JP2003525051A - 種子収量、バイオマス、および収穫指数が向上したトランスジェニック植物 - Google Patents

種子収量、バイオマス、および収穫指数が向上したトランスジェニック植物

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、種子およびバイオマスの生産が上昇した植物を作製する方法を提供する。より具体的には本発明は、種子数、種子重量、穂状種子数、止葉重量、および総植物重量を含むいくつかの植物形質について収量が増加した植物を作製する方法を提供する。本発明はまた、植物の収穫指数を向上させる方法を提供する。好ましい態様では、この方法は、配列番号：3を含む核酸、配列番号：3と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしSH2-REV6-HSの生物学的活性を保持するポリペプチドをコードする核酸、SH2-REV6-HSの生物学的活性を保持するペプチドをコードする配列番号：3の断片、配列番号：4を含むポリペプチドまたはSH2-REV6-HSの生物学的活性を保持するその断片をコードする核酸、およびSH2HSポリペプチドまたはSH2RTSポリペプチドをコードする核酸からなる群より選択される核酸を植物に導入する段階を含む。本発明はまた、本明細書に記載された方法で得られた植物にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は、植物の生産、すなわち植物の種子の生産および植物のバイオマスの
生産の両方を改善することに関する。より具体的には本発明は、同じ遺伝的背景
をもつ非トランスジェニック植物と比較したときに種子生産が増加しており且つ
バイオマス生産が増加したトランスジェニック植物に関する。さらに具体的には
本発明は、Sh2-Rev6-HSについてトランスジェニックである植物、およびそのよ
うな植物を生産する方法に関する。
【０００２】発明の背景 ADPグルコースピロホスホリラーゼ（AGP）は、植物、藻類、真菌、および細菌
などの生物、特に植物におけるデンプンおよびグリコーゲンの生合成に関与する
主要酵素の一つである。AGPは以下に示す反応を触媒する： α-グルコース-1-P ＋ ATPADP-グルコース ＋ PP1 上記反応の産物であるADP-グルコースは、植物のデンプン生合成および細菌によ
るグリコーゲン生合成における主要なグルコース供与体である。
【０００３】 AGPは植物界に広く分布している。AGPは、コムギ、イネ、オオムギ、およびト
ウモロコシなどの単子葉植物、ならびにホウレンソウ、バレイショ、およびエン
ドウなどの双子葉植物に存在する。AGPはまた、大腸菌などの一部のデンプン産
生細菌にも見出される。植物のAGPは、2個の小サブユニット（50〜55 kDa）およ
び2個の大サブユニット（51〜60 kDa）からなる四量体（210〜240 kDa）として
存在する。これに対して細菌のAGPはサイズが等しい4個のユニットからなると考
えられている。AGPはまた、シアノバクテリアおよび藻類においても生産される
ことがわかっている。この場合、四量体構造は植物AGPの構造と類似しており、
一般的な細菌にみられるホモ四量体構造ではなく2個の大サブユニットと2個の小
サブユニットからなる。
【０００４】 デンプンは主に食品原料として商業的に重要なだけでなく工業用化学物質とし
ても重要なため、AGPをコードする核酸の単離および特性解析には多大な労力が
注がれてきた。植物のAGPは2種の異なるタンパク質サブユニットからなる。トウ
モロコシの胚乳においてはAGPはShrunken-2 （Sh2）遺伝子およびBrittle-2 （B
t2）遺伝子にコードされている（Bhaveら、1990およびBaeら、1990）。Sh2は推
定分子量57,179 Daの大サブユニットをコードしており、Bt2は分子量52,224 Da
の小サブユニットをコードしている。他の種々の植物でもAGPをコードする核酸
の単離が報告されている：イネに由来する小サブユニットのcDNA （Andersonら
、1989）およびゲノムDNA （Andersonら、1991）；ホウレンソウの葉に由来する
小サブユニットおよび大サブユニットのcDNA（Morellら、1988）；ならびにバレ
イショ塊茎に由来する小サブユニットおよび大サブユニットのcDNA （Muller-Ro
berら、1990；およびNakataら、1991）。
【０００５】 また、デンプン合成を調節するために植物におけるAGP発現を変化させる試み
が成されている。欧州特許第455,316号には、逆方向に配置されて宿主植物でア
ンチセンスmRNA鎖の転写が生じるAGPをコードするDNAを含むプラスミドについて
記載されている。同特許では、非トランスジェニック植物と比べて同プラスミド
を含むトランスジェニックバレイショのAGP活性が低下しており、またデンプン
濃度が低下していることが示されている。米国特許第5,773,693号には、AGPの一
方のサブユニットまたは両方のサブユニットの発現を抑制するか、または低下さ
せることによってエンドウ植物体のショ糖量を増加させる方法が記載されている
。この方法には、Sh2サブユニットまたはBt2サブユニット、または両サブユニッ
トをコードする核酸をプロモーターおよびターミネーターに対してアンチセンス
方向に含むプラスミドでエンドウ植物体を形質転換する段階が含まれる。
【０００６】 これとは対照的に米国特許第5,977,437号には、色素体輸送ペプチドに操作可
能に結合されたオオムギ胚乳のAGPコード核酸を植物に導入する段階を含む、植
物におけるデンプン産生の速度および/または収量を増加させる方法について記
載されている。欧州特許第634,491号には、プロモーター、およびアミノ末端に
色素体輸送ペプチドを含む融合タンパク質、AGP酵素、ならびに3'側にあって翻
訳されない転写終結配列をコードするDNAを含む核酸で植物細胞を形質転換する
段階、形質転換された植物細胞を得る段階、および形質転換植物を形質転換植物
細胞から再生する段階を含む、デンプン量を増加させることで種子の油分を減少
させる方法が記載されている。また米国特許第5,792,290号には、コムギAGPをコ
ードする核酸について記載されており、余分なコピーのAGP遺伝子を、デンプン
産生を増強するために形質転換法により植物ゲノムに挿入することと、デンプン
産生を減少させるために内因性AGPをコードするmRNAの相補物を挿入することが
説明されている。
【０００７】 トウモロコシの胚乳は、穀粒発生過程で最もデンプンが多く蓄積する部位であ
る。トウモロコシ胚乳のSh2およびBt2の変異体では、AGP活性の欠損レベルに対
応してデンプン量が大きく減少していた。いずれの遺伝子変異体もAGP活性を約9
5%低下させることがわかっている（Tsaiら、1966；Dickinsonら、1969）。野生
型胚乳と比較してAGPが欠損し、デンプン量が低下すると、種子が成熟したとき
に穀粒は縮み、脆く、および/またはつぶれた状態になる。また酵素活性は機能
性の野生型Sh2対立遺伝子およびBt2対立遺伝子の量とともに上昇するが、変異型
酵素では力学的特性が変化することが観察されている。
【０００８】 AGPは植物におけるデンプン生合成の律速段階である。スターク（Stark）らは
、大腸菌AGPの変異型をバレイショ塊茎に導入してデンプン量を35%上昇させた（
Starkら、1992）。AGPはアロステリック酵素であり、その活性は、アロステリッ
ク部位へのエフェクターの結合によって調節される。植物では、AGPの正のエフ
ェクターは3-ホスホグリセリン酸（3-PGA）であり、負のエフェクターはリン酸
である（Dickinsonら、1969）。リン酸によってAGPが阻害されることが、植物の
デンプン生合成を最も大きく制限する可能性が高い（Girouxら、1996）。
【０００９】 ジルー（Giroux）ら（1996；それぞれ参照として全体が本明細書に組み入れら
れる米国特許第5,872,216号および第5,589,618号）は、インビボにおける部位特
異的変異導入法を用いて、AGPのアロステリック制御に関与することが知られて
いる遺伝子領域に短い挿入変異を作製した。付加的なチロシン残基またはセリン
残基の挿入を含むSh2遺伝子の単独の変異では、総AGP活性およびSH2タンパク質
量が低下した。付加的なチロシン残基および付加的なセリン残基を含む特異的な
復帰変異体では種子重量が11〜18%増加した。後者の復帰変異体は「Sh2-m1Rev6
」と命名された（同遺伝子を本明細書では「Sh2-Rev6」と記載する）。ジルー（
Giroux）ら（1996）ではまた、Sh2-m1Rev6を発現する異型においてデンプンの絶
対量の上昇がみられるものの、Sh2-m1Rev6の種子重量の上昇がデンプン量の上昇
のみに起因するのではないことが見出された。ジルー（Giroux）ら（1996）では
、Rev6によって引き起されるデンプン合成の促進が、種子内でより強固なシンク
を生じて、他の種子成分の合成の上昇に至ることが示唆されている。変異型AGP
を発現する植物に熱安定性の上昇をもたらすAGPの変異については米国特許第6,0
69,300号および国際公開公報第99/58698号に記載されている。
【００１０】 植物のシンク強度を調節することは、収穫高を増加させる方法の一つである。
光合成が活発な葉および他の緑色組織は一般に「ソース（source）」と呼ばれ、
貯蔵がなされる部位は「シンク（sink）」と呼ばれる。トウモロコシ、イネ、お
よびコムギなどの穀粒では主なシンクは胚乳であり、個々の種子重量がトウモロ
コシの収量の主要決定因子である（Duvickら、1992）。ジルー（Giroux）ら（19
96）により明らかにされているように、トウモロコシ胚乳のAGPをリン酸による
阻害に非感受性にすると、デンプン量に大きく影響を及ぼすことなく個々の種子
重量が増加する（米国特許第5,650,557号および第5,872,216号）。
【００１１】 長年にわたり生物学的収量を増加させたいという要望があり、経済学的に有用
な部分が、許容される植物の生長力および健康状態を損なわない一方で可能な限
り植物体の大部分を占めるような植物を得ることを目的として、植物構造を操作
することへの関心が喚起されてきた。植物体の穂（earまたはhead）の数、穂に
つく種子の数、または穂につく穀粒の数、種子の大きさ、もしくは穀粒の大きさ
などの種子（grain）または穀粒（kernel）の収量のさまざまな成分の相対的な
寄与を変化させることで収量を増加させようという試みはまだ成功していない。
というのは、ある一つの成分が上昇しても、別の成分の低下が伴う傾向があるか
らである（Wilson, D. （1981） Plant Breeding II. K. Frey編、アイオワ、ア
イオワ州立大学出版会、255ページ）。しかしながら、生長に関する部分（veget
ative part）に対する種子の割合を上昇させることで収量の増加を達成すること
は禾穀類では一般的にみられる（Wilson, D. （1981） Plant Breeding II. K.
Frey編、アイオワ、アイオワ州立大学出版会、255ページ）。
【００１２】 ランガー（Langer）およびヒル（Hill）（Langer, R. H. M.およびHill, G. D
. （1991） Agricultural Plants第2版、ケンブリッジ、ケンブリッジ大学出版
会、341ページ）では、収穫指数（Harvest Index；HI）を改善することで高収量
が達成可能であることが述べられている。というのは、HIは生物学的収量（Ybio l ）と経済学的収量（Yecon）を以下のように結びつけるからである： Ybiol × HI ＝ Yecon HIに影響を及ぼす処置は、必ずしも同程度ではなく、また同じ方向であるとは限
らないもののYbiolにも影響することが指摘されている。例えば穀類では、適切
な水の存在下において高個体群密度で窒素を加えることにより生物学的収量を増
加させることが可能である。予測される結果は、活発な栄養生長（heavy vegeta
tive growth）であるが、林冠へ光が十分届かないこと、種子の付きが悪いこと
、また生育が悪いことにより収穫指数は低くなる。これとは対照的に丈の短い穀
粒は収穫指数が高いことが特徴である。4〜5 t/haを産する短くて直立型のイネ
品種の収穫指数が約0.53〜0.56であることがわかっている。これに対し、種子収
量が約2.4 t/haの丈が高くて葉の多い品種の収穫指数は0.39〜0.42である（Lang
er, R. H. M.およびHill, G. D. （1991） Agricultural Plants 第2版、ケンブ
リッジ、ケンブリッジ大学出版会、341ページ）。同様にコムギの場合、メキシ
コ植物育種プログラムで作られた矮性および半矮性の品種の収穫指数は高い。し
かし丈の短い植物も少量の種子しか産生しない。したがって、植物育種プログラ
ムでは生物学的収量と収穫指数の両方を評価する必要がある。
【００１３】 本発明は、植物の種子生産およびバイオマス生産を増加させる方法を提供する
。より具体的には本発明は、同じ遺伝的背景をもつ非トランスジェニック植物と
比較したときに総種子数が増加し、個々の種子重量が増加し、植物体あたりの総
種子重量が増加し、ならびに地上部分の植物バイオマスが増加し、また収穫指数
が上昇したトランスジェニック植物を提供する。遺伝子を導入した結果、以上の
すべてのパラメータが上昇した植物の生産は、植物における通常のソース/シン
クの関係からするとかなり予想外のことである。
【００１４】発明の簡単な概要 本発明は、植物体の生産、すなわち植物体の種子生産および植物体のバイオマ
ス生産の両方が改善した植物を作製する方法を提供する。本発明はまた、記載さ
れた方法で生産される単子葉植物および双子葉植物を提供する。
【００１５】 より具体的には本発明は、プロモーターに操作可能に結合された核酸であって
、SH2-REV6-HS（配列番号：3）の核酸、高ストリンジェンシー条件下でSH2-REV6
-HSとハイブリダイズしタンパク質SH2-REV6-HS（配列番号：4）の生物学的活性
を保持するポリペプチドをコードする核酸、SH2-REV6-HSの生物学的活性を保持
するペプチドをコードするSH2-REV6-HSの断片、配列番号：4を含むポリペプチド
もしくはSH2-REV6-HSの生物学的活性を保持するその断片をコードする核酸、ま
たはSH2HSポリペプチドもしくはSH2RTSポリペプチドをコードする核酸を植物に
導入することによって、植物が産生する種子数を増加させる方法、植物体が産生
するバイオマスを増加させる方法、または植物の収穫指数を上昇させる方法を提
供する。好ましくはSH2HSポリペプチドはSH2HS33ポリペプチドである。この方法
は以上の方法で作製された植物を成長させる段階をさらに含む。本発明は以上の
方法で作製された植物も含む。
【００１６】 本発明の方法は、イネ、コムギ、オオムギ、オートムギ、サトウモロコシ、お
よびキビなどの単子葉植物、ならびにエンドウ、アルファルファ、ミヤコグサ、
ヒヨコマメ、チコリー、クローバー、ケール、ヒラマメ、プレーリーグラス、ワ
レモコウ（small burnet）、ダイズ、およびレタスなどの双子葉植物に適用する
ことができる。
【００１７】 本発明はまた、プロモーターに操作可能に結合された核酸であって、SH2-REV6
-HS（配列番号：3）の核酸、高ストリンジェンシー条件下でSH2-REV6-HSとハイ
ブリダイズしタンパク質SH2-REV6-HS（配列番号：4）の生物学的活性を保持する
ポリペプチドをコードする核酸、SH2-REV6-HSの生物学的活性を保持するペプチ
ドをコードするSH2-REV6-HSの断片、配列番号：4を含むポリペプチドもしくはSH
2-REV6-HSの生物学的活性を保持するその断片をコードする核酸、またはSH2HSポ
リペプチドもしくはSH2RTSポリペプチドをコードする核酸を単子葉植物に導入す
ることによって、単子葉植物の止葉重量を増加させる方法も提供する。好ましく
はSH2HSポリペプチドはSH2HS33ポリペプチドである。この方法は以上の方法で作
製された植物を成長させる段階をさらに含む。本発明は以上の方法で作製された
植物も含む。
【００１８】 本発明はまた、プロモーターに操作可能に結合された核酸であって、SH2-REV6
-HS（配列番号：3）の核酸、高ストリンジェンシー条件下でSH2-REV6-HSとハイ
ブリダイズしタンパク質SH2-REV6-HS（配列番号：4）の生物学的活性を保持する
ポリペプチドをコードする核酸、SH2-REV6-HSの生物学的活性を保持するペプチ
ドをコードするSH2-REV6-HSの断片、配列番号：4を含むポリペプチドもしくはSH
2-REV6-HSの生物学的活性を保持するその断片をコードする核酸、またはSH2HSポ
リペプチドもしくはSH2RTSポリペプチドをコードする核酸を単子葉植物に導入す
ることによって、単子葉植物が産生する穂状の種子（seed head）の数を増加さ
せる方法も提供する。好ましくはSH2HSポリペプチドはSH2HS33ポリペプチドであ
る。この方法は以上の方法で作製された植物を成長させる段階をさらに含む。本
発明は以上の方法で作製された植物も含む。
【００１９】 本発明はまた、プロモーターに操作可能に結合された核酸であって、SH2-REV6
-HS（配列番号：3）の核酸、高ストリンジェンシー条件下でSH2-REV6-HSとハイ
ブリダイズしタンパク質SH2-REV6-HS（配列番号：4）の生物学的活性を保持する
ポリペプチドをコードする核酸、SH2-REV6-HSの生物学的活性を保持するペプチ
ドをコードするSH2-REV6-HSの断片、配列番号：4を含むポリペプチドもしくはSH
2-REV6-HSの生物学的活性を保持するその断片をコードする核酸、またはSH2HSポ
リペプチドもしくはSH2RTSポリペプチドをコードする核酸を双子葉植物に導入す
ることによって、双子葉植物の2個またはそれ以上の形質を増加させる方法も提
供する。好ましくはSH2HSポリペプチドはSH2HS33ポリペプチドである。この方法
は以上の方法で作製された植物を成長させる段階をさらに含む。本発明は以上の
方法で作製された植物も含む。
【００２０】 本発明はさらに、プロモーターに操作可能に結合された核酸であって、SH2-RE
V6-HS（配列番号：3）の核酸、高ストリンジェンシー条件下でSH2-REV6-HSとハ
イブリダイズしタンパク質SH2-REV6-HS（配列番号：4）の生物学的活性を保持す
るポリペプチドをコードする核酸、SH2-REV6-HSの生物学的活性を保持するペプ
チドをコードするSH2-REV6-HSの断片、配列番号：4を含むポリペプチドもしくは
SH2-REV6-HSの生物学的活性を保持するその断片をコードする核酸、またはSH2HS
ポリペプチドもしくはSH2RTSポリペプチドをコードする核酸を単子葉植物に導入
することによって、単子葉植物の2個またはそれ以上の形質の収量を増加させる
方法を提供する。好ましくはSH2HSポリペプチドはSH2HS33ポリペプチドである。
この方法は以上の方法で作製された植物を成長させる段階をさらに含む。この方
法は以上の方法で作製された植物も含む。
【００２１】 本発明は、上述の方法で得られた植物体を1種または複数の他の植物体と交配
させること、および交配の結果産生される種子を収穫して成長させることをさら
に含む。
【００２２】 本発明は、上述の方法で得られた植物を自家受粉させることで産生させた種子
を収穫すること、および収穫された種子を成長させることをさらに含む。
【００２３】 本発明は、SH2-REV6-HS（配列番号：4）のアミノ酸配列またはSH2-REV6-HSの
生物学的活性を保持するその断片をコードする核酸を含む植物体を提供する。
【００２４】 本発明は、SH2HSタンパク質もしくはSH2RTSタンパク質のアミノ酸配列またはS
H2HSタンパク質もしくはSH2RTSタンパク質の生物学的活性を保持するその断片を
コードする核酸を含む植物体を提供する。好ましい態様においてSH2HSポリペプ
チドはSH2HS33のアミノ酸配列を有する。
【００２５】発明の詳細な説明 I．定義 本明細書で使用される「AGP」という用語は、ADPグルコースピロホスホリラー
ゼを意味する。
【００２６】 本明細書で使用される「対立遺伝子」という用語は、遺伝子の任意の複数の代
替形態を意味する。
【００２７】 本明細書で使用される「生物学的活性」という表現は、SH2-REV6ポリペプチド
、SH2HS33ポリペプチド、およびSH2-REV6-HSポリペプチドなどの本発明のSH2変
異型ポリペプチドの任意の機能的活性を意味する。対象となるポリペプチドの機
能的活性には、総種子数が増加すること、個々の種子重量が増加すること、植物
体あたりの総種子重量が増加すること、地上部分の植物バイオマスが増加するこ
と、収穫指数およびリン酸非感受性が上昇すること、ならびに熱安定性が上昇す
ることが含まれるがこれらに限定されない。
【００２８】 本明細書で使用される「Bt2」という用語は、AGPの小サブユニットをコードす
るBrittle-2遺伝子を意味する。本明細書で使用される「bt2」という用語は、ト
ウモロコシの穀粒の粒質を乾燥時に脆くするBt2遺伝子の変異型を意味する。
【００２９】 本明細書で使用される「穀類（cereal）」という用語は、文脈に応じて以下の
いずれかを意味する：（1）トウモロコシなどの草本植物、または（2）草本植物
の種子（grain）。
【００３０】 本明細書で使用される「作物（crop plant）」という用語は、以下の目的を含
むがこれらに限定されない任意の商業目的のために成長させる任意の植物を意味
する：種子（seedおよびgrain）の生産、干し草の生産、装飾使用、果実の生産
、液果の生産、野菜の生産、油の生産、タンパク質の生産、飼料の生産、サイレ
ージ、動物の放牧、ゴルフコース、芝生、花卉生産、造園、砂防、緑肥、土壌（
soil tilth/health）の改善、医薬品/薬物の生産、食品添加物の生産、喫煙関連
製品、パルプ生産、および木材生産。本発明で対象となる特定の作物には、コム
ギ、イネ、トウモロコシ、オオムギ、ライムギ、サトウダイコン、バレイショ、
カンショ、ダイズ、ワタ、トマト、カノーラ、およびタバコが含まれるがこれら
に限定されない。
【００３１】 本明細書で使用される「他家受粉」または「交雑育種」という用語は、ある植
物体の花の花粉を別の植物の花の胚珠（柱頭）に（人工的または自然に）つける
ことを意味する。
【００３２】 本明細書で使用される「品種（cultivar）」という用語は、園芸的手法または
農学的手法で生産され、野生の個体群には通常みられない植物の変種、株、また
は品種（race）を意味する。
【００３３】 本明細書で使用される「双子葉植物（Dicotyledoneae、dicotyledonous、dico
tyledon、またはdicot）」という用語は同義語であり、通常発芽時に現れる2枚
の子葉（embryonic seed leafまたはcotyledon）を有する任意のさまざまな顕花
植物を意味する。例として、タバコ、ダイズ、バレイショ、カンショ、ダイコン
、キャベツ、セイヨウアブラナ、およびリンゴの木などが含まれるがこれらに限
定されない。
【００３４】 本明細書で使用される「止葉（flag leaf）」という用語は、結実する（稔性
のある）稈（culm）の最上部に位置する葉を意味する。この葉は、花序または穂
状の種子（seed head）のすぐ下に位置する。
【００３５】 本明細書で使用される「遺伝子型」という用語は、個々の細胞、細胞培養物、
植物体、または植物群の遺伝的構造を意味する。
【００３６】 本明細書で使用される「種子（grain）」という用語は文脈に応じて以下のい
ずれかを意味する：（1）一つのグループとみなされる穀草（cereal grasses）
、または（2）1種または複数の穀草の実。
【００３７】 本明細書で使用される「草本（grassまたはgrasses）」という用語はイネ科に
属する植物を意味する。
【００３８】 本明細書で使用される「収穫指数（Harvest Index）」という用語は、収穫さ
れた総植物体重量の割合を意味する。この指数は、種子（grain）の重量/（種子
重量＋植物体重量）の比である。これは本明細書の別の部分に記載があるHIと同
一のものである（LangerおよびHill、1991も参照）。HIは生物学的収量と経済学
的収量とを結びつけ、HIは経済学的収量/生物学的収量の比で示す。経済学的収
量（Yecon）は種子の重量であり、生物学的収量（Ybiol）は種子の重量に植物体
の重量を加算したものである。種子の重量は総種子重量（total seed weight）
と同義である。
【００３９】 本明細書で使用される「ヘテロ接合体（heterozygote）」という用語は、少な
くとも1か所の座位で異なる対立遺伝子（所与の遺伝子の形態）を有する二倍体
または倍数体の個々の細胞または植物体を意味する。
【００４０】 本明細書で使用される「ヘテロ接合性（heterozygous）」という用語は、特定
の遺伝子座に異なる対立遺伝子（所与の遺伝子の形態）が存在することを意味す
る。
【００４１】 本明細書で使用される「ホモ接合体（homozygote）」という用語は、1か所ま
たは複数の座位に同じ対立遺伝子を有する個々の細胞または植物体を意味する。
【００４２】 本明細書で使用される「ホモ接合性（homozygous）」という用語は、相同な染
色体セグメントの1か所または複数の座位に同一の対立遺伝子が存在することを
意味する。
【００４３】 本明細書で使用される「雑種」という用語は、一つまたは複数の遺伝子が異な
る親どうしの交配の結果生じる任意の植物体を意味する。
【００４４】 本明細書で使用される「近交（inbred）または「近交系（inbred line）」と
いう用語は、比較的純粋な育種株を意味する。
【００４５】 本明細書で使用される核酸分子は、その核酸分子が、同核酸の供給源に由来す
る他のポリペプチドをコードする核酸の混入物から実質的に分離される場合に「
単離される」と言われる。
【００４６】 本明細書で使用される「系列」という用語は、植物の型を指す場合は、自家受
精または異花受精する植物、および、本質的かつ明瞭な特徴が類似したほぼ同じ
遺伝的背景を有する単系列の条件的なアポミクトを意味する。
【００４７】 本明細書で使用される「座位」という用語は、遺伝学的に定義された任意の部
位を意味する。座位は遺伝子の場合もあれば、遺伝子の一部の場合もあり、また
は、何らかの調節機能をもつDNA配列の場合もあり、また、異なる配列で占めら
れる場合がある。
【００４８】 本明細書で使用される「集団選択」という用語は、個々の植物体が選択されて
それらの種子の集合物から次世代を増殖させる際の選択の一形態を意味する。
【００４９】 本明細書で使用される「単子葉植物（Monocotyledoneae、monocotyledonous、
monocotyledon、またはmonocot）」という用語は同義であり、種子内に1枚の子
葉を有する任意のさまざまな顕花植物を意味する。単子葉植物の例には、イネ、
コムギ、オオムギ、トウモロコシ、およびユリなどが含まれるがこれらに限定さ
れない。
【００５０】 本明細書で使用される「ノーザンブロット」という用語は、アガロースゲル上
のRNAを対象として電気泳動でサイズに従ってRNAを分離した後に、RNAをゲルか
ら固相支持体（ニトロセルロースまたはナイロンのメンブレンなど）にトランス
ファーするRNA分析法を意味する。固定されたRNAに標識化プローブを添加し、使
用したプローブに相補的なRNA種を検出する。ノーザンブロットは分子生物学分
野の標準的なツールの一つである（Sambrookら、Molecular Cloning： A Labora tory Manual 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1985）。
【００５１】 本明細書で使用される「放任受粉」という用語は、いくつかの遺伝子流動に自
由に曝される植物体個体群を意味し、遺伝子流動に対する有効な防御壁を設ける
閉鎖型の反対である。
【００５２】 本明細書で使用される「放任受粉個体群（open-pollinated population）」ま
たは「放任受粉変種（open-pollinated variety）」という表現は、少なくとも
複数回の交雑受精（cross-fertilization）が通常可能な植物体を意味し、多様
性を示すことがあるが個体群または変種が他のものとは異なるものとなる一つま
たは複数の遺伝子型または表現型も有する標準に対して選択される。他家受精に
対する防御壁のない雑種は放任受粉個体群または放任受粉変種である。
【００５３】 本明細書で使用される「胚珠」という用語は雌性配偶体を意味し、「花粉」と
いう用語は雄性配偶体を意味する。
【００５４】 本明細書で使用される「表現型」という用語は、個体の遺伝的構造（genetic
makeup）（すなわち遺伝子型）と環境との相互作用の結果生じる個々の細胞、細
胞培養物、植物体、または植物群の観察可能な特質を意味する。
【００５５】 本明細書で使用される「子孫」という用語は、特定の植物体（自家交配）また
は対となる植物体（交配または戻し交配）の子を意味する。子孫はF1、F2、また
はそれに続く任意の世代となりうる。典型的には、親は花粉の供与体および胚珠
の供与体であり、これらが交配されて本発明の植物体の子孫を作る。親はまた本
発明の雑種植物（F2植物）のF1親ということもできる。また親は、本発明の雑種
植物と戻し交配されて本発明の別の雑種植物を生じる反復親を意味する。
【００５６】 本明細書で使用される「ポリメラーゼ連鎖反応」という用語は「PCR」と同義
であり、変性、オリゴヌクレオチドプライマーとのアニーリング、およびDNAポ
リメラーゼによる伸長のサイクルを用いて多数のコピーの標的DNA配列を増幅す
る手法を意味する。
【００５７】 本明細書で使用される「復帰体」という用語は、変異型Sh2遺伝子（すなわち
野生型のSh2遺伝子に対する遺伝子）を意味する。この場合、変異は、野生型穀
粒の表現型（すなわち変異型sh2sh2遺伝子型でみられる表現型のように縮んだ種
子とは異なる膨らんだ種子）を生じる。復帰体の遺伝子型のAGP活性はsh2sh2遺
伝子型よりも強い場合があり、AGP活性は野生型のSh2遺伝子型よりも強い場合も
弱い場合もある。典型的には復帰体は野生型の種子表現型を示し、正常（すなわ
ち非復帰体）の野生型に比べて少なくとも約30%のAGP活性をもつ。場合によって
は「復帰体」という用語は、変異型Sh2遺伝子を含む細胞または植物体を意味す
ることがある。
【００５８】 本明細書で使用される「イネ」という用語は、種々のイネ種（O. sativa、O.
glaberrima、O. perennis、O. nivara、およびO. breviligulata）を含むがこれ
らに限定されない任意のイネ（Oryza）種を意味する。したがって本明細書で使
用される「イネ」という用語は、任意の栽培イネ、任意の野生イネ、任意のイネ
種、任意の種内および種間のイネの交配植物、あらゆるイネの変種、あらゆるイ
ネの遺伝子型およびあらゆるイネ品種を含むがこれらに限定されない任意の型の
イネを意味する。
【００５９】 本明細書で使用される「自家受粉」という表現は、ある植物体の花の花粉を同
じ植物体の同じ花または別の花の胚珠（柱頭）に（人工的または自然に）つける
ことを意味する。
【００６０】 本明細書で使用される「Sh2」という表現は、AGPの大サブユニットをコードす
るShrunken-2遺伝子を意味する。場合によっては、この用語はSh2遺伝子型を含
む細胞または植物体を意味することがある。
【００６１】 本明細書で使用される「sh2」という表現は、トウモロコシの穀粒を乾燥時に
縮んだ状態やつぶれた状態にするSh2遺伝子の変異型を意味する。場合によって
は、この用語はsh2遺伝子型を含む細胞または植物体を意味することがある。
【００６２】 本明細書で使用される「Sh2hs」という表現は、トウモロコシ胚乳のAGPの熱に
安定な異型をコードするShrunken-2遺伝子の変異体を意味する。場合によっては
、この用語はSh2hs遺伝子型を含む細胞または植物体を意味することがある。「S
H2HS」という表現はSh2hsにコードされたポリペプチドを意味する。本発明に適
した好ましい態様は、本明細書でSH2HS33と称されるポリペプチドをコードするS
h2hs33遺伝子である。SH2HS33ポリペプチドは、米国特許第6,069,300号および国
際公開公報第99/58698号に記載されているHS33変異を含む。本発明の方法の使用
対象として適している他の態様には、本明細書でそれぞれSH2HS13、SH2HS14、SH
2HS16、SH2HS39、SH2HS40、およびSH2HS47と称されるポリペプチドをコードする
Sh2hs13、Sh2hs14、Sh2hs16、Sh2hs39、Sh2hs40、およびSh2hs47の各ポリヌクレ
オチドが含まれるがこれらに限定されない。SH2HS13、SH2HS14、SH2HS16、SH2HS
39、SH2HS40、およびSH2HS47のポリペプチドはそれぞれ、米国特許第6,069,300
号および国際公開公報第99/58698号に記載されているHS13、HS14、HS16、HS39、
HS40、およびHS47の変異を含む。
【００６３】 本明細書で使用される「Sh2rts」という表現は、トウモロコシ胚乳のAGPの熱
安定性の異型をコードするShrunken-2遺伝子の温度感受性の復帰体変異を意味す
る。場合によっては、この用語はSh2rts遺伝子型を含む細胞または植物体を意味
することがある。「SH2RTS」という表現はSh2rtsにコードされたポリペプチドを
意味する。本発明の方法の使用対象に適した態様の例には、本明細書ではそれぞ
れSH2RTS48-2とSH2RTS60-1と称されるポリペプチドをコードするSh2rts48-2ポリ
ヌクレオチドとSh2rts60-1ポリヌクレオチドが含まれるがこれらに限定されない
。SH2RTS48-2ポリペプチドおよびSH2RTS60-2ポリペプチドはそれぞれ、米国特許
第6,069,300号および国際公開公報第99/58698号に記載されているようにRTS48-2
変異およびRTS60-2変異を含む。
【００６４】 本明細書で使用される「Sh2hs33」という表現は、トウモロコシ胚乳のAGPの安
定性をサブユニット間の相互作用の増強を介して高めるSh2における1か所の点突
然変異を意味する。この変異は、アミノ酸333位におけるHisからTyrへの変化で
ある（GreeneおよびHannah、1998）。場合によっては、この用語はSh2hs33遺伝
子型を含む細胞または植物体を意味することがある。
【００６５】 本明細書で使用される「Sh2-Rev6」という表現は「Sh2-m1-Rev6」と同義であ
り、Shrunken-2遺伝子の異型を意味する。Sh2-Rev6遺伝子のポリペプチド産物は
、野生型Sh2ポリペプチドのアミノ酸494位と495位との間に挿入された2個の付加
的なアミノ酸であるチロシンとセリンを含む。Sh2-Rev6にコードされたトウモロ
コシの胚乳はリン酸に非感受性のAGPを発現し、トウモロコシでは種子重量が増
加する（Girouxら、1996；米国特許第5,650,557号および第5,872,216号）。場合
によっては、この用語はSh2-Rev6遺伝子型を含む細胞または植物体を意味するこ
とがある。
【００６６】 本明細書で使用される「Sh2-Rev6-HS」という表現は「Sh2-m1Rev6-HS」と同義
であり、Sh2-Rev6遺伝子の熱に安定な異型を意味する。この異型では333位にお
けるHisがTyrで置き換わっている。場合によっては、この用語はSh2-Rev6-HS遺
伝子型を含む細胞または植物体を意味することがある。トウモロコシAGPのHS33
変異は、熱安定性をもたらす他の変異とともに米国特許第6,069,300号および国
際公開公報第99/58698号に記載されており、本発明の方法における使用に特に適
している。
【００６７】 本明細書で使用される「Sh2hs33」という表現は、Sh2の特定の熱安定性の遺伝
的異型を意味する。この異型は、野生型トウモロコシのSh2遺伝子の333位におけ
るHisからTyrへの変異を含む（GreeneおよびHannah、1998）。この変異により、
トウモロコシ胚乳のAGP活性は熱に安定となる。場合によっては、この表現はSh2
hs33遺伝子型を含む細胞または植物体を意味することがある。
【００６８】 本明細書で使用される「縮んだ（shrunken）および脆い（brittle）」という
表現は、トウモロコシの特定の型の穀粒の形態を表している。縮んだ、脆い穀粒
では胚乳は大きくつぶれている。乾燥前の胚乳は、ほとんどデンプンを生じない
液体が満たされた袋状をしている。乾燥させると、穀粒は縮んでつぶれて、くぼ
みが目立ち、脆い質感を伴う角ばった構造となる（Coeら、1988）。
【００６９】 本明細書で使用される「合成品種（synthetic）」という表現は、特定の一連
のクローンまたは種子増殖系列（seed-propagated line）の交雑に由来する一連
の子孫を意味する。合成物には、交雑、自家受精、同胞受精で生じる種子の混合
物が含まれる場合がある。
【００７０】 本明細書で使用される「T1、T2、T3、...」という表現は、T0または親世代と
称される特定の組織培養物由来の、または形質転換された細胞系列をたどること
ができる細胞または植物体の後続の世代を意味する。植物に関しては、形質転換
細胞から直接作られる植物体はT0世代と呼ばれる。T0世代の植物体の自家受粉で
作られる種子はT1の種子と呼ばれる。T1の種子を発芽させた結果得られる植物体
は、T1世代またはT1子孫と呼ばれる。T1世代により作られる種子はT2種子と呼ば
れる。
【００７１】 本明細書で草本について使用される「分げつ（tiller）」という用語は、地上
面において生じる側方の側枝を意味する。本研究で数えられる個々の分げつは、
シュートの茎に穂を有していた。
【００７２】 本明細書で使用される「形質転換」という用語は、核酸（すなわちヌクレオチ
ドの多量体）を細胞内へ移すことを意味する。本明細書で使用される「遺伝的形
質転換」という表現は、DNA、特に組換えDNAを細胞内に移して取り込ませること
を意味する。
【００７３】 本明細書で使用される「トランスジェニック」という表現は、さまざまな形質
転換法によって外来核酸配列または修飾型核酸配列を受け入れる細胞、細胞培養
物、植物体、および植物体の子孫を意味する。この場合、外来核酸配列または修
飾型核酸配列は、外来核酸配列または修飾型核酸配列を受ける植物体の種ではな
い同じ種または別の種に由来する。このようなトランスジェニック細胞、細胞培
養物、植物体、およびそのような植物体の子孫の作製に使用される外来核酸また
は修飾型核酸には、少なくとも一つの生物学的活性または機能を有する産物をコ
ードする遺伝子、遺伝子断片、ならびに核酸配列が含まれる。本明細書で使用さ
れる「トランスジェニック植物」および「形質転換植物」という表現は同義であ
り、「トランスジェニック系列」および「形質転換系列」という表現と同様であ
る。本明細書で使用される「対応する非トランスジェニック植物」および「対応
する非トランスジェニック系列」という表現は、「トランスジェニック」の細胞
、細胞培養物、植物体、および植物体の子孫が受けた外来遺伝子または修飾遺伝
子のような外来遺伝子または修飾型遺伝子を受けていない細胞、細胞培養物、植
物体、および植物体の子孫を意味する。
【００７４】 本明細書で使用される「品種（variety）」という用語は種の細区分を意味し
、形状または機能が他の類似した一連の個体とは異なる種内の個体群からなる。
【００７５】 本明細書で使用される「コムギ」という用語は、種々のコムギ種（T. aestivu
m、T. monococcum、T. tauschii、およびT. turgidum）を含むがこれらに限定さ
れない任意のコムギ（Triticum）種を意味する。したがって本明細書で使用され
る「コムギ」という用語は、任意の栽培コムギ、任意の野生コムギ、任意のコム
ギ種、任意の種内および種間のコムギの交配植物、あらゆるコムギの変種、あら
ゆるコムギの遺伝子型およびあらゆるコムギの品種を含むがこれらに限定されな
い任意の型のコムギを意味する。栽培コムギには、アインコルン（einkorn）、
マカロニコムギ（durum）、および一般的なコムギが含まれるがこれらに限定さ
れない。
【００７６】 本明細書で使用される「野生型」という用語は、特定遺伝子の天然の対立遺伝
子を意味する。場合によっては、この用語は特定遺伝子の野生型対立遺伝子を含
む細胞または植物体を意味する。
【００７７】 II．Sh2-Rev6およびSh2-Rev6-HSをコードする核酸 ジルー（Giroux）ら（1996）は、Sh2-Rev6をコードするゲノムDNAおよびcDNA
を単離して配列を決定した。Sh2-Rev6のヌクレオチド配列は配列番号：1に、ま
たSH2-REV6のアミノ酸配列は配列番号：2に提供されている（米国特許第5,650,5
57号および米国特許第5,872,216号も参照）。少なくとも1つの機能性のSh2-Rev6
対立遺伝子を含むトウモロコシの種子が、1999年5月16日にATCC（American Type
Culture Collection）、12301 パークローン・ドライブ、米国メリーランド州
ロックビル（20852）に登録されており、アクセッション番号ATCC 97624が与え
られている（米国特許第5,650,557号および米国特許第5,872,216号の第5カラム
を参照）。
【００７８】 Sh2-Rev6は、アミノ酸333位におけるHisからTyrへの変化によって修飾されて
異型Sh2-Rev6-HSが作られている（GreeneおよびHannahら、1998；米国特許第6,0
69,300号）。Sh2-Rev6-HSのヌクレオチド配列は配列番号：3に、またSH2-REV6-H
Sのアミノ酸配列は配列番号：4に提供されている。
【００７９】 本明細書で使用されるSh2-Rev6、Sh2hs33、およびSh2-Rev6-HSは、本明細書に
記載された特異的に同定されて特性が解析された異型、ならびに当業者に周知の
以下の方法で過度の実験を行うことなく単離/生成および特性解析が可能な対立
遺伝子異型、保存的置換を有する異型、および相同物を含む。
【００８０】 アミノ酸またはヌクレオチドのレベルにおける相同性または同一性は、配列類
似性の探索に適したblastp、blastn、blastx、tbiastn、およびtblastx（全文が
参照として組み入れられるKarlinら、1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87、2
264〜2268、およびAltschul、1993、J. Mol. Evol. 36、290〜300）のプログラ
ムで使用されるアルゴリズムを用いるBLAST （Basic Local Alignment Search T
ool）分析法で決定される。BLASTプログラムで用いられる方法は、問合わせ配列
とデータベース配列との間で類似したセグメントを最初に考慮すること、次に同
定されたすべてのマッチの統計学的優位性の有無を評価すること、最後に、事前
に選択した有意性の閾値を満たすマッチのみを要約することである。配列データ
ベースの類似性探索に関する基本的な問題に関する議論については、全文が参照
として本明細書に組み入れられるアルツチュル（Altschul）ら、1994、Nature G enetics 6、119〜129を参照されたい。ヒストグラム（histogram）、ディスクリ
プション（description）、アラインメント（alignment）、期待評点（expect）
（すなわちデータベース配列に対するマッチの報告に関する統計学的有意性の閾
値）、カットオフ（cutoff）、マトリックス（matrix）、およびフィルター（fi
lter）の探索パラメータはデフォルト設定である。blastp、blastx、tblastn、
およびtblastxで用いられるデフォルトのスコアリングマトリックス（scoring m
atrix）はBLOSUM62マトリックスである（全文が参照として組み入れられるHenik
offら、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89、10915〜10919）。blastnについ
ては、スコアリングマトリックスはM（マッチ残基対に対するリワードスコア（r
eward score））対N（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア（penalty scor
e））の比で設定される。デフォルト値はMが5でNが-4である。
【００８１】 「Sh2-Rev6遺伝子」、「Sh2-Rev6-HS遺伝子」、および「Sh2hs33遺伝子」とい
う表現には、本明細書に例示されているSh2-Rev6遺伝子、Sh2hs33遺伝子、およ
びSh2-Rev6-HS遺伝子のあらゆる対立遺伝子異型が含まれる。このような対立遺
伝子異型は、本明細書に記載されたSh2-Rev6遺伝子、Sh2hs33遺伝子、およびSh2
-Rev6-HS遺伝子から作られるタンパク質として1種または複数の同じ生理学的特
性を生じるタンパク質をコードする。
【００８２】 本発明で使用されるSh2-Rev6、Sh2hs33、およびSh2-Rev6-HSの核酸分子または
その断片は当技術分野で周知の方法で合成することもできる。上記の分子を遺伝
子工学的手法で作製することは、任意の許容される手法を用いてDNAを構築し、
発現媒体にDNAをクローニングし、また、この媒体をSH2-REV6タンパク質、SH2HS
33タンパク質、およびSH2-REV6-HSタンパク質を発現する細胞に導入することで
も可能である。これについては例えば、サムブロック（Sambrook）ら、Molecula r Cloning： A Laboratory Manual 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s、1985に記載された方法を参照されたい。
【００８３】 SH2-REV6タンパク質、SH2HS33タンパク質、およびSH2-REV6-HSタンパク質など
の本発明のポリペプチドの全体または一部をコードするすべてのポリヌクレオチ
ドも、それらが本明細書に記載された対象タンパク質の一つまたは複数の機能的
活性をもつポリペプチドをコードする限りにおいて本明細書に含まれると理解さ
れる。したがって例えば本明細書に記載されたSH2-REV6タンパク質、SH2HS33タ
ンパク質、およびSH2-REV6-HSタンパク質の活性を有する任意のポリヌクレオチ
ド断片は本発明に含まれる。
【００８４】 本発明のポリヌクレオチド配列には、例えばSH2-REV6タンパク質、SH2HS33タ
ンパク質、およびSH2-REV6-HSタンパク質などの本発明のポリペプチドをコード
するDNA、cDNA、合成DNA、およびRNAの配列が含まれる。このようなポリヌクレ
オチドにはまた、天然のポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、および意図
的に操作したポリヌクレオチドも含まれる。例えばこのようなポリヌクレオチド
配列には、天然のイントロンを含む場合も含まない場合もあるゲノムDNAが含ま
れる場合がある。また、このようなゲノムDNAは、プロモーター領域またはポリA
配列と関連して得られる場合がある。他の例として、mRNA配列の一部を、選択的
RNAスプライシングのパターンまたはRNA転写用の代替プロモーター使用のために
変化させることができる。さらに別の例としてSh2-Rev6、Sh2hs33、およびSh2-R
ev6-HSのポリヌクレオチドに、例えば部位特異的変異導入法およびDNAシャフリ
ング法で付加的な変異が導入される場合がある。
【００８５】 本発明のポリヌクレオチドは、遺伝暗号の性質上、縮重した配列をさらに含む
。遺伝暗号は、複数のヌクレオチドのトリプレットが同じアミノ酸をコード可能
であるために縮重すると言われる。天然のアミノ酸は20種類あり、そのほとんど
が複数のコドンで指定される。遺伝暗号の縮重の結果、Sh2-Rev6、Sh2hs33、お
よびSh2-Rev6-HSなどの対象となるポリヌクレオチドヌクレオチド配列に対して
一部は極めて短いヌクレオチド配列の相同性をもつ多くのヌクレオチド配列が本
発明で使用される場合があることは当業者には言うまでもない。したがって、す
べての縮重したヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列にコードされる対象ポリ
ペプチド（例えばSH2-REV6、SH2HS33、およびSH2-REV6-HSのポリペプチド）のア
ミノ酸配列が機能的に変化しないか、または機能上実質的に同等である限りにお
いて本発明に含まれる。本発明は、Sh2-Rev6、Sh2hs33、およびSh2-Rev6-HSに代
表される本発明のポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレットの遺
伝暗号にしたがってなされる可能なアミノ酸およびコドンの選択に基づく組み合
わせを選択することで作製可能と思われるバリエーションのペプチド配列または
ヌクレオチド配列のそれぞれまたはすべてを特に想定している（これらすべての
バリエーションは本明細書で特異的に記載されているとみなされる）。
【００８６】 本発明のポリヌクレオチド（例えばSh2-Rev6、Sh2hs33、およびSh2-Rev6-HSな
ど）と選択的にハイブリッドを形成する、本明細書に記載された配列の断片（部
分、セグメント）も本発明に含まれる。本明細書で使用される選択的なハイブリ
ダイゼーションとは、関連ヌクレオチド配列と非関連ヌクレオチド配列とを区別
するストリンジェントな条件（例えばManiatisら、（1989） Molecular Cloning ： A Laboratory Manual 、Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載された
手法を参照）におけるハイブリダイゼーションを意味する。mRNAおよびDNAのコ
ード鎖に相補的な、本発明の活性断片は一般的には少なくとも約15ヌクレオチド
であり、より一般的には少なくとも20ヌクレオチドであり、好ましくは30ヌクレ
オチドであり、またさらに好ましくは50ヌクレオチドまたはそれ以上である。
【００８７】 「ストリンジェントな条件」とは、（1）洗浄時に低イオン強度および高温を
用いる条件（例えば0.5 Mのリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.2）、1 mMのEDTA（p
H 8.0）（溶媒は7%のSDS）で65℃または55℃）、または（2）ハイブリダイゼー
ション過程にホルムアミドなどの変性剤を用いる条件（例えば50%（vol/vol）の
ホルミアミドに0.1%のウシ血清アルブミン、0.1%のフィコール（Ficoll）、0.1%
のポリビニルピロリドン、0.05 Mのリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5）＋0.75 M
のNaCl、0.075 Mのクエン酸ナトリウムで42℃）である。具体的な例としては、5
0%のホルムアミド、5×SSC （0.75 MのNaCl、0.075 Mのクエン酸ナトリウム）、
50 mMのリン酸ナトリウム（pH 6.8）、0.1%のピロリン酸ナトリウム、5×デンハ
ルト溶液、超音波処理したサケ精子DNA （50 μg/ml）、0.1%のSDS、および10%
の硫酸デキストランで55℃における処理と、0.2×SSCおよび0.1%のSDS中で55℃
における洗浄が含まれる。当業者であれば、明瞭かつ検出可能なハイブリダイゼ
ーションシグナルを得るために適したストリンジェンシー条件を容易に決定およ
び変化させることができる。好ましい分子は、Sh2-Rev6、Sh2hs33、およびSh2-R
ev6-HSの相補物と上記の条件下でハイブリッドを形成する分子であって、機能性
タンパク質をコードする分子である。
【００８８】 本発明では、SH2-REV6、SH2HS33、およびSH2-REV6-HSをコードする対象ポリヌ
クレオチドに相補的な配列を含む核酸分子と、明瞭なシグナルを生じるのに十分
なストリンジェンシー条件下でハイブリッドを形成するSH2-REV6、SH2HS33、お
よびSH2-REV6-HSなどの対象SH2変異型タンパク質をコードする核酸分子を使用す
る。本明細書で使用される「核酸」は、例えばSH2-REV6ポリペプチド、SH2HS33
ポリペプチド、およびSH2-REV6-HSポリペプチドなどの本発明のポリペプチドを
コードするRNAもしくはDNA、またはそのようなペプチドをコードする核酸に相補
的なRNAもしくはDNAの配列、またはそのような核酸とストリンジェントな条件下
でハイブリダイズしそれらと安定に結合状態を維持するRNAもしくはDNAの配列、
またはSH2-REV6、SH2HS33、およびSH2-REV6-HSなどの本発明のタンパク質と少な
くとも60%の配列同一性、または少なくとも65%の配列同一性、または少なくとも
70%の配列同一性、または少なくとも75%の配列同一性、または少なくとも80%の
配列同一性、または少なくとも85%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配
列同一性、またさらに好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有するポリペ
プチドをコードするRNAもしくはDNAの配列と定義される。
【００８９】 本発明はさらに、核酸分子をコードするものの任意の一つの断片を提供する。
本明細書で使用される核酸分子をコードする断片は、全タンパク質のコード配列
の小さな部分を意味する。断片のサイズは意図した用途によって決定される。例
えば断片がタンパク質の活性部分をコードするものとして選択される場合、対象
となる断片は対象タンパク質の機能性領域をコードするように十分大きいもので
あることが必要とされる。例えば本発明の断片は、AGPのアロステリック制御に
かかわる本発明のSH2-REV6、SH2HS33、およびSH2-REV6-HSのドメインまたは領域
をコードする。この断片を核酸プローブまたはPCRプライマーとして使用する場
合、断片の長さは、プローブまたはプライマーの使用時に偽陽性結果が比較的少
なくなるように選択する。
【００９０】 プローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の特異的なプライマーとして使
用される、または本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列を合成するための
本発明のコード核酸分子の断片（すなわち合成オリゴヌクレオチド）は、化学的
手法、例えばマッテウッチ（Matteucci）ら（1981） J. Am. Chem. Soc. 103、3
185〜3191に記載されているホスホジエステル法、または自動合成法によって容
易に合成することができる。また、より大きなDNAセグメントは、対象遺伝子の
さまざまなモジュール性セグメントを限定する一連のオリゴヌクレオチドを合成
した後にオリゴヌクレオチドを連結して完全な修飾型遺伝子を構築するといった
よく知られた方法で容易に調製することができる。
【００９１】 本発明のコード核酸分子はさらに、診断目的およびプローブとする目的で検出
可能な標識を含むように修飾される場合がある。このようなさまざまな標識は当
技術分野で周知であり、本明細書に記載されたコード分子とともに容易に使用す
ることができる。適切な標識には、ビオチンや放射性標識されたヌクレオチドな
どが含まれるがこれらに限定されない。当業者であれば、当技術分野で周知の任
意の標識を用いて、標識されたコード核酸配列を得ることができる。
【００９２】 翻訳段階でタンパク質配列に組み込まれるアミノ酸の欠失、付加、または変更
による一次構造そのものの修飾は、対象タンパク質の活性を破壊することなく作
ることができる。このような置換または他の変更により、本発明の適した範囲に
含まれる核酸にコードされたアミノ酸配列を有するタンパク質が生じる。
【００９３】 III．他の関連核酸分子の単離 本明細書で記載されるように、SH2-REV6タンパク質、SH2HS33タンパク質、も
しくはSH2-REV6-HSタンパク質、またはSH2-REV6タンパク質、SH2HS33タンパク質
、もしくはSH2-REV6-HSタンパク質の断片をコードする核酸分子などの本発明の
核酸分子の同定および特性解析を行うことで、当業者であれば本明細書に記載さ
れた配列のほかにタンパク質ファミリーの他のタンパク質をコードする核酸分子
を単離することができる。またここで記載された核酸分子を用いることで、当業
者であれば本明細書に記載されたSH2-REV6、SH2HS33、およびSH2-REV6-HSのほか
にタンパク質ファミリーの他のタンパク質をコードする核酸分子を単離すること
ができる。
【００９４】 基本的に当業者であれば、適切な細胞で調製された発現ライブラリーをスクリ
ーニングするための抗体プローブを作製するために本明細書に記載された任意の
アミノ酸配列の任意の一つを容易に用いることができる。典型的には、精製タン
パク質またはモノクローナル抗体で免疫されたウサギなどの哺乳類に由来するポ
リクローナル抗血清を用いて、cDNA発現ライブラリーまたはゲノム発現ライブラ
リーをつり上げて、タンパク質ファミリーの他のタンパク質に適したコード配列
を得ることができる。クローン化されたcDNA配列は、融合タンパク質として発現
させたり、自身の調節配列を用いて直接発現させたり、酵素の発現に使用される
特定の宿主に適した調節配列を用いた構築物で発現させたりすることができる。
【００９５】 または、本明細書に記載されたコード配列の一部を合成して、任意の生物体に
由来するいくつかのタンパク質ファミリーのタンパク質をコードするDNAを検索
するためのプローブとして用いることができる。約18〜20ヌクレオチド（約6〜7
アミノ酸の連続をコードする）を含むオリゴマーを調製して、ゲノムDNAライブ
ラリーまたはcDNAライブラリーのスクリーニングに使用して、ストリンジェント
な条件または過剰なレベルの偽陽性シグナルを十分除去するストリンジェンシー
条件下でハイブリダイゼーションシグナルを得ることができる。
【００９６】 また、オリゴヌクレオチドプライマー対をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）用に
調製して、核酸分子をコードするクローンを選択することができる。このような
PCRプライマーを用いるPCRの変性/アニーリング/伸長のサイクルは当技術分野で
周知であり、容易に応用して他のコード核酸分子の単離に使用することができる
。
【００９７】 IV．組換えDNA（rDNA）分子を用いる組換えタンパク質の生産 本発明はさらに、本明細書に記載された核酸分子を用いたSH2-REV6、SH2HS33
、およびSH2-REV6-HSなどの本発明のポリペプチドを作製する方法を提供する。
一般的な意味では、タンパク質の組換え体の生産には典型的には以下の段階が関
与する：最初に、例えばSH2-REV6タンパク質、SH2HS33タンパク質、およびSH2-R
EV6-HSタンパク質、またはSH2-REV6タンパク質の断片、SH2HS33タンパク質の断
片、およびSH2-REV6-HSタンパク質の断片をコードする核酸分子を得る。コード
配列がイントロンで分断されていない場合は、任意の宿主で発現させるのにその
まま適している。この核酸分子を次に好ましくは上述の適切な調節配列と操作可
能に結合させて配置することでタンパク質の読み枠を含む発現ユニットを形成す
る。この発現ユニットを使用して、適切な宿主の形質転換を行い、形質転換され
た宿主を組換えタンパク質生産を可能とする条件で培養する。任意選択で組換え
タンパク質を培地から、または細胞から単離する。タンパク質の回収および精製
は、ある程度の不純物の存在を問題としない状況では必ずしも必要としない場合
がある。
【００９８】 前述の段階のそれぞれは、さまざまな方法で行うことができる。例えば所望の
コード配列をゲノム断片から回収して、適切な宿主で直接使用することができる
。さまざまな宿主で使用可能な発現ベクターの構築は、適切なレプリコンおよび
上述の調節配列を用いて達成される。調節配列、発現ベクター、および形質転換
の方法は、遺伝子の発現に使用される宿主細胞のタイプによって変わり、これに
ついては既に詳述した。適切な制限酵素切断部位は、仮にそれが通常存在しない
場合は、コード配列の末端に導入して、ベクター中に挿入するために切り出し可
能な遺伝子を提供するようにする。当業者であれば、本発明の核酸分子とともに
使用される当技術分野で周知の任意の宿主-発現系を容易に適用して組換えタン
パク質を産生させることができる。
【００９９】 V．SH2-REV6タンパク質、SH2HS33タンパク質、およびSH2-REV6-HSタンパク質 本明細書で使用されるSH2-REV6タンパク質、SH2HS33タンパク質、およびSH2-R
EV6-HSタンパク質は、SH2-REV6ポリヌクレオチド、SH2HS33ポリヌクレオチド、
およびSH2-REV6-HSポリヌクレオチド、その対立遺伝子異型、ならびにSH2-REV6
、SH2HS33、およびSH2-REV6-HSの活性を有する保存的置換にコードされたアミノ
酸配列を有するタンパク質を意味する。また本発明に使用されるポリペプチドは
、SH2-REV6、SH2HS33、およびSH2-REV6-HSにコードされるタンパク質、ならびに
ポリペプチドおよび断片、特にSH2-REV6、SH2HS33、およびSH2-REV6-HSの生物学
的活性を有するもの、またSH2-REV6、SH2HS33、およびSH2-REV6-HSまたはその関
連部分にコードされるポリペプチドに対して少なくとも65%の配列同一性を有す
るもの、またはSH2-REV6、SH2HS33、およびSH2-REV6-HSまたはその関連部分にコ
ードされるポリペプチドに対して少なくとも70%の同一性、もしくは少なくとも7
5%の同一性、もしくは少なくとも80%の同一性、もしくは少なくとも85%の同一性
をもつもの、ならびにより好ましくはSH2-REV6、SH2HS33、およびSH2-REV6-HSま
たはその関連部分にコードされるポリペプチドに対して少なくとも90%の配列同
一性を有するもの、またさらに好ましくはSH2-REV6、SH2HS33、およびSH2-REV6-
HSまたはその関連部分にコードされるポリペプチドに対して少なくとも95%の配
列同一性を有するものを含み、また以上のポリペプチドの一部も含む。当業者で
あれば、対象アミノ酸配列がAGPのアロステリック制御にかかわるSH2-REV6、SH2
HS33、およびSH2-REV6-HSのドメインまたは領域などのタンパク質の機能性ドメ
インの範囲内にあるか否かを認識できる。したがって相同タンパク質がアミノ酸
配列全体に対して40%未満の相同性を有する一方で一つの機能性ドメインに90%を
超える相同性をもつことがある。
【０１００】 本発明に使用されるSH2-REV6タンパク質、SH2HS33タンパク質、およびSH2-REV
6-HSタンパク質には、特異的に同定されて特性解析が行われた本明細書記載の異
型、ならびに対立遺伝子異型、保存的置換の異型、および当業者に周知の方法に
より過度の実験を行うことなく単離/生成されて特性解析が可能な相同物が含ま
れる。
【０１０１】 本明細書で使用される「実質的に純粋な」という表現は、天然の状態では結合
している他のタンパク質、脂質、炭水化物、または他の材料を実質的に含まない
SH2-REV6ポリペプチド、SH2HS33ポリペプチド、およびSH2-REV6-HSポリペプチド
などの本発明のポリペプチドを意味する。当業者であれば、標準的なタンパク質
精製法で対象ポリペプチドを精製することができる。
【０１０２】 本発明はまた、SH2-REV6ポリペプチド、SH2HS33ポリペプチド、およびSH2-REV
6-HSポリペプチドなどの本発明の単離ポリペプチドをコードするアミノ酸配列も
使用する。本発明のポリペプチドには、保存的異型の結果としての例示的なSH2-
REV6タンパク質、SH2HS33タンパク質、およびSH2-REV6-HSタンパク質とは異なる
ものが含まれる。本明細書で使用される「保存的変化（conservative variation
）」または「保存的置換」という表現は、アミノ酸残基が別の生物学的に似た残
基で置換されることを意味する。保存的変化または保存的置換はポリペプチド鎖
の形状を変化させる可能性は低い。保存的変化または保存的置換の例には、イソ
ロイシン、バリン、ロイシン、もしくはメチオニンなどの1個の疎水性残基の別
の残基への置換、またはアルギニンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸、
またはグルタミンとアスパラギンなどの置換などの1個の極性残基の別の残基へ
の置換が含まれる。したがって、すべての保存的置換は、ヌクレオチド配列にコ
ードされた対象ポリペプチドが機能的に変化しないかまたは類似したものである
限りにおいて本発明に含まれる。
【０１０３】 本明細書で使用されるように、SH2-REV6タンパク質、SH2HS33タンパク質、お
よびSH2-REV6-HSタンパク質などの本発明の単離ポリペプチドは、例えば、アミ
ノ酸が欠失していたり（例えばペプチドなどのタンパク質の短縮型）、挿入して
いたり、逆転していたり、置換していたり、および/または、誘導体化されてい
たりする（例えばグリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレ
ニル化、パルミトイル化、アミド化、および/またはグリコシルホスファチジル
イノシトールの付加による誘導体）SH2-REV6タンパク質、SH2HS33タンパク質、
およびSH2-REV6-HSタンパク質などの完全長の場合もあれば、タンパク質の任意
の相同物の場合もある。このような修飾型タンパク質は、対象タンパク質の機能
的活性の少なくとも一つを保持しているか、または対象タンパク質の発現の結果
作られる生理学的特性の少なくとも一つを作るタンパク質を含む。対象タンパク
質の相同物は、相同物をコードする核酸配列がストリンジェントな条件下で対象
タンパク質（例えばSH2-REV6タンパク質、SH2HS33タンパク質、およびSH2-REV6-
HSタンパク質のアミノ酸配列）をコードする核酸配列とハイブリッドを形成しう
るSH2-REV6タンパク質、SH2HS33タンパク質、およびSH2-REV6-HSタンパク質のア
ミノ酸配列などの対象タンパク質に十分類似したアミノ酸配列を有するタンパク
質である。適切なストリンジェンシーの要件については既に記載した。
【０１０４】 SH2-REV6タンパク質、SH2HS33タンパク質、およびSH2-REV6-HSタンパク質の相
同物を含む対象タンパク質相同物は、対象タンパク質をコードする遺伝子の対立
遺伝子変異の結果として得ることができる。例えばSH2-REV6タンパク質、SH2HS3
3タンパク質、およびSH2-REV6-HSタンパク質の相同物は、例えばランダム変異導
入または標的化変異導入をもたらす従来技術または組換えDNA技術を用いてタン
パク質をコードする遺伝子に対する直接的な修飾を含むがこれらに限定されない
当技術分野で周知の手法を用いて産生させることができる。
【０１０５】 本発明のタンパク質の一次アミノ酸配列の小規模な修飾は、本明細書に記載さ
れた遺伝子群から作られる対象タンパク質（例えばSH2-REV6、SH2HS33、およびS
H2-REV6-HS）と比較して実質的に等しい活性を有するタンパク質を生じる場合が
ある。本明細書で使用される対象タンパク質と「機能的に等しいタンパク質」と
は、対象タンパク質の生物学的活性または免疫学的特性に実質的に類似した生物
学的活性または免疫学的特性を有するタンパク質のことである。「機能的に等し
いタンパク質」という表現は、本発明の遺伝子にコードされたSH2-REV6、SH2HS3
3、およびSH2-REV6-HSなどのタンパク質の生物学的活性を有する分子の断片、異
型、類似体、相同物、または化学的誘導体を含むことを意図している。
【０１０６】 「SH2-REV6、SH2HS33、およびSH2-REV6-HSのタンパク質」、「SH2-REV6タンパ
ク質」、「SH2HS33タンパク質」、および「SH2-REV6-HSタンパク質」という表現
は正常型のSH2-REV6、SH2HS33、およびSH2-REV6-HSの活性を有するこれらのタン
パク質のすべての対立遺伝子異型を含む。一般に、SH2-REV6タンパク質、SH2HS3
3タンパク質、およびSH2-REV6-HSタンパク質の対立遺伝子異型は、本発明で使用
される遺伝子に特異的にコードされたアミノ酸配列とは若干異なるアミノ酸配列
を有するが、例示的な表現型を生じることが可能である。対立遺伝子異型は、既
に挙げた個々の配列とは若干異なるアミノ酸配列を有するものの、個体重量およ
び総種子重量の増加、種子数の増加、収穫指数（HI）の上昇、および地上部分の
植物体の大きさの増大を示す表現型を生じる能力を有する。
【０１０７】 本発明の方法を当業者が用いて、個体重量および総種子重量が増加した植物体
、種子数が増加した植物体、収穫指数が上昇した植物体、および植物体の大きさ
が増大した植物体を作製することができる。
【０１０８】 本出願人らはさらに、本発明のSh2-Rev6、Sh2hs33、およびSh2-Rev6-HSなどの
ポリヌクレオチドのDNA配列の変化を認識する方法を説明する。ある方法では、
当業者が理解すると思われる十分なハイブリダイゼーション条件下で本発明に使
用される例えばSh2-Rev6遺伝子、Sh2hs33遺伝子、またはSh2-Rev6-HS遺伝子に相
補的な配列を有する核酸分子（プローブとしても知られる）を導入する。Sh2-Re
v6、Sh2hs33、およびSh2-Rev6-HSを含む本発明のポリヌクレオチドに関連したDN
A配列の変化を認識する別の方法は、当技術分野で周知の複数の方法による直接
的なDNA配列分析である。別の態様は、さまざまな植物の属、種、株、変種、ま
たは品種の対象ポリヌクレオチドにおけるDNA配列変化の検出を含む。本発明の
ポリヌクレオチド配列、例えばSh2-Rev6、Sh2hs33、およびSh2-Rev6-HSは、他の
植物における対応遺伝子の存在を検出するためのプローブとして使用することが
できる。既に説明したように、Sh2-Rev6、Sh2hs33、およびSh2-Rev6-HSの配列は
決定されているので当業者であれば容易に利用することができる。一つの態様に
おいて、これらの配列はSh2-Rev6遺伝子、Sh2hs33遺伝子、または Sh2-Rev6-HS
遺伝子の1本の対立遺伝子またはその断片に特異的に結合し、また別の態様では
複数の対立遺伝子に結合する。このような検出法には、ポリメラーゼ連鎖反応、
制限酵素断片長多型（RFLP）分析、および1本鎖立体構造分析が含まれる。
【０１０９】 本発明のこのようなアッセイ法に有用な分析用プローブには、SH2-REV6、SH2H
S33、およびSH2-REV6-HSなどの本発明のポリペプチドに対する抗体が含まれる。
このような抗体は、当技術分野で周知の標準的手法で作られるモノクローナル抗
体またはポリクローナル抗体の場合がある（HarlowおよびLaneによるAntibodies ： A Laboratory Manual 、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1988を参照
）。抗体を用いて、タンパク質に結合させた後に抗体-タンパク質複合体をELISA
法やウエスタンブロット法などで検出することで本発明のタンパク質を検出する
ことができる。抗体はまた、SH2-REV6、SH2HS33、およびSH2-REV6-HSなどの対象
タンパク質のペプチド配列から当技術分野の標準的な手法によって産生される（ Protocols in Immunology 、John Wiley & Sons、1994を参照）。免疫学的に重要
な部分を含むモノクローナル抗血清またはポリクローナル抗血清の断片も調製す
ることができる。
【０１１０】 例えばSH2-REV6ポリペプチド、SH2HS33ポリペプチド、およびSH2-REV6-HSポリ
ペプチドといった対象ポリペプチドを、抗体プローブを用いて生物試料中に検出
したり測定したりするアッセイ法は、任意の利用可能なフォーマットの基礎とな
りうる。例えば、SH2-REV6ポリペプチド、SH2HS33ポリペプチド、またはSH2-REV
6-HSポリペプチドが分析対象物であるイムノアッセイ法では、被検試料、典型的
には生物試料は、抗SH2-REV6抗体、抗SH2HS33抗体、または抗SH2-REV6-HS抗体と
ともに、抗原-抗体複合体を形成可能とする条件下でインキュベートされる。固
相支持体に結合させた抗体を被検試料とともにインキュベートして洗浄し、分析
対象物に対する二次標識抗体とインキュベートした後に再び支持体を洗浄する「
サンドイッチ」アッセイ法などのさまざまなフォーマットを用いることができる
。分析対象物は二次抗体が支持体に結合しているか否かを判定することで検出さ
れる。異種または同種のいずれかとすることができる競合的なフォーマットでは
、被検試料は通常、抗体および標識された競合抗原と連続的または同時にインキ
ュベートされる。以上のフォーマットおよび他のフォーマットは当技術分野で周
知である。
【０１１１】 VI．形質転換法 トランスジェニック植物を作製する方法は当業者に周知である。トランスジェ
ニック植物は現在、エレクトロポレーション法；マイクロインジェクション法；
粒子加速法またはバイオリスティック照射法（biolistic bombardment）として
も知られる微粒子銃法；ウイルスを用いた形質転換法；およびアグロバクテリウ
ムを用いた形質転換法（例えば米国特許第5,405,765号、第5,472,869号、第5,53
8,877号、第5,538,880号、第5,550,318号、第5,641,664号、および第5,736,369
号；Watsonら（1992） Recombinant DNA、Scientific American Books；Hinchee
ら（1988） Bio/Tech. 6：915〜922 （1988）；McCabeら、Bio/Tech. 6：923〜9
26；Toriyamaら、（1988） Bio/Tech. 6：1072〜1074；Frommら（1990） Bio/Te ch . 8：833〜839；Mullinsら（1990） Bio/Tech. 8：833〜839；およびRaineri
ら（1990） Bio/Tech. 8：33〜38を参照）を含むがこれらに限定されない多種多
様な形質転換法で作製することができる。
【０１１２】 A．アグロバクテリウムを用いた形質転換法 アグロバクテリウムを用いた形質転換法は、植物への発現ベクター導入法とし
て最も広く用いられている方法である（Horschら（1985） Science 227：1229）
。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびアグロバク
テリウム・リゾジェネス（A. rhizogenes）は、植物細胞を遺伝的に形質転換す
る植物病原性土壌細菌である。アグロバクテリウム・ツメファシエンスおよびア
グロバクテリウム・リゾジェネスのそれぞれTiプラスミドおよびRiプラスミドは
、植物の遺伝的形質転換を担う遺伝子をもつ（Kado, C.I. （1991） Crit. Rev. Plant. Sci . 10：1）。アグロバクテリウムベクター系およびアグロバクテリウ
ムを用いる遺伝子導入法に関する記述は、グリューバー（Gruber）ら（1993）「
植物形質転換用ベクター（Vectors for Plant Transformation）」（Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology 、グリック（Glick, B.R.）およ
びトンプソン（Thompson, J.E.）編、（CRC Press、Inc.、Boca Raton）の89〜1
19ページ）、Mikiら（1993） 「外来DNAの植物への導入法（Procedures for Int
roducing Foreign DNA into Plants）」（Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology） 、グリック（Glick, B.R.）およびトンプソン（Thompson,
J.E.）編、（CRC Press、Inc.、Boca Raton）の67〜88ページ、およびモロニー
（Moloneyら）（1989） Plant Cell Reports 8：238などにみられる。
【０１１３】 アグロバクテリウムを用いた形質転換法は主に、双子葉植物を形質転換するた
めに用いられている。双子葉植物を対象としたアグロバクテリウムを用いた形質
転換法は、粒子銃法、エレクトロポレーション法、およびポリエチレングリコー
ルを用いた形質転換法などの他の形質転換法と比べて大きな導入対象片の異種核
酸の輸送を促進する。またアグロバクテリウムを用いた形質転換法は、比較的小
規模の遺伝子再編成を生じるようであり、またさらに典型的には、植物染色体へ
の少数の遺伝子コピーの組込みを生じるようである。
【０１１４】 単子葉植物はアグロバクテリウムの天然の宿主ではない。アグロバクテリウム
を用いた形質転換法はアスパラガス（Bytebierら、1987） Proc. Natl. Acad. S ci. USA 84：5354〜5349）およびヤム（Dioscore bublifera）（Schaferら（198
7） Nature 327：529〜532）を対象に報告されているが、イネ科（Gramineae）
の植物はアグロバクテリウムで形質転換されないと一般的には考えられられてい
る（Potrykus I.（1987） Biotechnology 8：535〜543）。しかし、最近のチョ
ウ（Zhao）らによる米国特許第5,981,840号にはトウモロコシを対象としたアグ
ロバクテリウムを用いた形質転換法が記載されている。チョウらの方法には以下
に挙げる段階が含まれる：トウモロコシ植物に由来する少なくとも1種の未成熟
胚に少なくとも一つの遺伝子を胚に伝達する能力をもつアグロバクテリウムを接
触させる段階；胚をアグロバクテリウムとともに共培養する段階；N6塩類、アグ
ロバクテリウム成長阻害能力をもつ抗生物質、および対象遺伝子発現する胚を選
択するための選択用薬剤を含む培地中で胚を培養する段階；および対象遺伝子を
発現する植物体を再生させる段階。
【０１１５】 B．微小発射体（microprojectile）を用いた形質転換法 バイオリスティック法とも呼ばれる微粒子銃法（microprojectile bombardmen
t）では、DNAの輸送は生物学的に不活性な材料でできた極めて小さな粒子を用い
て行われる。不活性な粒子をDNAで被覆して、適切な速度まで加速すると、1個ま
たは複数の粒子が1個または複数の細胞内に入り込み、細胞内でDNAが粒子から遊
離して発現する。一部の細胞は照射時にひどく損傷を被るものの、一部の受容細
胞は生存して導入DNAを安定に保持して、それを発現する。サンフォード（Sanfo
rd）らは、適切な粒子発射装置に関する一般的な記述を提供している（Sanford
ら（1987） Particulate Sci. Technol. 5：27〜37）。
【０１１６】 微粒子銃法は、新しい遺伝的特性をコードする遺伝子を、タマネギ、ワタ、ト
ウモロコシ、タバコ、イネ、コムギ、ヒマワリ、ダイズ、および一部の野菜を含
むいくつかの植物に導入するのに良好に使用されている（米国特許第4,945,050
号；Sanfordら（1988） Trends in Biotechnology 6：299；Sanfordら（1988） Part. Sci. Technol. 5：27；J.J. FinerおよびM.D. McMullen （1990） Plant Cell Reports 8：586〜589；およびGordon-Kamm （1990） The Plant Cell 2：6
03；Kleinら（1988） Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85：4305〜4309）。微粒子銃
法による形質転換は、アグロバクテリウムを用いた形質転換法と比べてそれほど
種特異的でも遺伝子型特異的でもないが、照射後の安定な形質転換事象が起こる
頻度は、所望の表現型を担うDNA分子または遺伝子の植物ゲノムDNAへの組込みに
かかわる天然の機構が存在しないこともあって極めて低い。例えばワタを対象と
した微粒子銃による形質転換は、形質転換の標的とする100〜500個の成長点あた
りクローンのトランスジェニック植物を1個体しか生じないことが報告されてい
る。これらの形質転換体の0.1〜1%のみが子孫への外来DNAの伝達能を有していた
（国際公開公報第92/15675号）。微粒子の照射を受けた細胞は植物体に再生しな
ければならず、労働集約的で無菌性の組織培養法を必要とし、また一般的に多く
の作物（特にワタ）において遺伝子型に依存する。同様に低い形質転換頻度は他
の植物種でも報告されている。微粒子銃法他の短所には、植物組織が損傷を受け
る部位、すなわち形質転換対象が送り込まれる部位が制御できないことがある。
生殖系列の組織を標的とすることができないことは、微粒子銃法で達成される形
質転換効率の低さをある程度説明している。また発射頻度は、形質転換対象の植
物細胞ゲノムへの2コピー以上の形質転換用DNAまたは遺伝子の送達を生じる。こ
れは、再生後の形質転換植物に有害な影響を及ぼすことがある。DNAを微粒子銃
法で送り込んで、挿入対象遺伝子の一部のみをもつトランスジェニック植物を生
じる際に挿入DNAが断片化することもある。
【０１１７】 微粒子銃法の効率を高めようとする試みがなされている。例えば欧州特許出願
第0486 233号には、照射後の組織を対象遺伝子を有するアグロバクテリウムで処
理する手法について記載されている。高密度の微粒子発射体を高速で照射すると
きに生じる衝撃は、アグロバクテリウム感染による伝達を特異的に高める環境と
なる一連の微小な損傷を生じると考えられている。しかしながら、形質転換され
た植物細胞を植物体に再生させなければならないのは変わりなく、稔性をもつ安
定な形質転換植物を再生植物の個体群全体から選択しなければならない。器官発
生および体細胞胚形成が植物体の再生に用いられている。それにもかかわらず、
器官発生は形質転換細胞および非形質転換細胞をともに含むキメラ植物を頻繁に
生じ、また体細胞胚形成は器官発生よりは優れているものの大部分の穀物では高
度に遺伝子型に依存する。
【０１１８】 形質転換因子（transforming agent）またはDNAを、因子またはDNAが生殖系列
組織の細胞のDNA（特に植物の卵細胞のDNA）に直接組み込まれるように生殖系列
組織に送り込む試みがなされている。トロリンダー（Trolinder）らによる米国
特許第5,994,624号には、形質転換因子を植物組織に送り込む改善された方法で
あるインプランタ形質転換法（implanta transformation）が記載されている。
この方法では、植物組織の多くの細胞層を通して小さな高圧の溶液流を注入可能
とする針不要の注入装置が用いられる。形質転換因子は植物の花組織に送り込ま
れることで、対象遺伝子を含む形質転換因子の植物生殖系列細胞への送達が促進
される。注入装置が作り出す高圧の流れは、アグロバクテリウム培養物またはDN
A溶液が、針を有するシリンジを用いた直接注入または微粒子銃の使用で引き起
されるような大規模な組織損傷を引き起すことなく植物の花組織の多くの細胞層
を透過する確率を高める。この方法を用いて、胚形成組織の培養細胞、分裂組織
、および植物カルス（植物体に再生することができる）を含む植物の細胞および
組織を形質転換することができる。また、この方法によって、ワタ、ダイズ、ア
ルファルファ、アマ、タバコ、ヒマワリ、ラッカセイ、イチゴ、トマト、エンド
ウ、マメ類、カボチャ、コショウ、トウモロコシ、モロコシ類、オオムギ、オー
トムギ、ライムギ、コムギ、イネ、アブラナ、およびバレイショからなる群より
選択される植物の細胞および組織を形質転換することができる。
【０１１９】 クライン（Klein）ら（Kleinら（1988） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：43
05〜4309；Kleinら（1988） Bio/Technol. 6：59〜563；Kleinら（1989） Plant
Physiol. 91：440〜444）では、トウモロコシの非再生性懸濁培養細胞を対象と
する照射法のプロトコルが提供されているが、カルス培養または再生可能なトウ
モロコシ細胞を対象とする照射法についてのプロトコルはこれまで公にされてい
ない。ルンドクウィスト（Lundquist）ら（米国特許第6,013,863号）では、微粒
子銃法による再生可能なトウモロコシカルス培養へのDNAの送達法で、数個の形
質転換細胞について高レベルの生存率が認められたことが記載されている。この
方法はおそらく、他のイネ科の穀類の稔性のある安定なトランスジェニック植物
の作製に適用することができる。ドワイト（Dwight）ら（米国特許第5,990,387
号）には、稔性のある安定な形質転換されたトウモロコシ（Zea mays）の植物体
を作製する方法が記載されている。この方法は以下の段階を含む：農学的形質を
コードする遺伝子を有する発現ベクターを含む外来DNAを提供する段階；トウモ
ロコシの胚形成カルス、懸濁培養物、または植物体から単離された未成熟胚を提
供する段階；胚形成カルス、懸濁培養物、または植物体から単離された未成熟胚
へ1回または複数回の微粒子照射を行って外来DNAを導入する段階；および稔性の
あるトランスジェニックトウモロコシの植物体を再生させる段階。ドワイトらの
方法で良好に形質転換される植物には、トウモロコシ、ライムギ、オオムギ、コ
ムギ、サトウモロコシ、オートムギ、キビ、イネ、ヒマワリ、アルファルファ、
ナタネ、およびダイズなどが含まれる。
【０１２０】 ビスワス（Biswas）らは、胚発生細胞クラスターを対象とした微粒子銃法によ
るトランスジェニックイネ植物の作製について説明しており（Biswasら（1998） Plant Science、133：203〜210）、またヨウ（Yao）らは、オオムギ小胞子への
高速微小発射体を用いたプラスミドDNAの直接送達によるトランスジェニックオ
オムギ植物の作製について説明している（Yaoら（1997） Genome、40：570〜581
）。クリストウ（Christou）らは、イネの胚発生カルスの安定な形質転換に影響
するパラメータについて、また放電を利用した粒子加速法によるトランスジェニ
ック植物の再生について報告している（Christouら（1995） Annals of Botany
75：407〜413）。
【０１２１】 C．他の形質転換法 DNAを植物に物理的に送り込む他の方法には、標的細胞の超音波処理（Zhangら
（1991） Bio/Technology 9：996）およびリポソーム法、またはスフェロプラス
ト融合法（Deshayesら（1985） EMBO J.、4：2731、Christouら（1987） Proc N atl. Acad. Sci. USA 84：3962）などがある。CaCl2沈殿法、ポリビニルアルコ
ールまたはポリ-L-オルニチンを用いてDNAをプロトプラストに直接的に取り込ま
せる方法も報告されている（Hainら（1985） Mol. Gen. Genet. 199：161および
Draperら（1982） Plant Cell Physiol. 23：451）。ノブレ（Nobre）らは、ス
クテラム（scutellum）のプロトプラストを対象としたPEGを用いた形質転換法に
よるオオムギの稔性のあるトランスジェニック植物体の再生法について報告して
いる（Nobreら（1997） Barley Genetics Newsletter、27：16〜17）。プロトプ
ラストならびに全細胞および組織を対象とするエレクトロポレーション法につい
ても説明されている（Donnら（1990） Abstracts of VIIth International Cong ress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC 、A2〜38、53ページ；D'Halluin
ら（1992） Plant Cell 4：1495〜1505、およびSpencerら（1994） Plant Mol. Biol . 24：51〜61）。ダリュアン（D'Halluin）ら（米国特許第6,002,070号）は
実際に、エレクトロポレーションによる単子葉植物を対象とした迅速かつ効率の
よい形質転換法について説明している。ダリュアンの方法には、コンパクトな胚
発生カルスを形成可能な完全組織、または完全組織から得られたコンパクトな胚
発生カルスのいずれかへの対象DNAのエレクトロポレーションが含まれる。
【０１２２】 トランスジェニック植物を作製する他の手法にはウィスカー（whisker）を用
いた形質転換法がある。この方法では、材料を植物組織とともにインキュベート
し、DNA分子の植物細胞内への取り込みを促進させる。DNAの取り込みを促進する
このような材料（主にシリコンカーバイド）は使用時に細胞表面の損傷を伴うと
考えられている。総説はワン（Wang）ら（1995）（In Vitro Cell. Dev. Biol.
34：101〜4）を参照されたい。
【０１２３】 VII．導入遺伝子 組換えDNA手法を用いて植物に良好に導入された遺伝子には以下の形質をコー
ドする遺伝子が含まれるがこれらに限定されない：種子の貯蔵タンパク質（修飾
型7Sマメ科種子貯蔵タンパク質（7S legume seed storage protein）を含む）（
米国特許第5,508,468号、第5,559,223号、および第5,576,203号）；除草剤耐性
（米国特許第5,498,544号および第5,554,798号；Powellら（1986） Science 232
：738〜743；Kaniewskiら（1990） Bio/Tech. 8：750〜754；Dayら（1991） Pro c. Natl. Acad. Sci. USA 88：6721〜6725）；フィターゼ（米国特許第5,593,96
3号）；細菌、真菌、線虫、および害虫に対する耐性（Bt遺伝子によりもたらさ
れる鱗翅目の昆虫に対する耐性を含む）（米国特許第5,597,945号および第5,597
,946号；Hilderら、Nature 330：160〜163；Johnsonら（1989） Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA 86：9871〜9875；Periakら（1990） Bio/Tech. 8：939〜943）；
レクチン（米国特許第5,276,269号）；および花色（Meyerら（1987） Nature 33
0：677〜678；Napoliら（1990） Plant Cell 2：279〜289 （1990）；van der K
rolら（1990） Plant Cell 2：291〜299）。
【０１２４】 VIII．外因性DNAを植物で発現させるための発現ユニット 本発明はさらに、本発明のタンパク質をコードする核酸分子で形質転換された
宿主細胞を提供する。宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよい。本発明のタン
パク質の発現に有用な真核細胞には、細胞株が細胞培養法に適合し、また発現ベ
クターの増殖法および遺伝子産物の発現に適合する限りにおいて制限はない。宿
主として好ましい真核細胞には任意の植物種が含まれる。
【０１２５】 任意の原核生物の宿主を用いて、本発明のタンパク質をコードするrDNA分子を
発現させることができる。好ましい原核生物の宿主は大腸菌である。
【０１２６】 本発明のrDNA分子による適切な細胞宿主の形質転換は、典型的には使用される
ベクターのタイプおよび使用される宿主系に依存するよく知られた方法で達成さ
れる。原核生物の宿主細胞の形質転換に関しては、エレクトロポレーション法お
よび塩処理法が通常用いられる。これについては例えばコーエン（Cohen）ら（1
972） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69：2110〜2114；およびマニアティス（Man
iatis）ら（1982） Molecular Cloning - A Laboratory Manual、Cold Spring H
arbor Laboratory Pressを参照されたい。rDNAを含むベクターによる脊椎動物細
胞の形質転換法に関しては、エレクトロポレーション法、カチオニック脂質法、
または塩処理法が通常用いられる。これについては例えばグラハム（Graham）ら
（1973） Virology 52：456〜467；およびウィグラー（Wigler）ら（1979） Pro c. Natl. Acad. Sci. USA 76：1373〜1376を参照されたい。
【０１２７】 うまく形質転換された細胞、すなわち本発明のrDNA分子を含む細胞は、選択マ
ーカーの選択法を含むよく知られた手法で同定することができる。例えば、本発
明のrDNAの導入の結果得られた細胞をクローン化して1個のコロニーを生じさせ
ることができる。このようなコロニーに由来する細胞を回収し、溶解し、またそ
のDNA内容物中のrDNAの有無を調べることは、サザン（Southern）（1975） J. M ol. Biol. 98：503〜517；またはベレント（Berent）ら（1985） Biotech. Hist ochem. 3：208に記載された方法などで可能である。また細胞が産生したタンパ
ク質は免役学的方法でアッセイすることができる。
【０１２８】 本明細書の別のところで説明されているように、本発明のいくつかの態様では
、SH2-REV6タンパク質、SH2HS33タンパク質、およびSH2-REV6-HSタンパク質をコ
ードする配列などの外因的に供給された核酸配列を植物で発現させるために発現
ユニット（または発現ベクターまたは発現系）が用いられる。植物における用途
に発現ユニット/発現系/発現ベクターを作製する方法は当技術分野で周知であり
、SH2-REV6タンパク質、SH2HS33タンパク質、およびSH2-REV6-HSタンパク質など
の本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を植物細胞で発現させ
る用途に容易に応用することができる。当業者であれば、本明細書に記載されて
いる概要にしたがって本発明の方法に任意の適切な植物系/ベクター系/発現系を
容易に使用することができる。
【０１２９】 タンパク質の発現の調節に使用される発現調節因子は、コード配列と関連して
通常みられる発現調節因子（相同な発現因子）であっても非相同な発現調節因子
であってもよい。さまざまな相同および非相同の発現調節因子は当技術分野で周
知であり、本発明に使用される発現ユニットを作るために容易に使用することが
できる。例えば転写開始領域には、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのTi
プラスミド上に見出されるオクトピン、マンノピン、ノパリンなどの任意のさま
ざまなオピンの開始領域を含めることができる。あるいは、カリフラワーモザイ
クウイルスの35Sプロモーターなどの植物ウイルスのプロモーターを用いて植物
の遺伝子発現を調節することもできる。また、プロリフェラのプロモーター、果
実特異的なプロモーター、Ap3プロモーター、熱ショックプロモーター、種子特
異的なプロモーターなどの植物プロモーターを使用することもできる。最も好ま
しいプロモーターは芽生えで最も活性が高い。
【０１３０】 構成的プロモーター（CaMVまたはNosのプロモーターなど）、器官特異的なプ
ロモーター（トマトのE8プロモーターなど）、または誘導的プロモーターは、通
常は当技術分野で周知の標準的な手法でタンパク質またはアンチセンスをコード
する領域に連結される。発現ユニットはさらに、転写終結因子および/またはエ
ンハンサー因子などの付加的な因子を用いることで最適化することができる。
【０１３１】 したがって植物における発現については、発現ユニットは通常、タンパク質配
列のほかに植物プロモーター領域、転写開始部位、および転写終結配列を含む。
発現ユニットの5'端および3'端に1か所しかない制限酵素切断部位は通常、既存
のベクターへの容易な挿入を可能とするために含まれる
【０１３２】 異種プロモーター/構造遺伝子、またはアンチセンスの組み合わせの構築時に
は、プロモーターは、天然の状態における転写開始部位からの距離と同様に、異
種転写開始部位からほぼ同じ距離のところに位置することが好ましい。しかし当
技術分野で周知であるように、この距離のある程度の変化はプロモーターの機能
を失うことなく許容される場合がある。
【０１３３】 発現カセットはプロモーター配列のほかに、効率のよい終結をもたらすために
構造遺伝子の下流に転写終結領域も含むことがある。終結領域はプロモーター配
列と同じ遺伝子から得られるほか、異なる遺伝子からも得られる。構造遺伝子に
コードされたmRNAが効率よくプロセシングを受けると、RNAのポリアデニル化を
指令するDNA配列も、ベクターコンストラクトに一般に加えられる。ポリアデニ
ル化の配列には、アグロバクテリウムのオクトピンシンターゼのシグナル（Giel
enら（1984） EMBO J 3：835〜846）、またはノパリンシンターゼのシグナル（D
epickerら（1982） Mol. and Appl. Genet. 1：561〜573）が含まれるがこれら
に限定されない。
【０１３４】 結果として得られる発現ユニットは、高等植物の形質転換に適したベクターに
連結されるか、または通常であればベクターに含まれるように構築される。この
ようなベクターはまた典型的には、形質転換植物細胞を培養物中で同定可能な選
択マーカー遺伝子を含む。通常このようなマーカー遺伝子は抗生物質耐性をコー
ドする。このようなマーカーは、G418、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カ
ナマイシン、およびゲンタマイシンに対する耐性を含む。植物細胞の形質転換後
、ベクターを有する細胞は、特定の抗生物質を含む培地上における成長能力を指
標として同定される。細菌またはウイルスに由来する複製関連配列も一般に含ま
れて、細菌宿主またはファージ宿主におけるベクターのクローン化を可能とする
（好ましくは広宿主域の原核生物起源の複製起点が含まれる）。所望のコンスト
ラクトをもつ細菌細胞の選択を可能とするために、細菌用の選択マーカーも含ま
れるべきである。適切な原核生物の選択マーカーも、カナマイシンまたはテトラ
サイクリンなどの抗生物質に対する耐性を含む。
【０１３５】 当技術分野で知られているように、付加的な機能をコードする他のDNA配列が
ベクター上に存在する場合もある。例えばアグロバクテリウムを用いた形質転換
法の場合、後に植物染色体へ移すためにT-DNAの配列も含まれることがある。
【０１３６】 本発明に用いられるSh2-Rev6、Sh2hs33、およびSh2-Rev6-HSの配列などの本発
明のポリヌクレオチド配列は、EST （Expressed Sequence Tags）、エピトープ
、または蛍光タンパク質マーカーなどのさまざまな他の核酸分子と融合させるこ
ともできる。
【０１３７】 ESTは、相補的DNA（cDNA）クローンの3'端または5'端から配列決定される典型
的には長さが300〜400ヌクレオチドの遺伝子断片である。シロイヌナズナ（Arab
idopsis thaliana）のほぼ30,000個のESTがフランスとアメリカのコンソーシア
ムによって作製されている（Delsenyら（1997） FEBS Lett. 405（2）：129〜13
2；Arabidopsis thaliana Database、http://genome.www.stanford.edu/Arabido
psis）。大規模なESTデータベースに由来する遺伝子発現パターンの分析に関す
る議論については、例えばファノン（M.R. Fannon）（1996） TIBTECH 14：294
〜298を参照されたい。
【０１３８】 生物学的に適合性のある蛍光タンパク質プローブ、特に、オワンクラゲ（Aequ
orea victoria）に由来する自己集合性の緑色蛍光タンパク質（GFP）は、細胞生
物学、分子生物学、および発生生物学の研究を革命的に変化させた。というのは
このようなタンパク質を用いることで生細胞内における生化学的過程の視覚化が
可能となるからである（Murphyら（1997） Curr. Biol. 7（11）：870〜876；Gr
ebenokら（1997） Plant J. 11（3）：573〜586；Pangら（1996） Plant Physio l. 112（3）；Chiuら（1996） Curr. Biol. 6（3）：325〜330；Plautzら（1996
） Gene 173（1）：83〜87；Sheenら（1995） Plant J. 8（5）：777〜784）。
【０１３９】 部位特異的変異導入法を用いて、可溶性修飾型GFP（smGFP）と呼ばれる、より
可溶性の大きいコドン修飾型のGFPが開発されている。これをシロイヌナズナに
導入すると、コドン修飾型GFPと比較して強い蛍光が観察される。このことはsmG
FPが、その大部分が可溶性および機能性の状態で存在するために「より明るい」
ことを意味する（Davisら（1998） Plant Mol. Biol. 36（4）：521〜528）。GF
Pおよびβ-グルクロニダーゼ（GUS）をコードする遺伝子を融合させることで、
研究者らは、シロイヌナズナを含む植物の一過性で安定な発現系における使用に
最適な一連の二機能性レポーターコンストラクトを作製することが可能となった
（Quaedvliegら（1998） Plant Mol. Biol. 37（4）：715〜727）。
【０１４０】 バーガー（Berger）ら（Bergら（1998） Dev. Biol. 194（2）：226〜234）で
は、シロイヌナズナの胚軸表皮細胞のGFPマーカー系列が単離されたことが報告
されている。GFP融合タンパク質は、ゲラニルゲラニルピロリン酸（GGPP）を含
むいくつかのシロイヌナズナ遺伝子の位置を決定して特性を決定するために用い
られている（Zhuら（1997） Plant Mol. Biol. 35（3）：331〜341）。
【０１４１】 IX．育種法 放任受粉個体群 ライムギ、トウモロコシ各種、およびサトウダイコンなどの穀物、牧草、アル
ファルファおよびクローバーなどのマメ科植物、ならびにカカオ、ココナッツ、
アブラヤシ、および一部のゴムノキなどの熱帯性の木本性作物の放任受粉個体群
の改良は、高い（が極めて大きいほどではない）程度のヘテロ接合性を維持しな
がら好ましい対立遺伝子の固定に向かう遺伝子頻度の変化に本質的に依存する。
このような個体群が均質になることはありえず、また放任受粉された品種におけ
る型の真度（trueness-to-type）は、個々の植物体の特徴ではなく全体としての
個体群の統計学的な性質である。したがって放任受粉された個体群の不均一性は
、近交系の系列、クローン、および雑種の均一性と対照的である（または事実上
対照的である）。
【０１４２】 個体群の改良法は、純粋に表現型の選択法（集団選択と通常呼ばれる）に基づ
くものと、子孫調査（progeny testing）に基づく選択法の二群に属するのが妥
当である。個体間の改良は、遺伝子が一つの個体群から別の個体群へ流れるとい
う開放系における育種個体群の概念を用いる。ある個体群（品種、株、生態型、
または任意の生殖質の供給源）の植物を、自然に（例えば風で）、または手を使
ったりハチ（一般的にはApis mellifera L.またはMegachile rotundata F.）を
使ったりして他の個体群の植物と交配させる。両供給源の所望の形質をもつ植物
を単離することで一方の個体群（ときには両方の個体群）を改良するために選択
法が適用される。
【０１４３】 放任受粉による個体群の改良法には基本的に2つの主要な方法がある。第1に、
個体群が選択された手法により全体的に変化する状況がある。この結果、分離時
に個体自身内における任意交配（random-mating）によって無限に増殖可能な改
良個体群が生じる。第2に、合成品種は個体群の改良と同じ最終的結果を達成す
るが、それ自体で増殖しない。すなわち親系列またはクローンから再構成しなけ
ればならない。放任受粉個体群を改良するための以上の植物育種法は当業者に周
知であり、また、他家受粉植物の改良にルーチンに用いられる育種法に関する包
括的な総説は以下を始めとする多くのテキストおよび記事に記載されている：ア
ラード（Allard）（1960） Principles of Plant Breeding、John Wiley & Sons
、Inc.；シモンズ（Simmonds）（1979） Principles of Crop Improvement、Lon
gman Group Limited；ハルアー（Hallauer）およびミランダ（Miranda）（1981
） Quantitative Genetics in Maize Breeding、アイオワ大学出版会；およびイ
ェンセン（Jensen）（1988） Plant Breeding Methodology、John Wiley & Sons
、Inc.
【０１４４】集団選択 集団選択では、所望の個々の植物体を選択し、収穫し、種子を複合し、後続世
代を生産するための調査を行わない。選択法は母系のみに基づき、受粉に対する
対照はないので、集団選択は選択を伴う任意交配の形状をとることになる。上述
した通り、集団選択の目的は、個体群内における優れた遺伝子型の割合を高める
ことにある。
【０１４５】合成品種 合成品種は、同一育種間で、すべての可能な雑種の混合における良好な混合能
力について選択されたいくつかの遺伝子型を交配し、その後に放任受粉により品
種を維持することで作られる。親が、一部のサトウダイコンおよびマメ類（Vici
a）でみられるように（ある程度近交系）種子増殖系列か、または牧草、クロー
バー、およびアルファルファでみられるようにクローンであるか否かによって原
則として差はない。親は、一般的な混合能力に基づいて選択されるが、時には試
験交配またはトップ交雑（topcross）により選択される場合もあり、一般的には
多重交配によって選択される。親の種子系列は故意に近交系とすることができる
（例えば自家受粉または同胞交配による）。しかしながら、たとえ親が故意に近
交系でなくとも、系列維持中の系列内における選択は、ある程度の同系交配が起
きることを確実なものとする。クローンの親が変化せずに高度にヘテロ接合性で
あることは言うまでもない。
【０１４６】 合成品種が親の種子生産プロットから農家の手に直接進むか、または最初に1
サイクルもしくは2サイクルの増殖を行わなければならないかは、種子生産およ
び種子に対する要求の規模によって変わる。実際には、草本およびクローバーは
一般的には1回または2回増殖させるので、当初の合成品種からかなり離れる。
【０１４７】 集団選択がときに用いられるのに対し、子孫調査は一般に多重交配の場合に好
まれる。というのは、その操作性が簡便であり、目的に対する明らかな妥当性が
あること、すなわち合成品種における一般的な混合能力のを活用できるからであ
る。
【０１４８】 合成品種に入る親系列または親クローンの数は大きく変動する。実際には、親
系列の数は10〜数100個の範囲にある（平均100〜200個）。100個またはそれ以上
のクローンから作られる基礎の広い合成品種（broad based synthetics）は、基
礎の狭い合成品種と比べて種子増殖中により安定であると期待されることがある
。
【０１４９】雑種 雑種は、遺伝子型が異なる親どうしの交配で生じる個々の植物体である。市販
の雑種は現在、トウモロコシ（メイズ）、サトウモロコシ、サトウダイコン、ヒ
マワリ、およびブロッコリーを含む多くの穀物で盛んに使用されている。雑種は
コムギおよびイネでも作ることができる。雑種は、2つの親の直接交配（単交雑
雑種）、単交雑雑種と別の親との交配（三元または三系交雑雑種）、または2つ
の異なる雑種の交配（四元または複交配雑種）を含む多種多様な方法で作ること
ができる。
【０１５０】 厳密に言えば、異系交配（すなわち放任受粉）で得られる個体群の大部分は雑
種であるが、この用語は通常、親が十分異なるゲノムをもち、異なる種または亜
種として認識される個体について言う場合のために残しておかれる。雑種は、両
親のゲノムの質的および/または量的な差に基づき稔性がある場合もあればない
場合もある。雑種強勢（heterosisまたはhybrid vigor）は通常、雑種を作るた
めに使用された親系列と比較して雑種の生長力を高め、生存率を高め、また稔性
を高めるヘテロ接合性の上昇に関連している。最大の雑種強勢は通常、2種の遺
伝学的に異なる、高度に近交系の交配により達成される。
【０１５１】 雑種の生産は、よく発達した産業であり、親系列と親系列の交配の結果生じる
雑種の両方を単離して産生することが関与する。雑種生産法の詳細な議論につい
ては例えばライト（Wright）、Commercial Hybrid Seed Production 8：161〜17
6（Hybridization of Corp Plants、前掲）を参照されたい。
【０１５２】 X．コムギの種子数、種子収量、およびシンク能力 コムギの種子数および後の種子収量は花序間の競争の影響を受ける（Whingwir
iら、1981）。コムギの収量は、同化産物の供給を欠くために、または種子の大
きさおよび/または数を制限する花序間の競争のために穂になる部分（ears pote
ntial）より常に低い（ZamskiおよびGrunberger、1995）。健康でよく育ったコ
ムギ植物は、穂および種子と比べて常に多くのシュート（頭部になる器官）およ
び花序（種子になる器官）を生産する。種子数を制御する重要な因子は発生種子
のシンク強度である（ThorneおよびWood、1987）。この分野の総説の一つ（Evan
sら、1975）では、コムギの多くの事例で収量が発生種子のシンク能力により制
限されることが記載されている。低シンク強度に起因する制限は、種子の付きの
減少、コムギ穂数の減少、および個々の種子重量の減少としてみられることがあ
る。コムギでは、発生中の穂に至る同化フローの速度が、初期の花の生存率を決
定して最終種子数の決定に重要な役割を果たすと一般的に考えられている（Spie
rtzおよびvanKeulen、1980；Abbateら、1998）。コムギの穀粒数を増やすおそら
く最も有効な方法は、穀粒発生に至る同化フローを変えることであると考えられ
る（Bindrabanら、1998）。シンク強度が上昇した本発明のトランスジェニック
コムギは、この仮説が正しいことの確認となる。
【０１５３】 本明細書で言及または引用されたすべての特許、特許出願、仮出願、および出
版物は、本明細書に明示された内容に矛盾しない範囲において全体が参照として
組み入れられる。
【０１５４】材料および方法 I．トランスジェニック植物の作製 本発明のベクターを用いて望む通りに植物を形質転換して、本明細書の別のと
ころで述べた本発明の植物を作る場合がある。
【０１５５】コムギの形質転換 ウィークス（Weeks）ら（1993）およびバシル（Vasil）ら（1993）に記載され
た方法は、コムギ品種「Hi-Line」を形質転換するための小規模修飾に適用され
ている（Lanningら、1992）。ルーチンに実施される手法では、開花から約7日後
にコムギ品種から単離された未成熟胚が最初に用いられる。
【０１５６】 Biolistic PDS-1000 He （Bio-Rad laboratories、米国）装置を、微粒子銃法
によるコムギ組織の形質転換に使用した。
【０１５７】 コムギのカルスには1500 psiで破砕されたディスクを使用した。破砕されたデ
ィスク、マクロキャリア、ストッピングスクリーンなどの無菌化などの他の手順
は製造業者のマニュアルに厳密に従った。
【０１５８】イネの形質転換 シヴァマニ（Sivamani）ら（1996）に記載された方法をイネ品種「M202」の形
質転換法に適用することができる（Johnsonら、1986）。ルーチンに実施される
この手法は、成熟種子から培養された胚形成カルスを最初に用いる。
【０１５９】 微粒子銃を用いたイネ組織の形質転換にはBiolistic PDS-1000 He （Bio-Rad
laboratories、米国）装置を用いる。
【０１６０】 イネのカルスには1500 psiで破砕されたディスクを使用する。破砕されたディ
スク、マクロキャリア、ストッピングスクリーンなどの無菌化などの他の手順は
製造業者のマニュアルに厳密に従う。
【０１６１】エンドウの形質転換 米国特許第5,286,635号（実施例9）および米国特許第5,773,693号（実施例V）
に記載された方法をエンドウ（Pisum sativum L.）品種「Pea Green Arrow」（P
ark Seed（登録商標）から市販品を入手可能）を形質転換する小規模修飾に適用
することができる。エンドウの外植片材料を、Sh2-Rev6-HS配列を有するアグロ
バクテリウム細胞とともにインキュベートすることで形質転換する。エンドウの
外植片は好ましくは、エンドウの種子の幼芽から得て、形質転換されたシュート
は好ましくはカルス相を通過させることなく外植片材料において直接誘導する。
形質転換されたエンドウの植物体は、形質転換されたシュートから、発根および
それに続く土への移植により再生することができる。外因性のSh2-Rev6-HSのDNA
は、対象遺伝子を発現可能と考えられる再生された「Pea Green Arrow」植物の
染色体中に安定に組み込まれる。
【０１６２】 II．プラスミド コムギ CaMV 35Sプロモーターの制御下にあり、AdhIイントロンおよびNOSターミネー
ターをもつBar遺伝子（Frommら、1990）のコード配列を含むプラスミドDNA pRQ1
01をトランスジェニックコムギ組織を選択する際の選択マーカーとして用いた。
【０１６３】イネ イネの選択マーカーには、トウモロコシのユビキチンプロモーターの制御下に
あるハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼのコード配列を含むプラスミ
ドDNA pILTAB222を用いた（Sivamaniら、1996）。
【０１６４】エンドウ エンドウの選択マーカーには、米国特許第5,773,693号記載のセフォタキシム耐
性のコード配列を用いることができる。この抗アグロバクテリウム抗生物質は、
エンドウのカルスを成長させる選択・再生用培地中で（500 mg/l）使用すること
ができる。
【０１６５】一般的事項 マーカー遺伝子（すなわちBar、ハイグロマイシン耐性、またはセフォタキシ
ム）は、Sh2-Rev6-HS遺伝子とは異なるコンストラクト上にあった。
【０１６６】 Sh2-Rev6-HS遺伝子を穀物に導入するためにプラスミドpSh2-Rev6-HSを作製し
た。このプラスミドはSh2-Rev6-HSのcDNAを含むほか、Sh2プロモーター、Sh1の
第1イントロン、およびNOSターミネーターも含む（Rogersら、1987）。具体的に
はプラスミドpSh2-Rev6-HSは、5'→3'方向に連結された以下のヌクレオチド断片
を含む：Sh2プロモーターのヌクレオチド -1084〜+36；ポリリンカーの8ヌクレ
オチド；2残基のC；Sh1の第1エキソンのヌクレオチド+43〜+52、Sh1の第1イント
ロンのヌクレオチド+53〜+1080、およびSh1の第2エキソンのヌクレオチド+1081
〜1097を含むSh1の第1イントロンカセットのヌクレオチド；1残基のC；BamHI制
限酵素切断部位を含むポリリンカーの13残基のヌクレオチド；Sh2-Rev6-HS （配
列番号：3）をコードするcDNA；KpnIおよびSstI制限酵素切断部位を含む18ヌク
レオチドのポリリンカー；およびNOSターミネーターの核酸。Sh2プロモーターの
核酸配列は、ショー（Shaw）およびハナ（Hannah）（1992）、Plant Physiology 、98：1214〜1216に記載されている。Sh1イントロンカセットの配列のナンバリ
ングは、ザック（Zack）ら（1986） Maydica. 31、5〜16に示されており、Sh1の
第1イントロンカセットが一時的な遺伝子発現に及ぼす作用は、クランシー（Cla
ncy）ら（（1994） Plant Science、98、151〜161）およびバシル（Vasil）ら（
（1989）、Plant Science、91、1575〜1579））に記載されている。3残基の付加
的なC（2個は5'端にあり、1個は3'端にある）はサブクローニングの過程で残さ
れたヌクレオチドである。プラスミドは、輸送ペプチドおよびコンセンサス開始
部位を含む。本出願に使用されるプラスミドpSh2-Rev6-HSはフロリダ州立大学か
ら提供されたものである。
【０１６７】 Sh2-Rev-HSをエンドウなどの双子葉植物に導入する際には、上述のプラスミド
を、Sh2プロモーターがエンドウのビシリン（vicilin）プロモーター（米国特許
第5,773,693号）などの双子葉植物の種子特異的なプロモーターで置換されるよ
うに修飾する。Sh2-Rev6-HSの双子葉植物における発現に関与する他の適切なプ
ロモーターおよび/またはコンストラクトは当業者に周知である（例えば米国特
許第5,773,693号を参照）。
【０１６８】 III．トランスジェニック植物の選択および再生 コムギ トランスジェニックコムギ植物は、ビアラフォス（bialaphos）（Meiji Seika
Kaisha Ltd、Japan）選択法を用いたウィークス（Weeks）ら（1993）およびバ
シル（Vasil）ら（1993）に記載された方法によって粒子銃を使用した未成熟胚
から得られた。コムギの耐性カルスを培地に移してシュートと根の両方の産生を
誘導する。
【０１６９】イネ トランスジェニックイネ植物は、シヴァマニ（Sivamani）ら（1996）の手法に
より、微粒子を照射したイネの胚発生カルスからハイグロマイシン選択法で得た
。イネの耐性カルスを培地に移してシュートと根の両方の産生を誘導する。
【０１７０】エンドウ トランスジェニックエンドウ植物は、アグロバクテリウムで形質転換したエン
ドウ外植片カルスから、米国特許第5,773,693号の方法によりセフォタキシム選
択法で得ることができる。
【０１７１】 エンドウのシュートは、米国特許第5,773,693号（実施例V）にしたがってソル
バロッド・プラグ（Sorbarod plugs）（Baumgartnen Papiers SA、スイス）に移
して、液体YRM中に浸漬することで根を発生させることができる。
【０１７２】一般的事項 推定トランスジェニック植物の苗を温室に移して自家受粉させた。コムギの場
合、このような苗の通常75%を上回るものが逸出植物であり、真のトランスジェ
ニック植物は、0.1%のグルホシネート（Liberty（登録商標）、Agrevo社）を植
物体に噴霧して選択した。
【０１７３】 IV．PCR用プライマー PCRに用いるSh2特異的なプライマーおよびNOS特異的なプライマーを用いて、S
h2-Rev6-HS導入遺伝子がトランスジェニック植物内に存在することを確認した。
5'側のプライマーはMC4Sh2であり、このコンストラクトのSh2配列に特異的な26-
merの配列は以下の通りである：
【０１７４】 3'側のプライマーはMC35PUC19であり、このコンストラクトのpucバックボーン
に特異的な24-merの配列は以下の通りである：
【０１７５】 これらのプライマーは、826 bpのPCR産物（Sh2 cDNAの309 bp、NOSの260 bp、
およびpUC19の257 bp）を生じる。
【０１７６】 本発明を実施する手順を示す例を以下に挙げる。これらの実施例は制限するも
のと解釈すべきでない。特に断らない限り、すべてのパーセンテージは重量%を
示し、すべての溶液混合物の割合は体積を示す。
【０１７７】実施例1：トランスジェニックコムギ植物の遺伝解析 コムギ形質転換体の一次プールから、Sh2-Rev6-HSおよび/またはbasta耐性に
関してトランスジェニックであるいくつかの独立した形質転換体が得られた。
【０１７８】 管理した条件下にて温室内でT0植物に種子を生産させ成熟させた。
【０１７９】 選択したコムギ形質転換体を対象に、導入遺伝子の有無、およびbasta耐性に
関するT1種子の分離データの分析をPCR法で行った。
【０１８０】 トランスジェニックコムギ植物のPCR法によるスクリーニングでは、MC4Sh2お
よびMC35PUC19（プライマーの配列は上述）を用いて、葉の組織から標準的なPCR
プロトコルで調製したゲノムDNA試料中におけるSh2-Rev6-HSの有無を調べた。
【０１８１】 27個体の独立した系列のトランスジェニックコムギを検討した。検討対象の27
個体のトランスジェニック系列はすべてbasta耐性について陽性であった。27個
体のトランスジェニック系列の15個体がSh2-Rev6-HS導入遺伝子の存在に関して
陽性を示し、残りの12個体はSh2-Rev6-HSの導入遺伝子の存在に関して陽性を示
さなかった。
【０１８２】実施例2：トランスジェニックコムギ植物体の表現型解析 さまざまな表現型を集めて、温室で育てた27個体のトランスジェニックコムギ
植物体をそれぞれ分析した。既に言及した通り、27個体すべてのトランスジェニ
ック系列が除草剤耐性遺伝子を保持していた。形質には以下のようなものが含ま
れた：植物体1個体あたり種子数（Seeds/Plnat）；個々の種子重量（Individual
Seed Wt.）（穀粒1個あたりのミリグラム：mg/kernel）；収穫指数（Harvest I
ndex）；総種子重量（Total Seed Wt.）（植物体1個体あたりのグラム：g/plant
）；植物体1個体あたりの穂数（Heads）；総植物体重量（Plant Wt.）（植物体1
個体あたりのグラム：g/plant）；および止葉重量（Flag Leaf Wt.）（植物体1
個体あたりのグラム：g/plant）。
【０１８３】 種子は37℃のインキュベーター内でむらなく乾燥して水分を約10%〜約14%とし
た。
【０１８４】 植物体の地上部を成熟した時点で収穫し、水分が約0%になるまで125℃のイン
キュベート内でむらなく乾燥させた。乾燥後の植物体重量および乾燥後の止葉重
量を、種子と同じ水分含有量（すなわち約10%〜約14%）における重量を反映する
ように補正した。根は回収しなかった。
【０１８５】 植物体重量は、植物体の総種子重量および植物体の止葉重量を含まない植物体
の「地上部」の総重量で表す。
【０１８６】 収穫指数（HI）は以下の式から計算した： HI＝{（総種子重量）/（総種子重量＋ 総植物体重量 ＋止葉重量）}。
【０１８７】 植物体1個体あたりのコムギの穂数については、任意の特定の穂内における種
子の有無または数度に関係なく穂数をカウントした。
【０１８８】 表現型関連データは、以下に述べる複数の異なる方法で分析した。
【０１８９】PCR+系列とPCR-系列との比較 この比較は、Sh2-Rev6-HSに関して陰性結果（PCR-）を示した全トランスジェ
ニック系列（12系列）に対して、Sh2-Rev6-HSに関してPCR陽性結果（PCR+）を示
した全トランスジェニック系列（15系列）を対象に行った。したがってPCR+系列
は除草剤耐性遺伝子およびSh2-Rev6-HS遺伝子の両方を有するのに対して、PCR-
系列は除草剤耐性遺伝子のみを有する。結果を表１に示す。
【表１】 PCR+系列とPCR-系列との比較 ＊、＊＊、＊＊＊は、ｔ検定に基づき、それぞれｐ値≦0.05、0.01または0.001
を示す。
【０１９０】SH2+とSH2-との比較 。 第2の比較では、導入タンパク質のレベルの上昇（SH2+）も示した、Sh2-Rev6-
HSに関してPCR陽性を示した8個体のトランスジェニック系列のみを平均化して他
の系列（SH2-）と比較した。SH2+の8個体のPCR+系列は、導入タンパク質のレベ
ルの上昇が検出された系列である。基本的にSH2のレベルは、除草剤耐性遺伝子
のみに関してトランスジェニックであった系列の同レベルと比較した。除草剤耐
性遺伝子のみについてトランスジェニックである系列によるSH2の産生と比較し
て25%またはそれ以上のSH2タンパク質を産生したこのような実験対象植物を「SH
2+」と表した。
【０１９１】 SH2+系列は、導入タンパク質の有意な発現を欠く他の19の系列（「SH2-」）と
比較した。したがって、19個体のSH2-系列は、有意なレベルのSH2-REV6-HSタン
パク質を発現しなかった7個体のPCR+系列、およびSH2-REV6-HSを全く発現しなか
った12個のPCR+系列からなる。このデータを表２に示す。
【表２】 SH2+とSH2-との比較 ＊、＊＊、＊＊＊は、ｔ検定に基づき、それぞれｐ値≦0.05、0.01または0.001
を示す。
【０１９２】 表２のデータは、SH2+系列の植物体1個体あたりの総種子数が、SH2-系列の植
物体1個体あたりの総種子数と比較して約54%増加したことを示す。SH2-系列と比
較するとSH2+系列では個々の種子重量は約13%上昇し、総種子収量は約68%増加し
た。SH2+系列の収穫指数は、SH2-系列の同指数より約25%高い値であった。SH2+
系列はまた、植物体の総重量および止葉重量について有意に大きい値を示した（
それぞれ約+25%と約+15%）。
【０１９３】Sh2-Rev6-HSのホモ接合系列とへテロ接合系列との比較 T2種子の子孫調査でホモ接合であることが判明したT1植物を「Homoz SH2+」と
表した。Homoz SH2+植物体の種子は他の系列と比べて遺伝子量の多い導入遺伝子
をもつことが予想される。この比較では、Homoz SH2植物とヘテロ接合のSH2+植
物（Heteroz SH2+）とを比較し、また12個体のPCR-系列との比較も行った。
【表３】 Sh2-Rev6-HSのホモ接合系列とへテロ接合系列との比較 ＊、＊＊、＊＊＊は、ｔ検定に基づき、それぞれｐ値≦0.05、0.01または0.001
を示す。
【０１９４】 分析対象植物体の大多数（約3分の2）はSh2-Rev6-HSに関してヘテロ接合であ
ると判定されたので、SH2-REV6-HSをコードする導入遺伝子の可能遺伝子量の半
分のみをもつ。
【０１９５】 上昇した遺伝子量の作用を明らかにするために、個々のT1植物についてホモ接
合またはヘテロ接合かの判定を、植物体から収穫したT2種子を対象とした子孫調
査で行った。除草剤耐性マーカー遺伝子の分離がみられないことがホモ接合であ
ることの証拠とされた。22個体のSH2+ホモ接合植物体とヘテロ接合のSH+植物と
の比較の結果、Sh2-Rev6-HS導入遺伝子の遺伝子量の増加が、導入遺伝子を含ま
ないか発現しない植物体に対してさらに大きな収量および植物体成長の上昇を誘
導することがわかる。表３に示す結果から、植物体1個体あたりの総種子重量がS
H2+ヘテロ接合植物体と比べて約110%上昇することがわかる。
【０１９６】実施例3：イネを用いた実験 トランスジェニックイネ植物は「材料および方法」で記載された通りに作製す
る。結果として得られたイネ植物体は、実施例1および2に記載された手順で分析
する。
【０１９７】実施例4：エンドウを用いた実験 トランスジェニックエンドウ植物は「材料および方法」で記載された通りに作
製する。結果として得られたエンドウ植物は、実施例1および2に記載された手順
で分析する。
【０１９８】実施例5：SH2-REV6-HS トランスジェニックイネ系列のノーザン分析 10個またはそれ以上の発生中の種子を個々のT0トランスジェニックイネ系列か
ら回収した。すべてのT0トランスジェニック系列はSh2-Rev6-HS導入遺伝子につ
いてPCR陽性であった。標準的な方法でRNAを調製して分析した。AGPの小サブユ
ニットのプローブ（Brittle-2）またはSh2-Rev6-HS導入遺伝子のコード配列を用
いて2回のブロッティングを行った。M202で表される遺伝子型が品種対照となる
。
【０１９９】 図1からわかるように、RS1、RS4、RS10、RS20、およびRS22のトランスジェニ
ック植物はSh2-Rev6-HS導入遺伝子を発現している。これに対し、非形質転換M20
2植物体は同導入遺伝子を発現していない。ローディングにおける違いは小さい
ため、発現の小さな差は導入遺伝子に起因する場合もあればそうでない場合もあ
る。ローディングにおける有意差は、Brittle-2遺伝子をプローブの対象とした2
回行ったブロッティングからは明らかではない。
【０２００】実施例6：SH2-REV6-HSトランスジェニック系列のAGP活性およびT1の種子重量 AGP活性のアッセイ法は、最小10個の発生中の種子から調製した抽出物を用い
て3回繰り返して行った実験の平均を反映している。活性は、品種対照植物M202
について得られた平均値に対する値で表される。T1の種子重量は、個々のT0トラ
ンスジェニック系列から回収した成熟したT1種子の無作為に抽出したサブサンプ
ルの平均である。
【０２０１】 AGP活性レベルに関しては、Sh2-Rev6-HSトランスジェニックイネ系列の大多数
はM202に対して有意に上昇している。系列RS17およびRS21のAGP活性は有意に上
昇していない。系列RS10は、RNAレベルにおける全系列のうち過剰発現の最高レ
ベルを示しており、また、最高の抽出可能AGP活性も示している。
【０２０２】実施例7：RS1のT1のグロースチャンバーによる収量調査 Sh2-Rev6-HSトランスジェニックイネ系列RS1を代表する16個体のT1植物（それ
ぞれ1、3、4、5、6、7、10、13、15、17、18、19、20、22、23、および25）をグ
ロースチャンバー（growth chamber）内で成長させ、5個体のM202および対照ト
ランスジェニック系列97-3の5個体との比較を行った（97-3系列はハイグロマイ
シン耐性のみをもつ）。個々の種子に由来する16個のRS1のT1植物体および5個体
の97-3植物体をハイグロマイシン選択法を用いてペトリ皿上で発芽させた後に土
中に移植した。97-3植物体はハイグロマイシン耐性遺伝子座に関してホモ接合で
あり、RS1のT1植物はハイグロマイシン/Sh2-Rev6-HS導入遺伝子座に関してヘテ
ロ接合（16個体中12個体）またはホモ接合（16個体中4個体）である。個々のRS1
のT1植物体の遺伝子量は子孫調査で決定した。RS1植物体10、18、19、および20
はホモ接合である。M202植物の確立が困難であった理由は、直接土壌に種子を蒔
いたためかもしれない。結果を表４に示す。
【表４】
【０２０３】 RS1対象とするこの最初の試験から、遺伝子型間および遺伝子型内に多様性が
あることがわかるが、いくつかの結果は妥当かもしれない。第一にRS1のT1植物
体は平均すると円錐花序あたりの種子重量が、いずれの対照遺伝子型より大きい
。第二にRS1のT1の円錐花序あたりの種子数はいずれの対照遺伝子より大きい。
この収量の要素、円錐花序あたりの種子数は、Sh2-Rev6-HSを用いて行われたコ
ムギ形質転換実験において極めて大きく正に影響を受けるパラメータである。
【０２０４】 上述の詳細な記述は、理解を明瞭にするためにのみ提供されるものであり、変
更は当業者に明らかなことから、不必要な制限があると理解されるべきではない
。本発明をその具体的な態様に関して記載してきたが、さらに修正が可能である
こと、ならびに一般的には本発明の原理に従い、本発明が属する技術分野の既知
または習慣的な実施の範囲内であり、これまでに記載した本質的特徴および添付
の特許請求の範囲にしたがって適用可能である本開示からのそのような逸脱を含
む、本発明の任意の変更、用途、または適応を含むものであることが理解される
と思われる。
【０２０５】 完全な引用が明細書本文中に示されていない参考文献
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1は、Sh2-Rev6-HSトランスジェニックイネ系列を対象としたノーザ
ンブロット分析の結果を示す。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の段階を含む、植物が産生する種子数を増加させる方法
    ： a．プロモーターに操作可能に結合された核酸を植物に導入する段階であって、
    該核酸が、配列番号：3を含む核酸、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：3
    とハイブリダイズしSH2-REV6-HSの生物学的活性を保持するポリペプチドをコー
    ドする核酸、SH2-REV6-HS生物学的活性を保持するペプチドをコードする配列番
    号：3の断片、配列番号：4を含むポリペプチドまたはSH2-REV6-HSの生物学的活
    性を保持するその断片をコードする核酸、およびSH2HSポリペプチドまたはSH2RT
    Sポリペプチドをコードする核酸からなる群より選択される、段階；ならびに b．段階aで作製された植物体を成長させる段階。
  2. 【請求項２】 以下の段階を含む、植物が産生するバイオマスを増加させる
    方法： a．プロモーターに操作可能に結合された核酸を植物に導入する段階であって、
    該核酸が、配列番号：3を含む核酸、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：3
    とハイブリダイズしSH2-REV6-HSの生物学的活性を保持するポリペプチドをコー
    ドする核酸、SH2-REV6-HSの生物学的活性を保持するペプチドをコードする配列
    番号：3の断片、配列番号：4を含むポリペプチドまたはSH2-REV6-HSの生物学的
    活性を保持するその断片をコードする核酸、およびSH2HSポリペプチドをコード
    する核酸からなる群より選択される、段階；ならびに b．段階aで作製された植物体を成長させる段階。
  3. 【請求項３】 以下の段階を含む、植物の収穫指数を増加させる方法： a．プロモーターに操作可能に結合された核酸を植物に導入する段階であって、
    該核酸が、配列番号：3を含む核酸、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：3
    とハイブリダイズしSH2-REV6-HSの生物学的活性を保持するポリペプチドコード
    する核酸、SH2-REV6-HSの生物学的活性を保持するペプチドをコードする配列番
    号：3の断片、配列番号：4を含むポリペプチドまたはSH2-REV6-HSの生物学的活
    性を保持するその断片をコードする核酸、およびSH2HSポリペプチドをコードす
    る核酸からなる群より選択される、段階；ならびに b．段階aで作製された植物体を成長させる段階。
  4. 【請求項４】 植物が単子葉植物である、請求項1、2、または3のいずれか
    一項記載の方法。
  5. 【請求項５】 植物がイネ、コムギ、オオムギ、オートムギ、サトウモロコ
    シ、およびキビ植物からなる群より選択される、請求項4記載の方法。
  6. 【請求項６】 植物が双子葉植物である、請求項1、2、または3のいずれか
    一項記載の方法。
  7. 【請求項７】 植物がエンドウ、アルファルファ、ミヤコグサ、ヒヨコマメ
    、チコリー、クローバー、ケール、ヒラマメ、プレーリーグラス、ワレモコウ（
    small burnet）、ダイズ、およびレタス植物からなる群より選択される、請求項
    6記載の方法。
  8. 【請求項８】 以下の段階を含む、単子葉植物の止葉重量を増加させる方法
    ： a．プロモーターに操作可能に結合された核酸を植物に導入する段階であって、
    該核酸が、配列番号：3を含む核酸、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：3
    とハイブリダイズしSH2-REV6-HSの生物学的活性を保持するポリペプチドをコー
    ドする核酸、SH2-REV6-HSの生物学的活性を保持するペプチドをコードする配列
    番号：3の断片、配列番号：4を含むポリペプチドまたはSH2-REV6-HSの生物学的
    活性を保持するその断片をコードする核酸、およびSH2HSポリペプチドをコード
    する核酸からなる群より選択される、段階；ならびに b．段階aで作製された植物体を成長させる段階。
  9. 【請求項９】 以下の段階を含む、単子葉植物によって産生される穂状の種
    子数を増加させる方法： a．プロモーターに操作可能に結合された核酸を植物に導入する段階であって、
    該核酸が、配列番号：3を含む核酸、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：3
    とハイブリダイズしSH2-REV6-HSの生物学的活性を保持するポリペプチドをコー
    ドする核酸、SH2-REV6-HSの生物学的活性を保持するペプチドをコードする配列
    番号：3の断片、配列番号：4を含むポリペプチドまたはSH2-REV6-HSの生物学的
    活性を保持するその断片をコードする核酸、およびSH2HSポリペプチドをコード
    する核酸からなる群より選択される、段階；ならびに b．段階aで作製された植物体を成長させる段階。
  10. 【請求項１０】 以下の段階を含む、双子葉植物の2つまたはそれ以上の形
    質を増加させる方法であって、該形質が種子数、平均種子重量、総種子重量、穂
    状の種子数、収穫指数、および総植物体重量からなる群より選択される方法： a．プロモーターに操作可能に結合された核酸を植物に導入する段階であって、
    該核酸が、配列番号：3を含む核酸、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：3
    とハイブリダイズしSH2-REV6-HSの生物学的活性を保持するポリペプチドをコー
    ドする核酸、SH2-REV6-HSの生物学的活性を保持するペプチドをコードする配列
    番号：3の断片、配列番号：4を含むポリペプチドまたはSH2-REV6-HSの生物学的
    活性を保持するその断片をコードする核酸、およびSH2HSポリペプチドをコード
    する核酸からなる群より選択される、段階；ならびに b．段階aで作製された植物体を成長させる段階。
  11. 【請求項１１】 以下の段階を含む、単子葉植物の2つまたはそれ以上の形
    質の収量を増加させる方法であって、該形質が種子数、平均種子重量、総種子重
    量、穂状の種子数、止葉重量、収穫指数、および総植物体重量からなる群より選
    択される方法： a．プロモーターに操作可能に結合された核酸を植物に導入する段階であって、
    該核酸が、配列番号：3を含む核酸、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：3
    とハイブリダイズしSH2-REV6-HSの生物学的活性を保持するポリペプチドをコー
    ドする核酸、SH2-REV6-HSの生物学的活性を保持するペプチドをコードする配列
    番号：3の断片、配列番号：4を含むポリペプチドまたはSH2-REV6-HSの生物学的
    活性を保持するその断片をコードする核酸、およびSH2HSポリペプチドをコード
    する核酸からなる群より選択される段階；ならびに b．段階aで作製された植物体を成長させる段階。
  12. 【請求項１２】 段階bで得られた植物体を第2の植物体と交配させる段階、
    ならびに交配の結果産生された種子を収穫および成長させる段階をさらに含む、
    請求項1、2、3、8、9、10、または11のいずれか一項記載の方法。
  13. 【請求項１３】 段階bで得られた植物体を自家受粉させることで産生され
    た種子を収穫する段階、および収穫された種子を成長させる段階をさらに含む、
    請求項1、2、3、8、9、10、または11のいずれか一項記載の方法。
  14. 【請求項１４】 植物がイネ、コムギ、オオムギ、オートムギ、サトウモロ
    コシ、およびキビ植物からなる群より選択される、請求項8、9、または11のいず
    れか一項記載の方法。
  15. 【請求項１５】 SH2HSポリペプチドが、SH2HS13、SH2HS14、SH2HS16、SH2H
    S33、SH2HS39、SH2HS40、およびSH2HS47、またはSH2HSポリペプチドの生物学的
    活性を保持するSH2SH2ポリペプチド断片からなる群より選択される、請求項1、2
    、3、8、9、10、または11のいずれか一項記載の方法。
  16. 【請求項１６】 SH2RTSポリペプチドが、SH2RTS48-2およびSH2RTS60-1、ま
    たはSH2RTSポリペプチドの生物学的活性を保持するSH2RTSポリペプチド断片から
    なる群より選択される、請求項1、2、3、8、9、10、または11のいずれか一項記
    載の方法。
  17. 【請求項１７】 植物が、エンドウ、アルファルファ、ミヤコグサ、ヒヨコ
    マメ、チコリー、クローバー、ケール、ヒラマメ、プレーリーグラス、ワレモコ
    ウ（small burnet）、ダイズ、およびレタス植物からなる群より選択される、請
    求項10記載の方法。
  18. 【請求項１８】 請求項1、2、3、8、9、10、または11のいずれか一項記載
    の方法により作製される植物。
  19. 【請求項１９】 配列番号：4に記載のアミノ酸配列をコードする核酸を含
    む植物。
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