CN1503842A

CN1503842A - 淀粉生物合成酶的热稳定突变体

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Publication number: CN1503842A
Application number: CNA028082281A
Authority: CN
Inventors: Cl; C·L·汉娜; T·W·格林; B·布格尔
Original assignee: University of Florida
Current assignee: University of Florida
Priority date: 2001-03-14
Filing date: 2002-03-14
Publication date: 2004-06-09
Also published as: UA84669C2; RU2003130272A; DK1373488T3; AR032990A1; RU2303633C2; EP1373488B1; DE60232138D1; US20030056248A1; ATE430192T1; ES2325984T3; EP2107111A1; PT1373488E; US6969783B2; WO2002072784A2; EP1373488A4; MXPA03008350A; WO2002072784A3; BR0208079A; EP1373488A2; AU2002305047A1

Abstract

本发明涉及新的突变多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码具有增强的热稳定性的酶。当在植物中表达时，这些多核苷酸导致在热胁迫条件下生长的植物的产量增加。在一个实施方案中，本发明多核苷酸分子编码玉米胚乳ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)和可溶性淀粉合成酶(SSS)酶活性。植物和植物组织也为本发明所预期，所述植物和植物组织经培育含有或经转化具有所述突变多核苷酸并且表达所述多核苷酸所编码的多肽。本发明也涉及用于分离本发明范围之内的多核苷酸和多肽的方法。本发明还提供增加在热胁迫条件下生长的植物的产量的方法。

Description

淀粉生物合成酶的热稳定突变体

本发明在国家科学基金项目号9316887的政府资助下完成。政府享有本发明的某些权利。

相关申请的相互参照

本申请要求美国临时专利申请系列号60/275,768(2001年3月14日提交)的权利。

发明背景

植物生命的固着特性使其持续暴露于环境因素，所述环境因素对植物的生长和发育产生积极和消极作用。现代农业面临的一个主要障碍就是不利的环境条件。引起重大作物损失的一个重要因素是热胁迫。温度胁迫使许多谷类作物如玉米、小麦和大麦的粮食产量大大减少。由于热胁迫造成的产量下降在世界重要谷物中占7到35％。

许多研究已经鉴定了热胁迫的可能生理学后果。Hunter等人的早期工作(Hunter，R.B.，Tollenaar，M.和Breuer，C.M.[1977]加拿大植物科学杂志(Can.J.Plant Sci.)57：1127-1133)利用生长室条件证实在玉米中温度可减少籽粒的灌浆持续时间。Tollenaar和Bruulsema(Tollenaar，M.和Bruulsema，T.W.[1988]加拿大植物科学杂志(Can.J.Plant Sci.)68：935-940)得到了相似结果，在他们的结果中籽粒灌浆时间受温度升高的不利影响。Badu-Apraku等人(Badu-Apraku，B.，Hunter，R.B.和Tollenaar，M.[1983]加拿大植物科学杂志(Can.J.Plant Sci.)63：357-363)测定出，与生长在昼/夜温度为25/15℃的玉米相比，生长在35/15℃条件下的玉米植物的产量显著减少。由于温度升高引起的产量减少也被历史上和气候学上的研究所支持(Thompson，L.M.[1 986] Agrion.J 78：649-653；Thompson，L.M.[1975]科学(Science)188：535-541；Chang，J.[1981]Agricul.Metero.24：253-262；以及Conroy，J.P.，Seneweera，S.，Basra，A.S.，Rogers，G.和Nissen-Wooller，B.[1994]澳大利亚植物生理学杂志(Aust.J.PlantPhysiol.)21：741-758).

利用体外谷粒培养系统的研究已经证明，热胁迫对发育中的种子的生理学过程施以负面影响(Jones，R.J.，Gengenbach，B.G.和Cardwell，V.B.[1981]作物科学(Crop Science)21：761-766；Jones，R.J.，Ouattar，S.和Crookston，R.K.[1984]作物科学(Crop Science)24：133-137；以及Cheikh，N.和Jones，R.J.[1995]植物生理学(Physiol.Plant.)95：59-66)。在大于最适温度的35℃下培养的玉米粒重量显著减少。

在小麦中的工作已经鉴定出，小麦胚乳对热胁迫的反应的一个特点是可溶性淀粉合成酶(SSS)活性的丧失。(Hawker，J.S.和Jenner，C.F.[1993]澳大利亚植物生理学杂志(Aust.J.Plant Physiol.)20：197-209；Denyer，K.，Hylton，C.M.和Smith，A.M.[1994]澳大利亚植物生理学杂志(Aust.J.PlantPhysiol.)21：783-789；Jenner，C.F.[1994]澳大利亚植物生理学杂志(Aust.J.PlantPhysiol.)21：791-806)。另外的研究显示小麦胚乳SSS是热不稳定的(Rijven，A.H.G.C.[1986]植物生理学(Plant Physiol.)81：448-453；Keeling，P.L.，Bacon，P.J.，Holt，D.C.[1993]植物(Planta.)191：342-348；Jenner，C.F.，Denyer，K.和Guerin，J.[1995]澳大利亚植物生理学杂志(Aust.J.Plant Physiol.)22：703-709)。

玉米中SSS和ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)在热胁迫条件下的作用还不甚清楚。AGP催化ATP和α-葡萄糖-1-磷酸生成ADP-葡萄糖和焦磷酸。ADP-葡萄糖作为植物淀粉生物合成和细菌糖原生物合成中糖基的供体。对玉米(Zea mays)淀粉缺陷突变体胚乳的研究表明，作为关键酶，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶在淀粉生物合成的调节中具有重要作用(Tsai，C.Y.和Nelson，Jr.，O.E.[1966]科学(Science)151：341-343；Dickinson，D.B.，J.Preiss [1969]植物生理学(Plant Physiol.)44：1058-1062)。

Ou-Lee和Setter (Ou-Lee，T.和Setter，T.L.[1985]植物生理学(PlantPhysiol.)79：852-855)检测了温度对玉米穗顶端区域的影响。在淀粉集中积累期，当温度升高时，与基部谷粒相比，顶端谷粒中的AGP活性较低。相反，在这一时期正常温度下发育的谷粒中，顶端和基部谷粒中AGP活性相似。然而，温度对这一时期顶端和基部谷粒中淀粉合成酶活性的影响并无差异。而且，热处理的顶端谷粒的淀粉合成酶活性与对照相比有所增加。在AGP活性上没有观察到这种现象。Singletary等人(Singletary，G.W.，Banisadr，R.和Keeling，P.L.[1993]植物生理学(Plant Physiol.)102：6(增刊)；Singletary，G.W.，Banisadra，R.，Keeling，P.L.[1994]澳大利亚植物生理学杂志(Aust.J.Plant Physiol.)21：829-841)利用体外培养系统对籽粒灌浆期中不同温度的影响进行定量，随温度从22增加到36℃，种重稳步下降。Duke和Doehlert的工作也支持了AGP在产量损失中的作用(Duke，E.R.和Doehlert，D.C.[1996]环境实验植物学(Environ.Exp.Botany)36：199-208)。

Keeling等人(1994，前述引文)的工作利用Q₁₀分析对玉米和小麦中的SSS活性进行定量，并且证实SSS是碳流入淀粉的重要控制点。

AGP和SSS的体外生化研究清楚地显示两种酶都是热不稳定的。当57℃加热5分钟时，玉米胚乳AGP丧失96％的活性(Hannah，L.C.，Tuschall，D.M.和Mans，R.J.[1980]遗传学(Genetics)95：961-970)。这与马铃薯AGP不同，后者在70℃完全稳定(Sowokinos，J.R.和Preiss，J.[1982]植物生理学(Plant Physiol.)69：1459-1466；Okita，T.W.，Nakata，P.A.，Anderson，J.M.，Sowokinos，J.，Morell，J.和Preiss，J.[1990]植物生理学(Plant Physiol.)93：785-90)。SSS的热失活研究显示其在高温下也是不稳定的，并且动力学研究确定当温度从25℃升高到45℃时，支链淀粉的Km值呈指数升高(Jenner等人，1995，前述引文)。

生物化学和遗传学证据已经表明，AGP是高等植物淀粉生物合成和大肠杆菌糖原生物合成中的关键酶(Preiss，J.和Romeo，T.[1994]核酸研究和分子生物学进展(Progress in Nuc.Acid Res.And Mol Biol.)47：299-329；Preiss，J.和Sivak，M.[1996]“库和源中的淀粉合成”，见：植物和作物中的光同化物分配：源-库关系(photoassimilate distribution in plants andcrops：source-sink relationships)，Zamski，E.主编，Marcil Dekker公司，139-168页)。AGP催化的步骤据认为是淀粉生物合成途径的起始步骤，其反应产物为活化的糖基供体——ADP葡萄糖。淀粉合成酶利用所述ADP葡萄糖延伸多糖多聚体(综述见于Hannah，L.Curtis[1996]″玉米胚乳中的淀粉合成″，见：植物细胞和分子生物学进展(Advances in Celluar andMolecular Biology of Plants)第4卷，B.A.Larkins和I.K.Vasil(主编)，植物种子发育的细胞和分子生物学(Cellular and Molecular Biology ofPlant Seed Development)，Kluwer学院出版社，Dordrecht，荷兰)。

对马铃薯AGP的最初研究显示，在大肠杆菌中表达产生的该酶与天然块茎中的该酶在变构和动力学特性上非常相似(Iglesias，A.，Barry，G.F.，Meyer，C.，Bloksberg，L.，Nakata，P.，Greene，T.，Laughlin，M.J.，Okita，T.W.，Kishore，G.M.和Preiss，J.[1993]生物化学杂志(J.Biol Chem.)268：1081-86；Ballicora，M.A.，Laughlin，M.J.，Fu，Y.，Okita，T.W.，Barry，G.F.和Preiss，J.[1995]植物生理学(Plant Physiol.)109：245-251)。Greene等人指出了在马铃薯AGP的结构-功能研究中细菌表达系统的用途(Greene，T.W.，Chantler，S.E.，Kahn，M.L.，Barry，G.F.，Preiss，J.和Okita，T.W.[1996]国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)93：1509-1513；Greene，T.W.，Woodbury，R.L.和Okita，T.W.[1996]植物生理学(PlantPhysiol.)112：1315-1320)。现已鉴定出在变构和底物结合位点作图时具有重要作用的多个突变(Okita，T.W.，Greene，T.W.，Laughlin，M.J.，Salamone，P.，Woodbury，R.，Choi，S.，Ito，H.，Kavakli，H.和Stephens，K.[1996]“通过生成修饰的植物生物合成酶改造植物淀粉”，见：EngineeringCrops for Industrial End Uses，Shewry，P.R.，Napier，J.A.和Davis，P.主编，Portland出版有限公司，伦敦)。

AGP酶已经从细菌和植物中分离出来。细菌AGP由同四聚体组成，而植物光合和非光合组织的植物AGP为异四聚体，由2种不同的亚基构成。该植物酶由两个不同的基因编码，其中一个亚基比另一个大。这一特性在许多植物中得到证明。利用SDS-PAGE估计，菠菜叶中的AGP亚基的分子量为54kDa和51kDa。两个亚基都可以与抗纯化的菠菜叶AGP的抗体发生免疫反应(Copeland，L.，J.Preiss(1981)植物生理学(PlantPhysiol.)68：996-1001；Morell，M.，M.Bloon，V.Knowles，J.Preiss[1988]生物化学杂志(J Bio.Chem.)263：633)。利用制备的抗菠菜叶大和小亚基的抗血清的免疫学分析显示马铃薯块茎AGP也由两个基因编码(Okita等人，1990，前述引文)。马铃薯块茎的两个亚基(50和51kDa)的cDNA克隆也已经分离并测序(Muller-Rober，B.T.，J.Kossmann，L.C.Hannah，L.Willmitzer，U.Sounewald[1990]Mol.Gen.Genet.224：136-146；Nakata，P.A.，T.W.Greene，J.M.Anderson，B.J.Smith-White，T.W.Okita，J.Preiss[1991]植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)17：1089-1093)。马铃薯块茎AGP大亚基是热稳定的(Nakata等人[1991]，前述引文)。

正如Hannah和Nelson(Hannah，L.C.，O.E.Nelson(1975)植物生理学(Plant Physiol.)55：297-302；Hannah，L.C.和Nelson，Jr.，O.E.[1976]生物化学遗传学(Biochem.Genet.)14：547-560)所推断，Shrunken-2(Sh2)(Bhave，M.R.，S.Lawrence，C.Barton，L.C.Hannah[1990]植物细胞(Plant Cell)2：581-588)和Brittle-2(Bt2)(Bae，J.M.，M.Giroux，L.C.Hannah[1990] Maydica 35：317-322)都是玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的结构基因。Sh2和Bt2分别编码该酶的大亚基和小亚基。通过cDNA测序推断出Sh2和Bt2蛋白质的分子量分别为57,179 Da(Shaw，J.R.，L.C.Hannah[1992]植物生理学(Plant Physiol.)98：1214-1216)和52,224Da。胚乳是玉米谷粒发育期间大部分淀粉沉积的位点。与AGP活性缺陷水平相对应，Sh2和bt2玉米胚乳突变体的淀粉水平大大减少。已证实，任何一个基因的突变都将使AGP活性减少约95％(Tsai和Nelson，1966，前述引文；Dickinson和Preiss，1969，前述引文)。而且已经观察到，酶活性随功能性野生型Sh2和Bt2等位基因的剂量而增加，而突变酶具有改变的动力学特性。AGP是植物淀粉生物合成中的限速步骤。Stark等人将大肠杆菌AGP的突变形式导入马铃薯块茎中，得到淀粉含量增加35％(Stark等人[1992]科学(Science)258：287)。

现已报道了对多种植物的编码AGP酶亚基的基因的克隆和鉴定。这包括玉米的Sh2 cDNA(Bhave等人，1990，前述引文)、Sh2基因组DNA(Shaw和Hannah，1992，前述引文)以及Bt2 cDNA(Bae等人，1990，前述引文)；水稻的小亚基cDNA(Anderson，J.M.，J.Hnilo，R.Larson，T.W.Okita，M.Morell，J.Preiss[1989]生物化学杂志(J.Biol.Chem.)264：12238-12242)和基因组DNA(Anderson，J.M.，R.Larson，D.Landencia，W.T.Kim，D.Morrow，T.W.Okita，J.Preiss[1991]基因(Gene)97：199-205)；以及菠菜叶的大小亚基cDNA(Morell等人，1988，前述引文)和马铃薯块茎的大小亚基cDNA(Muller-Rober等人，1990，前述引文；Nakata，P.A.，Greene，T.W.，Anderson，J.W.，Smith-White，B.J.，Okita，T.W.和Preiss，J.[1991]植物分子生物学(Plant Mol. Biol.)17：1089-1093)。另外，已经从小麦胚乳和叶组织(Olive，M.R.，R.J.Ellis，W.W.Schuch[1989]植物生理分子生物学(Plant Physiol. Mol. Biol.)12：525-538)以及拟南芥叶(Lin，T.，Caspar，T.，Sommerville，C.R.和Preiss，J.[1988]植物生理学(Plant Physiol.)88：1175-1181)中分离出cDNA克隆。此外，Ainsworth等人描述了大麦的AGP序列(Ainsworth，C.，Hosein，F.，Tarvis，M.，Weir，F.，Burrell，M.，Devos，K.M.，Gale，M.D.[1995]植物(Planta)197：1-10)。

在迄今所研究的所有组织和生物体中AGP以变构酶形式执行功能。AGP的变构特性最先在大肠杆菌中被证实是重要的。从大肠杆菌中分离了一个过度产生糖原的突变体，并且该突变定位于AGP结构基因上，命名为glyC。已证实此大肠杆菌突变体(称作glyC-16)对激活剂果糖-1，6-二磷酸较敏感，而对抑制剂cAMP较不敏感(Preiss，J.[1984]微生物学年评(Ann.Rev.Microbiol.)419-458)。尽管植物AGP也为变构酶，但它们与大肠杆菌AGP响应不同的效应分子。在植物中，3-磷酸甘油酸(3-PGA)作为其激活剂而磷酸盐(PO₄)作为抑制剂(Dickinson和Preiss，1969，前述引文)。

利用体内诱变系统，Giroux等人能够在玉米胚乳AGP的功能重要区域产生点特异突变体(Giroux，M.J.，Shaw，J.，Barry，G.，Cobb，G.B.，Greene，T.，Okita，T.W.和Hannah，L.C.[1996]国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)93：5824-5829)，上述体内诱变系统由Ac-介导切除偶然紧靠已知激活剂结合位点的Ds转座因子而产生。突变体Rev6在AGP大亚基上含有酪氨酸-丝氨酸插入，并且所述突变体使种重增加了11-18％。另外，据已出版国际申请WO 01/64928所讲授，利用编码含有Rev6突变的玉米AGP大亚基的多核苷酸转化植物可使植物具有多种增强特征，例如种子数目、植物生物量、收获指数等等。

已出版国际专利申请WO 99/58698和WO 98/22601以及已颁发的美国专利号6,069,300公开了玉米AGP酶大亚基上的突变，当表达这些突变酶时，与野生型AGP酶相比这些突变可赋予增强的热稳定性。在’300专利和WO出版物中公开了几种热稳定突变体，包括突变体HS 13(177位Pro替代Ala)、HS 14(在400位His替代Asp以及454位Ile替代Val)、HS 16(104位Thr替代Arg)、HS 33(333位Tyr替代His)、HS 39(333位Tyr替代His)、HS 40(333位Tyr替代His以及460位Ile替代Thr)、HS 47(216位Pro替代Arg以及333位Tyr替代His)、RTS 48-2(177位Val替代Ala)以及RTS 60-1(396位Val替代Ala)。

发明概述

本发明涉及用于提高植物中作物产量的材料和方法，上述植物例如那些产生谷类作物的植物。在一个实施方案中，本发明提供热稳定AGP酶以及编码这些酶的核苷酸序列。在优选实施方案中，本发明热稳定酶可以用于提供对高温具有更大耐受性的植物，并因此增加这些植物的作物产量。在特别优选实施方案中，改进的植物为谷类植物。可应用本发明的谷类包括例如玉米、小麦、水稻和大麦。

附图简述

图1显示玉米野生型Shrunken-2等位基因的基因组核苷酸序列。内含子用小写字母表示。第1位碱基为转录起始位点。

图2显示野生型与多种玉米AGP大亚基突变体的酶活性比较。所有反应重复二次。给出的数字为去除本底后重复实验的平均值。百分比为热处理后残存活性与热处理之前活性的比值。

附图图例如下：

″sh2″＝野生型sh2蛋白质；

″sh2ht″＝热处理后的野生型sh2蛋白质；

″33″＝含有HS 33突变(即在玉米AGP大亚基的第333位以酪氨酸替代组氨酸)的sh2蛋白质；

″33ht″＝热处理后的含有HS 33突变的sh2蛋白质；

″177″＝含有rts48-2突变(即在玉米AGP大亚基的第177位以缬氨酸替代丙氨酸)的sh2蛋白质；

″177ht″＝热处理后的含有rts48-2突变(即在玉米AGP大亚基的第177位以缬氨酸替代丙氨酸)的sh2蛋白质；

″396″＝含有rts60-1突变(即在玉米AGP大亚基的第396位以缬氨酸替代丙氨酸)的sh2蛋白质；

″396ht″＝热处理后的含有rts60-1突变(即在玉米AGP大亚基的第396位以缬氨酸替代丙氨酸)的sh2蛋白质；

″7+6″＝含有″177″和″396″突变联合的sh2蛋白质；

″7+6ht″＝热处理后的含有″177″和″396″突变联合的sh2蛋白质；

″7+3″＝含有″177″和″HS33″突变联合的sh2蛋白质；

″7+3ht″＝热处理后的含有″177″和″HS33″突变联合的sh2蛋白质；

″6+3″＝含有″396″和″HS33″突变联合的sh2蛋白质；

″6+3ht″＝热处理后的含有″396″和″HS33″突变联合的sh2蛋白质；

图3显示Sh2编码区的限制性图谱。所示限制酶为那些用于分离全编码区和产生双重和三重突变型的酶。突变用星号(^*)表示。序列简述

SEQ ID NO.1为与玉米AGP大亚基第318-350位氨基酸区域相对应的氨基酸序列，其含有HS 33突变。

SEQ ID NO.2为与玉米AGP大亚基第170-189位氨基酸区域相对应的氨基酸序列，其含有RTS48-2突变。

SEQ ID NO.3为与玉米AGP大亚基第389-406位氨基酸区域相对应的氨基酸序列，其含有RTS60-1突变。

SEQ ID NO.4为玉米野生型Shrunken-2等位基因的基因组核苷酸序列。

SEQ ID NO.5为可根据本发明使用的合成寡核苷酸引物。

SEQ ID NO.6为可根据本发明使用的合成寡核苷酸引物。

SEQ ID NO.7为可根据本发明使用的合成寡核苷酸引物。

SEQ ID NO.8为可根据本发明使用的合成寡核苷酸引物。

SEQ ID NO.9为可根据本发明使用的合成寡核苷酸引物。

SEQ ID NO.10为可根据本发明使用的合成寡核苷酸引物。

发明详述

本发明涉及新的突变多核苷酸分子及其编码的多肽，相对于表达野生型基因型的植物而言，其赋予在热胁迫条件下生长的植物增强的热抵抗力和增高的产量。在特定实施方案中，本发明多核苷酸分子编码玉米胚乳ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)和可溶性淀粉合成酶(SSS)酶活性。与野生型酶活性相比，该突变酶可以使表达此突变酶的种子和植物组织在种子和植物发育时期对热胁迫条件表现出增强的稳定性。

本发明一方面涉及多核苷酸，与野生型AGP大亚基多肽的序列相比，所述多核苷酸编码的AGP大亚基含有2个或2个以上的氨基酸改变，其中表达的突变蛋白质展现出增强的稳定性。优选地，当与小亚基一起表达时，与野生型蛋白质相比，由本发明多核苷酸编码的多肽表现出增强的酶活性，并且优选地，与可赋予增加的热稳定性的单氨基酸突变，如HS 33相比表现出大约相同或更高水平的酶活性。本发明多核苷酸可以编码野生型序列的2、3或更多个氨基酸改变。优选地，本发明多核苷酸编码具有氨基酸替代的多肽，所述氨基酸替代发生在与玉米AGP大亚基中的位置相对应的一个或多个下述位置：177、333和396位。

在一个实施方案中，本发明多核苷酸编码含有双重突变的植物AGP大亚基突变体，即，在该多肽序列中有组氨酸至酪氨酸的替代以及丙氨酸至缬氨酸的替代。在示范性实施方案中，酪氨酸替代组氨酸发生在与玉米AGP大亚基序列第333位残基相对应的氨基酸上。在一个实施方案中，缬氨酸替代丙氨酸发生在与玉米AGP大亚基序列第177位残基相对应的氨基酸上。在另一实施方案中，缬氨酸替代丙氨酸发生在与玉米AGP大亚基序列第396残基相对应的氨基酸上。

在另一实施方案中，本发明多核苷酸编码突变的植物AGP大亚基，在该多肽序列中包含两个丙氨酸至缬氨酸的替代。在示范性实施方案中，第一个丙氨酸至缬氨酸的替代发生在与玉米AGP大亚基序列第177位残基相对应的氨基酸上，而第二个丙氨酸至缬氨酸的替代发生在与玉米AGP大亚基序列第396位残基相对应的氨基酸上。与具有两个突变的本发明突变蛋白质相关的酶活性如图2所示。

另一实施方案涉及三重突变体，其包含在与玉米AGP大亚基序列第333位残基相对应的位置上组氨酸被酪氨酸替代、与177位残基相对应的位置上丙氨酸被缬氨酸替代，以及与396位残基相对应的位置上丙氨酸被缬氨酸替代。

以上提到的氨基酸残基编号基于公认的该蛋白质的氨基酸编号(Shaw和Hannah，1992，前述引文)。进行这些替代的位点可由本领域技术人员容易地确定。下述表1显示了此处所示范的双和三重氨基酸替代突变体。

表1
表1	Sh2多肽突变体氨基酸改变
HS 7+3 177位Val替代Ala并且333位Tyr替代HisHS 6+3 396位Val替代Ala并且333位Tyr替代HisHS 7+6 177位Val替代Ala并且396位Val替代AlaHS 7+6+3 177位Val替代Ala并且396位Val替代Ala及333位Tyr替代His	Sh2多肽突变体氨基酸改变

由于植物不同种类之间AGP多肽的同源性(Smith-White和Preiss[1992]分子进化杂志(J.Mol.Evol.)34：449-464)，普通技术人员可以容易地确定玉米以外其它植物的AGP中与此处公开的玉米AGP突变位置相对应的突变位置。因此，本发明包括编码非玉米植物的突变AGP的多核苷酸，所述植物包括但并不限于小麦、大麦、燕麦和水稻，当所述多核苷酸在植物中表达时可使热稳定性增强。

美国专利号6,069,300及已出版国际申请WO 99/58698和WO98/22601上公开了AGP中可赋予热稳定性的单氨基酸突变，以及产生和选择所述突变的方法。一般地，对含有编码玉米AGP SH2亚基的多核苷酸的质粒进行诱变，然后放入表达BT2亚基的突变大肠杆菌glg C-细胞，并且将细胞在42℃培养以筛选可以在此温度下产生糖原的突变体。分离出几个突变体，称为热稳定(HS)突变体。制备这些突变体的粗提取物并测定所得AGP的热稳定性。这些单氨基酸替代突变体在60℃孵育5分钟后保留8-59％的活性。另外，在其中几个突变体中热处理之前玉米胚乳AGP突变体的总酶活性升高约2到3倍。

可以容易地将能赋予热稳定性的多个突变联合在一个亚基中。例如，可以使用不同的单一限制性位点，所述单一限制性位点将sh2的编码区分为三个不同的片断。如果适当，突变联合可以通过亚克隆含有增加的突变的相应片断产生。如果两个突变紧邻，那么可以使用定点诱变的方法构建这种联合。一个点特异突变方法涉及PCR、诱变引物和Dpn I限制性内切酶的使用。引物可以构建成在其5’末端含有突变，并用于使用保真聚合酶Vent的PCR扩增。然后将扩增得到的DNA用Dpn I消化。由于从大肠杆菌分离的亲本DNA为甲基化的，因此其对Dpn I敏感。消化的DNA通过凝胶电泳大小分级分离、连接并克隆至表达载体。突变利用测序分析确认，之后转化至含有野生型小亚基的AC70R1-504株系中。然后可以分析联合突变体。

本发明也涉及具有此处所述氨基酸替代的突变多肽，所述突变多肽由本发明多核苷酸编码。在优选实施方案中，多肽突变体来自玉米。

本发明还涉及本发明所述的AGP热稳定突变体与该酶小亚基中的热稳定突变的联合。AGP小亚基中赋予该酶热稳定性的突变也可以利用美国专利号6,069,300以及已出版国际申请WO 99/58698和WO 98/22601中所述的方法容易地制备并鉴定。小亚基热稳定突变体可以与本发明突变体共表达以进一步增强AGP酶的稳定性。

植物或植物组织也为本发明所预期，所述植物或植物组织通过培育或转化而含有本发明突变多核苷酸并且表达由所述多核苷酸编码的多肽。表达突变多核苷酸的植物和植物组织可产生下述组织，该组织可以例如在发育过程中遭遇热胁迫时由热导致的在重量或产量上的损失较低。本发明范围内的植物包括单子叶植物和双子叶植物，所述单子叶植物如水稻、小麦、大麦、燕麦、高粱、玉米、百合和粟；所述双子叶植物如豌豆、紫花苜蓿、鹰嘴豆、菊苣、三叶草、羽叶甘蓝、兵豆、北美雀麦、大豆、烟草、马铃薯、甘薯、萝卜、甘蓝、油菜、苹果树和莴苣。在特别优选实施方案中，该植物为谷类。本发明适用的谷类包括例如玉米、小麦、水稻、大麦、燕麦、黑麦和粟。

本发明也涉及产生和鉴定本发明范围内的多核苷酸和多肽的方法。在一个实施方案中，通过基因突变然后利用细菌表达系统筛选可以分离编码如下植物AGP亚基的多核苷酸分子，所述AGP亚基具有在植物淀粉合成中可以减轻热诱导的损失的突变。单个的氨基酸替代可以按照于此所述方法组合在一个亚基中。

本发明还涉及含有本发明多核苷酸的植物和植物组织，其中所述本发明多核苷酸编码本发明突变多肽。在优选实施方案中，该植物或植物组织具有掺入到其基因组中的本发明AGP突变基因。其它可赋予有利表型的等位基因也可以掺入到该植物基因组中。在优选实施方案中，该植物为谷类植物。更优选地，该植物为玉米。具有AGP突变基因的植物可以从基因组中含有该突变基因的种子生长而成。另外，基因转化植物的技术(如农杆菌感染、生物轰击方法等等)为本领域所公知。

由于遗传密码的简并性，于此公开的任一变体AGP多肽都可以由多种不同的多核苷酸序列编码。另外，构建可变(alternative)多核苷酸序列的方法为本领域技术人员所熟知，所述可变(alternative)多核苷酸将编码与本发明多肽相同或基本相同的多肽。这些变体或可变多核苷酸序列也在本发明范围内。于此使用的“基本相同”序列是指这样的序列，所述序列所编码的氨基酸替代、缺失、添加或插入均不在实质上改变此处所述AGP突变多核苷酸所编码多肽的功能活性。

于此使用的术语“核酸”和“多核苷酸序列”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚体，并且除非另有限定，其包括天然核苷酸的已知类似物，所述类似物将与天然核苷酸以相同方式行使功能。多核苷酸序列包括DNA链序列和RNA序列，所述DNA链序列可以转录成RNA，而所述RNA序列可以翻译成蛋白质。多核苷酸序列包括全长序列以及来自全长序列的较短序列。应该理解，特定多核苷酸序列包括天然序列的简并密码子，所述简并密码子的引入可以在特定宿主细胞中提供优先密码子。示范性序列的等位变异也在本发明范围之内。本发明范围内的多核苷酸序列还包括与示范性序列特异杂交的序列。该多核苷酸包括单链或双链形式的有义和反义链。

除了此处公开的突变体中的那些具体示范性氨基酸替代外，其它氨基酸替代也考虑在本发明范围内。氨基酸可分为以下几类：非极性、不带电荷的极性、碱性和酸性。将突变AGP多肽的某类氨基酸替代为同类另一氨基酸的保守替代也在本发明范围之内，只要与野生型多肽相比具有此保守替代的突变AGP多肽依旧保持增强的热稳定性即可。下述表2列出每一类氨基酸的实例。

表2
表2	氨基酸类型氨基酸实例
非极性 Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp不带电荷的极性 Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln酸性 Asp、Glu碱性 Lys、Arg、His	氨基酸类型氨基酸实例

例如，本发明包括利用其它氨基酸(如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)来替代HS 33、HS 7+3、HS 6+3和HS 7+6+3突变体中第333位上的酪氨酸。AGP大亚基第333位苯丙氨酸或甲硫氨酸的替代也特别为本发明范围所期望。因此，333位苯丙氨酸或甲硫氨酸与177位缬氨酸或396位缬氨酸的联合，或与后两者的联合为本发明所特别期望的。同样地，利用其它氨基酸，如亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸来替代RTS 48-2、RTS 60-1、HS 7+3、HS 6+3、HS 7+6和HS 7+6+3突变体中第177和396位上的缬氨酸也在本发明范围之内。在热稳定突变位点之外的位点上的氨基酸替代也考虑在本发明范围内，只要与野生型多肽相比该多肽依旧保持或赋予增强的热稳定性即可。

本发明多核苷酸和蛋白质也可以按照更具体的同一性和/或相似性范围来定义，所述同一性和/或相似性是与此处所示范的多核苷酸和蛋白质相比较而言。序列同一性一般大于60％，优选大于75％，更优选大于80％，甚至更优选大于90％，并且可以大于95％。与此处所列示范性序列相比，序列的同一性和/或相似性可以为49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。除非另有指明，于此使用的两个序列的序列同一性和/或相似性百分比可以利用由Karlin和Altschul改进(Karlin和Altschul[1993]美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：5873-5877)的Karlin和Altschul运算法则确定(Karlin和Altschul[1990]美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87：2264-2268)。这种运算法则被引入Altschul等人的NBLAST和XBLAST程序(Altschul等人[1990]分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215：402-410)。BLAST检索可以利用NBLAST程序(分值＝100，字长＝12)进行来获得具有所需序列同一性百分比的序列。为获得用于比较目的的空位(gap)比对，可以使用Altschul等人所描述的Gapped BLAST(Altschul等人[1997]核酸研究(Nucl.Acids Res.)25：3389-3402)。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各程序(NBLAST和XBLAST)的默认参数。参见NCBI/NIH网站。

本发明也涉及编码全长突变多肽的片断的多核苷酸，只要所述片断基本上保持与全长多肽相同的功能活性。由这些多核苷酸编码的突变AGP多肽片断也在本发明范围之内。全长序列的片断可以利用本领域公知的标准技术制备。

本发明也包括那些编码淀粉生物合成酶的多核苷酸分子，所述分子具有与野生型序列充分同源的序列以至于允许其与野生型序列在标准严紧条件和标准方法(Maniatis，T.，E.F.Fritsch，J.Sambrook[1982]分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)冷泉港，纽约)下杂交。于此使用的杂交的“严紧”条件是指以下条件：杂交一般在低于DNA杂合体熔解温度(Tm)20-25℃的温度下，在6×SSPE，5×Denhardt′s溶液，0.1％SDS、0.1mg/ml变性DNA中过夜进行。熔解温度通过下述公式描述(Beltz，G.A.，K.A.Jacobs，T.H.Eickbush，P.T.Cherbas和F.C.Kafatos[1983]酶学方法(Methods of Enzymology)，R.Wu，L.Grossman和K.Moldave主编，学院出版社(Academic Press)，纽约100：266-285)：

Tm＝81.5℃+16.6Log[Na⁺]+0.41(％G+C)-0.61(％甲酰胺)-600/双链碱基对长度。

洗涤一般按照以下进行：

(1)室温下，1×SSPE，0.1％SDS中洗涤15分钟，共2次(低严紧性洗涤)。

(2)在Tm-20℃下，0.2×SSPE，0.1％SDS中洗涤15分钟，一次(中等严紧性洗涤)。

本发明多核苷酸分子可用于转化植物以在所述植物中表达突变热稳定酶。另外，本发明多核苷酸可用于表达重组变体酶。它们还可作为检测相关酶的探针使用。所述多核苷酸也可用作DNA大小标准。

本发明多核苷酸分子也包括编码含有突变的淀粉生物合成酶(如AGP酶)的多核苷酸，所述突变除使表达这些突变体的植物热稳定性增强外，还使其种重增加。在编码玉米AGP大亚基的多核苷酸中，热稳定突变与使种重增加的突变(例如Rev6)的联合为本发明所特别预期，所述热稳定突变诸如Sh2-HS 7+6或Sh2-HS 7+3。美国专利号5,589,618和5,650,557公开了在AGP大亚基中编码突变的多核苷酸(例如Rev6)，所述突变使表达该突变多肽的植物种重增加。

按照本发明，赋予AGP亚基热稳定性的突变可以与玉米的磷酸盐不敏感突变(如Rev6突变)联合以增强Rev6编码的大亚基的稳定性。

据预计，正如在AGP中所观察的，SSS的酶活性在高温度下也将被削弱。因此，可以按照于此所述方法，在增加的热条件(42℃)下表达诱变的SSS形式以分离热稳定变体。本发明另一方面涉及SSS的这些热稳定诱变形式。

本发明也涉及在热胁迫条件下增强植物产量特征的方法，所述方法通过向植物中掺入本发明多核苷酸进行，其中所述多核苷酸在淀粉生物合成酶中含有使热稳定性增强或对热胁迫条件的抗性增加的突变以及使产量特征增强的突变。增强的产量特征包括例如增加的种子数目、增加的种重、增加的植物生物量以及增加的收获指数。

于此引用或参考的所有专利、专利申请、临时申请和出版物在与本说明书明确的讲授相一致的前提下特此全部引入作为参考。

以下为举例阐述本发明实施方法的实施例。这些实施例不应理解为限制性的。除非另外指明，所有百分比为重量百分比并且所有溶剂混合物比例为体积比。

实施例1——对含有多个氨基酸突变的玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的测试

玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的表达。将表达玉米胚乳或马铃薯块茎ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的AC70R1-504大肠杆菌(E.coli)细胞的甘油原种接种至10ml Luria肉汤(75g/mL壮观霉素和50g/mL卡那霉素)，并在37℃、220rpm振荡培养过夜。使用这些培养物接种250mLLuria肉汤(75g/mL壮观霉素和50g/mL卡那霉素)。培养物在37℃、220rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.55。利用0.2mM异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和.02mg/mL萘啶酮酸在室温、220rpm振荡条件下诱导培养物7小时。在4℃、3500rpm离心10min收集细胞。将细胞沉淀重悬于800L提取缓冲液中。上述提取缓冲液为50mM HEPES，pH7.5、5mM MgCl₂、5mM EDTA、20％蔗糖和30％硫酸铵。临用前向提取缓冲液中加入DTT(1mM)、50g/ml溶菌酶、1g/mL抑胃酶肽、1g/mL亮抑酶肽、1g/mL抗蛋白酶、10g/mL胰凝乳蛋白酶抑制剂、1mM苯甲基磺酰氟和1mM苄脒。将裂解物每次3秒超声3次，两次超声之间于冰上孵育。样品在4℃、13,000rpm离心1分钟。将上清移出并分装等待测定。

单个突变的联合。设计亚克隆策略来研究上述突变与HS 33联合的作用以及这些突变互相联合的作用。为将回复突变RTS 48-2与RTS 60-1联合，含有各回复突变的质粒(在联合突变前，已将温度敏感型亲本突变除去)用Eco RV消化，之后用RTS 48-2的339bp片断替换RTS 60-1的相应片断(图3)。产生的质粒命名为Sh2-HS 7+6。使用类似的策略将RTS48-2的回复突变与在HS33中所鉴定的突变联合。即，含有这些突变的质粒用Eco RV消化，之后用RTS 48-2的339 bp片断替换HS 33的相应片断。产生的质粒命名为Sh2-HS 7+3。为将回复突变RTS 60-1与在HS 33中鉴定到的突变联合，将含有这些突变的质粒用Mun I/KpnI消化，并且用RTS60-1的390bp片断替换HS 33的相应的片断(图3)。产生的质粒命名为Sh2-HS 6+3。为将回复突变RTS 60-1和RTS 48-2与在HS 33中鉴定到的突变联合，将质粒Sh2-HS 6+3以及含有回复突变RTS 48-2的质粒用EcoRV消化，之后用RTS 48-2的339bp片断替换Sh2-HS 6+3的相应片断。产生的质粒命名为Sh2-HS 7+6+3。

所有质粒的最终测序利用了6个引物以双向覆盖全部Sh2编码区。所使用的引物如下：

LHBB1(5′→3′)：5′-CGACTCACTATAGGGAGACC-3′(SEQ ID NO.5)；

LH27(5′→3′)：5′-CCCTATGAGTAACTG-3′(SEQ ID NO.6)；

LH9(5′→3′)：5′-TATACTCAATTACAT-3′(sEQ ID NO.7)；

LHBB2(3′→5′)：5′-GTGCCACCTGACGTCTAAG-3′(SEQ ID NO.8)；

LH2135(3′→5′)：5′-CAGAGCTGACACGTG-3′(SEQ ID NO.9)；

LH32(3′→5′)：5′-AAGCTGATCGCCACTC-3′(SEQ ID NO.10).

ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的热处理。测定野生型(sh2)和突变ADP-葡萄糖焦磷酸化酶在热处理前后的酶活性，所述突变ADP-葡萄糖焦磷酸化酶包含单氨基酸突变(HS 33、RTS 48-2、RTS 60-1)或多个氨基酸突变(HS 7+3，即RTS 48-2加HS 33；HS 6+3，即RTS 60-1加HS 33；以及HS 7+6，即RTS 48-2加RTS 60-1)。热处理为将测试蛋白质在60℃孵育5分钟。

60℃热处理5分钟后残存的活性百分比见表3。数据组中的基因型为Sh2野生型、HS 33、RTS 60-1(仅回复突变)、RTS 48-2(仅回复突变)、Sh2-HS 7+6、Sh2-HS 6+3、Sh2-HS 7+3和Sh2-HS 7+6+3。

表3.热处理后残存的活性百分比
表3.热处理后残存的活性百分比	酶％活性 SEM^a N^b
Sh2野生型 32 11 3HS 33 69 7 7RTS 60-1 61 13^* 2RTS 48-2 64 6 3Sh2-HS 7+6 77 21^* 2Sh2-HS 6+3 69 9 3Sh2-HS 7+3 83 8 3Sh2-HS 7+6+3 72 11 3	酶％活性 SEM^a N^b

a平均值的标准误

b实验重复次数

*代表全距，而不是S.E.M.

热处理前Sh2野生型、HS 33、RTS 60-1、RTS 48-2、Sh2-HS 7+6、Sh2-HS 6+3、Sh2-HS 7+3和Sh2-HS 7+6+3的活性见表4。HS 33的活性比Sh2野生型的活性高2.1倍。RTS 48-2和RTS 60-1的活性高1.4倍。它们的双重突变型的活性增加1.9倍。虽然这两个突变的联合增加了活性，但是双重突变型并不展示协同效果。当RTS 60-1突变与HS 33突变联合时展示出加性效果，与Sh2野生型相比活性升高3.4倍。RTS 48-2突变与HS33突变联合时活性增加稍小，至2.9倍，有趣的是，三重突变型显示比每一单独的次位点回复突变微有增加，但小于组合两个次位点回复突变型的双重突变型。

表4.活性增加倍数
表4.活性增加倍数	酶增加倍数全距 N^b
Sh2野生型 n/a n/a n/aHS 33 2.1 0.2^a 3RTS 60-1 1.4 0 1RTS 48-2 1.4 0 1Sh2-HS 7+6 1.9 0.2 2Sh2-HS 6+3 3.4 0 1Sh2-HS 7+3 2.9 0.1 2Sh2-HS 7+6+3 1.8 0.1 2	酶增加倍数全距 N^b

a平均值的标准误

b实验重复次数

n/a不适用的

ADP-葡萄糖焦磷酸化酶测定。为获得上述突变体的定量数据，利用合成(正向)测定法测量活性，该合成(正向)测定法测量糖核苷酸ADP-葡萄糖中掺入的[¹⁴C]葡萄糖-1-P。所述测定利用下述方法制备的粗制酶提取物进行。

利用ADP-葡萄糖合成反应测量ADP-葡萄糖中掺入的[¹⁴C]葡萄糖-1-P。反应混合物含有80mM HEPES，pH7.5m，1mM葡萄糖-1-P，4mMMgCl₂，0.5mg mL^-1牛血清白蛋白，10mM 3-PGA以及15,000cpm的[¹⁴C]葡萄糖-1-P。反应体积为50mL。测定通过加入1.5mM ATP起始。将反应在37℃孵育30分钟并煮沸2分钟终止。未掺入的葡萄糖-1-P通过加入0.3U的细菌碱性磷酸酶(Worthington Biochemical Corporation，Lakewood，NJ)并且在37℃孵育2.5小时切除。将20mL反应混合物试样点至DEAE滤纸上，用蒸馏水洗涤3次，干燥，并通过液体闪烁计数器定量。

对于单突变型和双重突变型的其它结果见图2。对联合突变型Sh2-HS7+6(RTS 48-2加RTS 60-1)和联合突变型Sh2-HS 6+3(RTS 60-1加HS 33)而言，给出的数字为酶的3个稀释物(重复二次)的数据乘以稀释倍数并减去本底后的平均值。对联合突变型Sh2-HS 7+3(RTS 48-2加HS 33)而言，给出的数字为酶的2个稀释物(重复二次)的数据乘以稀释倍数并减去本底后的平均值。这些数字的图示利用Microsoft Excel制作而成。

实施例2-热稳定突变与Rev6的联合

根据本发明，热稳定突变可以和与增加种重相关的突变相联合，所述与增加种重相关的突变诸如Rev6突变。其目的是在增强稳定性的同时，保持期望的Rev6的磷酸盐不敏感性特征。含有Rev6突变与热稳定突变联合的突变体可以按照此处所述的方法构建和验证。可以将这些“联合”突变体转化进带有野生型小亚基的AC70R1-504中。增加的热稳定性可以通过低葡萄糖培养基上的阳性糖原染色容易地鉴定。Rev6在这种培养基上生长时并不染色。最初，所有联合突变型可以经过酶学筛选以保持磷酸盐不敏感性，然后只对保持磷酸盐不敏感性的联合作进一步分析。

应该理解，于此描述的实施例和实施方案仅用于举例阐述的目的，并且鉴于此的多种修改或改变将是本领域技术人员明了的，这些修改或改变包括在本申请的精神和范围之内并在所附权利要求的范围之内。

序列表

<110>弗罗里达大学研究基金公司

<120>淀粉生物合成酶的热稳定突变体

<130>UF-305

<160>10

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>33

<212>PRT

<213>玉米(zea mays)的HS 33突变体

<400>1

Leu His Asp Phe Gly Ser Glu Ile Leu Pro Arg Ala Val Leu Asp Tyr

1 5 10 15

Ser Val Gln Ala Cys Ile Phe Thr Gly Tyr Trp Glu Asp Val Gly Thr

20 25 30

Ile

<210>2

<211>20

<212>PRT

<213>玉米的RTS48-2突变体

<400>2

Thr Gln Met Pro Glu Glu Pro Val Gly Trp Phe Gln Gly Thr Ala Asp

1 5 10 15

Ser Ile Arg Lys

20

<210>3

<211>18

<212>PRT

<213>玉米的RTS60-1突变体

<400>3

Asp Lys Cys Lys Met Lys Tyr Val Phe Ile Ser Asp Gly Cys Leu Leu

1 5 10 15

Arg Glu

<210>4

<211>7739

<212>DNA

<213>玉米的野生型Shrunken-2等位基因

<400>4

taagaggggt gcacctagca tagatttttt gggctccctg gcctctcctt tcttccgcct 60

gaaaacaacc tacatggata catctgcaac cagagggagt atctgatgct ttttcctggg 120

cagggagagc tatgagacgt atgtcctcaa agccactttg cattgtgtga aaccaatatc 180

gatctttgtt acttcatcat gcatgaacat ttgtggaaac tactagctta caagcattag 240

tgacagctca gaaaaaagtt atctctgaaa ggtttcatgt gtaccgtggg aaatgagaaa 300

tgttgccaac tcaaacacct tcaatatgtt gtttgcaggc aaactcttct ggaagaaagg 360

tgtctaaaac tatgaacggg ttacagaaag gtataaacca cggctgtgca ttttggaagt 420

atcatctata gatgtctgtt gaggggaaag ccgtacgcca acgttattta ctcagaaaca 480

gcttcaacac acagttgtct gctttatgat ggcatctcca cccaggcacc caccatcacc 540

tattcaccta tctctcgtgc ctgtttattt tcttgccctt tctgatcata aaaaatcatt 600

aagagtttgc aaacatgcat aggcatatca atatgctcat ttattaattt gctagcagat 660

catcttccta ctctttactt tatttattgt ttgaaaaata tgtcctgcac ctagggagct 720

cgtatacagt accaatgcat cttcattaaa tgtgaatttc agaaaggaag taggaaccta 780

tgagagtatt tttcaaaatt aattagcggc ttctattatg tttatagcaa aggccaaggg 840

caaaatcgga acactaatga tggttggttg catgagtctg tcgattactt gcaagaaatg 900

tgaacctttg tttctgtgcg tgggcataaa acaaacagct tctagcctct tttacggtac 960

ttgcacttgc aagaaatgtg aactcctttt catttctgta tgtggacata atgccaaagc 1020

atccaggctt tttcatggtt gttgatgtct ttacacagtt catctccacc agtatgccct 1080

cctcatactc tatataaaca catcaacagc atcgcaatta gccacaagat cacttcggga 1140

ggcaagtgtg atttcgacct tgcagccacc tttttttgtt ctgttgtaag tatactttcc 1200

cttaccatct ttatctgtta gtttaatttg taattgggaa gtattagtgg aaagaggatg 1260

agatgctatc atctatgtac tctgcaaatg catctgacgt tatatgggct gcttcatata 1320

atttgaattg ctccattctt gccgacaata tattgcaagg tatatgccta gttccatcaa 1380

aagttctgtt ttttcattct aaaagcattt tagtggcacg caattttgtc catgagggaa 1440

aggaaatctg ttttggttac tttgcttgag gtgcattctt catatgtcca gttttatgga 1500

agtaataaac ttcagtttgg tcataagatg tcatattaaa gggcaaacat atattcaatg 1560

ttcaattcat cgtaaatgtt ccctttttgt aaaagattgc atactcattt atttgagttg 1620

caggtgtatc tagtagttgg aggagatatg cagtttgcac ttgcattgga cacgaactca 1680

ggtcctcacc agataagatc ttgtgagggt gatgggattg acaggttgga aaaattaagt 1740

attgggggca gaaagcagga gaaagctttg agaaataggt gctttggtgg tagagttgct 1800

gcaactacac aatgtattct tacctcagat gcttgtcctg aaactcttgt aagtatccac 1860

ctcaattatt actcttacat gttggtttac tttacgtttg tcttttcaag ggaaatttac 1920

tgtatttttt gtgttttgtg ggagttctat acttctgttg gactggttat tgtaaagatt 1980

tgttcaaata gggtcatcta ataattgttt gaaatctggg aactgtggtt tcactgcgtt 2040

caggaaaaag tgaattattg gttactgcat gaataactta tggaaataga ccttagagtt 2100

gctgcatgat tatcacaaat cattgctacg atatcttata atagttcttt cgacctcgca 2160

ttacatatat aactgcaact cctagttgcg ttcaaaaaaa aaaatgcaac tcttagaacg 2220

ctcaccagtg taatctttcc tgaattgtta tttaatggca tgtatgcact acttgtatac 2280

ttatctagga ttaagtaatc taactctagg ccccatattt gcagcattct caaacacagt 2340

cctctaggaa aaattatgct gatgcaaacc gtgtatctgc tatcattttg ggcggaggca 2400

ctggatctca gctctttcct ctgacaagca caagagctac gcctgctgta agggataaca 2460

ctgaacatcc aacgttgatt actctattat agtattatac agactgtact tttcgaattt 2520

atcttagttt tctacaatat ttagtggatt cttctcattt tcaagataca caattgatcc 2580

ataatcgaag tggtatgtaa gacagtgagt taaaagatta tattttttgg gagacttcca 2640

gtcaaatttt cttagaagtt tttttggtcc agatgttcat aaagtcgccg ctttcatact 2700

ttttttaatt ttttaattgg tgcactatta ggtacctgtt ggaggatgtt acaggcttat 2760

tgatatccct atgagtaact gcttcaacag tggtataaat aagatatttg tgatgagtca 2820

gttcaattct acttcgctta accgccatat tcatcgtaca taccttgaag gcgggatcaa 2880

ctttgctgat ggatctgtac aggtgattta cctcatcttg ttgatgtgta atactgtaat 2940

taggagtaga tttgtgtgga gagaataata aacagatgcc gagattcttt tctaaaagtc 3000

tagatccaaa ggcattgtgg ttcaaaacac tatggacttc taccatttat gtcattactt 3060

tgccttaatg ttccattgaa tggggcaaat tattgattct acaagtgttt aattaaaaac 3120

taattgttca tcctgcaggt attagcggct acacaaatgc ctgaagagcc agctggatgg 3180

ttccagggta cagcagactc tatcagaaaa tttatctggg tactcgaggt agttgatatt 3240

ttctcgttta tgaatgtcca ttcactcatt cctgtagcat tgtttctttg taattttgag 3300

ttctcctgta tttctttagg attattacag tcacaaatcc attgacaaca ttgtaatctt 3360

gagtggcgat cagctttatc ggatgaatta catggaactt gtgcaggtat ggtgttctct 3420

tgttcctcat gtttcacgta atgtcctgat tttggattaa ccaactactt ttggcatgca 3480

ttatttccag aaacatgtcg aggacgatgc tgatatcact atatcatgtg ctcctgttga 3540

tgagaggtaa tcagttgttt atatcatcct aatatgaata tgtcatcttg ttatccaaca 3600

caggatgcat atggtctaat ctgctttcct tttttttccc ttcggaagcc gagcttctaa 3660

aaatgggcta gtgaagattg atcatactgg acgtgtactt caattctttg aaaaaccaaa 3720

gggtgctgat ttgaattcta tggttagaaa ttccttgtgt aatccaattc ttttgttttc 3780

ctttctttct tgagatgaac ccctctttta gttatttcca tggataacct gtacttgact 3840

tattcagaaa tgattttcta ttttgctgta gaatctgaca ctaaagctaa tagcactgat 3900

gttgcagaga gttgagacca acttcctgag ctatgctata gatgatgcac agaaatatcc 3960

ataccttgca tcaatgggca tttatgtctt caagaaagat gcacttttag accttctcaa 4020

gtaatcactt tcctgtgact tatttctatc caactcctag tttaccttct aacagtgtca 4080

attcttaggt caaaatatac tcaattacat gactttggat ctgaaatcct cccaagagct 4140

gtactagatc atagtgtgca ggtaagtctg atctgtctgg agtatgtgtt ctgtaaactg 4200

taaattcttc atgtcaaaaa gttgtttttg tttccagttt ccactaccaa tgcacgattt 4260

atgtattttc gcttccatgc atcatacata ctaacaatac attttacgta ttgtgttagg 4320

catgcatttt tacgggctat tgggaggatg ttggaacaat caaatcattc tttgatgcaa 4380

acttggccct cactgagcag gtactctgtc atgtattctg tactgcatat atattacctg 4440

gaattcaatg catagaatgt gttagaccat cttagttcca tcctgttttc ttcaattagc 4500

ttatcattta atagttgttg gctagaattt aaacacaaat ttacctaata tgtttctctc 4560

ttcagccttc caagtttgat ttttacgatc caaaaacacc tttcttcact gcaccccgat 4620

gcttgcctcc gacgcaattg gacaagtgca aggtatatgt cttactgagc acaattgtta 4680

cctgagcaag attttgtgta cttgacttgt tctcctccac agatgaaata tgcatttatc 4740

tcagatggtt gcttactgag agaatgcaac atcgagcatt ctgtgattgg agtctgctca 4800

cgtgtcagct ctggatgtga actcaaggta catactctgc caatgtatct actcttgagt 4860

ataccatttc aacaccaagc atcaccaaat cacacagaac aatagcaaca aagcctttta 4920

gttccaagca atttagggta gcctagagtt gaaatctaac aaaacaaaag tcaaagctct 4980

atcacgtgga tagttgtttt ccatgcactc ttatttaagc taattttttg ggtatactac 5040

atccatttaa ttattgtttt attgcttctt ccctttgcct ttcccccatt actatcgcgt 5100

cttaagatca tactacgcac tagtgtcttt agaggtctct ggtggacatg ttcaaaccat 5160

ctcaatcggt gttggacaag tttttcttga atttgtgcta cacctaacct atcacgtatg 5220

tcatcgtttc aaactcgatc cttcctgtat catcataaat ccaatgcaac atacgcattt 5280

atgcaacatt tatctgttga acatgtcatc tttttgtagg ttaacattat gcaccataca 5340

atgtagcatg tctaatcatc atcctataaa atttacattt tagcttatgt ggtatcctct 5400

tgccacttag aacaccatat gcttgatgcc atttcatcca ccctgctttg attctatggc 5460

taacatcttc attaatatcc tcgcctctct gtatcattgg tcctaaatat ggaaatacat 5520

tctttctggg cactacttga ccttccaaac taacgtctcc tttgctcctt tcttgtgtgt 5580

agtagtaccg aagtcacatc tcatatattc ggttttagtt ctactaagtc ccgggttcga 5640

tccccctcag gggtgaattt cgggcttggt aaaaaaaatc ccctcgctgt gtcccgcccg 5700

ctctcgggga tcgatatcct gcgcgccacc ctccggctgg gcattgcaga gtgagcagtt 5760

gatcggctcg ttagtgatgg ggagcggggt tcaagggttt tctcggccgg gaccatgttt 5820

cggtctctta atataatgcc gggagggcag tctttccctc cccggtcgag ttttagttct 5880

accgagtcta aaacctttgg actctagagt cccctgtcac aactcacaac tctagttttc 5940

tatttacttc tacctagcgt ttattaatga tcactatatc gtctgtaaaa agcatacacc 6000

aatgtaatcc ccttgtatgt cccttgtaat attatccatc acaagaaaaa aaggtaaggc 6060

tcaaagttga cttttgatat agtcctattc taatcgagaa gtcatctgta tcttcgtctc 6120

ttgttcgaac actagtcaca aaattttttg tacatgttct taatgagtcc aacgtaatat 6180

tccttgatat tttgtcataa gccctcatca agtcaatgaa aatcacgtgt aggtccttca 6240

tttgttcctt atactgctcc atcacttgtc tcattaagaa aatctctctc atagttaacc 6300

ttttggcatg aaacaaaatc acacagaagt tgtttccttt ttttaagatc ccacacaaaa 6360

gaggtttgat ctaaggaatc tggatccctg acaggtttat caaaatcctt tgtgtttttc 6420

ttaaaactga atattcctcc agcttctagt attgatgtaa tattcaatct gtttagcaag 6480

tgaacacctt ggttcttgtt gttactgtac cccccccccc cccccccccc cgaggcccag 6540

attaccacga catgaataca agaatattga acccagatct agagtttgtt tgtactgttg 6600

aaaatcggtg acaattcatt ttgttattgc gctttctgat aacgacagga ctccgtgatg 6660

atgggagcgg acacctatga aactgaagaa gaagcttcaa agctactgtt agctgggaag 6720

gtcccagttg gaataggaag gaacacaaag ataaggtgag tatggatgtg gaaccaccgg 6780

ttagttccca aaaatatcac tcactgatac ctgatggtat cctctgatta ttttcaggaa 6840

ctgtatcatt gacatgaatg ctaggattgg gaagaacgtg gtgatcacaa acagtaaggt 6900

gagcgagcgc acctacatgg gtgcagaatc ttgtgtgctc atctatccta attcggtaat 6960

tcctatccag cgctagtctt gtgaccatgg ggcatgggtt cgactctgtg acagggcatc 7020

caagaggctg atcacccgga agaagggtac tacataaggt ctggaatcgt ggtgatcttg 7080

aagaatgcaa ccatcaacga tgggtctgtc atatagatcg gctgcgtgtg cgtctacaaa 7140

acaagaacct acaatggtat tgcatcgatg gatcgtgtaa ccttggtatg gtaagagccg 7200

cttgacagaa agtcgagcgt tcgggcaaga tgcgtagtct ggcatgctgt tccttgacca 7260

tttgtgctgc tagtatgtac tgttataagc tgccctagaa gttgcagcaa acctttttat 7320

gaacctttgt atttccatta cctgctttgg atcaactata tctgtcatcc tatatattac 7380

taaattttta cgtgtttttc taattcggtg ctgcttttgg gatctggctt cgatgaccgc 7440

tcgaccctgg gccattggtt cagctctgtt ccttagagca actccaagga gtcctaaatt 7500

ttgtattaga tacgaaggac ttcagccgtg tatgtcgtcc tcaccaaacg ctctttttgc 7560

atagtgcagg ggttgtagac ttgtagccct tgtttaaaga ggaatttgaa tatcaaatta 7620

taagtattaa atatatattt aattaggtta acaaatttgg ctcgttttta gtctttattt 7680

atgtaattag ttttaaaaat agacctatat ttcaatacga aatatcatta acatcgata 7739

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸引物

<400>5

cgactcacta tagggagacc 20

<210>6

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸引物

<400>6

ccctatgagt aactg 15

<210>7

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸引物

<400>7

tatactcaat tacat 15

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸引物

<400>8

gtgccacctg acgtctaag 19

<210>9

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸引物

<400>9

cagagctgac acgtg 15

<210>10

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸引物

<400>10

aagctgatcg ccactc 16

Claims

1.编码突变的植物ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽或所述突变多肽的生物学活性片断的多核苷酸，其中所述突变多肽在所述多肽的氨基酸序列的2个或多个位点包含氨基酸突变，并且当所述突变多肽与ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亚基一起表达形成突变ADP-葡萄糖焦磷酸化酶时，所述突变酶或所述突变酶的生物学活性片断与野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶相比，展现出增强的热稳定性。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述突变酶展现出与仅具有单个氨基酸替代的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶相比基本上相同或较大的酶活性，所述单个氨基酸替代是在玉米野生型大亚基氨基酸序列的第333位由酪氨酸替代组氨酸。

3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第一氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第333位相对应的组氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中替代第333位组氨酸的氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷胺酰胺。

5.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中替代第333位组氨酸的氨基酸为酪氨酸。

6.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中替代第333位组氨酸的氨基酸为苯丙氨酸。

7.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中替代第333位组氨酸的氨基酸为甲硫氨酸。

8.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第一氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第177位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

9.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中替代第177位丙氨酸的氨基酸为脯氨酸。

10.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中替代第177位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

11.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第一氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第396位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

12.根据权利要求11所述的多核苷酸，其中替代第396位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

13.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第二氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第177位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

14.根据权利要求13所述的多核苷酸，其中替代第177位丙氨酸的氨基酸为脯氨酸。

15.根据权利要求13所述的多核苷酸，其中替代第177位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

16.根据权利要求4所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第二氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第177位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

17.根据权利要求16所述的多核苷酸，其中替代第177位丙氨酸的氨基酸为脯氨酸。

18.根据权利要求16所述的多核苷酸，其中替代第177位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

19.根据权利要求5所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第二氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第177位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

20.根据权利要求19所述的多核苷酸，其中替代第177位丙氨酸的氨基酸为脯氨酸。

21.根据权利要求19所述的多核苷酸，其中替代第177位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

22.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第二氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第177位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

23.根据权利要求22所述的多核苷酸，其中替代第177位丙氨酸的氨基酸为脯氨酸。

24.根据权利要求22所述的多核苷酸，其中替代第177位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

25.根据权利要求7所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第二氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第177位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

26.根据权利要求25所述的多核苷酸，其中替代第177位丙氨酸的氨基酸为脯氨酸。

27.根据权利要求25所述的多核苷酸，其中替代第177位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

28.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第二氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第396位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

29.根据权利要求28所述的多核苷酸，其中替代第396位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

30.根据权利要求4所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第二氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第396位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

31.根据权利要求30所述的多核苷酸，其中替代第396位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

32.根据权利要求5所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第二氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第396位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

33.根据权利要求32所述的多核苷酸，其中替代第396位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

34.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第二氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第396位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

35.根据权利要求34所述的多核苷酸，其中替代第396位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

36.根据权利要求7所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第二氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第396位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

37.根据权利要求36所述的多核苷酸，其中替代第396位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

38.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第二氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第396位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

39.根据权利要求38所述的多核苷酸，其中替代第396位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

40.根据权利要求9所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第二氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第396位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

41.根据权利要求40所述的多核苷酸，其中替代第396位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

42.根据权利要求10所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第二氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第396位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

43.根据权利要求42所述的多核苷酸，其中替代第396位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

44.根据权利要求13所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第三氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第396位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

45.根据权利要求44所述的多核苷酸，其中替代第396位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

46.根据权利要求14所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第三氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第396位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

47.根据权利要求46所述的多核苷酸，其中替代第396位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

48.根据权利要求15所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第三氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第396位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

49.根据权利要求48所述的多核苷酸，其中替代第396位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

50.根据权利要求16所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第三氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第396位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

51.根据权利要求50所述的多核苷酸，其中替代第396位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

52.根据权利要求17所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第三氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第396位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

53.根据权利要求52所述的多核苷酸，其中替代第396位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

54.根据权利要求18所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第三氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第396位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

55.根据权利要求54所述的多核苷酸，其中替代第396位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

56.根据权利要求19所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第三氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第396位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

57.根据权利要求56所述的多核苷酸，其中替代第396位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

58.根据权利要求20所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第三氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第396位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

59.根据权利要求58所述的多核苷酸，其中替代第396位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

60.根据权利要求21所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第三氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第396位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

61.根据权利要求60所述的多核苷酸，其中替代第396位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

62.根据权利要求22所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第三氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第396位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

63.根据权利要求62所述的多核苷酸，其中替代第396位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

64.根据权利要求23所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第三氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第396位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

65.根据权利要求64所述的多核苷酸，其中替代第396位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

66.根据权利要求24所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第三氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第396位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

67.根据权利要求66所述的多核苷酸，其中替代第396位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

68.根据权利要求25所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第三氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第396位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

69.根据权利要求68所述的多核苷酸，其中替代第396位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

70.根据权利要求26所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第三氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第396位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

71.根据权利要求70所述的多核苷酸，其中替代第396位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

72.根据权利要求27所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽包含第三氨基酸突变，所述突变为：与玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第396位相对应的丙氨酸被能够赋予所述突变酶增强的热稳定性的氨基酸替代。

73.根据权利要求72所述的多核苷酸，其中替代第396位丙氨酸的氨基酸为缬氨酸。

74.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变多肽还包含可使表达该多核苷酸的植物具有增加的种重的氨基酸突变。

75.根据权利要求74的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含Rev6突变。

76.根据权利要求74的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码AGP酶大亚基，在该大亚基中，在与具有天然AGP酶亚基的玉米的野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第494和495位相对应的氨基酸之间插入至少一个丝氨酸残基。

77.根据权利要求74的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码AGP酶大亚基，在该大亚基中，在与具有天然AGP酶亚基的玉米的野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第494和495位相对应的氨基酸之间插入氨基酸对酪氨酸：丝氨酸。

78.根据权利要求74的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码AGP酶大亚基，在该大亚基中，在与具有天然AGP酶亚基的玉米的野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基多肽氨基酸序列第495和496位相对应的氨基酸之间插入氨基酸对丝氨酸：酪氨酸。

79.增强植物抵抗热胁迫条件的抗性的方法，所述方法包括将多核苷酸掺入所述植物并表达由所述多核苷酸编码的蛋白质，其中所述多核苷酸选自：权利要求1的多核苷酸、权利要求2的多核苷酸、权利要求3的多核苷酸、权利要求4的多核苷酸、权利要求5的多核苷酸、权利要求6的多核苷酸、权利要求7的多核苷酸、权利要求8的多核苷酸、权利要求9的多核苷酸、权利要求10的多核苷酸、权利要求11的多核苷酸、权利要求12的多核苷酸、权利要求13的多核苷酸、权利要求14的多核苷酸、权利要求15的多核苷酸、权利要求16的多核苷酸、权利要求17的多核苷酸、权利要求18的多核苷酸、权利要求19的多核苷酸、权利要求20的多核苷酸、权利要求21的多核苷酸、权利要求22的多核苷酸、权利要求23的多核苷酸、权利要求24的多核苷酸、权利要求25的多核苷酸、权利要求26的多核苷酸、权利要求27的多核苷酸、权利要求28的多核苷酸、权利要求29的多核苷酸、权利要求30的多核苷酸、权利要求31的多核苷酸、权利要求32的多核苷酸、权利要求33的多核苷酸、权利要求34的多核苷酸、权利要求35的多核苷酸、权利要求36的多核苷酸、权利要求37的多核苷酸、权利要求38的多核苷酸、权利要求39的多核苷酸、权利要求40的多核苷酸、权利要求41的多核苷酸、权利要求42的多核苷酸、权利要求43的多核苷酸、权利要求44的多核苷酸、权利要求45的多核苷酸、权利要求46的多核苷酸、权利要求47的多核苷酸、权利要求48的多核苷酸、权利要求49的多核苷酸、权利要求50的多核苷酸、权利要求51的多核苷酸、权利要求52的多核苷酸、权利要求53的多核苷酸、权利要求54的多核苷酸、权利要求55的多核苷酸、权利要求56的多核苷酸、权利要求57的多核苷酸、权利要求58的多核苷酸、权利要求59的多核苷酸、权利要求60的多核苷酸、权利要求61的多核苷酸、权利要求62的多核苷酸、权利要求63的多核苷酸、权利要求64的多核苷酸、权利要求65的多核苷酸、权利要求66的多核苷酸、权利要求67的多核苷酸、权利要求68的多核苷酸、权利要求69的多核苷酸、权利要求70的多核苷酸、权利要求71的多核苷酸、权利要求72的多核苷酸、权利要求73的多核苷酸。

80.根据权利要求79所述的方法，其中所述植物为单子叶植物。

81.根据权利要求80所述的方法，其中所述单子叶植物选自水稻、小麦、大麦、燕麦、高粱、玉米、百合和粟。

82.根据权利要求79所述的方法，其中所述植物为玉米。

83.根据权利要求79所述的方法，其中所述植物为双子叶植物。

84.根据权利要求83所述的方法，其中所述双子叶植物选自豌豆、紫花苜蓿、鹰嘴豆、菊苣、三叶草、羽叶甘蓝、兵豆、北美雀麦、大豆、烟草、马铃薯、甘薯、萝卜、甘蓝、油菜、苹果树和莴苣。

85.植物或植物组织，其含有选自如下的多核苷酸：权利要求1的多核苷酸、权利要求2的多核苷酸、权利要求3的多核苷酸、权利要求4的多核苷酸、权利要求5的多核苷酸、权利要求6的多核苷酸、权利要求7的多核苷酸、权利要求8的多核苷酸、权利要求9的多核苷酸、权利要求10的多核苷酸、权利要求11的多核苷酸、权利要求12的多核苷酸、权利要求13的多核苷酸、权利要求14的多核苷酸、权利要求15的多核苷酸、权利要求16的多核苷酸、权利要求17的多核苷酸、权利要求18的多核苷酸、权利要求19的多核苷酸、权利要求20的多核苷酸、权利要求21的多核苷酸、权利要求22的多核苷酸、权利要求23的多核苷酸、权利要求24的多核苷酸、权利要求25的多核苷酸、权利要求26的多核苷酸、权利要求27的多核苷酸、权利要求28的多核苷酸、权利要求29的多核苷酸、权利要求30的多核苷酸、权利要求31的多核苷酸、权利要求32的多核苷酸、权利要求33的多核苷酸、权利要求34的多核苷酸、权利要求35的多核苷酸、权利要求36的多核苷酸、权利要求37的多核苷酸、权利要求38的多核苷酸、权利要求39的多核苷酸、权利要求40的多核苷酸、权利要求41的多核苷酸、权利要求42的多核苷酸、权利要求43的多核苷酸、权利要求44的多核苷酸、权利要求45的多核苷酸、权利要求46的多核苷酸、权利要求47的多核苷酸、权利要求48的多核苷酸、权利要求49的多核苷酸、权利要求50的多核苷酸、权利要求51的多核苷酸、权利要求52的多核苷酸、权利要求53的多核苷酸、权利要求54的多核苷酸、权利要求55的多核苷酸、权利要求56的多核苷酸、权利要求57的多核苷酸、权利要求58的多核苷酸、权利要求59的多核苷酸、权利要求60的多核苷酸、权利要求61的多核苷酸、权利要求62的多核苷酸、权利要求63的多核苷酸、权利要求64的多核苷酸、权利要求65的多核苷酸、权利要求66的多核苷酸、权利要求67的多核苷酸、权利要求68的多核苷酸、权利要求69的多核苷酸、权利要求70的多核苷酸、权利要求71的多核苷酸、权利要求72的多核苷酸、权利要求73的多核苷酸。

86.根据权利要求85所述的植物或植物组织，其中所述植物或植物组织为单子叶的。

87.根据权利要求86所述的植物或植物组织，其中所述单子叶植物或植物组织选自水稻、小麦、大麦、燕麦、高粱、玉米、百合和粟。

88.根据权利要求85所述的植物或植物组织，其中所述植物为玉米，或所述植物组织来自玉米。

89.根据权利要求85所述的植物或植物组织，其中所述植物或植物组织为双子叶的。

90.根据权利要求89所述的植物或植物组织，其中所述双子叶植物或植物组织选自豌豆、紫花苜蓿、鹰嘴豆、菊苣、三叶草、羽叶甘蓝、兵豆、北美雀麦、大豆、烟草、马铃薯、甘薯、萝卜、甘蓝、油菜、苹果树和莴苣。

91.根据权利要求85所述的植物组织，其中所述植物组织为种子。

92.由权利要求1的多核苷酸编码的突变淀粉生物合成蛋白质。

93.增强植物特征的方法，其中所述植物特征选自种子数目、植物生物量、收获指数、旗叶重、结种花序以及总种重，所述方法包括向所述植物的基因组中掺入权利要求75所述的多核苷酸，并表达由所述多核苷酸分子编码的蛋白质。