CN113817750B

CN113817750B - 一种水稻胚乳粉质相关基因OsDAAT1及其编码蛋白质和应用

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Publication number: CN113817750B
Application number: CN202111219152.7A
Authority: CN
Inventors: 万建民; 雷洁; 董慧; 滕烜; 田云录; 刘世家; 刘喜; 王益华; 江玲; 张文伟
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2021-10-20
Filing date: 2021-10-20
Publication date: 2023-09-01
Anticipated expiration: 2041-10-20
Also published as: CN113817750A

Abstract

本发明公开一种水稻胚乳粉质相关基因OsDAAT1及其编码蛋白质和应用，本发明提供的基因OsDAAT1，为如下1)或2)或3)或4)所述的DNA分子：1)SEQ ID NO.1所示的DNA分子；2)SEQ ID NO.2所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码植物胚乳发育相关蛋白的DNA分子。本发明还提供所述基因编码的蛋白质，所述蛋白影响植物胚乳的发育，将所述蛋白的编码基因导入胚乳发育异常的植物中，可以培育胚乳发育正常的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

Description

一种水稻胚乳粉质相关基因OsDAAT1及其编码蛋白质和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种水稻胚乳粉质相关基因OsDAAT1及其编码蛋白质和应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球超过半数以上的人口以稻米为主食。随着人口数量的增加以及人们生活水平的提高，人们对稻米产量和品质的要求也与日俱增。水稻籽粒中，胚乳是主要的储能器官，储存着大量的淀粉、蛋白质和脂质，为种子的萌发及幼苗的发育提供能量，同时也是人类食物的主要来源。胚乳的发育不仅影响种子的大小，还决定着稻米的品质，包括外观品质、加工品质、食味品质和营养品质。在增产理论“增源-畅流-扩库”的实践中，胚乳的发育既决定了库的大小，也影响流的畅通。因此，研究水稻胚乳发育对稻米产量和品质的提高具有重要意义。

先前的研究表明，水稻胚乳的发育受多种代谢途径共同调控，如淀粉的生物合成、贮藏蛋白质的转运、造粉体的发育、糊粉层的发育、碳氮代谢、糖代谢和线粒体功能等。因此，新的调控因子的挖掘对研究水稻胚乳发育调控网络和未来稻米品质改良工作具有重要意义。

科学家们在水稻的长期研究中发现大量的粉质胚乳突变体，其表现为胚乳淀粉颗粒排列疏松，籽粒呈现不透明表型。随着分子生物学和分子遗传学方法与技术的快速发展，多位研究者对水稻粉质胚乳性状进行了基因的克隆和功能研究。迄今为止，已经有一批直接或间接调控胚乳发育的功能因子被克隆，但是水稻胚乳发育的调控网络还不清楚，这就需要我们定位和克隆更多的基因来进一步揭示水稻胚乳发育的机制。

发明内容

本发明的目的在于公开一种水稻胚乳粉质相关基因OsDAAT1及其编码蛋白质和应用。

本发明提供的基因OsDAAT1，为如下1)或2)或3)或4)所述的DNA分子：

1)SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

2)SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码植物胚乳发育相关蛋白的DNA分子。

序列表中的SEQ ID NO.1，由7373个核苷酸组成。

本发明还提供了一种上述基因OsDAAT1编码的蛋白质。

具体的，本发明提供的蛋白质，选自如(a)或(b)所示的任一种：

(a)由SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO.3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与胚乳发育相关的由SEQ ID NO.3衍生的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO.3，由563个氨基酸组成。

本发明还提供了含有所述基因OsDAAT1的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组过表达载体可为在限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切载体pCAMBIA1390的重组位点插入所述基因(OsDAAT1)得到的重组质粒。将含有OsDAAT1的pCAMBIA1390命名为pCAMBIA1390-OsDAAT1。

含有以上任一所述基因(OsDAAT1)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

扩增所述基因(OsDAAT1)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围，所述的引物对优选Primer1/Primer2、Primer3/Primer4和Primer5/Primer6。

在精细定位此基因过程中涉及到的定位引物(见表1)，InDel引物为本实验需要而自行设计的引物，这些自行设计的引物也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了所述基因，所述蛋白质，所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在植物育种中的应用。

本发明还提供了所述基因，所述蛋白质，所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在培育胚乳发育正常的转基因植物中的应用。

本发明还提供了一种培育胚乳发育正常的转基因植物的方法，是将所述基因导入胚乳发育异常植物中，得到胚乳发育正常的转基因植物。

具体的，可以将所述基因通过所述重组表达载体导入胚乳发育异常的植物中。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

有益效果：

本发明首次发现、定位并克隆得到一个新的植物胚乳粉质相关蛋白的基因OsDAAT1。本发明的植物胚乳粉质相关蛋白影响植物的胚乳发育过程。抑制该蛋白编码基因的表达可导致植物种子中胚乳发育的障碍，从而可以培育胚乳变异的转基因植物。将所述蛋白的编码基因导入胚乳发育异常的植物中，可以培育胚乳发育正常的植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

附图说明

图1为野生型Nipponbare与突变体daat1的籽粒表型。

图2为野生型Nipponbare与突变体daat1籽粒扫描电镜观察。

图3为野生型Nipponbare与突变体daat1的灌浆速率测定。

图4为野生型Nipponbare与突变体daat1的千粒重测定。

图5为野生型Nipponbare与突变体daat1的淀粉含量测定。

图6为突变基因在第3染色体上的精细定位。

图7为转pCAMBIA1390-OsDAAT1的T₀代植株的T₁籽粒表型。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、水稻胚乳发育相关位点及其编码基因的发现

一、水稻胚乳粉质突变体daat1的表型分析及遗传分析

从粳稻品种Nipponbare组织培养的后代中筛选出一个胚乳粉质突变体，命名为daat1。

图1左图为Nipponbare成熟种子整体和横断面的扫描图，表现为胚乳完全透明的表型，右图为daat1成熟种子整体和横断面的扫描图，表现为腹部胚乳不透明，背部胚乳透明的表型。

对野生型和daat1突变体种子的横截面进行了扫描电镜观察(图2)，野生型种子淀粉颗粒排列紧密，大小均一，daat1突变体种子的背部淀粉颗粒形态与野生型相似，而腹部淀粉颗粒排列松散，颗粒大多为圆形。因此在光线通过时会发生散射，导致daat1籽粒外观呈现不透明表型。

在整个种子发育过程中，daat1突变体的灌浆速率明显低于野生型(图3)。从开花后6天开始，突变体的干物质积累开始显著低于野生型，并且这个差异一直维持到灌浆结束。与灌浆速率明显降低相对应的结果是，成熟的daat1突变体种子千粒重明显低于Nipponbare(图4)。同时，淀粉含量较野生型显著降低(图5)。

二、突变基因位点的图位克隆

1、突变基因的定位

首先，配制了突变体daat1和另一野生型N22的杂交组合F₁，自交一代后获得了F₂种子。将F₂种植下去，取F₂植株的叶片，并收获种子F₃。将F₃种子去壳，观察并统计F₃的表型，追溯F₃全为粉质的F₂植株，以此为标准筛选46株极端个体进行连锁，将目的基因确定在水稻第3染色体上。

利用实验室的公用引物与自己设计的引物，增加极端个体数量至2309株，最终将目的基因确定在标记Q1和Q28之间，区段大小48kb(图6)。

上述SSR标记分析的方法如下所述：

(1)提取上述选取单株的总DNA作为模板，具体方法如下：

①取0.2克左右的水稻幼嫩叶片，置于2.0mL Eppendorf管中，管中放置一粒钢珠，把装好样品的Eppendorf管在液氮中冷冻5min，置于2000型GENO/GRINDER仪器上粉碎样品1min。

②加入660μL提取液(含100mM Tris-HCl(pH 8.0)，20mM EDTA(pH 8.0)，1.4MNaCl,0.2g/mL CTAB的溶液)，漩涡器上剧烈涡旋混匀，冰浴30min。

③加入40μL 20％SDS，65℃温浴10min，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。

④加入100μL 5M NaCl，温和混匀。

⑤加入100μL 10×CTAB，65℃温浴10min，间断轻轻上下颠倒混匀。

⑥加入900μL氯仿，充分混匀，12000rpm离心3min。

⑦转移上清液至1.5mL Eppendorf管中，加入600μL异丙醇，混匀，12000rpm离心5min。

⑧弃上清液，沉淀用70％(体积百分含量)乙醇漂洗一次，室温凉干。

⑨加入100μL 1×TE(121g Tris溶于1升水中，用盐酸调pH值至8.0得到的溶液)溶解DNA。

⑩取2μL电泳检测DNA质量，并用DU800分光光度仪测定浓度(Beckman InstrumentInc.U.S.A)。

(2)将上述提取的DNA稀释成约20ng/μL，作为模板进行PCR扩增；

PCR反应体系(10μL)：DNA(20ng/μL)1μL，上游引物(2pmol/μL)1μL，下游引物(2pmol/μL)1μL，10×Buffer(MgCl₂ free)1μL，dNTP(10mM)0.2μL，MgCl₂(25mM)0.6μL，rTaq(5U/μL)0.1μL，ddH₂O 5.1μL，共10μL。

PCR反应程序：94.0℃变性5min；94.0℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共循环35次；72℃延伸7min；10℃保存。PCR反应在MJ Research PTC-225热循环仪中进行。

(3)SSR标记的PCR产物检测

扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以50bp的DNA Ladder为对照比较扩增产物的分子量大小，银染显色。

上述引物开发过程如下：

(1)SSR标记开发

将公共图谱的SSR标记与水稻基因组序列进行整合，下载突变位点附近的BAC/PAC克隆序列。用SSRHunter(李强等，遗传，2005，27(5):808-810)或SSRIT在线软件(http://archive.gramene.org/db/markers/ssrtool)搜索克隆中潜在的SSR序列(重复次数≥6)；将这些SSR及其邻近400～500bp的序列在NCBI通过BLAST程序在线与相应的籼稻序列进行比较，如果两者的SSR重复次数有差异，初步推断该SSR引物的PCR产物在籼、粳间存在多态性；再利用Primer Premier 5.0软件设计SSR引物，并由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。将自行设计的SSR成对引物等比例混合，检测其在N22和Nipponbare之间的多态性，表现多态者用作精细定位的分子标记。用于精细定位的分子标记见表1。

表1用于精细定位的分子标记

2、粉质基因的获得

经过对48kb区间内的测序，发现了daat1基因存在大片的缺失，

根据网上公布的序列设计引物，序列如下所述：

Primer1：5'AGTTTGTTAGCGTGCGACTGCA 3'(SEQ ID NO.4)；

Primer2：5'GATCGTCTGCATCTATCACA 3'(SEQ ID NO.5)。

以Primer1和Primer2为引物，以Nipponbare的发育中胚乳DNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因。扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，55℃4min，72℃10min，35个循环；72℃5min。将PCR产物回收纯化后连接到pMD18-T(日本Takara公司上)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司CB101)，挑选阳性克隆后，进行测序。

序列测定结果表明，PCR反应获得的片段具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，编码563个氨基酸残基组成的蛋白质(见序列表的SEQ ID NO.3)。将SEQ ID NO.3所示的蛋白命名为OsDAAT1，将SEQ ID NO.3所示的蛋白的编码基因命名OsDAAT1。

实施例2、转基因植物的获得和鉴定

一、重组表达载体构建

以Nipponbare(来自南京农业大学水稻所种质资源库)的基因组DNA为模板，以Primer3/4为引物进行PCR扩增获得OsDAAT1基因的启动子部分。以Nipponbare的cDNA为模板，以Primer5/6为引物进行PCR扩增获得OsDAAT1基因的CDS全长。

进行PCR扩增获得OsDAAT1基因，PCR引物序列如下：

Primer3：

5'CCGGCGCGCCAAGCTTTACCGACGATAACGAGGGAG 3'(SEQ ID NO.6)；

Primer4：

5'TCCGGCGGCGGCGGCGGCATCGGTCTCCTCCGCAGCGCT 3'(SEQ ID NO.7)；

Primer5：

5'GAGCGCTGCGGAGGAGACCGATGCCGCCGCCGCCGCCGGAG 3'(SEQ ID NO.8)；

Primer6：

5'GAATTCCCGGGGATCCTTATTCATCGGCATTTCTGGGTATT 3'(SEQ ID NO.9)。

上述引物Primer3和Primer4位于SEQ ID NO.2所示基因的上游2.5kb，扩增产物为该基因的启动子，将PCR产物1回收纯化。再用引物Primer5和Primer6扩增该基因的CDS全长，将PCR产物2回收纯化。采用INFUSION重组试剂盒(日本Takara公司)将两段PCR产物克隆到载体pCAMBIA1390中。INFUSION重组反应体系(10μL)：PCR产物1 1.0μL，PCR产物2 1.0μL，pCAMBIA1305 5.0μL，5×infusion buffer 2.0μL，infusion enzyme mix 1μL。短暂离心后将混合体系37℃水浴15分钟，而后50℃水浴15分钟，取2.5μL反应体系用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司；CB101)。将全部转化细胞均匀涂布在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。37℃培养16h后，挑取克隆阳性克隆，进行测序。测序结果表明，得到了含有SEQ ID NO.1所示基因的重组表达载体，将含有OsDAAT1的pCAMBIA1390命名为pCAMBIA1390-OsDAAT1，OsDAAT1基因片段利用INFUSION重组试剂盒(日本Takara公司)插入到该载体的HindIII和BamHI酶切位点之间。

二、重组农杆菌的获得

用电击法将pCAMBIA1390-OsDAAT1转化农杆菌EHA105菌株(购自美国英俊公司)，得到重组菌株，提取质粒进行PCR及酶切鉴定。将PCR及酶切鉴定正确的重组菌株命名为EH-pCAMBIA1390-OsDAAT1。

用pCAMBIA1390作为对照载体转化农杆菌EHA105菌株，方法同上，得到转空载体对照菌株。

三、转基因植物的获得

分别将EH-pCAMBIA1390-OsDAAT1和转空载体对照菌株转化水稻淀粉含量降低突变体N65，具体方法为：

(1)28℃培养EH-pCAMBIA1390-OsDAAT1(或转空载体对照菌株)16小时，收集菌体，并稀释到N6液体培养基(Sigma公司，C1416)中至浓度为OD600≈0.5，获得菌液；

(2)将培养至一个月的daat1水稻成熟胚胚性愈伤组织与步骤(1)的菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(N6固体共培养培养基，Sigma公司)中，24℃共培养3天；

(3)将步骤(2)的愈伤接种在含有100mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第一次筛选(16天)；

(4)挑取健康愈伤转入含有100mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次；

(5)挑取健康愈伤转入含有50mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第三次筛选，每15天继代一次；

(6)挑取抗性愈伤转入分化培养基上分化；得到分化成苗的T₀代阳性植株。

四、转基因植株的鉴定

1、PCR分子鉴定

将步骤三获得的T₀代植株提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用Primer5和Primer6为引物进行扩增。

PCR反应体系：DNA(20ng/μL)2μL，Primer5(10pmoL/μL)2μL，Primer6(10pmol/μL)2μL，10xBuffer(MgCl₂ free)2μL，dNTP(10mM)0.4μL，MgCl₂(25mM)1.2μL，rTaq(5U/μL)0.4μL，ddH₂O 10μL，总体积20μL。

扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30s，55℃2min，72℃2.5min，35个循环；72℃5min。

PCR产物用8％的非变性PAGE胶分离，银染。确定转基因阳性植株。

2、表型鉴定

分别将T₀代转pCAMBIA1390-OsDAAT1阳性植株、T₀代转空载体对照植株、突变体daat1和Nipponbare种植在南京农业大学土桥水稻育种基地转基因田内。种子成熟后，收取各材料种子，观察到pCAMBIA1390-OsDAAT1植株的种子中出现了透明的种子(图7)。因此证明daat1中的突变表型是由OsDAAT1的突变造成的。pCAMBIA1390-OsDAAT1可以使daat1株系的粉质胚乳恢复至与野生型相似的透明胚乳。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种水稻胚乳粉质相关基因OsDAAT1及其编码蛋白质和应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7373

<212> DNA

<213> 稻属水稻(Oryza sativa var. Nipponbare)

<400> 1

gtaagggttc accaatcacc attgacgcca ctctttcccc cctcccgagc acagagcaga 60

gagagagaga gagagagaga gcgctgcgga ggagaccgat gccgccgccg ccgccggagc 120

cggagccgga gccggtggtg atccacgcgt ggtcggcgcc gcgctccctc agcaccagcc 180

tcatgtactc cttcgcccag gtccgcgcct cctccttcgc ctcgcctcgg cctcgcccac 240

cccgctgcgc acgggggatc cccctgggcc ggcggcgagt cggcgaaccg ggggccaccg 300

ccgcaaccag ctgcattacc tgcacggccg gctcgcttcc cccgtttcgc tttctgatga 360

tttttttttt aattcttgtg tttgggatag agggatgaca tggaggtgct cgacgagccg 420

ctctacgcta atttcctgcg cgtcaccggc gtcgacaggc cgtatcgcga ggagcttctg 480

tctaacatgg taaaccttga caaatggttt gattatttaa tcacactact accgttgcta 540

ctggagaagg aaatttttgt tgcgtgatct ttgcggcatt tagtaatgga tgtttatttg 600

aagtagcggt cgtttggaac tgaaccaaat cagctgtaat catgctcttc tgacatgatt 660

gaaacttgaa aggatgggga gatggttttg acatcctgct tcgtgaatta cctttttttt 720

ttggttgctt ctagcacttc cctgactact ggacctttct gtccaaatgt tctcaatgtc 780

ttaattagat catttccatt tcaatatcga aaataatact gtgcaccatc cttgtgtgtg 840

ctttttaaaa ctagctctgc taagttacca taaatttcta tactagcaat atgcatggag 900

catggagcct tctatataat agaatcacta ggaatacttc cagtgcagga tcctgatggt 960

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gtagattttt tattttctaa gatgttgctc acagatttat aaatgatccc ttaatccctc 1080

aatcttttgt ttgtagcaca ttgcaaagca gcgcctccct aacctgtcaa gtgacctgat 1140

gaaaaaggga aaacatttca tattgatacg caaccctcta aatatcctgg tattactgcc 1200

ttttgttttc agtatcacat agacacatac atttttactc atttttgctt tgcatactgt 1260

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agtcgtccca ccatcattct ttgagctcgg catagcggaa cttgtctcga tatacagtga 1380

attgtgtgag cttgggagcc ctccgcctgt gatagatgca gacgatctac aacgggatcc 1440

tgaggtatat ctattcttgg atattcaatg atgttattac tgtggacact atctacttaa 1500

tatagtgtgt ggcatgccat tattttgtag tgggctgctt tgaagggcat ggcattgcag 1560

tcctcaagca attagtctag gttatactac actaataaaa aaatgaagtt catattatct 1620

tcattttttt gaaatcatgg gggcctgaaa tgatttttca tattagattg aaaaataata 1680

atccttgaga taatttctaa tattatgaca ttatctcaat tcctgtattg cattcgcaaa 1740

ttgctttgtt tttacttcac atgcaggctg tcttgagtgg actatgtgag gatctaggta 1800

ttccttatca gccacaaatg ctccagtaag tatattctac atggtaacca cgctaaaatt 1860

ttctattgtt aagtatgcac gttagaacaa gcatggttgg acatcaagat tcaaaggcct 1920

gttcttcctt tttagatggg aagctggccc caaggacttt gatggtattt gggctccctg 1980

gtggtatagg agtgtacaca agtctactgg tttctctatg ccacgccgtt atcctttggt 2040

aagcttgcat caaacatttc tttcaatttt cagcatctat tcttgtggtt tttgcaaagt 2100

tagtatccat atcatctatt tttcaagaca agtattgcat tggtatagat agagaacaga 2160

ggacctctga agcaacatga cgatgtaaca gggagttgaa ggggtcgctt gcagaaaatg 2220

tgcttagata ttgtaaaaca aacgtgttat agctaaagcg agaaaaccag atggttgggg 2280

ataatacctt agatgaaagt tatttgaagt tatgtacgta tatcttcatt tggatagcct 2340

gatcattctg ctgaatttct agatcatccc atctaatttt ttgcaagtag tttttttcac 2400

cattgtattg aatatgttat ggttcttgca ggttagcttt ttgagaacat acaaacaata 2460

gggatatttg gtttgaagaa ataacttttg gaataaataa tagagcagtg tgatgatgct 2520

ggaaaggtcc aagctgaact tacaaaaatg gtacaaacca caaacatgaa aacaaacata 2580

catatatggc taatctgaaa gcaagaaaag aaaacaccaa tgctgttcaa aagttcacca 2640

gatagattcc ttggttttgt ccttaaatag attatgatac ctacacatga tcatggactt 2700

tttggcattt gtacactcca tttattcgag aagaacattt ttgcgtacca ttgaacccca 2760

tgctgcttca tataggagtc aaccatcaaa tatgaaacac cttatttgaa aagagctgat 2820

ctgttaagta aatatgcatt ctaacaaaat atccattgag atgtaaaaga gtttaacctt 2880

attgagtggc agccctgtca aacaagtttc cgttcctaac aagatgcaat tcatttcatc 2940

gtgagttggt gtaacatttg gtacagcttt taattatcat tgactttctc tattcgattt 3000

cagacttttc catttgcttt gtatgatcta cttgaacaaa gcttgccatt ttacaacgtg 3060

ctgaaacgcc atgtaagcaa aaccatagga tccccgcaac caacattacc tgatcctcct 3120

cttccagtac ctgaaaataa aaaaattctt gtttgggttg gagatgagct tttgccccgt 3180

gatagtgcaa aggtacatca cttataactt ttggtatgct ctcagtatta taatggtcac 3240

acttgagcag ttgttccttt tttttttatt ctaatcattt atcttgtaaa ggtttcagta 3300

tttgattcag ttgtacaagg aggggatgct gtgtgggaag gattacgtat atacgatggg 3360

aaagtgttca aacttgatga acacttggat aggtgcaata actatttctg tatttccatt 3420

cttttttctg cttgtgatat atgagaagat tgtccttatg tttttatcta ggttgtttga 3480

ttctgcaaaa gctatggcct tcagcaatgt gcctagtcgt gattgggtaa tttgacttga 3540

ctgctctcat ctatactgtt cgttacattg caagaaatat caaattaatc tttgttaaga 3600

atctttgatg ttctgttgtg ccttttttgc attgatgttt cagcttgtgt agtaatagtc 3660

tctgaaattt tggtttctaa tattaacagt tgtatgtcca atgaaaagat tattgctgtg 3720

ggccaatgtt gaagtttgaa ctactcctga atcaagcttc cattatgtgc atgtttctat 3780

gcagattaag gatgccatct ttaggactct caatgcaaat ggaatgttca ataatgctca 3840

tataaggctt acactcaccc gtgggaagaa ggtaaaaaga tgaacctaga ttcatcagta 3900

gtgtcacttt tcaagtatat atatttgtcg acatctttgc atatcctgct tgatcacttc 3960

attcgctacc ttcaatttca aaaaactgca ggtgacatct ggaatgagtc cagctttcaa 4020

cctctatgga tgcaccttga taggtattca tcctcctagt cctatcttgc ttgcatgaga 4080

atgccaagta tttgttttca gttttccacc ttgtggcata aggacattat gtaggacaat 4140

gtgaaggttt agctgcttaa tcacctgtag tgcttggtac ccatactgaa aatctggcgt 4200

tgctactgtt ggctggccag tgctggtata aaaccacata accaatgata tagagtagca 4260

acttttgagt gcctagcggt ggtatgctat taataaattg accaattgta ttgtgaaaaa 4320

tatatgtatg ccactatata tgatttgcaa ttctgtggaa aactaagtgg gtgcaataat 4380

gctaatttct aataagacct gttctttcag tgcttgcaga gtggaaacca ccagtttatg 4440

ataactcgca tggaataaag ttggtaactg ccaccacgcg gcgtaattct ccgaatgtaa 4500

ggtccatttg gaaacatata catgatccat gttaatttga aagttcacaa agcatcctgt 4560

ttagtttcct gtttgggaat aaacattgac tttggctgct cttacgactt ttcagagcat 4620

agattcaaag atacatcaca acaatcttat caacaatatt ctggcgaagg tactttatcc 4680

tttagatttg tatagctgtc cttacataca tttttttaaa tggagccctt tattaattgt 4740

aatagcacta agttgctaat gcttttatgc agatagaggg taaccttgca caggctgagg 4800

atgccatcat gctagataaa gatggttttg tatcagaaac aaatgcaaca aacattgtaa 4860

gtgtacatgg ctgttatcat taacatatct cgaatttgcc tcaatatttt ttattgaagg 4920

agagagttta cctcaatttt attcataact tttgttttct aaaaatgcca ctgtgttaat 4980

tgcagtttat ggttaagaag ggcattgtgt tgacacctca tgctgagtac tgccttccag 5040

gcattacgcg tgcaactgta agtctaatca ggttccagtt ggaaaactat cagcagagcc 5100

aatctaaaaa attggatacc tccattggaa tgacatggaa gagaatttat tagaactttt 5160

ctgtctaatt gcagccacta ctttttcaag gagcgttatt gcaatacaca tttcatttat 5220

acactatttt gacttgtaca actatatttg tactggaaat tattgtgaaa atcagagaaa 5280

tttttgtttt tactgacaaa gaggcccgat aaatattgaa tatgaggaac cacttctgtt 5340

actccctctt tttataatat atcttgaggt tcttgaatca cgggcatttt ataaattatc 5400

ttcaagagaa aatgtaaaat atctgatagt ggctttgtac catgagatct accgagttac 5460

tttgtttggc actgatagtg cctttttttt ttcttttcgt ttcctatgaa tgcaaaattg 5520

caaataccac aatatgttta cctaagccta tagttatatc atgtagatat tttttactgg 5580

cttgctgcat catgacttca agaaatatgt tgtatctact tacgtgcaag gaagacgaaa 5640

tttgtggttt cagttagcat gaagcactat gtgattatca agttgaacaa acttcttttc 5700

tggaaaaatc agaagagtca tatttgctga tgctaatatt tttcatgttg gatgaaatta 5760

acaggtcatg gatcttgtgg taaaagagag cctggtgtta catgaacgtc gcattagttt 5820

atcagaattt catgctgcag acgaggttcc agtcttattc atggacataa gttcatatat 5880

gatttttccc tctatgcaat ggtgaatctt tgttaggaac aatgaaacct gccttttcaa 5940

gaaaaaaagg aagtgtttat ggttttaagg aaacctgctt ttctagggta aaaagggtag 6000

agaaaatgcc atgtgcagag gtctgaattg gcttgaccat agaacccccg ttacagcgtg 6060

tagtactgta atcctctgag taaacgaaat gatcgacaat actccctccg tttcatatta 6120

taagtcgttt gacttttttc ctagtcaaac ttctttaagt tggaccaaat ttatagaaaa 6180

aatatagtag tattttcaac acgaaacaaa catattatca aaatatattc aatgttagat 6240

ttaatgaaac taatttaata ttttagatgt tgctaatttt ttctatgaac ttggtcaaac 6300

tttatttcta taaacatatt atcaaaatat attcaatgtt gctaaatttt tctttaaaaa 6360

atcaaacaac ttataatatg aaacggaagg agtattattt tgcttacttg aatgaagcaa 6420

ttgtgattat caagttgagc ctacattgtt ttctgaaaaa aaaatcaaaa taatcatctt 6480

tgcatatgct aacatctttc atgtttaact agatagttct tatctacctt ttcatgaatt 6540

actataataa gatggacatg ttgagatgtt ctataacatt tacttgaaat ctgaattttg 6600

ataatggggg ttttcacctg caggtatgga ctactggaac gatgggtgaa atcacaccgg 6660

tgagtttaca tttttgcact atgcgctcat gttttccctt agccatttaa cagcacagct 6720

atctgatggt tttgttgaat ttaataataa atatctagtt tacttgcatg tattctgttt 6780

tctaaaccag agtatttagt cactctagtc aagtggccat tttacaccta agttattatc 6840

ataaaattgt gttccctatt aatcggggtt ttccattttg ctagtatttt attagatacg 6900

tcaagcataa atagactgcg aacttgtaac agtgttggca cgtactgcac atatgctcgt 6960

tgctgacata atctattcta caacaggtcg taatgattga tggtcgtgaa attggtgacg 7020

ggaaaatagg tccggtcaca agacaaatcc agaatgcata caaagtcata actgcaggtt 7080

ctggagtaac aatacccaga aatgccgatg aataacaggt gtatatgcct tcctggtcta 7140

cctgccggaa ccagtataaa gcaaacttga ttgttagaga aataaatgtg aaaagatgca 7200

tcactaaatt gtcgtgccaa ttggaaaatg tgtatgaagc atgtactctg tttttcttag 7260

actcagtagg ggttttcgcc aaaattgcag atttcatttg tggacgatta tgaattcaat 7320

aaacatgtcc aatgctagta gctcagtttg gcactgtggt ggcctttcta aaa 7373

<210> 2

<211> 1692

<212> DNA

<213> 稻属水稻(Oryza sativa var. Nipponbare)

<400> 2

atgccgccgc cgccgccgga gccggagccg gagccggtgg tgatccacgc gtggtcggcg 60

ccgcgctccc tcagcaccag cctcatgtac tccttcgccc agagggatga catggaggtg 120

ctcgacgagc cgctctacgc taatttcctg cgcgtcaccg gcgtcgacag gccgtatcgc 180

gaggagcttc tgtctaacat ggatcctgat ggtaacaaag ttatcagtga agtcattttt 240

gggccaggga agagaaaata tcgttactgc aagcacattg caaagcagcg cctccctaac 300

ctgtcaagtg acctgatgaa aaagggaaaa catttcatat tgatacgcaa ccctctaaat 360

atcctgccat catttgacaa agtcgtccca ccatcattct ttgagctcgg catagcggaa 420

cttgtctcga tatacagtga attgtgtgag cttgggagcc ctccgcctgt gatagatgca 480

gacgatctac aacgggatcc tgaggctgtc ttgagtggac tatgtgagga tctaggtatt 540

ccttatcagc cacaaatgct ccaatgggaa gctggcccca aggactttga tggtatttgg 600

gctccctggt ggtataggag tgtacacaag tctactggtt tctctatgcc acgccgttat 660

cctttgactt ttccatttgc tttgtatgat ctacttgaac aaagcttgcc attttacaac 720

gtgctgaaac gccatgtaag caaaaccata ggatccccgc aaccaacatt acctgatcct 780

cctcttccag tacctgaaaa taaaaaaatt cttgtttggg ttggagatga gcttttgccc 840

cgtgatagtg caaaggtttc agtatttgat tcagttgtac aaggagggga tgctgtgtgg 900

gaaggattac gtatatacga tgggaaagtg ttcaaacttg atgaacactt ggataggttg 960

tttgattctg caaaagctat ggccttcagc aatgtgccta gtcgtgattg gattaaggat 1020

gccatcttta ggactctcaa tgcaaatgga atgttcaata atgctcatat aaggcttaca 1080

ctcacccgtg ggaagaaggt gacatctgga atgagtccag ctttcaacct ctatggatgc 1140

accttgatag tgcttgcaga gtggaaacca ccagtttatg ataactcgca tggaataaag 1200

ttggtaactg ccaccacgcg gcgtaattct ccgaatagca tagattcaaa gatacatcac 1260

aacaatctta tcaacaatat tctggcgaag atagagggta accttgcaca ggctgaggat 1320

gccatcatgc tagataaaga tggttttgta tcagaaacaa atgcaacaaa catttttatg 1380

gttaagaagg gcattgtgtt gacacctcat gctgagtact gccttccagg cattacgcgt 1440

gcaactgtca tggatcttgt ggtaaaagag agcctggtgt tacatgaacg tcgcattagt 1500

ttatcagaat ttcatgctgc agacgaggta tggactactg gaacgatggg tgaaatcaca 1560

ccggtcgtaa tgattgatgg tcgtgaaatt ggtgacggga aaataggtcc ggtcacaaga 1620

caaatccaga atgcatacaa agtcataact gcaggttctg gagtaacaat acccagaaat 1680

gccgatgaat aa 1692

<210> 3

<211> 563

<212> PRT

<213> 稻属水稻(Oryza sativa var. Nipponbare)

<400> 3

Met Pro Pro Pro Pro Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Val Val Ile His

1 5 10 15

Ala Trp Ser Ala Pro Arg Ser Leu Ser Thr Ser Leu Met Tyr Ser Phe

20 25 30

Ala Gln Arg Asp Asp Met Glu Val Leu Asp Glu Pro Leu Tyr Ala Asn

35 40 45

Phe Leu Arg Val Thr Gly Val Asp Arg Pro Tyr Arg Glu Glu Leu Leu

50 55 60

Ser Asn Met Asp Pro Asp Gly Asn Lys Val Ile Ser Glu Val Ile Phe

65 70 75 80

Gly Pro Gly Lys Arg Lys Tyr Arg Tyr Cys Lys His Ile Ala Lys Gln

85 90 95

Arg Leu Pro Asn Leu Ser Ser Asp Leu Met Lys Lys Gly Lys His Phe

100 105 110

Ile Leu Ile Arg Asn Pro Leu Asn Ile Leu Pro Ser Phe Asp Lys Val

115 120 125

Val Pro Pro Ser Phe Phe Glu Leu Gly Ile Ala Glu Leu Val Ser Ile

130 135 140

Tyr Ser Glu Leu Cys Glu Leu Gly Ser Pro Pro Pro Val Ile Asp Ala

145 150 155 160

Asp Asp Leu Gln Arg Asp Pro Glu Ala Val Leu Ser Gly Leu Cys Glu

165 170 175

Asp Leu Gly Ile Pro Tyr Gln Pro Gln Met Leu Gln Trp Glu Ala Gly

180 185 190

Pro Lys Asp Phe Asp Gly Ile Trp Ala Pro Trp Trp Tyr Arg Ser Val

195 200 205

His Lys Ser Thr Gly Phe Ser Met Pro Arg Arg Tyr Pro Leu Thr Phe

210 215 220

Pro Phe Ala Leu Tyr Asp Leu Leu Glu Gln Ser Leu Pro Phe Tyr Asn

225 230 235 240

Val Leu Lys Arg His Val Ser Lys Thr Ile Gly Ser Pro Gln Pro Thr

245 250 255

Leu Pro Asp Pro Pro Leu Pro Val Pro Glu Asn Lys Lys Ile Leu Val

260 265 270

Trp Val Gly Asp Glu Leu Leu Pro Arg Asp Ser Ala Lys Val Ser Val

275 280 285

Phe Asp Ser Val Val Gln Gly Gly Asp Ala Val Trp Glu Gly Leu Arg

290 295 300

Ile Tyr Asp Gly Lys Val Phe Lys Leu Asp Glu His Leu Asp Arg Leu

305 310 315 320

Phe Asp Ser Ala Lys Ala Met Ala Phe Ser Asn Val Pro Ser Arg Asp

325 330 335

Trp Ile Lys Asp Ala Ile Phe Arg Thr Leu Asn Ala Asn Gly Met Phe

340 345 350

Asn Asn Ala His Ile Arg Leu Thr Leu Thr Arg Gly Lys Lys Val Thr

355 360 365

Ser Gly Met Ser Pro Ala Phe Asn Leu Tyr Gly Cys Thr Leu Ile Val

370 375 380

Leu Ala Glu Trp Lys Pro Pro Val Tyr Asp Asn Ser His Gly Ile Lys

385 390 395 400

Leu Val Thr Ala Thr Thr Arg Arg Asn Ser Pro Asn Ser Ile Asp Ser

405 410 415

Lys Ile His His Asn Asn Leu Ile Asn Asn Ile Leu Ala Lys Ile Glu

420 425 430

Gly Asn Leu Ala Gln Ala Glu Asp Ala Ile Met Leu Asp Lys Asp Gly

435 440 445

Phe Val Ser Glu Thr Asn Ala Thr Asn Ile Phe Met Val Lys Lys Gly

450 455 460

Ile Val Leu Thr Pro His Ala Glu Tyr Cys Leu Pro Gly Ile Thr Arg

465 470 475 480

Ala Thr Val Met Asp Leu Val Val Lys Glu Ser Leu Val Leu His Glu

485 490 495

Arg Arg Ile Ser Leu Ser Glu Phe His Ala Ala Asp Glu Val Trp Thr

500 505 510

Thr Gly Thr Met Gly Glu Ile Thr Pro Val Val Met Ile Asp Gly Arg

515 520 525

Glu Ile Gly Asp Gly Lys Ile Gly Pro Val Thr Arg Gln Ile Gln Asn

530 535 540

Ala Tyr Lys Val Ile Thr Ala Gly Ser Gly Val Thr Ile Pro Arg Asn

545 550 555 560

Ala Asp Glu

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agtttgttag cgtgcgactg ca 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gatcgtctgc atctatcaca 20

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccggcgcgcc aagctttacc gacgataacg agggag 36

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tccggcggcg gcggcggcat cggtctcctc cgcagcgct 39

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gagcgctgcg gaggagaccg atgccgccgc cgccgccgga g 41

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaattcccgg ggatccttat tcatcggcat ttctgggtat t 41

Claims

1.SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的基因，SEQ ID NO.3所示的蛋白质，包含SEQ IDNO.1 或SEQ ID NO.2所示的基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育胚乳发育正常的水稻中的应用，所述水稻具有SEQ ID NO.2所示基因的缺陷。

2.一种培育胚乳发育正常的转基因水稻的方法，是将SEQ ID NO.1 或SEQ ID NO.2所示的基因导入具有SEQ ID NO.2基因缺陷的胚乳发育异常水稻中，得到胚乳发育正常的转基因水稻。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：SEQ ID NO.1 或SEQ ID NO.2所示的基因通过重组表达载体导入胚乳发育异常的水稻中。