PT943001E - Mutantes estáveis ao calor de enzimas da biossíntese de amido - Google Patents

Description

ΕΡ Ο 943 001/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Mutantes estáveis ao calor de enzimas da biossíntese de amido"

Antecedentes da invenção A natureza séssil da vida vegetal geras uma exposição constante a factores ambientais que exercem efeitos positivos e negativos no seu crescimento e desenvolvimento. Um dos maiores entraves com que a agricultura moderna se depara são as condições ambientais adversas. Um factor importante que causa uma perda significativa de colheitas é o stress térmico. 0 stress térmico reduz grandemente o rendimento de grãos em muitas colheitas de cereais, tais como o milho, trigo e cevada. As diminuições de rendimento devido ao stress térmico variam entre 7 a 35% nos cereais com relevância em todo o mundo. Vários estudos identificaram consequências fisiológicas prováveis do stress térmico. Trabalhos iniciais de Hunter et al. (Hunter, R. B., Tollenaar, M., e Breuer, C. M. [1977] Can. J Plant Sei. 57:1127-1133) utilizando câmaras de crescimento sob condições controladas, mostraram que a temperatura diminuiu a duração do enchimento do grão no milho. Tollenaar e Bruulsema (Tollenaar, M. e Bruulsema, T. W. [1988] Can. J. Plant Sei. 68:935-940) identificaram resultados semelhantes, em que a duração do enchimento do grão foi alterada de forma adversa por temperaturas aumentadas. Badu-Apraku et al. (Badu-Apraku, B., Hunter, R. B., e Tollenaar, M. [1983] Can. J. Plant. Sei. 63:357-363) mediram uma redução acentuada no rendimento de plantas de milho crescidas sob o regime de temperatura de dia/noite de 35/15°C, em comparação com o crescimento num regime de temperatura de 25/15°C. Os rendimentos reduzidos devido a temperaturas aumentadas também são suportados por estudos históricos e climatológicos (Thompson, L.M. [1986] Agron. J. 78:649-653; Thompson, L.M. [1975] Science 188:535-541; Chang, J. [1981] Agricul. Metero. 24:253-262; e Conroy, J.P., Seneweera, S., Basra, A.S., Rogers, G., e Nissen-Wooller, B. [1994] Aust. J. Plant Physiol. 21:741-758). 2 ΕΡ Ο 943 001/ΡΤ Ο facto de os processos fisiológicos da semente em desenvolvimento serem afectados de forma adversa pelo stress térmico é evidente de estudos que utilizam um sistema de cultura de grão in vitro (Jones, R.J., Gengenbach, B.G., e Cardwell, V.B. [1981] Crop Science 21:761-766; Jones, R.J., Ouattar, S., e Crookston, R.K. [1984] Crop Science 24:133-137; e Cheikh, N., e Jones, R.J. [995] Physiol. Plant. 95:59-66). Os grãos de milho cultivados à temperatura acima da óptima de 35°C exibiam uma redução drástica no peso.

Trabalhos realizados com trigo identificaram a perda de actividade da amido solúvel-sintase (SSS) como uma caracteristica tipica da resposta do endosperma de trigo ao stress térmico (Hawker, J.S. e Jenner, C.F. [1993] Aust. J. Plant Physiol. 20: 197-209; Denyer, K., Hylton, C.M., e Smith, A.M. [1994] Aust. J. Plant Physiol. 21:783-789; Jenner, C.F. [1994] Aust. J. Plant Physiol. 21:791-806). Outros estudos com a SSS de endosperma de trigo mostram que esta é lábil ao calor (Rijven, A.H.G.C. [1986] Plant Physiol. 81:448-453; Keeling, P.L., Bacon, P.J., Holt, D.C. [1993] Planta. 191:342-348; Jenner, C.F., Denyer, K., e Guerin, J.[1995] Aust. J. Plant Physiol. 22:703-709).

Os papéis da SSS e da ADP-glucose-pirofosforilase (AGP) sob condições de stress térmico no milho são menos claros. A (AGP) catalisa a conversão de ATP e α-glucose-l-fosfato em ADP-glucose e pirofosfato. A ADP-glucose é utilizada como um dador de glicosilo na biossintese do amido por plantas e na biossintese do glicogénio por bactérias. A importância da ADP-glucose-pirof osforilase como uma enzima chave na regulação da biossintese de amido foi constatada no estudo de mutantes de endosperma de milho (Zea mays) deficientes em amido (Tsai, C.Y., e Nelson, Jr., O.E. [1966] Science 151:341-343; Dickinson, D.B., J. Preiss [1969] Plant Physiol. 44:1058-1062) .

Ou-Lee e Setter (Ou-Lee, T. e Setter, t.l.[1985] Plant Physiol. 79:852-855) examinaram os efeitos da temperatura nas regiões apicais ou da ponta de espigas de milho. Com temperaturas elevadas, a actividade da AGP era inferior nos grãos apicais quando comparada com grãos basais durante o período de deposição intensa de amido. Pelo contrário, em 3 ΕΡ Ο 943 001/ΡΤ grãos desenvolvidos a temperaturas normais, a actividade da AGP era semelhante nos grãos apicais e basais, durante este período. No entanto, a actividade de amido-sintase durante este período não era diferencialmente afectada nos grãos apicais e basais. Além disso, os grãos apicais tratados pelo calor exibiam um aumento na actividade de amido-sintase em relação ao controlo. Isto não foi observado com a actividade de AGP. Singletary et al. (Singletary, G.W., Banisadr, R., e Keeling, P.L. [1993] Plant Physiol. 102: 6 (supl).; Singletary, G.W., Banisadra, R., Keeling, P.L. [1994] Aust. J. Plant Physiol. 21:829-841) utilizando um sistema de cultura in vítro quantificaram o efeito de várias temperaturas durante o período de enchimento do grão. O peso da semente decresceu de forma constante à medida que a temperatura aumentava de 22-36°C. Um papel para a AGP na perda de rendimento também é suportado pelo trabalho de Duke e Doehlert (Duke, E.R. e Doehlert, D.C. [1996] Environ. Exp. Botany. 36:199-208).

Trabalhos realizados por Keeling et al. (1994, supra) quantificaram a actividade de SSS no milho e trigo utilizando análise Qio e mostraram que a SSS é um ponto de controlo importante no fluxo de carbono para o amido.

Estudos bioquímicos in vítro com AGP e SSS mostram claramente que ambas as enzimas são lábeis ao calor. A AGP de endosperma de milho perde 96% da sua actividade quando aquecida a 57°C, durante 5 minutos (Hannah, L.C., Tuschall, D.M., e Mans, R.J. [1980] Genetics 95:961970). Isto contrasta com a AGP de batata que é totalmente estável a 70°C (Sowokinos, J.R. e Preiss, J. [1982] Plant Physiol. 69:1459-1466; Okita, T.W., Nakata, P.A., Anderson, J.M., Sowokinos, J., Morell, J., e Preiss, J. [1990] Plant Physiol. 93:785-90). Estudos de inactivação pelo calor com SSS mostraram que esta também é lábil a temperaturas mais elevadas e estudos cinéticos determinaram que o valor de Km para a amilopectina aumentou exponencialmente quando a temperatura aumentou de 25-45°C (Jenner et al., 1995, supra).

Evidências bioquímicas e genéticas identificaram a AGP como uma enzima chave na biossíntese do amido em plantas superiores e na biossíntese do glicogénio em E. coli (Preiss, J. e Romeo, T. [1994] Progress in Nuc. Acid Res. and Mol Biol. 4 ΕΡ Ο 943 001/ΡΤ 47:299-329; Preiss, J. e Sivak, Μ. [1996] "Starch synthesis in sinks and sources," In Photoassimilate distribution in plants and crops:source-sink relationships. Zamski, E., ed., Marcil Dekker Inc. pp. 139-168). A AGP catalisa o que é visto como o passo inicial na via de biossintese do amido, sendo o produto da reacção o dador de glucosilo activado, ADPglucose. Esta é utilizada pela amido-sintase para alongamento do polimero polissacaridico (revisto em Hannah, L. Curtis [1996] "Starch synthesis in the maize endosperm," In: Advances in Cellular and Molecular Biology of Plants, Vol. 4. B.A. Larkins e I.K. Vasil (eds.). Cellular and Molecular Biology of Plant Seed Development. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Holanda, (no prelo)).

Estudos iniciais com AGP de batata mostraram que a expressão em E. coli originou uma enzima com propriedades alostéricas e cinéticas muito semelhantes às da enzima nativa de tubérculos (Iglesias, A., Barry, G.F., Meyer, C.,

Bloksberg, L., Nakata, P., Greene, T., Laughlin, M.J., Okita, T.W., Kishore, G.M., e Preiss, J. [1993] J. Biol Chem. 268:1081-86; Ballicora, M.A., Laughlin, M.J., Fu, Y., Okita, T.W., Barry, G.F., e Preiss, J. [1995] Plant Physiol. 109:245- 251). Greene et al. (Greene, T.W., Chantler, S.E., Kahn, M.L.,

Barry, G.F., Preiss, J., e Okita, T.W. [1996] Proc. Natl. Acad. Sei. 93:1509-1513; Greene, T.W., Woodbury, R.L., e Okita, T.W. [1996b] Plant Physiol. (no prelo)) mostraram a utilidade do sistema de expressão bacteriano nos seus estudos de estrutura-função com a AGP de batata. Identificaram-se várias mutações importantes no mapeamento de locais alostéricos e de ligação ao substrato (Okita, T.W., Greene, T.W., Laughlin, M.J., Salamone, P., Woodbury, R., Choi, S., Ito, H., Kavakli, H., e Stephens, K. [1996] "Engineering Plant Starches by the Generation of Modified Plant Biosynthetic Enzymes," In Engineering Crops for Industrial End Uses, Shewry, P.R., Napier, J.A., e Davis, P., eds., Portland Press Ltd., Londres (no prelo)).

As enzimas AGP foram isoladas quer de bactérias, quer de plantas. A AGP bacteriana consiste de um homotetrâmero, enquanto que a AGP de plantas, de tecidos fotossintéticos e não fotossintéticos, é um heterotetrâmero composto por duas subunidades diferentes. A enzima de plantas é codificada por 5 ΕΡ Ο 943 001/ΡΤ dois genes diferentes, sendo uma subunidade maior que a outra. Esta caracteristica foi observada em várias plantas. As subunidades de AGP na folha de espinafre têm pesos moleculares de 54 kDa e 51 kDa, tal como estimado por SDS-page. Ambas as subunidades são imunorreactivas com anticorpos criados contra AGP purificada de folhas de espinafre (Copeland, L., j. Preiss (1981) Plant Physiol. 68:996-1001; Morell, Μ., M. Bloon, V. Knowles, J. Preiss [1988] J. Βίο. Chem. 263:633). Análises imunológicas utilizando anti-soros preparados contra as subunidades pequenas e grandes de folha de espinafre mostraram que a AGP de tubérculo de batata também é codificada por dois genes (Okita et al., 1990, supra). Os clones de ADNc das duas subunidades de tubérculo de batata (50 e 51 kDa) também foram isolados e sequenciados (Muller-Rober, B.T., J. Kossmann, L.C. Hannah, L. Willmitzer, U. Sounewald [1990] Mol. Gen. Genet. 224:136-146; Nakata, P.A., T.W. Greene, J.M. Anderson, B.J. Smith-White, T.W. Okita, J. Preiss [1991] Plant Mol. Biol. 17:1089-1093). A subunidade grande de AGP de tubérculo de batata é estável ao calor (Nakata et al. [1991], supra).

Tal como foi postulado por Hannah e Nelson (Hannah, L.C., O.E. Nelson (1975) Plant Physiol. 55:297-302.; Hannah, L.C., e Nelson, Jr., O.E. [1976] Biochem. Genet. 14:547-560), ambos os genes, Shrunken-2 (Sh2) (Bhave, M.R., S. Lawrence, C. Barton, L.C. Hannah [1990] Plant Cell 2:581-588) e Brittle-2 (Bt2) (Bae, J.M., M. Giroux, L.C. Hannah [1990] Maydica 35:317-322) são genes estruturais de ADP-glucose-pirofosforilase de endosperma de milho. O Sh2 e o Bt2 codificam para a subunidade grande e a subunidade pequena da enzima, respectivamente. A partir da sequenciação do ADNc, as proteínas de Sh2 e Bt2 têm um peso molecular previsto de 57 179 Da (Shaw, J.R., L.C. Hannah [1992] Plant Physiol. 98:12141216) e 52 224 Da, respectivamente. O endosperma é o local de maior deposição de amido durante o desenvolvimento do grão no milho. Os mutantes de endosperma de milho Sh2 e bt2 têm niveis de amido muito reduzidos, que correspondem a niveis deficientes de actividade de AGP. Verificou-se que mutações em qualquer destes genes reduzem a actividade da AGP em cerca de 95% (Tsai e Nelson, 1966, supra·, Dickinson e Preiss, 1969, supra) . Além disso, verificou-se que as actividades enzimáticas aumentam com a dosagem de alelos Sh2 e Bt2 do tipo selvagem funcionais, enquanto que as enzimas mutantes têm propriedades cinéticas 6 ΕΡ Ο 943 001/ΡΤ alteradas. A AGP é ο passo limitante na biossíntese do amido em plantas. Stark et al. colocaram uma forma mutante de AGP de E. coli em tubérculo de batata e obtiveram um aumento de 35% no teor de amido (Stark et al. [1992] Science 258:287). A clonagem e a caracterização dos genes que codificam para as subunidades da enzima AGP foram descritas para várias plantas. Estas incluem ADNc de Sh2 (Bhave et al.r 1990, supra), ADN genómico de Sh2 (Shaw e Hannah, 1992, supra), e ADNc de Bt2 (Bae et al., 1990, supra) de milho; ADNc de subunidade pequena (Anderson, J.M., J. Hnilo, R. Larson, T.W. Okita, M. Morell, J. Preiss [1989] J. Biol. Chem. 264:12238-12242) e ADN genómico (Anderson, J.M., R. Larson, D. Landencia, W.T. Kim, D. Morrow, T.W. Okita, J. Preiss [1991] Gene 97:199-205) de arroz; e ADNc de subunidade pequena e grande de folha de espinafre (Morell et al., 1988, supra) e tubérculo de batata (Muller-Rober et al., 1990, supra; Nakata, P.A., Greene, T.W., Anderson, J.W., Smith-White, B.J., Okita, T.W., e Preiss, J. [1991] Plant Mol. Biol. 17:1089-1093). Além disso, foram isolados clones de ADNc a partir de endosperma e tecido da folha de trigo (Olive, M.R., R.J. Ellis, W.W. Schuch [1989] Plant Physiol. Mol. Biol. 12:525-538) e folha de

Arabidopsis thaliana (Lin, T., Caspar, T., Sommerville, C.R., e Preiss, J. [1988] Plant Physiol. 88:1175-1181). A AGP funciona como uma enzima alostérica em todos os tecidos e organismos investigados até agora. Verificou-se pela primeira vez em E. coli que as propriedades alostéricas da AGP eram importantes. Isolou-se um mutante de E. coli com sobreprodução de glicogénio e a mutação foi mapeada no gene estrutural para a AGP, designado por glyC. Verificou-se que a E. coli mutante, conhecida como glyC-16 é mais sensível ao activador, frutose-1,6-difosfasto e menos sensível ao

inibidor, AMPc (Preiss, J. [1984] Ann. Rev. Microbiol. 419-458). Embora as AGP das plantas também sejam alostéricas, elas respondem a moléculas efectoras diferentes das da AGP bacteriana. Nas plantas, o ácido 3-fosfoglicérico (3-PGA) funciona como um activador, enquanto que o fosfato (P04) actua como um inibidor (Dickinson e Preiss, 1969, supra).

Utilizando um sistema de mutagénese in vivo criado pela excisão mediada por Ac de um elemento transponível Ds 7 ΕΡ Ο 943 001/ΡΤ localizado casualmente próximo de um local de ligação a um activador conhecido, Giroux et al. (Giroux, M.J., Shaw, j., Barry, G., Cobb, G.B., Greene, T., Okita, T.W., e Hannah, L. C. [1996] Proc. Natl. Acad. Sei. 93:5824-5829) foram capazes de produzir mutantes específicos do local, numa região funcionalmente importante da AGP de endosperma de milho. Um mutante, Rev6, continha uma inserção de tirosina-serina e condicionou um aumento de 11-18% no peso da semente.

Em WO91/11520 descreve-se a utilização de formas modificadas de polinucleótidos que codificam para AGP com uma estabilidade ao calor melhorada para aumentar o rendimento de amido numa planta, e.g. Zea mays.

Charing et al. [1994] J. Biol. Chem. 269(39):214107- 24113, descrevem a preparação de um mutante de AGP de folha de espinafre que é designado aí como "K419R" e que retém mais actividade do que a enzima do tipo selvagem após tratamento pelo calor a 60°C, durante 5 minutos.

Greene et al. [1996] PNAS USA 93:1509-1513 descrevem uma mutação de aminoácidos que aumenta o peso da semente.

Sumário da invenção

De acordo com um aspecto da presente invenção, um polinucleótido que codifica para um polipéptido de adp-glucose-fosforilase (AGP) de planta, mutante, compreende uma mutação de aminoácidos na sua subunidade grande e exibe uma estabilidade ao calor aumentada em relação a um polipéptido AGP do tipo selvagem, em que a mutação compreende a substituição do aminoácido correspondente a His-333, Ala-177, Asp-400, Val-454, Arg-104, Thr-460 ou Arg-216 no milho. Outros aspectos da invenção são um método para aumentar a resistência ao calor de uma planta, plantas transformadas e tecido de planta e polipéptido de AGP mutante. A presente invenção proporciona enzimas estáveis ao calor que podem ser utilizadas para proporcionar plantas com uma maior tolerância a temperaturas mais elevadas, aumentando assim o rendimento da colheita destas plantas. Numa concretização particularmente preferida, a planta melhorada é 8 ΕΡ Ο 943 001/ΡΤ um cereal. Os cereais a que esta invenção se aplica incluem, por exemplo, milho, trigo, arroz e cevada.

Breve descrição das Figuras

Figura 1. Mutantes da subunidade grande de AGP de endosperma de milho estáveis ao calor. É apresentada a percentagem de actividade de AGP remanescente após cinco minutos de tratamento pelo calor a 60°C.

Figura 2. Alinhamento da sequência primária da região em torno da mutação HS33 com subunidades grandes de milho, trigo, cevada e batata. As regiões conservadas estão dentro de caixas.

Figura 3. Alinhamento de sequência primária da região em torno da mutação HS40 com subunidades grandes de milho, trigo, cevada e batata. As regiões conservadas estão dentro de caixas. 0 resíduo de ácido aspártico a negrito corresponde ao mutante alostérico D413A de LS de batata (Greene, T.W., Woodbury, R.L., e Okita, T.W. [1996] Plant Physiol. (no prelo)) . A sequência de AGP de folha de espinafre é o péptido do local activador 2 identificado em estudos análogos de 3-PGA (Bali, K. e Preiss, J. [1994] J. Biol. Chem. 269:24706-24711). O resíduo de lisina marcado está a negrito.

Descrição detalhada da invenção A presente invenção refere-se a novas moléculas de polinucleótidos mutantes e aos polipéptidos por elas codificados, que conferem um maior rendimento em plantas crescidas sob condições de stress térmico, em relação a plantas com o genótipo do tipo selvagem. Em concretizações específicas, as moléculas de polinucleótidos da presente invenção codificam para as actividades das enzimas ADP-glucose-pirofosforilase (AGP) e amido-solúvel-sintetase (SSS) de endosperma de milho. As enzimas mutantes conferem uma maior estabilidade às sementes face a condições de stress térmico durante o desenvolvimento da semente, em comparação com as actividades da enzima do tipo selvagem. 9 ΕΡ Ο 943 001/ΡΤ

Numa concretização, um polinucleótido mutante da presente invenção codifica para uma subunidade grande de AGP contendo uma substituição de aminoácidos de histidina-para-tirosina na sequência do polipéptido. Esta substituição ocorre no resíduo de aminoácido número 333, de acordo com número aceite de aminoácidos nesta proteína (Shaw e Hannah, 1992, supra). A posição desta substituição pode ser facilmente identificada por um perito na arte. Uma segunda mutação exemplificada na presente invenção é uma substituição de treonina-para-isoleucina na posição número 460 da proteína AGP. Na tabela 1 a seguir são apresentados mutantes adicionais que conferem estabilidade aumentada ao calor.

Tabela 1 Mutante Alteração de aminoácido HS 13 Ala para Pro na posição 177 HS 14 Asp para His na posiçãc i 400, e Vai para Ile na posição 454 HS 16 Arg para Thr na posição 104 HS 33 His para Tyr na posição 333 HS 39 His para Tyr na posição 333 HS 40 His para Tyr na posição 333 e Thr para Ile na posição 460 HS 47 Arg para Pro na posição 216 e His para Tyr na posição 333

Os clones de ADNc para as subunidades da AGP de endosperma de milho (SH2 e BT2) e uma estirpe de E. coli deficiente na AGP bacteriana endógena (glg C”) (AC70R1-504) facilitaram o estabelecimento de um sistema de expressão bacteriano para estudar a AGP de endosperma de milho. A expressão de uma única subunidade não é capaz de complementar o mutante glg C~ e não é produzido nenhum glicogénio (Iglesias, A., Barry, G. F., Meyer, C., Bloksberg, L., Nakata, P., Greene, T., Laughlin, M. j., Okita, T. w., Kishore, G. M., e Preiss, J. [1993] J. Biol Chem. 268: 1081-86). No entanto, a expressão de ambas a subunidades, grande e pequena, em vectores de expressão compatíveis, complementa totalmente a mutação glg C” e restaura a produção de glicogénio, tal como evidenciado por uma coloração acastanho-vermelhado escura de 10 ΕΡ Ο 943 001/ΡΤ colónias expostas a iodo. Assim, a complementação é facilmente identificada, por simples exposição das colónias a iodo.

Numa concretização, utilizaram-se células de E. coli glg CT que expressam os genes estruturais quer de AGP de endosperma de batata, quer de milho. As células que contêm genes de AGP de batata podem sintetizar níveis elevados de glicogénio quando crescidas a 37°C, ou a 42°C. No entanto, as células que expressam AGP de endosperma de milho apenas sintetizam glicogénio a 37°C. Este resultado demonstra a sensibilidade ao calor da AGP de endosperma de milho do tipo selvagem. O facto de haver uma diferença entre a AGP de batata e a de milho a este respeito proporciona um sistema eficiente para pesquisar células mutantes que têm variantes da AGP de endosperma de milho estáveis ao calor.

Um aspecto da presente invenção refere-se à identificação eficiente de AGP que é estável ao calor. Deste modo, um plasmídeo que compreende um polinucleótido que codifica para a subunidade SH2 de AGP de milho foi quimicamente mutado, como descrito a seguir, colocado em células de E. coli mutantes que expressam a subunidade BT2 e crescido a 42°C. Também se podem utilizar outros mutagénios conhecidos na especialidade.

Isolaram-se onze mutantes que coram com iodo, hereditários, designados por mutantes estáveis ao calor (HS). Prepararam-se extractos brutos destes mutantes e monitorizou-se a estabilidade ao calor da AGP resultante. Os mutantes retêm entre 8-59% da sua actividade após incubação a 60°C, durante cinco minutos (Figura 1). Esta é comparável com os 1-4% observados rotineiramente para a AGP do tipo selvagem, a esta temperatura.

Os resultados mostram que se podem criar formas estáveis ao calor de enzimas, de acordo com a presente invenção, por mutação. Inesperadamente, a actividade total da AGP de endosperma de milho antes do tratamento pelo calor estava aumentada cerca de 10 vezes na maioria destes mutantes. Este resultado surpreendente torna estes mutantes particularmente vantajosos para utilização em agricultura. As técnicas de mutagénese, como aqui descritas, podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção para identificar outros genes 11 ΕΡ Ο 943 001/ΡΤ que codificam para enzimas da biossintese de amido, estáveis ao calor.

Os genes que codificam para vários dos mutantes estáveis ao calor, incluindo os dois mutantes HS mais estáveis ao calor, HS33 e HS40, foram completamente sequenciados. 0 HS33 que retém 59% da sua actividade após tratamento pelo calor, contém uma mutação de um único par de bases que altera um residuo de histidina na posição 333 da sequência de aminoácidos do polipéptido para uma tirosina (Figura 2) . Os alinhamentos de sequência primária com as subunidades grandes de AGP de trigo e cevada mostram que também está presente uma histidina no residuo análogo (Figura 3) (Ainsworth, C., Hosein, F., Tarvis, M., Weir, F., Burrell, M., Devos, K.M.,

Gale, M.D. [1995] Planta 197:1-10). Por análise de sequência de HS40 que retém 41% da sua actividade após tratamento pelo calor, esta também continha uma mutação de histidina para tirosina na posição 333. Identificou-se uma mutação pontual adicional que produziu uma substituição de treonina para isoleucina. O residuo de treonina é altamente conservado em subunidades grandes de AGP, enquanto que em subunidades pequenas de AGP o residuo análogo é ou uma cisteina, ou uma serina (Ainsworth et al., 1995, supra). A substituição de treonina para isoleucina está localizada próximo do terminal carboxilo da subunidade grande e próximo de um local de ligação conhecido para o activador 3-PGA (Figura 3). A presente invenção também se refere a mutantes de AGP estáveis ao calor que têm mutações na subunidade pequena da enzima. Também se incluem no âmbito da invenção, polinucleótidos que codificam para as subunidades pequenas de AGP mutantes. As mutações na subunidade pequena de AGP que conferem estabilidade ao calor à enzima também podem ser facilmente preparadas e identificadas, utilizando métodos da presente invenção.

As plantas e tecido de plantas criadas para conter, ou transformados com, os polinucleótidos mutantes, e que expressam os polipéptidos codificados pelos polinucleótidos, também são contemplados pela presente invenção. As plantas e tecido de plantas que expressam os polinucleótidos mutantes produzem tecidos que têm, por exemplo, uma menor perda de peso 12 ΕΡ Ο 943 001/ΡΤ ou rendimento induzida pelo calor quando submetidos a stress térmico durante o desenvolvimento. A presente invenção também se refere a métodos para produzir e identificar polinucleótidos e polipéptidos contemplados no âmbito da invenção. Numa concretização, pode-se utilizar mutação génica, seguida de selecção utilizando um sistema de expressão bacteriano, para isolar moléculas de polinucleótido que codificam para enzimas que podem aliviar a perda induzida pelo calor na síntese de amido em plantas. A presente invenção também se refere a plantas e tecido de planta que têm um gene de AGP mutante incorporado no seu genoma. Também se podem incorporar outros alelos aqui descritos no genoma de uma planta. Numa concretização preferida, a planta é uma planta de cereal. Mais preferencialmente, a planta é Zea mays. As plantas que têm um gene de AGP mutante podem ser crescidas a partir de sementes que compreendem um gene mutante no seu genoma. Além disso, são conhecidas da especialidade técnicas para transformar plantas com um gene.

Devido à degenerescência do código genético, uma variedade de sequências polinucleotidicas diferentes podem codificar para cada um dos polipéptidos de AGP variantes aqui descritos. Além disso, está no âmbito dos conhecimentos do perito na especialidade criar sequências de polinucleótidos alternativas que codificam para o mesmo, ou essencialmente o mesmo polipéptido da presente invenção. Estas sequências de polinucleótidos variantes ou alternativas estão no âmbito da presente invenção. Tal como aqui utilizadas, as referências a "essencialmente a mesma" sequência referem-se a sequências que codificam para substituições, deleções, adições ou inserções de aminoácidos que não alteram materialmente a actividade funcional do polipéptido codificado pelo polipéptido de AGP mutante aqui descrito. A substituição de aminoácidos que não os especificamente exemplificados nos mutantes aqui descritos também é contemplada no âmbito da presente invenção. Os aminoácidos podem ser divididos nas seguintes classes: não polares, 13 ΕΡ Ο 943 001/ΡΤ polares não carregados, básicos e ácidos. As substituições conservativas em que um polipéptido de AGP mutante que tem um aminoácido de uma classe é substituído por outro aminoácido da mesma classe estão no âmbito da presente invenção, desde que o polipéptido de AGP mutante com a substituição ainda retenha a estabilidade ao calor aumentada em relação a um polipéptido do tipo selvagem. A Tabela 2 a seguir fornece uma lista de exemplos de aminoácidos que pertencem a cada classe.

Tabela 2

Classe de aminoácido Exemplos de aminoácidos Não polar Ala, vai, Leu, lie, Pro, Met, Phe Polar não carregado Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gin Ácido Asp, Glu Básico Lys, Arg, His

Por exemplo, a substituição da tirosina na posição 333 na AGP de endosperma de milho mutante HS33, HS39, HS40 e HS47 por outros aminoácidos, tais como glicina, serina, treonina, cisteina, asparagina e glutamina, estão no âmbito da invenção. A presente invenção também se refere a polinucleótidos que codificam para fragmentos do polipéptido mutante de comprimento total, desde que os fragmentos retenham substancialmente a mesma actividade funcional que o polipéptido de tamanho total. Os fragmentos do polipéptido AGP mutante codificados por estes polinucleótidos também estão no âmbito da presente invenção. A presente invenção também contempla as moléculas de polinucleótidos que têm sequências que são suficientemente homólogas à sequência de ADN de Sh2 do tipo selvagem, de modo a permitir a hibridação com essa sequência sob condições convencionais de rigor elevado. Estas condições de hibridação são convencionais na especialidade (veja-se, e.g., Maniatis, T., E.F. Fritsch, J. Sambrook [1989] Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque). 14 ΕΡ Ο 943 001/ΡΤ

As moléculas de polinucleótidos da presente invenção podem ser utilizadas para transformar plantas para expressar a enzima AGP estável ao calor, mutante, nessas plantas. Além disso, os polinucleótidos da presente invenção podem ser utilizados para expressar a enzima AGP variante recombinante. Também podem ser utilizados como sonda para detectar enzimas relacionadas. Os polinucleótidos também podem ser utilizados como padrões de tamanho do ADN.

As moléculas de polinucleótidos da presente invenção também incluem os polinucleótidos que codificam para enzimas AGP que conferem um peso de semente aumentado, além de uma maior estabilidade ao calor, numa planta. A combinação de uma mutação de estabilização ao calor, HS, com uma mutação que confere um maior peso da semente, e.g., Rev6, é especificamente contemplada na presente invenção. Veja-se, por exemplo, patentes US 5589618 e 5650557.

As mutações nas subunidades de AGP que conferem estabilidade ao calor podem ser combinadas de acordo com a presente invenção com mutantes de milho insensíveis a fosfato, tal como a mutação Rev6, para aumentar a estabilidade da subunidade grande codificada por Rev6. É esperado que a actividade enzimática de SSS seja danificada à temperatura mais elevada, como se verificou para AGP. Assim, as formas mutadas de SSS podem ser expressas sob condições de temperatura aumentada (42°C), para isolar variantes estáveis ao calor. Estas formas de SSS mutadas estáveis ao calor constituem outros aspectos da presente invenção.

Todas as publicações e patentes aqui citadas são aqui incorporadas como referência.

Em seguida descrevem-se exemplos que ilustram procedimentos para a prática da invenção. Estes exemplos não deverão ser considerados limitativos. Todas as percentagens são em peso e todas as proporções de misturas de solventes são em volume, salvo indicação em contrário. 15 ΕΡ Ο 943 001/ΡΤ

Exemplo 1 - Utilização de mutagénese para obter variantes estáveis ao calor de AGP de endosperma de milho O mutagénio químico hidroxilamina-HCl foi inicialmente utilizado para mutagénese aleatória do plasmídeo de expressão da subunidade grande. A hidroxilamina hidroxila preferencialmente o azoto do amino na posição C-4 da citosina e leva a uma transição de GC para AT (Suzuki, D.T., Griffith, A.J.F., Miller, J.H., e Lewontin, R.C. [1989] In Introduction to genetic analysis, Freeman, NI, 4a ed., pp.475-499). 0 mutagénio químico foi escolhido pela sua elevada frequência de mutação. As limitações do mutagénio químico são reconhecidas e se não for isolada uma grande variedade de variantes genéticas pode-se realizar mutagénese aleatória baseada em PCR. A mutagénese por PCR produz um espectro mais alargado de mutações que incluem frequências semelhantes de transições e transversão e oferece uma alternativa excelente ao método químico. Pode-se utilizar o método descrito por Cadwell e Joyce (Cadwell, R.C. e Joyce, G.F. [1992] PCR Methods and Applications 2:28-33) para o método baseado em PCR.

Uma vez que todo o plasmídeo de expressão é utilizado na mutagénese aleatória, é possível que ocorram mutações fora da região codificante. Embora se espere que essas mutações não tenham nenhum efeito na estabilidade ao calor da AGP de endosperma de milho, cada variante pode ser subclonada num plasmídeo de expressão não mutado, antes de ser feita qualquer caracterização adicional ao nível da enzima. Ambos os plasmídeos de expressão da subunidade grande e pequena podem ser construídos de um modo tal que uma digestão com Ncol/Saci irá libertar toda a região codificante. Esta pode ser facilmente clonada de novo num plasmídeo de expressão digerido com Ncol/Saci, não mutado.

Exemplo 2 - Caracterização molecular e análise de variantes de AGP estáveis ao calor

Inicialmente, obtiveram-se 11 variantes estáveis ao calor da subunidade grande de endosperma de milho. Duas foram completamente sequenciadas. A sequenciação é realizada utilizando instrumentos DuPont e ABI. 16 ΕΡ Ο 943 001/ΡΤ

Os dados da sequência podem ser comparados de forma rotineira com o alelo do tipo selvagem progenitor. Esta análise revela a extensão de diversidade de alterações que condicionam a estabilidade ao calor.

Ambos os mutantes de HS sequenciados contêm a alteração de histidina para tirosina idêntica na subunidade grande. Os mutantes de HS derivados por PCR podem ser rapidamente pesquisados quanto à alteração de histidina para tirosina, utilizando mutagénese especifica do local, utilizando iniciadores que alteram a tirosina de novo para histidina.

Exemplo 3 - Expressão, purificação e análise cinética de variantes genéticas

As condições para a expressão de AGP de endosperma de milho do tipo selvagem em E. coli foram totalmente caracterizadas. As condições óptimas de crescimento e de indução variam um pouco em relação às anteriormente publicadas para AGP de batata expressa em E. coli (Iglesias et al., 1993, supra, Ballicora et al., 1995, supra). A indução à temperatura ambiente durante 12-14 horas na presença de IPTG 0,3 mM e ácido nalidixico a 25 pg/ml origina consistentemente niveis elevados de expressão e actividade. A adição de sulfato de amónio a 30% e K^PChV^HPCh" 10 mM ao tampão de extracção estabiliza a AGP de milho no extracto bruto. A AGP concentrada em sulfato de amónio é ainda purificada por cromatografia de interacção hidrófoba utilizando meio de aminopropilo C3 Tentacle (EM Separations) empacotado numa coluna HR 10/10 da Pharmacia. A proteína liga-se à coluna num tampão que contém sulfato de amónio 1M. A AGP é eluída da coluna por lavagens sucessivas em gradiente descontínuo de tampão que contém 0,75 M, 0,5 M, 0,25 M e 0 M de sulfato de amónio. A AGP de endosperma de milho do tipo selvagem elui tipicamente na lavagem de 0,25 Μ. A AGP de endosperma de milho purificada em C3 é adicionalmente purificada por cromatografia de troca aniónica utilizando meios de troca aniónica Macro-Prep DEAE (BioRad) empacotados numa coluna HR10/10 da Pharmacia. A AGP é eluída por um gradiente linear de KC1 100-500 mM, e tipicamente elui a uma concentração de sal de cerca de 300 mM. O sistema de FPLC da Pharmacia é utilizado para 17 ΕΡ Ο 943 001/ΡΤ todos os passos cromatográficos. As condições para os passos de purificação individuais estão totalmente caracterizadas. A actividade de AGP durante a purificação é monitorizada pelo teste de pirofosforólise e os passos de purificação são monitorizados por SDS-PAGE, coloração com Coomassie e análise de Western, utilizando anticorpos policlonais específicos para as subunidades grande e pequena de AGP de endosperma de milho.

Exemplo 4 - interacção de subunidades aumentada

Um efeito pleiotrópico totalmente inesperado dos mutantes de AGP de endosperma de milho HS é um aumento de actividade de 2 vezes antes do tratamento pelo calor. Uma explicação possível para este resultado é que desviámos, por alteração mutacional, a proporção entre os monómeros SH2 e BT2 e polímeros existentes na célula de E. coli. Talvez, no tipo selvagem, apenas 10% ou menos das proteínas totais existam na forma heterotetramérica activa, enquanto que nos mutantes, esta percentagem é muito maior. Se o polímero é mais resistente ao calor do que os monómeros, então o fenótipo dos mutantes seria idêntico ao que foi observado. Pode-se utilizar análise cinética para determinar alterações nas afinidades para substratos e/ou efectores alostéricos.

Para testar a ideia de que a proporção entre monómero/polímero pode ser alterada nestes mutantes, podem-se monitorizar as quantidades de monómeros e polímeros no tipo selvagem e mutantes seleccionados, quer antes, quer depois do tratamento pelo calor. A disponibilidade de anticorpos (Giroux, M.J., e Hannah, L.C. [1994] Mol. Gen. Genetics 243:400-408) para ambas as subunidades torna esta abordagem possível. Isto pode ser analisado quer através de ultracentrifugação em gradiente de sacarose, quer através de cromatografia em gel e irá determinar facilmente qual o método mais eficiente e definitivo.

Uma vez que a AGP de plantas superiores consiste em duas subunidades semelhantes, mas distintas, que oligomerizam para formar a estrutura heterotetramérica nativa, as mutações que aumentam esta interacção podem proporcionar uma maior estabilidade à enzima. Pode-se utilizar um sistema de dois híbridos de levedura (CLONTECH Laboratories, Paio Alto, CA) 18 ΕΡ Ο 943 001/ΡΤ para avaliar interacções entre subunidades. Podem-se construir iniciadores específicos para a amplificação das regiões codificantes. Estes iniciadores adicionam locais de restrição únicos às extremidades 5' e 3' de modo que a clonagem facilita a fusão por tradução da subunidade individual ao domínio de ligação do ADN de GAL4 (pGBT9), ou domínio de activação de GAL4 (pGAD424). Se as proteínas clonadas nos vectores interagem, o domínio de ligação ao ADN e o domínio de activação irão formar um activador de transcrição funcional. Este por sua vez activa a expressão do gene repórter, lacZ, clonado por trás de um promotor GAL4.

Inicialmente, podem-se caracterizar as condições com as subunidades do tipo selvagem. As regiões codificantes das subunidades grande e pequena do tipo selvagem podem ser clonadas nos vectores de expressão de levedura pGBT9 e pGAD424. Podem-se gerar e testar todas as combinações possíveis. Os vectores pGBT9 e pGAD424 contendo Sh2 e Bt2 podem ser co-transformados na mesma estirpe de levedura e ser seleccionados para crescimento em meios sem triptofano (pGBT9) e leucina (pGAD424). A interacção de subunidades como função da expressão de lacZ pode ser detectada de dois modos. As colónias positivas são visualmente identificadas por um teste em filtro de B-galactosidase. Com este teste as colónias de teste são ligadas ao filtro, lisadas e incubadas com uma solução de X-gal. As colónias que exibem uma cor azul podem ser analisadas. A interacção de subunidades pode ser ainda analisada por um teste enzimático específico para B-galactosidase. Isto permite a quantificação da interacção. As mutações que aumentam as interacções de subunidades irão originar níveis mais elevados de actividade de B-galactosidase, quando testadas.

Exemplo 5 - Aumento adicional da estabilidade

Os mutantes de subunidade grande isolados variam nas suas características de estabilidade ao calor, o que sugere a possibilidade de múltiplas mutações. Apesar da análise de sequência de mutantes HS33 e HS40 revelar que as sequências mutantes não são idênticas, ambos os mutantes continham a alteração idêntica de histidina para tirosina. Tendo em conta a identificação de diferentes alterações HS na proteína SH2, é 19 ΕΡ Ο 943 001/ΡΤ possível compilar de forma eficiente estas alterações numa proteína. Além disso, qualquer mutação HS na subunidade pequena pode ser co-expressa com os mutantes HS SH2 para aumentar ainda mais a estabilidade da enzima de endosperma de milho.

Os mutantes HS múltiplos numa subunidade podem ser facilmente combinados. Por exemplo, podem-se utilizar diferentes locais de restrição únicos que dividem as regiões codificantes de Sh2 em três fragmentos distintos. Quando adequado, podem-se produzir combinações de mutações subclonando o fragmento correspondente que contém a mutação adicionada. Se duas mutações estão numa vizinhança próxima então pode-se utilizar mutagénese dirigida para o local para manipular estas combinações. Um método para mutações específicas do local envolve PCR, iniciador mutagénico e a utilização da endonuclease de restrição Dpnl. Podem-se construir iniciadores para conter a mutação na extremidade 5' e utilizar para amplificar por PCR, utilizando a polimerase de verificação Vent. 0 ADN amplificado pode ser então digerido com Dpnl. 0 ADN progenitor isolado de E. coli é metilado e portanto, susceptível a Dpnl. 0 ADN digerido é fraccionado por tamanhos por electroforese em gel, ligado e clonado nos vectores de expressão. As mutações são confirmadas por análise da sequência e transformadas na estirpe AC70R1-504 que é portadora da subunidade pequena de tipo selvagem. Em seguida, podem-se analisar os mutantes de combinação.

Exemplo 6 - Combinação de mutações de estabilidade ao calor com Rev6

De acordo com a presente invenção, as mutações estáveis ao calor podem ser combinadas com uma mutação associada com um maior peso de semente, tal como, por exemplo, a mutação Rev6. 0 objectivo é manter a característica desejada de insensibilidade ao fosfato de Rev6, aumentando ao mesmo tempo a sua estabilidade. Os mutantes duplos Rev6/HS podem ser construídos e confirmados como aqui descrito. Os mutantes duplos podem ser transformados em AC70R1-504 que é portadora da subunidade pequena do tipo selvagem. Pode-se identificar facilmente uma estabilidade ao calor aumentada por meio de uma coloração de glicogénio positiva, num meio de baixo teor de 20 ΕΡ Ο 943 001/ΡΤ glucose. Ο Rev6 não cora quando crescido neste meio. Inicialmente, todas as combinações de mutantes podem ser pesquisadas enzimaticamente quanto à manutenção da insensibilidade ao fosfato e apenas as combinações que mantêm insensibilidade ao fosfato são posteriormente analisadas.

Exemplo 7 - Clonaqem de mutantes SSS I

Pode-se obter uma estirpe de E. coli glgA~ deficiente na glicogénio-sintase bacteriana endógena, a partir do E. coli Stock Center. Os vectores de expressão bacteriana actualmente utilizados para a expressão de AGP podem ser utilizados para expressão de SSS.

Uma estratégia de clonagem, tal como utilizado, por exemplo, com Sh2 e Bt2 (Giroux et al., 1996, supra) é a seguinte: um iniciador contém uma restrição única mais o terminal 5' do transcrito, enquanto que o outro iniciador contém outro local de restrição único e sequências 3' em relação ao codão de terminação da tradução do gene sob investigação. A clonagem subsequente destes origina uma fusão por tradução no plasmideo. Estes iniciadores específicos do gene são inicialmente utilizados em reacções RT-PCR utilizando ARN poliA+ de endospermas em desenvolvimento. A expressão da SSS I de endosperma de milho irá complementar a falta de actividade de glicogénio-sintase na estirpe glg A~. A complementação deverá ser facilmente visualizada com coloração com iodo, tal como acontece com a expressão de AGP na estirpe glg C”. Os extractos brutos podem ser incubados a várias temperaturas e períodos de tempo, para determinar a estabilidade ao calor de SSS I. A estirpe glg A~ que expressa a SSS I de endosperma de milho pode ser crescida a várias temperaturas para determinar se a função é sensível à temperatura, como acontece com o sistema bacteriano de expressão de AGP. Uma vez estabelecida uma temperatura restritiva, pode-se realizar uma mutagénese aleatória com o clone de SSS I. As formas mutantes de SSS I podem ser transformadas na estirpe glg A“, crescidas à temperatura restritiva e as variantes estáveis ao calor podem ser 21 ΕΡ Ο 943 001/ΡΤ identificadas pela sua capacidade para produzir glicogénio que cora com iodo, à temperatura de restrição.

Lisboa

Claims (33)

1. ΕΡ Ο 943 001/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Polinucleótido que codifica para um polipéptido de ADP-glucose-fosforilase (AGP) de planta, mutante, que compreende uma mutação de aminoácido na sua subunidade grande e que exibe uma estabilidade ao calor aumentada em relação a um polipéptido de AGP do tipo selvagem, em que a mutação compreende a substituição do aminoácido correspondente a His-333, Ala-177, Asp-400, Val-454, Arg-104, Thr-460 ou Arg-216 no milho.
2. 2. Polinucleótido de acordo com a reivindicação 1, em que o polinucleótido mutante é AGP de endosperma de milho.
3. 3. Polinucleótido de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o polipéptido mutante retém 8-59% da actividade quando colocado em células de E. coli que expressam a subunidade BT2 e crescidas a 60°C, durante 5 minutos.
4. 4. Polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a mutação compreende a substituição de His-333.
5. 5. Polinucleótido de acordo com a reivindicação 4, em que a substituição é Tyr.
6. 6. Polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a mutação compreende a substituição de Ala-177.
7. 7. Polinucleótido de acordo com a reivindicação 6, em que a substituição é Pro.
8. 8. Polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a mutação compreende a substituição de Asp-400.
9. 9. Polinucleótido de acordo com a reivindicação 8, em que a substituição é His. ΕΡ Ο 943 001/ΡΤ 2/4
10. 10. Polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a mutação compreende a substituição de Val-454.
11. 11. Polinucleótido de acordo com a reivindicação 10, em que a substituição é lie.
12. 12. Polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a mutação compreende a substituição de Arg-104.
13. 13. Polinucleótido de acordo com a reivindicação 12, em que a substituição é Thr.
14. 14. Polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a mutação compreende a substituição de Thr-460.
15. 15. Polinucleótido de acordo com a reivindicação 14, em que a substituição é Ile.
16. 16. Polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a mutação compreende a substituição de Arg-216.
17. 17. Polinucleótido de acordo com a reivindicação 16, em que a substituição é Pro.
18. 18. Polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o polipéptido mutante compreende ainda uma mutação Rev6 que confere um maior peso de semente a uma planta que expressa o polinucleótido.
19. 19. Método para aumentar a resistência ao calor de uma planta que compreende incorporar um polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores no genoma da planta e expressar a proteína por ele codificada.
20. 20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que a planta é uma planta de cereal. ΕΡ Ο 943 001/ΡΤ 3/4
21. 21. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o cereal é milho, trigo, arroz ou cevada.
22. 22. Método de acordo com a reivindicação 19, em que a planta é Zea mays.
23. 23. Planta que expressa o polipéptido AGP mutante definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.
24. 24. Planta de acordo com a reivindicação 23, que é uma planta de cereal.
25. 25. Planta de acordo com a reivindicação 24, em que o cereal é milho, trigo, arroz ou cevada.
26. 26. Planta de acordo com a reivindicação 23, em que a planta é Zea mays.
27. 27. Tecido de planta cujo genoma compreende a sequência de um polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18.
28. 28. Tecido de planta de acordo com a reivindicação 27, em que a planta é uma planta de cereal.
29. 29. Tecido de planta de acordo com a reivindicação 28, em que o cereal é milho, trigo, arroz ou cevada.
30. 30. Tecido de planta de acordo com a reivindicação 27, em que a planta é Zea mays.
31. 31. Tecido de planta de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30 que é uma semente.
32. 32. Polipéptido de ADP-glucose-fosforilase (AGP) de planta, mutante, que compreende uma mutação de aminoácido na sua subunidade grande e que exibe uma estabilidade ao calor aumentada em relação a um polipéptido de AGP do tipo selvagem, em que a mutação compreende a substituição de um aminoácido correspondente a His-333, Ala-177, Asp-400, Val-454, Arg-104, Thr-460 ou Arg-216 no milho. ΕΡ Ο 943 001/ΡΤ 4/4
33. 33. Polipéptido de acordo com a reivindicação 32, que é como definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 18. Lisboa,