CN117757769A - 一种CsMEK5基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用和转基因植株 - Google Patents
一种CsMEK5基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用和转基因植株 Download PDFInfo
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Abstract
本申请提供了一种CsMEK5基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用，所述CsMEK5基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述CsMEK5基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明CsMEK5基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用，通过克隆柑橘CsMEK5基因编码序列，进行超量表达载体构建，然后转化柑橘，得到的转基因植株溃疡病病斑面积和病情指数与野生型相比最大下降率为63％和64％，能够显著的减轻溃疡病的发病程度，减小病斑面积，通过超量表达CsMEK5基因可大大提高植株对细菌性溃疡病的抗性，这对于柑橘的抗细菌性溃疡病育种具有重大的应用价值。
Description
技术领域
本申请属于分子生物学技术领域，更具体地说，是涉及一种CsMEK5基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用和转基因植株。
背景技术
柑橘是我国南方第一大水果，也是全球重要的经济作物。然而，柑橘细菌性溃疡病(Citrus bacterial canker，CBC)却严重阻碍了柑橘产业的健康发展(胡军华等，2015)。柑橘溃疡病是由黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonascitrisubsp.citri，Xcc)引起，它起源于印度、爪哇等地(胡军华等，2015)。我国福建、湖南、广东等柑橘主产区受柑橘溃疡病侵害较为严重。溃疡病菌主要侵染柑橘叶片、枝梢、果实等，其中苗木、幼树受害较为严重(何秀玲等，2007)。病树会出现落叶、枯梢、树势衰弱以及落果等现象，严重的影响了柑橘的产量和品质。受到柑橘溃疡病危害的芸香科植物有几十种，其中绝大部分为经济栽培品种。有研究发现甜橙最易感病，其次是酸橙和柚类(袁承东等，1997；李敏等，2013)。目前全世界已经有30多个国家和地区将柑橘细菌性溃疡病列为重要的植物检疫对象。
目前为控制柑橘溃疡病危害通常采取一种综合防治策略：其中以化学防治为主，生物防治为辅。但是由于化学防治措施对环境不友好，极易对环境造成污染，且需要投入大量的人力、物力，生物防治效果差，成本高，所以亟待通过培育抗病新品种来减少溃疡病带来的损失(陈力等，2008；朱雪梅等，2017)。在抗病育种方面一代代柑橘人进行了长期杂交育种，但由于杂交育种周期长使得育种效率低。随着分子生物学的兴起，人们开始从抗病基因工程方向对病原菌本身和植物的抗病防卫反应进行研究。基因工程手段也在抗溃疡病研究中进行了尝试(段敏杰等，2016；贾瑞瑞等，2017)，获得了一些对溃疡病有抗性的转基因材料。例如陈善春等获得了对柑橘溃疡病有抗性的转柞蚕抗菌肽D基因的锦橙、新会橙、脐橙株系(陈善春等，1996)。外源基因NLS，Chit42，Xa21和PthA在转移至冰糖橙，椪柑和甜橙后对柑橘溃疡病具有抗性(Mendes et al.，2010；Yanget al.，2011)。Li的研究发现CsBZIP40是响应柑橘溃疡病侵染的一个重要的转录因子，并且猜测是通过SA途径影响柑橘品种的抗性(Li et al.，2017)。CsLOB1基因作为溃疡病病原基因PthA的靶蛋白，被认为是是柑橘溃疡菌的感病因子，使得植物对溃疡病更为敏感(Li et al.，2014)，Peng等(2017)对柑橘溃疡病感病基因CsLOB1启动子进行CRISPR/Cas9靶向敲除从而获得了对柑橘溃疡病抗性提高的植株。
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase，MAPK)级联系统是真核生物细胞中高度保守的信号系统之一，参与了动植物细胞的生长、分裂、分化和胁迫响应等过程(Jonkeet al.，2002)，其细胞活性在生长因子、氧化应激和高渗条件下升高。MAPK级联通常由MAPK激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinasekinase)、MAPK激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MAPKK或MEK)及MAPK三种蛋白激酶组成且逐级磷酸化传递信号(Schaeffer&Weber 1999)。该通路不仅在生理过程以及氧化应激(Samuelet al.，2000)过程中作用明显，而且在生物和非生物胁迫(Jonaket al.，2004)过程中发挥着不可或缺的重要作用。其中，MAPKK位于MAPK级联的中间环节(Ta-Hsiang etal.，1999)目前为止已有很多研究者对MEK进行了大量研究，结果表明，MEK在植物生长发育及胁迫响应(生物胁迫与非生物胁迫)等过程中发挥重要作用。例如拟南芥MAPK级联(MEKK1-MEK4-5-MPK6)和WRKY转录因子被证明参与了先天性免疫，并在鞭毛蛋白受体FLS2的下游发挥作用(Yanget al.，2001)；对拟南芥MEK基因研究发现，AtMEK2和AtMEK1参与先天性免疫反应(Gaoet al.，2008)，AtMEK6激活侧根形成所需的AtMAPK13(Melikanet al.，2004；Zenget al.，2011)；AtMEK3被证明通过茉莉酸(JA)途径参与抗病(Takahashiet al.，2010)；AtMEK4和AtMEK5的激活参与了乙烯的生物合成、H2O2的合成和类似超敏反应(HR)样细胞的死亡，且AtMEK5的激活诱导细胞加速死亡需要乙烯传导(Ren et al.，2002，Liuetal.，2008)；在马铃薯中StMKK1通过负调控PAMP-触发免疫(PTI)和SA相关信号通路在抗病过程中发挥双重作用(Chenet al.，2021)。烟草NTMEK2组成型活性突变体的异位表达会诱导下游MAPK的激活，防御基因的表达和超敏反应样细胞的死亡(Asaiet al.，2002)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：现有预防柑橘溃疡病侵染的方法各自存在的上述问题。
本发明提供一种CsMEK5基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用，所述CsMEK5基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
作为一种可能的设计，所述CsMEK5基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
作为一种可能的设计，将所述CsMEK5基因进行克隆，构建超量表达载体；
将超量表达载体转化柑橘，得到溃疡病抗性提高的转基因植株。
作为一种可能的设计，所述克隆采用PCR扩增，正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
作为一种可能的设计，所述克隆具体为：
提取柑橘的总RNA，然后反转录为cDNA，最后采用高保真酶PCR扩增CsMEK5基因编码序列DNA片段。
作为一种可能的设计，所述构建超量表达载体具体为：
以带有CaMV 35S启动子的pNmGFPer为载体；其中：CaMV 35S启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
利用限制性内切酶对扩增后所得CsMEK5基因编码序列DNA片段，最后连接至采用相同限制性内切酶酶切的载体上。
作为一种可能的设计，所述应用还包括对所述转基因植株进行抗性评价。
作为一种可能的设计，所述抗性评价具体采用PCR扩增，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
作为一种可能的设计，在PCR扩增完成后还包括实时荧光定量PCR扩增进行CsMEK5基因表达量检测，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；优选地，荧光定量PCR扩增中的内参基因为柑橘Actin基因，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。
本发明的有益效果为：
本发明CsMEK5基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用，通过克隆柑橘CsMEK5基因编码序列，进行超量表达载体构建，然后转化柑橘，得到的转基因植株病斑面积和病情指数均显著低于WT对照组，病斑面积与野生型相比最多下降了63％，病情指数最高下降了64％，能够显著的减轻溃疡病的发病程度，减小病斑面积，通过超量表达CsMEK5基因可大大提高植株对细菌性溃疡病的抗性，这对于柑橘的抗细菌性溃疡病育种具有重大的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为CsMEK5基因所在位置的展示图；
图2为实施例中CsMEK5植物超量表达载体构建流程图；
图3为实施例中CsMEK5基因在柑橘基因组中PCR重组验证的电泳图；
图4为实施例中转基因植株中CsMEK5基因相对表达量分析图；
图5为实施例中转基因植株表型图；
图6为实施例中超量表达植株叶片接种溃疡病菌的10天后症状图；
图7为实施例中转基因柑橘叶片病斑大小统计图；
图8为实施例中转基因柑橘叶片发病程度(病情指数)统计图；
图9为实施例中工艺流程图。
具体实施方式
为了使本申请所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者间接在该另一个元件上。当一个元件被称为是“连接于”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或间接连接至该另一个元件上。
需要理解的是，术语“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本申请的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
实施例1
柑橘CsMEK5基因编码序列的克隆
1.RNA提取及cDNA合成
用RNA提取试剂盒(艾德莱，CAT：RN09)提取柑橘(晚锦橙)叶片总RNA，琼脂糖凝胶电泳验证RNA质量，浓度计测定其浓度。使用Recombinant DNase I合成cDNA(TAKARA)，cDNA于-20℃保存备用。
2.CsMEK5基因编码序列的PCR扩增
如图1所示，CsMEK5的位于1号染色体上，基因全长为1848bp，含有1个外显子。使用Pfam软件对CsMEK5的结构进行分析，发现CsMEK5编码380个氨基酸，含有一个由255个氨基酸残基组成的Pkinase蛋白结构域。
使用引物OE-F(SEQ ID No.3)和OE-R(SEQ ID No.4)从柑橘cDNA中扩增获得CsMEK5片段(图2)，片段长度为1143bp(包含酶切位点)，扩增的DNA片段经测序分析为柑橘CsMEK5基因编码序列。
扩增体系：10X PCR mix：2.5μL；引物OE-F(5μmol/L)：1μL；引物OE-R(5μmol/L)：1μL；cDNA约60ng；加ddH2O至25μL。
扩增程序：94℃，5min；94℃，30s，56℃，30s，72℃，1.5min，35个循环；72℃延伸10min。
3.DNA片段回收
紫外灯下，用洁净的刀片切下含有目的片段的琼脂糖凝胶块。使用试剂盒(艾德莱)回收片段。
实施例2
超量表达载体的构建并转化农杆菌
载体构建流程图如图3，所有限制性内切酶购自(THERMO)公司，按照使用说明操作。
具体操作如下：将CsMEK5基因片段和超表达载体pNmGFPer用限制性内切酶SpeⅠ和KpnⅠ双酶切后回收进行连接过夜，连接采用T4 DNA Ligase kit(TAKARA)。连接产物转化大肠杆菌DH5α，阳性克隆提取质粒即得到CsMEK5的超量表达载体pNmGFPer-MEK5。质粒提取采用试剂盒(艾德莱)。
用电击法将构建的超量表达载体导入根癌农杆菌EHA105。预先取冻存的EHA105农杆菌感受态细胞(50μL)，于冰上融化，加入2μL所构建的超量表达载体的质粒于感受态细胞中，吹打混匀后，冰上放置5min。将混合液转入事先吹干的电击杯底，将电击杯放入卡槽调整到正确位点。将电击装置调节为“Agr”档，按下电击按钮，检查电击数据确保电击成功。加入1mL LB液体培养基至电击杯中，移液枪吹打混匀，移至无菌离心管中，260r/min，28℃摇床振荡培养60min。10000r/min将菌液离心1min，弃上清液(剩约100μL重悬菌体)，重悬后涂布，28℃倒置暗培养2天。待菌斑长出后，挑取单菌落进行PCR验证。
实施例3
遗传转化柑橘(晚锦橙)
1.柑橘实生苗上胚轴的获得
新鲜柑橘(晚锦橙)果实洗净，70％酒精表面消毒，无菌的条件下取出种子，剥掉种皮，种子萌发培养基上萌发，28℃下暗培养2周，然后在16h光照/8h黑暗条件下培养1周。无菌条件取萌发幼苗上胚轴切成1cm茎段，用于根癌农杆菌遗传转化。
2.根癌农杆菌菌液制备
用于转染的农杆菌菌液(含CsMEK5超量表达载体)加入30％的无菌甘油保存于-80℃的超低温培养箱中。转染前，在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线培养。挑单菌落，接种于25ml含有相同抗生素的LB液体培养基中，28℃震荡培养过夜。测浓度后将菌液稀释成OD＝0.1的菌液进行二摇，约3h后，菌液OD＝0.5时，5000r/min离心10min，弃上清，用pH5.4的MS液体培养基重悬用于转染。
3.柑橘上胚轴茎段转化
将柑橘上胚轴茎段在农杆菌菌液中浸泡13min后擦干，将茎段转移到共培养培养基中，26℃暗培养2天。
4.转化子的筛选
共培养完成后，将上胚轴转移到筛选培养基中，28℃暗培养7天，外殖体在28℃，16h光照/8h黑暗培养，每两周继代一次，然后GUS染色初步鉴定。
5.转化子的成苗培养
待幼苗长到1cm以上时，将其切下后嫁接到无菌试管中的晚锦橙苗，在成苗培养基中进行培养；待幼苗长到5cm左右时将其嫁接到枳实生苗上，在温室中进行培养。
实施例4
转基因植株验证
1.PCR检测外源基因整合
初筛得到的植株叶片100mg，使用DNA提取试剂盒(艾德莱，CAT：DN15)提取基因组DNA，PCR检测CsMEK5基因在柑橘基因组的整合。PCR反应条件：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，30次循环；72℃10min。检测引物为ID-F(SEQ ID No.6)和ID-R(SEQ ID No.7)。PCR结果见图3，阳性植株可以得到1165bp的扩增片段野生型WT对照植株无扩增。
2.CsMEK5基因表达量分析
提取柑橘叶片总RNA(艾德莱，CAT No：RN09)，使用Recombinant DNase I合成cDNA。利用qRT-PCR检测目的基因的表达量，检测引物为RT-F(SEQ ID No.8)和RT-R(SEQ IDNo.9)；内参基因Actin的检测引物为RT-F(SEQ ID No.10)和RT-R(SEQ ID No.11)。
反应体积20μL，反应条件：95℃3min，94℃10s；56℃10s，72℃10s，40次循环；72℃10min。实验重复三次。
采用2-△△Ct法计算转基因植株中CsMEK5基因的相对表达量：定义水处理的样本为参照因子，即其CsMEK5的表达水平为1，然后计算转基因柑橘中相对参照因子基因表达的倍数2-△△Ct，为其相对表达量。检测结果见图4。结果显示，CsMEK5基因在转基因植株中相比野生型植株有高水平表达(>20倍)。
3.转基因植株表型观察
观察分析3株转基因植株表型，发现外观和长势上并无明显异常(图5)。说明超量表达CsMEK5基因并未对植株的表型和发育产生直接的明显的变化。
实施例5
转基因植株的抗性评价
成熟叶片清洗后用75％的酒精消毒并用无菌水冲洗，置于超净台；以叶脉为中心进行针刺，六针为一组，每侧两组，用移液器点样溃疡病菌液，每针孔点样1μL(1X 105CFU/mL)。于28℃恒温光照培养箱中培养(16h光照/8h黑暗)。叶片点菌后培养10天拍照，用ImageJ V1.47软件统计病斑面积。根据病情指数公式计算发病程度。按照病斑面积将病情分为0-7级，以字母R表示病斑面积，0级(R≤0.25mm2)，1级(0.25mm2＜R≤0.5mm2)，2级(0.5mm2＜R≤0.75mm2)，3级(0.75mm2＜R≤1mm2)，4级(1.0mm2＜R≤1.25mm2)，5级(1.25mm2＜R≤1.5mm2)，6级(1.5mm2＜R≤1.75mm2)，7级(R＞1.75mm2)；根据公式计算发病程度：DI＝100XΣ【各级病斑数X相应级数值】/(病斑总数X最大级数)。
超量表达植株和同时期嫁接的WT植株，选取发育一致的叶片针刺接种溃疡病菌。离体接种溃疡病菌10天后，接种溃疡病菌的植株均不同程度发病，病斑大小存在一定的差异(图6)。上述实验重复三次以确保结果的准确性。
对离体接种柑橘溃疡病菌的叶片的病斑大小进行统计。分析发现转基因植株病斑面积和病情指数均显著低于WT对照组，其中OE3最小，病斑面积与野生型相比下降了63％(图7)，病情指数下降了64％(图8)。由此可见，CsMEK5的超量表达能够显著减小柑橘细菌性溃疡病的病斑面积，减轻柑橘细菌性溃疡病的发病程度。
本发明中，根癌农杆菌转化所用培养基：
种子萌发培养基：
MS+30g/L蔗糖+2.5g/L Gelrite，pH5.8。
共培养培养基：
MS+2mg/L BA+0.5mg/L IAA+1mg/L 2，4–D+100μmolAS+30g/L蔗糖+2.5g/LGelrite，pH5.8。
筛选培养基：
MS+2mg/L BA+0.5mg/L IAA+500mg/L Cef+50mg/L Kan+30g/L蔗糖+2.5g/LGelrite，pH5.8。
成苗培养基：
MS+30g/L蔗糖，pH5.8。
以下为各基因或蛋白质的核苷酸序列或氨基酸序列。
SEQ ID NO：1：
ATGCACAATGTGACTTAATATATGTTATTGTACCAAAAATAAAGGGAACCAGAAGTTATTTCCCCAGGCAAAAACTCTATTTTCTCGGCCCCTTTCTTGGCCTTTTTCCTCTCTTTCGAGAACTTTCTCTCTCCATTTTTCCTTCGAAACAAACAAAAGCTCATGGTATGGATTCTTAACAACAAAATCAAACCACCGAAAATCTCATTACATCTTCCAATCCAATGATCATTTCTTGCGTGAAAAAAATTCAACCTTTCTTTCATTGAAAAAAAAAATTTAAAACAAATTCACCTTCAACTCCGTTTTACACCGAGACTCGCCGGCGTAATCATCGATGAGACCTGTTCTACCGCCGCCGCCGAGCGGCTTATCCTCCTCGTCCTCTTCCTCGTCCGCCTCTTCGTCGTCATCATTGGCCAATCGCAGAGGTCAACGCCGGAGACCGGACCTCACGCTGCCAATCCCGCAGCGGGACCCATCCTTGGCCGTCCCCCTTCCGTTACCGCCGACGTCAAACTCGTCCTCTTCCTCCGGTCAGTCGACGAGCCACCAGAACCACCACCCCCACCAGCAGCAGCAAAACCAAACTCAGAACAACCACCAGAACCGGCACCAGCTCATCAACCCGGCTGAGCTCCAGAAAGGAAACCGAATCGGCAGCGGCAGCGGCGGCACGGTCTGGAGAGTCGTCCACCCGCCGACGTCGCGCGTGTTCGCGCTCAAGGTAATATACGGTAACCACGAGGACTCCGTCAGATCTCAGATCTGCCGTGAAATCGAGATCCTCCGCGACGTTAATCACCCTAACGTCGTTAAGTGTCACGACATGTACGACCGTAACGGCGAGATAGAGGTCCTGTTAGAGTACATGGACGGTGGATCCCTAGAAGGGGCCCACATAAGACAGGAGCACATATTATCTGATTTAGCTAGACAAGTATTAAGTGGATTAGCGTATTTACACAAACGAAAAATCGTACACCGTGATATTAAGCCCTCAAATTTGTTAATAAATTCTAGCAAAAATGTGAAAATTGCGGATTTTGGGGTTAGTAGGATCTTAGCACAGACGATGGATCCCTGCAATTCAGCCGTAGGGACCATAGCTTATATGAGTCCTGAGAGGATTAACACCGATTTGAATCATGGGAAATACGATGGATATGCAGGGGACATATGGAGCTTAGGGGTGAGTATATTGGAGTTTTATCTAGGGAGGTTTCCGTTTGCCGTGGGGAGGCAAGGGGATTGGGCGAGTTTGATGTTTGCAATATGTTTCGCCCAGCCACCGGAGGCGCCTGAAATGGCATCGAGGGAGTTTAGGGATTTTATTTCGCGTTGTTTGCAGAAAGACCCGCATAGCAGGTGGCCGGCTGCGCAGTTGTTGCAGCATCCGTTTATATTGAGAGCAGGGCAGAGTCAGGTGAATCAGAATCTCCGGCAAATTTTGCCGCCTCCTCGCCCTCTTAGTTCTTAGTTTTTTATGCTTCTTTTTTTGGAGAAAAAATTGGGATTTTGGTATTTTTGCTGAATATTCTTGTTTGATATGATGGGATTAATTATGGATTTGATTCTTAGGGGAGGAAGGTTAAAAGTTAGTTAATCCGGGTTATGGATTTATAATGGGGGAATTATGATGGATGATGATCAACTTTCAATCAATGAAATGAATCAATCTTGTCCTTCGATGATG TTTACTCGAAAAGGAAATTTTCTGTTTATTATGACTGTCTCTGGCCTTAAGTTTTTATATTTATTTTCCTGTTTTAGTAATCTTGTATATGCTTATGTTACCATGAGCTGAGTAAAGATTGAAGATTGGTTTCGGAGTGATGCATTATTGGC
SEQ ID NO：2：
MRPVLPPPPSGLSSSSSSSSASSSSSLANRRGQRRRPDLTLPIPQRDPSLAVPLPLPPTSNSSSSSGQSTSHQNHHPHQQQQNQTQNNHQNRHQLINPAELQKGNRIGSGSGGTVWRVVHPPTSRVFALKVIYGNHEDSVRSQICREIEILRDVNHPNVVKCHDMYDRNGEIEVLLEYMDGGSLEGAHIRQEHILSDLARQVLSGLAYLHKRKIVHRDIKPSNLLINSSKNVKIADFGVSRILAQTMDPCNSAVGTIAYMSPERINTDLNHGKYDGYAGDIWSLGVSILEFYLGRFPFAVGRQGDWASLMFAICFAQPPEAPEMASREFRDFISRCLQKDPHSRWPAAQLLQHPFILRAGQSQVNQNLRQILPPPRPLSS
SEQ ID NO：3：
GGGGTACCATGAGACCTGTTCTACCGC
SEQ ID NO：4：
GGACTAGTCTAAGAACTAAGAGGGCGAG
SEQ ID NO：5：
TGGAGTCAAAGATTCAAATAGAGGACCTAACAGAACTCGCCGTAAAGACTGGCGAACAGTTCATACAGAGTCTCTTACGACTCAATGACAAGAAGAAAATCTTCGTCAACATGGTGGAGCACGACACGCTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAG
SEQ ID NO：6：
CATTTGGAGAGGACAGGGTACC
SEQ ID NO：7：
GCCTCCTCGCCCTCTTAGTTCTTAG
SEQ ID NO：8：
CATCCTTGGCCGTCCCCCTTCC
SEQ ID NO：9：
GCTGGTGCCGGTTCTGGTGGTGT
SEQ ID NO：10：
CATCCCTCAGCACCTTCC
SEQ ID NO：11：
CCAACCTTAGCACTTCTCC
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种CsMEK5基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用，其特征在于，所述CsMEK5基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的CsMEK5基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用，其特征在于，所述CsMEK5基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求1或2所述的CsMEK5基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用，其特征在于，
将所述CsMEK5基因进行克隆，构建超量表达载体；
将超量表达载体转化柑橘，得到溃疡病抗性提高的转基因植株。
4.根据权利要求3所述的CsMEK5基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用，其特征在于，所述克隆采用PCR扩增，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
5.根据权利要求3所述的CsMEK5基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用，其特征在于，所述克隆具体为：
提取柑橘的总RNA，然后反转录为cDNA，最后采用高保真酶PCR扩增CsMEK5基因编码序列DNA片段。
6.根据权利要求3所述的CsMEK5基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用，其特征在于，所述构建超量表达载体具体为：
以带有CaMV 35S启动子的pNmGFPer为载体；其中：CaMV 35S启动子的核苷酸序列如SEQID NO.5所示；
利用限制性内切酶对扩增后所得CsMEK5基因编码序列DNA片段，最后连接至采用相同限制性内切酶酶切的载体上。
7.根据权利要求3所述的CsMEK5基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用，其特征在于，所述应用还包括对所述转基因植株进行抗性评价。
8.根据权利要求7所述的CsMEK5基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用，其特征在于，所述抗性评价具体采用PCR扩增，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
9.根据权利要求8所述的CsMEK5基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用，其特征在于，在PCR扩增完成后还包括实时荧光定量PCR扩增进行CsMEK5基因表达量检测，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；优选地，荧光定量PCR扩增中的内参基因为柑橘Actin基因，正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.10所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。
10.一种权利要求1-9任一项所述的CsMEK5基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用所获得的溃疡病抗性提高的转基因植株。
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