CN1127016A

CN1127016A - 提高贮存马铃薯质量的方法

Info

Publication number: CN1127016A
Application number: CN94192717.2A
Authority: CN
Inventors: G·F·巴里; G·M·吉索尔; D·M·施塔克; J·C·扎卢斯基
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1993-05-28
Filing date: 1994-05-18
Publication date: 1996-07-17
Also published as: EP0701618A1; PL178628B1; JPH08510645A; US5648249A; HUT73468A; AU687409B2; AU6947394A; WO1994028149A1; HU9503394D0; PL311755A1; PL180247B1; CA2162383A1

Abstract

一种提高贮存在降低温度下的马铃薯质量的方法和一种延长贮存马铃薯块茎休眠期的方法，包括提高贮存在环境温度或降低温度期间的马铃薯块茎中的ADP葡萄糖焦磷酸化酶的活性。提供新的DNA分子、作物细胞和马铃薯作物，其中ADP葡萄糖焦磷酸化酶的基因是在冷诱导启动子控制下。

Description

提高贮存马铃薯质量的方法

马铃薯的长期贮存特性代表着块茎质量的一个主要因素。保持马铃薯质量的关键是休眠期(收获后和发芽前的这段时间)。商业上，马铃薯在加工前要放很长时间(长至10个月或更长)，温度一般在2-10℃。与在7～12℃下贮存相比，冷却贮存(2-6℃)具有最好的长期环境：降低呼吸、减少水份损失和微生物侵染，需要的化学发芽抑制剂也较少(Burton，1989)。可见，低温产生冷诱导的甜化作用，所产生的高糖值导致在炸制产品中将出现不能接受的褐色(Coffin等人，1987，Weaver等人，1978)。积累的糖主要是葡萄糖、果糖和蔗糖，在各种烹煮包括炸制过程中，加热时，主要是还原糖(主要是葡萄糖和果糖)与自由氨基通过美拉德反应(Maillardreactin)形成褐色素(Burton，1989，Sballenberger等人，1959)。另外，蔗糖在炸制中由于对焦糖化作用或焦化反应敏感而产生黑色素。还原糖量超过新鲜重量的0.2％就足以形成褐色素。从而妨碍了某些型式的加工。如果糖量不是明显高于限量0.2％，马铃薯加工者可通过昂贵且费时的漂烫方法降低糖量。在较高的温度(18℃)下，可以对马铃薯进行重调节降低糖含量，但是经常在此温度下糖量还没有降到足够低就开始发芽，所以要利用化学发芽抑制剂(Ryall和Lipton，1979，Hardenburg等人，1986)。然而，重调节需要增加贮存设备，这影响到产品的最后价格。此外，已有表明长期贮存后的重调节无效(Coffin等人，1987)。过多使用化学品对环境和身体感觉带来不利的影响，以及目前的发芽抑制剂不久可能被禁用，因此，现在需要具有以下特点的马铃薯品种：在不用化学品的情况下经得起长期冷贮存，没有还原糖的积累，较大程度地保留淀粉量。

贮存较长时间后，发芽的马铃薯块茎带来以下问题：大量的发芽降低了市场价值，块茎中生物碱的量可能提高。

通过基因工程的方法已经获得淀粉量明显提高的马铃薯块茎。参见91年6月7日申请的WO 91/19806(Kishore)和U.S.S.N.07/709,663，所述专利申请并入本文作为参考文献。在这些块茎中表达了一种基因，这种基因编码ADP葡萄糖焦磷酸化酶(ADPGPP)，此酶催化淀粉和糖原的生物合成中的一个关键步骤。优选的基因来自E.coli，所得的酶不好调节，这是高活性的变异体。以块茎特异性方式如由I类贮存蛋白(patatin)启动子表达这种基因的突变体glgC16时，淀粉量比收获时非转基因对照块茎的淀粉量高。

在作物细胞中，碳水化合物代谢是一个复杂的过程。在冷贮存中，人为干预许多不同的反应可能影响还原糖的积累，例如，糖类可以重新合成淀粉，由此影响游离糖发生还原反应。其它的方法是通过降低糖含量也能提高马铃薯的冷贮存性能，包括抑制淀粉水解，通过糖原酵解去除糖，或把糖转变成不参与美拉德反应的其它形式。这些方法的难点是：要确定达到希望结果的活性，获得低温性能，还要保留马铃薯种植者，加工者和消费者都满意的产品质量。

有人提出磷酸果糖激酶(PFK)在冷诱导甜化过程中起重要的作用(Kruger和Hammond，1988，ap Rees等人，1988，Dixon等人，1981，Claassen等人，1991)。ap Rees等人(1988)指出，冷处理对碳水化合物代谢中不同途径的影响不平衡，因为PFK的冷不稳定性使糖原酵解急剧降低。PFK活性的降低提高了蔗糖产生中磷酸己糖的获得量。另外，支持这一观点的理由还来自对含有冷稳定PFK的马铃薯新繁殖克隆的观察，在冷却情况下没有明显糖量的积累。

最近，欧洲专利申请0438904披露：在贮存中通过去除糖原酵解和进一步代谢中的己糖，提高PFK活性降低了糖的积累。来自E.coli的PFK酶在马铃薯块茎中表达，报告声称提高了PFK活性，降低了收获时受试块茎中的蔗糖含量。但是，已经表明在低温下焦磷酸：果糖6-磷酸磷酸转移酶(PFP)保持活性(Claassen等人，1991)。PFP活性正如PFK一样为糖原酵解提供了果糖6-磷酸，因为这两个酶催化相同的反应。因此，这种方法在提高马铃薯冷贮存质量方面的有效性还令人怀疑。此外，去除糖原酵解和进一步代谢中的糖不是提高马铃薯块茎贮存性能的优选方法，因为通过呼吸作用损失了有效干物质的含量。糖重新合成淀粉或减慢淀粉的破坏是优选的方法，因为保留了干物质。

本发明的一个目的是提供一种降低马铃薯块茎中的糖量和提高贮存马铃薯质量的方法。本发明的另一个目的是提高经低温贮存后改善了再调节速度和程度的马铃薯。本发明还有一个目的是提供在环境温度或降低的温度下延长贮存马铃薯的体眠期的方法。

发明概述

本发明提供一种提高低温下贮存马铃薯质量的方法，包括在贮存期间在降低的温度下提高马铃薯块茎中的ADP葡萄糖焦磷酸化酶(ADPGPP)的活性。本发明还提供一种方法：即在冷贮存过程中通过提高ADPGPP酶活性来降低贮存在降低温度下的马铃薯块茎中的糖量。还提供了一种延长贮存马铃薯的休眠期的方法，包括提高贮存期间所述ADPGPP酶活性。

本方法优选通过以下步骤完成：

(a)将重组的双链DNA分子插入到马铃薯作物细胞的基因组，所述双链DNA分子包括：

(i)一个作用于作物的启动子，其在靶作物组织中引导产生一个RNA序列，

(ii)引导产生RNA序列的一个结构DNA序列，此RNA序列编码包括氨基端质体传输肽和ADP葡萄糖焦磷酸化酶的融合多肽，

(iii)一个作用于作物细胞的3′非转译DNA序列，引导转录终止和聚腺苷酸化的核苷酸加到RNA序列的3′端；

(b)获得转化的作物细胞；和

(c)由转化过的作物细胞再生经遗传转化成具有改善冷贮存性能的马铃薯作物。

本发明提供了新的重组体DNA分子、作物细胞和再生的马铃薯作物，其中(a)(i)的启动子是冷诱导的启动子，例如来自马铃薯或拟南芥属(Arabidopsis)。这些再生的马铃薯作物用于本发明的所有方法中。

优选的ADP葡萄糖焦磷酸化酶(ADPGPP)来自E.coli，称作glgC，其基因序列以下表示为SEQ ID NO：1，其氨基酸序列表示为SEQID NO：2。更优选的ADPGPP酶是突变体ADPGPP，即glgC16，其基因序列以下表示为SEQ ID NO：3，其氨基酸序列以下表示为SEQ IDNO：4。在缺少激活剂果糖1，6-二磷酸(FBP)时发现此突变体对底物有较高的亲和性，降低FBP浓度能达到1/2最大量的活性。

本发明所用的术语“提高贮存马铃薯质量”，或其变化说法，是指提供这样的马铃薯：贮存后糖量降低、极少或不损失淀粉、降低发芽的发生率和/或加强再调节的速度或程度。

本发明所用的术语“冷贮存”或“在降低温度下贮存”，或它们的变化说法是指保持在小于或等于15℃的温度下，这可以通过致冷或环境温度达到。

本发明所用的术语“冷诱导启动子”是指这样一个DNA碱基序列：在温度等于或小于15℃时用一条DNA链作为模板启动mRNA的转录产生相应互补的一条RNA链。

本文所用的术语“延长休眠期”或其变化的说法是指延缓呼吸的启动和块茎发芽。

本文所用的术语“glgC16马铃薯”、“glgC16块茎”、“glgC16品系”或它们的变化说法是指这样的马铃薯品系或其产生的块茎：它们是用下述的一个质体终端传输肽的融合体优选CTP转化了的。

附图简要说明

图1表示作物转化载体pMON17316的质粒图谱。

图2表示作物转化载体pMON17279的质粒图谱。

本发明的详细说明

淀粉磷酸化酶和淀粉分解酶决定着冷贮存期间淀粉的降解，它们作用的结果是由淀粉形成1-磷酸葡萄糖和/或葡萄糖。葡萄糖可转化成1-磷酸葡萄糖，并作为ADPGPP酶的一种底物，因而也是在表达这一酶的块茎中生物合成淀粉的底物。利用转化酶或蔗糖合成酶从蔗糖的降解产物也可以形成1-磷酸葡萄糖。由于转化酶的作用，在贮存期间主要积累还原糖而不是蔗糖(Pressey，1966)。由活性转化酶释放的葡萄糖和果糖也可以作为生物合成淀粉底物的前体。

ADPGPP的表达是衡量冷诱导甜化作用的有效方法。假设在冷贮存期间维持淀粉的生物合成，就会对己糖量有连续的要求，这样，糖的积累量减少，因此块茎就适合于加工处理。但是，其它机制也影响ADPGPP的作用。另外，也可以通过保持低糖量以及延缓呼吸的启动和发芽来完成贮存在任何温度下的马铃薯休眠期的延长。

为实施上述方法，在马铃薯作物的基因组中掺入一个表达ADPGPP的基因。这个基因可以和调节马铃薯中淀粉和/或糖代谢/分解代谢的其它基因结合(有意义或反义方向)，例如：磷酸果糖激酶(EPO438 904)、α-和β-淀粉酶、蔗糖磷酸合成酶、己糖激酶、淀粉磷酸化酶、脱支酶或葡糖磷酸变位酶。这些其它的基因可以来自作物、微生物或动物。

另一方面，诱变马铃薯克隆可以使贮存块茎中的ADPGPP量提高，由此提高ADPGPP酶活性水平。选择这种块茎的基础是显示比活性增加、Vmax提高、负效应物(Pi)的抑制作用降低或为达到最大活性而对激活剂(3-PGA)产生的依赖性降低。

表达以双链DNA形式存在的作物基因包括，借助RNA聚合酶从一条DNA链转录信息RNA(mRNA)，然后在核中进行mRNA初级转录物的后续加工。这个加工过程涉及3′端非转译区域，聚腺苷酸化的核苷酸由此加到RNA的3′端。

DNA到mRNA的转录由常被称作“启动子”的DNA区域调节。该启动子区含有一段碱基序列，其发出信号使RNA聚合酶与所说DNA相联系，并启动用一条DNA链作为模板的mRNA转录，得到一条相应互补的RNA链。

文献中已经记载了许多在作物细胞中有活性的启动子。这些启动子包括胭脂碱合酶(NOS)和章鱼碱合酶(OCS)启动子[由根癌土壤杆菌肿瘤诱导性质粒携带]，花椰菜花叶病毒启动子例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S和玄参花叶病毒35S-启动子，来自小亚基的核酮糖1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO，大量的作物多肽)的光诱导性启动子和叶绿素a/b结合蛋白质基因启动子等。所有这些启动子已用来产生在作物中表达的各种DNA构建体，例如参见PCT公开WO 84/02913。

用于下面实施例1和2中的I类贮存蛋白启动子已表现出高活性和块茎特异性(Bevan等人，1986；Jefferson等人，1990)。已知具有块茎特异性或增强表达的许多其它基因，包括马铃薯块茎ADPGPP基因、大或小亚基(Muller等人，1990)、蔗糖合酶(Salanoubat和Belliard，1987，1989)、主要块茎蛋白质包括22kd蛋白质复合体和蛋白酶抑制剂(Hannapel，1990)颗粒结合的淀粉合酶基因(GBSS)(Rohde等人，1990)和其它I类和II类贮存蛋白(Rocha Sosa等人，1989；Mignery等人，1988)。能考虑用于本发明的其它启动子包括：那些在马铃薯块茎中显示增强或特异表达的启动子，常和表达淀粉生物合成或修饰酶基因相关的启动子，或在马铃薯块茎中显示不同表达模式的启动子，它们具有例如在皮层或髓或表皮增强的表达，例如或是在块茎发育过程的不同时间表达。这些启动子的例子包括以下酶基因的启动子：粒结合的和其它淀粉合酶、分支酶(Kossmann等人，1991；Blennow，A.和Joharsson，G.，1991；WO 92/14827；WO 92/11375)；歧化酶(Takeha等人，1993)、脱支酶、淀粉酶、淀粉磷酸化酶(Nakano等人，1989；Mori等人，1991)、果胶酯酶(Ebbelaar等人，1993)，和40kD糖蛋白；泛激素，天冬氨酸蛋白酶抑制剂(Sukerli等人，1990)，羧肽酶抑制剂，块茎多酚氧化酶(Shahar等人，1992；GenBank^Accessi on Numbers M95196和M95197)，推断的胰蛋白酶抑制剂和其它块茎cDNA(Stiekema等人，1988)和β-淀粉酶和sporamins(来自Ipomoea batatas；Yoshida等人，1992；Ohta等人，1991)。

由各种马铃薯启动子表达细菌ADPGPP的方法已由Kishore公开在PCT申请WO 91/19806中，结果提高了马铃薯块茎中的淀粉含量。

本发明不需要以淀粉含量高的块茎来达到在冷贮存期间降低还原糖积累的目的。在马铃薯中glgC16基因可以由一个冷诱导性启动子表达，因此glgC16酶仅存在于贮存条件下。这种酶的存在保持贮存期间淀粉的生物合成，从而防止糖积累。

有很多包括作物启动子的冷诱导性启动子例子(Yamaguchi-Shinozaki等人，1993；Qoronfleh等人，1992；Miner等人，1992；Houde等人，1992；White等人，1992；Huang等人，1987；Murata等人，1992；Gilmour等人，1992；Hajela等人，1990；和Kurkela等人，1990)。分离马铃薯块茎中的冷诱导性蛋白质已被证实(van Berkel等人，1991；van Berkel等人，1994)。引发冷诱导性表达这些蛋白质的启动子能用现有技术中的方法分离。一种方法是由冷刺激的块茎产生cDNA文库，然后通过与非冷刺激的文库的不同杂交反应来鉴定冷特异的克隆。利用扣除文库可以更有效地运用这种方法，其中在构建过程从文库中去除以非冷特异性方式表达的克隆。对从这些调节的转录物衍生的cDNA核苷酸序列进行检测这也将促使相应的启动子区域分离。作为大量马铃薯块茎冷调节的转录物，这些cDNA序列是已知的(van Berkel等人，1994)，然后用鉴定为冷特异性的cDNA探针从基因组克隆鉴定启动子片段。这些冷调节的启动子已被鉴定并测序(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki，1994，和Baker，1994)。启动子片段可用来指导以冷调节方式表达E.coli glgC16基因。几种其它ADPGPP酶中的一种可以由这种启动子表达，以影响冷贮存马铃薯块茎的糖浓度，由此提高块茎质量。利用杂合启动子或不同启动子调节元件的融合体也能提高冷调节启动子的表达水平，或对所需要作物器官的表达更具特异性。现在已经描述过冷调节的基因，其中的表达优先在不同的组织中(Zhu等人，1993)或其中的基因经冷调节比经其它刺激作用调节更具有特异性(Wilhelm和Thomashow，1993；Nordin等人，1993)。另外，长度从9个碱基对到几百个碱基对的特异限定的序列表现出控制启动子对不同冷作用和其它刺激作用如脱落酸水平和干旱刺激的反应性(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki，1994)。优先在块茎中表达的启动子是已知的，这一优先表达所必要的这些启动子的区域也已确定(Jefferson等人，1990；Liu等人，1990)。这些技术资料使得能在来自启动子的小的冷反应元件如来自coF78、cor15a或cor15b的元件和贮存蛋白启动子间构建融合体。融合发生在贮存蛋白启动子的-500～-2000bp区域。当今的分子遗传技术包括聚合酶链反应和定位诱变和便利地合成寡核苷酸，这些技术使上述融合成为可能。

与ADPGPP基因一起使用氨基端质体传输肽需把酶传输到发生淀粉合成反应的质体上。另外，可以省略这个传输肽，而将所述基因插入到存在于质体中的DNA。用Svab等人(1990)描述的方法可完成叶绿体的转化。经诱变制备改变的ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因

本领域的技术人员将认识到，在不是绝对需要时，利用ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因可以得到增强的效果，在保持足够的催化活性情况下，这种基因受到降低的变构调节作用(“去调节的”)且较优选不受显著水平的变构调节作用(“不调节的”)。在E.coli或其它合适的宿主中可对细菌或作物ADP葡萄糖焦磷酸化酶的结构编码序列进行诱变，再对提高了糖原产量，如对所述的E.coli的glgC16基因进行筛选。应意识到，利用编码ADP葡萄糖焦磷酸化酶的基因无需进行酶(基因)修饰，该ADP葡萄糖焦磷酸化酶仅接受以不显著抑制催化活性的水平存在于被选择作物中调节剂(激活剂/抑制剂)的作用。然后，这些“不调节的”或“去调节的”ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因插入本文所述的作物中，得到淀粉含量提高的转基因作物。

例如，任何ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因能克隆到E.coli B菌株AC7OR1-504(Leung，1986)中。这个菌株有缺损的ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因，对于其它糖原生物合成酶去阻遏5-7倍。ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因/cDNA可以放在质粒上，位于E.coli glgC启动子或任何其它细菌启动子之后。然后，这个构建体进行定点或随机诱变。诱变后，将这些细胞涂布于含1％葡萄糖的富集培养基上。培养集落后，用碘溶液(0.2w/v％I₂、0.4w/v％KI溶于水，Creuzet Sigal，1972)浸没平板。与含有非突变E.coli的相似平板比较，借助更暗的染色能检测到产生较多糖原的集落。

因为诱变方法能产生启动子突变，所以，经第一轮筛选的任何推断的ADP葡萄糖焦磷酸化酶突变体必然有再次克隆到非突变载体的ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因，以相同的方法筛选所得的质粒。通过两轮筛选的突变体不论用和不用激活剂和抑制剂检测都具有ADP葡萄糖焦磷酸化酶活性。比较非突变的酶和突变的ADP葡萄糖焦磷酸化酶对激活剂和抑制剂的反应性，能够鉴定出新突变体的特征。

Plaxton和Preiss 1987年的报告说明玉米胚乳ADP葡萄糖焦磷酸化酶具有与其它作物ADP葡萄糖焦磷酸化酶相似的调节特性(Plaxton和Preiss 1987)。他们指出，较早的报告之所以说玉米胚乳ADP葡萄糖焦磷酸化酶在没有激活剂(3-PGA)时活性提高并且对抑制剂(Pi)的敏感性降低，是因为分离操作过程中酶的蛋白水解性裂解。借助改变ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因以产生蛋白水解性裂解的玉米胚乳ADP葡萄糖焦磷酸化酶的酶类似物，这将降低变构调节作用。

为测定E.coli液体培养物的ADP葡萄糖焦磷酸化酶活性，在离心机中旋转沉淀这些细胞，然后将每克细胞膏状物重悬于约2ml的提取缓冲液中(0.05M N-甘氨酰甘氨酸pH7.0，5.0mM DTE，1.0mMEDTA)。通过两次流经氟氏细胞压碎机对这些细胞进行裂解。这些细胞提取物在微型离心机中旋转5分钟，上清液流经G-50旋转柱脱盐。

测定合成ADP葡萄糖的酶是用已公开方法的改进方法(Haugen等人，1976)。每100μl试样，含有：10μmol Hepes pH7.7，50μg BSA，0.05μmol[¹⁴C]葡萄糖-1磷酸酯，0.15μmolATP，0.5μmol MgCl₂，0.1μg结晶酵母无机焦磷酸酶，1mM钼酸铵，酶，所需要的激活剂或抑制剂和水。在37℃保温此反应混合物10分钟，借助沸腾60秒停止反应。该试样在微离心机中旋转，40μl上清液注入Synchrom Synchropak AX-100阴离子交换HPLC柱。用65mM KPi pH5.5洗脱样品。在约7-8分钟洗脱出来反应的[¹⁴C]葡萄糖-1-磷酸酯，在约13分钟洗脱[¹⁴C]ADP葡萄糖。借助ADP葡萄糖峰中的放射活性量确定酶活性。

借助正效应子(3-磷酸甘油酸盐；3-PGA)和负效应子(无机磷酸盐；Pi)(Ghosh和Preiss，1966；Copeland和Preiss 1981；Sowokinos和Preiss 1982；Morell等人，1987；Plaxton和Preiss，1987、Preiss，1988)严密调节作物ADPGPP酶活性；3-PGA：Pi比值通过调整ADPGPP活性而在调节淀粉的生物合成中起很重要的作用(Santarius和Heber，1965；Heldt等人，1977；Kaiser和Bassham，1979)。作物ADPGPP酶是两个大/“收缩”(Shrunken)和两个小/“脆”(Brittle)亚基的异四聚体(Morell等人，1987；Lin等人，1988a，1988b：Hrishnan等人，1986：Okita等人，1990)，有充足的证据表明异四聚体是ADPGPP最活化的形式。支持这一结论的论据在于：分离出缺乏任一个亚基的作物“不含淀粉”的突变体(Tsai和Nelson，1966；Dickinson和Preiss，1969；Lin等人，1988a，1988b)以及发现小亚基的“ADPGPP”均四聚体仅有低酶活性的特征(Lin等人，1988b)。另外，对于两个亚基，所提及的效应子相互作用的残基已确定(Morell等人，1988)。酶的活化形式的直接论据和对纯化马铃薯酶所报告的动力学数据的进一步支持源于在E.coli中表达马铃薯ADPGPP活性和比较这种酶物质和来自马铃薯块茎酶的动力学特性(Iglesias等人，1993)。

鉴定和描述作物ADPGPP来调节酶变异体之特征的方法与分离E.coli glgC16和相关突变体(例如glgC-SG5和CL1136)的方法相似。对于大的亚基和小亚基而言，很多作物ADPGPP cDNA或这些cDNA的部分已由单子叶作物和双子叶作物克隆(Anderson等人，1989a；Olive等人，1989；Muller等人，1990；Bhave等人，1990；du Jardin和Berhin，1 991；Smith-White和Preiss，1992)。由作物cDNA以及所述的细菌cDNA编码的蛋白质表现出高度保守性(Bhave等人，1990)。特别是，已经鉴定出一个高保守区，也含有一些在酶功能和效应子互相反应中相关的残基(Morell等人，1988；du Jardin和Berhin，1991)。现在已分离出马铃薯块茎ADPGPP亚基基因的克隆。这些包括一个完整的小亚基基因和一个几乎完整的大亚基基因，其中小亚基基因是由用将近全长的相同基因的cDNA克隆加入来自基因组克隆的第一外显子的序列组装起来的。装配的小亚基基因的核苷酸序列(SEQ IDNO：7)和氨基酸序列(SEQ ID NO：8)记载于下文。这里提到的核苷酸序列不同于以下述方法最初分离到的基因，这些方法是：利用寡核苷酸引物序列GTTGATAACAAGATCTGTTAACCATGGCGGCTTCC(SEQ ID NO：11)借助定位诱变在ATG密码子处引入BglII＋NcoI位点以促使所述基因克隆进E.coli和作物表达载体。用寡核苷酸引物序列CCAGTTAAAACGGAGCTCATCAGATGATGATTC(SEQ ID NO：12)在终止密码子处引入SacI位点。SacI位点作为3′克隆位点。用寡核苷酸引物序列GTGTGAGAACATAAATCTTGGATATGTTAC(SEQ ID NO：13)除去内部BglII位点。在PrecA-gene 10L表达盒中，在recA启动子控制下，于E.coli中表达这个装配的基因(Wong等人，1988)，产生可测量水平的蛋白质。利用寡核苷酸引物序列GAATTCACAGGGCCATGGCTCTAGACCC(SEQ ID NO：14)借助定位诱变放置一个起始蛋氨酸密码子以表达成熟的基因。

几乎完整的大亚基基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)和氨基酸序列(SEQ ID NO：10)如下文所示。利用寡核苷酸引物序列AAGATCAAACCTGCCATGGCTTACTCTGTGATCACTACTG (SEQ IDNO：15)借助定位诱变在成熟的N端上放置一个起始蛋氨酸密码子。起始蛋氨酸的作用是促使E.coli中的这个大亚基基因表达。HindIII位点位于终止密码子后的103bp处，且作为3′克隆位点。用5′RACE方法(Rapid Amplification of cDNA Ends；Frohman，1990；Frohman等人，1988；Loh等人，1989)分离完整的大ADPGPP基因。用于这种方法的寡核苷酸引物表示如下：1)GGGAATTCAAGCTTGGATCCCGGGCCCCCCCCCCCCCCC(SEQ ID NO：16)；2)GGGAATTCAAGCTTGGATCCCGGG(SEQ ID NO：17)；and3)CCTCTAGACAGTCGATCAGGAGCAGATGTACG(SEQ ID NO：18).前两个分别等同于Loh等人(1989)的ANpolyC和AN引物，第三个引物反向互补于大ADPGPP基因中的序列。EcoRI/HindIII/BamHI-PstI片段被克隆PCR 5′序列产物，它们容易用现有的基因部分装配。

鉴定ADPGPP弱调节的酶突变体，先对来自显示糖原合成增加的诱变E.coli培养物的集落划线，在含有1％葡萄糖的Luria-琼脂平板上用碘染集落24-48小时，然后再确定来自这些分离物的ADPGPP酶对这一活性的正负效应物的反应性特征(Cattaneo等人，1969；Preiss等人，1971)。采用相似的方法分离作物ADPGPP酶的这类变异体。而给出每一个亚基基因的表达系统对含有所述基因的培养物或纯化的DNA借助任一种已知的化学或物理方法(Miller，1972)分别进行每个基因的诱变。另一个方法是在有抑制性Mn⁺⁺离子存在的情况下对一个完整基因采用PCR法(Ehrlich，1989)，条件是产生大量掺入错误的核苷酸。PCR法也可以利用与刚好是所述基因的一个特异区邻接的引物，然后将这个诱变过的片段重新克隆进未诱变的基因段。随机合成寡核苷酸的方法也可以在合成反应中借助混合核苷酸用以产生基因的高度诱变短区，结果是在这一区的所有位置上发生掺入错误。这个小区的两侧是限制性位点。为的是把这一小区重新插入到基因的剩余部分。借助标准的碘方法筛选所得培养物或转化体，它们显示出糖原值比对照物高。优选的筛选方法是在仅有ADPGPP活性缺损的E.coli株中进行，其为表型上的糖原-，用glgC使与糖原+互补。E.coli菌株应保留产生糖原所需的其它活性。在相同的E.coli宿主中，通过把所述基因放在具有不同选择标记基因的相容性质粒上而使两种基因被一起表达。这些质粒在细菌宿主中有相似的拷贝数以最多地形成异四聚体。这种表达系统的一个例子是pMON17335和pMON17336的结合(Iglesias等人，1993)。使用不同的质粒能筛选一种基因的一种诱变群体，或在该基因转化到表达第二种基因的感受态宿主中后筛选两种基因的一种诱变群体，也可在相同宿主中将其结合之后筛选两种诱变群体。在碘染色增强的集落中重新分离质粒DNA之后，将ADPGPP编码序列再次克隆到表达载体中，检验表型并测试ADPGPP活性和其对效应物分子的反应。改进的变异体表现出Vmax提高，负效应子(Pi)的抑制作用降低或为达到最大活性而对激活剂(3-PGA)产生的依赖性。测定这些改进的特征包括Pi以0.045mM(I_0.5＝0.045mM)存在时或3-PGA以0.075mM(A_0.5＝0.075mM)存在时检测ADPGPP活性。有用的变异体在此浓度的Pi下表现出小于40％的抑制作用或在此浓度的3-PGA下表现出大于50％的活性。在分离改良的变异体并测定有反应的一个或多个亚基后，通过核苷酸测序检测突变体。借助定位诱变重新产生这一变化，并在激活或抑制剂存在下重新测定ADPGPP活性以证实所说的突变。然后，将该突变转移至相当的完整ADPGPP cDNA基因中，借助把含有来自被改变的细菌表达形式的变化之区域重新克隆到含有淀粉质体靶序列的作物形式，或借助于对完整的天然ADPGPP作物基因的定位诱变可完成上述转移。

实施例1构建用于glgC16表达的DNA载体

为在作物细胞中表达E.coli glgC16基因，且为使酶击靶到质体，所说基因需被融合至一个编码质体-击靶传输肽的DNA中(下文称作CTP/ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因)，并被融合至合适的作物调节区中。完成的方法是：把glgC16基因克隆至一系列含有所需序列的质粒载体中。

质粒pLP226在HincII片段上含有glgC16，其在HincII位点克隆至pUC8载体中(Leung等人，1986)。pLP226来自密什根州立大学的JackPreiss博士，它被转化到用氯化钙方法(Sambrook等人，1989)制备的冷冻感受态E.coli JM101细胞中。将已转化的细胞在含有100μg/mlα-氨基苄青霉素的2XYT(infra)平板上进行平板培养。从5ml过夜培养基中借助快速碱提取法(RAE)纯化质粒pLP226(Birnhoim和Doly，1979)。

为把glgC16基因融合到编码叶绿体传输肽的DNA中，在基因的5′端上需要一个NcoI位点。还需要终止密码子下游的SacI位点以把CTP/ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因移到下一个载体中。为了导入这些位点，利用大约20ng快速碱提取纯化的质粒pLP226作为模板进行PCR反应(^#13)。反应是根据生产者(Perkin Elmer Cetus)的建议完成的。引物是QSP3和QSP7。QSP3用于导入包括glgC16基因起始密码子的NcoI位点。将QSP7引物在glgC16基因的3′非转译区杂交并加入SacI位点。将热循环计设定(The Thermal Cycler)为30个循环，每个循环包括94℃变性步骤1分钟，50℃退火步骤2分钟，72℃延伸步骤3分钟。每一循环后延伸步骤增加15秒。QSP3引物：5′GGAGTTAGCCATGGTTAGTTTAGAG 3′(SEQ ID NO：19)QSP7引物：5′GGCCGAGCTCGTCAACGCCGTCTGCGATTTGTGC 3′(SEQ ID NO：20)

将PCR产物克隆至载体pGEM3zf+(Promega，Madison，WI)中，其已用SacI和HindIII酶切，并含有连接在HindIII位点的已经修饰的拟南芥属(Arabidopsis)小亚基CTP的DNA。该CTP的DNA序列和氨基酸序列分别表示在SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6中。

在56℃，用5单位的小牛肠碱性磷酸酶处理线性化的载体30分钟。将载体和具有含新NcoI和SacI位点的glgC16基因的PCR^#13片段放在琼脂糖凝胶上电泳，借助与DEAE膜的结合纯化这些片段。用DEAE膜纯化所说片段的方法是由Schleicher和Schuell提供的，标题为“Binding and Recovery of DNA and RNA Using S and SDEAE Membrance”。

连接物#5用pGEM3zf+将glgC16基因融合至已经修饰的拟南芥属SSU.CTP的DNA上。所说连接物含有3μl已用NcoI和SacI酶切的载体，以及3μl已用NcoI和SacI酶切并在凝胶上再纯化的PCR^#13产物。将总量为20μl中的5μl的连接物^#5转化到冷冻感受态JM101细胞中，将转化的细胞铺在含有α-氨基苄青霉素的2XYT平板上(16g/l细菌胰化胨，10g/l酵母提取物，10g/l NaCl，pH7.3，用1.5％琼脂固化)进行平板培养。

过夜生长后从平板上挑选出样品1。将该样品接种到4ml 2XYT介质中，在37℃生长过夜。经快速碱提取方法分离质粒，分别用EcoRI、NcoI以及EcoRI和NcoI酶切DNA。在琼脂糖凝胶上分离酶切物，观察到预期的片段。由样品1分离的质粒表示为pMON20100，由pGEM3zf+、已经修饰的拟南芥属SSU CTP的DNA和glgC16基因组成。融合是以允许其从SP6聚合酶的启动子进行转录的方向进行的。

为检测把ADP葡萄糖焦磷酸化酶引入到已分离的莴苣叶绿体中的构建体，需要将CTP/ADP葡萄糖焦磷酸化酶融合体转录和翻译，以制备[³⁵S]标记的ADP葡萄糖焦磷酸化酶。为制备借助SP6聚合酶进行转录的DNA模板，将pMON20100的CTP/ADP葡萄糖焦磷酸化酶区经PCR扩增产生大量的线性DNA。为此，将借助快速碱提取法纯化的大约0.1μl的pMON20100用作PCR反应#80的模板。引物是商业上可得到的SP6启动子引物(Promega)和Oligo QSP7(SEQ ID NO：20)。将SP6引物杂交至载体中SP6启动子上，且包括完整的SP6启动子序列。因此，用此寡核苷酸引导的PCR产物将含有SP6聚合酶的识别序列。QSP7(SEQ ID NO：20)引物将在glgC16基因的3′非转译区杂交。这和用来在glgC16终止密码子下游导入SacI位点的引物相同。设定热循环计(Thermal Cycler)为30个循环，每个循环包括于94℃变性1分钟、55℃退火2分钟和72℃延伸3分钟。每一循环后，增加15秒的延伸步骤。SP6启动子引物：5′GATTTAGGTGACACTATAG 3′(SEQ ID NO：21)

将5μl的PCR反应物^#80在琼脂凝胶上电泳，并经与DEAE膜结合纯化。洗脱所说DNA，将其溶解在20μl TE中。将2μl凝胶纯化的PCR^#80产物用于SP6 RNA聚合酶体外转录反应中。反应条件是提供人(Promega)描述的合成大量RNA(100μl的反应物)的条件。借助兔子网织红细胞溶胞系统(Promega)用PCR反应^#80DNA制得RNA进行体外翻译。如上所述，用来自pMON20100的³⁵S标记的蛋白质(即PCR反应物#80)进行体外叶绿体导入测定。处理叶绿体导入测定中的样品后，用3-17％聚丙烯酰胺梯度，在SDS-PAGE凝胶上对样品进行电泳。将凝胶在含40％甲醇和10％乙酸的溶液中固定20-30分钟。然后，将凝胶浸泡在EN³HNCE^TM中20-30分钟，接着在凝胶干燥器上干燥。利用增感屏以及使凝胶过夜曝光，通过放射自显影使凝胶显像，结果表明融合蛋白质被导入到分离的叶绿体中。

下一步将pMON20100中的构建体操作融合到增强CaMV35S启动子(Kay，R.1987)和由pMON999分离的NOS 3′端(Bevan，M.1983)上。PCR反应物114含有作为模板的质粒pMON20100并应用了引物QSM11和QSM10。QSM11退火至已经修饰的拟南芥属(Arabidopsis)SSUCTP的DNA上，形成了从ATG起始密码子的上游7bp处的一个BglII位点。QSM10退火至glgC16基因的3′端，紧接在终止密码子后加上一个XbaI位点，在终止密码子后5bp处加入一个SacI位点。早已加入到glgC16基因的SacI位点大约是在终止密码子下游100bp处。设定热循环计为25个循环，每个循环包括于94℃变性1分钟、55℃退火2分钟和72℃延伸步骤3分钟。每一循环后，增加15秒的延伸步骤。

QSM11引物(SEQ ID NO：22)：

5′AGAGAGATCTAGAACAATGGCTTCCTCTATGCTCTCTTCCGC 3′

QSM10引物(SEQ ID NO：23)：

5′GGCCGAGCTCTAGATTATCGCTCCTGTTTATGCCCTAAC 3′

将95μl(来自总体积100μl的)PCR反应物^#114经乙醇沉淀，并在20μl TE中重新悬浮。在37℃，用BglII(4单位)和SacI(10单位)过夜酶切5μl的上述物质。用同样的方法酶切5μl(5μg)含有增强CaMV35S启动子和NOS 3′端的载体pMON999。用限制酶酶切后，将DNA于琼脂糖凝胶上电泳，经与DEAE膜结合纯化。将每种DNA溶解在20μl TE中。在20μl的总体积中将1μl PCR114与3μl载体连接。在14℃温育连接混合物7小时。将10μl连接物转化到冷冻感受态的MM294细胞中，且铺板于含100μg/ml α-氨基苄青霉素的LB平板上(10g/l细菌胰化胨、5g/l酵母提取物、10g/l NaCl和1.5％固化用琼脂)。挑选克隆，接种到含100μg/ml N-氨基苄青霉素的有5ml LB介质的试管中，生长过夜。用5ml过夜培养物进行快速碱提取以分离质粒DNA。用EcoRI酶切DNA，分离的等分试样用NotI酶切。在琼脂糖凝胶上分析这些样品后，证实质粒pMON20102含有具有glgC16基因特征的497bp EcoRI片段，该质粒还含有具有增强CaMV35S启动子已经修饰的拟南芥属SSU CTP的DNA、glgC16基因和NOS 3′端的2.5kbNotI片段。

然后，用pMON20102质粒构建将以块茎特异性方式表达glgC16基因的DNA载体，该载体还将被用来转化马铃薯。这种构建导致了在马铃薯块茎中ADPGPP的特异表达，并提高了块茎中的淀粉含量。

用于马铃薯转化的载体是土壤杆菌介导作物转化载体pMON886的一个衍生物。pMON886质粒由以下已清楚表征的DNA片段组成。一个由转位子Tn7分离出的0.96kb片段，Tn7编码细菌放线壮观素/链霉素(Spc/Str)抗性，并且是在E.coli和根瘿土壤杆菌中筛选的决定因子(Fling等人，1985)。这个片段连接到遗传工程操作得到为进行作物表达的一个嵌合卡那霉素抗性基因上，以能够选择已转化的组织。这个嵌合基因的组成是0.35kb花椰菜花叶病素355启动子(P-35S)(Odell等人，1985)，0.83kb新霉素磷酸转换酶II型基因(NPTII)和0.26kb胭脂碱合酶基因的3′-非转译区(NOS3′)(Fraley等人，1983)。下一个片段是来自RK₂质粒的复制起始点0.75kb(ori-V)(Stalker等人，1981)。它连接到pBT322的3.1kbSalI至PvuI片段上，该片段提供用于在E.coli中维持的复制起始点<ori-322>和用于接合转入到根瘿土壤杆菌细胞的bom位点。再下一个片段是pTiT37质粒的0.36kb PvuI片段，其含有胭脂碱型T-DNA右界区(Fraley等人，1985)。

通过将glgC16基因置于块茎特异启动子控制之下的基因操作，使之在块茎中得到初步表达。glgC16蛋白质定向到作物细胞中的质体中，因为它作为C-末端与N-末端蛋白质部分的融合体合成，其编码来自拟南芥属thaliana SSU 1A基因序列的叶绿体击靶序列(CTP)(Timko等人，1989)。在导入过程中，去除CTP部分以释放glgC16酶。其它作物表达信号还包括3′-聚腺苷酸化的序列，其由位于表达盒的编码部分下游的NOS3′序列提供。这个表达盒按如下方法装配：作为HindIII-BamHI片段马铃薯贮存蛋白(patatin)启动子从pBI241.3质粒切下(pBI241.3质粒含有包括从1323处的AccI位点到2289处的DraI位点的马铃薯贮存蛋白(patatin)-1启动子片段[位置参见Bevan等人的序列，1986]且带有在前一位置加入的HindIII接头和在后一位置加入的BamHI接头；Bevan等人，1986)，并且与CTP1-glgC16融合体(pMON20102的BglII-SacI片段)和用HindIII同SacI消化的pUC-型质粒载体(载体中的这些克隆位点侧面有NotI识别位点)连接在一起。然后，作为pMON886中的NotI位点，这个表达盒被导入，从而使glgC16基因表达方向与NPTII(卡那霉素)基因表达的方向相同。这个衍生物称为pMON20113，在Kishore WO 91/19806的图7中得到说明。作物转化再生

用辅助质粒pRK2013，借助三亲株结合系统，把pMON20113载体移到解除抵御能力的根瘿土壤杆菌株中(Ditta等人，1980)。所用的解除抵御能力的菌株ABI载有Ti质粒，其借助去除引起根瘿病的作物激素基因而解除抵御能力。ABI株是载有解除抵御能力的pTiC58质粒pMP90RK的A208根瘿土壤杆菌(Koncz和Schell，1986)。解除抵御能力的Ti质粒提供在连入ABI株后自发复制pMON载体所需要的trfA基因功能。当作物组织与ABI∷pMON结合物一起培育时，借助由解除抵御能力的pMP90RK Ti质粒编码的vir功能，将载体转至作物细胞中。

按下述方法，把编码细菌ADPGPP基因(SEQ ID NO：1)的pMON20113构建体转化入Russet Burbank马铃薯品种Williams中。为了转化Russet Burbank马铃薯，将无菌Russet Burbank枝条培养物保持在圣代杯中，其中含有补充有25ml/L抗坏血酸的8ml PM培养基(Murashige和Skoog<MS>无机盐、30g/l蔗糖、0.17g/lNaH₂ PO₄H₂O、0.4mg.1硫胺素-HCl和100mg/l肌醇，在pH6.0用2g/l Gelrit固化)。每个枝条大约长5cm时，切出3-5mm茎节间段，并用来自4天陈旧平板培养物的根瘿土壤杆菌过夜培养物1∶10稀释液进行接种。于20℃，在载于1/10P培养基的1.5ml烟草细胞喂养层上放置的无菌滤纸上(1/10P培养基：1/10浓度MS无机盐和有机附加物且无酪蛋白<Jarret等人，1980>，30g/l蔗糖和8.0g/l琼脂)共同培养茎外植体2天。共同培养后，外植体转入全浓度P-1培养基以进行愈伤组织诱导，培养基包括MS无机盐、Jarret等人(1980)的有机附加物，除去酪蛋白，5.0mg/l玉米素核糖核苷(ZR)和0.10mg/l萘乙酸NAA(Jarret等人，1980a、1980b)。还含有羧苄青霉素(500mg/l)和头孢氨噻肟(100mg/L)以抑制细菌生长，且加入100mg/l卡那霉素以选择转化的细胞。

4星期后，外植体转到相同组分的培养基中，但用0.3mg/l赤霉酸(GA3)代替NAA(Jarret等人，1981)，目的是促使枝条形成。在转移至枝条诱导培养基后约2星期，枝条开始发育。切下这些枝条，移到PM培养基小瓶中生根。在生根培养基上约4星期后，把此作物转入土壤，其渐渐变得耐寒。检测枝条的新霉素磷酸转移酶II所给的卡那霉素抗性，通过将枝条放在含有50mg/l卡那霉素的PM生根培养基上，以选择转化的细胞。

在培养物中再生的Russet Burbank Williams作物移植到6英寸(～15.24cm)盒中，在温室条件下生长至成熟。收获块茎，在室温下检化2天。收集长度大于2cm的全部块茎，在3℃、高湿度下贮存。贮存块茎的特异性比重和淀粉测定

冷贮存(3℃)3和4个月之后，测定每种作物最大的2个或3个块茎的特异性比重(SG)，每个块茎的一般重量是20～40克。在测定特异性比重前几个小时，块茎可以被升温到室温，但是不允许重复调节。特异性比重的计算是通过空气中重量/水中重量的方法进行的，其中SG＝空气中重量/(空气中重量－水中重量)。按照下面的式子(Von Scheete，1937)计算以SG为基础的淀粉百分数和干物质百分数：

淀粉％＝17.546＋(199.07)(SG－1.0988)

干物质％＝24.182＋(211.04)(SG－1.0988)

按Lin等人，1988所描述的方法对新鲜的、贮存块茎组织的中心部分进行淀粉分析。在收获取组织前，块茎不可以升温。简单地说，切取大约100mg中心部分，称重，放入1.5ml离心管中，在干冰上冷冻。然后，在Savant Speed-Vac Concentrator中干燥组织至恒重，测定最后的干重。首先除去可溶性糖：在70℃下，用1ml 80％乙醇提取三次，每次处理时间20分钟。在最后一次温育后，在Speed-Vac Concentrator中干燥去除所有的剩余乙醇。将固体物质重新悬浮在400μl 0.2M氢氧化钾中，磨碎，然后在100℃保温30分钟以溶解淀粉。冷却溶液，加入80μl 1N乙酸进行中和。在37℃用，14.8单位的胰腺α-淀粉酶(Sigma Chemical，St.Louis)处理30分钟，随后在55℃用10单位淀粉葡糖苷酶(Sigma Chemical，St.Louis)处理60分钟，使淀粉降解成葡萄糖。用Sigma(St.Louis)己糖激酶药盒测量经酶消化释放的葡萄糖，这些数值用来计算淀粉含量。糖分析试验

块茎贮存在3℃下，在糖分析前不允许于室温下重复调节。获取从贮存块茎中心切下的部分，测定鲜重，在Savant Speed-VacConcentrator中干燥前，在干冰上冷冻该组织。每个样品鲜重约100mg。粗磨干的块茎物质，在70℃，用0.5ml 80％乙醇提取糖，提取三次，每次20分钟。每次保温后，不溶物在微离心机中旋转沉淀2分钟，收集上清液。混合全部三次提取物的上清液，干燥，在1ml 100mM Tris缓冲液，pH7.5中重新悬浮。每次糖分析试验，用10μl样品。

对于每个样品，按照制造者的方法，用葡萄糖[HK]诊断药盒(Sigma Chemical，Co.，St.Louis，MO)测量葡萄糖含量。简单地说，1mL重组试剂与10μl样品在室温下保温10分钟，测定样品的浓度的方法是：在340nm的吸收值减去水中10μl样品的吸收值。然后，经如下公式计算葡萄糖百分数：

葡萄糖％＝[(A₃₄₀×2.929)/mg·鲜重]×100％往上述测定葡萄糖的反应物中加入1μg磷酸葡糖异构酶，从葡萄糖百分数中减去所得的葡萄糖＋果糖的百分数，测定果糖含量。测定蔗糖含量的方法是：在葡萄糖HK试验中加入1μg磷酸葡糖异构酶和100μg酵母转化酶，在室温下延长保温时间至30分钟。如上所述，减去所得的葡萄糖和果糖含量测定出蔗糖百分数。贮存块茎的Western blot分析

在分离组织进行分析前，不允许对贮存于3℃下的块茎升温。为了Western blot分析，从干燥的块茎组织粗粉中提取蛋白质方法是：在100mM Tris pH7.5、35mM KCl、5mM二硫苏糖醇、5mM抗坏血酸、1mM EDTA、1mM苄脒和20％甘油中以1∶1研磨块茎组织粗粉。用Pierce BCA方法测定提取物的蛋白质的浓度，在3-17％SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质(Laemmli，1970)。检测E.coliADPGPP的方法是：利用抗纯化的E.coli ADPGPP的山羊抗体和碱性磷酸酶结合的兔抗山羊抗体(Promega，Madison，WI)。测定炸制颜色

在Parma，Idaho田间条件下生长以下马铃薯品系：八种表达E.coli glgC16基因的转基因马铃薯品系；和20个对照品系，它们的组成是来自不表达E.coli glgC16基因的pMON20113转化品系和几个非转基因Russet Burbank对照品系的混合品系。收获块茎，在40℃贮存两个月。测定全部马铃薯系的炸制颜色的方法是：从每一品系的代表样品中切取中心部分，在375°F豆油中炸制3分30秒钟。经光电压测量测定炸制颜色，根据USDA冷冻炸薯条颜色等级图报告所测值。结果

所有收获的块茎来自相同品种、同龄、在一样的生长条件下挨着生长的作物Russet Burbank Williams，82)。Western blot分析表明E.coli ADPGPP水平和收获时测定的水平基本相等(表1)，这说明在冷贮存期间E.coli ADPGPP蛋白质的水平是稳定的。分析在3℃、高湿度条件下贮存的块茎表明，表达E.coli glgC16基因的块茎与对照块茎相比，积累的还原糖减少5-6倍(表2、3、4、5和6)。在对照的和转基因的块茎之间少糖水平基本相当，而在转基因的块茎中淀粉水平明显提高。这些结果说明，在表达E.coliglgC16基因的块茎中，由于淀粉在贮存期间降解，所形成的糖重新合成为淀粉，相反，在对照块茎中糖趋于积聚。

表达E.coli glgC16基因的转基因马铃薯作物在野外条件下成长，glgC16马铃薯系的块茎连同几种不同对照系的块茎贮存在4Q°FG(4℃)下。冷贮存两个月后，测定与糖含量直接相关的炸制颜色。与贮存在相同条件下的对照块茎炸制色(较暗的颜色)相比，转基因马铃薯块茎的平均炸制色得到显著地改善(较浅)(表7)，这表明在表达E.coli glgC16基因的块茎中糖水平较低。于3℃下贮存14星期的田间生长的块茎样品中，还原糖含量的直接测量值支持了炸制色结果，因为表达E.coli glgC16基因的块茎含有比对照块茎显著减少的还原糖(表8)。测定转基因马铃薯作物块茎在冷贮存后的再调节速度和程度。与对照系相比，块茎特异性比重大于1.083的转基因系的炸制颜色表明在65°F下再调节速度和程度得到提高(表9)。

表1

在收获时和冷贮存三个月后马铃薯块茎中E.coli ADPGPP的表达。通过与已知标准相比，从Western blot分析中估算E.coliADPGPP水平，数值表示为GlgC16(ng)/50μg提取的块茎蛋白质。

GlgC16ng

品系收获时 3个月

353c 20-25 20-25

535c 25-30 20-25

448a 25-30 25-30

182a 2 0.5-1

199a 20-25 20-25

288c 20-25 20-25

194a 15-20 15-20

524a 10 15-20

表2

冷贮存三个月块茎中的糖和淀粉含量(干重计算值)。还原糖是葡萄糖和果糖，且总糖是还原糖加蔗糖。数值(百分干重)代表9个glgC16+高淀粉马铃薯系和11个对照(glgC16-)马铃薯系在3℃下贮存三个月的平均值。

还原糖蔗糖总糖淀粉glgC16+ 1.5 1.2 2.6 59.5对照 7.0 0.8 7.8 53.7

表3

冷贮存4个月块茎中的糖和淀粉含量(鲜重计算值)。还原糖是葡萄糖和果糖，总糖是还原糖加蔗糖。数值(百分鲜重)表示9个glgC16+高淀粉马铃薯系和11个对照(glgC16-)马铃薯系在3℃下贮存4个月的平均值。

还原糖蔗糖总糖淀粉glgC16+ 0.1 0.1 0.3 9.9对照 0.8 0.2 1.0 6.0

表4

冷贮存4个月后的马铃薯块茎的还原糖含量。记录所含糖值在所示范围内的作物品系数目。百分数以鲜重计。

还原糖百分数

0-0.2 0.2-0.4 0.4-0.6 0.6-0.8 0.8-1.0 1.0+对照系 0 2 0 4 2 3glgC16系 6 3 0 0 0 0

表5

冷贮存4个月后马铃薯块茎的总糖含量。记录所含糖值在所示范围内的作物品系数目。百分数以鲜重计。

总糖含量

0-1 1-2 2-3 3-4 4-5 5+对照系 0 0 0 2 3 6glgC16系 3 4 2 0 0 0

表6

冷贮存4个月后的马铃薯块茎的淀粉含量。记录所含淀粉值在所示范围内的作物品系数目。百分数以鲜重计。

淀粉百分数

2-4 4-6 6-8 8-10 10-12 12-14对照系 1 6 3 1 0 0glgC16系 0 0 2 3 3 1

表7

在40°F冷贮存2月后的田间生长块茎的平均炸制颜色。根据USDA公布的冷冻炸马铃薯的颜色标准确定炸制色值。在这些分级中，0＝很浅颜色，4＝很深的颜色。记录炸制颜色在所示范围内的作物品系数目。

炸制颜色分级

2-2.49 2.5-2.99 3.0-3.49 3.5-4.0对照系 0 0 4 16glgC16系 1 1 6 0

表8

在3℃下贮存14星期后的田间生长的马铃薯块茎的还原糖含量。记录所含糖值在所示范围内的作物品系数目。百分数以鲜重计。

还原糖百分数

0.5-1 1-1.5 1.5-2 2-2.5对照系 0 4 2 2glgC16系 4 2 2 0

实施例2

低温贮存后，由于糖含量上升，经常不能接受马铃薯用于炸制。经过处理例如漂烫或再调节可以改善这些贮存的马铃薯；前一种处理用热水处理马铃薯片去除糖，后一种处理是在较高温度(～65°F)下贮存块茎期间使糖代谢。漂烫主要使酶失活，但是当糖含量高时，这一步骤所用的次数延至通常处理次数的许多倍。这一步的延长导致：产品回收较低、味道损失、浪费时间，它要求高能量供给并产生具有高生物氧需求的废料因而在处理废水上造成了额外的限制。再调节需要增加控制温度的贮存设施，要求在不同温度下进行多步处理以达到最佳效果。在较高的温度和较长时间下将增加发芽和病变的机会。由冷贮存GlgC16块茎炸制的马铃薯的颜色值经常比对照物低(较好)，在某些情况下，甚至3-4个月后其值仍低以至于不需要进行再调节。这些试验扩展到50°F下贮存2个月再在38°F下贮存3个月的块茎，也包括测量再调节速度。

对用下列载体转化的作物块茎进行试验：pMON17316(具有贮存蛋白3.5启动子)、pMON17279(具有马铃薯ADPGPP的小亚基)；可对含有前述贮存蛋白1.0启动子/glgC16载体的作物块茎也进行试验。这些载体按如下方法构建：

由质粒pPBI240.7获得贮存蛋白3.5启动子(Bevan，1986)。3.5启动子的大部分从pPBI240.7的HindIII位点(-3500)到XbaI位点(-337)切下，与启动子的其余部分即从XbaI位点到+22处BglII位点(在先是DraI位点)结合，以三重连接进入提供BglII位点以形成pMON17280的载体中。然后，后-质粒用作完整的3.5启动子和pMON20102的质体击靶肽-GlgC16融合体的三重连接载体，如上所述形成块茎表达盒(在pMON17282中)。由贮存蛋白3.5启动子、质体击靶肽-GlgC16融合体和NOS3′序列组成的盒在NotI片段上导入到作物转化载体pMON17227(为Ti质粒载体，它已由Barry等人在WO 92/04449(1991)中公开和描述在此引作参考文献)，以形成pMON17316。参见图1。

获得马铃薯块茎ADPGPP小亚基基因的启动子(SEQ ID NO：24)作为基因组克隆1-2的XbaI-BglII片段，插入到BlueseriptIIKS-的XbaI和BamHI位点(Nakata等人，1992)。所用的启动子片段由推断的起始蛋氨酸5′端大约2.0kb处的ClaI位点延伸到位于这一ATG前12bp处的HindIII位点的部分组成。通过利用另一个pUC载体进行亚克隆，把BglII位点放在邻近HindIII位点处，且通过后一位点连接到CTP击靶和glgC16编码序列的融合体上。将具有作物3′识别序列的此盒克隆进作物转化载体中以形成pMON17279(还包括一个盒，其中E.coli uidA[GUS]基因由相同的小马铃薯ADPGPP启动子表达)。参见图2。

这些载体由土壤杆菌属菌转化插入马铃薯细胞中，随后进行草甘膦选择。为了利用作为选择试剂的草甘膦转化马铃薯，使合适的土壤杆菌在2ml LBSCK中生长过夜。第二天，用MSO以1∶10稀释细菌，或直到确定光密度读数为0.2-0.33。将马铃薯作物在补充25mg/ml抗坏血酸的PM培养基上于无菌条件生长三个星期，除去马铃薯作物茎上的叶。把茎切成3-5mm的段，用上述的稀释细菌培养。将外植体放在备好的共培养平板上。共培养平板含由湿润滤纸覆盖的1.5mLTxD细胞的1/10MSO。每个平板放有约50个外植体。共培养2天后，将外植体放存愈伤组织诱导培养基上2天，该培养基含有5.0mg/l Zeatin Riboside、10mg/l AgNO₃和0.1mg/l NAA。然后，将外植体转入含有用于选择的0.025mM草甘膦的愈伤组织诱导培养基上。4星期后，将外植体放在含有5.0mg/l ZeationRiboside+ 10mg/l AgNO₃和0.3mg/l GA₃以及用于选择的0.025mM草甘膦的枝条诱导培养基上。8星期时开始出现枝条。12星期中每4个星期，将外植体转移到新鲜的枝条诱导培养基中。切取枝条，置于PM培养基上约2星期或直到它们长到能放在土壤中那么大，

GlgC16 Russet Burbank系的数据，包括那些由贮存蛋白1.0(HS01；HS03；MT01)、贮存蛋白3.5(HS13)以及马铃薯ADPGPP(HS10)启动子的小亚基表达GlgC16的品系，都表示在下面(表9)。很多GlgC16马铃薯(Atlantic品种)系也做了检测(MT01；贮存蛋白1.0启动子)。一般，生产者必须对等于或大于2.0分的产品进行漂烫以制出可接受的产品。很多刚从冷贮存拿出的Russet BurbankGlgC16系的炸制评分能给出小于2.0，因此它们能直接加工。大量品系在进行很短的再调节后能取得小于2.0的炸制颜色的评分。这种改善的再调节反应表现在具有固体成分增加的品系和比重未表现增加的GlgC16品系上。改进之处还表现用以在块茎中表达GlgC16的所有启动子的情况下。所得的可以直接从贮存中取出即炸制的作物品系以及快速再调节的品系的效果也显示在GlgC16 Atlantic品种中。品系MT01-27还表明，无需在块茎中提高淀粉量以获得增强的冷贮存性能，因为这些所试验的品系的特异性比重与对照的Atlantic品种相比没有明显的区别。

表9

含有GlgC16马铃薯的炸制颜色/再调节反应。(根据USDA图评定炸制颜色，分级是0-4，最低-最高)。

65°F下天新

系

0 3 6 10 13 17

Control-Russet Burbank

RB02 2.2 2.3 1.8 2.0 1.0 1.3

RB03 3.5 3.3 2.5 1.7 2.3 2.5

RB05 2.3 2.5 2.2 2.0 1.2 1.3

GlgC16 Russet Burbank

HS13-47^* 3.0 2.5 0.7 0.7 1.3 1.3

HS10-15^* 1.3 1.3 0.4 0.8 1.0 1.0

HS13-50^* 3.2 1.0 0.5 1.0 1.2 0.8

MT01-82^* 2.2 1.2 0.7 1.0 1.5 1.0

HS13-36^* 2.2 1.3 0.7 1.2 1.2 0.8

HS10-20^* 1.0 0.7 0.5 0.5 0.4 0.5

^*-特异性比重大于1.083

HS01-58# 2.8 2.5 1.3 0.7 1.5 1.8

HS03-20# 3.2 2.3 1.7 2.8 1.8 2.0

HS03-18# 2.0 1.8 1.7 0.7 1.3 1.3

HS03-12A# 3.3 2.5 2.7 2.2 2.2 0.8

HS03-12B# 3.0 3.2 2.0 2.7 1.3 2.0

HS01-49# 2.2 1.3 2.3 2.2 1.5 0.8

HS13-30# 3.2 2.3 2.0 2.8 1.7 3.0

#-特异性比重小于1.083

Control-Atlantic

AT-1 2.3 2.3 2.3 1.5 1.5 1.8

GlgC16 Atlantic

MT01-24 2.5 1.8 2.8 1.2 2.2 1.3

MT01-27 1.0 0.5 1.3 0.3 0.8 0.7

实施例3

在贮存于60°F下的马铃薯块茎上(这些块茎先前已在38-40°F下贮存了3个月)，测试GlgC16对延缓发芽的影响。每隔一段时间检则块茎(4-6)，记录出现的发芽＞0.5cm时的天数(表10)。发芽的延缓以50％发芽的天数表示，常在GlgC16系中有所提高，并在试验的三个品种中能观察到(Russet Burbank Atlantic和Norchip)；在由贮存蛋白1.0((HS01；HS03和MT01)、贮存蛋白、3.5(HS13)和马铃薯小ADPGPP(HS10)启动子表达GlgC16的系中能观察到；也能在提高了和未提高固体成分含量的品系中看到。这些延缓发芽的系一般种植在土壤中时发芽。

表10

品种品系 50％发芽的天数

Russet对照 15

Burbank对照 14

对照 9

HS01-25 11

HS01-49 15

HS01-58 18

HS03-3 12

HS03-5 13

HS03-17 13

HS03-26 14

HS03-27 12

HS03-41 24

HS10-10 14

HS10-15 26

HS10-20 ＞43÷

HS13-2 11

HS13-13 16

HS13-23 23

HS13-30 15

HS13-34 25

HS13-37 12

HS13-47 21

HS13-50 19

HS13-68 13

HS13-70 24

MT01-10 14

MT01-11 13

MT01-30 14

MT01-37 19

MT01-82 16Atlantic 对照 6

MT01-6 11

MT01-7 9

MT01-15 10

MT01-31 6Norchip 对照 8

MT01-1 12

MT01-5 13

^-观察的持续时间；此系的块茎种在土中时发芽。

实施例4

对在两个不同的启动子控制下，对用glgC16转化的马铃薯进行另外的试验。从两个马铃薯品种分离马铃薯块茎ADPGPP的大亚基启动子：Russet Burbank(SEQ ID NO：25)和Desiree(SEQ ID NO：26)。用来自ADP葡萄糖焦磷酸化酶的大亚基cDNA的5′端的探针进行噬菌斑杂交，鉴定克隆。借助作物的共同序列，鉴定这些克隆的翻译起始位点(ATG)(Lutcke等人，1987)。用PCR引物在ATG的下游3′端导入BAMHI位点，在两个启动子的5′端导入HINDIII位点。所得的600bp Russet Burbank启动子和1600bp Desiree启动子分别连入pMON10098代替E35S启动子，并与来自含有CTP-glgC16嵌合基因的pMON20102的BglII-SacI片段融合。从这些质粒中除去E35S-NPTII-Nos盒，用含有pMON17227的FMV-CTP-CP4-E9盒的NotI-SalI片段代替，如上所述，产生pMON21522(Russet Burbank-衍生的启动子)和pMON21523(Desiree-衍生的启动子)。pMON10098质粒含有以下的DNA区：1)为了作物表达以选择转化的组织而经基因工程操作的嵌合卡那霉素抗性基因。嵌合基因的组成是：0.35kb花椰菜花叶病毒35S启动子(P-35S)(Odell等人，1985)，0.83kb NPTII基因，和0.26kb NOS 3′的3′-非转译区；2)pTi15955章鱼碱Ti质粒ClaI至DraI的0.45kb片段，它含有T-DNA左界区(Barker等人，1983)；3)含有RK2质粒复制起始点(ori-V)的0.75kb片段(Stalker等人，1981)；4)提供在E.coli中维持的复制起始点(ori-322)和用于结合转入根瘿土壤杆菌细胞的bom位点的pBR322SalI至PstI的3.Okb片段；5)分离自编码细菌放线壮观素/链霉素抗性(SPC/Str)转位子Tn7的0.93kb片段(Fling等人，1985)且它是在E.coli和根瘿土壤杆菌中选择的决定因子；6)含有胭脂碱-型T-DNA右界区的pTiT37质粒PvuI至BclI的0.36kb片段(Fraley等人，1985)；和7)最后的片段是表达盒，其组成是；由启动子序列(P-E35S)的复制增强的0.65kb花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子(Kay等人，1987)，具有几个独特克隆位点的合成多接头，豌豆rbcS-E9基因(E93′)的0.7kb3′非转译区(Coruzzi等人，1984)。利用三亲株交配系统把质粒配入根瘿土壤杆菌株ABI中，用以转化Russet Burbank系Williams 82。

以pMON22152和pMON21523转化的Russet Burbank也表现出改进的贮存特性，其中GlgC16是由马铃薯块茎ADPGPP的大亚基启动子表达的。收获田间生长的块茎，在50°F下放1个月然后在40°下冷贮存放4个月。在一项试验中，借助检测所炸材料的反射值估算这些直接来自贮存的块茎制成的炸制品的炸制颜色；优选较低的值。在第二项试验中，将冷贮存块茎的一部分移到55°F下，以测试再调节中的反应。这些对于块茎的茎和头端(bud)的计算数据表示在表11中。在这两个试验中，无论直接炸制的还是经重调节后的，很多品系比对照品系的色值要好。例如，pMON21522-144、pMON21523-79和很多其它的品系都表现出在对照物之上的惊人的改善。

表11

pMON21522 炸薯条的反射值_1.2

40°F 贮存³ 40°F贮存：21d.@55°F4

LINE# 头端⁵ 茎部⁵ 头端茎部

144 24.3 22.1 34.6 25.4

209 22.8 20.1 31.4 23.2

149 27.1 22.4 30.7 27.5

178 25.3 21.1 34.9 29.3

194 23.7 20.8 30.6 23.5

204 21.3 14.7 33.9 23.0

218 22.8 18.9 33.3 20.7

对照/平均值⁶ 19.7 16.8 31.0 25.1

pMON21523 炸薯条的反射值_1.2

40°F贮存₃ 40°F贮存：21d@55°F4LINE# 头端⁵ 茎部⁵ 头端茎部.33 22.1 16.5 29.8 23.134 21.2 18.2 32.1 27.338 24.0 23.2 28.3 23.640 24.4 15.3 31.5 26.247 22.0 15.6 34.9 27.748 23.0 19.3 31.1 24.979 24.4 19.7 35.8 29.780 21.8 20.5 32.7 25.593 20.7 17.4 31.1 23.299 19.8 17.1 30.6 23.431 22.1 21.6 30.2 24.735 20.0 16.8 34.5 28.437 20.6 18.5 34.2 27.239 18.0 15.8 33.1 24.442 19.2 15.1 31.9 24.143 23.9 20.7 32.1 22.060 20.7 16.3 32.4 20.364 22.3 16.1 30.0 23.071 21.8 20.9 33.1 24.776 22.8 21.5 28.5 25.081 16.5 16.0 29.1 22.792 15.3 15.0 30.3 23.5对照/平均值⁶ 19.7 16.8 31.0 25.1

¹ 从每4-6个块茎中切取四条中心部分，在375°F下炸制。

² 用PHOTOVOLT 577反射仪测量反射值。

³ 从野生的块茎中制取薯条，块茎已在50°F下贮存1个月，然后在40°F下贮存4个月(冷贮存)。

⁴ 从野生的块茎中制取薯条，块茎已在50°F下贮存1个月，在40°F下贮存4个月(冷贮存)，然后在55°F下再调节21天。

⁵ 分别在炸后的薯条的头端和茎部测定反射值。

⁶ 为比较，计算22个对照Russet Burbank品系的平均值。

综上所述，可以看到本发明很适合于达到上述所有的结果和目的，并且具有明显的和本发明所固有的优点。应理解到，某些特点和局部组合是有用的，很多内容在不考虑其它特点和局部组合情况下可以被利用。这些已被考虑到并写入权利要求范围中。因为本发明可以形成很多可能的实施例而不脱离其范围，所以应理解：本文所说明的或附图所显示的所有内容都作为说明性的解释而没有限制的意思。

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Stiekema et al.(1988)Plant Mol.Biol.11：255-269.Stukerlj et al.(1990)Nucl.Acids Res.18：46050.Svab，et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8526-8530.Takaha et al.，(1993)J.Biol.Chem.268：1391-1396.Timko，et al.(1985)Nature(London)318：579-582.Tsai，C.Y.and O.E.Nelson.(1966)Science 151：341-343.Vasil，V.，F.Redway and I.Vasil.(1990)Bio/Technology 8：429-434.van Berkel，J.，et al.(1991)Abstract # 1576 presented at the Interna-

tional Congress of Plant Molecular Biology，Tucson，AZ.van Berkel，J.，et al.(1994)Plant Physiol.104：445-452.Von Scheele，C.(1937)Landw Ver Stn 127：67-96.Weaver，et al.(1978)Am.Pot.J.55：83-93.White，T.C.，et al.(1992)Plant Physiol.99(Suppl.1)：78.Wilhelm，K.S.，et al.(1993)Plant Mol.Biol.23：1073-1077.Wong，et al.(1988)Geneg 68：193-203.Yamaguchi-Shinozaki，et al.(1993)Mol.Gen.Genet.238：331-340.Yamaguchi-Shinozaki，K.and Shinozaki，K.(1994)The Plant Cell

6： 251-264.Yoshida et al.(1992)Geneg 10：255-259.Zhu，B.，et al.(1993)Plant Mol.Biol.21：729-735.

序列表(1)一般信息：(i)申请人：

(A)名字：Monsanto公司

(B)街道：800 North Lindbergh

(C)城市：St.Louis

(D)洲： Missouri

(E)国家：美国

(F)邮编(ZIP)：63167

(G)电话：(314)694-3131

(H)电传：(314)694-5435(ii)发明名称：提高贮存马铃薯质量的方法(iii)序列数：26(iv)计算机阅读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(vi)在先申请资料：

(A)申请号：US 08/070155

(B)申请日：28-MAY-1993(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：

(A)长度：1296碱基对

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20 25 30CTG AAG GAT TTA ACC AAT AAG CGA GCA AAA CCG GCC GTA CAC TTC GGC 144Leu Lys Asp Leu Thr Asn Lys Arg Ala Lys Pro Ala Val His Phe Gly

35 40 45GGT AAG TTC CGC ATT ATC GAC TTT GCG CTG TCT AAC TGC ATC AAC TCC 192Gly Lys Phe Arg Ile Ile Asp Phe Ala Leu Ser Asn Cys Ile Asn Ser

50 55 60ATC CGT CGT ATG GGC GTG ATC ACC CAG TAC CAG TCC CAC ACT CTG 240Gly Ile Arg Arg Met Gly Val Ile Thr Gln Tyr Gln Ser His Thr Leu65 70 75 80

CAC ATT CAG CGC GGC TGG TCA TTC TTC AAT GAA GAA ATG AAC 288Val Gln His Ile Gln Arg Gly Trp Ser Phe Phe Asn Glu Glu Met Asn

85 90 95

GTC GAT CTG CTG CCA GCA CAG CAG AGA ATG AAA GGG GAA AAC 336Val Asp Leu Leu Pro Ala Gln Gln Arg Met Lys Gly Glu Asn

100 105 110

CGC GGC ACC GCA GAT GCG GTC ACC CAA AAC CTC GAC ATT ATC 384

Arg Gly Thr Ala Asp Ala Val Thr Gln Asn Leu Asp Ile Ile

115 120 125TAT AAA GCG GAA TAC GTG GTG ATC CTG GCG GGC GAC CAT ATC 432Tyr Lys Ala Glu Tyr Val Val Ile Leu Ala Gly Asp His Ile

130 135 140

CAA GAC TAC TCG CGT ATG CTT ATC GAT CAC GTC GAA AAA GGT 480GIn Asp Tyr Ser Arg Met Leu Ile Asp His Val Glu Lys Gly 150 155 160TGT ACC GTT GTT TGT ATG CCA GTA CCG ATT GAA GAA GCC TCC 528

Cys Thr Val Val Cys Met Pro Val Pro Ile Glu Glu Ala Ser

165 170 175

GCA TTT GGC GTT ATG GCG GTT GAT GAG AAC GAT AAA ACT ATC GAA TTC 576Ala Phe Gly Val Met Ala Val Asp Glu Asn Asp Lys Thr Ile Glu Phe

180 185 190GTG GAA AAA CCT GCT AAC CCG CCG TCA ATG CCG AAC GAT CCG AGC AAA 624Val Glu Lys Pro Ala Asn Pro Pro Ser Met Pro Asn Asp Pro Ser Lys

195 200 205TCT CTG GCG AGT ATG GGT ATC TAC GTC TTT GAC GCC GAC TAT CTG TAT 672Ser Leu Ala Ser Met Gly Ile Tyr Val Phe Asp Ala Asp Tyr Leu Tyr

210 215 220GAA CTG CTG GAA GAA GAC GAT CGC GAT GAG AAC TCC AGC CAC GAC TTT 720Glu Leu Leu Glu Glu Asp Asp Arg Asp Glu Asn Ser Ser His Asp Phe225 230 235 240GGC AAA GAT TTG ATT CCC AAG ATC ACC GAA GCC GGT CTG GCC TAT GCG 768Gly Lys Asp Leu Ile Pro Lys Ile Thr Glu Ala Gly Leu Ala Tyr Ala

245 250 255CAC CCG TTC CCG CTC TCT TGC GTA CAA TCC GAC CCG GAT GCC GAG CCG 816His Pro Phe Pro Leu Ser Cys Val Gln Ser Asp Pro Asp Ala Glu Pro

260 265 270TAC TGG CGC GAT GTG GGT ACG CTG GAA GCT TAC TGG AAA GCG AAC CTC 864Tyr Trp Arg Asp Val Gly Thr Leu Glu Ala Tyr Trp Lys Ala Asn Leu

275 280 285GAT CTG GCC TCT GTG GTG CCG AAA CTG GAT ATG TAC GAT CGC AAT TGG 912Asp Leu Ala Ser Val Val Pro Lys Leu Asp Met Tyr Asp Arg Asn Trp

290 295 300CCA ATT CGC ACC TAC AAT GAA TCA TTA CCG CCA GCG AAA TTC GTG CAG 960Pro Ile Arg Thr Tyr Asn Glu Ser Leu Pro Pro Ala Lys Phe Val Gln305 310 315 320GAT CGC TCC GGT AGC CAC GGG ATG ACC CTT AAC TCA CTG GTT TCC GGC 1008Asp Arg Ser Gly Ser His Gly Met Thr Leu Asn Ser Leu Val Ser Gly

325 330 335GGT TGT GTG ATC TCC GGT TCG GTG GTG GTG CAG TCC GTT CTG TTC TCG 1056Gly Cys Val Ile Ser Gly Ser Val Val Val Gln Ser Val Leu Phe Ser

340 345 350CGC GTT CGC GTG AAT TCA TTC TGC AAC ATT GAT TCC GCC GTA TTG TTA 1104Arg Val Arg Val Asn Ser Phe Cys Asn Ile Asp Ser Ala Val Leu Leu

355 360 365CCG GAA GTA TGG GTA GGT CGC TCG TGC CGT CTG CGC CGC TGC GTC ATC 1152Pro Glu Val Trp Val Gly Arg Ser Cys Arg Leu Arg Arg Cys Val Ile

370 375 380GAT CGT GCT TGT GTT ATT CCG GAA GGC ATG GTG ATT GGT GAA AAC GCA 1200Asp Arg Ala Cys Val Ile Pro Glu Gly Met Val Ile Gly Glu Asn Ala385 390 395 400GAG GAA GAT GCA CGT CGT TTC TAT CGT TCA GAA GAA GGC ATC GTG CTG 1248Glu Glu Asp Ala Arg Arg Phe Tyr Arg Ser Glu Glu Gly Ile Val Leu

405 410 415GTA ACG CGC GAA ATG CTA CGG AAG TTA GGG CAT AAA CAG GAG CGA TAA 1296Val Thr Arg Glu Met Leu Arg Lys Leu Gly His Lys Gln Glu Arg

420 425 430

(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征：

(A)长度：431氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Val Ser Leu Glu Lys Asn Asp His Leu Met Leu Ala Arg Gln Leu

1 5 10 15Pro Leu Lys Ser Val Ala Leu Ile Leu Ala Gly Gly Arg Gly Thr Arg

20 25 30Leu Lys Asp Leu Thr Asn Lys Arg Ala Lys Pro Ala Val His Phe Gly

35 40 45Gly Lys Phe Arg Ile Ile Asp Phe Ala Leu Ser Asn Cys Ile Asn Ser

50 55 60Gly Ile Arg Arg Met Gly Val Ile Thr Gln Tyr Gln Ser His Thr Leu65 70 75 80Val Gln His Ile Gln Arg Gly Trp Ser Phe Phe Asn Glu Glu Met Asn

85 90 95Glu Phe Val Asp Leu Leu Pro Ala Gln Gln Arg Met Lys Gly Glu Asn

100 105 110Trp Tyr Arg Gly Thr Ala Asp Ala Val Thr Gln Asn Leu Asp Ile Ile

115 120 125Arg Arg Tyr Lys Ala Glu Tyr Val Val Ile Leu Ala Gly Asp His Ile

130 135 140Tyr Lys Gln Asp Tyr Ser Arg Met Leu Ile Asp His Val Glu Lys Gly145 150 155 160Val Arg Cys Thr Val Val Cys Met Pro Val Pro Ile Glu Glu Ala Ser

165 170 175Ala Phe Gly Val Met Ala Val Asp Glu Asn Asp Lys Thr Ile Glu Phe

180 185 190Val Glu Lys Pro Ala Asn Pro Pro Ser Met Pro Asn Asp Pro Ser Lys

195 200 205Ser Leu Ala Ser Met Gly Ile Tyr Val Phe Asp Ala Asp Tyr Leu Tyr

210 215 220Glu Leu Leu Glu Glu Asp Asp Arg Asp Glu Asn Ser Ser His Asp Phe225 230 235 240

Gly Lys Asp Leu Ile Pro Lys Ile Thr Glu Ala Gly Leu Ala Tyr Ala

245 250 255His Pro Phe Pro Leu Ser Cys Val Gln Ser Asp Pro Asp Ala Glu Pro

260 265 270Tyr Trp Arg Asp Val Gly Thr Leu Glu Ala Tyr Trp Lys Ala Asn Leu

275 280 285Asp Leu Ala Ser Val Val Pro Lys Leu Asp Met Tyr Asp Arg Asn Trp

290 295 300Pro Ile Arg Thr Tyr Asn Glu Ser Leu Pro Pro Ala Lys Phe Val Gln305 310 315 320Asp Arg Ser Gly Ser His Gly Met Thr Leu Asn Ser Leu Val Ser Gly

325 330 335Gly Cys Val Ile Ser Gly Ser Val Val Val Gln Ser Val Leu Phe Ser

340 345 350Arg Val Arg Val Asn Ser Phe Cys Asn Ile Asp Ser Ala Val Leu Leu

355 360 365Pro Glu Val Trp Val Gly Arg Ser Cys Arg Leu Arg Arg Cys Val Ile

370 375 380Asp Arg Ala Cys Val Ile Pro Glu Gly Met Val Ile Gly Glu Asn Ala385 390 395 400Glu Glu Asp Ala Arg Arg Phe Tyr Arg Ser Glu Glu Gly Ile Val Leu

405 410 415Val Thr Arg Glu Met Leu Arg Lys Leu Gly His Lys Gln Glu Arg

420 425 430(2)SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征：

(A)长度：1296碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：DNA(基因组的)(ix)特点：

(A)名称/关键字：CDS

(B)位置：1..1296(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

ATG GTT AGT TTA GAG AAG AAC GAT CAC TTA ATG TTG GCG CGC CAG CTG 48Met Val Ser Leu Glu Lys Asn Asp His Leu Met Leu Ala Arg Gln Leu1 5 10 15CCA TTG AAA TCT GTT GCC CTG ATA CTC GCG GGA GGA CGT GGT ACC CGC 96Pro Leu Lys Ser Val Ala Leu Ile Leu Ala Gly Gly Arg Gly Thr Arg

50 55 60GGG ATC CGT CGT ATG GGC GTG ATC ACC CAG TAC CAG TCC CAC ACT CTG 240Gly Ile Arg Arg Met Gly Val Ile Thr Gln Tyr Gln Ser His Thr Leu65 70 75 80GTG CAG CAC ATT CAG CGC GGC TGG TCA TTC TTC AAT GAA GAA ATG AAC 288Val Gln His Ile Gln Arg Gly Trp Ser Phe Phe Asn Glu Glu Met Asn

85 90 95GAG TTT GTC GAT CTG CTG CCA GCA CAG CAG AGA ATG AAA GGG GAA AAC 336Glu Phe Val Asp Leu Leu Pro Ala Gln Gln Arg Met Lys Gly Glu Asn

100 105 110TGG TAT CGC GGC ACC GCA GAT GCG GTC ACC CAA AAC CTC GAC ATT ATC 384Trp Tyr Arg Gly Thr Ala Asp Ala Val Thr Gln Asn Leu Asp Ile Ile

115 120 125CGT CGT TAT AAA GCG GAA TAC GTG GTG ATC CTG GCG GGC GAC CAT ATC 432Arg Arg Tyr Lys Ala Glu Tyr Val Val Ile Leu Ala Gly Asp His Ile

130 135 140TAC AAG CAA GAC TAC TCG CGT ATG CTT ATC GAT CAC GTC GAA AAA GGT 480Tyr Lys Gln Asp Tyr Ser Arg Met Leu Ile Asp His Val Glu Lys Gly145 150 155 160GTA CGT TGT ACC GTT GTT TGT ATG CCA GTA CCG ATT GAA GAA GCC TCC 528Val Arg Cys Thr Val Val Cys Met Pro Val Pro Ile Glu Glu Ala Ser

165 170 175GCA TTT GGC GTT ATG GCG GTT GAT GAG AAC GAT AAA ACT ATC GAA TTC 576Ala Phe Gly Val Met Ala Val Asp Glu Asn Asp Lys Thr Ile Glu Phe

210 215 220GAA CTG CTG GAA GAA GAC GAT CGC GAT GAG AAC TCC AGC CAC GAC TTT 720Glu Leu Leu Glu Glu Asp Asp Arg Asp Glu Asn Ser Ser His Asp Phe225 230 235 240

GGC AAA GAT TTG ATT CCC AAG ATC ACC GAA GCC GGT CTG GCC TAT GCG 768Gly Lys Asp Leu Ile Pro Lys Ile Thr Glu Ala Gly Leu Ala Tyr Ala

260 265 270TAC TGG CGC GAT GTG GGT ACG CTG GAA GCT TAC TGC AAA GCG AAC CTC 864Tyr Trp Arg Asp Val Gly Thr Leu Glu Ala Tyr Trp Lys Ala Asn Leu

275 280 285GAT CTG GCC TCT GTG GTG CCG GAA CTG GAT ATG TAC GAT CGC AAT TGG 912Asp Leu Ala Ser Val Val Pro Glu Leu Asp Met Tyr Asp Arg Asn Trp

290 295 300CCA ATT CGC ACC TAC AAT GAA TCA TTA CCG CCA GCG AAA TTC GTG CAG 960Pro Ile Arg Thr Tyr Asn Glu Ser Leu Pro Pro Ala Lys Phe Val Gln305 310 315 320GAT CGC TCC GGT AGC CAC GGG ATG ACC CTT AAC TCA CTG GTT TCC GAC 1008Asp Arg Ser Gly Ser His Gly Met Thr Leu Asn Ser Leu Val Ser Asp

420 425 430(2)SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征：

(A)长度：431氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Met Val Ser Leu Glu Lys Asn Asp His Leu Met Leu Ala Arg Gln Leu1 5 10 15Pro Leu Lys Ser Val Ala Leu Ile Leu Ala Gly Gly Arg Gly Thr Arg

20 25 30Leu Lys Asp Leu Thr Asn Lys Arg Ala Lys Pro Ala Val His Phe Gly

35 40 45Gly Lys Phe Arg Ile Ile Asp Phe Ala Leu Ser Asn Cys Ile Asn Ser

85 90 95Glu Phe Val Asp Leu Leu Pro Ala Gln Gln Arg Met Lys Gly Glu Asn

100 105 110Trp Tyr Arg Gly Thr Ala Asp Ala Val Thr Gln Asn Leu Asp Ile Ile

115 120 125Arg Arg Tyr Lys Ala Glu Tyr Val Val Ile Leu Ala Gly Asp His Ile

165 170 175Ala Phe Gly val Met Ala Val Asp Glu Asn Asp Lys Thr Ile Glu Phe

180 185 190Val Glu Lys Pro Ala Asn Pro Pro Ser Met Pro Asn Asp Pro Ser Lys

195 200 205Ser Leu Ala Ser Met Gly Ile Tyr Val Phe Asp Ala Asp Tyr Leu Tyr

210 215 220Glu Leu Leu Glu Glu Asp Asp Arg Asp Glu Asn Ser Ser Mis Asp Phe225 230 235 240Gly Lys Asp Leu Ile Pro Lys Ile Thr Glu Ala Gly Leu Ala Tyr Ala

245 250 255His Pro Phe Pro Leu Ser Cys Val Gln Ser Asp Pro Asp Ala Glu Pro

260 265 270Tyr Trp Arg Asp Val Gly Thr Leu Glu Ala Tyr Trp Lys Ala Asn Leu

275 280 285Asp Leu Ala Ser Val Val Pro Glu Leu Asp Met Tyr Asp Arg Asn Trp

290 295 300Pro Ile Arg Thr Tyr Asn Glu Ser Leu Pro Pro Ala Lys Phe Val Gln305 310 315 320Asp Arg Ser Gly Ser His Gly Met Thr Leu Asn Ser Leu Val Ser Asp

325 330 335

Gly Cys Val Ile Ser Gly Ser Val Val Val Gln Ser Val Leu Phe Ser

340 345 350Arg Val Arg Val Asn Ser Phe Cys Aen Ile Asp Ser Ala Val Leu Leu

355 360 365Pro Glu Val Trp Val Gly Arg Ser Cys Arg Leu Arg Arg Cys Val Ile

405 410 415Val Thr Arg Glu Met Leu Arg Lys Leu Gly His Lys Gln Glu Arg

420 425 430(2)SEQ ID NO：5的信息：(i)序列特征：

(A)长度：355碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：DNA(基因组的)(ix)特点：

(A)名称/关键字：CDS

(B)位置：88..354(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：AAGCTTGTTC TCATTGTTGT TATCATTATA TATAGATGAC CAAAGCACTA GACCAAACCT 60CAGTCACACA AAGAGTAAAG AAGAACA ATG GCT TCC TCT ATG CTC TCT TCC 111

Met Ala Ser Ser Met Leu Ser Ser

1 5GCT ACT ATG GTT GCC TCT CCG GCT CAG GCC ACT ATG GTC GCT CCT TTC 159Ala Thr Met Val Ala Ser Pro Ala Gln Ala Thr Met Val Ala Pro Phe

10 15 20

AAC GGA CTT AAG TCC TCC GCT GCC TTC CCA GCC ACC CGC AAG GCT AAC 207Asn Gly Leu Lys Ser Ser Ala Ala Phe Pro Ala Thr Arg Lys Ala Asn25 30 35 40AAC GAC ATT ACT TCC ATC ACA AGC AAC GGC GGA AGA GTT AAC TGC ATG 255Asn Asp Ile Thr Ser Ile Thr Ser Asn Gly Gly Arg Val Asn Cys Met

45 50 55CAG GTG TGG CCT CCG ATT GGA AAG AAG AAG TTT GAG AGT CTC TCT TAC 303Gln Val Trp Pro Pro Ile Gly Lys Lys Lys Phe Glu Thr Leu Ser Tyr

60 65 70CTT CCT GAC CTT ACC GAT TCC GGT GGT CGC GTC AAC TGC ATG CAG GCC 351Leu Pro Asp Leu Thr Asp Ser Gly Gly Arg Val Asn Cys Met Gln Ala

75 80 85ATG G 355Met(2)SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特征：

(A)长度：89氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Met Ala Ser Ser Met Leu Ser Ser Ala Thr Met Val Ala Ser Pro Ala1 5 10 15Gln Ala Thr Met Val Ala Pro Phe Asn Gly Leu Lys Ser Ser Ala Ala

20 25 30Phe Pro Ala Thr Arg Lys Ala Asn Asn Asp Ile Thr Ser Ile Thr Ser

35 40 45Asn Gly Gly Arg Val Asn Cys Met Gln Val Trp Pro Pro Ile Gly Lys

50 55 60Lys Lys Phe Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Pro Asp Leu Thr Asp Ser Gly65 70 75 80Gly Arg Val Asn Cys Met Gln Ala Met

85

(2)SEQ ID NO：7的信息：(i)序列特征：

(A)长度：1575碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(ix)特点：

(A)名称/关键字：CDS

(B)位置：3..1565

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：CC ATG GCG GCT TCC ATT GGA GCC TTA AAA TCT TCA CCT TCT TCT AAC 47Met Ala Ala Ser Ile Gly Ala Leu Lys Ser Ser Pro Ser Ser Asn

1 5 10 15AAT TGC ATC AAT GAG AGA AGA AAT GAT TCT ACA CGT GCT GTA TCC AGC 95Asn Cys Ile Asn Glu Arg Arg Asn Asp Ser Thr Arg Ala Val Ser Ser

20 25 30AGA AAT CTC TCA TTT TCG TCT TCT CAT CTC GCC GGA GAC AAG TTG ATG 143Arg Asn Leu Ser Phe Ser Ser Ser His Leu Ala Gly Asp Lys Leu Met

35 40 45CCT GTA TCG TCC TTA CGT TCC CAA GGA GTC CGA TTC AAT GTG AGA AGA 191Pro Val Ser Ser Leu Arg Ser Gln Gly Val Arg Phe Asn Val Arg Arg

50 55 60AGT CCA ATG ATT GTG TCG CCA AAG GCT GTT TCT GAT TCG CAG AAT TCA 239Ser Pro Met Ile Val Ser Pro Lys Ala Val Ser Asp Ser Gln Asn Ser

65 70 75CAG ACA TGT CTA GAC CCA GAT GCT AGC CGG AGT GTT TTG GGA ATT ATT 287Gln Thr Cys Leu Asp Pro Asp Ala Ser Arg Ser Val Leu Gly Ile Ile80 85 90 95CTT GGA GGT GGA GCT GGG ACC CGA CTT TAT CCT CTA ACT AAA AAA AGA 335Leu Gly Gly Gly Ala Gly Thr Arg Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Lys Arg

100 105 110

GCA AAG CCA GCT GTT CCA CTT GGA GCA AAT TAT CGT CTG ATT GAC ATT 383Ala Lys Pro Ala Val Pro Leu Gly Ala Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ile

115 120 125CCT GTA AGC AAC TGC TTG AAC AGT AAT ATA TCC AAG ATT TAT GTT CTC 431Pro Val Ser Asn Cys Leu Asn Ser Asn Ile Ser Lys Ile Tyr Val Leu

130 135 140ACA CAA TTC AAC TCT GCC TCT CTG AAT CGC CAC CTT TCA CGA GCA TAT 479Thr Gln Phe Asn Ser Ala Ser Leu Asn Arg His Leu Ser Arg Ala Tyr

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450 455 460

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465 470 475

GTG AAG ATC ATT AAC AAA GAC AAC GTT CAA GAA GCG GCT AGG 1487

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Asp Gly Tyr Phe Ile Lys Ser Gly Ile Val Thr Val Ile Lys

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Leu Ile Pro Ser Gly Ile Ile Ile

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450 455 460

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Leu Lys Ala Met Gln Val Asp Thr Thr Leu Val Gly Leu Ser Pro Gln225 230 235 240Asp Ala Lys Lys Ser Pro Tyr Ile Ala Ser Met Gly Val Tyr Val Phe

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(C)链型：双链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：DNA(基因组的)(xi)序列描述：$EQ ID N0：26：

ACCGGGCCCC CCCTGGAGGT CGAGTGCCAT CACATCCAGG GTGTAGGCTC 60

AAACTTGGTA TCTGAGCTCA GAGTTCAAGA GTCTAAGGTG TCTATAAAGT 120

AGAGTCCTAG TTATCGGTGT GAAGCGCGCC ACATCTATAA CCAGGAGGCT 180

AGAATTATCA TACTTCTTTC ATACTCTTTT CGTGCAATAG AGTTCAACTC 240

CTTTATAATT CATGTTTACG CATATCTTTG AGATCATGCC TCCATGTAGA 300GTCGTCCTGC TAGAAGAAAT ATTGATCCTC AGGATCAAGG GGTACCCAAT 360

TGCGACCCCA AGGAAAGGTC ACTAATGTTG AGTTCCAGGA TGTTATACGG 420

AAGTTGTGAC CAACCAAGCT GGACAACAAA GAGGGAATCA ACAAGATGTG 480

CCAGAATCCG TGAGTTCTTA AGGATGAATC CTTCAGACTT CACCAATTCA 540AGGATCTGGA AAACTTTGTG GAAGAGTTGT AGAAGGTTTT TGAGGTTATG 600ATGCTGAGCG AGTGGAACTA ACTGCATACC AACTGAATGG TGTTGCTAGA 660ACCAATAGAA AAAGAGTAGA GTTGAGGGTG CACAAATTGT GAGTTGGGCA 720

ACGCCTTCAT GGGGCATTTC TTTTCCCATG AACTATATGG CAAAGGTAAG 780

CACTCTTAAG CAGGAATCCA TGAGTGTGCA TAAGTATAGC CTCAAGTTCA 840GCCTATGCTC CAGAGATGGC TGTTGATATG AGGAGCAGGA TGGGCTTGTT 900

TTGTCTCATC TGTCAATCAA AGAAGGTAAG GTTGTGATGT GGATAAAGGA 960GAAAGGGTAA TGATCCTTGT GCAACAGGTT GAGGAAGATA AGTTGAGGGA 1020TTCTGAAACA AGAGGGCTAA GAACACATGA AATGAGTACG TAAGCAGAAG 1080

AGTAATGCAA ATCGGTTATC TTTTCAATGA AAGCCAAATA AACCTGCTTG ATTGTTTGCA 1140AGTGCAACCT GTACCAACGA ACAAAGGTGA GTTCAAGAAT CAGAATTCTT AGAAATTCAG 1200AGCTAGACCT GCACAATCTC AAGGTAGTGT GGCACAAGGA TGTAATGGGA CTCCTGCATG 1260TGTTAAGTAC GGTAGGAACC ACCCAGGAGC GTGTCATGAT GGCTCTGCTG GTTGCTTCAA 1320GTGTGGTCAG AATGGTCACT TCATGAGAGA GTGCCTAAAG AANAGGCAAG GTAATAGCAA 1380TGGGGGCAAT ATATCACAAT CTTCTTCAGT GGCTCCACNA GATAGAGCTG CACCTTGAGG 1440ATCATGGGTT CATATGCGTA AAGATTCATG TTTTGTGGTA ATGCTATGAG GTATTAGTAC 1500TGAGCATATA GCTAGCTTGG GTTTTGGGTT TACCGACCAT TTTTTTTAAT TAGTGATATT 1560TTCTTTATGT ATTTTATACT TTTCTTGGTT GCTTAAAGAT TACATATACT TTATTGAGAT 1620TTGAATAAAT CTATTTGATT TAGATCCATT GATAAATCTT AATCTTATGG GATTACTGAT 1680TTGTTGATTG GCTGCAGAAG GATCC 1705

Claims

1.一种提高贮存在降低温度下的马铃薯块茎质量的方法，包括用重组的双链DNA分子转化马铃薯作物，在降低的温度下贮存期间块茎中提供增加水平的ADP葡萄糖焦磷酸化酶活性，该重组的双链DNA分子包括(a)作用于马铃薯以致在块茎中产生RNA序列的启动子，(b)能产生RNA序列的结构DNA序列，其中的RNA序列编码包括氨基末端质体传输肽和ADP葡萄糖焦磷酸化酶的融合多肽，和(c)作用于作物细胞以致转录终止和聚腺苷酸化的核苷酸加到RNA序列的3′端的3′非转译DNA序列；从这些转化的马铃薯作物获得块茎，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是去调节的。

2.权利要求1的方法，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是E.coli glgC酶。

3.权利要求1的方法，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是突变的E.coli酶。

4.权利要求3的方法，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶有SEQID NO：4中所示的序列。

5.一种降低在低温下贮存的马铃薯块茎中糖含量的方法，包括用重组的双链DNA分子转化马铃薯作物，在降低温度下贮存期间块茎中提供增加水平的ADP葡萄糖焦磷酸化酶活性，该重组的双链DNA分子包括(a)作用于马铃薯以致块茎中产生RNA序列的启动子，(b)能产生RNA序列的结构DNA序列，其中RNA序列编码包括氨基末端质体传输肽和ADP葡萄糖焦磷酸化酶的融合多肽，和(c)作用于作物细胞以致转录终止和聚腺苷酸化的核苷酸加到RNA序列的3′端的3′非转译DNA序列；从这些转化的马铃薯作物获得块茎，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是去调节的。

6.权利要求5的方法，其中所述的ADPGPP酶是E.coli glgC酶。

7.权利要求5的方法，其中所述的ADPGPP酶是突变的E.coli酶。

8.权利要求7的方法，其中所述的ADPGPP酶有表示在SEQ IDNO：4中的序列。

9.一个重组的双链DNA分子，包括以下有效序列：

(a)作用于作物以致靶作物组织中产生RNA序列的冷诱导启动子，

(b)能产生RNA序列的结构DNA序列，该RNA序列编码包括氨基末端质体传输肽和ADP葡萄糖焦磷酸化酶的融合多肽，和

(c)作用于作物细胞以致转录端止和聚腺苷酸化的核苷酸加到RNA序列3′端的3′非转译DNA序列；

其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是去调节的。

10.权利要求9的DNA分子，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是E.coli glgC酶。

11.权利要求9的DNA分子，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是突变的E.coli酶。

12.权利要求11的DNA分子，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶有表示在SEQ ID NO：4中的序列。

13.权利要求9的DNA分子，其中所述的启动子来自马铃薯。

14.一种包括重组的双链DNA分子的马铃薯作物细胞，该重组体包括以下有效序列：

其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是去调节的。

15．权利要求14的马铃薯作物细胞，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是E．coli glgC酶。

16．权利要求14的马铃薯作物细胞，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是突变的E．coli酶。

17．权利要求16的马铃薯作物细胞，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶有表示在SEQ ID NO：4中的序列。

18.权利要求14的马铃薯作物细胞，其中所述的启动子来自马铃薯。

19.一种由权利要求14的细胞组成的马铃薯作物。

20.权利要求19的马铃薯作物，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是E.coli glgC酶。

21.权利要求19的马铃薯作物，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是突变的E.coli酶。

22.权利要求21的马铃薯作物，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶有表示在SEQ ID NO：4中的序列。

23.权利要求19的马铃薯作物，其中所述的启动子来自马铃薯。

24.一种延长贮存马铃薯块茎休眠期的方法，包括用重组的双链DNA分子转化马铃薯作物，在贮存期间块茎中提供增加水平的ADP葡萄糖焦磷酸化酶活性，该重组的双链DNA分子包括(a)作用于马铃薯以致在块茎中产生RNA序列的启动子，(b)能产生RNA序列的结构DNA序列，其中的RNA序列编码包括氨基末端质体传输肽和ADP葡萄糖焦磷酸化酶的融合多肽，和(c)作用于作物细胞以致转录终止和聚腺苷酸化的核苷酸加到RNA序列的3′端的3′非转译DNA序列；从这些转化的马铃薯作物获得块茎，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是去调节的。

25.权利要求24的方法，其中所述的贮存是在降低的温度下。

26.权利要求25的方法，其中所述的ADPGPP酶是在冷诱导启动子控制下的E.coli glgC酶。

27.权利要求25的方法，其中所述的ADPGPP酶是在冷诱导启动子控制下的突变的E.coli酶。

28.权利要求27的方法，其中所述的ADPGPP酶有表示在SEQID NO：4中的序列。

29.权利要求24的方法，其中所述的块茎来自权利要求19的作物。