CZ20013446A3 - Transgenní rostlina rezistentní k mykotoxinům a způsob přípravy takové rostliny - Google Patents

Description

Transgenní rostlina rezistentní takové rostliny

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká transgenního hostitele, zejména transgenních rostlin, rostlinných pletiv nebo buněk a semen, která jsou rezistentní k trichothecenu, a dále způsobů jejich přípravy. Vynález se dále týká způsobů prevence a/nebo redukce růstu hub na rostlinách, v rostlinných pletivech nebo buňkách. Vynález se dále týká způsobů prevence a/nebo redukce kontaminace rostlin, rostlinných pletiv nebo semen mykotoxiny. Dále se vynález týká použití trichothecenu jako selekčního činidla při transformaci rostlin.

Dosavadní stav techniky

Mnohé houby jsou vážnými škůdci na ekonomicky významných plodinách. Kromě toho kontaminace úrody toxiny z hub je celosvětovým problémem zemědělství. Mykotoxiny jsou toxické metabolity hub, často se vyskytující v zemědělských produktech, které se vyznačují tím, že způsobují zdravotní obtíže obratlovcům.

Trichotheceny j sou seskviterpenepoxidové mykotoxiny produkované různými druhy hub z rodů Fusaríum,

Trichothecium a Myrothecium, které působí jako silné inhibitory syntézy proteinů eukaryotických organismů. K druhům Fusaríum, které produkuj í tyto trichotheceny, patří

F. acumínatum,

F. crookwellense,

F.

culmorum, F. equíseti,

F. graminearum • ·

(Gibberella zeae) , F. lateritium, F. poae, F. sambucinum (G. pulicaris), and F. sporotrichioides (Marasas, W.F.O., Nelson, P.E., and Toussoun, T.A. 1984).

Jak bylo již dříve popsáno (A. E.Desjardins and T. M Hohn, Mycotoxins in plant pathogenesis. Mol.Plant-Microbe Interact. 10 (2):147-152, 1997), jak akutní tak i chronické mykotoxikózy byly popsány u hospodářských zvířat a lidí ve spojení s konzumací pšenice, žita, ječmene, ovsa, rýže a kukuřice kontaminované některými druhy Fusarium, které produkují trichothecenové mykotoxiny. Experimenty s chemicky čistými trichotheceny v nízkých dávkách reprodukovaly mnoho rysů pozorovaných u zvířat při toxikózách způsobených plesnivým zrním, včetně obtíží jako je anémie, imunosuprese, hemoragie, emeze a odmítání potravy. Historické a epidemiologické údaje o lidských populacích ukazují na spojitost mezi některými epidemiemi nemocí a spotřebou obilovin kontaminovaných druhy Fusarium, které produkují trichotheceny. Tak např. vypuknutí fatální nemoci známé jako alimentární toxická aleukie v Rusku v 19. Století bylo spojeno s konzumací přes zimu uskladněného obilí kontaminovaného druhem Fusarium, který produkuje trichothecenový toxin T-2. V Japonsku vypuknutí podobné nemoci zvané akakabi-byo nebo nemoc červené plísně bylo spojeno s konzumací obilovin infikovaných druhem Fusarium, produkujícícm jiný trichothecen, deoxynivalenol (dále zkráceno na DON). Trichotheceny byly detekovány i ve vzorcích toxického obilí při nedávném propuknutí obdobných nemocí v Indii a Japonsku. Existuje tudíž potřeba opatření přímo v zemědělství, která by zcela zabránila nebo alespoň snížila kontaminaci plodin mykotoxiny.

φ · φ ··· ·· ·· φφφ ···· · φφφφ · ·· · · • ··· ······ φ φφφ φ φ

ΦΦΦΦΦΦΦ · Φ ·· Φ · 99

- 3 Dále je známo, že druhy Fusarium produkující trichotheceny jsou destruktivní patogeny a napadají široké spektrum rostlinných druhů. Akutní toxicita trichothecenů a jejich výskyt v rostlinných pletivech vedou k předpokladu, že tyto mykotoxiny hrají důležitou roli v patogenezi Fusarium na rostlinách. To znamenalo, že mykotoxiny hrají roli také v nemoci a tudíž snížení jejich toxicity pro rostlinu by mohlo zabránit nebo alespoň snížit chorobu u rostlin. Kromě toho redukce choroby může přinést další prospěch, a sice snížení kontaminace rostlin mykotoxiny, zejména kontaminace zrna v případě obilnin.

Byly užity, a to s různou mírou úspěšnosti, různé metody ochrany rostlin před nemocemi jako je hniloba klasu u kukuřice, hniloba stébla nebo plíseň vrcholů pšenice. Jedna z metod byla aplikace antimikrobiálně působících chemických látek na plodiny. Avšak tato metoda má mnoho problémů, jak je odborníkům známo. Alternativně byla užita modernější metoda boje proti škůdcům, a sice s využitím organismů (tzv. biologický boj), které jsou přirozenými kompetitory nebo inhibitory škůdce. Avšak problémy se vyskytují při aplikaci biologického boje na velkých plochách a ještě obtížnější je udržet požadované živé organismy na ošetřované ploše po dlouhou dobu. V současnosti metody rekombinantní DNA poskytují prostředky ke vkládání klonovaných genů do rostlin, a tyto geny pak produkují sloučeniny s antimikrobiálním účinkem. Avšak tyto technologie zase vyvolaly obavy z toho, že mikrobi získají rezistenci ke známým, přirozeně se vyskytujícím antimkrobiálním látkám. Takže existuje stálá potřeba identifikovat v přírodě se vyskytující antimikrobilání činidla, jako jsou např. proteiny, která mohou • ·

- 4 • Β

být produkována v rostlinných buňkách přímo translací jediného genu.

Enzym trichothecen 3-O-acetyltransferáza katalyzuje acetylaci řady různých trichothecenů z Fusarium, včetně DON, na hydrxylové skupině na atomu uhlíku tři (C-3) a byl identifikován ve Fusarium sporotrichioides. (S. P. McCormick, N. J. Alexander, S. C. Trapp, and T. M. Hohn. Disruption of TRI101, the gene encoding trichothecene 3-O-acetyltransferase, from Fusarium sporotrichioides. Applied.Environ.Microbiol. 65 (12):5252-5256, 1999). Acetylace trichothecenů na C3-0H významně snižuje jeho toxicitu pro obratlovce i rostliny a vede k reakčnímu produktu 3-acetyldeoxyvalenolu (dále označovaný

3AD0N), viz Kimura et al., níže.

Sekvence strukturních genů kódujících trichothecen

3-O-acetyltransferázy z

Fusarium graminearum,

Fusarium sporotrichioides a také sekvence publikovány, viz např. Kimura et dalších orthologů byly al., Biosci. Biotechnol.

Biochem., 62 (5) 1033-1036 (1998), Kimura et al., FEBS Letters,

435 , 163-168 (1998) . Kromě toho se mělo za to, že gen z

Fusarium sporotrichioides kódující trichothecen 3-O-acetyltransferázu by mohl být užitečný pro získání odrůd rostlin se zvýšenou rezistencí k Fusarium, viz např. Hohn, T.M. et al. Molecular Genetics of Host-Specific Toxins in Plant Disease, 17-24 (1998) a Kimura et al. J.Biological Chemistry, 273(3) 1654-1661 (1998).

Dokud nebyl předložen tento vynález, existovalo mnoho nejasností, takže zdaleka nebylo zřejmé, zda by exprese trichothecen 3-O-acetyltransferázy v rostlině skutečně vedlo k vzniku rostliny rezistentní k trichothecenů. Tak např.

reakce katalyzovaná trichothecen 3-O-acetyltransferázou z • · · ·

Fusarium sporotrichoides je reverzibilní a mohla by tudíž selhat při ochraně rostliny proti trichothecenům jako je DON.

Nebylo také jisté, zda by to mohla být esteráza v rostlinných buňkách, která kompetuje s 3-0-acetyltransferázovou aktivitou při vzniku toxického DON z 3AD0N. Ani nebylo jasné, jak metabolismus reakčního produktu 3AD0N ovlivňuje rostlinu, tj. nebylo známo, zda např. vnesení trichothecen 3-O-acetyltransferázy nezmění růst a vývoj rostliny takovým způsobem, který by znehodnotil pozitivní příspěvek acetyltransferázy, např. by mohlo dojít k narušení mechanismu přirozené rezistence rostliny k chorobám. Také nebylo známo, zda se 3AD0N nemůže metabolizovat v rostlině na nový sekundární metabolít s toxickým účinkem. Ani nebylo jisté, pokud by byl DON produkovaný houbou účinně přeměňován na 3AD0N, zda by tato přeměna vedla ke zvýšené rezistenci rostliny k patogenu. Toto byly příklady neznámých a nejasných skutečností před podáním tohoto vynálezu.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje rostlinné buňky nebo buňky obsahující heterologní polynukleotid, který kóduje genový produkt, který je exprimován v rostlinné buňce, přičemž projevuje aktivitu rezistence k trichothecenu.

Dále vynález poskytuje rostlinu, která obsahuje výše popsané buňky, přičemž tato rostlina je rezistentní k trichothecenu.

• ·

- 6 Dalším předmětem vynálezu je rostlina, která je rezistentní k trichothecenu, když trichothecen obsahuje hydroxylovou skupinu na atomu uhlíku tři (C-3).

Dalším předmětem vynálezu je rostlina, která je rezistentní k houbě, která produkuje trichothecen, výhodně trichothecen obsahující hydroxylovou skupinu na atomu uhlíku tři.

Dalším předmětem vynálezu je rostlina, která je rezistentní k Fusarium, Trichothecium nebo Myrothecium.

Dalším předmětem vynálezu je rostlina, která je rezistentní k Fusarium, zejména (avšak ne výlučně) k Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium poae, Fusarium sambucinum, Fusarium equiseti, Fusarium acuminatum, Fusarium lateritium a Fusarium pseudograminearum.

Dalším předmětem vynálezu je rostlina, která je rezistentní k Fusarium graminearum.

Dalším předmětem vynálezu je rostlina obsahující heterologní polynukleotid, který kóduje genový produkt, který je v rostlině exprimován, přičemž tento protein obsahuje aktivitu rezistence k trichothecenu a heterologní polynukleotid je mikrobiální polynukleotid, výhodně polynukleotid z kvasinky nebo houby.

Dalším předmětem vynálezu je rostlina podle vynálezu, kde polynukleotid z houby je polynukleotid z Fusarium, výhodně z Fusarium graminearum nebo Fusarium sporotrichioides.

Dalším předmětem vynálezu je rostlina podle vynálezu, kde heterologní polynukleotid obsahuje sekvenci v podstatě podobnou sekvenci nukleové kyseliny uvedenou zde jako sekvence id. č. 1, nebo 7.

Dalším předmětem vynálezu je rostlina podle vynálezu, kde • · c · • · • · · · * · · · * · * • ··· ···· · * · ¥ • · · · ······ · · ♦ • ··« · · · · » ···· ··« ·· «· ·· ··

- 7 heterologní polynukleotid obsahuje sekvenci id. č. 1, 5 nebo 7, nebo sekvenci s ní homologní.

Dalším předmětem vynálezu je rostlina podle vynálezu obsahující heterologní polynukleotid, který obsahuje souvislý úsek po sobě následujících alespoň 80 párů baží sekvenčně identický se souvislým úsekem po sobě jdoucích alespoň 80 párů baží v sekvenci id. č. 1, 5 nebo 7, výhodně souvislý úsek po sobě následujících alespoň 50 párů baží sekvenčně identický se souvislým úsekem po sobě jdoucích alespoň 50 párů baží v sekvenci id. č. 1, 5 nebo 7, a ještě výhodněji souvislý úsek po sobě následujících alespoň 21 párů baží sekvenčně identický se souvislým úsekem po sobě jdoucích alespoň 21 párů baží v sekvenci id. č. 1, 5 nebo 7, a nejvýhodněji souvislý úsek po sobě následujících alespoň 18 párů baží sekvenčně identický se souvislým úsekem po sobě jdoucích alespoň 18 párů baží v sekvenci id. č. 1, 5 nebo 7.

Dalším předmětem vynálezu je rostlina podle vynálezu, která je rezistentní k trichothecenu vybranému ze skupiny obsahující toxin T-2, toxin HT-2, isotrichodermol, 4,15-diacetoxyscripenol (dále označovaný jako DAS),

3- deacetylkalonektrin, 3,15-dideacetylkalonektrin, scirpentriol, neosolaniol; typu B: 15-acetyldeoxynivalenol, nivalenol,

4- acetylnivalenol (fusarenon-X), 4,15-diacetylnivalenol,

4,7,15-acetylnivalenol a DON.

Dalším předmětem vynálezu je rostlina rezistentní k DAS nebo DON.

Dalším předmětem vynálezu je rostlina podle vynálezu, kde genový produkt je kódován polynukleotidem podle vynálezu.

Dalším předmětem vynálezu je rostlina podle vynálezu, kde genový produkt je 3-O-acetyltransferáza.

- 8 Dalším předmětem vynálezu je rostlina podle vynálezu, kde genový produkt je polypeptid obsahující sekvenci v podstatě podobnou sekvenci id. č. 2, 6 nebo 8.

Dalším předmětem vynálezu jsou semena kterékoliv z rostlin podle vynálezu.

Dalším předmětem vynálezu je kterákoliv z výše popsaných rostlin, přičemž tato rostlina je pšenice, kukuřice, ječmen nebo rýže.

Dalším předmětem vynálezu je způsob přípravy rostliny rezistentních k trichothecenu, který spočívá v tom, že obsahuje kroky, kdy se

a) transformuje rostlinná buňka heterologním genem, který kóduje genový produkt, přičemž tento genový produkt zvyšuje rezistenci k trichothecenu,

b) genový produkt je exprimován v biologicky významné hladině,

c) rostlinná buňka se regeneruje na rostlinu a

d) selektuje se rostlina se zvýšenou rezistencí k trichothecenu.

Dalším předmětem vynálezu je způsob, jak byl výše popsán, který navíc obsahuje krok, kdy se selektuje rostlina, na které je redukován růst houby, přičemž jde o houbu produkující trichothecen.

Dalším předmětem vynálezu je způsob, jak byl výše popsán, kdy houba patří do rodu Fusarium.

Dále vynález poskytuje rostliny rezistentní k trichothecenu, které byly získány způsobem podle vynálezu, který byl výše popsán.

Dále vynález poskytuje semena rostlin produkována samosprášením nebo křížením rostliny podle vynálezu, jak byla ···· ·· ·· ·· ··

9 9 · · 9 9 * · · ♦

9 99 9 9 9 9 9 9 9 · • · 9 · 99999· ·9 9

9 9 · 9 · · · · • 999 999 ·· ·· ·· ·9

- 9 popsána výše, přičemž rostliny vyrostlé z takových semen mají zvýšenou rezistenci k trichothecenu.

Dále vynález poskytuje způsob prevence kontaminace rostlin mykotoxiny, a to včetně semen, který spočívá v tom, že rostliny podle vynálezu popsané výše se pěstují výhodně v oblasti mírně až silně zamořené houbovým škůdcem, přičemž rostlina je výhodně kulturní rostlina.

Dalším předmětem vynálezu je způsob prvence růstu hub na rostlině, výhodně hub z rodu Fusarium, který spočívá v tom, že se pěstují rostliny podle vynálezu, které produkují trichothecen, výhodně trichothecen obsahující hydroxylovou skupinu na atomu uhlíku C-3 jak byl popsán výše, výhodně v oblasti mírně až silně zamořené houbovým škůdcem, přičemž rostlina je výhodně kulturní rostlina.

Dalším předmětem vynálezu je způsob produkce rostlin rezistentních k houbám, kterýžto způsob obsahuje kroky:

a) transformuje rostlinná buňka heterologním genem, který kóduje genový produkt, přičemž tento genový produkt zvyšuje rezistenci k trichothecenu,

b) genový produkt je exprimován v biologicky významné hladině,

c) rostlinná buňka se regeneruje na rostlinu,

d) selektuje se rostlina . se zvýšenou rezistencí k trichothecenu, a

e) volitelně se samospráší nebo zkříží rostlina získaná v kroku d.

Dalším předmětem vynálezu je způsob, kde houba je rodu

Fusarium.

Dalším předmětem vynálezu je způsob produkce semen, kdy rostliny vyrostlé ze semen jsou rezistentní k houbám, přičemž toto toto toto toto ··

9 9 · ! t ♦ ··«· · · · · • toto· tototo· to · « · · • ••«toto* · · tento způsob obsahuje samosprášení nebo křížení rostlin podle vynálezu.

Dalším předmětem vynálezu je způsob výše popsaný, kdy semena jsou rezistentní k houbám rodu Fusarium.

Dalším předmětem vynálezu je způsob selekce transformovaných hostitelských buněk, který obsahuje kroky, kdy se

- transformuje hostitelská buňky konstruktem nukleové kyseliny, který kóduje trichothecen 3-0-acetyltransferázu, a transformovaná hostitelská buňky se kultivuje v přítomnosti trichothecenového selekčního činidla.

Dalším předmětem vynálezu je způsob selekce transformovaných hostitelských buněk, kdy hostitelské buňky jsou rostlinné buňky, mikrobiální buňky, a zejména kdy mikrobiální buňky jsou buňky hub.

Dalším předmětem vynálezu je způsob selekce transformovaných hostitelských buněk jak byl popsán výše, kdy hostitelská buňka je dále transformována druhým požadovaným polynukleotidem.

Dalším předmětem vynálezu je způsob selekce transformovaných hostitelských buněk, kdy trichothecen je vybrán ze skupiny obsahující toxin T-2, toxin HT-2, isotrichodermol, 4,15-diacetoxyscripenol (dále označovaný jako DAS) , 3-deacetylkalonektrin, 3,15-dideacetylkalonektrin, scirpentriol, neosolaniol; typu B: 15-acetyldeoxynivalenol, nivalenol, 4-acetylnivalenol (fusarenon-X), 4,15-diacetylnivalenol, 4,7,15-acetylnivalenol a DON.

Dále vynález poskytuje rostlinu rezistentní k trichothecenu, která je získatelná způsobem podle vynálezu.

Dále vynález poskytuje rostlinu rezistentní k houbám, • ·

- 11 která je získatelná způsobem podle vynálezu.

A ještě dále vynález poskytuje semena rostlin získatelná způsobem podle vynálezu.

Při popisu předkládaného vynálezu se užívají některé specifické termíny, jejichž význam je vysvětlen v následujících definicích.

Exprese: Týká se transkripce a/ nebo translace endogenního genu nebo transgenu v rostlinách. V případě antisense konstruktu se termín exprese týká pouze transkripce antisense DNA.

Operativně spojený/asociovaný: Týká se dvou sekvencí DNA, které jsou fyzicky nebo funkčně spojeny. Tak např. promotor nebo regulátorová sekvence je asociována se sekvencí DNA, která kóduje RNA nebo protein, když jsou tyto dvě sekvence operativně spojeny, nebo situovány tak, že regulátorová sekvence ovlivňuje expresi kódující nebo strukturní sekvence DNA.

Termíny Heterologní polynukleotid nebo heterologní DNA se týkají molekuly nukleové kyseliny, která není přirozeně asociována s hostitelskou buňkou, do které je vnesena, a označují genové konstrukty, vícečetné kopie nevyskytující se v přírodě sekvencí DNA, které se jinak v přírodě vyskytují, homologní molekulu nukleové kyseliny, která je však operativně spojena s jinou než nativní molekulou nukleové kyseliny. Takže k heterologním genům v hostitelské buňce patří gen, který je endogenní vzhledem k dané hostitelské buňce, ale byl modifikován např. užitím metody tzv. DNA shuffling. Termín zahrnuje také vícečetné kopie, nevyskytující se v přírodě, sekvencí DNA, které se jinak v přírodě vyskytují. Termín se

···« 0* 00 «00 0*00

000· · ♦ 0 · ♦ 0 · 00000 • 0 0<· 0000 ··· 0· ··

- 12 týká segmentu DNA, který je cizorodý nebo heterologní vůči buňce, nebo je vůči buňce homologní, avšak je v pozici nukleové kyseliny hostitelské buňky, kde se normálně v přírodním stavu nevyskytuj e.

Termín nukleová kyselina nebo polynukleotid se týká deoxyribonukleotidů nebo ribonukleotidů a jejich polymerů, buďto v jednořetězcové nebo dvouřetězcové formě. Pokud není termín specificky vymezen, zahrnuje nukleové kyseliny obsahující známé analogy přírodních nukleotidů, které jsou metabolizovány podobně jako přirozeně se vyskytující nukleotidy. Pokud není uvedeno jinak, konkrétní sekvence nukleové kyseliny implicitně zahrnuje její konzervativně modifikovanou varantu (např. substituce degenerovaných kodonů) a komplementární sekvenci a také sekvence zde explicitně uvedené. Specificky substituce degenerovaných kodonů lze dosáhnou přípravou sekvence, kde třetí pozice jedno nebo více (např. všech) kodonů je nehrazena směsí baží nebo deoxy i nosinovým zbytkem (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)). Termíny nukleová kyselina nebo sekvence nukleové kyseliny nebo polynukleotid se užívají naprosto zaměnitelně s termíny gen, cDNA, nebo mRNA kódovaná genem.

Termín v podstatě podobná, v souvislosti molekulou nukleové kyseliny, označuje molekulu nukleové kyseliny odpovídající referenční nukleotidové sekvenci, kdy odpovídající molekula nukleové kyseliny kóduje polypeptid mající v podstatě stejnou strukturu a funkci jako polypeptid kódovaný referenční nukleotidovou sekvencí, tzn. Jsou zde jen takové záměny aminokyselin, které neovlivňují funkci polypeptidu. Výhodně ι :: :

• ·9 99 • «9

99♦·

v podstatě podobná molekula nukleové kyseliny kóduje stejný polypeptid, j aký j e kódován referenční molekulou nukleové

Termín molekulu

označuj

nukleové kyseliny, která byla modifikována pro optimální expresi v konkrétní hostitelské buňce, např.

rostlinné buňce.

Procentuální identita sekvencí dvou v podstatě podobných molekul nukleové kyseliny je alespoň 45%, výhodně 65%, výhodněji 75%, ještě výhodněji 85% a ještě výhodněji alespoň 85%, ještě výhodněji 90% a ještě výhodněji až 95%, a nejvýhodněji alespoň 99%. Výhodně uvedená procentuální identita existuje v úseku sekvence dlouhém alespoň 50 zbytků, výhodněji jsou sekvence v podstatě identické v úseku 100 zbytků a nejvýhodněji jsou sekvence v podstatě identické v úseku 150 zbytků. V nejvýhodnějším provedení je kódující sekvence v podstatě identická v celé délce kódujícího úseku. Srovnávání sekvencí lze provádět pomocí Smith-Watermanova algoritmu, jak bude ještě podrobněji dále popsáno (viz např. Waterman, M.S. Introduction to Computationla Biology: Maps, sequences and genomes. Chapman & Halí. London, 1995. ISBN 0-412-99391-0 nebo také viz http://www-hto.use.edu/software/seqaln/index.html).

Byl užit lokální S program verze

1.16 s následujícími parametry:

shoda (match) 1, penalta ze neshodu (missmatch)

0,33, penalta za mezeru (open-gap) 2, penalta za rozšířenou mezeru (extended-gap) 2.

Jinou indikací toho, že dvě sekvence nukleové kyseliny jsou v podstatě identické, je to, že tyto dvě molekuly navzájem hybridizují za stringentních podmínek. Termín specificky hybridizovat s se týká vazby, vytvoření duplexu nebo hybridizace molekuly pouze s určitou nukleotidovou sekvencí za

- 14 stringentních podmínek, pokud je tato sekvence v komplexní směsi (např. celkové buněčné) DNA nebo RNA přítomna.

Stringentní hybridizační podmínky a stringentní hybridizačni promývací podmínky v kontextu hybridizačnich experimentů v předkládaném vynálezu, jako je Southern a Northern hybridizace, jsou sekvenčně závislé a jsou různé za různých vnějších podmínek. Delší sekvence specificky hybridizují za vyšší teploty. Obsáhlé pokyny pro hybridizace nukleových kyselin lze najít v příručce Tijssen (1993) Laboratory Technigues in Biochemistry a Molecular BiologyHybridization with Nucleic Acid Probes, part I, chapter 2 Overview of principles of hybridization and the stratégy of nucleic acid probe assays Elsevier, New York. Obecně podmínky hybridizace a promývání s vysokou stringencí se volí přibližně o 5 °C nižší než je teplota tání (T_m) specifické sekvence při dané iontové síle a pH. Typicky za stringentních podmínek sonda hybridizuje jen se svou cílovou subsekvencí a s žádnou j inou sekvencí.

T_m je teplota (při definované iontové síle a pH) , při které 50 % cílové sekvence hybridizuje s dokonale shodnou sondou. Velmi stringentní podmínky se volí tak, že jsou shodné s T_m pro danou sondu. Příkladem hybridizace komplementární nukleové kyseliny ve stringentních podmínkách, když nukleová kyselina obsahuje více než 100 nukleotidů, na filtru při Southern nebo Northern přenosu, je 50 % formamid s 1 mg heparinu ve 42 C, když se hybridizace provádí přes noc.

Příkladem vysoce stringentního promývání je 0,1 5M NaCl při

C po 15 minut. Příkladem stringentního promývání je promývání ve 0,2x SSC při 65 C po 15 minut ( pro složení SSC pufru viz Sambrook, infra) . Často promývání za vysoce

- 15 stringentních podmínek předchází promývání za slabě stringentních podmínek, aby bylo odstraněno nespecifické pozadí. Příkladem promývání se střední stringencí pro duplexy např. delší než 100 nukleotidů, je lx SSC při 45 C po 15 minut. Příkladem promývání s nízkou stringencí pro duplexy např. delší než 100 nukleotidů, 4-6x SSC při 40 C poi 15 minut. Pro krátké sondy (např. 10 až 50 nukleotidů) stringentní podmínky znamenají koncentraci solí nižší než l,0M Na, typicky 0,01 to 1,0 M Na (nebo jiné soli) při pH 7,0 až 8,3 a při teplotě nejméně 30 °C. Stringentních podmínek lze také dosáhnout přídavkem destabilizujících činidel jako je např. formamid. Obecně poměr signálu k pozadí velikosti 2 a vyšší při použití nepříbuzné sondy v určitém hybridizačním testu indikuje detekci specifické hybridizace. Nukleové kyseliny, které spolu za stringentních podmínek nehybridizují, jsou i přesto v podstatě identické, pokud jimi kódované proteiny jsou v podstatě identické. K tomu dochází např. tehdy, když je kopie nukleové kyseliny připravena užitím maximální povolené degenerace genetického kódu.

Následují příklady různých hybridizačních/promývacích podmínek, které je možné užít při klonování homologních nukleotidových sekvencí, které jsou v podstatě identické s referenční sekvencí podle vynálezu: testovaná nukleotidová sekvence výhodně hybridizuje s referenční sekvencí v podmínkách: 7% dodecylsulfát sodný (SDS), 0,5 M NaPO₄, 1 mM EDTA v 50°C, promývání ve 2X SSC, 0,1% SDS při 50°C, výhodněji 7% dodecylsulfát sodný (SDS), 0,5 M NaPO₄, 1 mM EDTA v 50°C s promýváním v IX SSC, 0,1% SDS při 50°C, ještě výhodněji 7% dodecylsulfát sodný (SDS), 0,5 M NaPO₄, 1 mM EDTA v 50°C s promýváním v 0,5X SSC, 0,1% SDS při 50°C, výhodně •φ •φ •φ •φ • Φ φφφφ ·Φ φφ φφφ φφφφ φ φφφφ * Φφ φ · φ φ · φ φ φφφφφ • φφφ φ · φφφφφφφ φφ φ* ·· φφ

- 16 7% dodecylsulfát sodný (SDS) , 0,5 Μ NaP0₄, 1 mM EDTA při 50°C s promýváním v O,1X SSC, 0,1% SDS při 50°C, ještě výhodněji 7% dodecylsulfát sodný (SDS), 0,5 M NaP0₄, 1 mM EDTA při 50°C s promýváním v O,1X SSC, 0,1% SDS při 65 °C. Polynukleotid podle vynálezu, který hybridizuje za výše uvedených podmínek, výhodně obsahuje alespoň 80 baží, výhodněji alespoň 50 baží a zvláště alespoň 21, a nejvýhodněji alespoň 18 baží. K výhodným homologům podle vynálezu patří molekuly nukleové kyseliny, které kódují aminokyselinovou sekvenci, která sdílí alespoň 45% identitu se sekvencí id. č. 2, 6 nebo 8 při srovnání užitím paramterů uvedených dále, přičemž aminokyselinová sekvence kódovaná homologem vykazuje aktivitu rezistence k trichothecenu, např. 3-O-acetyltransferázovou aktivitu.

Termín v podstatě podobný, pokud jde o protein, znamená protein odpovídající referenčnímu proteinu, přičemž protein má v podstatě stejnou strukturu a funkci jako referenční protein, např. obsahuje jen takové záměny aminokyselin, které neovlivňují funkci polypeptidů. Pokud jde o protein nebo aminokyselinovou sekvenci, procentuální identita v podstatě podobného proteinu nebo aminokyselinové sekvence s referenční sekvencí je alespoň 45%, výhodně 65%, výhodněji 75%, ještě výhodněji 85% a ještě výhodněji alespoň 85%, ještě výhodněji 90% a ještě výhodněji až 95%, a nej výhodně ji alespoň 99%, a sice při užití analýzy programem BLAST se standardními parametry, jak je popsáno dále.

K výhodným homologům polypeptidů podle vynálezu patří polypeptidy s aminokyselinovou sekvencí, která sdílí alespoň

45% identitu se sekvencí id. č. 2, 6 nebo 8 při srovnání užitím parametrů uvedených dále, přičemž aminokyselinová sekvence • ♦ 9 99 9 * · 99

9 9 9 9 9 9

9 99 · · 9 9

9 9 9 9 999 9

9 9 9 9

9999 999 Φ · ♦*

- 17 rezistence kódovaná homologem vykazuj e aktivitu k trichothecenu, např. 3-O-acetyltransferázovou aktivitu.

Optimální přiřazení (alignment) sekvencí nukleových kyselin nebo aminokyselin pro srovnávání lze provádět, jak bylo zmíněno výše, pomocí algoritmu pro vyhledávání lokální homologie podle Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981) , algoritmu pro přiřazení homologií podle Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), metodou vyhledávání podobnosti podle Pearson & Lipman, Proč. Naťl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), a počítačovými implementacemi těchto algoritmů (GAP, BESTFIT, FASTA, a TFASTA, které jsou součástí programového balíku Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, WI), nebo také vizuálním porovnáním (viz Ausubel et al., infra).

Jedním příkladem algoritmu, který je vhodný ke stanovení procenta sekvenční identity a sekvenční podobnosti je program BLAST popsaný v Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) . Software pro provádění analýzy BLAST je veřejně dostupný prostřednictvím National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Podle tohoto algoritmu se nejdříve identifikují páry sekvencí s nejvyšším skóre (HSP) tak, že identifikuje slova o délce W ve zkoumané sekvenci, která splňují pozitivně oceněnou prahovou hodnotu T při přiřazení se slovem o stejné délce v databázi sekvencí. Hodnota T se označuje jako prahové skóre, neighborhood word score threshold (Altschul et al., 1990). Takto nalezená sousední slova slouží jako jádra pro iniciaci vyhledávání delších slov, která je obsahují. Nalezená slova jsou pak obousměrně prodlužována podél obou sekvencí,dokud se zvyšuje kumulativní skóre. Kumulativní skóre se počítá, pro

• 9	····	* ·	• to		··
t ·	•	•		9		• ·	to	*
•	• ··	•	*	•	•	•	•	•	•
•	• 9	9	•	• ♦ ·	9 ·	•	•	9
• • •tt	9 ···	•	• ··	•	♦ · • 4»	• to«	9

nukleotidové sekvence, užitím parametru M (pozitivní skóre pro pár shodujících se zbytků, vždy > 0) a N (negativní skóre pro neshodující se zbytky, vždy < 0). Pro aminokyselinové sekvence se užívá skórovací matice pro výpočet kumulativního skóre. Prodlužování nalezených slov oběma směry je zastaveno, když kumulativní skóre se zmenší o hodnotu X proti maximální dosažené hodnotě, jeho hodnota je nulová nebo nižší v důsledku akumulace jednoho nebo více přiřazení s negativním skórem a nebo po dosažení konce obou sekvencí. Parametry W, T, a X algoritmu BLAST určují jeho citlivost a rychlost přiřazování. Program pro srovnávání nukleotidových sekvencí BLASTN užívá délku slova (W) 11, expektaci (E) 10, hranice 100, M=5, N=-4 a srovnává oba řetězce. Program pro srovnávání proteinových sekvencí BLASTP užívá jako nastavené parametry délku slova (W) 3, expektaci (E) 10 a skórovací matrici BLOSUM62 (viz Henikoff & Henikoff, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)).

Kromě výpočtu procenta identity program BLAST provádí také statistickou analýzu podobnosti dvou sekvencí (viz např. Karlin & Altschul, Proč. Nati. Acad. Sel. USA 90: 5873-5787 (1993)). Jedním kritériem podobnosti, které produkuje algoritmus BLAST, je smallest sum probability, (P(N)), které poskytuje indikaci pravděpodobnosti náhodné shody dvou nukleotidových nebo aminokyselinových sekvencí. Tak např. testovaná sekvence nukleové kyseliny je považována za podobnou referenční sekvenci, jestliže smallest sum probability při srovnání testované a referenční sekvence nukleové kyseliny je menší než 0,1, výhodněji menší než 0,01 a nej výhodněji menší než 0,001.

Další indikací, že dvě sekvence nukleové kyseliny nebo proteinů jsou v podstatě podobné je to, že protein kódovaný

999 • · 9 99

9 99

999 první nukleovou kyselinou je imunologicky zkříženě reaktivní nebo se specificky váže s proteinem kódovaným druhou nukleovou kyselinou. Takže dva proteiny jsou typicky v podstatě podobné, když se liší jen konzervativními substitucemi.

Termín specificky (nebo selektivně) vázat protilátku nebo specificky (nebo selektivně) imunoreaktivní, pokud se týká proteinů nebo peptidů, označuje vazebnou reakci, která je určující pro přítomnost proteinu v přítomnosti heterogenní populace proteinů a dalších biologicky aktivních látek. Takže v podmínkách daného imunotestu se specifické protilátky váží na určitý protein a neváží se ve významném množství na jiné proteiny přítomné v tomtéž vzorku. Specifická vazba k protilátce za takových podmínek vyžaduje selekci protilátek na jejich specificitu pro určitý protein. Tak např. protilátky připravené proti proteinu s aminokyselinovou sekvencí kódovanou kteroukoliv sekvencí nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být selektovány tak, že se získají protilátky specificky imunoreaktivní s daným proteinem a nereagující s žádným jiným proteinem, s výjimkou polymorfních variant. Pro selekci protilátek specificky imunoreaktivních s daným proteinem lze užít celou řadu formátů imunotestů. Tak např. imunotest na pevné fázi ELISA, Western blot nebo imunohistochemické testy se rutinně užívají pro selekci specifických protilátek. Viz Harlow a Lané (1988) Antiboplies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York Harlow a Lané), kde jsou popsány různé formáty imunotestů a podmínky pro stanovení specifické imunoreaktivity. Typická specifická nebo selektivní reakce alespoň dvakrát přesahuje signál odpovídající pozadí nebo šumu, výhodněji je vyšší 10 až lOOx.

·· »4·· *♦ ·· ·· ·· « ' ♦ 4 · · · · · · * · • « · · 9 · · · « ·« · • ♦ · · · ·*· · · ·· · • * 9 · 9 9·99 ·♦·♦ ··« ·♦ «» ·< ·*

- 20 Konzervativně modifikované variace určité nukleové sekvence kyseliny označují takové sekvence nukleové kyseliny, které kódující identické nebo v podstatě identické sekvence aminokyselin, a nebo pokud jde o sekvence nukleové kyseliny nekódující aminokyselinové sekvence, označuje nutně identické sekvence. Jelikož genetický kód je degenerovaný, velký počet funkčně identických nukleových kyselin může kódovat daný polypeptid. Tak např. kodony CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, a AGG všechny kódující aminokyselinu arginin. Takže v každé pozici, kde má být kodon specifický pro arginin, může býk kodon alternativně kterýkoliv z výše uvedených, aniž by došlo ke změně kódovaného proteinu. Takové variace nukleových kyselin se nazývají umlčené variace, což je jeden z druhů konzervativně modifikovaných variací, každá zde popsaná sekvence nukleových kyselin kódující protein současně popisuje každou ze všech možných umlčených variací, pokud není specificky uvedeno j inak.

Odborníkovi je zřejmé, ze (kromě

ATG, který je normálně každý kodon nukleové kyseliny může být standardními metodami jediným kodonem pro methionin) modifikován, přičemž poskytne funkčně identickou molekulu.

Tudíž každá umlčená variace nukleové kyseliny, která kóduje protein, je implicitně obsažena v každé zde popsané sekvenci.

Kromě toho, odborníkovi je zřejmé, že jednotlivé substituce, delece nebo adice, které mění, přidávaj í nebo odstraňuj í jednu aminokyselinu nebo j en malé procento aminokyselin (typicky méně než 5 %, ještě typičtěji méně než

%) v kódované sekvenci jsou konzervativně modifikované variace, kde změna vede podobnou aminokyselinou.

k substituci aminokyseliny chemicky

Tabulky konzervativních substitucí poskytující přehled funkčně podobných aminokyselin jsou

- 21 odborníkům známy. Každá z pěti následujících skupin aminokyselin obsahuje navzájem zaměnitelné aminokyseliny: Alifatické: Glycin (G) , Alanin (A), Valin (V), Leucin (L) , Isoleucin (I); Aromatické: Fenylalanin (F) , Tyrosin (Y), Tryptofan (W) ; Obsahující síru: Methionin (M) , Cystein (C) ; Basické: Arginin (R), Lysin (K), Histidin (H); Kyselé: Kyselina asparagová (D), kyselina glutamová (E), Asparagin (N), Glutamin (Q) . Viz také Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company. Kromě toho substituce, delece nebo adice, které mění, přidávají nebo odstraňují jednu aminokyselinu nebo jen malé procento aminokyselin v kódované sekvenci jsou také konzervativně modifikované variace.

Termín subsekvence označuje sekvence nukleové kyseliny nebo aminokyselinové sekvence, které jsou částí delší sekvence nukleové kyseliny nebo aminokyselin, případně proteinu.

Nukleové kyseliny jsou prodlužovány (elongace), když jsou inkorporovány další nukleotidy (nebo analogické molekuly).

Obvykle se elongace provádí za pomoci polymerázy (např. DNA polymerázy), např. polymerázy, která připojuje sekvence na 3-konec sekvence nukleové kyseliny.

Dvě nukleové kyseliny jsou rekombinované, když j e sekvence každé z těchto dvou nukleovych kyselin obsažena v další generaci nukleové kyseliny. Dvě sekvence nukleové kyseliny j sou rekombinované přímo, když obě molekuly nukleové kyseliny slouží jako substrát rekombinace. Dvě sekvence nukleové kyseliny jsou rekombinované nepřímo, když jsou rekombinovány prostřednictvím meziproduktu, jako je např.

cross-over oligonukleotid. Pro skutečným substrátem jen jedna nepřímou sekvence, rekombinaci je a v některých případech žádná ze sekvencí není substrátem rekombinace.

·« «φφφ ·· φφ ·· ·· φ φ φ φφφφ · « φ φ • ••φ φ φφ φ · * φ · φ φφφ « φφφ · φ φφ φ φ φφφ φφφφφ φφφφ φφφ φφφ» φφ φφ

- 22 Specifická vazebná afinita mezi dvěma molekulami, např. ligandem a receptorem, znamená přednostní vazbu jedné molekuly k druhé molekule ve směsi různých molekul. Vazba molekul je považována za specifickou, jestliže vazebná afinita je přibližně 1 χ 10⁴ M¹ až 1 χ 10⁶ M’¹ nebo vyšší.

Substrát: tímto termínem se označuje molekula, kterou enzym přirozeně rozpoznává a přeměňuje na produkt v biochemické metabolické dráze, kde enzym v přírodě vykonává svou činnost, nebo je to modifikovaná molekula, která je také rozpoznávána enzymem a je přeměňována na produkt v enzymatické reakci podobně přirozeně se vyskytující reakci.

Termín transformace označuje proces vnesení heterologní DNA do hostitelské buňky nebo organismu.

Termíny transformovaný, transgenní a rekombinantní označují hostitelský organismus jako je např. baktérie nebo rostlina, do kterého byla vnesena heterologní molekula nukleové kyseliny. Molekula nukleové kyseliny je trvale integrovaná do genomu hostitelské buňky nebo je přítomna jako extrachromosomální molekula. Taková extrachromosomální molekula se může sama replikovat (autoreplikující molekula). Transformované buňky, tkáně nebo rostliny zahrnují nejenom konečný produkt transformace, ale také jejich transgenní potomstvo. Termíny netransformovaný, netransgenní nebo nerekombinantní hostitel označují organismus divokého typu, tj. např. bakterii nebo rostlinu, které neobsahují heterologní molekulu nukleové kyseliny.

Předkládaný vynález se týká transgenních hostitelských organismů, zejména rostlin, rostlinných pletiv, semen a buněk, které obsahují heterologní polynukleotid kódující genový

• 9 999«		99		44
* 9 9	9	9	* 9	• 9	9 9
	9	9	• 4	4 9	9 4
* ·	• 4	•		4 4 4	9 9
• ·	•	4	9	• ·	4 9
		4 ·	49	• 4	99

produkt, přičemž tento genový produkt má aktivitu rezistence k trichothecenu, a dále se vynález týká způsobů přípravy takových rostlin a rostlinných materiálů. Termín aktivita rezistence k trichothecenu zde označuje takovou aktivitu, která redukuje nebo inhibuje fytotoxicitu trichothecenu pro houbu a/nebo rostlinu, a v příkladech provedení vynálezu se aktivita rezistence k trichothecenu týká aktivity, která přenáší acetát na atom uhlíku tři (C-3) v trichothecenu.

Předkládaný vynález se dále týká transgenních hostitelských organismů, zejména rostlin, rostlinných pletiv, semen a buněk, které exprimují heterologní polynukleotid kódující genový produkt, přičemž tento genový produkt má aktivitu rezistence k trichothecenu, přičemž genový produkt je zejména acetlytransferáza, zvláště 3-O-acetyltransferáza a konkrétně pak trichothecen 3-O-acetyltransferáza, a také způsobů přípravy takových rostlin a rostlinných materiálů.

Exprese heterologního polynukleotidu podle vynálezu obsahuje syntézu RNA a lze ji detekovat pomocí Northern analýzy (Northern blot). Expresi heterologního polynukleotidu podle vynálezu lze zejména detekovat tak, že se použije značená sonda získaná z heterologního polynukleotidu podle vynálezu, ve zvláštním provedení vynálezu ze sekvence id. č. 1, 5 nebo 7, která hybridizuje s RNA izolovanou z transgenní rostliny podle vynálezu v podmínkách: 7% dodecylsulfát sodný (SDS), 0,5M fosforečnan sodný pH 7.0, lmM EDTA, 10 mg/ml BSA při 65°C, s promýváním v 0,5% BSA (frakce V), 5% SDS, 40mM fosforečnan sodný pH 7.0, lmM EDTA, 0,25M chlorid sodný, při 65 ° C, výhodně v 1% SDS, 40mM fosforečnan sodný pH 7.0, lmM EDTA, 0,125M chlorid sodný, při 65 ⁰ C, a výhodně 1% SDS, 40mM fosforečnan sodný pH 7.0, lmM EDTA, při 65 ⁰ C.

«·		• 9	• 9	99
• · ·		•	• ♦	• ♦	•	•
• «·$	•	•	• ·	• ·	•	•
9 ·	• ·	•		• * ·	•	9
• ·	«	•	9	9 ·	•	•
	··	··	• 9	• 9

Předkládaný vynález se dále týká transgenních rostlin, rostlinných pletiv, semen a buněk, exprimujících heterologní polynukleotid podle vynálezu, přičemž transgenní rostliny, rostlinná pletiva, semena a buňky jsou rezistentní k trichothecenu. Přitom rostliny, rostlinná pletiva, semena a buňky rezistentní k trichothecenu jsou podle předkládaného vynálezu takové rostliny a rostlinné materiály, které jsou schopny metabolizovat v přítomnosti trichothecenu, což lze stanovit např. podle příkladu 7. Ve zvláštním provedení rostliny, rostlinná pletiva, semena a buňky rezistentní k trichothecenu mají specifickou enzymatickou aktivitu alespoň 10 nmol triacetoxyscirpenolu (dále označován TAS)/^g proteinu/15 minut při inkubaci s nasycením substrátem, zvláště alespoň 5 nmol TAS/^g proteinu/15 minut, a zvláště pak alespoň 1 nmol TAS/gg proteinu/15 minut, zvláště alespoň 0,8 nmol TAS^g proteinu/15 minut, zvláště 0,5 nmol TAS^g proteinu/15 minut, zvláště pak specifickou aktivitu o 0,25 nmol TAS/gg proteinu/15 minut, zejména specifickou aktivitu o 0,1 nmol TAS^g proteinu/15 minut, zvláště specifickou aktivitu o 0,05 nmol TAS^g proteinu/15 minut a dokonce zejména specifickou aktivitu o 0,01 nmol TAS^g proteinu/15 minut vyšší než je bazální hladina přirozené aktivity u kontrolních organismů divokého typu, a to při stanovení zejména testem popsaným v příkladu 6.

K rostlinám podle vynálezu rezistentním k trichothecenu patří rostliny, u kterých vyšší procento semen klíčí a vytváří kořeny v přítomnosti trichothecenu, ve srovnání s kontrolními rostlinami divokého typu, když je trichothecen přítomen v koncentraci alespoň 5 μg/ml, výhodně alespoň 10 μ9/πϊ1, ještě výhodněji 15 μg/ml, ještě výhodněji alespoň 20 μg/ml, a

·· ···· ··		··	··	99
• · · ·	•	• ·	•	9	9	9
• ··· ·	•	• ·	•	9	9	•
• · · ·	•	··*	• ·	9	9	•
• · ·	•	•	•	9	9	•
		··	99	99

nejvyhodněji alespoň 25 μ9/Γη1. Ve zvláště výhodném provedení k rostlinám podle vynálezu rezistentním k trichothecenu patří rostliny, u kterých alespoň o 10 % více semen, výhodněji o 20 %, výhodněji o 3 0 %, výhodněji o 40 %, výhodněji o 50 %, výhodněji o 60 %, výhodněji o 70 %, výhodněji o 80 %, výhodněji o 80 %, a ještě výhodněji o 90 % více semen, klíčí a vytváří kořeny v přítomnosti trichothecenu, ve srovnání s kontrolními rostlinami divokého typu,

Trichotheceny se obvykle rozdělují do několika strukturních skupin. Konkrétní provedení předkládaného vynálezu se týká rezistence k trichothecenům skupiny A a B. K trichothecenům skupin A a B patří trichotheceny z Fusarium a tyto skupiny se odlišují zejména absencí (skupina A) nebo přítomností (skupina B) karbonylové funkční skupiny na atomu uhlíku v poloze 8 (C-8). Trichothecen DON ze skupiny B obsahuje tudíž karbonylovou skupinu na osmém uhlíku.

Předkládaný vynález se konkrétně týká rezistence k trichothecenům, které obsahují hydroxylovou skupinu na atomu uhlíku tři (C-3) . K těmto trichothecenům patří toxin T-2, toxin

DAS, 3-deacetylkalonektrin,

•..

k

HT-2, isotrichodermol,

15-ace scirpentriol, neosolaniol;

nivalenol, 4-acetylnivalenol (fusarenon-X), 4,15-diacetylnivalenol, 4,7,15-acetylnivalenol a DON, a také jejich různé acetylované deriváty.

Ve zvláštním provedení vynálezu rostliny, rostlinná pletiva, semena a buňky jsou rezistentní k trichothecenu, který j e produkován houbami, z e j ména houbami rodu Fusarium.

Rezistence k houbám v předkládané přihlášce znamená, že po inokulaci houbou nedojde k iniciaci infekce anebo doj de j en • · · ···· ·«·· ···· · · · · · · · · • ··· ······ ·· · • · · · · · · · · ···· ··· ·β ·· ·· ··

- 26 k redukovanému rozšíření infekce ve srovnání s kontrolní rostlinou divokého typu.

Ve výhodném provedení transgenní rostliny podle vynálezu rezistentní k houbám jsou obiloviny, které po infekci houbou obsahují méně infikovaných obilek nebo semen ve srovnání s kontrolní rostlinou divokého typu, výhodně nejméně o 10 % méně infikovaných obilek při srovnání stejného počtu obilek nebo semen z kontrolní rostliny divokého typu, výhodněji o 20 % méně, výhodněji o 40 % méně, a ještě výhodněji alespoň o 50 % méně infikovaných obilek při srovnání stejného počtu obilek nebo semen z kontrolní rostliny divokého typu. K obilovinám podle vynálezu rezistentním k houbám patří kukuřice, pšenice, ječmen, rýže a oves, přičemž tento výčet není omezující.

V případě pšenice, rozšíření houby na vrcholu rostliny se vyhodnocuje jak bylo popsáno v příkladu 9, vyhodnocením počtu symptomatických a asymptomatických klásků na každém inokulovaném vrcholu a vypočtením procenta symptomatických klásků. Ve výhodném provedení vynálezu pšenice podle vynálezu rezistentní k houbě obsahuje po infekci houbou méně infikovaných klásků ve srovnání s kontrolní rostlinou divokého typu, a sice alespoň o 10 % méně infikovaných klásků ve srovnání s vyhodnocením stejného počtu klásků u kontrolní rostliny divokého typu, výhodněji o 20 % méně, výhodněji o 40 % méně, a ještě výhodněji alespoň o 50 % méně infikovaných klásků ve srovnání s vyhodnocením stejného počtu klásků u kontrolní rostliny divokého typu.

U kukuřice se rozšíření houby v klasu hodnotí vizuálním stanovením procenta infikovaných obilek jak je popsáno v příkladu 9. Ve výhodném provedení vynálezu kukuřice podle vynálezu rezistentní k houbě obsahuje po infekci houbou méně ·· ···· ·· ·· ·· ·· • · · · · · · ···· ···· · · · · 0 · · · • ··· ······ ·· · • · · · ····· ···· ··· ·· ·· ·· ··

- 27 infikovaných obilek ve srovnání s kontrolní rostlinou divokého typu, a sice alespoň o 10 % méně infikovaných obilek ve srovnání s vizuálním vyhodnocením stejného počtu klasů kontrolní rostliny divokého typu, výhodněji o 20 % méně, výhodněji o 40 % méně, a ještě výhodněji alespoň o 50 % méně infikovaných obilek ve srovnání s vizuálním vyhodnocením stejného počtu klasů u kontrolní rostliny divokého typu. U kukuřice se vnitřní rozšíření houby ve stonku vyhodnocuje vizuálně rozříznutím stébla a vyhodnocením míry ztráty zbarvení. Ve výhodném provedení vynálezu obsahuje kukuřice podle vynálezu menší rozsah vnitřní a/nebo vnější ztráty zbarvení stébla ve srovnání s kontrolní rostlinou divokého typu.

V jiném výhodném provedení vynálezu k rostlinám podle vynálezu rezistentním k houbám patří ty rostliny, u kterých semen klíčí v přítomnosti houbové infekce vyšší procento semen než u kontrolních rostlin divokého typu. Ve zvláště výhodném provedení vynálezu k rostlinám podle vynálezu rezistentním k houbám patří ty rostliny, u kterých klíčí v přítomnosti infekce Fusaríum alespoň o 10 % více semen, výhodně alespoň o 20 % více, výhodněji alespoň o 30 % více, ještě výhodněji alespoň o 40 % více, ještě výhodněji alespoň o 50 % více, ještě výhodněji alespoň o 60 % více, ještě výhodněji alespoň o 70 % více, ještě výhodněji alespoň o 80 % více, ještě výhodněji alespoň o 90 % více, ještě výhodněji alespoň o 100 % více, a ještě výhodněji alespoň o 150 % více, než u kontrolních rostlin divokého typu.

V jiném výhodném provedení transgenní rostliny podle vynálezu rezistentní k houbám produkují semena nebo zrno obsahující méně mykotoxinů, např. kontaminace trichotheceny, než semena nebo zrno kontrolních rostlin divokého typu. Ve zvláště výhodném provedení vynálezu, plodiny podle vynálezu, a zejména obiloviny podle vynálezu, produkují semena obsahující alespoň o 10 % méně trichothecenů, výhodně alespoň o 20 % méně trichothecenů, výhodněji alespoň o 30 % méně trichothecenů, výhodněji alespoň o 40 % méně trichothecenů, výhodněji alespoň o 50 % méně trichothecenů, výhodněji alespoň o 60 % méně trichothecenů, ještě výhodněji alespoň o 70 % méně trichothecenů a ještě výhodněji alespoň o 80 % méně trichothecenů kontaminujících zrno ve srovnání s kontrolními rostlinami divokého typu. Kontaminace trichotheceny se stanoví např. postupem podle příkladu 10.

K polynukleotidům vhodným pro předkládaný vynález patří heterologní polynukleotidy kódující acetyltransferázy, zejména acetyltransferázy schopné poskytovat rezistenci k trichothecenů, zejména kódující trichothecen 3-O-acetyltransferázy.

Ve zvláštním provedení předkládaného vynálezu jsou polynukleotidy získány, avšak ne výlučně, z hub, a sice rodů Fusarium, Trichothecium a Myrothecium, konkrétně druhů Fusarium jako jsou např. F. acuminatum, F. crookwellense, F. culmorum, F. equiseti, F. graminearum (Gibberella zeae) , F. lateritium, F. poae, F. sambucinum (G. pulicaris) , a F. sporotrichioides. K heterologním polynukleotidům podle vynálezu patří sekvence id. č. 1, 5 a 7 a také sekvence v podstatě podobné sekvencím id. č. 1, 5 a 7.

Polynukleotidy podle vynálezu jsou vneseny do hostitelské buňky, např. rostlinné nebo bakteriální buňky nebo buňky houby, užitím konvenčních metod genového inženýrství. Obecně to znamená vložit polynukleotid do expresního systému, vůči kterému je polynukleotid heterologní, a sice metodami

- 29 • · · · • •Φ φ · · φ φφφφ • ΦΦΦ φ · · · φ ··· • φ · · · ··· · · · φ· φ · · φ · · · ·· klonování, které jsou odborníkům známy. Příslušný vektor obsahuje elementy nezbytné pro transkripci a translaci polynukleotidů podle vynálezu v hostitelské buňce, do které byl vnesen. Pro tento účel lze užít velký počet vektorových systémů, které jsou odborníkům známy, např. plazmidy, bakteriofágy a jiné modifikované viry. Složky vektoru mohou být modifikovány, aby se dosáhlo zvýšené exprese. Např. lze využít zkrácených sekvencí, substitucí nukleotidů nebo optimalizace nukleotidů nebo dalších modifikací. Expresní systémy, které jsou odborníkům známy, lze užít za vhodných podmínek k transformaci skutečně jakékoliv rostliny. Heterologní polynukleotid podle vynálezu je výhodně stabilně transformován a integrován do genomu hostitelských buněk. V jiném výhodném provedení vynálezu je heterologní polynukleotid lokalizován v samostatně se replikujícím vektoru. K příkladům takových samostatně se replikujících vektorů patří viry, zejména Gemini viry. Z transformovaných buněk se pak regenerují celé transgenní rostliny, kterým pak polynukleotid podle vynálezu uděluje rezistenci k trichothecenů.

Polynukleotid podle vynálezu určený pro expresi v transgenních rostlinách podle vynálezu je nejdříve vložen do expresní kazety za vhodný promotor schopný exprese v rostlině. Expresní kazety obsahuje také všechny sekvence potřebné pro expresi heterologního polynukleotidů podle vynálezu. K takovým sekvencím patří, i když tento výčet není omezující, terminátory transkripce, zvláštní sekvence ke zvýšení exprese jako jsou např. introny, vitální sekvence a také směrovací sekvence, které slouží ke směrování genového produktu do specifické organely nebo specifického buněčného kompartmentu. Taková expresní kazeta je pak snadno vložena do vektoru vhodného pro

- 30 transformaci rostlin, jak byl zmíněn výše. V následující části jsou popsány různé složky typických expresních kazet.

Výběr promotoru použitého v expresní kazetě je určen prostorovým a časovým profilem exprese heterologního polynukleotid podle vynálezu v transformované rostlině. Vybrané promotory exprimují heterologní polynukleotid podle vynálezu v buňkách specifického typu (např. buňkách listové epidermis, mezofylových buňkách, buňkách kůry kořene) nebo specifických pletivech nebo orgánech (např. kořeny, listy, květy) a jejich výběr odráží požadované místo akumulace genového produktu. Alternativně vybraný promotor exprimuje polynukleotid podle vynálezu za různých indukčních podmínek. Promotory se liší svou silou, tj. schopností vyvolávat transkripci. V závislosti na použitém hostitelském systému může být použit kterýkoliv vhodný promotor z řady promotorů, které jsou odborníkům známy. Tak např. pro konstitutivní expresi se může užít CaMV 35S promotor, promotor aktinu z rýže nebo ubikvitinový promotor. Pro regulovatelnou expresi lze užít např. chemicky indukovatelný promotor PR-1 z tabáku nebo Arabidopsis (viz např. U.S. Patent 5,689,044).

Pro použití v expresních kazetách je k dispozici řada transkripčních terminátorů. Tyto transkripční terminátory jsou zodpovědné za ukončení transkripce za heterologním polynukleotidem podle vynálezu a jeho správnou adenylaci. K vhodným transkripčním terminátorům patří ty, které jsou funkční v rostlinách, jako např. CaMV 35S terminátor, tmi terminátor, terminátor nopalinsyntázy a terminátor rbcS E9 z hrachu. Tyto terminátory se mohou užít jak pro dvouděložné tak i jednoděložné rostliny.

- 31 Byly nalezeny mnohé sekvence, které zesilují genovou expresi z transkripční jednotky a tyto sekvence mohou být užity ve spojení s polynukleotid podle vynálezu ke zvýšení jeho exprese v transgenní rostlině podle vynálezu. Tak např. různé intronové sekvence, jako např. introny genu Adhl z kukuřice zesilují expresi, zejména u jednoděložných rostlin. Kromě toho je známo, že řada netranslatovaných vedoucích sekvencí pocházejících z virů také zesiluje expresi, a tyto sekvence jsou zvláště účinné ve dvouděložných rostlinách.

Kódující sekvence vybraného genu může být případně metodami genového inženýrství upravena na sekvenci pro optimální expresi v konkrétním biologickém druhu rostliny, jak je odborníkům známo (viz např. Perlak et al. , Proč. Nati.

et al. , Bio/technol.

Nucl. Acids Res. 21:

5294-5300 (1993). Metody modifikací kódující sekvence beroucí do úvahy využití kodonů v rostlinných genech ve vyšších rostlinách, zelených řasách a kyanobakteriích jsou odborníkům známa (viz např. tabulka 4 v Murray et al. Nucl. Acids Res. 17: 477-498 (1989); Campbell a Gowri Plant Physiol. 92: 1-11(1990).

Je známo, že v rostlinách existují různé mechanismy cílení genových produktů a sekvence řídící tyto mechanismy byly do značné míry již charakterizovány. Tak např. cílení genového produktu do chloroplastu je řízeno signální sekvencí vyskytující se na aminokonci různých proteinů, kterážto sekvence je v průběhu transportu do chloroplastu odštěpena za vzniku zralého proteinu (viz např. Comai et al. J. Biol. Chem. 263: 15104-15109 (1988)). Jiné genové produkty jsou lokalizovány např. v mitochondriích a peroxisomech (např. Unger et al. Plant Molec. Biol. 13.: 411-418 (1989)). cDNA kódující

- 32 tyto produkty může být také modifikována, aby se dosáhlo zacílení heterologního produktu kódovaného touto cDNA do jiného buněčného kompartmentu. Kromě toho byly charakterizovány i sekvence, které umožňují cílení genových produktů kódovaných sekvencí DNA do dalších organel. Aminokoncové sekvence jsou zodpovědné za cílení do ER, apoplastu a za extracelulámí sekreci z aleuronových buněk (Koehler & Ho, Plant Cell 2: 769783 (1990)) . Kromě toho aminokoncové sekvence společně s karboxykoncovými sekvencemi zodpovídají za cílení genového produktu do vakuoly (Shinshi et al. Plant Molec. Biol. 14: 357368 (1990) ) . Fúzí vhodných směrovacích sekvencí zmíněných výše s heterologním polynukleotidem podle vynálezu je možné nasměrovat genový produkt do jakékoliv organely nebo buněčného kompartmentu.

Pro transformaci rostlin jsou k dispozici četné vektory, které jsou odborníkům známy, a polynukleotidy podle vynálezu mohou být užity ve spojení s kterýmkoliv z těchto vektorů. Výběr vektoru závisí na zvoleném způsobu transformace a na druhu rostliny, která má být transformována. Pro různé rostliny jsou výhodné odlišné selekční markéry. K selekčním markérům rutinně užívaným pro transformace rostlin patří gen nptll, poskytující rezistenci ke kanamycinu a příbuzným antibiotikům (Messing & Vierra. Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al. , Nátuře 304:184-187 (1983)), gen bar, který poskytuje rezistenci k herbicidu fosfinotricinu (White et al. , Nucl. Acids Res 18: 1062 (1990), Spencer et al. Theor. Appl. Genet 79.: 625-631 (1990)), gen hph, který poskytuje rezistenci k antibiotiku hygromycinu (Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4: 29292931), a gen dhfr, který poskytuje rezistenci k methotrexatu (Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1983)), a gen EPSPS, •« ♦··· ·· ·· ·· ·· ♦ · * ·♦·· ···« • · · · · ·· · · · · · • ··· ······ · · · • · · · · · « · · «······ ·· ·· ·« ··

- 33 který poskytuje rezistenci ke glyfosatu (U.S. Patenty 4,940,935 a 5,188,642), gen fosfomanózoisomerázy manA, který poskytuje selektivní metabolickou výhodu v přítomnosti manózy (U.S. Patent 5,767,378 , který je celý vložen formou odkazu, a

Miles& Guest, GENE, 32:41-48 (1984)) a selektovatelný markér

PAT, který poskytuje rezistenci k herbicidu BASTA (Sung H. Park et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. - Plant, 34: 117-121 (1998)).

K dispozici je také mnoho vektorů pro transformaci zprostředkovanou Agrobacterium tumefaciens. Tyto vektory typicky nesou alespoň jednu hraniční sekvenci T-DNA a patří sem např. vektory jako je pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)). K typickým vektorů pro transformaci zprostředkovanou Agrobacterium patří binární vektory pCIB200 a pCIB2001, a také binární vektory pCIBlO a jejich deriváty pro hygromycinovou selekci (viz např. U.S. Patent 5,639,949).

Transformace bez použití Agrobacterium tumefaciens obchází požadavek na přítomnost sekvence T-DNA ve vybraném transformačním vektoru a kromě vektorů popsaných výše, které T-DNA sekvence obsahují, mohou být tedy použity také vektory, které tyto sekvence postrádají. Transformační techniky, které se neopírají o Agrobacterium, zahrnují transformaci prostřednictvím ostřelování mikročásticemi, absorpci protoplasty (např. PEG a elektroporace) a mikroinjekce. Výběr vektorů závisí převážně na selekci výhodné pro transformovanou odrůdu. K typickým vektorům vhodných pro transformaci nezprostředkovanou Agrobacterium patří pCIB3064, pSOG19 a pSOG35 (viz např. U.S. Patent 5,639,949).

Jakmile je požadovaný polynukleotid jednou zaklonován do expresního systému, transformuje se (tj . přenese transformací) do rostlinné buňky. Metody transformace rostlinné buňky a φφ φφφφ φφ φφ φφ φφ •φφ φφφφ φφφφ φφφφ φ φφ φ φ φφ · φ φφφφ φφφ φ · φ · φ φ φφφ φφφφφ φφφφ φφφ φφ φφ φφ ·Φ

- 34 regenerace rostlin jsou v oboru dobře známy. Tak např. pro přenos cizorodé DNA byly užity Ti-plazmidové vektory, přímý příjem DNA, liposomy, elektroporace, mikroinjekce a mikročástice. Kromě toho lze pro transformaci rostlinných buněk užít bakterie z rodu Agrobacterium.

Metody transformace dvouděložných rostlin jsou v oboru dobře známy a patří sem dvě základní skupiny metod: metody založené na použití Agrobacterium a metody transformace bez použití Agrobacterium. K druhému z uvedených typů metod patří přímý příjem genetického materiálu protoplasty nebo buňkami. Toho lze dosáhnout tzv. příjmem zprostředkovaným PEG nebo elektroporací, ostřelováním mikročásticemi nebo mikroinjekcemi. V každém z těchto případů se pak buňky regenerují na celé rostliny, a sice metodami, které jsou odborníkům známy.

Transformace většiny jednoděložných rostlin je v dnešní době rutinní záležitostí. K výhodným metodám patří přímý přenos DNA do protoplastu pomocí PEG nebo metodou elektroporace, ostřelováním kalusových kultur mikročásticemi, a případě i transformace zprostředkovaná Agrobacterium. Cílové tkáně lze odvodit z takových zdrojů jako je např. kultivar pšenice UC703 nebo genotyp kukuřice CG000526. Tak např. transformace kukuřice zprostředkovaná Agrobacterium se může provádět postupme popsaným v U.S. patentové přihlášce 09/089,111, která je vložena formou odkazu, a která byla publikována jako dokument WO 98/54961), a transformace ječmene se může provádět postupem např. podle publikací M. Cho, J. Wong, C. Marx, W. Jiang, P. Lemaux and B. Buchanan (1999). Overexpression of thioredoxin h leads to enhanced activity of starch debranching enzyme (pullulanase) in barley grain. PNAS 96: 14641-14646; S.

Zhang, M. Cho, T. Koprek, R. Yun, P. Bregitzer and P. Lemaux ·· ···· ·· ·· ·· ·· ··· · · · 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 Φ · · · ·

9 · · »···♦· 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9 (1999). Genetíc transformátion of commercial cultivars of oat (Avena sativa L.) and barley (Hordeum vulgare L.) using in vitro shoot meristematic cultures derived from germinated seedlings. Plant Cell Rep. 18: 959-966; P. Bregitzer, S. Harlbert and P. Lemaux (1998). Somaclonal variation in the progeny of transgenic barley. TAG 96: 421-425; M. Cho, W. Jiang and p. Lemaux (1998). Transformation of recalcitrant barley cultivars through improvement of regenerability and decreased albinism. Plant sci. 138: 229-244; P. Lemaux, m. Cho, S. Zhang, and p. Bregitzer (1998). Transgenic cereals: Hordeum vulgare L.

- current status and future prospects. In: Vasil I, Phillips R (eds) Molecular Improvement of Cereal Crops, Kluwer Academie Publ, Dordrecht, The Netherlands, pp 255-316; S. Zhang, R. Williams-Carrier, D. Jackson, and P. Lemaux (1998) . Expression of CDC2Zm and KN0TTED1 during in vitro aaxillary shoot meristem proliferation and adventitious shoot meristem formation in maize (Zea mays L.) and barley (Hordeum vulgare L.) . Planta 2 04: 542-54 9; D. McElroy, J. Louwerse, S. McElroy and P.

Lemaux (1997). Development of a simple transient assay for Ac/Ds activity in cells of intact barley tissue. Plant J. 11: 157-165; S. Tingay, D. McElroy, R. Kalia, S. Fieg, M. Wang, S. Thornton and R. Brettell (1997). Agrobacterium tumefaciensmediated bareley transformation. The Plant J. 11: 1369-1376;

J.Qureshi, Z. Basri, R. Singh, R. Burton, M. Dalton, J. Kollmorgen and G. Fincher. 1988. Agrobacterium-mediated transformation of two varieties of barley (Hordeum vulgare L.) Proč. 42^nd. Conference of Australian Society for Biochemistry and Molecular Biology, September 28-October 1, 1998, Adelaide, Australia; J. Qureshi, R. Singh, Z. Basri, R. Stewart, R. Burton, J. kollmorgen and G. Fincher (1997). Strategies for genetic transformátion of elite Australian barley varieties. Proč. 8th. Aust.Barley Technical symp. Gold Coast, Queensland, 7-12 September 1997. 2:8.9-11; P. Lemaux, M. Cho, J. Louwerse, R. Williams and Y. Wan (1996). Bombardment-mediated transformation methods for barley. Bio-Rad US/EG Bull 2007: 16; T. Koprek, R. Hansch, A. Nerlich, R. Mendel and J. Schulze (1996). Fertile transgenic barley of different cultivars obtained by adjustment of bombardment conditions to tissue response. Plant Sci. 119: 79-91; T. Hagio, T. Hirabayashi, H. Machii and H. Tomutsune (1995) . Production of fertile transgenic barley (Hordeum vulgare L.) plants using the hygromycin-resistance markér. Plant Cell Rep. 14: 329-334; H. Funatsuki, H. Kuroda, M. Kihara, P. Lazzeri, E. Muller, H. Lorz and I. Kishinami (1995). Fertile transgenic barley regenerated by direct DNA transfer to protoplasts. TAG 91: 707-712; A. Jahne, D. Becker, R. BrettSchneider and H. Lorz (1994). Regeneration of transgenic, microscpore-derived, fertile barey. TAG 89: 525-533; Y. Wan and P. Lemaux (1994). Generation of large numbers of independently transformed fertile barley plants. Plant Physiol. 104: 37-48;

Polynukleotid podle vynálezu může být užit k přenesení rezistence k trichothecenu do širokého spektra rostlinných buněk krytosemenných rostlin, jak dvouděložných tak i jednoděložných. Ačkoliv polynukleotid podle vynálezu může být transformován do buněk rostliny prakticky jakéhokoliv biologického druhu, výhodně jde o buňky agronomicky důležitých plodin jako jsou rýže, pšenice, ječmen, žito, kukuřice, ječmen, brambor, topinambur, tuřín, dýně, tykev, cukina, meloun, sója a čirok. Polynukleotid rezistence k trichothecenu podle vynálezu může být užit v kombinaci s dalšími vlastnostmi důležitými pro

- 37 produkci a kvalitu. Polynukleotidy podle vynálezu mohou být vneseny do rostlinných linií prostřednictvím šlechtění, které jsou odborníkům známy.

Jakmile se získá alela genu rezistence k trichothecenu transformací do kulturní rostliny nebo do buněnčné kultury, ze které se může regenerovat kulturní rostlina, může pak být přenesena do komerčních odrůd metodami tradičního šlechtění, takže se získají plodiny s rezistencí k trichothecenu bez nutnosti genetického inženýrství alely a její transformace do plodiny.

Různě kroky šlechtění jsou charakterizovány definovanými zásahy člověka, jako je např. výběr linií pro křížení, přímé opylování rodičovských linií nebo výběr vhodných rodičovských rostlin. V závislosti na požadovaném výsledku se provádějí různá šlechtitelská opatření. Odpovídající metody jsou odborníkům známy, a patří k nim (i když výčet není omezující) hybridizace, inbreeding, zpětné křížení, víceliniové křížení, křížení variet, mezidruhovou hybridizaci, aneuploidní techniky apod. K metodám hybridizace patří také sterilizace rostlin, kdy se získávají rostliny se samčí nebo samičí sterilitou mechanickými, chemickými nebo biochemickými metodami. Opylení rostliny se samčí sterilitou pylem jiné linie zajistí že genom rostliny se samčí sterilitou ale samičí fertilitou získá uniformně vlastnosti obou rodičovských linií. Takže transgenní semena a rostliny podle předkládaného vynálezu se mohou použít pro šlechtění zlepšených linií rostlin, které např. vykazují buďto žádný nebo snížený růst houbových infekcí na rostlině nebo v rostlinném pletivu nebo semenu, a tudíž jsou schopny zabránit kontaminaci rostliny, pletiva nebo semen mykotoxiny.

♦ ♦ «φφφ ·· φφ φφ φφ *»· ·φφφ φφφφ • ··· φφφφ φφφφ • ·Φ· φ * φ φ φ φ φφ φ « φφφ «φφφφ • φφφ φφφ ·· φφ φφ φφ

Vlastnosti rezistence k trichothecenu vnesené do transgenních semen a rostlin popsaných výše jsou přenášeny pohlavním rozmnožováním nebo vegetativním růstem a mohou tak být udržována a rozmnožovány v dalších generacích rostlin. Obecně takové udržování a rozmnožování užívá metody zemědělství vhodné pro specifické účely jako je kultivace půdy, setí nebo sklízení. Lze také užít speciální metody jako je hydroponie nebo pěstování ve sklenících. Jelikož jsou rostoucí plodiny náchylné k napadení a poškození hmyzem nebo infekcemi, a také kompeticí s plevely, je třeba podniknout opatření proti plevelům, chorobám, hmyzu, nematodám, a dalším škůdcům, ke zlepšení výnosů. Mohou tom být jak mechanická patření, jako je kultivace půdy bránami nebo odstraňování plevelů nebo nemocných rostlin, tak i použití agrochemikálií jako jsou herbicidy, fungicidy, gametocidy, nematicidy, růstové regulátory, agens pro dozrávání a insekticidy.

V semenářství jsou kvalita klíčení a uniformita osiva nezbytnými charakteristikami produktu, zatímco kvalita klíčení a uniformita semen sklízených a prodávaných farmáři nejsou tak důležité. Jelikož je obtížné udržovat plodinu v čistém stavu bez příměsi semen jiné plodiny nebo plevelu, kontrolovat nemoci přenášené semeny, a produkovat osivo s dobrou kvalitou klíčení, značně obsáhlé a dobře definované techniky výroby osiva byly vyvinuty producenty osiva, kteří mají zkušenosti s pěstováním, udržováním a prodejem čistého osiva. Je běžnou praxí, že farmář kupuje certifikované osivo odpovídající kvalitativním standardům, místo aby používal osivo z vlastní úrody. Materiál používaný jako osivo je obvykle ošetřen ochrannou vrstvou obsahující herbicidy, insekticidy, fungicidy, baktericidy, nematicidy, moluscicidy nebo jejich různé směsi. Obvykle

- 39 • · ♦ · · ♦ · · «· ti··· ti · · · · ··· • · · · ······ ·· · • ··· ti · ti ·· ··· ·«· 99 99 9999 užívané ochranné vrstvy obsahují sloučeniny jako kaptan, karboxin, thiram (TMTD®) , metalaxyl (Apron®) a pirimifosmetyl (Actellic®) . Pokud je to potřeba, tyto sloučeniny tvoří prostředek společně s dalšími pomocnými látkami, nosiči, surfaktanty nebo adjuvans usnadňujícími aplikaci, což běžně užívá v oboru prostředků pro ochranu před poškozením bakteriálními, houbovými nebo živočišnými škůdci. Ochranná vrstva se může aplikovat impregnací osiva tekutým prostředkem nebo kombinovanou aplikací kapalného a suchého prostředku. Jiné způsoby aplikace lze také použít, např. přímé ošetření pupenů nebo plodů.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká nových metod v zemědělství, které byly např. zmíněny výše, kdy se užívají transgenní rostliny, transgenní rostlinný materiál nebo transgenní semena podle vynálezu.

V jiném provedení se předkládaný vynález týká transgenních rostlin, rostlinných buněk, pletiv, orgánů, semen nebo částí rostlin, získaných z transgenních rostlin. Vynález zahrnuje také potomstvo transgenních rostlin podle vynálezu, a také transgenní rostlinné buňky, pletiva, orgány, semena a části rostlin získané z transgenních rostlin podle vynálezu.

V jiném provedení vynálezu heterologní polynukleotid podle vynálezu se užije také jako selekční markér při transformaci. V tomto provedení vynálezu je transgenní rostlina transformována požadovaným druhým heterologním polynukleotidem a také heterologním polynukleotidem podle vynálezu, který kóduje genový produkt kódující aktivitu rezistence k trichothecenu, a sice pomocí expresních kazet a metodami, které jsou odborníkům známy, a jejichž příklady byly zmíněny výše. Po transformaci se transformované rostlinné buňky

- 40 φ φ «φφφ «φ ·« φφ φφ • φφ φφφφ φφφφ φ φφφ φφφ* φφφφ φ φφφ φφφφφφ φφ φ φ φφφ φ * φ φ φ φφφφ φφφ φφ φφ φφ φφ selektují podle schopnosti přežívat po expozici trichothecenu, jako je zejména DAS, DON nebo T-2 toxin. Hostitelská buňka je eukaryotická nebo prokaryotická hostitelská buňka, která je transformována pomocí expresních kazet a metodami, které jsou odborníkům známy. Hostitelská buňka je rostlinná buňka, buňka houby, bakteriální buňka, buňka kvasinky, zvířecí nebo i hmyzí buňka.

Ve zvláště výhodném provedení se polynukleotid podle vynálezu, který kóduje genový produkt obsahující aktivitu rezistence k trichothecenu, užije jako selekční markér při transformaci rostlin. Tak např. rostliny, rostlinná pletiva, semena nebo rostlinné buňky exprimující alespoň druhou požadovanou heterologní DNA sekvenci podle vynálezu mohou být transformovány tak, aby exprimovaly sekvenci kódující polypeptid obsahující sekvenci v podstatě podobnou sekvenci id. č. 2, 6 nebo 8. Transformované buňky se pak přenesou na médium obsahující fytotoxický trichothecen, zejména DAS a/nebo DON a/nebo T-2 toxin, a to v množství dostatečném k inhibici růstu nebo přežívání buněk, které neexprimují polypeptid v podstatě podobný sekvenci id. c. 2, 6 nebo 8, přičemž pouze transformované buňky porostou nebo jejich růst nebude inhibován. Koncentrace trichothecenu vhodná pro selekci rostlin exprimujících polypeptid v podstatě podobný aminokyselinové sekvenci id. č. 2, 6 nebo 8, je v rozmezí 1 μg/ml až 90 μg/ml . Tato metoda je použitelná pro jakékoliv rostlinné buňky schopné exprimovat polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci v podstatě podobnou nukleotidové sekvenci id. č. 1, 5 nebo 7, a může se užít s jakoukoliv požadovanou heterologní sekvencí DNA. Exprese druhé heterologní sekvence DNA a heterologního polynukleotidu podle vynálezu může

·· ····	• A	·♦		··
φ · Φ	♦	•	♦	•	r	*	•	•
• · ··	•	•	*	•	•	•	•	•
• ·	* ·	•		• · ·	• ·	•	•	•
• ·	•	•		•	•	•	•	•
	··					·«

být řízena stejným promotorem, který je funkční v rostlinné buňky, nebo samostatnými promotory.

Popis sekvencí uvedených v seznamu sekvencí:

Sekvence id. č.

je cDNA sekvence z

Fusarium sporotrichioides kódující polypeptid předkládaného vynálezu mající aktivitu rezistence k trichothecenu

Sekvence id. č. 2 je polypeptid mající aktivitu rezistence k trichothecenu kódovaný sekvencí id. č. 1

Sekvence	id.	XZ c.	3	j e DNA primer.
Sekvence	id.	xz c.	4	je DNA primer.
Sekvence	id.	xz c.	5	je DNA sekvence z Fusarium graminearum

kódující polypeptid předkládaného vynálezu mající aktivitu rezistence k trichothecenu

Sekvence id. č. 6 je polypeptid mající aktivitu rezistence k trichothecenu kódovaný sekvencí id. Č. 3.

Sekvence id. č. 7 je DNA sekvence ze Saccharomyces cerevisiae kódující polypeptid předkládaného vynálezu mající aktivitu rezistence k trichothecenu

Sekvence id. č.	8 je	polypeptid	maj ící	aktivitu
stence k trichothecenu kódovaný sekvencí	id. č.	5.
Sekvence	id.	č.	9 je	DNA sekvence vektoru pCIB9818.
Sekvence	id.	č.	10	je	DNA sekvence	vektoru	pAgroTRIr.
Sekvence	id.	č.	11	je	DNA sekvence	vektoru	pNOV1704 .

- 42 ·* ·*·· .· ·· ·· ·« • · * ···· · · , , • ··· · · * * · ·« · • ... ····.· ·. , • ·»» ·«·** »»··,·« ·· ·· *· ·«

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady popisují materiály a metody použité při realizaci předkládaného vynálezu a také získané výsledky. Slouží pro ilustraci popsaného vynálezu a rozsah vynálezu přitom nijak neomezují.

Příklad 1

Plazmidy pNOV1700, pCIB9818, pAgroTRIr a pNovl704

1. pNOV1700:

Plazmid pNOV1700 byl uložen v souladu s Budapešťskou smlouvou 19. března 1999 ve sbírce patentovaných kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 Northern University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, pod číslem NRRL B-30117.

pNOV1700 obsahuje sekvenci id. č. 1 operativně spojenou s ubikvitinovým promotorem ze Z.mays, včetně části exonu a intronu, a polyadenylační signál nopalinsyntázy.

2. pCIB9818

Plasmid pCIB9818 je kruhový plazmid velikost 6111 půrů baží mající sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 9. Ubikvitinový promotor ze Z.mays, báze 12 až 1993 sekvence id. č. 9, včetně části exonu a intronu, báze 896 až 1011, a intron, báze 1047 až 1993, je operativně spojený se selekčním markérem, což je manózofosf átisomeráza, báze 2090 až 3193,

- 43 *· *· ·* ·» • ·· · · «·* • ··» » ·· ♦ e ··* • · · » · ♦»· · · ··<

» ·»» « « « , « *»·««·· *· ·· ·· ·* invertovaným PEPC intronem č. 9, báze 3248 až 3355 a terminační sekvencí genu CaMV 35S, báze 3357 až 3434.

3. pAgroTRIr

Plasmid pAgroTRIr je cirkulární binární vektor velikosti 13,737 párů baží, který má DNA sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 10. pAgroTRIr obsahuje selekční markér operativně spojený s promotorem a terminanční sekvencí, a polynukleotidovým úsekem majícím sekvenci id. č. 1 ležícím za a navíc v souhlasném čtecím rámci s UBI 3 promotorem z Arabidopsis thaliana (S. Norris, S. Meyer, and J. Callus, Plant Molecular Biology 22:895-906, (1993)) a současně před a v souhlasném čtecím rámci s polyadenylačním signálem nos

4. pNovl704

Plasmid pNOV1704 je cirkulární binární vektor velikosti 12949 párů baží mající DNA sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 11. Ubikvitinový promotor ze Z. mays, báze 11 až 1992 v sekvence id. č. 11 (obsahující exon 1: 895 až 1010 a intron 1: 1046 až 1992) je operativně spojený se sekvencí selekčního markéru, což je manózofosfátisomeráza, báze 2089 až 3192, a terminační sekvencí nopalinsyntázy, báze 3557 až 3688. pNOV1704 dále obsahuje ubikvitinový promotor ze Z. mays, báze 9218 až 11218 (obsahující exon 1: 10110 až 10224 a intron 1: 10225 až 11218), operativně spojený se sekvencí id. č. 1 trichothecen 3-O-acetyltransferázy, báze 11234 až 12662, a terminační sekvencí noc, báze 12667 až 12935.

*· ΦΦΦΦ *· |· φφ ·· • · · Φ φ Φ Φ Φ Φ « Φ

ΦΦΦΦ 9 Φ Φ Φ · Φ 4 Φ

Φ φφφ φ ΦΦΦ φ φ φ « φ * »φφ ΦΦΦΦΦ

ΦΦΦ · ΦΦΦ ΦΦ φ· φ· »«

- 44 Transformace, selekce a regenerace pšenice

Příklad 2

Transformace

Nezralá zygotická embrya (0.75-1.25mm) byla vyříznuta ze sterilizovaných (10% Chlorox X 10 minut) obilek pšenice, a pak byla položena skutelem (štítkem) nahoru na misky s MS médiem (Murashige and Skoog, (1962)

Physiol.

Plant

15:473-439)

3% sacharózu, obsahuj ícím dichlororfenoxyoctovaá), 150mg/l

3mg/l

2,4-D glutamin, (kyselina

75mg/l asparagin, a zpevněným 0,7% phytagarem (3MS3S médium).

Embrya pak byla inkubována ve tmě při 28°C po 5-10 dnů před transformací.

Optimální doba pro transformaci ostřelováním mikročásticemi je až 7 dnů po umístění na misku. 4 hodiny před ostřelováním byla embrya umístěna na plazmolytické médium (tj. stejné médium jak bylo popsáno výše, avšak místo sacharózy obsahující 15% maltózu) uspořádána v krizích o průměru směřujícím nahoru.

Vektor pNOV1700 popsaný v příkladu restrikčními enzymy PvuII a XmnI a fragment

2,5 cm skutelem byl naštěpen velikosti 4117 bp obsahující polynukleotidový úsek mající sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 1 s ubikvitinovým promotorem a polyadenylačním signálem nos, byl izolován. pCIB9818, také popsaný v příkladu 1, byl naštěpen restrikčním enzymem AscI a fragment velikosti 4246 bp obsahující UBI promotor z kukuřice, selekční markér a terminační sekvenci CaMV 35S, byl izolován.

Izolované fragmenty DNA byly precipitovány na zlaté mikročástice velikosti 0,3 μπι standardní Sanfordovou metodou. Za souvislého třepání (vortex) bylo do mikrozkumavky Eppendorf,

*9 99 9 9	9*	9«	• 9	99
• * ·	•	9	9 9	9	9	9	9
• 99«	•	•	9 9	9	9	9	9
9 · ·	« ·	999 9	•	9	9	9
• 9	• 9 99	9 99	9 • 9	9	9 9 99

obsahující 50 μΐ 50% glycerolu a 3 mg zlata, přidáno 5 μ9 izolovaného DNA fragmentu pro každý konstrukt, 50 μΐ 2,5M CaCl₂ a 20 μΐ O,1M spermidinu. Směs DNA/zlato pak byla dvakrát opláchnuta ethanolem. Po odstranění supernatantu z druhého opláchnutí byl přidán ethanol na výsledný objem 70 μΐ. V každé zkumavce tak byla DNA/zlato pro 6 použití. Cílové misky byla ostřelovány dvakrát, takže bylo na cílovou misku vneseno asi 3 pg DNA (když bylo použito 5 μ9 každého konstruktu, což bylo obvyklé) a 1,0 mg zlata. Použitý tlak byl 6,895 MPa (1000 psi). Po ostřelování byly cílové misky vráceny do tmy a tam ponechány přes noc, Po přibližně 24 hodinách plasmolýzy byla embrya vyjmuta a vložena na 3MS3S a inkubována další 3 týdny ve tmě pro iniciaci kalusu. V tomto období nebyla žádná subkultivce.

Selekce a regenerace

Embryogenní pletivo, které se vyvinulo v průběhu 3týdenního iniciačního období bylo odříznuto od ostatního pletiva a umístěno na regenerační/selekční médium. Základní regenerační médium je médium 3MS3S bez 2,4-D, ale s lmg/1 GA3 (Gibberellin A3)a NAA (1-naftalenoctová kyselina), nazývané NG médium. Je přidáno 10g/l manózy a 5g/l sacharózy (médium NG1M.5S). Pletivo je vystaveno této iniciační fázi regenerace po dobu 2 týdnů. Po většinu této doby je pletivo umístěno na světle. Vývoj nadzemních částí a kořenů začíná v průběhu této fáze a po dvou týdnech vstupují všechna pletiva do další fáze.

Druhou fází je regenerace a selekce s manózou, kdy je manóza snížena na 5g/l a sacharóza zvýšena na 20g/l (MS2S.5M.

Pletiva jsou ponechána na tomto médiu obvykle 4 týdny, v jejichž průběhu dojde k dalšímu vývoji nadzemních částí a kořenů.

····	··	99	99	• 9
• · ·	•	•	• ·	•	•	•	•
• 999	• ·	• 9	•	•	•	•
• · ·	•	•	··· ·	9 9	•	•
• ·	• · ·*	• 99	• · 99	• 99	•

Dobře rostoucí rostlinky s dobrým zbarvením a rozvinutou nadzemní částí i kořeny jsou vyjmuty z misky a umístěny do větších kultivačních nádobek zvaných GA7. To je závěrečné stadium selekce a regenerace. Médium obsahuje pouze 1/2 MS solí a 15g/l manózy. Nej lepším indikátorem toho, že rostliny byly transformovány, je aktivní růst kořenů v médiu. Byly odebrány vzorky pletiva listů z aktivně rostoucích rostlinek a bylo na nich provedeno PCR jednak pro požadovaný gen i pro selekční markér, před tím, než byly rostlinky přeneseny do skleníku.

Příklad 3

Transformace Arabidopsis thaliana

Konstrukty binárního vektoru pAgroTRIr popsané v příkladu 1 byly transformovány do Agrobacterium tumefaciens kmenu GV3101 (Bechtold, N. et al., CR Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie, 316:1194-1199 (1993)) elektroporací (Dower, W.J., Mol. Biol.

Rep 1:5 (1987). 25ml kultura z jediné kolonie Agrobacterium

GV3101 obsahující pAgroTRIr v médiu YEB + Rifampicin 100 a Kanamycin 100 byla inkubována přes noc ve 30 °C. Velké kultury byly zahájeny inokulací 500 ml téhož média užitím 5 ml předchozí menší kultury a opět inkubovány přes noc ve 30 °C. OD při 600 nm a pak byly kultury stočeny při 5 K 15 minut v rotoru GSA. Buňky pak byly resuspendovány v IM modifikovaném infiltračním médiu na finální OD při 600 nm 0,08. Bylo přidáno 200 μΐ Silwetu na 1 1 resuspendovaných buněk. 3 květináče s Arabidopsis ekotypu Columbia po 4 rostlinách byly otočeny a ponořeny do 500 ml buněčné suspenze. Rostliny byly v suspenzi • · • · · · • ·

- 47 protřepány, aby se odstranily vzduchové bubliny a pak v suspenzi inkubovány 15 minut. Pak byl na tác s rostlinami položen kryt, aby zůstaly vlhké přes noc.

Pak byly rostliny ponechány růst 3 až 4 týdny, a pak byly jeden týden rostliny ponechány bez zavlažování. Tobolky se semeny byly sklizeny a asi jeden a půl týdne sušeny. Semena pak byla vyseta a ponechána růst asi dva týdny. Pak byly rostliny postříkány selekčním činidlem, a postřik byl opakován o dva dny pozděj i a pak znovu o čtyři dny pozděj i. Po třech dnech byly přežívající rostliny přeneseny do nových květináčů.

Příklad 4

Transformace kukuřice ostřelováním mikročásticemi

Kultury embryogenního kalusu typu I (Green et al 1983, Sómatic cell genetic systems in corn. A. Fazelahmad, K. Downey, J. Schultz, RW Voellmy, eds. Advances in Gene Technology: Molecular Genetics of Plants and Animals. Miami Winter Symposium Series, Vol. 20. Academie Press, NY.) byly iniciovány z nezralých embryí kukuřice, která byla velká 1,5 až 2 mm a pocházela z materiálu pěstovaného ve skleníku. Embrya byla asepticky vyjmuta z povrchově sterilizovaných palic přibližně 14 dnů po opylení. Embrya pak byla umístěna na D médium iniciující kalus (Duncan et al,(1985) Planta 165:pp322-332) s 2% sacharózou a 5mg/l chlorambenu. Embrya a embryogenní kultury se pak inkubovaly ve tmě. Embryogenní kalusy jsou pak po 14 dnech odděleny z explantátů. Kalusy se pak umístí na D médium pro udržování kalusu s 2% sacharózou a 0,5mg/l 2,4-D. Po ·· ···· · · · · ·· ·· • · · · · · · · · · · • · ·· · · · · · · · · • · · · ······ ·· · • · · · ····· ······« ·· ·· ·· ··

- 48 6 týdnech, kdy byly každý týden přesazeny na nové udržovací médium, se stabilizovaly kompaktní embryogenní kultury. Aktivně rostoucí embryogenní kalusy byly vybrány jako cílová pletiva pro přenos genů ostřelováním. Kousky kalusu byly umístěny na cílové misky obsahující udržovací médium s 12% sacharózou přibližně 4 hodiny před vlastním přenosem genů.

Kousky kalusů byly uspořádány do kruhů o průměru 8 a 10 mm ve středu cílové misky.

Vektor pNOV1700, popsaný v příkladu 1, byl naštěpen restrikčními enzymy PvuII a XmnI a byl izolován fragment velikosti 4117 bp obsahující polynukleotidový úsek mající sekvenci id. č. 1, promotor a polyadenylační signál. Vektor pCIB9818, také popsaný v příkladu 1, byl naštěpen restrikčním enzymem As cl a byl izolován fragment velikosti 4246 bp obsahující markerový gen, promotor a terminační signál.

Izolované fragmenty

DNA byly precipitovány na zlaté mikročástice postupem, který je popsán v příručce k zařízení

DuPont Biolistics. 2 až 3 μg každého plazmidového konstruktu bylo použito pro přípravu náplně pro 6 výstřelů. Polynukleotid podle vynálezu byl přenesen do cílového pletiva pomocí zařízení PDS-lOOOHe Biolistics. Nastavení parametrů uvedeného ostřelovacího zařízení bylo následující: 8 mm mezi rozrušovacím diskem a mikročásticemi, 10 mm mezi mikročásticemi a zastavovací mřížkou a 7 cm mezi zastavovací mřížkou a cílem.

Každá cílová miska byla zasažena dvakrát užitím rozrušovacích disků s tlakem 4,482 MPa (650 psi). Mřížka z nerezové oceli 200 X 200 mesh (McMaster-Carr, New Brunswick, NJ) byla umístěna mezi zastavovací mřížku a cílovou misku. Sedm dní po ostřelování byly kousky cílového pletiva přeneseny z vysoce osmotického média na selekční médium.

• ·

Cílové pletivo bylo umístěno na udržovací médium bez sacharózy a obsahující 1% manózu. Po 3 až 5 týdnech byly rostoucí kousky kalusů subkultivovány na udržovací médium bez sacharózy a obsahující 1,5% manózu. Embryogenní kalusy rostoucí na selekčním médiu byly subkultivovány každé dva týdny po dobu 6 až 10 týdnů, dokud nebyl k dispozici dostatek kalusů pro regeneraci alespoň 10 až 20 rostlin. Pletivo přežívající selekci z původního kousku cílového pletiva bylo subkultivováno jako jediná kolonie a bylo považováno za výsledek jediné transformační události. Kolonie byly přeneseny na modifikované MS médium (Murashige and Skoog, 1962 (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15: 473-497.) obsahující 2% sacharózu a 1% manózu (MS2S+1M) s 0,25 mg/1 ancymidolu a 0,5 mg/1 kinetinu. Po dvou týdnech byly regenerující kolonie přeneseny na médium MS2S+1M bez hormonů. Regenerující nadzemní části s kořeny nebo bez kořenů ze všech kolonií byly přeneseny do kultivačních boxů Magenta obsahujících médium MS3S a malé rostlinky s kořeny takto získané byly přeneseny do půdy ve skleníku.

Příklad 5

Analýza exprese v transgenních rostlinách

Pletiva transgenních rostlin byla analyzována na přítomnost polynukleotidu obsahujícího sekvenci id. č. 1. DNA byla extrahována z pletiva transformovaných rostlin a standardním způsobem byl proveden test metodou PCR. Pro amplifikaci genového konstruktu byly užity následující primery • ·

- 50 5'-acgaatcattcaccgaggag-3'(SEQ ID No. 3) a

5¹-ctcacactctcaggcttacc-3'(SEQ ID NO. 4).

Fragment velikosti 650 nt ze sekvence id. č.l byl detekován u pšenice získané podle příkladu 2.

Northern analýza

Transgenní rostliny byly analyzovány na přítomnost RNA metodou Northern hybridizace. RNA extrahovaná z rostlinných pletiv byla rozdělena elektroforézou na gelu a pak přenesena na nylonovou membránu. Tato membrána pak byla hybridizována s radioaktivní sondou, získanou ze Styl fragmentu velkého 429 nt ze sekvence id. č.l. Specifická RNA byla detekována u rostlin pšenice a Arabidopsis transformovaných podle příkladu 2 a 3 .

Příklad 6

Enzymatický test na trichothecen 3-O-acetyltransferázovou aktivitu

a) Extrakce rostlinného pletiva pro enzymový test:

Tři kousky listu velikosti 1 x 1/8 palce (přibližně 50 mg) byly odebrány z transgenních rostlin podle vynálezu transformovaných a regenerovaných podle příkladu 2 až 4.

b) Drcení vzorku se skleněnými perličkami

Vzorek pletiva byl vložen do 2 ml zkumavky s kulatým dnem a víčko zkumavky bylo uzavřeno. Zkumavka byla vložena kapalného dusíku a pak přes noc byla uložena v -80 °C.

« · · ·

- 51 Zkumavka byla protřepána 24 sekund na třepačce a byly přidány

0,4 ml pufru z fosforečnanu sodného. Pal byla zkumavka protřepána 10 sekund na vortexu a uložena na led.

Pak byla protřepána na vortexu dalších minut a stočena v mikrocentrifuze Eppendorf při 14

000 rpm. Supernatant byl odebrán a přenesen do čisté zkumavky.

Byly smíchány následující složky:

Trichothecenový substrát: 2 μΐ DAS (20% aceton v 50 mM pufru fosoforečnanu sodného s pH 7,0). Může být užit také DON.

- Acetyl CoA substrát: 2 μΐ [¹⁴C]-acetyl CoA, NEN katalog, č. NEC313 (60 mCi/mmol a 0,02 mCi/ml)

- Pufr: reakční směs doplněna na objem 50 μΐ fosfátovým pufrem s pH 7,0

Test byl iniciován přidáním následujícího enzymového preparátu do reakce, která pak byla inkubována 15 minut při °C.

Enzymový preparát: 10 μΐ rostlinného extraktu ve fosfátovém pufr o pH 7,0.

Po 15 minutách bylo přidáno 100 μΐ ethylacetátu a zkumavky byla dvakrát protřepána na vortexu po několik sekund. Pak byla zkumavka stočena 2 minuty při 14000 rpm na mikrocentrifuze Eppendorf. 50 μΐ ethylacetátové frakce bylo odebráno a přidáno do jiné zkumavky obsahující scintilační koktejl. Tato zkumavky pak byla 2 minuty měřena scintilačním počítačem.

Bylo identifikováno dvacet samostatných rostlin pšenice získaných podle příkladu 2, které měly specifické aktivity

0,60 až 13,4 nmol acetylovaného produktu^g proteinu/15 minut.

Specifické aktivity transformovaných rostlin pšenice byly významně vyšší než u negativní kontroly. Negativní kontrola je netransformovaný kultivar pšenice, který má specifickou • · φφφ· ·· ···· ·· • · · φφφ· · · ·φ φφφφ · · φ · · φ ·· • ΦΦΦΦ ··· 9 9 9 9· • · φ · · Φ Φ Φ·

ΦΦΦΦ ΦΦΦ ΦΦ ···· ··

- 52 aktivitu 0,1 až 0,2 nmol acetylovaného produktu/gg proteinu/15 minut.

Pět jednotlivých rostlin Arabidopsis získaných podle příkladu 3 mělo specifické aktivity 3,8 až 28 nmol acetylovaného produktu^g proteinu/15 minut. Specifické aktivity transformovaných rostlin byly významně vyšší než u negativní kontroly. Negativní kontrol byly rostliny Arabidopsis thaliana var. Columbia transformované konstruktem nukleové kyseliny pro expresi selekčního markéru, které mají specifickou aktivitu nižší než 0,1 nmol acetylovaného produktu^g proteinu/15 minut.

Byly identifikovány rostliny kukuřice alespoň ze dvou různých transformant získaných podle příkladu 4 mající specifické aktivity v rozmezí 11,1 to 17,9 nmol acetylovaného produktu^g proteinu/15 minut. Specifické aktivity transformovaných rostlin byly významně vyšší než u negativní kontroly. Negativní kontrol byly netransformované rostliny kukuřice, které měly specifickou aktivitu nižší než 0,2 nmol acetylovaného produktu/gg proteinu/15 minut.

Byly také identifikovány rostliny kukuřice z alespoň 16 různých transformant získaných pomocí transformace prostřednictvím Agrobacterium tumefaciens pNOV1704, které měly specifické aktivity 17 až 183 nmol^g/15minut.

Příklad 7

Biologický test rezistence transgenních rostlin k trichothecenu

Bylo připraveno 250 ml média CPR obsahující následující složky a hodnota pH byla pomocí KOH nastavena na 6,5:

MS soli

0,54 g

MS vitamíny

1,25 ml sacharóza 1% (volitelná) 2,50 g

Agaróza byla přidána do výše uvedeného média v koncentraci 1 % (2,50 g) a médium bylo sterilizováno v autoklávu. 25 ml chlorfenolové červeni o koncentraci 50 mg/ml bylo přidáno ke sterilnímu médiu.

Médium bylo udržováno na 55 °C a byl přidán DAS nebo DON v acetonu v různých koncentracích (DON - 4, 8 nebo 16 μΐ koncentrace 10 mg/ml nebo DAS - 2, 4 nebo 6 μΐ koncentrace na 1,7 ml). Médium bylo rozděleno přibližně po 0,5 ml do jamek 48jamkové mikrotitrační destičky.

Kousky pletiva, 0,85 x 0,32 cm (1/3 x 1/8) palce, transformovaných rostlin a také kontrolních rostlin divokého typu, byly vloženy do jamky mikrotitrační destičky. Listy byly odstříhány na Petriho misku a pak byly pinzetou vloženy do jamek. Mikrotitrační destička byla inkubována 2 až 4 dny ve 20 °C na světle. Metabolismus kousků listů vedl ke změně barvy (pokles pH) z červené na žlutou. Aktivita rezistence k trichothecenu nebo snížená citlivost transformant k trichothecenu vedla ke vzniku žlutého zbarvení v jamkách v přítomnosti DAS nebo DON.

Barevné změny z červené na žlutou ve srovnání s kontrolou, která zůstává červená, byly pozorovány u rostlin pšenice a • · ···· ·· ·· · · ·· ♦ ·· ♦ · · · · · ♦ * • · · · · · « · · · · · • ♦ · · · ··· · · · · · • ··· · · · · · ··«· ··· ·· ·· 99 ··

- 54 kukuřice podle vynálezu. Kromě toho jednotlivé listy projevovaly významné menší chlorotické změny než odpovídající listy kontrolních rostlin.

Příklad 8

Test klíčení

A. test rezistence na trichothecen pomocí klíčení

Setba z transgenních rostlin podle vynálezu je pěstována za selektivního tlaku selekčního agens a výsledné rostliny jsou pak samosprášeny. Výsledná setba je vyseta na médium MS3S (MS soli 4,3 g/1, MS vitamíny lOOx, sacharóza 30 g/1 a phytagar 8 g/1) a doplněna bud' DAS nebo DON (ve 20 mg/ml) v hustotě 1000 až 12 00 semen/Petriho misku (100 mm průměr) . Po inkubaci na světle po dobu 4 dnů je zjišťován růst sazenic na miskách.

Ze semen Arabidopsis z rostlin získaných podle příkladu 3 výše a pěstovaných v médiu obsahujícím DAS byly četné rostliny s rozvinutou kořenovou i nadzemní částí, zatímco kontrolní setba (parentální linie Arabidopsis, var. Columbia) klíčila špatně a nevytvářela žádné kořeny, když byla pěstována v médiu doplněném DAS. Mezi transformovanými a kontrolními semeny pěstovanými ve stejném médiu bez DAS nebyly pozorovány žádné rozdíly.

- 55 ··

B. Test rezistence na plísně pomocí klíčení pro detekci rezistence na hnilobu semenáčků

1. Test rezistence k houbám pomocí klíčení u pšenice

Testy rezistence k houbám pomocí klíčení u pšenice se prováděly v podstatě tak, jak bylo popsáno autory R. H. Proctor, T. M. Hohn a S. P. McCormick („Reduced virulence of Gibberella zeae caused by disruption of a trichothecene toxin biosynthetic gene, Mol.Plant-Microbe Interact. 8 (4):593-601,

1995), což je v úplnosti zahrnuto formou odkazu.

Inokulum se skládalo z makrokonidií F. gramiearum ředěných vodou na koncentraci 1 χ 10⁶ konidií na ml. Inokulum bylo připraveno promytim makrokonidií z tekutiny V-8 agarových kultur pěstovaných pod bílým světlem a pod světlem blízkého UV po dobu 7-10 dnů. V testech se semenáčky byla semena dvou různých transgenních pšenic z příkladu 2 výše a kontroly divokého typu povrchově sterilizována promytim v roztoku 10% chlorového běliciho přípravku a 0,05% Tween po dobu přibližně 15 minut a pětkrát propláchnuta sterilní destilovanou vodou. Semena jsou máčena v suspenzi makrokonidií po dobu přibližně 10 minut a pak jsou zaseta do 10 cm květináčů z umělé hmoty obsahujících vermikulit (20 semen na květináč). Před vysetím jsou květináče naplněny přibližně do vermikulitem a postaveny do 2 až 4 cm vody, dokud není vršek vermikulitu vlhký. Po vysetí jsou semena pokryta dalšími 1 až 2 cm vermikulitu a květináče jsou umístěny jednotlivě do igelitových sáčků a inkubovány týden v růstové komoře ve 22 °C při 16 hodinách světla a 8 hodinách tmy. Po přibližně jednom týdnu jsou květináče vyndány ze sáčků a po dvou týdnech je vyhodnoceno ·« 0 · · · · · · · 9 · 99 «0 · * 0 · *««· • 0 · · 9 · · · 9 99* • ··· ·»··»» 99· • · · 0·0·99

00000Φ 0· · ·Μ · * onemocnění spočítáním semenáčků, které se vyvinuly v každém květináči. Kontroly jsou ošetřeny tak, jak je popsáno výše s výjimkou, že semena jsou máčena ve sterilní vodě a je použito 40 semen.

Klíčilo 50 % a 43 % semen ze dvou různých transgenních rostlin ve srovnání se stejnými transgenními semeny ošetřenými vodou, zatímco z kontrolního divokého typu klíčilo 17 % ve srovnání se stejnými semeny ošetřenými vodou.

2. Test rezistence k houbám pomocí klíčení u kukuřice

Inokulum je vytvořeno z kultur F. graminearum pěstovaných na agaru z fazolí mungo (vyrobeném s tekutinou z vařených fazolí mungo) při 25 °C při střídajících se 12 hodinových cyklech světlo a tma. Spory jsou sklízeny tak, že se destička nejdříve zaplaví sterilní vodou a pak se seškrábne skleněnou tyčinkou. Roztok je sloučen a koncentrace spor je upravena na 1 x 10⁶ spór/ml dvojitě destilovanou sterilní vodou v den inokulace.

Půda skládající se ze sterilizované směsi zeminy, rašeliny a vermikulitu je inokulována 1 ml roztoku spór/litr půdy v 5 litrových plochých kultivačních nádobách a naočkovaná půda je smíchána v míchačce na beton 2 minuty na náklad. Kontrolní ošetření spočívalo v nezamořené půdě. Kultivační nádoby byly osety 30 zrny transgenní setby podle vynálezu nebo kontrolou divokého typu a inkubovány v růstových komorách udržovaných při 55 °F v semi-saturovaných půdních podmínkách po dobu 4 týdnů. Světelné podmínky byly 14 dnů po vysetí 24 hodin tma a 15 až 24 dnů po vysetí 12 hodin světla. K nádobám byly přidány kolíky * ·

- 57 s označením a nádoby byly přestěhovány do růstové komory a randomi zovány.

Jakmile se začaly objevovat rostliny, začalo jejich počítání a provádělo se denně nebo každý druhý den, dokud se vývoj rostlin nezastavil.

Byly určovány známky viditelné ztráty zbarvení a zastavení vývoje rostlin a použity k charakterizaci stupně rezistence rostlin ve srovnání s kontrolami divokého typu. Byly vybírány rostliny, které měly menší viditelnou ztrátu zbarvení a/nebo menší zastavení vývoje rostlin než kontroly divokého typu.

Příklad 9

Test rezistence k houbám

A. Testování transgenních rostlin pšenice

Snětí vrcholu nebo prašivina vrcholu pšenice je způsobována infekcí houbou Fusarium graminearum (také označovanou jako Gibberella zeae) . Kultury F. graminearum jsou pěstovány na V-8 agarovém médiu (připraveném s tekutinou V-8) nebo na agaru z fazolí mungo (připraveném s tekutinou z vařených fazolí mungo) při 25 °C při střídajících se 12 hodinových cyklech světlo a tma. Spory jsou sklízeny tak, že se destička nejdříve zaplaví sterilní vodou a pak se seškrábne skleněnou tyčinkou. Roztok je sloučen a koncentrace spór je upravena na 5 χ 10⁴ spór/ml dvojitě destilovanou sterilní vodou v den inokulace.

Transgenní rostliny jsou získány tak, jak je popsáno v příkladu 2 výše a kontrolní rostliny mohou být pěstovány ve skleníku do anteze nebo do uzrání. Vrcholy jsou inokulovány injekcí přibližně 20 μΐ (přibližně 1 000 spor) inokula mezi lemma a palea jednoho kvítku blízko středu každého vrcholu. Některé vrcholy byly neočkovány nebo byly očkovány sterilní vodou jako kontroly. Rostliny jsou pak přestěhovány do růstové komory a inkubovány při vysoké vlhkosti 21 dnů nebo jsou rostliny nejdříve inkubovány v mlžné komoře po dobu 72 hodin v 65 až 70 °F, a pak jsou inkubovány ve skleníku po dalších 18 dnů.

Transgenní rostliny podle vynálezu a kontrolní rostliny mohou být také pěstovány na poli, kde jsou vrcholy inokulovány rozprášením.

Onemocnění je vyhodnoceno počítáním počtu symptomatických a asymptomatických klásků na každém inokulovaném vrcholu a na reprezentativním počtu transgenních vrcholů a vrcholů kontrol divokého typu a z toho je vypočteno procento klásků na každém vrcholu, které jsou symptomatické. Symptomy se skládají z předčasného bělení ve srovnání s kontrolními rostlinami a v některých případech je pozorována nekróza klásků. Jsou vybrány rostliny, které měly méně symptomatických klásků, než kontroly divokého typu.

Šest různých transgenních rostlin, které měly odlišný počet kopií sekvence id. č. 1 a různý počet míst inzerce podle dat ze Southern analýzy, měly průměrné procento symptomatických klásků na jeden vrchol v rozmezí od 10,4 0 % do 31,20 % ve srovnání s 44,75 % pro kontroly divokého typu, když byly transgenní rostliny a kontroly inkubovány ve skleníku, jak je popsáno výše. Tytéž transgenní rostliny měly enzymatickou aktivitu měřenou tak, jak je popsáno v příkladu 6 výše, v rozmezí od 0,874 do 29,1 nmol/ g/15 minut.

- 59 • Φ φφ • Μ φ·»# φφφφ

Φφ·· φ ·· · φ Φ· · φ φ·φ · φ φ φ φ φ φφ · φ φφφ φφφφφ φφφφ ··· φφ ·· φφ «φ

Β. Testování transgenních rostlin kukuřice

Test hniloby palic kukuřice

Hniloba palice kukuřice je způsobována Fusarium graminearum (jiné označení Gibberella zeae) . Kultury F. graminearum jsou pěstovány na V-8 agarovém médiu (připraveném s tekutinou V-8) při 25 °C při střídajících se 12 hodinových cyklech světlo a tma. Spory jsou sklízeny tak, že se destička nejdříve zaplaví sterilní vodou a pak se seškrábne skleněnou tyčinkou. Roztok je sloučen a koncentrace spor je upravena na 5 χ 10⁵ spór/ml dvojitě destilovanou sterilní vodou v den inokulace. Transgenní rostliny a kontrolní rostliny byly pěstovány ve skleníku nebo na poli. Když byly pěstovány ve skleníku, byly transgenní a kontrolní rostliny udržovány ve skleníku čtyři až sedm dní po objevení vláken, kdy byly zavedeny 2 ml suspenze spor do kanálku vláken (do dutiny uvnitř plevy a nad klas). To bylo prováděno s použitím subkutánní jehly z nerezové oceli kalibru 18 připojené k velké stříkačce. Pro testování rezistence na onemocnění byla používána kromě inokulací kanálku vláken také metoda inokulace zrn. Inokulace zrn zahrnuje zavedení suspenze spor (přibližně 0,4 ml) do skupiny čtyř zrn prostřednictvím četných injekcí jehlou kalibru 18 připojenou ke stříkačce. Onemocnění je vyhodnocováno vizuálním vyšetřením palic sklízených 5 až 7 týdnů po inokulací na viditelně infikovaná zrna. Hodnocení stupně choroby pro oloupané palice bylo založeno na vizuálním stanovení procenta viditelně infikovaných zrn v palici takto: 1 je 0 %, 2 je 1 až 3 %, 3 je 4 až 10 %, 4 je 11 až 25 %, 5 je 26 až 50 %, 6 je 51 až 75 %, 7 je 76 až

Φ · φφφ· φφ · · φ φ φ φφφφ ••♦Φ φ ·· · φ φφφ φφφφ φ φφφφ φφφφ φφφ φ* φ· • Φ·· • · φφ « φ ·· • 9 · ·· • Φ ·· • ·Φ ♦

100 %. Byly vybrány rostliny kukuřice, které měly nízké procento viditelně infikovaných zrn ve srovnání s kontrolou divokého typu.

Příklad 10

Test kontaminace mykotoxinem

Pro analýzu koncentrace mykotoxinu byly vzorky připraveny takto. Z transgenních rostlin podle vynálezu byla sbírána semena, zvážena a dána dohromady. Když byla testována zrna pšenice, bylo zrní sbíráno u vrcholů stejných transgenních rostlin podle vynálezu a zváženo a dáno dohromady. Když byla testována transgenní kukuřice, byly palice kukuřice sušeny, aby se snížil stupeň vlhkosti, palice byly ručně oloupány a zrna z palic téže transgenní rostliny byla zvážena a dána dohromady. Každý vzorek zrní nebo zrn byl důkladně promíchán, aby se podpořila náhodná distribuce zrní. 50 g vzorku zrní nebo zrn bylo namleto ve mlýnku na jemný prášek (např. mlýnek Retsch ultra centrifugal milí type ZM1, Brinkmanlnstruments, lne., Rexdale, Ontario, Romer Series II Milí, Union, Missouri, USA). Koncentrace zkoumaného mykotoxinu, jako je například DON, pak byla určována s použitím komerčně dostupných testů, jak oje například testovací systém na mykotoxin DONtest TAG™ (VICAM, LP, 313 Pleasant Street, Watertown, MA 02472) nebo byla analyzována firmou pro komerční analýzy (např. Romer Labs, lne, Union, Missouri, USA nebo Trilogy Analytical Laboratory, lne., Beaufort, Missouri, USA) . Ve všech aspektech analýzy byly následovány instrukce výrobce. U testovacího systému na ··♦* ·· 99 99 ·· ·>< « 9 9 9 9999

99· 9 9 9 9 9 9 9»

999 999999 99 ·

9 9 9 9 9 9 9 9

9999 999 9* *· 99 99

- 61 mykotoxin DONtest TAG™ byla prováděna konečná fluorometrická měření na DON. Byly vybrány rostliny produkující zrní nebo zrna, které měly mně mykotoxinu, jako je například DON.

Příklad 11

Použití polynukleotidu podle sekvence id. č. 1 jako selektivního markéru

A. Selektivní markér v buňkách hub

Konstruktem DNA obsahujícím polynukleotid mající sekvenci id. č. 1 operativně spojenou s galaktosidázovým promotorem byla transformována Ashbya gossypi při použití standardních transformačních technik pro houby. Transformované buňky rostly v médiích obsahujících DAS v koncentraci pohybující se v rozmezí od 1,56 ng/ml do 196 pg/ml, zatímco netransformované buňky hub divokého typu nikoliv.

B. Selektivní markér v buňkách rostlin

Semena z rostlin Arabidopsis transformovaných podle příkladu 3 výše, ale ještě nepodrobena selekci, byla vyseta na 0,1% agarózové médium obsahující 0, 5 nebo 10 μg/ml DAS. Po inkubaci po dobu 2 týdnů v růstové komoře ve 22 °C se 16 hodinami světla a 8 hodinami tmy byly velké nezakrnělé) rostliny transplantovány z misky DAS a odpovídající počet byl transplantován z kontrolní misky.

• * • 99 · 9 · ·* • 99 9 9·90

999 999999 ··· *999999* • 999 999 99 99 >999

- 62 Listy rostlin Arabidopsis transplantovaných z 5 g/ml misky byly testovány na enzymatickou aktivitu po 2 týdenním období růstu a vykázaly, že 11 z 11 nezakrnělých rostlin bylo enzymaticky aktivní, jak měřeno v příkladu 6, zatímco 9 z 10 rostlin neselektovaných pomocí DAS bylo ve stejném testu negativních. Ta jedna neselektovaná rostlina, která byla enzymaticky aktivní, byla mnohem méně aktivní, než jakákoliv z testovaných DAS selektovaných rostlin.

Výše popsaná provedení vynálezu jsou pouze ilustrativní. Tento popis vynálezu umožní odborníkovi různé varianty vynálezu. Všechny tyto zřejmé a předvídatelné varianty jsou však v rozsahu vynálezu definovaného připojenými patentovými nároky.

Claims (36)

1. Rostlinná buňka obsahující heterologní polynukleotid kódující genový produkt, který je exprimován v rostlinné buňce, přičemž tento genový produkt má aktivitu rezistence k trichothecenu.

2. Rostlina obsahující rostlinnou buňku podle nároku 1, přičemž rostlina je rezistentní k trichothecenu.

3. Rostlina podle nároku 2, která je rezistentní k trichothecenu obsahujícímu hydroxylovou skupinu na atomu uhlíku tři.

4. Rostlina podle nároku 1, která je rezistentní k houbě produkující trichothecen, výhodně trichothecen obsahující hydroxylovou skupinu na atomu uhlíku tři.

5. Rostlina podle nároku 4, která je rezistentní k Fusarium, výhodně k Fusarium graminearum.

6. Rostlina podle nároku 2, kde heterologní polynukleotid je mikrobiální polynukleotid, výhodně polynukleotid z kvasinky nebo houby.

7. Rostlina podle nároku 6, kde polynukleotid z houby je polynukleotid z houby Fusarium, výhodně Fusarium graminearum nebo Fusarium sporotrichioides.

8. Rostlina podle kteréhokoliv z nároků. 1 až 7, kde heterologní polynukleotid obsahuje sekvenci v podstatě podobnou sekvenci id. č. 1, 5 nebo 7.

9. Rostlina podle nároku 8, kde heterologní polynukleotid obsahuje sekvenci nukleové kyseliny id. č. 1, 5 nebo 7.

10. Rostlina podle nároku 8 obsahující heterologní polynukleotid, který obsahuje úsek po sobě souvisle následujících 80 párů baží sekvenčně identický s úsekem po sobě souvisle následujících 80 párů baží sekvence id. č. 1, 5 nebo 7, výhodně úsek po sobě souvisle následujících 50 párů baží sekvenčně identický s úsekem po sobě souvisle následujících 50 párů baží sekvence id. č. 1, 5 nebo 7, výhodněji úsek po sobě souvisle následujících 21 párů baží sekvenčně identický s úsekem po sobě souvisle následujících 21 párů baží sekvence id. č. 1, 5 nebo 7 a nej výhodně ji úsek po sobě souvisle následujících 18 párů baží sekvenčně identický s úsekem po sobě souvisle následujících 18 párů baží sekvence id. č. 1, 5 nebo 7.

11.Rostlina podle nároku 10, kde heterologní polynukleotid obsahuje úsek po sobě souvisle následujících 18 párů baží sekvenčně identický s úsekem po sobě souvisle následujících 18 párů baží sekvence id. č. 1, 5 nebo 7.

-deacetylkalonektrin, scirpentriol, neosolaniol;

12.Rostlina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11, kde trichothecen je vybrán ze skupiny obsahující T-2 toxin, HT-2 toxin, isotrichodermol, DAS, 3-deacetylkalonektrin, 3,15-diΦΦ φφφφ φφ φφ ·· ··

ΦΦΦ φφφφ φφφφ φφφφ φ φφ · · · ·* φ Φφφφ φφφ φ φ φ φφ φ φφφ φ φ φ φφ φφφφ φφφ φφ φφ φφ ·· trichothecen typu Β: 15-acetyldeoxynivalenol, nivalenol,

4-acetylnivalenol (fusarenon-X), 4,15-diacetylnivalenol,

4,7,15-acetylnivalenol a DON, ale výhodně DON nebo DAS.

13. Rostlina podle nároku 2, kde genový produkt je kódován polynukleotidem podle kteréhokoliv z nároků 1 a 6 až 9.

14. Roštlina podle nároku 13, kde genový produkt je protein udělující rostlině rezistenci k trichothecenu, výhodně acetyltransferáza, zejména 3-0-acetyltransferáza.

15. Rostlina podle nároku 14, kde genový produkt je polypeptid obsahující sekvenci v podstatě podobnou sekvenci id. č. 2, 6 nebo 8.

16. Rostlina podle kteréhokoliv z nároků 2 až 15, přičemž jde o rostlinu pšenice, kukuřice, ječmene nebo rýže.

17.Semena rostliny podle kteréhokoliv z nároků 2 až 15.

18.Způsob přípravy rostliny rezistentní k trichothecenu, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy:

a) rostlinná buňka se transformuje heterologním genem kódujícím genový produkt, kde genový produkt zvyšuje rezistenci k trichothecenu,

b) genový produkt se exprimuje v biologicky významné hladině,

c) z rostlinné buňky se regeneruje celá rostlina a

d) vybere se rostlina se zvýšenou rezistencí k trichothecenu.

·· ·»*· • · ♦ · ··

19. Způsob podle nároku 18 vyznačující se tím, že dále obsahuje krok, kdy se vybere rostlina, na které je redukován růst plísně, přičemž jde o houbu, která produkuje trichothecenový virulentní faktor.

20. Způsob podle nároku 19 vyznačuj ící se tím, že houba je z rodu Fusarium.

21. Způsob prevence kontaminace rostlin, včetně semen, mykotoxiny, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se pěstuje rostlina podle kteréhokoliv z nároků 2 až 16 nebo rostlina připravená způsobem podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, výhodně na ploše středně až silně napadené houbovou infekcí.

22. Způsob podle nároku 20 vyznačující se tím, že rostlina je kulturní rostlina.

23.Způsob redukce a/nebo prevence růstu houby na rostlině, výhodně houby z rodu Fusarium, která produkuje trichothecen, výhodně trichothecen obsahující hydroxylovou skupinu na atomu uhlíku tři, vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se pěstuje rostlina podle kteréhokoliv z nároků 2 až 16 nebo rostlina připravená způsobem podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, výhodně na ploše středně až silně napadené houbovou infekcí.

24.Způsob podle kteréhokoliv z nároků 18 až 24, kdy rostlina ke kulturní rostlina.

·· ·#· · • to ·· • to • · ♦ ♦ to • · • · • • • • • · · · • • • · • * • • • to · • • • · · • · • • • to • · • • • to • ·· • · • ·

25.Způsob přípravy rostlin rezistentních k houbě, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy

a) rostlinná buňka se transformuje heterologním genem kódujícím genový produkt, kde genový produkt zvyšuje rezistenci k trichothecenu,

b) genový produkt se exprimuje v biologicky významné hladině,

c) z rostlinné buňky se regeneruje celá rostlina,

d) vybere se rostlina se zvýšenou rezistencí k trichothecenu, a

e) volitelně se rostlina získaná v kroku d) dále kříží nebo samospráší.

26.Způsob podle nároku 25 vyznačuj ící se tím, že houba je houba z rodu Fusarium.

27.Způsob produkce semen, kdy rostliny vypěstované z těchto semen jsou rezistentní k houbě, vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se rostlina podle kteréhokoliv z nároků 2 až 16 nebo rostlina získaná způsobem podle nároku 25 nebo 26 zkříží nebo samospráší a pak se sklidí semena.

28. Způsob podle nároku 27 vyznačuj ící se tím, že semena jsou rezistentní k houbě rodu Fusarium.

29. Způsob selekce transformovaných hostitelských buněk vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se hostitelská buňka transformuje konstruktem nukleové kyseliny, který kóduje trichothecen 3-O-acetyltransferázu, a transformované hostitelské buňky • w »*··· • » • ··· • · •ti • · • ·· • ·· •· •ti ti ti *· • ·» • ti «· • * ·ti • ti titi • ti titi • ti ·ti ti··· se pak kultivuj í v přítomnosti trichothecenu.

30.Způsob podle nároku 29 v y z n to m, v ze hostitelská buňka je rostlinná buňka.

31.Způsob podle nároku 30 v y z n to m, ·

ze hostitelská buňka je mikrobiální hostitelská buňka.

32.Způsob podle nároku 31 v y z n a č u j ící m, v ze mikrobiální hostitelská buňka je hostitelská buňka houby.

33.Způsob podle nároku 29 vyzná č u j ící í m, že trichothecen je vybrán ze skupiny obsahující

T-2 toxin, HT-2 toxin, isotrichodermol,

DAS, 3-deacetylkalonektrin, 3,15-dideacetylkalonektrin, scirpentriol, neosolaniol;

trichothecen typu B:

15-acetyldeoxynivalenol, nivalenol,

4-acetylnivalenol (fusarenon-X), 4,15-diacetylnivalenol,

4,7,15-acetylnivalenol a DON.

34. Rostlina rezistentní k trichothecenu připravitelná způsobem podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20.

35. Rostlina rezistentní k houbě připravitelná způsobem podle kteréhokoliv z nároků 25 až 26.

36.Semena rostlin připravitelná způsobem podle kteréhokoliv z nároků 27 až 28.