 anterior, y las plantas de control, se pueden hacer crecer en el invernadero hasta la antesis o entestamiento, se inoculan las testas mediante la inyección de aproximadamente 20 microlitros (aproximadamente 1,000 esporas) de inoculo entre la lema y la palea de un florete cerca de la parte media de cada testa. Algunas testas se dejan sin inocular, o se inoculan con agua estéril como controles. Luego se mueven las plantas a una cámara de crecimiento, y se incuban bajo una alta humedad durante hasta 21 días, o las plantas primero se incuban en una cámara de niebla durante 72 horas a 18.3°C-21.1°C (65 a 70 °F) , y luego se incuban en el invernadero durante 18 días adicionales . Las plantas transgénicas de la invención y la planta de control también se pueden cultivar en el campo, en donde las testas se inoculan mediante rociado. La enfermedad se evalúa contando el número de espiguillas sintomáticas y asintomáticas en cada testa inoculada, sobre un número representativo de testas transgénicas y testas de control de tipo silvestre, y a partir de esto calculando el porcentaje de espiguillas en cada testa que son sintomáticas. Los síntomas consisten en blanqueamiento prematuro, comparándose con las plantas de control, y algunos casos necrosis de las espiguillas. Se seleccionan las plantas que tengan menos espiguillas sintomáticas que el control de tipo silvestre.

Seis diferentes plantas transgénicas que tenían diferentes números de copias de la SEC ID NO. 1, y diferentes números de sitios de inserción de acuerdo con los datos Southern, tuvieron un porcentaje promedio de espiguillas sintomáticas por testa que fue del 10.40 por ciento al 31.20 por ciento, comparándose con el 44.75 por ciento para el control de tipo silvestre, en donde las plantas transgénicas y los controles se incuban en el invernadero como se describió anteriormente. Estas mismas plantas transgénicas tuvieron actividades enzimáticas, medidas como se describe en el Ejemplo 6 anterior, de 0.874 a 29.1 nanomoles/microgramo/15 minutos.

B. Prueba de plantas de maíz transgénicas Ensayo de putrefacción de mazorca de maíz La putrefacción de la mazorca de maíz es ocasionada por Fusari um graminearum (teleomorfo: Gibberella zeae) . Los cultivos de F. graminearum se cultivan en un medio de agar V-8 (hecho con jugo V-8) bajo ciclos alternados de 12 horas de luz y oscuridad a-25°C. Las esporas se cosechan inundando primero la placa con agua estéril, y luego raspando la placa utilizando una varilla de vidrio. La solución se recolecta, y la concentración de esporas se ajusta a 5 x 105 esporas/mililitro con agua estéril doblemente destilada en el día de la inoculación.

Las plantas transgénicas y las plantas de control se cultivan en el invernadero o en el campo. Cuando se cultivan en el invernadero, las plantas transgénicas y de control se mantienen en el invernadero hasta 4 a 7 días después del surgimiento de la seda, y luego se mueven hasta una cámara de crecimiento, en donde se introducen 2 mililitros de suspensión de esporas en el canal de la seda (adentro de la cavidad de la cascara y arriba de la mazorca) . Esto se realiza utilizando una aguja hipodérmica de acero inoxidable calibre 18 conectada a una gran jeringa. En adición a las inoculaciones del canal de seda, también se utiliza un método de inoculación del grano para ensayar la resistencia a las enfermedades. La inoculación del grano implica la introducción de la suspensión de esporas (aproximadamente 0.4 mililitros) en un grupo de 4 granos, a través de múltiples inyecciones con una aguja calibre 18 conectada a una jeringa. La enfermedad se evalúa mediante inspección visual de las mazorcas cosechadas de 5 a 7 semanas después de la inoculación, para determinar los granos visiblemente infectados. La escala de evaluación de la enfermedad para las mazorcas con cascara se basa en una estimación visual del porcentaje de granos visiblemente infectados en una mazorca, como sigue: 1 es el 0 por ciento; 2 es del 1 al 3 por ciento; 3 es del 4 al 10 por ciento; 4 es del 11 al 25 por ciento; 5 es del 26 al 50 por ciento; 6 es del 51 al 75 por ciento; 7 es del 76 al 100 por ciento. Se seleccionan las plantas de maíz que tengan un porcentaje más bajo de granos visiblemente infectados, comparándose con el control de tipo silvestre.

EJEMPLO 10 : Ensayo de Contaminación con Micotoxina Se preparan muestras para el análisis de concentración de micotoxina como sigue. Se recolectan semillas de plantas transgénicas de la invención y del control de tipo silvestre, se pesan, y se juntan. Cuando se está ensayando la semilla de trigo, se recolecta la semilla de trigo de las testas de las mismas plantas transgénicas de la invención, y se pesan y se juntan. Cuando se está ensayando el maíz transgénico, las mazorcas de maíz se secan para bajar los niveles de humedad, se pelan las mazorcas, y los granos de las mazorcas de la misma planta transgénica se pesan y se juntan. Cada muestra de semilla o grano se mezcla completamente para promover una distribución aleatoria de las semillas. Se muelen 50 gramos de muestra de semillas o granos hasta un polvo fino en un molino (por ejemplo, molinos ultra-centrifugo Retsch tipo ZM1, Brinkmanlnstruments, Inc., Rexdale, Ontario, Molino Romer Serie II, Union, Missouri, USA) . Luego se determina la concentración de la micotoxina de interés, tal como DON, utilizando las pruebas comercialmente disponibles, tales como el sistema de prueba de micotoxina DONtest TAGMR (VICAM, LP, 313 Pleasant Street, Watertown, MA 02472) o se analiza por una compañía de análisis comercial (por ejemplo Romer Labs, Inc, Union, Missouri, USA o Trilogy Analytical Laboratory, Inc., Beaufort, Missouri, USA). Se siguen las instrucciones del fabricante para todos los aspectos del análisis. Para el sistema de prueba de micotoxina DONtest TAG^J se conduce una medición fluorométrica final para DON. Se seleccionan las plantas que producen semillas o granos que tienen menos micotoxina, tal como DON, que el control de tipo silvestre.

EJEMPLO 11 : Uso del polinucleótido de acuerdo con la SEC ID NO. 1 como un marcador seleccionable A. Marcador Seleccionable en Células Fúngales. Se transforma Ashbya gossypi utilizando técnicas materias de transformación fungal convencionales, con una construcción de ADN que comprende un polinucleótido que tiene la secuencia de la SEC ID NO. 1 operativamente enlazada al promotor de galactosidasa. Las células transformadas crecieron en el medio que comprendía DAS en una concentración de 1.56 nanogramos/mililitro a 196 picogramos/mililitro, mientras que el tipo silvestre no transformado no creció. B. Marcador Seleccionable en Células de Planta.

Las semillas de plantas Arabidopsis transformadas de acuerdo al Ejemplo 3 anterior pero aún sin - someterse a selección se ponen en placas en medio de agarosa al 1 por ciento que contiene DAS del 0.5 o 10 microgramos/mililitros. Después de la incubación en un cuarto de cultivo a 22 °C con 16 horas de luz y 18 horas de oscuridad durante 2 semanas, son transplantadas las plantas mayores sin crecimiento desde una placa DAS, y un número correspondiente es transplantado desde la placa control. Las hojas de las plantas Arabidopsis transplantadas desde la placa de 5 microgramos/mililitros, se ensayan después de la actividad enzimática en un periodo de crecimiento de 2 semanas, y muestran 11 de 11 plantas sin crecer en donde la actividad enzimática es medida mediante el Ejemplo 6 mientras 9 de 10 plantas no se seleccionan por DAS donde en el mismo ensayo son negativas. Una planta no seleccionada que fue enzimáticamente activa fue mucho menos activa que cualquiera de las plantas seleccionada de DAS ensayadas . Las modalidades anteriormente dadas a conocer son ilustrativas. Esta descripción de la invención pondrá a un experto en la materia en posesión de muchas variaciones de la invención. Se pretende que todas las variaciones obvias y predecibles sean comprendidas por las reivindicaciones adjuntas .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Hohn, T. Salmerón, J. Jeters, C. Kendra, D. Reinders, J. Kuznia, R. Diil-Mackey, R. <120> PLANTA TRANSGÉNICOSA Y MÉTODOS <130> lista de secuencias <140> <141> <160> 11 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1403 <212> 7ADN <213> Fusarium sporotrichioides <400> 1 atcaaaatgg ccgcaaccag cagcacaacc agccagtctt ttgacataga gctcgacatc 60 atcggccagc aaccgcctct tctttcaatc tacacccaga tcagtctcgt ttaccccgtc 12 tctgatccct cccagtatcc caccatcgtc agcacccttg aggaaggcct aaaacgcctc 18 tctcaaacct tcccatgggt cgcgggccag gtcaagaccg agggcatcag ccaaggaaac 24 acaggaactt ccaagatcat tccatatgag gagacacccc gtcttgtggt gaaagacctc 30 cgtgatgatt cctcagcgcc aacgatcgag gggttgagaa aggcgggttt ccccttagag 36 atgtttgacg agaacgtcgt cgctccgagg aagacattag ctatcggacc tggcaatggc 42 cccaacgacc cgaagcctgt gttgctattg cagctcaact tcattaaggg cggactcatt 48 ctcaccgtca acggacaaca tggtgctatg gacatgacag gacaagatgc aattattcgt 54 cttctctcca aggcgtgccg caacgaatca ttcaccgagg aggaaatctc ggccatgaac 60 ctcgatcgca agacggtagt ccctctcctt gaaaactaca aagttggtcc tgagctagac 66 caccagatcg ccaaacctgc gcctgctggc gacgctccac ccgcaccggc caaggcaagc 72 tgggcgttct .tttcattcac tcccaaggcc ctctcggagc tgaaagacgc agccacaaag 78 actcttgacg cgtcgtccaa gtttgtgtca actgatgatg ctctttcggc gtttatctgg 84 caatcaacct cgcgcgtacg tctcgcaaga ttggatgctt ccacacctac tgaattctgc 90 cgcgctgtcg acatgcgggg cccaatgggc gtatcaagca catacccagg ccttcttcaa 96 aacatgacct accatgactc gaccgtcgcc gaaatcgcca acgaaccact tggcgcaaca 10 gcatcacgcc tgcgctcgga actcaacagt gatcgtttgc gcagacgaac acaagctttg 10 gcgacgtaca tgcatggcct gcctgacaag tcgagcgtct ccctgaccgc cgatgcgaat 11 ccgtcaagca gcatcatgct gagttcctgg gccaaggtgg gatgctggga gtatgacttt 12 gggtttggac tgggtaagcc tgagagtgtg agaagacctc gctttgaacc ttttgagagt 12 ttgatgtact ttatgcccaa gaagcctgat ggggagttta cggcgtccat ttctctgagg 13 gatgaggata tggagagact aaaggcggat gaggagtgga caaagtacgc aaagtatatt 13 gggtagatag tttactagac tac 14 <210> 2. <211> 459 <212> PRT <213> Fusarium sporotrichioides <400> 2 Met Ala Ala Thr Ser Ser Th Ser Ser Gln Ser Phe Asp lie Glu Leu 1 5 10 15 Asp lie lie Gly Gln Gln Pro Pro Leu Leu Ser lie -Tyr Thr Gln lie 20 " 25 30 Ser Leu Val Tyr Pro Val Ser Asp Pro Ser Gln Tyr Pro Thr lie Val 35 40 55 Ser Thr Leu Glu Glu Gly Leu Lys Arg Leu Ser Gln Thr Phe Pro Trp 50 55 50 Val Ala Gly Gln Val Lys Thr Glu Gly lie Ser Glu Gly Asn Thr Gly 65 70 75 80 Thr Ser Lys lie lie Pro Tyr Glu Glu Thr Pro Arg Leu Val Val Lys 85 90 95 Asp Leu Arg Asp Asp Ser Ser Ala Pro Thr lie Glu Gly Leu Arg Lys 100 105 110 Ala Gly Phe Pro Leu Glu Met Phe Asp Glu Asn Val Val Ala Pro Arg 115 120 125 Lys Thr Leu Ala lie Gly Pro Gly Asn Gly Pro Asn Asp Pro Lys Pro 130 135 140 Val Leu Leu Leu Gln Leu Asn Phe lie Lys Gly Gly Leu lie Leu Thr 145 150 155 Val Asn Gly Gln His Gly Ala Met Asp Met Thr Gly Gln Asp Ala lie 165 170 175 lie Arg Leu Leu Ser Lys Ala Cys Arg Asn Glu Ser Phe Thr Glu Glu 180 185 ^ 190 Glu lie Ser Ala Met Asn Leu Asp Arg Lys Thr Val Val Pro Leu Leu 195 200 205 Glu Asn Tyr Lys Val Gly Pro Glu Leu Asp His Gln lie Ala Lys Pro 210 213 220 Ala Pro Ala Gly Asp Ala Pro Pro Ala Pro Ala Lys Ala Ser Trp Ala 225 230 235 240 Phe Phe Ser Phe Thr Pro Lys Ala Leu Ser Glu Leu Lys Asp Ala Ala 245 250 255 Thr Lys Thr Leu Asp Ala Ser Ser Lys Phe Val Ser Thr Asp Asp Ala 260 265 270 Leu Ser Ala Phe lie Trp Gln Ser Thr Ser Arg Val Arg Leu Ala Arg 275 280 285 Leu Asp Ala Ser Thr Pro Thr Glu Phe Cys Arg Ala Val Asp Met Arg 290 295 300 Gly Pro Met Gly Val Ser Ser Thr Tyr Pro Gly Leu Leu Gln Asp Met 305 310 315 320 Thr Tyr His Asp Ser Thr Val Ala Glu lie Ala Asn Glu Pro Leu Gly 325 330 335 Ala Thr Ala Ser Arg Leu Arg Ser Glu Leu Asn Ser Asp Arg Leu Arg 340 345 350 Arg Arg Thr Gln Ala Leu Ala Thr Tyr Met His Gly Leu Pro Asp Lys 355 360 365 Ser Ser Val Ser Leu Thr Ala Asp Ala Asn Pro Ser Ser Ser lie Met 370 375 380 Leu Ser Ser Trp Ala Lys Val Gly Cys Trp Glu Tyr Asp Phe Gly Phe 385 390 395 400 Gly Leu Gly Lys Pro Glu Ser Val Arg Arg Pro Arg Phe Glu Pro Phe 405 410 415 Glu Ser Leu Met Tyr Phe Met Pro Lys Lys Pro Asp Gly Glu Phe Thr 420 425 430 Ala Ser lie Ser Leu Arg Asp Glu Asp Met Glu Arg Leu Lys Ala Asp 435 440 445 Glu Glu Trp Thr Lys Tyr Ala Lys Tyr lie Gly 450 455 <210> 3 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial : cebador de ADN <400> 3 acgaatcatt caccgaggag 20 <210> 4 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial : cebador de ADN <400> 4 ctcacactct caggcttacc 20 <210> 5 <211> 1356 <212> ADN <213> Fusarium graminearum <400> 5 atggctttca agatacagct cgacaccctc ggccagctac caggcctcct ttcgatctac 6 acccaaatca g ctcctcta ccccgtctct gattcctctc aatatc cac tattgtcagc 120 accttcgagc aaggtcptaa gcgcttctcc gaagccgccc catgggtcgc aggccaggtc 18C aaagccgagg gcattagcga gggasacaca ggaactccct ttatc tccc ttttg=ggac 240 gttcctcgtg ttg agtgaa agacctccgc gatgatcctr cagcgcccac gatcgagggt 300 atgagaaa?g cgggataccc tatggcgatg tttgacgaga acatcatcgc gccaaggaag 360 acgttaccta ttggacctgg tactggcccc gacgacccaa agcctgtaat tctattgcag 420 czcaa.czt.ce. tcaagg cgg actcatcctc actgccaacg gacagcacgg tgctatsgat 480 stggcaggcc aagatgcggt gatccgtcta ctctccaagg cgtgccgtaa cgacccattc 540 accgaagagg aaatgacggc catgaacctc gatcgcaaga cgatagttcc ttaccttgaa 600 aactatacga ttggccccga ggtagatcat cagattgtca aagctgatgt agctggtggt 660 gacgctg c tcacgccggt cagtgcaagc tgggcgttct tcacattcag ccccaaggcc 720 atgtcagagc tcaaggatgc tgceaccaag act ttgacg catcaacaaa ttcgtgccg 78 actgacgatg ctct- tcgac gttcaectgg aaatcggcct ctcgcg gcg a 84 atcgatggct ctgcacctac cgagttctgc cgtgctg g atgctcgacc ggcaa-gqgr 90 gtccegaaca actacccag c t-tc t—aa aaca cgacct; eccacaactc gacca cgg 6 gaaatcgcca acgag cac cggcg aece gcatcacgc a gacc.c 1C gcgagcatgc gccagcgaac aagaggt etc gcgac acc tgcac acaa CCC CßC üG :n -ccaacg at ccctgacccc tgatg gga rca tacca gcg ca s t II gccaaggtgg gactctggga tacgacttt gggctcggac tgggtaag c 12 agacgg csa tctt tgagcc tgttgagagc trgacgtact ttatgeccaa gaagcctgat 1- ggcgag tct grgcggcg t tcctctgagg gatgaggata tgsaccsatt gaaggcgsar 13 aaggagtgga ccaagtatgc g agtacgrt ggttag 12 <210> 6 <211> 451 <212> PRT <213> Fusarium graminearum <400> 6 Met Ala Phe Lys lie Gln Leu Asp Thr Leu Gly Gln Leu Pro Gly Leu 1 5 10 15 Leu Ser lie Tyr Thr Gln lie Ser Leu Leu Tyr Pro Val Ser Asp Ser 20 25 30 Ser Gln Tyr Pro Thr lie Val Ser Thr Phe Glu Gln Gly Leu Lys Arg 35 40 45 Phe Ser Glu Ala Val Pro Trp Val Ala Gly Gln Val Lys Ala Glu Gly 50 55 60 lie Ser Glu Gly Asn Thr Gly Thr Ser Phe lie Val Pro Phe Glu Asp 65 70 75 80 Val Pro Arg Val Val Val Lys Asp Leu Arg Asp Asp Pro Ser Ala Pro 85 90 95 Thr lie Glu Gly Met Arg Lys Ala Gly Tyr Pro Met Ala Met Phe Asp 100 105 110 Glu Asn lie lie Ala Pro Arg Lys Thr Leu Pro lie Gly Pro Gly Thr 115 120 125 Gly Pro Asp Asp Pro Lys Pro Val lie Leu Leu Gln Leu Asn Phe lie 130 135 140 Lys Gly Gly Leu lie Leu Thr Val Asn Gly Gln His Gly Ala Met Asp 145 150 155 160 Met Val Gly Gln Asp Ala Val lie Arg Leu Leu Ser Lys Ala Cys Arg 165 170 175 Asn Asp Pro Phe Thr Glu Glu Glu Met Thr Ala Met Asn Leu Asp Arg 180 185 190 Lys Thr lie Val Pro Tyr Leu Glu Asn Tyr Thr lie Gly Pro Glu Val 195 200 205 Asp His Gln lie Val Lys Ala Asp Val Ala Gly Gly Asp Ala Val Leu 210 215 - -220 Thr Pro Val Ser Ala Ser Trp Ala Phe Phe Thr Phe Ser Pro Lys Ala 225 230 235 240 Met Ser Glu Leu Lys Asp Ala Ala Thr Lys Thr Leu Asp Ala Ser Thr 245 250 255 Lys Phe Val Ser Thr Asp Asp Ala Leu Ser Ala Phe lie Trp Lys Ser 260 265 270 Ala Ser Arg Val Arg Leu Glu Arg lie Asp Gly Ser Ala Pro Thr Glu 275 280 285 Phe Cys Arg Ala Val Asp Ala Arg Pro Ala Met Gly Val Ser Asn Asn 290 295 300 Tyr Pro Gly Leu Leu Gln Asn Met Thr Tyr His Asn Ser Thr lie Gly 305 310 315 320 Glu lie Ala Asn Glu Ser Leu Gly Ala Thr Ala Ser Arg Leu Arg Ser 325 - 330 335 Glu Leu Asp Pro Ala Ser Met Arg Gln Arg Thr Arg Gly Leu Ala Thr 340 . 345 350 Tyr Leu His Asn Asn Pro Asp Lys Ser Asn Val Ser Leu Thr Ala Asp 355 360 365 Ala Asp Pro Ser Thr Ser Val Met Leu Ser Ser Trp Ala Lys Val Gly 370 375 380 Leu Trp Asp Tyr Asp Phe Gly Leu Gly Leu Gly Lys Pro Glu Thr Val 385 390 395 400 Arg Arg Pro lie Phe Glu Pro Val Glu Ser Leu Met Tyr Phe Met Pro 405 410 415 Lys Lys Pro Asp Gly Glu Phe Cys Ala Ala Leu Ser Leu Arg Asp Glu 420 425 430 Asp Met Asp Arg Leu Lys Ala Asp Lys Glu Trp Thr Lys Tyr Ala Gln 435 440 445 Tyr Val Gly 450 <210> 7 <211> 1425 <212> ADN <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 7 atgtttagag tcaagatcat ctctcagaaa cgtacaaaaa gtgtacagat gctagaaaac 60 gatcaacttg a-attttggg acaacaacct tcgctataca aactatacac tcaaatatgc 120 tctatc acc gtgtaccaga tcct ctgct catgaccate. tcgtaaatrac cttaacaaga 180 ggacttgaaa ca tggctaa aaatttccag tggctagcag gaaa gtcgt aaatgaaggt 240 gctgacgaag gtaacactgg tacctacaga a tgtcccgt cagacaaaat tccacctatc 300 grccaagatc ttcgagaaga tctgtccgcc ccaacaetgg attcgcttga aaaagc gac 360 tttcctatct acatgttaga cgaaaagact tttgcgcctt gcatgactat caatccacct 420 ggaaacacta taggtatggc cgccaagagt gggcctgtat ttgcagttca agcaaacttt 480 atctccggcg gcctcgtrtt aactartgtc gggcagcaca atattatgga ta aacagga 540 caggaaagta tcatcaactt gctcaataaa tcttgccacc aaaaaccttt ctctgatgaa 600 gaactgctca ttggaaatat ag aaaagc aaatctattc 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He Ser Gln Lys Arg Thr Lys Ser Val Gln 1 5 10 15 Met Leu Glu Asn Asp Gln Leu Asp He Leu Gly Gln Gln Pro Ser Leu 20 25 30 Tyr Lys Leu Tyr Thr Gln He Cys Ser lie Tyr Arg Val Pro Asp Pro 35 40 45 Ser Ala His Asp His He Val Asn Thr Leu Thr Arg Gly Leu Glu Thr 50 55 60 Leu Ala Lys Asn Phe Gln Trp Leu Ala Gly Asn Val Val Asn Glu Gly 65 70 75 80 Ala Asp Glu Gly Asn Thr Gly Thr Tyr Arg He Val Pro Ser Asp Lys 85 90 95 He Pro Leu He Val Gln Asp Leu Arg Glu Asp Leu Ser Ala Pro Thr 100 105 110 Met Asp Ser Leu Glu Lys Ala Asp Phe Pro He Tyr Met Leu Asp Glu 115 120 125 Lys Thr Phe Ala Pro Cys Met Thr He Asn Pro Pro Gly Asn Thr He 130 135 140 Gly Met Ala Ala Lys Ser Gly Pro Val Phe Ala Val Gln Ala Asn Phe 145 150 155 160 He Ser Gly Gly Leu Val Leu Thr He Val Gly Gln His Asn He Met 165 170 175 Asp He Thr Gly Gln Glu Ser He He Asn Leu Leu Asn Lys Ser Cys 180 185 190 His Gln Lys Pro Phe Ser Asp Glu Glu Leu Leu He Gly Asn He Asp 195 200 . 205 Lys Ser Lys Ser He Pro Leu Phe Asp Glu Thr Trp Glu Pro Asp Thr 210 215 220 Thr Leu Val His Glu He Val Glu Thr Ser Arg Asn Thr Ser Gly Glu 225 - 230 235 . " 240 Glu Lys Glu Gln Ser Cys Ser Ser Asn Ser Thr Trp Ala Tyr Val Glu 245 250 255 Phe Ser Ala He Ser Leu Gln Asn Leu Arg He Leu Ala Met Gln Thr 260 265 270 Cys Thr Ser Gly Thr Lys Phe Val Ser Thr Asp Asp He Val Thr Ala 275 280 285 Phe He Trp Lys Ser Val Ser Arg Ala Arg Leu Ser Arg Leu Lys Pro 290 295 300 Glu Thr Lys Ser Asn Leu Gly Arg Ala Val Asp Val Arg Lys Arg Leu 305 - 310' ~ - 315 320 Gly Leu Pro Glu Thr Tyr Pro Gly Leu Leu Val Asn Met Thr Phe Asp 325 330 335 Thr Gly Ser Leu Lys Ser Leu Asp His Lys Ser Leu Gly Val Leu Ala 340 345 350 Ser Gln He Arg Arg Lys Leu Asp Pro Lys Val Phe Asp Leu Ala Tyr 355 360 365 Asn Thr Cys Ala Leu Ala Thr Leu Leu Ser Arg Cys Pro Asp Lys Thr 370 375 380 Lys Val Ser He Pro Gln Pro He Asp Thr Leu Ser Gly He Met Val 385 390 395 400 Ser Ser Trp Ala Lys Val Ser Leu Tyr Asp Val Asp Phe Asn Leu Gly 405 410 415 Leu Gly Lys Pro Lys Ser Val Arg Arg Pro Arg Phe He Ser Leu Gly 420 425 430 Ser Leu He Tyr Phe Met Pro Arg Ser Ser Arg Gly Glu Met Val Val 435 440 445 Ala Leu Cys Leu Arg Asp Lys Asp Trp Glu Cys Leu Asn Ala Asp Lys 450 455 460 Glu Trp Thr Asn Tyr Ala Thr His He Gly 465 470 <210> 9 <211> 6111 <212> ADN <213> Plásmido <400> 9 aagcttgcat gcctgcagtg cagcgtgacc cggtcgtgcc cctctctaga gataatgagc 60 attgcatgtc taagttataa aaaattacca catattt ttt ttgtcacact tgt tgaagt 12 gcagtttatc tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat ataatctata 18 gtactacaat aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag acatggtcta 24 aaggacaatt gagtattttg acaacaggac tctacagttt tatcttttta gtgtgcatgt 30 gttctccttt ttttttgcaa atagcttcac ctatataata cttcatccat tttattagta 36 catccattta gggtttaggg ttaatggctt ttatagacta atttttttag tacatctatt 42 ttattctatt ttagcc-cta aattaagaaa actaaaactc tattttagtt tttttattta 48 acaatecaga eataaaaeag aaeaaaaeea agtgactaaa aateaaacaa a a ccee?£i 5 agaaattaaa aaaaceaagg aaacateeee ctegteecga cragacaacg ccagccesee 60 '.. aaacgccgtc gacgagecea acggacacca accagcgaac cagcagcgec gcgecgg cc ? 6 aagcgaagca gacggcacgg catcecrgec gccgccectg gaccc-recec aaga er.rcO 720 ctccaccget ggacttgctc cgccgtcggc ae cagaaat egcgcggcgc agcggcagar B-.1 gxgagccggc acggca gcg gccecctcct ccececacgg cacccz agc r.acgcrír?a'3- 84 L' ecccceccca cc cecceec gceeecccee ccecgcccgc — caacasar sgacacccc: 7 ." zccaca-ccz ceeeccccaa ccecgegetg eecggagcgc a zacacacac aac agarce í'éC cccccaaaec cacccgecgg cacceccgce tcaaggeacg ccgcecgecc tCKCCCCCC 1022 ccccccccta ccttctceag aecggccerc cggtccaego t agggcc g seagLLctac íoeo ecegetcae gteegcgeta gatccgtgtt tgcgttagac ccgcgcegct agcgetcgca 1140 cacggaegcg acctgeacgt cagacacgt e ctgattgcta acetgccagt g et ectet 1200 gggsaatcce gggatgg tc tagccgeecc gcagacggga ecgaceecae ga ct etee 12ÓC gececgetgc atagggettg gtttgcccet tecceetaee tcaataeatc ccgeccacei 1320 gtTiegerggg ecaeceettc aegcete ee tegccetggc tgtgacgatg cggrceggce 13S0 gggcggrcgc tceagaecgg agtacaacec tgt ecaaac tacccggtgg ac c caCtaat 1440 eetggacccg taesegtgeg ccaeacaea: rcatagteac gaaeega=ca tsaeggstrTp 15 óaaeatcgac ceaggaeagg ea e a?. ú >. gacgcgggee ecactgatgc 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Claims (36)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una célula de planta que comprende un polinucleótido heterólogo que codifica un producto genético que se expresa en la célula de planta, caracterizada porque el producto genético tiene actividad de resistencia al tricoteceno. 2. Una planta que comprende una célula de planta de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la planta es resistente a un tricoteceno. 3. La planta de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la planta es resistente a un tricoteceno que comprende un grupo hidroxilo de C-
3. 3.
4. 4. La planta de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la planta es resistente a un hongo que produce un tricoteceno, preferiblemente un tricoteceno que comprende un grupo hidroxilo de C-3.
5. 5. La planta de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la planta es resistente a Fusari um, preferiblemente a Fusari um graminearum.
6. 6. La planta de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el polinucleótido heterólogo es un polinucleótido microbiano, preferiblemente una levadura o un polinucleótido fungal.
7. 7. La planta de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el polinucleótido fungal es un polinucleótido de Fusari um, preferiblemente es un polinucleótido Fusari um graminearum o Fusarium sporo tri chi oi des .
8. 8. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el polinucleótido heterólogo comprende una secuencia sustancialmente similar a la SEC ID NO. 1, 5 ó 7.
9. 9. La planta de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el polinucleótido heterólogo comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO. : 1, 5 ó 7.
10. 10. La planta de conformidad con la reivindicación 8, comprende un polinucleótido heterólogo, caracterizada porque comprende de cuando menos una porción consecutiva de 80 pares de bases en una secuencia idéntica a una porción consecutiva de 80 pares de bases estipulada en la SEC ID NO: 1, 5 ó 7, preferiblemente de cuando menos una porción consecutiva de 50 pares de bases en una secuencia idéntica a una porción consecutiva de 50 pares de bases estipulada en la SEC ID NO: 1, 5 ó 7, y más preferiblemente de cuando menos una porción consecutiva de 21 pares de bases en una secuencia idéntica a una porción consecutiva de 21 pares de bases estipulada en la SEC ID NO: 1, 5 ó 7, y más preferiblemente una porción consecutiva de 18 pares de bases en una secuencia idéntica a una porción consecutiva de 18 pares de bases estipulada en la SEC ID NO. 1, 5 ó 7.
11. 11. La planta de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el polinucleótido heterólogo comprende una porción consecutiva de 18 pares de bases en una secuencia idéntica a una porción de 18- pares de bases consecutiva estipulada en las SEC ID NO. 1, 5, ó 7.
12. 12. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque el tricoteceno se selecciona a partir del grupo que consiste en toxina T-2, toxina HT-2, isotricodermol, DAS, 3-desacetilcalonectrina, 3, 15-didesacetilcalonectrina, escirpentriol, neosolaniol; tipo B: 15-acetildesoxinivalenol, nivalenol, 4-acetilnivalenol (fusarenona-X) , 4, 15-diacetilnivalenol, 4,7,15-acetilnivalenol, y DON, pero preferiblemente DON o DAS.
13. 13. La planta de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el producto genético es codificado por un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 6 a 9.
14. 14. La planta de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el producto genético es una proteína que da a una planta resistente al tricoteceno, preferiblemente una acetiltransferasa, pero especialmente una 3-0-acetiltransferasa. -
15. 15. La planta de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el producto genético es un polipéptido que comprende una secuencia sustancialmente similar a la SEC ID NO: 2, 6 u 8.
16. 16. La planta de conformidad con cualquiera de las rei-vindicaciones 2 a 15, caracterizada porque la planta es una planta de trigo, maiz, cebada o arroz.
17. 17. Una semilla de planta de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 2 a 15.
18. 18. Un método para producir una planta resistente al tricoteceno caracterizado porque comprende los pasos de: a) transformar una célula de planta con un gene heterólogo que codifica un producto genético, en donde el producto genético aumenta la resistencia a un tricoteceno; b) expresar el producto genético a un nivel biológico significativo c) regenera la célula de planta en una planta; y d) seleccionar una planta con resistencia incrementada a un tricoteceno.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque adicionalmente comprende la etapa de seleccionar una planta en la cual crece el hongo, en donde se reduce el hongo que produce un factor de virulencia de tricoteceno.
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el hongo es del género Fusari um.
21. 21. Un método para prevenir la contaminación de una planta con micotoxina, incluyendo la semilla de una planta, caracterizado porque comprende hacer crecer la planta de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16, o una planta producida mediante un método de conformidad con las reivindicaciones 18 a 20, preferiblemente en un área con infestación fungal moderada a severa.
22. 22. Un método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la planta es una planta de cultivo. - ~~
23. 23. Un método para reducir y/o prevenir el desarrollo de un hongo, preferiblemente un hongo del género Fusari um, en una planta producida mediante un tricoteceno, preferiblemente un tricoteceno que comprende un grupo hidroxilo C-3, caracterizado porque comprende hacer crecer la planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16, o una planta producida por un método de conformidad con las reivindicaciones 18 a 20, preferiblemente en un área con infestación fungal moderada a severa.
24. 24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24, caracterizado porque la planta es una planta de cultivo.
25. 25. Un método para producir una planta resistente a hongos caracterizado porque comprende (a) transformar una célula de planta con un gene heterólogo que codifica un producto genético, en donde el producto genético incrementa la resistencia a un tricotecepo; (b) expresar el producto genético en un nivel biológicamente significativo; (c) regenerar la célula de planta en la planta; y (d) seleccionar una planta con mayor resistencia a un tricoteceno; y (e) opcionalmente, auto-cruzar o cruzar externamente la planta obtenida en la etapa (d) .
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el hongo es del género Fusari um .
27. 27. Un método para producir semillas, en donde la planta que crece de las semillas es resistente a los hongos, caracterizado porque comprende cruzar o auto-cruzar la planta de conformidad con cualquiera^ de las reivindicaciones 2 a 16 o una planta producida por un método de conformidad con las reivindicaciones 25 a 26 y se recolectan las semillas.
28. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la semilla es resistente a un hongo del género Fusarium.
29. 29. Un método para seleccionar las células hospedera transformadas, caracterizado porque el método comprende : transformar una célula hospedera con una construcción de ácido nucleico que codifique una 3-0-acetiltransferasa de tricoteceno, hacer crecer la célula hospedera transformada en la presencia de un tricoteceno.
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la célula hospedera es una célula de planta.
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, en donde la célula hospedera es una célula hospedera microbiana.
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la célula hospedera microbiana es una célula hospedera fungal
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el tricoteceno se selecciona a partir del grupo que consiste en toxina 1-2, toxina HT-2, isotricodermol, DAS, 3-desacetilcalonectrina, 3, 15-didesacetilcalonectrina, escirpentriol, neosolaniol; tipo B: 15-acetildeoxinivalenol, nivalenol, 4-acetilnivalenol (fusarenona-X) , 4, 15-diacetilnivalenol, 4, 7, 15-acetilnivalenol, y DON.
34. 34. Una planta resistente al tricoteceno obtenible mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20.
35. 35. Una planta resistente a fungal obtenible mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 26.
36. 36. Una semilla de planta obtenible mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 28.