CN102978236A - 精确育种 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的植物育种方法。该方法通过使用也在传统育种中使用的遗传材料来改善作物的农艺性状。不像在传统育种中进行的随机有性重组整个基因组，而是在体外重排特定的遗传元件并插回到单个的植物细胞中。通过这种新的植物育种方法获得的植株不含有异源核酸，但是仅含有来自选作转化的植物种或与所选植物种性亲和植物的核酸。提供了通过这种新的植物育种方法开发的植物。特别地，提供显示改善的块茎贮藏和健康特性的马铃薯植株。

Description

精确育种
本申请为2004年10月18日进入中国国家阶段、申请号为038086433、申请日为2003年2月20日、发明名称为“精确育种”的发明专利申请的分案申请。
发明领域
本申请要求美国临时申请序列号60/357,661和60/377,602的优先权，其在这里引作参考。本发明涉及通过修饰植物基因组中特异的、熟知的DNA而提高植物的营养、健康和农艺特性的方法。与传统的植物育种相反，本发明的方法不会将未知的或有潜在毒性的基因引入到植物遗传组成中。此外，本发明的方法与常规的遗传工程策略不同，不将异源物种，即不能与将要通过遗传工程修饰的植物交互可孕的植物的核酸掺入到植物的基因组中。通过本发明的植物育种方法开发的植株显示改善的农艺特性。本发明特别优选的植株包括显示改善了健康和块茎贮藏特性的马铃薯，以及显示提高了疾病和干旱耐受性的草坪草。
背景
典型地一直是通过传统的植物育种或者遗传工程来改善植物的农艺特性。传统的育种一般导致将未知的核酸从一种植物转移到另一种植物。遗传工程技术将异源核酸引入到植物基因组中，即DNA不是来源于植物或者不是来源于与将要通过遗传工程修饰的植物天然交互可孕的植物。例如，遗传工程将非植物核酸引入到植物基因组中。传统的育种和遗传工程策略两者都产生含有不期望和不需要的遗传物质的植物基因组，得到的杂交的或转基因的植物显示不利的特性。可以证明这两种策略的缺陷对转基因植物是有害的，对食用这些产品的动物和人也是有害的。
传统育种依赖于未知DNA的转移
植物育种一般依靠植物染色体的随机重组以产生具有新的和改善特性的变种。因此，通过筛选从植物杂交获得的众多子代，育种者能够鉴定出那些显示期望特性，例如产量增加、活力增强、疾病和昆虫抗性提高、或者在干旱条件下生存能力增强的植株。然而，传统的育种方法是费力和耗时的，而且新的变种一般仅仅显示相对适度的改善。
此外，传统的植物育种一般导致将许许多多的未知基因转移到植物基因组中。很可能那些转移的基因中的一些编码潜在的有害的变应原，例如马铃薯块茎蛋白、凝集素、壳多糖酶、蛋白酶、奇异果甜蛋白（thaumatin）样蛋白、脂转移蛋白、淀粉酶、胰蛋白酶抑制剂，以及种子贮藏蛋白（Breiteneder等，J Allergy Clin Immunol 106：27－36）。
类似地，可能在毒素的生物合成中涉及渐渗基因，其中毒素包括山黛豆素（lathyrogens）、肼、芥子油苷和致甲状腺肿物、香豆素、皂苷、生物碱、糖苷生物碱、生物胺、酶抑制剂，如凝集素（血细胞凝集素）、胰蛋白酶抑制剂、鳌合底物如肌醇六磷酸和草酸、核糖毒素（ribotoxins）、抗微生物肽、氨基酸如β－N－草酰氨基－L－丙氨酸、苍术苷、夹竹桃苷、紫杉醇，和异喹啉（Pokorny，Cas Lek Cesk 136：267－70，1997）。通过努力“开发”以前没有用作食物消费的野生作物亲属的的遗传多样性，进一步提高了意外地将这些毒物引入到人和动物食物供应品中的风险（Hoisington等，Proc Natl Acad Sci USA 96：5937－43，1999）。
尽管传统的植物育种能够容易地将在不期望的抗营养化合物中涉及的基因引入到粮食作物和植物中，但是其不能容易地将它们除去。例如，花了约15年时间通过灭活Lpa基因减少谷物和水稻中有害的肌醇六磷酸水平（Raboy，J Nutr 132：503S－505S，2002）。用长的时间框架来实现积极的结果是不实际的，特别是由于现在急切地需要更有效地和高效地提高粮食作物质量的方法。最近才发现与抗营养化合物的合成有关的基因的一个实例是多酚氧化酶（PPO）基因，其氧化某些酚类化合物产生象苯氧基自由基和醌衍生物那样的致突变的、致癌的和细胞毒性试剂（Kagan等，Biochemistry 33：9651－60，1994）。在植物如马铃薯的基因组中存在这个基因的多重拷贝，使得特别难于通过育种来减少PPO的活性。
如果对它们的遗传基础知道得很少或者一无所知，那么甚至需要更多的时间来除去抗营养化合物。例如，一直没有将基因与在一些被加热到160℃或者更高时的马铃薯中高浓度丙烯酰胺的累积相联系，丙烯酰胺是一种烈性神经毒素和诱变剂（Tareke等，J Agric Food Chem.50：4998－5006，2002）。因此在使用传统育种的加工期间很难高效地开发新的能产生较少丙烯酰胺的马铃薯变种。因此，需要种植具有较低水平的这类危险化合物，但是没有使用未知或异源核酸的马铃薯和其它富含碳水化合物的食物，例如小麦。
可在加工期间累积并且很难通过育种减少到最少或消除的其它抗营养化合物包括美拉德反应（Maillard－reaction）产物N－亚硝基－N－（3－酮－1，2－丁二醇）－3’－硝基酪胺（Wang等，Arch Toxixol 70：10－5，1995），以及5－羟甲基－2－糠醛（Janzowski等，Food Chem Toxicol38：801－9，2000）。一直没有被很好地表征的另外的美拉德反应产物也已知显示诱变特性（Shibamoto，Prog Clin Biol Res 304：359－76，1989）。
由于传统的植物育种固有的不精确，要迅速地提高粮食作物中有益的营养化合物的水平同样可能是困难的。例如，期望提高各种作物中“抗性淀粉”的水平（Topping等，Physiol Rev 81：1031－64，2001）。这种淀粉最终负责促进免疫应答，抑制潜在的病原体，以及降低包括结肠直肠癌在内的疾病的发病率（Brid等，Curr Issues Intest Microbiol 1：25－37，2000）。然而，仅可得到的抗性淀粉水平增加的植株是象玉米突变株“amyloseextender”，“dull”，和“sugary－2”那样低产量的变种。新的高抗性淀粉来源如马铃薯的产生将能够将这种促进健康的成分较广泛地结合到饮食中。
不能安全地操纵植物的基因型经常导致使用外部的化学药品以诱导期望的基因型。尽管众多的育种程序延迟块茎发芽，然而例如，买不到不用发芽抑制剂处理就可以贮藏数月的马铃薯变种。后者，如异丙基－N－氯苯基－氨基甲酸酯（CIPC），与急性毒性和肿瘤发展有关联，并可能以1mg/kg和5mg/kg之间的浓度存在于加工的马铃薯食品中。
遗传工程依赖于外源DNA的转移
遗传工程可以用于修饰、产生或除去植物的某些特性。尽管在提高植物的营养价值和健康特征方面一直存在有限的进步，但是绝大多数靶植物特性的改善促进了容易栽培作物。因此，某些植物抵抗草苷膦除草剂，因为它们含有细菌的5－烯醇丙酮酰莽草酸－3－磷酸合成酶基因（Padgette等，Arch Biochem Biophys.258：564－73，1987）。类似地，遗传工程已经生产了抗昆虫、抗病毒和抗真菌的植物变种（Shah等，Trends inBiotechnology 13：362－368，1995；Gao等，Nat Biotechnol.18：1307－10，2000；Osusky等，Nat Biotechnol.18：1162－6，2000），但是几乎没有一种具有增强营养或健康的益处。
根据标准的公知技术，将包括基因和调节元件的基因“表达盒”插入到从土壤杆菌分离的转移DNAs（“T－DNAs”）的边缘序列内并整合到植物基因组中。因此，土壤杆菌介导的T－DNA材料的转移经典地包括下列标准步骤：（1）遗传元件的体外重组，其中至少一个元件是异源的，以生产用于转化筛选的表达盒，（2）常常将这种表达盒与至少一种含有外源DNA的其它表达盒一起插入到双载体的T－DNA区，其通常由两侧是T－DNA边缘序列的土壤杆菌DNA的几百个碱基对构成，（3）将位于T－DNA边缘之间的序列，常常伴随另外双载体序列的一些或全部一起，从土壤杆菌（Agrobacterium）转移到植物细胞中，以及（4）筛选稳定转化的植物细胞。参见，例如美国专利号4,658,082、6,051,757、6,258,999、5,453,367、5,767,368、6,403,865、5,629,183、5,464,763、6,201,169、5,990,387、4,693,976、5,886,244、5,221,623、5,736,369、4,940,838、6,153,812、6,100,447、6,140,553、6,051,757、5,731,179、5,149,645、和EP 0120,516、EP 0257,472、EP 0561,082、1,009,842A1、0 853,675A1、0 486,233B1、0 554,273A1、0270,822A1、0 174,166A1和WO 01/25459。
因此，遗传工程方法取决于将外源核酸引入到食物供应中。那些技术将由几个到多于20个的从病毒、细菌和植物中分离的非固有的遗传元件组成的复杂的融合转移转化的植物种中。这样的外源元件包括调节元件如启动子和终止子，以及在新特性的表达中涉及的或者作为转化事件鉴定或筛选标记的基因。尽管在规章批准前要检验含有外源DNA的食物的安全，但是许多消费者仍然关心表达外源蛋白的食用食品的远期效应，该外源蛋白是通过从其它非植物种中获得的基因产生的。
一个普遍使用的调节元件是花椰菜花叶病毒（CaMV）的35S“超级”启动子，其在植物工程中一般用于诱导与其直接连接的转基因的高水平表达。然而，该35S启动子也能提高其附近的天然基因的表达（Weigel等，Plant Physiol.，122：1003－13，2000）。这类启动子可能因此在内源基因的表达中诱导不可预知的改变，可能导致不良效果，如增加生物碱产量。优选的“强”启动子通常是那些从病毒中分离的启动子，这些病毒如水稻tungro杆状病毒、玉米条斑病毒、木薯叶脉病毒、紫茉莉病毒、花生褪绿条死病花椰菜花叶病毒、玄参花叶病毒和小球藻病毒。其它经常使用的启动子克隆自细菌种，以及包括胭脂氨酸合酶和章鱼氨酸合酶基因的启动子。
为了达到基因转录的适当终止，将终止子序列融合到转基因的3’－末端并且终止子序列包括土壤杆菌的胭脂氨酸合成酶和章鱼氨酸合成酶基因的遗传元件。可以使用其它的遗传元件来进一步增强基因表达或将表达的蛋白靶向某些细胞小室。这些元件包括促进转基因表达的内含子和将外源基因靶向某些细胞小室的信号肽序列，常常来自外源植物种。
在新特性的表达中所涉及的某些基因最经常源于异源来源。如果使用天然基因，那么经常将它们反向以在转基因植物中使该基因的表达沉默，并与外源DNA如选择性标记基因共转化。这种“反义”技术的主要缺点是反向的DNA通常含有在启动子和终止子之间插入的新的和未表征过的可读框。因此，所有用来源于淀粉相关基因RI（Kossmann等，美国专利6,207,880）、L－和H－型葡聚糖磷酸化酶基因（Kawchuk等，美国专利5,998,701，1999）、多酚氧化酶基因（Steffens，美国专利6,160,204，2000）、以及淀粉分支酶I和II基因（Schwall等，Nature Biotechnology 18：551－554，2000）的反义构建物遗传修饰的马铃薯植株都潜在地表达由至少50个氨基酸（表1）构成的新肽。这些新肽可能妨碍植物发育和/或减少马铃薯的营养价值，因而是不受欢迎的。
将常规的标记物基因掺入到遗传构建物中并用于选择转化事件。它们赋予转化植物抗生素抗性或除草剂抗性（美国专利No.6,174,724）、代谢优点（美国专利No.5,767,378）或者形态异常表型（美国专利No.5,965,791）。这类标记物一般来自细菌来源。
此外，由于T－DNA转移的不忠诚，在植物如番茄、烟草和马铃薯中约75％的转化事件除了含有T－DNA外还含有质粒“主链”序列（Kononov等，Plant J.11：945－57，1997）。这种主链序列的存在是不受欢迎的，因为它们是外源的并且一般含有复制起点和抗生素抗性基因标记。
的确存在除去象异源标记基因那样元件的各种方法，但是很少有一种可很容易地适用于植物遗传工程。根据一种这样的方法，将标记基因和期望的基因或核苷酸序列置于不同的载体上。用含有两个载体的单个土壤杆菌菌株（美国专利No.6,265,638）或者用两个土壤杆菌菌株，其中每个菌株携带两个载体中的一个，用以感染植株可能会偶然导致无关联的整合事件，其可以通过异杂交繁殖进行遗传分离。这种方法的主要缺点是基因座的遗传分离可能是非常费力和耗时的，特别是如果与T－DNA整合事件联系在一起的话。此外，这种方法不能广泛地在无性生殖的植物中应用，该植物无性繁殖，如肯塔基蓝草，或者营养体繁殖的作物如马铃薯，由于近交衰退、高水平的杂合性以及低繁殖力水平，其不能很容易地被培育。
另一个除去异源遗传元件的方法依靠将外源基因如选择性标记基因，插入到转座元件中。该修饰的转座元件可能接着以低频率从基因组中被剪接出去。接着必需与未转化的植株进行传统的杂交以便将转座的元件与宿主分离（美国专利No.5,482,852）。正如对于以前的方法已经描述的那样，这种可选择的方法不能用于营养体繁殖或者无性生殖的植物系统。
除去标记基因的第三种方法使用P1噬菌体的Cre/lox位点特异性重组系统（Dale&Ow，Pro.Natl.Acad.Sci.USA，88：10558－62，1991）。在两个lox位点之间将标记基因与Cre重组酶基因和在Cre的诱导中涉及的嵌合基因（两个基因都具有它们自己的启动子和终止子）一起插入，导致在再生过程期间切除由lox位点描绘的区域（Zuo等，Nat.Biotechnol.，19：157－61，2001）。这种复杂的过程是效率低和不可靠的，并且可能导致基因组不稳定。
最近的研究报道了一些植物基因本身可以被用作转化标记。这类植物标记的实例包括Pga22（Zuo等，Curr Opin Biotechnol.13：173－80，2002）、Cki1（Kakimoto，Science 274：982－985，1996）和Esr1（Banno等，Plant Cell 13：2609－18，2001）。然而，所有这些基因都引起细胞分裂素反应，这赋予了转基因植物不良的表型。此外，一旦通过上述方法中的任何一种进行了转化，就将仍然需要除去这类植物标记。
转化植物的可选择的方法也是基于外源遗传元件的体外重组，并依赖于在大肠杆菌（E.coli）中用于保养的细菌质粒序列，其中的部分序列是在转化过程中共整合的。用外源DNA转化植物的这类方法的实例描绘在美国专利Nos.5,591,616、6,051,757、4,945,050、6,143,949、4,743,548、5,302,523、和5,284,253。
通过省略再生前的任何筛选步骤也可能获得无标记的转基因植物。这种方法的缺点是通过这种方法产生的绝大多数事件将代表未转化植物或嵌合植物，因为它们通常不是来源于单个转化的植物细胞。使用无标记物的步骤来鉴定在所有细胞中都含有相同的DNA插入片段的转基因植物是极其困难和费力的。
因此，需要改善植物使其超过可通过传统的育种杂交和常规的遗传基因工程技术得到的植株是非常重要的，其不依赖于将未知的或外源核酸插入到植物基因组中。相应地，本发明提供了用于精确修饰植物自身的遗传材料的方法和组合物。因此，发明的“精确育种”策略不诱导不受欢迎的表型并且不将未知的或外源的核酸引入植物基因组中。
概述
本发明提供遗传性地提高植物的营养价值和农艺特性而不将未知的或外源DNA永久地或稳定地掺入到该植物基因组中的方法。根据本发明的方法，从期望的植物种或者从与期望的植物性亲和的植物种中分离特异性的、熟知的核酸、基因元件以及基因，经过修饰，接着重新插回到所期望的植物种的基因组中。该修饰可能需要突变分离的核酸序列，删除分离核酸的部分序列，或者简单地将分离的核酸连接到另一个多核苷酸上，例如将分离的核酸亚克隆到质粒载体中。
相应地，通过本发明的方法学产生的转基因植物不具有包含任何外源物种核酸的基因组。因此，本发明的方法生产的转基因植物其基因组不包含非植物种的启动子，不包含非植物种的终止子，不包含非植物种的5’－非翻译区，不包含非植物种的3’－非翻译区，不包含非植物种的标记基因，不包含非植物种的调节元件，不包含非植物种的基因，以及不包含从非植物种的基因组中获得的任何其它多核苷酸。
因此，本发明提供一种生产稳定的转基因植物的方法，该植物显示不被非转化植物表现的修饰表型，包括（a）用期望的多核苷酸转化植物细胞；（b）从转化的细胞中生长植物；和（c）筛选用所述期望的多核苷酸稳定转化的显示新表型的植物，其中从相应的非转化植物细胞中长出的植物不显示该新表型。优选地，期望的多核苷酸基本上由下列序列构成：（i）核酸序列，其分离自和/或天然属于植物细胞基因组，或属于相同种的其它植物，或者是分离自和/或天然属于与分离的植物细胞所来源的植物性亲和的植物种的基因组；和（ii）至少一种DNA序列，其是边缘样序列，其具有一序列，该序列天然属于所述植物细胞的基因组或天然属于相同种植物细胞的基因组，或者天然属于与分离的植物细胞所来源的植物性亲和植物的序列，其中边缘样序列能够将期望的多核苷酸稳定地整合到所述植物细胞的基因组中。
本发明的优选的方法需要产生显示不被非转化植物所表现的修饰表型的转基因植物，包括（a）用土壤杆菌感染外植体，该土壤杆菌（Agrobacterium）带有（i）一种“P－DNA”载体，其含有期望的转基因植物天然具有的多核苷酸，和（ii）一种含有包含选择性标记基因表达盒的“LifeSupport”载体；（b）选择选择性标记基因短暂表达的时间，优选1－10天，3－7天，或者4－5天；（c）将外植体转移到再生培养基中以允许形成嫩枝；（d）筛选众多嫩枝以确定哪些嫩枝在其基因组中包含期望的多核苷酸的至少一个拷贝，以及在那些嫩枝中哪些枝条在其基因组中不含有任何外源核酸，如选择性标记基因；和（e）允许在其基因组中含有期望的多核苷酸而不含有任何标记基因DNA的嫩枝长成整个植株，其中所得到的整个植物显示修饰表型，该表型不被从相同种的非转化植物细胞中长出的植物所显示。
根据这样的方法，期望的多核苷酸（i）基本上仅由分离自和/或天然属于植物细胞种或其性亲和种的基因组的元件构成；（ii）包括至少一种边缘元件，该元件具有一个分离自或者天然属于植物细胞种或其性亲和种基因组的序列，该序列能够将期望的多核苷酸稳定地整合到暴露于载体的植物细胞的基因组中；和（iii）被稳定地整合到转化植物的基因组中；其中该方法不将非植物种或外源DNA整合到转化植物的基因组中。
此外，可以使用任何选择性标记基因作为成功转化的指示物。例如，可以使用“新霉素磷酸转移酶”标记基因，或者使用“hpt”标记基因以分别赋予对氨基糖苷类抗生素、卡那霉素和潮霉素的抗性。其它的标记基因包括“bar”标记基因，其赋予对除草剂膦丝菌素的抗性；“DHFR”标记基因，其赋予对氨甲蝶呤的抗性；以及“ESPS”标记基因，其赋予对Round－up除草剂的抗性。在现有技术中公知如何进行这类标记基因的表达以确定标记基因是否已经在转化植物细胞的基因组中稳定地表达。相应地，技术人员知道如何跟踪标记基因的表达以确定标记基因仅在转化植物细胞中短暂地表达。
在本发明的另一个方面中，提供制备稳定地转化植物的方法，包括以下步骤（1）鉴定靶基因；（2）分离与所述靶基因相关的前导或尾随DNA序列；（3）可任选地修饰所述分离的前导或尾随DNA；（4）可操作地将所述的前导或尾随DNA连接到天然的调节元件上以形成表达盒；（5）将所述的表达盒插入位于双载体上的P－DNA中，其中该双载体也携带一个可操作的细胞分裂素基因，使得通过细胞分裂素基因的表达而检测的外源性的其它双载体序列意外插入；（6）将修饰的双载体引入土壤杆菌中；（7）使用LifeSupport介导的转化将重排的天然DNA稳定地整合到植物细胞的基因组中；（8）再生含有重排的天然DNA的植物细胞；（9）弃去显示过度生产细胞分裂素表型并且不能完全再生的植物；以及（10）维持与未转化植物难区分的期望植物用于进一步分析。
在本发明的另一个方面中，提供修饰所选植物种的性状表达的方法。在一个实施方案中，该方法包括（1）鉴定将被修饰的性状；（2）构建基本上由分离自或天然属于所选植物种的遗传元件构成的重组DNA分子，其中当重组的DNA分子被整合到所选植物种的基因组中时，修饰了转化植物种的性状表达；（3）使用LifeSupport介导的转化将重组的DNA分子稳定地整合到所选植物种的细胞中；以及（4）鉴定显示性状的表达已被修饰的转化植株。
在一个优选的实施方案中，通过用两种不同的土壤杆菌（Agrobacterium）菌株感染外植体将期望植株的天然多核苷酸插入期望植物的基因组中。第一个土壤杆菌菌株能够将天然DNA从P－DNA载体转移到植物细胞中；第二个菌株能将带有选择性标记基因的表达盒的T－DNA转移到植物细胞中。后一种载体的实例包括这里描述的所谓“LifeSupport”载体。通过优选能短暂表达标记基因1－10天、3－7天，或4－5天的植株，并随后将外植体转移到再生培养基中，获得众多事件，其中部分事件代表含有至少一个多核苷酸拷贝的植株，但是缺乏T－DNA或标记基因的任何拷贝。
在另一个实施方式中，使用单一的土壤杆菌菌株，其带有P－DNA载体和LifeSupport载体，其中P－DNA载体在P－DNA边缘样序列之间具有期望的天然兴趣基因或多核苷酸，LifeSupport载体含有标记基因的。标记基因可以，或者不可以在P－DNA边缘样序列、T－DNA边缘序列，或其它T－DNA样边缘序列之间插入。
因此，在另一个优选的实施方案中，P－DNA载体含有至少两个表达盒，其中一个包含由天然启动子驱动的天然的可筛选的或可选择的标记基因，然后是天然终止子。
通过优选选择表达至少2天，以及更优选至少5天的天然标记基因表达，随后将外植物转移到再生培养基中，获得众多事件，其代表含有至少一个拷贝的引入的DNA被稳定地整合到它们的基因组中的植株。在优选的实施方案中，植物来源的标记基因编码5－烯醇丙酮酰－3－磷酸莽草酸（5－enolpyruvul－3－phosphoshikimic acid）合酶或色氨酸脱羧酶突变体。在更优选的实施方案中，选择性标记物编码耐盐性。在最优选的实施方案中，耐盐性基因具有SEQ ID 35中显示的核苷酸序列，并在马铃薯中用于选择转化事件。
在另一个实施方案中，经过修饰的性状表达的特点是表达增加、表达降低或不能检测的表达的增加。
在本发明的另一个方面中，提供通过下列方法制备的植物，（1）鉴定将要被修饰的性状；（2）构建基本上由从所选植物种中分离的遗传元件构成的重组DNA分子，其中当重组的DNA分子被整合到所选植物种的基因组中时，它修饰转化的植物种中该性状的表达；（3）通过LifeSupport介导的转化将重组DNA分子稳定地整合到所选植物种的细胞中；以及（4）鉴定显示经过修饰性状表达的转化植株。
在进一步方面中，提供修饰所选植物种中性状表达的方法。这种方法包括（1）鉴定将被修饰的性状；（2）构建基本上由下列部分构成的重组DNA分子：（a）从所选植物种中分离的遗传元件，其中当遗传元件被整合到所选植物种的基因组中时，它修饰转化植物种中该性状的表达；和（b）从相同的植物种中分离的选择性标记基因；（3）通过LifeSupport介导的转化将重组DNA分子稳定地整合到所选植物种的细胞中；（4）检测选择性的标记基因；以及（5）鉴定显示经过修饰性状表达的转化植株。
在一个另外的方面中，提供显示性状表达经过修饰的植物。在一个实施方案中，将重组DNA分子稳定地整合到该植物的基因组中，其中该DNA分子基本上由从相同种或从与该种性亲和的植物中分离的遗传元件构成，其中该重组DNA分子修饰性状的表达。
在本发明的另一个方面中，提供被称作“植物－DNA”（“P－DNA”）的分离的核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，该P－DNA本身缺乏任何基因或其部分，并用末端T－DNA“边缘样”序列来描绘，它与任何烈性土壤杆菌菌株的T－DNA边缘核苷酸序列有至少50％，至少75％，至少90％或者至少95％的序列同一性，其支持将整个P－DNA从土壤杆菌高效转移到植物细胞。
在一个优选的实施方案中，“边缘样”序列促进和便于与其相连的多核苷酸的整合。在另一个优选的实施方案中，每个修饰的P－DNA的末端序列的长度为5－100碱基对、10－80碱基对、15－75碱基对、15－60碱基对、15－50碱基对、15－40碱基对、15－30碱基对、16－30碱基对、20－30碱基对、21－30碱基对、22－30碱基对、23－30碱基对、24－30碱基对、25－30碱基对、或者26－30碱基对。更优选地，边缘样序列的长度为20和28个核苷酸。
在优选的实施方案中，本发明的P－DNA左边和右边的边缘序列是分离自和/或天然属于将被修饰的植物的基因组，并且核苷酸序列不与任何已知的土壤杆菌（Agrobacterium）来源的T－DNA的边缘序列相同。因此，在一个实施方案中，P－DNA边缘序列可能具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或更多个不同于土壤杆菌种，如根癌农杆菌或发根植物单胞菌（Agrobacterium rhizogens）T－DNA边缘序列的核苷酸。或者，在另一个实施方案中，本发明的P－DNA边缘或边缘样序列与土壤杆菌种，如根癌农杆菌或发根植物单胞菌（Agrobacterium rhizogens）的T－DNA边缘序列具有至少95％、至少90％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％或至少50％的序列同一性。更优选地，天然植物的P－DNA边缘序列与土壤杆菌（Agrobacterium）的T－DNA边缘序列具有高于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、或60％的核苷酸序列同一性。
在一个优选的实施方案中，可从植物基因组中分离边缘样序列，接着进行修饰或者突变以改变效率，通过该效率能够将核苷酸序列整合到另一个核苷酸序列中。在另一个实施方案中，可在本发明的边缘样序列内添加或者掺入其它的多核苷酸序列。因此，在另一个实施方案中，可修饰P－DNA的左边缘或P－DNA的右边缘以使其具有5’－和3’－多克隆位点或者另外的限制性酶切位点。在进一步的实施方式中，可修饰P－DNA边缘序列以提高伴随载体的主链DNA不被整合到植物基因组中的可能性。
在一个甚至更优选的实施方案中，通过在聚合酶链反应中使用简并引物而从任何植物中分离P－DNAs。在一个优选的实施方式中，P－DNA来自马铃薯，用25个碱基对的末端来描绘，该末端与常规的T－DNA边缘序列分别有80和88％的同一性，具有SEQ ID NO.1显示的核苷酸序列。在另一个最优选的实施方案中，P－DNA来源于小麦，用25个碱基对的末端来描绘，该末端与常规的T－DNA边缘分别有72％和92％的同一性，含有SEQ ID NO.34中显示的核苷酸序列。
可以对这样的P－DNA进行修饰以使其包含位于边缘样序列之间的其它多核苷酸。在一个优选的实施方案中，经过修饰的P－DNA在5’－到3’－方向上基本上由促进DNA转移的第一个边缘样序列、启动子、可操作地连到启动子上的期望的多核苷酸、终止子以及也促进DNA转移的第二个边缘样序列构成。在一个另外的实施方案中，期望的多核苷酸代表在正义和/或反义方向上的前导序列、尾随序列或者基因的一个或几个拷贝。在更优选的实施方案中，修饰的P－DNA含有突变PPO基因和转化酶抑制剂基因两者的表达盒。
因此，在优选的实施方案中，期望的多核苷酸包括前导序列的正义和反义序列。在更优选的实施方案中，前导序列与所选植物种细胞的内在基因有关。在更优选的实施方案中，前导序列与从下列基因构成的组中选出的基因有关：PPO基因、R1基因、L或H型α葡聚糖磷酸化酶基因、UDP葡萄糖葡糖基转移酶基因、HOS1基因、S－腺苷高半胱氨酸水解酶基因、II类肉桂酸－4－羟化酶基因、肉桂酰－辅酶A还原酶基因、肉桂酰醇脱氢酶基因、咖啡酰辅酶A O－甲基转移酶基因、肌动蛋白解聚因子基因、Nin88基因、Lol p 5基因、变应原基因、P450羟化酶基因、ADP－葡萄糖焦磷酸化酶基因、脯氨酸脱氢酶基因、内－1，4－β－葡聚糖酶基因、玉米黄质环氧酶基因、以及1－氨基环丙烷－1－羧酸合酶基因。
在另一个优选的实施方案中，期望的多核苷酸包括尾随序列的正义和反义序列。在优选的实施方案中，尾随序列与从下列基因构成的组中选出的基因有关：PPO基因、R1基因、L或H型α葡聚糖磷酸化酶基因、UDP葡萄糖葡糖基转移酶基因、HOS1基因、S－腺苷高半胱氨酸水解酶基因、II类肉桂酸－4－羟化酶基因、肉桂酰－辅酶A还原酶基因、肉桂酰醇脱氢酶基因、咖啡酰辅酶A O－甲基转移酶基因、肌动蛋白解聚因子基因、Nin88基因、Lol p 5基因、变应原基因、P450羟化酶基因、ADP－葡萄糖焦磷酸化酶基因、脯氨酸脱氢酶基因、内－1，4－β－葡聚糖酶基因、玉米黄质环氧酶基因、以及1－氨基环丙烷－1－羧酸合酶基因。
在优选的实施方案中，期望的多核苷酸，如基因分离自和/或天然属于将被转化的植物。在另一个优选的实施方案中，修饰或突变期望的多核苷酸。在一个实施方案中，分离的多核苷酸的突变可能使得期望的多核苷酸与其未突变型有高于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、或60％的异化。
在本发明优选的实施方案中，位于P－DNA内的表达盒的启动子是组成型启动子。在更优选的实施方案中，组成型启动子是马铃薯的泛素－3基因的启动子。在甚至更优选的实施方案中，组成型启动子是马铃薯的泛素－7基因的启动子。
在另一个实施方案中，位于P－DNA内的表达盒的启动子是可调节的启动子。在更优选的实施方案中，可调节的启动子对温度敏感。在甚至更优选的实施方案中，可调节的启动子是ci21A启动子或C17启动子，每个都是从马铃薯中分离（Schneider等，Plant Physiol.113：335－45，1997；Kirch等，Plant Mol Biol 33：897－909，1997）出来的。
在另一个实施方案中，可以临时方式调节位于P－DNA内的表达盒的启动子。在优选的实施方案中，启动子是rbcS启动子（Ueda等，Plant Cell1：217－27，1989）。
在另一个实施方案中，通过脱落酸、创伤、茉莉酮酸甲酯或赤霉酸中的任何一个调节位于P－DNA内的表达盒的启动子。在进一步的实施方案中，这种启动子是选自Rab 16A基因的启动子、α－淀粉酶基因的启动子或pin2基因的启动子的启动子。
在另一个实施方案中，位于P－DNA内的表达盒的启动子是组织特异性的启动子。在特别优选的实施方案中，这种启动子是从马铃薯中分离的GBSS启动子。
在一个实施方案中，本发明提供能够在大肠杆菌（E.coli）和土壤杆菌两者中复制，并含有P－DNA或经过修饰的P－DNA的P－DNA载体。在优选的实施方案中，这种载体在其主链中也含有细胞分裂素的基因表达盒以便能够选择抗主链整合的事件。
在另一个优选的实施方案中，期望的核苷酸序列进一步包括间隔元件。在更优选的实施方案中，间隔元件是Ubi内含子序列或GBSS间隔序列。
在另一个优选的实施方案中，期望的核苷酸序列包括编码功能失活蛋白的突变的天然基因，如果在转基因植物中表达，其降低该蛋白的全部活性。在更优选的实施方案中，这种突变的基因编码缺乏结合铜的结构域的功能失活的多酚氧化酶。
在另一个优选的所实施方案中，期望的核苷酸序列包括编码功能上有活性的蛋白的天然基因。在更优选的实施方案中，这种基因编码与烟草液泡转化酶抑制剂同源的蛋白。
在另一个实施方案中，位于P－DNA内的表达盒的终止子是Ubi3终止子序列或所选植物种基因的3’－非翻译区。
在本发明的另一个方面，提供一种修饰靶植物细胞的方法。在一个实施方案中，该方法包括：（1）使用LifeSupport介导的转化将修饰的P－DNA插入到靶植物细胞中至少一个细胞的基因组中；和（2）观察在靶植物细胞中是否有表型的改变；其中在修饰的P－DNA中启动子转录与天然基因相关的正义和/或反义的非翻译序列以减少该天然基因的表达，因而修饰靶植物细胞。在另一个优选的实施方案中，在修饰的P－DNA中启动子转录一种基因使得在靶植物细胞中过度表达该基因。
在另一个方面，提供一种制备含有修饰P－DNA的所选植物种的转基因植物细胞的方法。该方法包括用P－DNA载体和LifeSupport载体共转染所选植物种的植物细胞，其中LifeSupport载体包括两侧是T－DNA的左边缘和T－DNA的右边缘的标记基因和插入到载体主链中的突变型virD2基因，选择短暂地表达标记基因的植物细胞，以及分离含有整合到其基因组中的修饰P－DNA但不含有来自LifeSupport载体的任何核苷酸的植物细胞。在优选的实施方案中，该标记基因赋予抗卡那霉素的抗性。在最优选的实施方案中在卡那霉素抗性基因之后是酵母ADH终止子。
在优选的实施方案中，作为转化目标的所选植物种的植物细胞在培养物中。在另一个优选的实施方案中，作为转化目标的所选植物种的植物细胞在植物内。
本发明也提供所选种的植株，其包含至少一个其基因组含有修饰的P－DNA的细胞。在优选的实施方案中，该修饰的P－DNA在5’－到3’－方向上基本上由其功能象T－DNA边缘序列并且随后跟以P－DNA序列的第一个末端、启动子、可操作地连接到启动子和终止子两者上的期望的核苷酸序列、以及用第二末端描绘的另外的P－DNA序列构成。在另一个实施方案中，期望的多核苷酸代表在正义和/或反义方向上的前导序列、尾随序列和基因的一个或几个拷贝。
在另一个实施方案中，设想包含至少一个其基因组含有修饰的P－DNA的细胞的植物。
在本发明的另一个方面，提供减少所选植物种中的基因表达的方法。该方法包括用P－DNA载体对来自所选植物种的植物细胞进行LifeSupport介导的转化，其中将这种载体的修饰的P－DNA稳定地整合到所述植物细胞的基因组中。在本发明的另一个方面，修饰的P－DNA包括期望的能减少来自所选植物种的内源基因表达的多核苷酸。
在本发明的另一个方面，可以诱变所选植物种的天然基因并使用本发明的方法重新引入到植物中。优选地，使用P－DNA载体将突变基因，例如突变的PPO基因整合到植物细胞的基因组中。
本发明也提供减少所选的植物种中多酚氧化酶基因的不希望要的表达的方法。在优选的实施方案中，该方法包括将修饰的P－DNA整合到所选植物种的基因组中，该修饰的P－DNA仅由从所选植物种或者从与所选植物种性亲和的植物中分离的核苷酸序列构成，在5’－到3’－方向上基本上由功能象T－DNA边缘序列并且随后跟以侧翼P－DNA序列的第一个P－DNA末端；启动子；期望的核苷酸，其是与特异性的PPO基因相关的正义方向的尾随核苷酸序列；特异性的PPO基因尾随核苷酸序列的反义方向序列；终止序列，以及用第二末端的描绘其功能象T－DNA边缘的另外的P－DNA序列构成，其中启动子产生能减少特异性的PPO基因表达的双链RNA分子，因此减少植物的特异组织中的黑斑伤痕。在另一个实施方案中，从先于特异性的PPO基因的5’－非翻译区中获得前导核苷酸序列的正义和反义方向的核苷酸序列。在进一步的实施方案中，可以通过另一个多核苷酸序列，在这里称作内含子或“间隔区”，将与PPO基因相关的正义和反义方向的前导或尾随序列分离。在优选的实施方案中，前导或尾随序列与马铃薯PPO基因相关。在更优选的实施方案中，前导或尾随序列与在马铃薯块茎中表达的马铃薯PPO基因相关。在最优选的实施方案中，前导或尾随序列与在马铃薯的块茎中除了表皮之外的所有部分中都表达的马铃薯PPO基因相关。
本发明也提供在所选植物种的块茎中减少丙烯酰胺生产、贮藏期间诱导发芽、磷酸盐蓄积、和/或冷诱导变甜的方法。
在优选的实施方案中，该方法包括用修饰的P－DNA对所选植物种进行LifeSupport介导的转化，该修饰的P－DNA仅包括从所选植物种或从与所选植物种性亲和的植株中分离的核苷酸序列，在5’－到3’－方向上基本上由具有左边缘样序列的第一个P－DNA、启动子、期望的核苷酸序列，其是来自与R1基因相关的前导序列的正义方向的核苷酸序列、这个前导序列的反义方向序列、终止序列、以及右边缘样序列构成。一旦表达，产生能减少R1基因表达的前导－RNA双链体，因而在植物中减少冷诱导的变甜。在另一个实施方案中，期望的正义和反义方向的核苷酸序列代表与R1基因相关的尾随序列。在进一步的实施方案中，可以通过另一个多核苷酸序列，这里称作内含子或“间隔区”，将与R1相关的正义和反义方向的前导序列或尾随序列分离。
在另一个优选的实施方案中，该方法包括用修饰的P－DNA对所选植物种进行LifeSupport介导的转化，其中该修饰的P－DNA与上面描述的P－DNA相似，但含有与α葡聚糖磷酸化酶基因相关的前导或尾随序列。
在另一个优选的实施方案中，该方法包括用修饰的P－DNA对所选植物种进行LifeSupport介导的转化，其中该修饰的P－DNA含有转化酶抑制剂基因。
在另一个优选的实施方案中，使用在前面段落中描述的修饰的P－DNA以减少美拉德反应的额外的不想要的产物的蓄积，其发生在富含碳水化合物的食物，如马铃薯块茎的加热期间。这些不想要的产物包括一直与各种病理学相关的高级糖化末端产物（AGEs）。
本发明也提供提高植物和粮食作物贮藏器官中抗性淀粉水平的方法。
在优选的实施方案中，该方法包括用修饰的P－DNA对所选植物种进行LifeSupport介导的转化，其中该修饰的P－DNA含有与淀粉分支酶I和II基因有关的尾随序列的融合的表达盒。
本发明还提供减少所选植物种中的黑斑擦伤的方法，包括（i）将用边缘样序列描绘的P－DNA整合到所选植物种的基因组中，其中P－DNA仅包含天然属于或分离自所选植物种的多核苷酸，或者包含天然属于或分离自与所选植物种性亲和的植物种的多核苷酸，其中P－DNA在5’－到3’－方向上基本上由启动子、PPO基因的正义方向的前导核苷酸序列、前导核苷酸序列的反义方向序列以及终止序列构成，其中所述的启动子产生双链RNA分子，其中所述的双链RNA分子造成内源性PPO基因表达减少，因此减少植物中的黑斑擦伤。
本发明还提供减少所选植物种中的黑斑擦伤的方法，包括将用边缘样序列描绘的P－DNA整合到所选植物种的基因组中，其中P－DNA仅包含天然属于或分离自所选植物种的核苷酸序列，或者包含天然属于或分离自与所选植物种性亲和的植物种的多核苷酸，其中P－DNA在5’－到3’－方向上基本上由启动子、PPO基因的正义方向的尾随核苷酸序列、尾随核苷酸序列的反义方向序列以及终止序列构成，其中所述的启动子产生双链RNA分子，其中所述的双链RNA分子造成PPO基因表达减少，因此减少植物中的黑斑擦伤。
本发明还提供减少所选植物种中的冷诱导变甜的方法，包括将用边缘样序列描绘的P－DNA整合到所选植物种的基因组中，其中P－DNA仅包含从所选植物种中分离的核苷酸序列，或者包含天然属于或分离自与所选植物种性亲和的植物种的多核苷酸，其中P－DNA在5’－到3’－方向上基本上由启动子、与R1基因相关的正义方向的前导核苷酸序列、前导核苷酸序列的反义方向序列以及终止序列构成，其中所述的启动子产生双链RNA分子，其中所述的双链RNA分子减少R1基因的表达，因此减少植物中冷诱导的变甜。
本发明还提供减少所选植物种中的冷诱导变甜的方法，包括将用边缘样序列描绘的P－DNA整合到所选植物种的基因组中，其中P－DNA仅包含从所选植物种中分离的核苷酸序列，或者由天然属于或分离自与所选植物种性亲和的植物种的多核苷酸，其中P－DNA在5’－到3’－方向上基本上由启动子、与R1基因相关的正义方向的尾随核苷酸序列、尾随核苷酸序列的反义方向序列以及终止序列构成，其中所述的启动子产生双链RNA分子，其中所述的双链RNA分子减少R1基因的表达，因此减少植物中冷诱导的变甜。
本发明也提供包含主要在块茎中表达的马铃薯GBSS基因和马铃薯蛋白酶抑制剂基因的启动子的分离的核苷酸序列。分离的启动子分别具有SEQ ID NO.：6和SEQ ID NO.：40中所显示的核苷酸序列。
在一个方面，本发明提供修饰所选植物性状的方法，包括：
a.用期望的多核苷酸稳定地转化所选植物的细胞，其中期望的多核苷酸基本上由所选植物、同种植物或者与所选植物性互交可孕的植物的天然核酸序列构成，
b.从转化的植物细胞中获得稳定转化的植物，其中转化的植物含有稳定整合到基因组中的期望的多核苷酸，并且其中期望的多核苷酸修饰该性状。
在优选的的实施方案中，该方法进一步包括用在植物细胞中短暂表达的选择性标记基因共转染植物细胞，鉴定转化的植物细胞，从转化的植物细胞中获得转化的植物，其中没有将选择性标记基因稳定地整合，而将期望的多核苷酸稳定地整合到基因组中。
在优选的实施方案中，期望的多核苷酸包括P－DNA、GBSS启动子、Ubi7启动子、Ubi3启动子、PIP启动子、修饰的PPO基因、转化酶抑制剂基因、耐盐性基因、与R1相关的前导序列、与磷酸化酶相关的前导序列、与R1相关的尾随序列、与SBE相关的尾随序列、Ubi内含子、GBSS间隔区、UbiT。
在另一个优选的实施方案中，本发明的“植物”是单子叶植物，从由小麦、草皮、草坪草、谷类植物、玉米、水稻、燕麦、小麦、大麦、高梁、兰花、蝴蝶花、百合、洋葱、香蕉、甘蔗、高梁、以及棕榈构成的组中选出。
在另一个实施方案中，本发明的“植物”是双子叶植物，从由avacado、马铃薯、烟草、番茄、甜菜、花茎甘蓝、木薯、甘薯、胡椒、棉花、一品红、豆科植物、苜蓿、大豆、胡萝卜、草莓、莴苣、橡树、枫树、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雏菊、以及仙人掌构成的组中选出。
在另一个实施方案中，通过土壤杆菌介导的转化来转化本发明方法的植物和植物细胞。优选地，土壤杆菌介导的转化依赖于使用至少一种双载体。在另一个实施方案中，土壤杆菌介导的转化方法使用第一双载体和第二双载体。在优选的实施方案中第一个双载体含有期望的多核苷酸，第二双载体含有选择性的标记基因，其中选择性的标记基因可操作地连接到启动子和终止子上。
根据本发明的方法，被修饰的性状是从下列性状构成的组中选出：提高的健康和营养特性、改善的贮藏性、提高的产量、增强的耐盐性、增强的重金属耐受性、提高的干旱耐受性、提高的疾病耐受性、提高的昆虫耐受性、提高的水应力耐受性、增强的冷和霜冻耐受性、增加颜色、增加甜味、提高活力、改善口味、改善质地、降低磷酸盐含量、提高发芽率、提高微营养摄入、改善淀粉组成、提高花的寿命。
本发明也包括通过本发明方法制备的植物。
在另一个方面，本发明提供修饰所选植物性状的方法，包括：
（a）鉴定要修饰的性状；
（b）构建第一个多核苷酸，其基本上由从所选植物、同种植物、或与所选植物性互交可孕的植物中分离的天然遗传元件构成，其中天然的遗传元件能够修饰控制该性状的基因的表达；
（c）构建包含可操作地连接到启动子和终止子上的选择性标记基因的第二多核苷酸；
（d）用第一和第二多核苷酸共转染来自所选植物的植物细胞；
（e）选择选择性标记基因的短暂表达；
（f）对用第一个多核苷酸稳定转化但是不含有整合到基因组中的第二个DNA分子的植物细胞进行筛选；和
（g）从显示该性状的表达经过修饰的转化的植物细胞中获得稳定转化的植物。
在一个实施方案中，遗传元件包括启动子、兴趣序列、终止子、增强子、内含子、间隔区或调节元件中的至少一个。在另一个实施方案中，权利要求4的方法，其中在第二个多核苷酸转染前，用第一个多核苷酸转染植物细胞，或者反过来。
在一个实施方案中，兴趣序列是基因。在另一个实施方案中，该基因是突变的或是野生型的多酚氧化酶基因或者是突变的或野生型的R1基因。在一个另外的实施方案中，兴趣序列是前导序列或尾随序列，其中前导或尾随序列代表植物细胞天然基因的上游或下游序列。在另一个实施方案中，兴趣序列包括可操作地连接到反义前导序列上的正义方向的前导序列。在另一个实施方案中，兴趣序列包括可操作地连接到反义尾随序列上的正义方向的尾随序列。在另一个实施方案中，启动子是可诱导的启动子。在另一个实施方案中，终止子是酵母ADH终止子序列。
根据本发明，前导序列构建物在5’－到3’－方向上包括启动子、正义方向上的前导序列、前导序列的反义序列、以及终止子，其中前导序列构建物的表达产生便于向下调节与其相关的基因表达的双链RNA分子。在一个另外的实施方案中，前导序列与PPO基因、R1基因、L型磷酸化酶基因、或者α葡聚糖磷酸化酶基因的编码区相关并位于其上游。
在另一个实施方案中，尾随构建物在5’－到3’－方向上包括启动子、正义方向上的尾随序列、尾随序列的反义序列、以及终止子，其中尾随序列构建物的表达产生便于向下调节与其联系的基因表达的双链RNA分子。在优选的实施方案中，尾随序列与PPO基因、R1基因、L型磷酸化酶基因、或者α葡聚糖磷酸化酶基因的编码区相关并位于其下游。
该方法进一步包括将植物细胞暴露于包含标记元件的第二载体，其中该标记在转化的植物中短暂地表达，并且不被稳定地整合到转化植物的基因组中。在一个实施方案中，该标记是除草剂的抗性基因、抗生素抗性基因、或NPTII。
优选地，通过土壤杆菌介导的转化来转化植物细胞。在一个实施方案中，土壤杆菌介导的转化依赖于使用至少一个双载体。在另一个实施方案中，该土壤杆菌（Agrobacterium）介导的转化方法使用第一双载体和第二双载体。在一个另外的实施方案中，第一双载体带有第一多核苷酸，第二双载体带有第二多核苷酸。
本发明提供另一个修饰所选植物中基因表达的方法，包括：
（a）鉴定功能基因；
（b）构建基本上由从所选植物、与所选植物同种的植物、或者与所选植物性互交可孕的植物中分离的天然遗传元件构成的第一多核苷酸，其中该天然遗传元件能够修饰该基因的表达；
（c）构建包含功能性选择性标记基因的第二多核苷酸；
（d）用第一和第二多核苷酸共转染来自所选植物的植物细胞；
（e）选择选择性标记基因的短暂表达；
（f）筛选用第一个多核苷酸稳定地转化，但不含有整合到基因组中的第二多核苷酸的植物细胞；和
（g）从显示该基因的表达经过修饰的转化植物细胞中获得转化植物。
优选地，通过土壤杆菌介导的转化来转化植物细胞。在一个实施方案中，土壤杆菌介导的转化依赖于使用至少一个双载体。在另一个实施方案中，土壤杆菌介导的转化方法使用第一双载体和第二双载体。在一个另外的实施方案中，第一双载体带有第一多核苷酸，第二双载体带有第二多核苷酸。
在另一个实施方案中，第一多核苷酸包括P－DNA、GBSS启动子、Ubi7启动子、Ubi3启动子、PIP启动子、修饰的PPO基因、转化酶抑制剂基因、耐盐性基因、与R1相关的前导序列、与磷酸化酶相关的前导序列、与R1相关的尾随序列、与SBE相关的尾随序列、Ubi内含子、GBSS间隔区、UbiT中的至少一个。
在另一个实施方案中，第二多核苷酸包括选择性标记基因、Ω－突变的virD2多核苷酸、codA多核苷酸、以及codA：：upp融合多核苷酸中的至少一个。
本发明也包括通过这种方法制备的植物。
在一个另外的实施方案中，提供显示与其来源的非转基因植物相比性状的表达经过修饰的转基因植物，其中用基本上由天然的遗传元件构成的期望的多核苷酸稳定地转化转基因植物，该天然的遗传元件从该植物、同种植物、或者与该植物性互交可孕的植物中分离，其中该多核苷酸修饰性状的表达。
在另一个优选的实施方案中，本发明的“植物”是单子叶植物，从由小麦、草皮、草坪草、谷类植物、玉米、水稻、燕麦、小麦、大麦、高梁、兰花、蝴蝶花、百合、洋葱、香蕉、甘蔗、高梁、以及棕榈构成的组中选出。
在另一个实施方案中，本发明的“植物”是双子叶植物，从由avacado、马铃薯、烟草、番茄、甜菜、花茎甘蓝、木薯、甘薯、胡椒、棉花、一品红、豆科植物、苜蓿、大豆、胡萝卜、草莓、莴苣、橡树、枫树、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雏菊、以及仙人掌构成的组中选出。
在另一个实施方案中，性状从下列性状构成的组中选出：提高的健康和营养特性、增加的贮藏性、提高的产量、增强的耐盐性、增强的重金属耐受性、提高的干旱耐受性、提高的疾病耐受性、提高的昆虫耐受性、提高的水应力耐受性、增强的冷和霜冻耐受性、增加的颜色、增加的甜味、提高的活力、改善的口味、改善的结构、降低的磷酸盐含量、提高的发芽率、提高的微营养摄入、改善的淀粉组成、提高的花的寿命。
在另一个实施方案中，期望的多核苷酸包括P－DNA、GBSS启动子、Ubi7启动子、Ubi3启动子、PIP启动子、修饰的PPO基因、转化酶抑制剂基因、耐盐性基因、与R1相关的前导序列、与磷酸化酶相关的前导序列、与R1相关的尾随序列、与SBE相关的尾随序列、Ubi内含子、GBSS间隔区、UbiT中的至少一个。
本发明也包括大小在从20到100bp范围的分离的边缘样核苷酸序列，其与根癌农杆菌的T－DNA边缘序列有52％与96％的序列相同。在优选的实施方案中，分离的核苷酸序列是从单子叶植物中分离的，单子叶植物从由小麦、草皮、草坪草、谷类植物、玉米、水稻、燕麦、小麦、大麦、高梁、兰花、蝴蝶花、百合、洋葱、香蕉、甘蔗、高梁、以及棕榈构成的组中选出。在另一个实施方案中，核苷酸序列是从双子叶植物中分离的，该双子叶植物从由马铃薯、烟草、番茄、甜菜、花茎甘蓝、木薯、甘薯、胡椒、棉花、一品红、豆科植物、苜蓿、大豆、胡萝卜、草莓、莴苣、橡树、枫树、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雏菊、以及仙人掌构成的组中选出。
在另一个实施方案中，分离的核苷酸序列是从马铃薯中分离的，并且具有在SEQ ID NO.94或95中显示的核苷酸序列。在优选的实施方案中，分离的核苷酸序列与根癌农杆菌的T－DNA边缘序列有52％的序列相同。本发明包括包含这样的核苷酸序列的载体。
本发明也提供制备用期望的多核苷酸稳定转化的植物的方法，包括：
（a）从该植物中分离两侧是边缘样序列的P－DNA，其中边缘样序列与根癌农杆菌的T－DNA边缘序列有52％至96％的序列同一性；
（b）在P－DNA边缘样序列之间插入期望的多核苷酸以形成P－DNA构建物；和
（c）用P－DNA构建物转化来自该植物的植物细胞；和
（d）从用P－DNA构建物稳定转化的转化植物细胞中重新获得植株。
在一个实施方案中，在由主链整合标记基因构成的载体上携带该P－DNA构建物，并且选择不含有主链整合标记基因的转化的植物细胞。在另一个实施方案中，该主链整合标记基因是细胞分裂素基因。在另一个实施方案中，不选择显示过量生产细胞分裂素表型的植物枝条。在另一个实施方案中，主链整合标记基因是IPT基因，不选择显示异常表型或者不能产生根的植物枝条。
在一个另外的实施方案中，植物细胞来自单子叶植物，该单子叶植物从由小麦、草皮、草坪草、谷类植物、玉米、水稻、燕麦、小麦、大麦、高梁、兰花、蝴蝶花、百合、洋葱、香蕉、甘蔗、高梁、以及棕榈构成的组中选出。
在另一个实施方案中，该植物细胞来自双子叶植物，该双子叶植物从由马铃薯、烟草、番茄、甜菜、花茎甘蓝、木薯、甘薯、胡椒、棉花、一品红、豆科植物、苜蓿、大豆、胡萝卜、草莓、莴苣、橡树、枫树、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雏菊、以及仙人掌构成的组中选出。
优选地，通过土壤杆菌介导的转化来转化植物细胞。在一个实施方案中，土壤杆菌介导的转化依赖于使用至少一个双载体。在另一个实施方案中，该土壤杆菌介导的转化方法使用第一双载体和第二双载体。在一个另外的实施方案中，第一双载体具有第一多核苷酸，第二双载体具有第二多核苷酸。在一个进一步的实施方案中，第二双载体包括阴性的选择性标记基因和Ω－突变的virD2基因中的至少一个，其中阴性的选择性标记基因是位于T－DNA右边缘和T－DNA左边缘内，并且其中Ω－突变的virD2基因位于第二双载体的主链内。在优选的实施方案中，第二双载体包括位于T－DNA右边缘和T－DNA左边缘内的阴性选择性标记基因，以及位于第二双载体主链内的Ω－突变的virD2基因。在本发明的一种实施方案中，所述第二双载体包括阴性的选择性标记基因和妨碍整合的基因中的至少一个，其中阴性的选择性标记基因位于T－DNA右边缘序列和T－DNA左边缘序列内，其中妨碍整合的基因位于第二双载体的主链内。
本发明也提供在5’－到3’－方向上基本上由第一T－DNA边缘样序列、启动子、可操作地连接到启动子上的期望的多核苷酸序列、终止子以及第二T－DNA边缘样序列构成的P－DNA，其中边缘样序列与T－DNA边缘序列具有小于100％的序列同一性。
在优选的实施方案中，T－DNA边缘样序列、启动子、期望的多核苷酸以及终止子都是从相同植物、相同植物种、或性互交可孕的植物中分离出来的。
在另一个实施方案中，P－DNA进而基本上由选择性标记基因构成。
在另一个实施方案中，T－DNA边缘样序列、启动子、期望的多核苷酸、终止子和选择性标记基因都是从相同植物、相同植物种、或性互交可孕的植物中分离。
在另一个实施方案中，P－DNA中的期望的多核苷酸序列是基因编码区的上游或下游序列，其中该上游序列是前导序列，其中下游序列是尾随序列。在这个实施方案中，T－DNA边缘样序列、启动子、前导序列、尾随序列、终止子和选择性标记基因都是从相同植物、相同植物种、或性互交可孕的植物中分离出来的。
在另一个实施方案中，由本发明提供包含这样的P－DNA构建物的载体。
在另一个实施方案中，启动子是可调节的启动子。在另一个实施方案中，可调节的启动子对温度敏感。在优选的实施方案中，可调节的启动子是小麦wcs120启动子。在另一个实施方案中，启动子是在时序调控下。在另一个实施方案中，启动子是羧化酶启动子。在进一步的实施方案中，羧化酶启动子是玉米羧化酶启动子。
可以通过脱落酸、创伤、茉莉酮酸甲酯或赤霉酸中的任何一种来调节启动子。在另一个实施方案中，启动子是选自Rab 16A基因启动子、α淀粉酶基因启动子或者pin2基因启动子的启动子。在另一个实施方案中，启动子是组织特异性的启动子。
在一个另外的实施方案中，前导序列是所选植物种细胞的内源基因的5’－非翻译区的一部分。在另一个实施方案中，5’－非翻译区位于基因的起始密码子的上游，其中该基因从由PPO基因、R1基因、HOS1基因、S－腺苷高半胱氨酸水解酶基因、II类肉桂酸－4－羟化酶基因、肉桂酰－辅酶A还原酶基因、肉桂酰醇脱氢酶基因、咖啡酰辅酶A O－甲基转移酶基因、肌动蛋白解聚因子基因、Nin88基因、Lol p 5基因、变应原基因、P450羟化酶基因、ADP－葡萄糖焦磷酸化酶基因、脯氨酸脱氢酶基因、内－1，4－β－葡聚糖酶基因、玉米黄质环氧酶基因、以及1－氨基环丙烷－1－羧酸合酶基因构成的组中选出。
在另一个实施方案中，尾随序列是位于选自下列基因的终止密码子下游的基因的3’－非翻译区的一部分：PPO基因、R1基因、HOS1基因、S－腺苷高半胱氨酸水解酶基因、II类肉桂酸－4－羟化酶基因、肉桂酰－辅酶A还原酶基因、肉桂酰醇脱氢酶基因、咖啡酰辅酶A O－甲基转移酶基因、肌动蛋白解聚因子基因、Nin88基因、Lol p 5基因、变应原基因、P450羟化酶基因、ADP－葡萄糖焦磷酸化酶基因、脯氨酸脱氢酶基因、内－1，4－β－葡聚糖酶基因、玉米黄质环氧酶基因、以及1－氨基环丙烷－1－羧酸合酶基因。
本发明的载体可以进一步包括间隔元件，该间隔元件是Ubi内含子序列或者GBSS间隔区序列。在另一个实施方案中，载体包括终止子，该终止子是Ubi3终止子序列或内源性植物基因的3’－非翻译区。
在另一个实施方案中，载体包括可选择性地连接到组成型启动子上的选择性标记基因以及可操作地连接到诱导型启动子上的Cre基因，其中选择性标记基因和Cre基因的两侧是第一重组酶的识别位点和第二重组酶的识别位点。在另一个实施方案中，第一重组酶的识别位点和第二重组酶的识别位点是lox位点。
在另一个实施方案中，诱导型启动子是温度敏感的启动子、化学诱导的启动子或时序启动子。在另一个实施方案中，诱导型启动子是Ha hsp17.7G4启动子、小麦wcs120启动子、Rab 16A基因启动子、α淀粉酶基因启动子、pin2基因启动子、羧化酶启动子。在另一个优选的实施方案中，进一步包括植物来源的标记基因。在另一个优选的实施方案中，植物来源的标记基因是烯醇丙酮酰－3－磷酸莽草酸合酶基因。
在本发明的另一个方面，提供了修饰植物细胞的方法，包括将P－DNA序列整合到植物细胞的基因组中，其中该P－DNA在5’－到3’－方向上基本上由第一T－DNA边缘样序列、启动子、可操作地连接到启动子上的期望的多核苷酸序列、终止子以及第二T－DNA边缘样序列构成，其中边缘样序列与T－DNA边缘序列有小于100％的序列同一性，其中T－DNA边缘样序列、启动子、期望的多核苷酸序列和终止子都分离自或天然属于植物细胞的基因组，其中期望的多核苷酸包括与植物基因的上游或下游非编码区相关的前导序列或尾随序列的正义和反义序列，其中期望的多核苷酸的表达产生靶向与期望的多核苷酸相关的基因的双链RNA转录本，从而修饰植物细胞。
本发明也包括修饰植物的方法，包括：
（i）用本发明的载体转染植物中的至少一个细胞；
（ii）选择表达功能性的选择性标记的细胞；
（iii）分离表达功能性的选择性标记的细胞；
（iii）诱导功能性的Cre基因在分离的细胞中的表达；
(iV)培养分离的细胞；和
(ii)观察培养的细胞的表型；
其中与未转染的植物细胞不同的表型表明靶植物细胞已经被修饰。
在优选的实施方案中，这种方法和本发明的其它方法的选择步骤是通过鉴定抵抗抗生素的细胞而进行的。
在另一个方面，鉴定其基因组含有P－DNA的靶植物细胞的方法，包括用本发明的载体和来源于第二土壤杆菌的载体共转染植物靶细胞，该第二载体包含两侧是T－DNA左边缘和T－DNA右边缘的标记基因以及Ω－突变的virD2基因，其中将P－DNA整合到植物靶细胞的基因组中，其中没有将来源于第二土壤杆菌的载体的任何部分整合到植物靶细胞的基因组中，在优选的实施方案中，在来源于第二土壤杆菌的载体中的标记是新霉素磷酸转移酶基因。
在另一个方面，提供鉴定其基因组含有整合盒的至少一部分的靶植物细胞的方法，进而包括选择在含卡那霉素的培养基中暂时生长存活的细胞，其中所选择细胞的基因组仅含有整合盒。在一个实施方案中，所述的靶植物细胞在植物内。本发明也包括包含至少一个其基因组含有这样的P－DNA的细胞的植物。
本发明也包括包含至少一个其基因组被人工操作以仅含有植物来源的核酸的细胞的植物，其中该植物的细胞不含有整合到细胞基因组中的外源核酸。所述细胞能够表达植物来源的核酸中的至少一个，该核酸的表达修饰了与植物相关的特性。
本发明也包括包含SEQ ID NO.93的多核苷酸序列的多核苷酸，其中多核苷酸的长度为20至80个核苷酸。在一个实施方案中，多核苷酸的长度为21至70个核苷酸，22至50个核苷酸，23至40个核苷酸，或者为24至30个核苷酸。
在另一个方面，本发明包括在SEQ ID NO.40中所显示的块茎特异性启动子。
本发明也包括基于土壤杆菌的制备不含有稳定地整合在核DNA中的选择性标记基因的转基因植物细胞的方法，包括：
a.构建由多核苷酸构成的第一双载体，该多核苷酸基本上由在期望的功能基因的5’和3’末端可操作地连接到T－DNA边缘或T－DNA边缘样序列上的期望的功能基因构成；
b.构建由在功能性的选择标记基因的5’和3’末端可操作地连接到T－DNA边缘或T－DNA边缘样序列上的功能性选择标记基因构成的第二双载体；
c.用下列菌株培育植物细胞：
i.带有第一和第二双载体的土壤杆菌菌株；或
ii.带有第一双载体的第一土壤杆菌菌株和带有第二双载体的第二土壤杆菌菌株；
d.选择其中将期望的功能基因整合到植物核DNA中，而没有将选择性的标记基因整合到植物的核DNA中的植物细胞，接着在含有适当选择剂的培养基上培养适当的时间。
在优选的实施方案中，选择性标记基因是除草剂抗性基因或抗生素抗性基因。在另一个优选的实施方案中，抗生素抗性基因是nNPTII基因。在另一个实施方案中，抗生素抗性基因是可操作地连接到泛素－7基因的启动子和酵母醇脱氢酶1（ADH）基因的终止子上的nptII结构基因。根据这个方法，首先与第一土壤杆菌菌株一起培养植物细胞，接着与第二土壤杆菌菌株一起培养，或者反过来。
在优选的实施方案中，第一双载体还包括双整合标记基因，该基因可用于检测用双载体主链序列稳定转化的植物细胞。在另一个实施方案中，双载体整合标记基因从由除草剂抗性基因、抗生素抗性基因或NPTII构成的组中选出。在另一个实施方案中，第二双载体进而包括在细菌和胞嘧啶脱氨酶（codA）和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶（upp）的基因之间的基因融合，该基因融合在T－DNA或T－DNA边缘样序列之间插入，将植物细胞暴露于5－氟胞嘧啶，接着与第一和第二土壤杆菌菌株一起培养以便选择抗那些用第二双载体转化的植物细胞。
在另一个实施方案中，第二双载体还包括减少主链整合的可能性的基因。在一个实施方案中，这样的基因是Ω－突变的virD2基因，其中Ω－突变的virD2基因减少选择性标记基因整合到植物的核DNA中的频率。
本发明也包括包含从马铃薯中分离的GBSS启动子的分离的核苷酸序列。在优选的实施方案中，这个分离的核苷酸序列具有SEQ ID.NO.6或13的核苷酸序列。
附图的简要描述
图1.在本发明中使用的一些P－DNA载体的图示说明。P－DNA区用灰盒显示。“ipt”等于ipt基因的表达盒；“npt”等于nptII基因的表达盒；“mPPO”等于修饰的PPO基因的表达盒；“INH”等于转化酶抑制剂基因的表达盒；“GUS”等于GUS基因的表达盒；“LPPO”等于与PPO基因有关的前导序列的正义和反义拷贝的表达盒；“LPH”等于与磷酸化酶基因有关的前导序列的正义和反义拷贝的表达盒；“Alf”等于马铃薯Alfin同系物的表达盒。详细描述见正文。
图2.无基因的表达盒。
图3.马铃薯和烟草转化酶抑制剂蛋白的序列对比。“St”等于马铃薯；“Nt”等于烟草。
图4.与各种PPO基因相关的尾随序列的对比。
图5.在本发明中使用的一些LifeSupport载体的图示说明。“codA”是codA基因的表达盒；“codA：：upp”是融合到upp上的codA基因的表达盒；“ΩvirD2”是ΩvirD2基因的表达盒。
优选实施方案的详细描述
本发明的“精确育种”策略改善植物和农作物的农艺性状、营养价值以及健康特性，不将未知的核酸、或外源物种的核酸引入植物种基因组中，并且不产生不想要的表型或有害的副作用。
因此，本发明提供转基因植物以及制备这样植物的方法，该方法不将非植物种的核酸整合到该植物的基因组中。核酸、启动子、调节元件、其它非编码的基因序列、标记、多核苷酸、以及整合到所选植物的基因组中的基因优选地都是从将被转化的植物、将被转化的相同种的植物或者与被转化植物性互交可孕的植物中分离出来。根据这里描述的方法，这样的“天然”核酸可被诱变、修饰或与其它天然核酸共同加入表达盒中，并重新整合到所选植物的基因组中。相应地，仅使用所选植物自己的核酸，或使用与所选植物性亲和植物的核酸来改变转基因植物的基因型和表型。
为了便于这种转基因植物的生产，本发明利用不是在土壤杆菌介导的转化中使用的所有T－DNA载体实际上都被整合到植物基因组中的事实，即，尽管载体可能被植物细胞摄入，但是可能不发生实际的整合事件。根据本发明，可以使用这样的载体将选择性标记基因带到植物细胞中。然后通过测定标记基因表达了多长时间来筛选植物细胞，以确定标记是否已经被稳定地整合到植物基因组中。相应地，期望仅短暂地表达选择性标记基因的植物细胞，因为它们代表摄入了选择性标记基因，但没有将其整合到它们的基因组中的细胞。
因此，通过使用这样的“标记载体”以及也用另一个含有期望的天然基因或多核苷酸的载体共转化的植物，可以选择两个载体都摄入的植物细胞，从这些细胞中确定哪些细胞具有仅含有期望的基因或多核苷酸的基因组。可以修饰“标记载体”进而减少标记物将被整合到植物基因组中的可能性。本发明提供以“LifeSupport”载体形式存在的这类“标记载体”。
除非另有定义，这里使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。一般地，这里使用的名称、细胞培养的实验室方法、分子遗传学，以及这里描述的核酸化学和杂交，都是现有技术中那些公知的和通常使用的方法。使用重组核酸方法、多核苷酸合成、微生物培养、细胞培养、组织培养、转化、转染、转导、分析化学、有机合成化学、化学合成、化学分析，以及药物配制和输送的标准技术。一般地，根据生产商的说明进行酶促反应以及纯化和/或分离步骤。一般根据公开的常规方法学来实施技术和方法，例如在Molecular cloning alaboratory manual，2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY（1989），和Current protocols in molecular biology，John Wiley&Sons，Baltimore，MD（1989）公开的方法。
氨基酸序列：这里使用的氨基酸序列包括寡肽、肽、多肽、或蛋白及其片段，其分离自、属于、或是在植物中天然存在的，或者是合成制备的，但包括内源对应物的核酸序列。
人工操纵的：这里使用的“人工操纵的”意思是通过手工或通过机械方法或重组的方法，如通过遗传工程技术，移动、排列、操作或控制植物或植物细胞，以便产生与未被操作的天然存在的对应物相比具有不同的生物学、生物化学、形态学、或生理表型和/或基因型的植物或植物细胞。
无性繁殖：通过从叶插、茎插、根插、块茎芽眼、匍匐丝、单个植物细胞原生质体、胼胝体等中产生整个植物的方法来生产子代，不包括配子的融合。
主链：除去用于转移的T－DNA或P－DNA序列之外的双载体的核酸序列。
边缘和边缘样序列：“边缘序列”是来源于土壤杆菌的特异性序列。典型地，左边缘序列和右边缘序列位于T－DNA的两侧，它们两者都作为virD2催化的切割反应的识别位点。这样的活性释放位于这样的边缘序列之间的核酸。见下表2中的边缘序列的实例。将释放的核酸与virD2和virE2构成复合体靶向经常将核酸整合到植物细胞基因组中的植物细胞核。通常，使用两个边缘序列，左边缘和右边缘，将位于它们之间的核苷酸序列整合到另一个核苷酸序列中。也可能仅用一个边缘序列，或者多于两个边缘序列，以这样的方式完成期望核酸的整合。
根据本发明，“边缘样”序列是从将要修饰的所选植物种，或者与将要修饰的植物种性亲和的植物中分离的，其功能象土壤杆菌（Agrobacterium）的边缘序列。即，本发明的边缘样序列促进和便于与其相连的多核苷酸的整合。本发明的植物DNA，即P－DNA优选地含有边缘样序列。
P－DNA的边缘样序列长度为5－100bp，10－80bp，15－75bp，15－60bp，15－50bp，15－40bp，15－30bp，16－30bp，20－30bp，21－30bp，22－30bp，23－30bp，24－30bp，25－30bp，或26－30bp。
本发明的边缘样序列可从任何植物中分离，如从马铃薯和小麦中分离。见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.34，这些序列在任一末端含有分别从马铃薯和小麦中分离的边缘样序列。因此，本发明使用的P－DNA左侧和右侧边缘序列是分离自和/或天然属于将要修饰的植物的基因组。P－DNA边缘样序列在核苷酸序列上不同于任何已知的来源于土壤杆菌的T－DNA边缘序列。因此，P－DNA边缘样序列可能具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或更多个不同于土壤杆菌种，如根癌农杆菌或发根植物单胞菌的T－DNA边缘序列的核苷酸。即，本发明的P－DNA边缘序列或边缘样序列与土壤杆菌种，如根癌农杆菌或发根植物单胞菌的T－DNA边缘序列具有至少95％，至少90％，至少80％，至少75％，至少70％，至少60％或至少50％的序列同一性，但不是100％序列同一性。这里使用的描述性术语“P－DNA边缘”和“P－DNA边缘样”可以互换。
天然的P－DNA边缘序列在核苷酸序列上与土壤杆菌的T－DNA边缘序列具有高于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、52％、51％或50％的相似性。因而边缘样序列可从植物基因组中分离，并被修饰或突变以改变通过其能够将核苷酸序列整合到另一个核酸序列中的效率。可在本发明的边缘样序列内加入或掺入其它的多核苷酸序列。因此，可以修饰P－DNA的左侧边缘序列或P－DNA的右侧边缘序列以使其具有5’－和3’－多克隆位点或者另外的限制性酶切位点。可以修饰P－DNA的边缘序列以提高不将伴随载体的主链DNA整合到植物基因组中的可能性。
下列表2描绘了已知的T－DNA边缘序列和在这里被鉴定为边缘样序列的序列。在表2中没有一个被鉴定为“边缘样”的序列以前被鉴定为具有T－DNA边缘样结构。通过本发明的方法在聚合酶链反应中使用简并引物从马铃薯基因组DNA中分离马铃薯的边缘样序列。本发明包括使用任何P－DNA边缘样序列将共连接的多核苷酸转移到植物细胞的基因组中。
实际上，本发明包括具有SEQ ID NO.93：ANGATNTATN6GT（SEQID NO.93）的核酸序列结构的任何边缘样序列，其中“N”是任何核苷酸，如“A”、“G”、“C”、“T”代表的那些核苷酸。这个序列代表通过本发明鉴定的边缘样核酸的共有序列。
表2.“边缘”和“边缘样”序列
Figure BDA00002344442100331
Figure BDA00002344442100341
Y=C或T；R=A或G；K=G或T；M=A或C；W=A或T；S=C或G；V=A，C，或G；B=C，G，或T。
边缘样序列的登记号为：水稻染色体10BAC OSJNBa0096G08基因组序列（AC078894.11）；拟南芥染色体3（NM_114337.1）；拟南芥染色体1（NM_105664.1）；嗜热厌氧杆菌株MB4T，全部基因组244个区中的第118区（AE013091.1）；人克隆HQ0089（AF090888.1）；根瘤菌属克隆：rhiz98el2.qlk。*根据目前描述的本发明的方法获得和分离了马铃薯左侧和右侧边缘序列。
载体DNA：“载体DNA”是用于携带某些遗传元件并将它们传递到植物细胞中的DNA片段。在常规的外源DNA转移中，这种载体DNA常常是土壤杆菌的T－DNA，用边缘序列来描绘。这里描绘的载体DNA是从将要修饰的所选植物种中获得的，并含有结构上和功能上不同于T－DNA边缘序列，但与这样的T－DNAs具有同样能力的末端，该能力能够支持DNA从土壤杆菌转移到植物细胞或某些其它真核生物的核中以及随后将这种DNA整合到这样的真核生物的基因中。
基本上由……构成：基本上由某些元件“构成”的组合物限于那些元件的包含物，以及那些实质上不影响本发明的组合物的基本特性和新特性的元件。因此，只要该组合物不影响本发明的基本特性和新特性，即不含有不是从所选植物种或与所选植物种性亲和的植物中分离的外源DNA，则该组合物可以被认为是本发明组合物的组分，其特点是用用语“基本上由……构成”表示。
简并引物：“简并引物”是含有足够的核苷酸变异的寡核苷酸，当与相似的，但不是严格同源的序列杂交时，其能迁就碱基错配。
双子叶植物（dicot）：其胚有两个子叶的有花植物。双子叶植物的实例包括但不限于烟草、番茄、马铃薯、甘薯、木薯、包括苜蓿和大豆的豆科植物、胡萝卜、草莓、莴苣、橡树、枫树、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雏菊、以及仙人掌。
调节序列：指对本领域技术人员来说是标准的和已知的那些序列，其可以被包含在表达载体中，以在植物系统中提高和/或使兴趣基因的转录最大化或提高和/或使得到的RNA翻译最大化。这些包括但不限于启动子、肽输出信号序列、内含子、聚腺苷酸化以及转录终止位点。修饰核酸构建物以提高在植物中的表达水平的方法在现有技术中通常也是已知的（见，例如Rogers等，260J.Biol.Chem.3731－38，1985；Cornejo等，23 PlantMol.Biol.567：81，1993）。在加工植物系统以影响蛋白的转录率中，现有技术中已知的各种因子，包括调节序列，如正向或负向作用序列、增强子和沉默子以及染色质结构可能都有影响。本发明提供可在工程植物中利用这些因子中的至少一种来表达兴趣蛋白。本发明的调节序列是天然的遗传元件，即从将被修饰的所选植物中分离的遗传元件。
外源：“外源”，对核酸来说，意味着核酸来源于非植物生物或来源于与将要转化的植物不同种的植物或者不是来源于不与将要转化的植物性互交可孕的不属于靶植物种的植物。
根据本发明，外源DNA或RNA代表在真菌、细菌、病毒、哺乳动物、鱼或鸟的遗传组成中天然存在的核酸，但不是天然存在于将要转化的植物中。因此，外源核酸是编码例如不被转化的植物天然生产的多肽的核酸。外源核酸不必编码蛋白产物。根据本发明，期望的转基因植物是不含整合在其基因组中的任何外源核酸的植物。
在另一个方面，可将天然遗传元件掺入和整合到根据本发明所选的植物种的基因组中。从属于所选植物种的植物或从与所选植物种性亲和的植物中分离天然遗传元件。例如，掺入到培养的马铃薯中的天然DNA可来源于任何基因型的马铃薯或与马铃薯（例如，S.demissum）性亲和的任何基因型的野生型马铃薯种。
基因：“基因”是指编码区，不包括5’－或3’－端到该区的核苷酸序列。功能基因是可操作地连接到启动子或终止子上的编码区。
遗传重排：是指可在活体内以及在体外自然发生的遗传元件的重新组合，其引入了遗传材料的新组织。例如，在植物发育和性重组期间在体内可自然发生在不同染色体的基因座上的多核苷酸的彼此拼接。相应地，在体外通过非天然遗传修饰技术形成的遗传元件的重组与也可通过体内性重组发生的重组事件相近似。
符合读框的：将核苷酸三联体（密码子）翻译成期望的植物细胞中的重组蛋白的新生的氨基酸序列。具体地，本发明包括以阅读框架连到第二个核酸上的第一个核酸，其中第一个核酸序列是基因，第二个核酸是启动子或类似的调节元件。
整合：是指将所选植物种，或与所选植物相同种的植物，或与所选植物种性亲和植物的核酸序列插入到所选植物种细胞的基因组中。“整合”是指仅将天然的遗传元件掺入到植物细胞的基因组中。为了整合天然的遗传元件，如通过同源重组，本发明可“使用”非天然DNA作为这样方法中的步骤。因此，本发明区分“使用”特定DNA分子和将特定DNA分子“整合”到植物细胞的基因组中。
引入：如这里所用的，是指通过包括感染、转染、转化或转导的方法将一种核酸序列插入细胞中。
分离的：“分离的”是指在物理上从其正常的、天然环境中分离出来的任何核酸或化合物。分离的材料可以被保持在含有例如溶剂、缓冲液、离子或其它成分的合适的溶液中，可以是纯化的或非纯化的形式。
前导序列：在基因之前（或5’端）的被转录但不被翻译的序列。
LifeSupport载体：LifeSupport载体是一种含有位于T－DNA或T－DNA样边缘之间的可表达的选择性标记基因，如新霉素磷酸转移酶标记的构建物。可以修饰LifeSupport载体以限制这样的标记以及位于边缘或边缘样序列之间的其它多核苷酸被整合到植物基因组中。例如，LifeSupport载体可以包括突变的virD2、codA：：upp融合，或这种遗传元件的任何组合。因此，修饰的virD2蛋白将仍然支持T－DNA转移到植物细胞核，但将限制随后的T－DNAs的基因组整合的效率（Shurvinton等，Proc NatlAcad Sci USA，89：11837－11841，1992；Mysore等，Mol Plant MicrobeInteract，11：668－683，1998）。或者，在再生前可使用codA：：upp基因融合作为阴性选择性标记。在一个优选的构建物中，LifeSupport载体包括可操作地连接到酵母ADH终止元件上的npt标记。
单子叶植物：其胚有一个子叶的有花植物。单子叶植物的实例包括单不限于草坪草、玉米、水稻、燕麦、小麦、大麦、高梁、兰花、蝴蝶花、百合、洋葱以及棕榈。
天然的：“天然的”遗传元件是指天然存在于、来源于或属于将要被转化的植物基因组的核酸。因此，从将要转化的植物或植物种的基因组中分离的，或者从与将要转化植物种性亲和或互交可孕的植物或植物种中分离的任何核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子是“天然”的，即是植物种固有的。也就是说，天然的遗传元件代表植物育种者可以理解的用于通过传统植物育种来改善植物的所有遗传材料。根据本发明，天然核苷酸的任何变异也被认为是“天然的”。在这个方面，“天然的”核酸也可从植物或其性亲和植物种中分离，并被修饰或突变使得得到的变体在核苷酸序列上与从植物中分离的未被修饰的天然核酸有高于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、或60％的相似性。天然核酸变种在核苷酸序列上也可能有少于约60％，少于55％，或少于50％的相似性。
从植物中分离的“天然的”核酸也编码从该核酸中转录和翻译的天然存在的蛋白产物的变体。因此，天然的核酸可能编码与在分离的核酸来源的植物中所表达的未修饰的天然蛋白，在氨基酸序列上有高于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、或60％相似性的蛋白。
天然存在的核酸：这个短语意思是核酸存在于所选植物种的基因组内，并可能是DNA分子或RNA分子。可将正常的在植物种的基因组中存在的限制性酶切位点改造成为外源性的DNA分子，如载体或寡核苷酸，即使该限制性酶切位点在物理上不是从该基因组中分离的。因此，本发明允许合成产生核苷酸序列，如限制性酶识别序列，只要该序列天然存在于所选植物种的基因组中，或者存在于与将要转化的所选植物种性亲和的植物中。
可操作地连接：以这样的方式结合两个或更多的分子，使得它们在植物细胞中联合起来正确地行使功能。例如，当启动子控制结构基因的转录时，将启动子可操作地连接到结构基因上。
P－DNA：根据本发明，P－DNA（“植物DNA”）分离自植物基因组并且在每个末端，或仅在一个末端，包括T－DNA边缘样序列。边缘样序列优选与土壤杆菌菌种，如根癌农杆菌或发根植物单胞菌的T－DNA边缘序列有至少50％，至少60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少90％，或至少95％，但小于100％的序列同一性。因此，可用P－DNAs代替T－DNAs将土壤杆菌的核苷酸序列转移到另一个多核苷酸序列中。可修饰P－DNA以便于克隆，并应当优选不天然编码蛋白或蛋白的一部分。P－DNA的特点是其在每个末端含有至少一个被称作“P－DNA边缘序列”或“P－DNA边缘样序列”的边缘序列，上述两个术语可以互换。参见上面“边缘序列”和“边缘样”的定义。P－DNA也可被看作是“T－DNA样”序列，见下面的定义。
植物：包括被子植物和裸子植物如马铃薯、番茄、烟草、苜蓿、莴苣、胡萝卜、草莓、甜菜、木薯、甘薯、大豆、玉米、草坪草、小麦、水稻、大麦、高梁、燕麦、橡树、桉树、胡桃和棕榈。因此，植物可以是单子叶或双子叶的。这里使用的词“植物”也包括植物细胞、种子、植物子代、不管是有性还是无性产生的繁殖体、以及这些中的任何一个的后代，如插条或种子。植物细胞包括悬浮培养物、胼胝体、胚、分生组织区、胼胝组织、叶、根、枝条、配子体、孢子体、花粉、种子和小孢子。植物可能处于成熟期的各种阶段，并且可以在液体或固体培养基中生长，或者在土壤或在花盆、温室或田间合适的培养基中生长。在植物中引入的前导序列、尾随序列或基因序列的表达可能是短暂的或是持久的。“所选植物种”可以是，但不限于这些“植物”中的任何一个的物种。
精确育种：是指通过将核酸，如从所选植物种、或从与所选植物种相同的另一个植物、或从与所选植物种性亲和的种中分离的天然基因和调节元件被稳定地引入单个植物细胞中，随后将这些遗传修饰的植物细胞再生成整个植物以改善植物的方法。由于没有将未知的或外源核酸永久地掺入到植物基因组中，因此本发明的技术利用也通过常规植物育种获得的相同的遗传材料。
植物种：属于显示至少某些性亲和性的各种正式命名的植物组。
植物转化和细胞培养：广义地是指遗传修饰植物细胞并将其转移到合适的植物培养基中以维持、进一步生长、和/或进一步发育的方法。
重组：如这里使用的，该术语广义地描述为赖以克隆基因、可进行DNA测序以及可生产蛋白产物的各种技术。如这里使用的，该术语也描述为在将基因转移到植物宿主系统的细胞中后所生产的蛋白。
选择性标记：“选择性标记”典型地是编码能赋予某种对抗生素、除草剂或有毒化合物的抗性的蛋白并且用于鉴定转化事件的基因。选择性标记的实例包括编码对链霉素有抗性的链霉素磷酸转移酶（spt）基因、将甘露糖－6－磷酸转化成果糖－6－磷酸的磷酸甘露糖异构酶（pmi）基因、编码卡那霉素和遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶（nptII）基因、编码对潮霉素有抗性的潮霉素磷酸转移酶（hpt或aphiv）基因，编码对磺酰脲类除草剂有抗性的乙酰乳酸合酶（als）基因、编码抑制谷氨酰胺合成酶如膦丝霉素或basta（例如，bar基因）作用的对除草剂有抗性的基因，或者现有技术中已知的其它类似的基因。
有义抑制：通过转基因植物中该基因的全部或部分基因的一个或更多个额外拷贝的表达来减少内源基因的表达。
T－DNA样：“T－DNA样”序列是从所选植物种，或从与所选植物种性亲和的植物中分离的核酸，其与土壤杆菌种的T－DNA有至少75％，80％，85％，90％，或95％，但不是100％的序列同一性。T－DNA样序列可包含一个或更多个边缘或边缘样序列，其中每一个序列都能将核苷酸序列整合到另一个多核苷酸中。这里使用的“P－DNA”是T－DNA样序列的一个实例。
尾随序列：在基因之后（或3’端）的转录但不翻译的序列。
转录的DNA：包含基因以及与该基因相关的非翻译的前导序列和尾随序列的DNA，通过前面的启动子的作用它被转录成单个mRNA。
转录和翻译终止子：本发明的表达载体典型地在转录起始调节区的相对端具有转录终止区。可选择转录终止区用于稳定mRNA以提高表达和/或用于将聚腺苷酸尾添加到基因的转录产物上（Alber&Kawasaki，Mol.&Appl.Genetics 4：19－34，1982）。用作举例说明的转录终止区包括豌豆RBCS基因的E9序列（Mogen等，Mol.Cell Biol.，12:5406-14，1992）和各种泛素基因的终止信号。
植物细胞的转化：将DNA稳定地整合到植物细胞的基因组中的方法。“稳定地”是指细胞基因组内的和通过细胞基因组的多核苷酸的持久的或非短暂的保留和/或表达。因此，稳定地整合的多核苷酸是一种在转化的细胞基因组内作为固定物的多核苷酸，并且可通过细胞或所得的转化植物的相继的子代被复制和增殖。转化可以在天然条件下或使用现有技术中各种公知方法的人工条件下发生。转化可能依赖于将核酸序列插入到原核或真核宿主细胞中的任何已知方法，包括土壤杆菌介导的转化方案、病毒感染、颈须噬菌体、电穿孔、热休克、脂质转染、聚乙二醇处理、显微注射以及粒子轰击。
转基因：将被插入到宿主基因组中的包括蛋白编码区的基因。在本发明的上下文中，从宿主基因组中分离包含转基因的元件。
转基因植物：含有至少一个转基因的遗传修饰的植物。
使用：本发明设想使用不同于将要转化的所选植物种的物种的核酸以便于将天然的遗传元件整合到所选植物的基因组中，只要这样的外源核酸不被稳定地整合到相同的宿主植物基因组中。例如，天然的遗传元件被克隆、定位或操纵到其中的质粒、载体或克隆构建物可以来自与天然的遗传元件来源不同的物种。
变体：这里使用的“变体”应被理解为意指偏离特定基因或蛋白的标准的或给定的核苷酸或氨基酸序列的核苷酸或氨基酸序列。术语“同工型”、“同种型”和“类似物”也指核苷酸或氨基酸序列的“变异”形式。通过一个或更多氨基酸的添加、除去或取代而改变的氨基酸序列或者核苷酸序列的变化，可被认为是“变体”序列。变体可以具有“保守的”改变，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学特性，例如，用异亮氨酸代替亮氨酸。变体可具有“非保守的”改变，例如用色氨酸代替甘氨酸。相似的较小的变异也可以包括氨基酸的缺失或插入，或者两者都有。使用现有技术中公知的计算机程序，如载体NTI程序组（InforMax，MD）软件可以发现在决定哪个氨基酸残基可以被取代、插入或缺失方面的指导。
因此应当理解，本发明不限于这里描述的特定的方法学、方案、载体和试剂等，因为这些可以变化。也应当理解，这里使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，不是对本发明范围的限制。必需注意到这里和在所附的权利要求书中使用的单数形式的“一”，“一个”以及“所述的”包括复数关系，除非上下文清楚地要求其它含义。因此，例如，提及“基因”是指涉及一个或更多基因，包括本领域技术人员已知的其等同物等。实际上，本领域的技术人员可以使用这里描述的方法在植物宿主系统中表达任何天然的基因（目前或随后已知的）。
P－DNA载体
将重组DNA掺入到植物细胞中的优选方法是土壤杆菌介导的转化方法。根据本发明，开发双载体以产生仅含有天然的马铃薯核酸的遗传修饰的马铃薯植株。这种载体在三个方面不同于常规的土壤杆菌介导的转化载体：（1）本发明的载体不含有用T－DNA边缘描绘的土壤杆菌来源的T－DNA序列，而含有两侧为边缘样序列的天然植物的DNA（P－DNA）片段，尽管边缘样序列在结构和功能上不同于T－DNA边缘，但是它们支持将P－DNA从土壤杆菌转移到植物细胞中，（2）本发明载体的主链可以含有标记，如果将其整合到植物细胞的基因组中，该标记会阻止这些细胞发育成成熟的植物，以及（3）本发明的载体在P－DNA末端之间不含有外源的选择性标记基因。
本发明令人惊奇地表明，两侧是边缘样序列的P－DNA片段支持DNA从土壤杆菌转移到植物细胞中。通过使用基于马铃薯P－DNA末端和常规T－DNA边缘之间的同源性所设计的引物，可从任何植物的基因组中分离P－DNA。接着检验这些片段，如果有效，则用于转化仅含有天然DNA的植物。也可以使用程序，如“blastn”来搜索植物基因组数据库以寻找含有与T－DNA边缘具有同源性的区域的DNA片段（Altschul等，J Mol Biol215：403－10，1990）。接着可以修饰经过鉴定的P－DNAs以提高它们的效用。例如，可删除分离的P－DNAs的内部片段并可添加限制性酶切位点以便于克隆。在末端序列引入点突变也可能是有效的，它使得P－DNA在转移DNA中更有效。
可在P－DNA边缘样序列之间插入任何基因表达盒。对于马铃薯的转化，这样的表达盒可以由可操作地连接到马铃薯的基因和/或与该基因相关的前导或尾随序列上的马铃薯启动子以及随后的马铃薯终止子构成。表达盒可以含有另外的马铃薯遗传元件，如符合读框的融合到基因5’－末端的信号肽序列，以及可置于，例如启动子和兴趣基因之间以提高表达的马铃薯内含子。对于用修饰的P－DNA转化小麦，在小麦P－DNA中插入的所有遗传元件，包括P－DNA本身都来自小麦或与小麦性亲和的植物种。
另一个分离P－DNAs的方法是通过产生土壤杆菌菌株文库，其含有随机的植物DNA片段而不是两侧为选择性标记基因的T－DNA。可以将用这种文库感染的外植体置于含有适当的选择性试剂的增殖培养基上，以鉴定支持将标记基因从土壤杆菌中的载体转移到植物细胞中的P－DNAs。
在转化过程期间可能不仅天然修饰的P－DNA，而且另外的质粒序列也从土壤杆菌被共同转移到植物细胞中。对于本发明的目的而言，这是一个不期望要的过程，因为这样的质粒“主链”序列代表非植物的外源DNA，如细菌DNA。本发明阻止含有主链序列的转化的植物细胞发育形成成熟的植物。因此，本发明使得在再生枝条期间区别含主链和不含主链的转化事件成为可能。
选择或筛选抗主链整合的事件的方法依赖于在载体的主链上，在P－DNA之外是否存在标记，如异戊烯磷酸转移酶（IPT）基因的表达盒。一旦主链整合了，IPT诱导的细胞分裂素的累积将改变转化的枝条的性状，并且阻止这些枝条生长出根。可以使用能改变转化的植物的叶、根、茎的性状、质地或颜色、高度或某些其它形态特征的任何其它基因来代替IPT基因用于筛选和/或选择抗主链整合的事件。这样的基因在这里被称为“主链整合标记”。因此，已知显示可归因于主链整合标记基因表达的改变了形态特征的转化植物除了含有期望的P－DNA外，在其基因组中还含有外源DNA。相应地，具有与主链整合标记相关的表型的植株是不期望要的。
本发明不限于仅使用IPT基因作为主链整合标记；可以这种方式使用其它的基因。例如，主链整合标记可以是土壤杆菌的反玉米素（transzeatine）合酶（TZS）基因（Krall等，FEBS Lett 527：315－8，2002）或隐性的拟南芥属（Arabidopsis）基因hoc1（Catterou等，Plant J30：273－87，2002）。在本发明中，这种方法比一些在载体主链序列中插入毒性基因的方法更易于应用。例如，参见EP 1 009,842。
通过将主链整合标记基因，如功能性细胞分裂素基因置于P－DNA的上游或下游，易于区别转化事件。丢弃显示改变了形态特性的转化植株，因为它们含有整合到基因组中的非天然的DNA序列。
另一种鉴定仅用天然DNA的稳定转化的植物的策略是使用聚合酶链反应。通过使用特异性设计来检测主链序列的引物，可以鉴定和丢弃除了P－DNA外还含有外源主链序列的植物。可以随后使用其它的引物组以进一步证实是否完整地转移了P－DNA。因此，通过使用基因的表达以改变植物的形态特性，或通过筛选在转化植物中稳定整合的外源DNA，可以鉴定和选择仅用天然DNA序列稳定转化的植株。
可以将特定宿主植物的遗传元件插入到能在大肠杆菌和土壤杆菌两者中复制的双载体的P－DNA序列中。可以通过对化学感受态细胞进行电穿孔、三亲株交配或热休克处理而将得到的载体引入到被缴械的（disarmed）土壤杆菌菌株如LBA4404中。接着可通过整个植株或外植体的感染将新的菌株用于转化单个的植物细胞。
可以将特定宿主植物的遗传元件插入到能在大肠杆菌（E.coli）和土壤杆菌两者中复制的双载体的P－DNA序列中。可以通过对化学感受态细胞进行电穿孔、三亲株交配或热休克处理而将得到的载体引入到土壤杆菌菌株如LBA4404中。接着可通过整个植株或外植体的感染将新的菌株用于转化单个的植物细胞。LBA4404含有被缴械的Ti－质粒pAL4404，其带有毒性作用基因和链霉素抗性基因。
LifeSupport载体
尽管将细菌标记基因稳定地整合到植物细胞的基因组中便于转化事件的鉴定，但是对植物基因组的这样修饰是不期望要的，因为标记基因代表外源DNA。可通过发展新的基于土壤杆菌的转化方法来避免使用外源的标记基因。
一个优选的实施方案是依靠使用两个土壤杆菌菌株的一种新方法：一个菌株含有具有在植物细胞核中用于短暂表达的选择性标记基因的双载体，另一个菌株含有具有在植物基因组中用于稳定整合的实际的兴趣序列的P－DNA（见实施例7）。
一旦用土壤杆菌菌株进行了共转染，那么一些植物细胞将接收到具有标记基因的T－DNA以及具有兴趣序列的P－DNA。没有随后通过将感染的外植体长时间置于适当的抗生素中来选择标记基因的稳定整合，而是仅将外植体短暂地暴露于抗生素中。这样，所有短暂表达的标记的基因的植物细胞将存活。因为由于内源核酸酶的活性，在绝大多数实例中T－DNAs将降解而不是稳定地整合到它们宿主的基因组中，所以这里显示在短暂选择中存活的大多数植物细胞都发育成缺乏标记基因的枝条。此外，本发明表明这些无标记枝条中的相当多的一部分含有稳定整合的P－DNAs。
有许多提高无标记转化效率的工具。首先，本发明表明可以通过用两个分别带有T－DNA/标记和P－DNA/兴趣序列的土壤杆菌菌株感染外植体来增大这种频率。首先用P－DNA菌株感染外植体，约4到6小时后用T－DNA菌株感染。
第二，可以修饰T－DNA菌株以表达Ω突变的virD2基因。修饰的virD2蛋白将仍然支持将T－DNA转移到植物细胞核中，但是限制随后的T－DNAs的基因组整合的效率（Shurvinton等，Proc Natl Acad Sci USA，89：11837－11841，1992；Mysore等，Mol Plant Microbe Interact，11：668－683，1998）。最优选的表达修饰的virD2基因的方法是通过在T－DNA载体的主链中插入受virD启动子驱动的Ω突变的virD2基因。
第三，可通过将端粒序列插入T－DNA的左边缘和右边缘序列附近来进一步减少稳定的T－DNA整合（Chiuazzi&Signer，Plant Mol.Biol.，26：923－934，1994）。
第四，可以增大带有标记基因的T－DNA区的尺寸以提高T－DNAs和P－DNAs共同移进植物细胞核中的频率，并且减少T－DNA的基因组整合的频率。
第五，也可以通过使用携带两个分别具有T－DNA和P－DNA的亲和性双载体的单个土壤杆菌菌株来提高T－DNAs和P－DNAs共同移进植物细胞核中的频率。两个亲和性的双载体的实例是pSIM 1301来源的载体和pBI121来源的载体。
因为短暂表达的标记基因通常将不整合到植物基因组中，所以不必这个基因和其调节序列两者都代表天然DNA。实际上，使用外源调节序列以促进感染的植物细胞中高水平的短暂的基因表达可能是有利的。本发明的令人惊奇的发现是含有GUS基因，随后是酵母醇脱氢酶1（ADH1）终止子的表达盒在马铃薯细胞中高水平地短暂表达。然而，具有酵母CYC1终止子的相似的构建物不能充分地起作用。也可以通过将标记基因可操作地连接到非天然的启动子上来提高短暂的表达水平。这样的启动子的实例是，例如合成的启动子如糖皮质激素诱导的启动子（Mori等，Plant J.，27：79－86，2001；Bohner等，Mol.Gen.Genet.，264：860－70，2001）、非天然的启动子如花椰菜花叶病毒和玄参花叶病毒的35S启动子，以及真菌的启动子。
作为上面描述的使用两株土壤杆菌介导的转化方法的可供替代的方法，也可以用包含具有天然标记基因和感兴趣的实际序列两者的P－DNA的单个菌株来转化植物。本发明表明可以使用耐盐性基因作为转化的天然标记。这样的耐盐性基因包括拟南芥属基因SOS1（Shi等，Nat Biotechnol.，2002）、AtNHX1（Apse等，Science，285：1256－8，1999）、Avpl（Gaxiola等，Proc Natl Acad Sci USA，98：11444－9，2001）以及CBF3（Kasuga等，Natl Biotechnol.17：287－91，1999）的农作物同系物。
通过本发明的精确育种方法学完成的遗传元件的重排也可以通过遗传重组的方法自发地发生。例如，所有植物都含有可以从一个染色体位置转座到另一个染色体位置的元件。通过插入到启动子或基因中，这样的转座因子可提高、改变和/或减少基因的表达。例如，在转录调节基因P－wr的启动子中插入玉米增变元件的AMu4导致有条纹的红果皮。在叶特异性的MADS盒基因ZMM19的启动子中插入相同的元件导致这种基因在玉米花序中的表达，导致颖片的叶状延长以及雄性和雌性花序中的其它改变，导致豆荚谷物的非常令人满意的表型。由于其奇特的雄花花穗和谷穗，豆荚谷物对于某些土著美洲部落来说具有宗教意义。许多基因也通过其它转座子诱导的修饰如倒位、缺失、添加以及异位重组而进行重排。（Bennetzen，Plant Mol Biol 42：251－69，2000）。此外，植物DNA重排经常通过基因内的重组过程而发生。例如，通过重组在抗特异病原体的抗性中所涉及的基因，植物能够产生具有新的特异性的抗性基因，并且因此与它们的病原体协同进化（Ellis等，Trends Plant Sci 5：373－9，2000）。基因内重组的另一个实例涉及植物如何繁殖：通过重组在自交不亲和性中涉及的基因而使植物从异体受精过渡到自体受精（Kusaba等，Plant Cell13：627－43，2001）。其它促进基因组进化的方法包括，例如，染色体断裂和染色体间的重组。
提高植物和粮食作物的营养价值
为了通过精确育种来修饰农作物的消极特性，如加工期间的丙烯酰胺累积、糖苷生物碱累积、不想要的高级糖化产物的累积、CIPC的累积、低水平的抗性淀粉、伤痕易感性、冷诱导的变甜、对疾病的易感性、低产量和低质量，将至少一种特异性的表达盒掺入到宿主的基因组中。使用三种不同的方法来除去消极特性：（1）过量表达阻止消极特性发生的基因，（2）为了用非功能性的蛋白将野生型的基因产物滴定出来，过量表达与消极特性相关的基因的突变形式，以及（3）通过表达与该基因相关的在正义和/或反义方向上的前导或尾随序列片段的至少一个拷贝，使与消极特性相关的特异性基因沉默。
在马铃薯中与消极特性相关并在体外可被修饰使其编码非功能蛋白的内源基因的一个实例是多酚氧化酶（PPO）基因。一旦受到冲击损伤，从质粒中释放的PPO基因产物进入细胞质（Koussevitzky等，J.Biol.Chem.，273：27064－9，1998），其中该基因产物将节导酚的氧化而产生各种苯氧基自由基和醌型衍生物，这些物质是有毒的和/或最终形成想要的聚合物在农作物中留下深色变色，或“黑斑”。
过度表达含有无功能的结合铜的结构域的突变PPO基因可降低主要在块茎和相关的器官如芽中表达的所有PPO基因的活性。突变使得多酚氧化酶蛋白失活，因为其不能结合铜。技术人员知道在什么位置进行点突变，如果是这样的话，那将损害基因产物的功能。申请人通过将马铃薯的PPO蛋白序列和甘薯PPO的蛋白序列进行对比而鉴定了马铃薯PPO中的结合铜的结构域（Klabunde等，Nat Struct.Biol.，5：1084－90，1998）。保守的区域，特别是那些在铜结合位点上含有保守的组氨酸的区域是使转基因产物失活的靶。因为在这样的器官中PPO活性的几乎完全缺乏可消极地影响植物抵抗病原体的能力，所以本发明也描绘了仅降低除了表皮之外的主要在成熟块茎的所有部分中都表达的特异性PPO基因的改进方法。由于通过使用与该基因相关的尾随序列使这种特异性的PPO基因的沉默不能减少块茎表皮中的PPO表达，因此将块茎的该部分几乎全部直接地暴露于试图感染的病原体中。
通过PPO基因诱导的酶促褐变不仅降低马铃薯块茎的质量，其也消极地影响作物食品如小麦、鳄梨、香蕉、莴苣、苹果以及梨。
与消极特性相关并且能够通过使用与这些基因相关的前导或尾随序列而被沉默的其它基因包括R1基因和L型磷酸化酶基因。在淀粉降解成还原糖，如葡萄糖和果糖中涉及这两个基因，还原糖一旦被加热就参与美拉德反应而产生有毒产物如丙烯酰胺。本发明表明，通过降低R1或磷酸化酶的活性而减少冷诱导的变甜导致减少马铃薯油炸加工期间的非酶促褐变以及丙烯酰胺的累积。
本发明也表明在遗传修饰的作物中过度表达某些天然基因的用途。通过在马铃薯中过度表达新分离的液泡转化酶抑制剂基因来降低蔗糖向还原糖的转化，显著地减少了美拉德反应产物如丙烯酰胺的水平。
本发明也预言显示转化酶抑制剂表达水平提高或者R1或磷酸化酶表达水平降低的马铃薯块茎将不需要在贮藏前用化学发芽抑制剂如CIPC彻底处理，因为它们降低的还原糖水平将（1）推迟发芽，和（2）允许在较低的温度下贮藏，因而进一步推迟发芽。极度降低的CIPC残余水平或者缺乏进一步提高了含有上述某种修饰的P－DNAs植物来源的加工食物的营养价值。
因此，来源于含有修饰的P－DNA块茎的法国油炸食品或油煎土豆片将含有剧烈降低的CIPC残余水平，进一步提高它们的营养价值。
同时下调马铃薯块茎中PPO以及R1或磷酸化酶基因表达的影响是协同的，因为不仅通过美拉德反应的非酶促褐变，而且PPO酶介导的褐变也需要还原糖。因此，转基因马铃薯块茎中还原糖水平的降低也将限制PPO的活性以及对黑斑伤痕的易感性。因此，PPO、R1和磷酸化酶基因和/或与这些基因相关的前导或尾随序列代表可被分离、修饰以及再引入回植物中以下调这些基因的表达的兴趣DNA片段。
除了开发伤痕抗性和降低的冷诱导变甜，通过不使用外源DNA的精确育种可以引入许多其它特性。例如，可以从野生型马铃薯种中分离疾病的抗性基因并插入对疾病易感的品种的基因组中。
修饰的植物和作物的环境效益
如上面描述，R1或磷酸化酶的水平降低导致淀粉磷酸化的降低。这种淀粉磷酸化的降低导致马铃薯块茎的磷酸含量降低90％（Vikso－Nielsen，Biomacromolecules，2：836－43，2001）。这将导致马铃薯加工工厂废水中的磷酸水平的降低，其现在约为25－40mg/L。因此，使用低磷酸的块茎将减少释放进入环境中的磷酸而有助于保护重要的生态系统。此外，对于最佳的生长和产量，低磷酸马铃薯可能需要用较少的磷酸施肥，其通过推迟可用磷酸资源的消耗而支持可更持续的农业。
提高植物和粮食作物的农业特性
除了两个重要的加工特性，即减少伤痕易感性和冷变甜之外，本发明也提供了逐渐重要的输入特性，即耐盐性。在本发明中描述的一些修饰的P－DNA构建物含有耐盐性基因作为转化的天然标记。重要地是，这个基因的效用不限于转化方法中的筛选步骤。马铃薯植株中耐盐性基因的过度表达能减少高盐度土壤水平所诱导的胁迫症状，并将使在百分率正在增长的含盐度水平超过最大值2毫姆欧/厘米电导率水平的农业土地上长出含有修饰的P－DNA的新品种成为可能，该电导率水平是生长常规品种的最适条件。
使用从所选植物种或从与所选植物种性亲和的种中分离的调节元件
一旦从感兴趣的植物种中分离出前导序列、基因或尾随序列并可任选地修饰，那么可将其可操作地连接到植物的启动子或类似的调节元件上用于在植物中适当表达。调节元件如这些在特异性的组织中或以某种水平或在特定的时间用于表达与感兴趣的基因相关的非翻译序列。
取决于在修饰特性中所涉及的策略，可能必需限制对植物的特定区域的沉默。正常驱使内源基因表达的启动子可能不适合组织特异性的表达。如在上面部分中描述的，细菌或病毒调节元件，如花椰菜花叶病毒的35S“超级”启动子的稳定整合可导致无法预计的和不想要的事件。因此，本发明的一个方面使用从所选的宿主植物种中分离的启动子。
在本发明的优选的实施方案中，将与R1、磷酸化酶以及PPO基因相关的前导或尾随序列可操作地连接到与颗粒结合的淀粉合酶基因的启动子上，为的是在马铃薯（S.tuberosum）中应用（Rohde等，J Gen&Breed，44，311－315，1990）。这种启动子经常被其他人用于驱动基因表达并且在马铃薯块茎中格外有活性（van der Steege等，Plant Mol Biol，20：19－30，1992；Beaujean等，Biotechnol.Bioeng，70：9－16，2000；Oxenboll等，Pro Natl Acad Sci USA，9：7639－44，2000）。在优选的实施方案中，也可以将这种启动子用于修饰的R1、磷酸化酶以及PPO基因的前导或尾随序列的表达。
或者，可将其它马铃薯启动子可操作地连接到马铃薯的兴趣序列上。这样的启动子包括在马铃薯块茎中促进表达的马铃薯块茎蛋白基因启动子（Bevan等，Nucleic Acid Res，14：4625－38，1986），或其片段、马铃薯UDP－葡萄糖焦磷酸化酶基因启动子（美国专利No.5,932,783）以及泛素基因的启动子（Garbarino等，Plant Physiol，109：1371－8，1995）。
也可通过使用诱导型启动子和在构建物中可操作地连到目的多核苷酸上的调节区来调节前导和/或尾随序列的转录。诱导型启动子的实例包括那些对温度敏感的启动子，如热或冷休克启动子。例如马铃薯ci21A-和C17-启动子是冷诱导的（Kirch等，Plant Mol Biol，33：897－909，1997；Schneider等，Plant Physiol，113：335－45，1997）。
可以使用对某些物质象抗生素、其它化学物质或pH应答的其它诱导型启动子。例如，已知脱落酸和赤霉酸影响植物细胞的细胞内pH等（andin so doing），调节Rab 16A基因和α淀粉酶1/6－4启动子(Heimovaara-Dijkstra等，Plant Mol Biol，4815－20，1995)。已知脱落酸、创伤和茉莉酮酸甲酯也诱导马铃薯pin2启动子（Lorberth等，Plant J，2：477－86，1992）。
在另一个实例中，一些核苷酸序列在时序控制下，仅在植物的某个发育阶段期间或在一天中的某个时间期间被激活而表达下游序列。例如，核酮糖－1，5－二磷酸羧化酶（rbcS）基因的小亚单位的马铃薯启动子可指导细胞特异的光调控的表达（Fritz等，Proc Natl Acad Sci USA，88：4458－62，1991）。技术人员非常精通诱导型启动子和调节序列的这些典型类型。
在调节表达中使用某些聚腺苷酸化信号改变mRNA转录本的稳定性可能也是有效的。特别是，当一些聚腺苷酸化信号可操作地连接到多核苷酸的3’末端时导致mRNA转录本易于降解。
因此，可以通过将其可操作地与一个或更多个这样的启动子、调节序列、3’聚腺苷酸化信号、3’非翻译区、信号肽等连接而调控基因的表达。根据本发明，如这里描述的那些，以及最终将被整合到植物基因组中的DNA序列和调节元件都是从将通过本发明的精确育种方法修饰的所选植物种的DNA中获得。即，来源自、分离自和克隆自其它物种，如细菌、病毒、微生物、哺乳动物、鸟类、爬行动物以及性不亲和的植物种的DNA序列和调节元件不被整合到转化植物的基因组中。只要不将该外源DNA整合到植物基因组中，在本发明中可使用与所选植物种的基因组异源的DNA以产生转化构建物。
本发明不仅提供通过整合从所选植物种，或从与所选植物种性亲和的植物中获得的DNA转化植物种的方法，而且也提供可调控该DNA表达的方法。相应地，可以通过如前面描述的，组织特异性的或某一其它策略来优化某个序列的表达。
使用从所选植物种中分离的终止序列
除了引发转录的调节元件，天然的表达盒也需要位于转录的起始调节区3’－末端的终止转录的元件。可从相同基因或从不同基因中获得转录终止区和转录起始区。可以选择尤其用于稳定mRNA以增强表达的转录终止区。
这种特别的元件，即所谓的“3’－非翻译区”在转运、稳定、定位和终止基因转录中很重要。在这个方面，本领域人员公知3’－非翻译区可形成某种发夹环。相应地，本发明预想可以将3’－非翻译区可操作地连接到被克隆的多核苷酸的3’末端，以便可以将得到的mRNA转录本暴露于对由3’非翻译区赋予的序列和结构起作用的因子中。
可以从分离出启动子和转基因的植物种中亚克隆泛素基因的3’序列，并且插入到转基因的下游以确保转录的适当终止。不管用哪一个启动子来驱使它们的表达，都可以将两个典型的转基因融合到马铃薯泛素基因（Ubi3）的终止序列上。
实施例
实施例1
P－DNAs的克隆
这个实施例表明T－DNA边缘序列对土壤杆菌是特异的。该实施例也显示植物含有T－DNA边缘样序列，并且提供从马铃薯和小麦中分离的通过这样的边缘样序列描绘的DNA片段的序列。
常规的转化系统使用土壤杆菌来源的T－DNAs作为将外源DNA从土壤杆菌转移到植物细胞中的载体（Schilperoort等，美国专利4940838，1990）。尽管T－DNAs通常包括几百个碱基对，用左边缘（LB）和右边缘（RB）重复序列描绘，但是它们可能也仅由这样的边缘序列构成。T－DNA边缘序列在DNA转移过程中起着极其重要的作用，因为它们起着作为virD2－催化的切割反应的特异性的识别位点的作用。将与土壤杆菌的virD2和virE2形成复合体的释放的单链DNA转移到经常成功地整合到植物基因组中的植物细胞核中。用于外源DNA转移的所有T－DNA边缘序列都来自根癌农杆菌和发根植物单胞菌的胭脂氨酸和章鱼氨酸菌株（表2）。这些边缘序列和经常位于土壤杆菌（Agrobacterium）DNA两侧的一些序列存在于成千的双载体中，这些双载体包括，例如pPAM（AY027531）、pJawohl（AF408413）、pYL156（AF406991）、pINDEX（AF294982）、pC1300（AF294978）、pBI121（AF485783）、pLH9000（AF458478）、pAC161（AJ315956）、BinHygTOp（Z37515）、pHELLSGATE（AJ311874），pBAR－35S（AJ251014）、pGreen（AJ007829）、pBIN19（X77672）、pCAMBIA（AF354046）、pX6－GFP（AF330636）、pER8（AF309825）、pBI101（U12639）、pSKI074（AF218466）、pAJ1（AC138659）、pAC161（AJ315956）、pSLJ8313（Y18556），以及pGV4939（AY147202）。最近，在chrysopine型Ti质粒pTiChry5中鉴定了T－DNA边缘序列的两个同系物（Palanichelvam等，Mol Plant Microbe Interact 13：1081－91，2000）。左边缘同系物与位于pTi15955的T－DNA中间的无活性的边缘同系物相同。右边缘同系物异常背离功能T－DNA的边缘序列。因此这些同系物在支持将DNA从pTiChry5转移到植物细胞中不可能具有功能活性。
仅需要用天然DNA使转化植物成为可能的新方法的开发，首先需要取代包括LB和RB的T－DNA。不幸的是，在包括那些由国家生物技术信息中心（National Center For Biotechnology Information）、基因组研究所（The Institute for Genomic Research）以及SANGER维护的公共数据库中高级BLAST搜索没能鉴定出植物的任何边缘序列。因此，必需考虑与T－DNA的边缘序列相似，但不完全相同的植物DNA序列，在这里称为“边缘样”（边缘样）序列。表2中显示在公共数据库中鉴定出的植物边缘样序列的实例。试图用边缘样序列取代T－DNA边缘序列的提议是因为边缘序列是高度保守的（见表2）。在其它细菌DNA的转移系统如IncP、PC194，以及φX174的切口区中这些序列的大部分也是高度保守的，表明这些序列是缀合样DNA转移所必需的（Waters等，Proc Natl Acad Sci 88：1456－60，1991）。由于在关于对边缘序列的要求上没有可靠的数据，因此整个边缘序列似乎在切割过程中很重要。试图通过检验边缘突变体在支持DNA转移中的效率来致力于这个问题的单个研究是不可靠的，因为阴性对照似乎没有恰当地起作用（van Haaren等，Plant Mol Biol 13：523－531，1989）。此外，在这种研究的结果中没有一个在分子学上被证实。尽管有这些担心，但是也在表2中显示了两个可能有效的边缘突变体。
在边缘序列中，基于同源性，鉴定了T－DNA边缘基序（表2）。尽管这种基序包括13,824个变体，这些变体中的许多变体在转移DNA中可能没有功能，或者可能是不适当的，但是其代表T－DNA边缘序列是什么样或可能是什么样序列的最宽泛可能的定义。接着用这种边缘基序在公众可得的DNA数据库中使用“基序对比和搜索工具”（Bailey和Gribskov，Bioinformatics 14：48－54，1998）以及“高级BLASTN”（“核苷酸错配罚分”＝－1；“期望值”＝105；Altschul等，Nuclei Acids Res 25：3389－3402，1997）搜索同系物。这些搜索在非土壤杆菌的生物中再次没能鉴定出任何相同的匹配。
为了尝试和提高分离出含有相当于边缘基序的边缘样序列的马铃薯DNA片段的几率，从100个遗传各异的登记号（所谓的“核心收集品”，由美国马铃薯基因库提供，WI）中分离出DNA。这种DNA是混合的，并且用作使用各种寡核苷酸的聚合酶链反应的模板，其中寡核苷酸被设计成退火到边缘或边缘样序列上。对扩增的片段进行序列分析，接着用嵌套引物使用反向PCR进一步证实序列。马铃薯DNA片段中特别感兴趣的一个片段含有无任何主要的可读框的新序列，其描绘为边缘样序列（表2）。这种片段的边缘样序列之一含有至少5个与T－DNA边缘序列的错配；另一个边缘样序列含有至少2个错配。尽管两个序列都含有与边缘基序的一个错配，但是仍要检验它们支持DNA转移的能力。为了那个目的，通过内部缺失首先将该片段的大小减少到0.4千个碱基对（SEQ ID NO.：1）。得到的片段被称为“P－DNA”（植物DNA）以区别于土壤杆菌来源的T－DNA。从马铃薯变种Russet Ranger的基因组中分离类似的片段，但是不用于任何进一步的实验。
基于P－DNA和T－DNA边缘序列之间的差异，使用具有下列简并引物的延伸酶扩增系统（Life Technologies）来分离小麦的P－DNA：5’－GTTTACANHNBNATATATCCTGYCA－3’（Bor－F）（SEQ IDNO.56）和5’―TGRCAGGATATATNVNDNTGTAAAC―3’(Bor–R)(SEQID NO.57)。得到的825个碱基对的片段显示为SEQ ID NO.：2，并用于取代常规双载体的T－DNA。可通过在P－DNA末端之间插入GUS基因表达盒，并用含有所得载体的土壤杆菌（Agrobacterium）感染小麦来检验这种构建物的效率。
实施例2
用P－DNA载体转化烟草
这个实施例表明，尽管P－DNA末端和T－DNA边缘序列之间存在结构（序列差异）和功能（转化频率）的差别，但是可以以与T－DNA类似的方式使用P－DNA以将DNA从土壤杆菌转移到烟草细胞中。
通过除去常规双载体pCAMBIA1301（Cambia，AU）的全部T－DNA区获得可在大肠杆菌和根癌农杆菌两者中维持的无T－DNA载体。这通过同时将pSIM1301的5.9kb SacII－SphI片段与使用寡核苷酸对从pCAMBIA1301中扩增的两个片段连接而完成，其中寡核苷酸对分别为：
5’―CCGCGGTGATCACAGGCAGCAAC―3’（SEQ ID NO.58）和
5’―AAGCTTCCAGCCAGCCAACAGCTCCCCGAC―3’（SEQ ID NO.59），以及
5’―AAGCTTGGCTACTAGTGCGAGATCTCTAAGAGAAAAGAGCGTTTA―3’（SEQ ID NO.60）和
5’―GCATGCTCGAGATAGGTGACCACATACAAATGGACGAACGG―3’（SEQ ID NO.61）。
为了使筛选抗主链整合的事件成为可能，将包含被Ubi3启动子驱动的土壤杆菌异戊烯转移酶（IPT）基因和其后Ubi3终止子的表达盒（SEQID NO.：3）作为2.6kbp SacII片段插入到上面描述的无T－DNA载体的主链中，产生pSIM100－OD－IPT。预期表达IPT基因的转化植物细胞将累积细胞分裂素并长成不能发育根的异常枝条。
将实施例1中描述的0.4kb P－DNA片段插入pSIM100－OD－IPT中以产生pSIM111（图1；SEQ ID NO.：4）。
为了检验使用pSIM111是否能够获得含有P－DNAs（包括位于P－DNA末端之间的任何序列）而无另外载体主链的转化植物，将新霉素磷酸转移酶（NPTII）的基因表达盒插入到pSIM111的P－DNA中产生pSIM108（图1）。
通过比较pSIM108和含有具有常规T－DNA边缘序列的修饰P－DNA的对照载体之间的转化频率，检验P－DNA末端在支持DNA转移中的效率。这种对照载体，称为pSIM109，是通过用寡核苷酸对：
5’―ACTAGTGTTTACCCGCCAATATATCCTGTCAGAG―3’（SEQ IDNO.62）和5’－AAGCTTTGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACGAAG－3’（SEQ ID NO.63）扩增含有NPTII基因表达盒的全部P－DNA而产生的。这些实施例中使用的第二个对照载体是常规的双载体pBI121（基因库登记号AF485783），其含有在规则的T－DNA上插入的相同NPTII基因表达盒。根据如下方法将双载体引入到根癌农杆菌LBA4404细胞中。将感受态LB4404细胞（50μL）在37℃在存在1μg载体DNA的条件下温育5分钟，在液氮（约－196℃）中冷冻约15秒，在37℃再温育5分钟。添加1ml液体肉汤培养基（LB）后，经处理的细胞在28℃生长3小时，并平铺于含有链霉素（100mg/L）和卡那霉素（100mg/L）的LB/琼脂上。接着从单个LBA4404克隆的过夜培养物中分离载体DNAs并通过限制性酶切分析检查以确定是否存在完整的质粒DNA。
通过使10倍稀释的过夜生长的LBA4404：：pSIM108细胞生长5－6小时，在2,800RPM下离心15分钟沉淀细胞，用补充了蔗糖（3％，pH 5.7）的MS液体培养基（Phytotechnology）冲洗细胞并在相同培养基中重悬细胞到OD600nm为0.2进行模型植物烟草的试验转化。接着用悬液感染4周龄的体外生长的烟草植株的叶外植体。将感染的烟草外植体在25℃在Percival生长室（16小时光照）内，在含有6g/L琼脂的协同培养基（1/10MS盐，3％蔗糖，pH5.7）上培养2天，随后转移到含有替卡西林－克拉维酸（150mg/L）和卡那霉素（100mg/L）的M401/琼脂培养基中。表3中显示在接下来的4周内每个外植体所产生的胼胝体的数量。我们的数据表明通过天然的末端或常规T－DNA边缘序列描绘的P－DNAs在转化的烟草中比T－DNAs的效率高约50％。增加的P－DNA转化效率可归因于不同的CG含量或P－DNA的其它未知的结构特征。
实施例3
用P－DNA载体转化马铃薯
这个实施例表明可以以类似T－DNA的方式，使用P－DNA将DNA从土壤杆菌转移到马铃薯细胞中。
根据下列方法通过用土壤杆菌菌株感染4周龄体外生长的RussetRanger小植株的茎外植体进行马铃薯转化。10倍稀释的过夜生长的培养物生长5－6小时，在2,800RPM下离心15分钟沉淀细胞，用补充了蔗糖（3％，pH 5.7）的MS液体培养基（Phytotechnology）冲洗，在相同培养基中重悬到OD600nm为0.2。接着用重悬的细胞感染0.4－0.6mm的节间马铃薯节段。将感染的茎在22℃在Percival生长室（16小时光照）内，在含有6g/L琼脂的协同培养基（1/10MS盐，3％蔗糖，pH 5.7）上培养2天，随后转移到含有特美汀（150mg/L）和卡那霉素（100mg/L）的胼胝体诱导培养基（CIM，补充了3％蔗糖3、2.5mg/L的玉米素核苷、0.1mg/L萘乙酸以及6g/L琼脂的MS）中。在CIM上培养1个月后，将外植体转移到含有替卡西林－克拉维酸和卡那霉素（分别为150和100mg/L）的枝条诱导培养基（SIM，补充了3％蔗糖、2.5mg/L玉米素核苷、0.3mg/L赤霉酸GA3以及6g/L琼脂的MS培养基）中。3－4周后，计数发育成转基因胼胝体和/或抽芽的外植体的数量。如在烟草中所示，用pSIM108感染的显示胼胝体的茎外植体的数量高于那些在对照实验中用常规双载体pBI121感染的数量（表3）。随后从这些胼胝体中长出的枝条可以被分成两个不同的类型。第一种类型的枝条与用LBA：：pBI121转化的对照枝条在表型上无法区分。第二种类型的枝条显示IPT表型。后一种类型的枝条生长受阻，仅有非常小的叶子，显示亮绿至黄颜色，一旦转移到无激素培养基中就不能生根。为了进一步确定IPT表型的枝条是否含有稳定整合到它们基因组中的IPT基因，将所有的枝条转移到含有补充了3％蔗糖和150mg/L替卡西林－克拉维酸MS培养基的Magenta盒中，允许再生长3到4周，用于分离DNA。这种植物DNA作为PCR反应中的模板，该反应含有设计为退火到IPT基因上的寡核苷酸对：5’－GTC CAA CTT GCA CAGGAAAGA C－3’，和5’―CAT GGA TGAAAT ACT CCT GA GC―3’。如表4显示，PCR实验进一步确定在IPT表型和IPT基因存在之间严格的相关性。也检查在从用pBI121转化中获得的植物中是否存在主链DNA。这是通过在从转化事件中分离的DNA上进行PCR反应来完成的，该反应使用“pBI121主链引物”：
5’―CGGTGTAAGTGAACTGCAGTTGCCATG―3’（SEQ ID NO.64），和5’―CATCGGCCTCACTCATGAGCAGATTGS―3’（SEQ ID NO.65）。扩增出0.7kbp的条带表明发生了主链整合。通过比较表4显示的数据，可推断对于P－DNA载体和T－DNA主链，整合频率是相似的。
进行第二个PCR实验以检验无IPT的植物是否不含有任何其它的主链序列。因为IPT表达盒靠近左边缘样序列，所以将这个实验的寡核苷酸对设计成退火到靠近右边缘样序列的主链序列上：
5’―CACGCTAAGTGCCGGCCGTCCGAG―3’（SEQ ID NO.66）和5’―TCCTAATCGACGGCGCACCGGCTG―3’（SEQ ID NO.67）。这个实验的数据进一步证实对IPT基因呈阳性的植物对主链的这个其它部分也呈阳性。
对马铃薯变种Russet Burbank进行类似的实验。根据IPT表型的评价，显示pSIM108和pSIM109的主链整合频率可与Russet Ranger中的那些相比（见表4和5）。
实施例4
马铃薯转化酶抑制剂基因
使用常规的转化方法，这个实施例表明过度表达新的马铃薯转化酶抑制剂基因将提高马铃薯块茎的加工和健康特性。
设计下列引物以扩增烟草液泡转化酶抑制剂Nt-inhhl的新马铃薯同系物（Greiner等，Nature Biotechnology，17，708－711，1999）：5’―AAAGTTGAATTCAAATGAGAAATTTATTC―3’（SEQ ID NO.68）和5’―TTTTAAGCTTTCATAATAACATTCTAAT―3’（SEQ ID NO.69）。通过混合下列成分进行扩增反应：4μl植物DNA、2μl向前的引物（10pM/ml）、2μl反相引物、25μl Hot Start Master Mix（Qiagen CatalogNr.203443）以及17μl水。使用PTC－100热循环仪（MJ Research）让这种反应混合物接受下列聚合酶链反应（PCR）条件的处理：（1）95℃，5分钟（1个循环），（2）94℃，1分钟；45℃，1分钟；以及72℃，4分钟（35个循环），（3）72℃，10分钟（1个循环）。在0.8％琼脂糖凝胶上加入全部产物，使用QIAquick凝胶提取试剂盒（Qiagen，CA）从凝胶中纯化540个碱基对的条带。接着将这种纯化的片段连接到pGEM－T Easy（Promega，WI）上并使用Max高效感受态细胞（GibcoBRL，MD）转化到大肠杆菌（E.coli）DH5α中。从转化的DH5α中分离的重组质粒DNA的序列分析显示，存在由编码推定的181个氨基酸蛋白（SEQ ID NO.：5）的543个碱基对构成的单一可读框；簇对比显示与Nt－inhh有70％的同源性（图2）。这种高水平的同源性扩展到15个氨基酸的N末端区，表明马铃薯同系物靶向液泡。有趣地是，马铃薯转化酶抑制剂同系物，称为St-inhl，与称为Nt-inhl的专利烟草细胞壁的转化酶抑制剂（专利WO98/04722；图2）仅有43％同源性。
尽管在未修饰的马铃薯块茎中存在St-inhl基因，但是其表达水平不足以全部抑制转化酶和减少冷诱导的变甜。为了提高马铃薯的贮藏特性，将St-inhl基因融合到颗粒粘附淀粉合酶基因（GBSS）的新的增加块茎的启动子上，已知该启动子促进块茎中基因的高水平表达。使用正向的引物5’―GAACCATGCATCTCAATC―3’（SEQ ID NO.70）和反向引物5’―GTCAGGATCCCTACCAAGCTACAGATGAAC―3’（SEQ  IDNO.71），通过进行PCR反应从马铃薯栽培品种Russet Ranger中分离GBSS启动子。在pGEM－T中克隆的扩增产物的序列分析表明这种新启动子含有658个碱基对（SEQ ID NO.：6）。接着将得到的启动子/基因融合连接到马铃薯泛素基因的3’调节序列（UbiT；SEQ ID NO.：7），因而确保转化酶抑制基因转录的适当终止。
在双载体的T－DNA边缘序列之间插入这种表达盒，使用得到的载体pSIM320转化上面描述的Russet Ranger。将9个独立的转基因系中的3个插条种植在土壤中并在生长室（光照11个小时，20℃）内生长4周。接着从每个品系中收获至少3个小块茎并转移到4℃的冰箱中以诱导冷变甜。4周后，通过使用Accu－Chek仪和检验条（Roche Diagnostics，IN）或者葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂（Megazyme，Ireland）测定这些冷藏的小块茎中的葡萄糖水平。将这些水平与6个未转化品系和用pSIM110来源的载体转化的6个缺乏转化酶抑制基因的“载体对照”系的平均葡萄糖水平进行比较。如在表6中所示，3个转基因系累积的葡萄糖少于“载体对照”系中的40％，表明马铃薯转化酶抑制剂同系物有功能活性。
下列实验显示块茎中存在的还原糖的量与块茎加工期间丙烯酰胺的产量相关。从农田中收获新鲜的Russet Ranger马铃薯块茎并贮藏在4℃以诱导冷变甜；对照块茎贮藏在18℃。4周后，测定两组块茎中的葡萄糖水平。随后，冲洗块茎，在华氏165度漂白8分钟或12分钟，切成0.290×0.290微条，在华氏160度浸入1％焦磷酸钠溶液，在华氏160度干燥直到丧失干重的14±2％，在华氏390度油炸40秒以达到最初油炸含水量的64±2％，在华氏－15度冷冻20分钟，在最初的6分钟内摇动托盘2－3次。接着通过Covance实验室（WI）分析得到的法国油炸食品的丙烯酰胺水平。如表7所示，在18℃贮藏的块茎中葡萄糖的水平低于0.1mg/g的检出水平，而冷贮藏的块茎含有平均3.4mg/g的葡萄糖。这个表也显示在由后者马铃薯生产的油炸食品中含有的丙烯酰胺水平比由贮藏在18℃的马铃薯生产的油炸食品高出约10倍。甚至对在18℃贮藏的马铃薯使用比在4℃贮藏的马铃薯还短的漂白时间来生产相似颜色（分别是78和71的颜色ids）的油炸食品，仍然在丙烯酰胺累积上得到5倍的差异（表7）。因此，似乎在块茎中还原糖如葡萄糖的量和这些块茎来源的油炸食品中丙烯酰胺的累积之间有直接的联系。
为了测定pSIM320品系中还原葡萄糖的水平是否限制加工诱导的丙烯酰胺的累积，将加工冷贮藏的pSIM320品系小块茎切成楔形物，漂白8分钟，在0.5％SAPP中浸30秒，在华氏160度干燥4.5分钟，在华氏380度油炸40秒，在华氏－15度冷冻15分钟，最后在华氏160度中干燥3分10秒。然后将加工过的材料运送到Covance实验室进行丙烯酰胺测定。如表6所示，从具有最低量葡萄糖的小块茎中获得的法国油炸食品累积最低水平的丙烯酰胺。在“320－2”和“320－4”品系中葡萄糖水平减少40％，与之相关的丙烯酰胺水平减少5倍。
实施例5
与马铃薯R1基因相关的前导和尾随序列
使用常规的转化方法，这个实施例表明可使用与马铃薯R1基因相关的新的前导序列以有效地提高马铃薯块茎的加工和健康特性。也可预言可以以相同的方式利用与该相同基因相关的新的尾随序列。
作为过度表达转化酶抑制剂基因的替换方法，发展不使用任何实际基因序列限制丙烯酰胺产生的方法。这样的抑制方法是基于使块茎表达的R1基因沉默。以前已经显示通过来源于该基因的1.9kb基因片段的反义表达可使与这种淀粉相关的基因沉默（Kossmann等，美国专利6,207,880）。然而，大DNA片段的反义表达是不良的，因为这样的片段含有新的可读框（表1）。作为上述方法的一种更安全的方式，从马铃薯中分离与R1基因相关的小前导序列。通过使用GIBCO BRL提供的5’RACE试剂盒在Russet Ranger马铃薯植株块茎的全部RNA上进行cDNA末端的快速扩增以获得这种前导序列。序列分析表明，与R1相关的前导序列由179个碱基对构成（SEQ ID NO.：8）。将被马铃薯泛素内含子（SEQ ID NO.：9）隔开的这种前导序列的正义和反义拷贝置于GBSS启动子和UbiT之间。在图3中显示得到的与R1相关的前导序列的表达盒（SEQ ID NO.：10）。在（图3；SEQ ID Nos.：12）中显示类似的表达盒，其含有来自GBSS启动子的间隔区（SEQ ID NO.：11），代替Ubi内含子隔开R1尾随序列的正义和反义拷贝。在图3中显示含有GBSS启动子的较长形式的另外的变体（SEQ ID NOs.：14－15）。
为了检验与R1相关的前导序列在限制丙烯酰胺产生中的效率，将在图3中所显示的表达盒作为KpnI－XbaI片段在双载体的T－DNA边缘序列之间插入。使用具有得到的pSIM332载体的土壤杆菌LBA4404株转化Russet Ranger马铃薯。为了诱导块茎的形成，将25个代表独立转化事件的枝条转移到土壤中并置于生长室内（光照11个小时，25℃）。3周后，将至少3个小块茎/品系在4℃贮藏4周以诱导淀粉转移。随后根据实施例4中描述的方法测定这些冷藏的小块茎中的葡萄糖水平，并与未转化的植株和载体对照中的平均葡萄糖水平相比较。如表8中所示，来自所有25个品系的小块茎显示冷藏后葡萄糖水平降低了。与对照相比，预计在来自显示R1表达水平减少的小块茎的法国油炸食品中丙烯酰胺的水平大约减少了2倍。在成熟的块茎中期望对下调R1基因表达的影响更强烈。
作为基于前导序列方法的替换方法，产生含有与R1相关的尾随序列的正义和反义拷贝的表达盒。通过在从马铃薯栽培品种Russet Ranger的微块茎中分离的全部RNA上进行逆转录多聚酶链式反应（RT－PCR）而获得这种尾随序列。使用Omniscript RT试剂盒（Qiagen，CA）产生互补DNA，然后用作使用Hot start DNA聚合酶（Qiagen，CA）的PCR反应的模板，该反应使用基因特异性反相引物R1－1（5’―GTTCAGACAAGACCACAGATGTGA―3’）。克隆到pGEM－T上的扩增的DNA片段的序列分析表明，与R1相关的尾随序列由333个碱基对构成（SEQ ID NO.：16）。通过在GBSS启动子和Ubi终止子之间插入的Ubi内含子或GBSS间隔区将尾随序列的正义和反义拷贝隔开（图3；SEQ ID Nos.：17－18）。在图3中显示含有较大GBSS启动子的类似形式（SEQ ID NOs.：19－20）。
可根据上面描述的方法测定葡萄糖和丙烯酰胺的水平。期望显示葡萄糖浓度降低约50％或更多的块茎在油炸过程中也累积少于约50％的丙烯酰胺。可在成熟的农田生长的块茎中进一步确定修饰植株的经改善的健康和贮藏特性。
可通过使用AOAC方法995.11食物中的磷（全部）（45.1.33AOAC国际正式分析方法，第17版）来测定马铃薯块茎中的磷酸水平。通过在马弗炉中干灰化随后用酸消化来制备样品。然后中和溶解的样品，用钼酸－抗坏血酸溶液处理并与一系列磷标准（经过类似处理）进行比较。使用双光束分光光度计在823纳米进行比色分析。预期磷含量会显著降低，这对环境有利。
实施例6
与L－α葡聚糖磷酸化酶基因相关的前导序列
使用常规的转化方法，这个实施例表明可使用与马铃薯L－α葡聚糖磷酸化酶基因相关的新前导序列以有效地提高马铃薯块茎的加工和健康特性。
以前已经显示可通过α葡聚糖磷酸化酶基因的0.9kb片段的反义表达来减少冷诱导的变甜（Kawchuk等，美国专利5,998,701，1999）。然而，这些相对大的DNA片段的反义表达是不良的，因为它们含有新的和未被描述的可读框，如果这些可读框在转基因植物中表达就可能影响食物的营养质量（表1）。
作为上述方法的更安全的方式，从成熟块茎的RNA中分离与L型葡聚糖磷酸化酶基因相关的小前导和尾随序列。用于这个目的所使用的引物对是：5’－GGATCCGAGTGTGGGTAAGTAATTAAG－3’（SEQ IDNO.72）和5’－GAATTCTGTGCTCTCTATGCAAATCTAGC－3’（SEQ IDNO.73）。扩增得到273个碱基对的前导序列，显示为SEQ ID NO.：21。类似地，使用“直接”引物5’－GGAACATTGAAGCTGTGG－3’（SEQ IDNO.74）和寡－dT引物来扩增与L型葡聚糖磷酸化酶基因相关的158个碱基对的“尾随序列”（SEQ ID NO.：22）。
然后使用这些尾随或前导序列设计表达盒以修饰L型葡聚糖磷酸化酶基因的表达，并如此通过限制淀粉转移来降低油炸产品中的丙烯酰胺水平。以与实施例5中描述的类似方式构建这些表达盒，并描述在图3中（SEQ IDNos.：23－26）。使用含有称为pSIM216的具有这种表达盒的双载体的土壤杆菌菌株感染马铃薯茎，产生25个转基因植株。将来自这些植株的小块茎在4℃贮藏4周以诱导冷变甜。然后分析经冷藏小块茎的葡萄糖水平。如表9所示，所有转基因品系的小块茎显示葡萄糖水平降低。
使用显示葡萄糖浓度至少降低50％的4个品系（216－2、216－5、216－10以及216－21品系）以评价加工诱导的丙烯酰胺水平。尽管在来自前3个品系的油炸块茎中丙烯酰胺水平与对照类似，但是来自216－21品系的法国油炸食品仅累积相当于野生型的45％的丙烯酰胺水平（每十亿分之136：305）。这些结果进一步证实在实施例4中描述的对过度表达马铃薯转化酶抑制剂基因块茎的实验，因为需要葡萄糖（和果糖）浓度相对大的降低以限制在冷藏的小块茎中热诱导的丙烯酰胺累积。因为期望在成熟的“216”块茎中磷酸化酶基因的沉默更有效，所以也期望在用这样的块茎生产的法国油炸食品中丙烯酰胺水平的降低更显著。可在成熟的块茎中进一步确定修饰的植株具有改善的健康和贮藏特性。
实施例7
修饰的多酚氧化酶基因
使用常规的转化方法，这个实施例表明可使用缺乏功能性铜结合位点的修饰的多酚氧化酶基因以有效地减少块茎的伤痕易感性。
以前已经显示，可通过1.8kb PPO基因的反义表达来减少黑斑伤痕易感性（Steffens，美国专利6,160,204，2000）。然而，这个大基因的反向互补序列的表达是不希望要的，因为它含有新的和未描述过的可读框，其编码由超过100个氨基酸构成的肽，可能潜在地影响食物的营养质量（表1）。作为上述方法的更安全的方式，修饰PPO基因以编码非功能蛋白。
通过使用聚合酶链反应（PCR）方法从Russet Ranger中分离野生型的马铃薯PPO基因。首先，从Russet Ranger芽中分离基因组DNA。然后使用DNA  聚合酶和寡核苷酸引物：
5’―CGAATTCATGGCAAGCTTGTGCAATAG―3’（PPO－F）（SEQ IDNO.75）和5’―CGAATTCTTAACAATCTGCAAGACTGATCG―3’（PPO－R）（SEQ ID NO.76）从马铃薯基因组DNA中扩增马铃薯PPO基因。将这些设计成与马铃薯PPO基因的5’－和3’－端互补。将扩增的1.6kb片段克隆到pGEM－T EASY载体（Promega）上，通过序列分析进一步证实其代表功能性的PPO基因（SEQ ID NO.：27）。
通过将这种蛋白与甘薯PPO蛋白进行对比，鉴定马铃薯PPO中的结合铜的结构域，其中甘薯的PPO蛋白显示在92位含有保守的半胱氨酸（Cys）残基、236位上含有谷氨酰胺（Glu）残基、以及在与两个活性位点铜配位的88，109，118，240，244和274位上含有组氨酸（His）残基（Klabunde等，Nature Structural Biol.，5：1084－1090，1998）。在马铃薯PPO中也存在这些半胱氨酸、谷氨酰胺以及组氨酸。
通过使用PCR突变取代的方法产生无活性的PPO基因。使用3对引物和野生型Russet Ranger PPO作为模板，通过Proof Start Taq DNA聚合酶（Qiagen）扩增出3个片段。第一对引物分别称为P1－F和P2－R，其序列是：5’―GAGAGATCTTGATAAGACACAACC―3’（SEQ ID NO.77）和5’―CATTACC1ATAAGCC2CAC3TGTATATTAGCTTGTTGC―3’（SEQ ID NO.78）（1：“A”突变成“C”，导致在186位上的半胱氨酸被甘氨酸取代；2：“A”突变成“C”，导致在183位上的半胱氨酸被色氨酸取代；3：“A”突变成“C”，导致在182位上的组氨酸被谷氨酰胺取代）。第二对引物分别称为P3－F和P4－R，其序列是：
5’―GTGCTTATAGAATTGGTGGC―3’（SEQ ID NO.79）和5’―TAGTTCCCGGGAGTTCAGTG―3’（SEQ ID NO.80）。第三对引物分别称为P5－F和P6－R，其序列是：
5’―CTCCCGGGAACTATAGG4AAACATTCCTCT5CGGTCCTGTCCACATCTGGTC―3’（SEQ ID NO.81）和5’―GTGTGATATCTGTTCTTTTCC―3’（SEQ ID NO.82）（4：“A”突变成“G”，导致在326位上的谷氨酰胺被甘氨酸取代；5：“A”突变成“T”，导致在330位上的组氨酸被亮氨酸取代）。
使用引物P1－F和P2－R扩增80个碱基对的片段，并用BglII消化。这个片段含有一个粘性末端（BglII）和一个钝性末端，并在铜结合位点I上具有3个突变。使用引物P3－F和P4－R扩增并用XmaI消化的0.4kb片段含有一个钝性末端和一个粘性末端（XmaI）。使用引物P5－F和P6－R扩增0.2kb片段，并用XmaI和EcoRV消化。这具有粘性末端（XmaI）和钝性末端（EcoRV）的第三个片段在铜结合位点II中有2个突变。接着用上面3个连接的PCR扩增片段取代克隆的野生型马铃薯PPO的BglII和EcoRV片段。通过序列分析进一步确定修饰的PPO基因中存在全部5个点突变（SEQ ID NO.：28）。为了产生修饰的PPO（mPPO）的表达盒，将下列4个片段同时连接起来：（1）含有GBSS启动子的BamHI－HindIII片段，（2）含有突变型PPO的HindIII－SacI片段，（3）含有Ubi－3终止子的SacI－KpnI片段，以及（4）用KpnI和BamHI消化的质粒pBluescript。然后在双载体的边缘序列之间插入这种表达盒而产生pSIM314。
通过用pSIM314转化Russet Ranger茎外植体来评价mPPO基因表达盒的效率。将含有这种表达盒的转基因植物的节插条置于补充了7％蔗糖的MS培养基中。在18℃黑暗培养5周后，分离微块茎并鉴定PPO活性。对于这个目的，将1g马铃薯块茎在液氮中粉碎。然后将这种粉末加到5ml含有50mM儿茶酚的50mM MOPS（3－（N－吗啉子基）丙磺酸）缓冲液（pH 6.5）中，在室温下旋转培养约1小时。然后沉淀固体部分，将上清液转移到另一个试管中，通过测量OD 410对时间的变化而测定PPO活性。如表10所示，与未转化的对照或用不含突变型PPO基因的构建物转化的对照相比，从一些转基因系中分离的微块茎显示多酚氧化酶活性显著降低。在“314－9”、“314－17”以及“314－29”品系中观察到PPO活性最强烈的降低。为了检验突变型PPO基因的表达是否也降低了小块茎中的PPO活性，在土壤中种植转基因系的生根的小植物，并在生长室内培养4周。对分离的小块茎的PPO测定表明，在决大多数实例中微块茎中降低的PPO活性与小块茎中降低的活性相关（表10）。可以繁殖显示PPO活性降低的转基因系，在温室和农田中进行检验以进一步确定成熟的块茎中“低伤痕”表型。由于微块茎和小块茎表达多种多酚氧化酶，所以其中的一些与主要在成熟的块茎中表达的靶向多酚氧化酶仅有有限的序列同源性，在如“314－9”和“314－17”品系的成熟块茎中可以预期PPO活性甚至会更极度降低。数据表明无功能活性的PPO基因的过度表达可导致降低伤痕易感性。也可在农田生长的成熟块茎中进一步证实修饰植物的经过改善的健康和贮藏特性。
实施例8
对马铃薯块茎的非表皮组织特异的多酚氧化酶基因的尾随序列
使用常规的转化方法，这个实施例表明，可使用与马铃薯PPO基因相关的新的尾随序列以有效地减少块茎的伤痕易感性。
使用反转录PCR也分离与在马铃薯块茎中表达的PPO基因相关的尾随序列。第一个PCR反应的引物是PPO－1（5’―GAATGAGCTTGACAAGGCGGAG―3’（SEQ ID NO.83））和寡－dT；第二个嵌套式PCR反应的引物是PPO－2（5’―CTGGCGATAACGGAACTGTTG―3’（SEQ ID NO.84））和寡－dT。克隆到pGEM－T上的扩增的DNA片段的序列分析显示存在154个碱基对的尾随序列（SEQ ID NO.：29）。接着将被Ubi内含子隔开的这种尾随序列的正义和反义拷贝融合到上面描述的GBSS启动子和Ubi3终止子上，以产生在图3中所示的表达盒（SEQ ID NO.：30）。在图3中显示含有被GBSS间隔区隔开的尾随序列片段的可选择的构建物（SEQ IDNO.：31）。在图3中显示具有较大GBSS启动子的类似形式（SEQ ID Nos.：32－33）。有趣地是，主要在成熟块茎中表达的PPO基因的尾随序列（图4中用P－PPO3表示）不同于主要在包括微块茎的其它组织中表达的PPO基因的尾随序列（图4中用PPOM－41和PPOM－44表示）。由于不同的与PPO基因相关的尾随序列之间的低同源性，因此使用P－PPO3尾随序列将仅导致成熟的块茎特异PPO基因的沉默。由于很难用PPO基因本身的序列来完成这种非常特异性的基因的沉默，因而表明了使用非编码序列进行基因沉默的优点。为了显示PPO活性的程度，将0.5ml 50mM的儿茶酚用移液管滴在切成薄片的遗传修饰的小块茎的切面上。与对照相比，块茎区可见的褐变减少约5到10倍。有趣地是，尽管是这样，但是在马铃薯外皮上没有观察到褐变。似乎使用的尾随序列特异性地使主要在皮层和髓中表达但不在表皮中表达的PPO基因沉默。因为PPO基因可能在某种防御反应中起某种作用，所以这种意外的发现可能对保护块茎本身不受一些病原体试图通过外皮感染是有益的。为了定量测定PPO活性，根据实施例7中描述的方法进行测定。表11显示与未转化的对照相比，转化的小块茎中PPO活性降低最高达到80％。因为与小块茎和微块茎相比，这些块茎更主要地表达靶PPO基因，所以预计在成熟块茎中降低的水平甚至将更多。可在成熟块茎中进一步证实如“217－7”和“217－26”品系的改善的特性。
实施例9
提高抗性淀粉水平的表达盒
增加块茎中直链淀粉/支链淀粉的比例可以进一步提高马铃薯产品的营养价值。一个可以提高直链淀粉含量的方法是基于编码淀粉分支酶（SBE）I和II基因的反义表达（Schwall等，Nature Biotechnology 18：551－554，2000）。这种方法的缺点是（1）通过利用反义技术同时沉默两个不同基因的效率非常低，（2）相对大的SBE－I和SBE－II基因序列的反义表达导致可读框（表1）的不合需要的表达，（3）包含两个反义表达盒的相应的构建物是不必要的大而复杂的，因而，增加了重组的机会并降低了转化频率。
我们的提高马铃薯中直链淀粉含量的方法是基于与两个基因都相关的尾随序列的表达。这些尾随序列（SEQ ID NO.：34和35）是用下列引物对进行分离的：5’―GTCCATGATGTCTTCAGGGTGGTA―3’（SEQ IDNO.85），5’―CTAATATTTGATATATGTGATTGT―3’（SEQ ID NO.86），5’―ACGAACTTGTGATCGCGTTGAAAG―3’（SEQ ID NO.87），以及5’―ACTAAGCAAAACCTGCTGAAGCCC―3’（SEQ ID NO.88）。单个启动子驱动被泛素－7内含子隔开的，其后是泛素－3终止子的两个尾随序列的正义和反义融合的表达。全部表达盒的大小仅为2.5kb。
实施例10
开发无标记的转化方法
这个实施例表明不需要选择性标记基因的稳定整合也可有效地转化植物。
这个方法首先利用靶向植物细胞核的DNAs经常不能随后整合到植物细胞的基因组中的现象。本发明人获得了令人惊奇的发现，通过将感染的外植体置于含有适当的选择性试剂的植物培养基上5天，可能选择出暂时表达含有选择性标记基因的非整合T－DNA的细胞。用于开发当前方法的第二个现象是不同双载体的T－DNAs经常靶向相同的植物细胞核。通过使用两个不同的双载体：一个含有T－DNA上的选择标记，另一个含有具有实际的兴趣序列的T－DNA或P－DNA，可以使用短暂的选择系统而获得大量胼胝体、枝条或植株，其重要的一部分代表无标记的转化事件。
使用被称为pSIM011的常规双载体来代表具有“兴趣序列”的载体，在这个检验实例中，兴趣序列是位于常规T－DNA上的β葡糖醛酸糖苷酶（GUS）的基因表达盒。在这些实验中使用的第二个双载体在pSIM011衍生物的T－DNA边缘序列之间含有包含被泛素－7基因的强启动子驱动的新霉素磷酸转移酶（NPTII）基因和其后的胭脂氨酸合酶（nos）基因的终止序列的表达盒。
令人惊奇的是，也可通过用酵母醇脱氢酶1（ADH）基因的终止子（基因库登记号V01292，SEQ ID NO.56）取代nos终止子来获得高水平的短暂NPTII基因表达水平。这个发现很有趣，因为酵母ADH1终止子与任何植物终止子都没有同源性。重要地是，这里应当注意到，许多酵母终止子在植物中不能充分发挥作用。例如，在上面描述的GUS基因后是酵母异－1－细胞色素c（CYC1）终止子（基因库登记号SCCYT1）的类似实验中，几乎没有观察到GUS基因表达。通过用酵母ADH1终止子取代nos终止子产生具有选择性标记基因NPTII的经过改善的载体。含有用于短暂转化的选择性标记基因的双载体被称为“LifeSupport”（图5）。
用两个分别含有pSIM011和LifeSupport的根癌农杆菌LBA4404株同时感染马铃薯茎外植体。1/10稀释的每个菌株的过夜生长的培养物在它们沉淀前生长5－6小时，根据实施例3中描述的方法洗涤并重悬到OD600nm为0.4。然后用以每个细菌0.2（OD600nm）的终密度的重悬细胞感染0.4－0.6cm节间马铃薯片段。如在实施例3中的方法处理感染的茎，主要区别是：用卡那霉素进行的选择限于在胼胝体诱导培养基中培养的前5天。然后，允许外植体在仅含有替卡西林－克拉维酸（timentine）150mg/L而无选择性抗生素的新鲜CIM和SIM中进一步发育。对从感染日起约3个月内从40－60％感染的茎中发育的胼胝体中长出的枝条的叶片，检验GUS表达并进行PCR分析以鉴定含有兴趣序列但不含标记基因的事件。如表12所示，11％的枝条代表无标记的转化事件。
也使用上述的两菌株方法转化烟草。对在约2个月内发育的枝条进行GUS测定和PCR分析。经过鉴定的无标记转化事件的高频率（18％）意味着所开发的方法可用于非马铃薯植物种（表12）。
重要地是，用两个不同的土壤杆菌菌株顺序感染而不是同时感染，导致提高了无标记转化的效率。通过用含有pSIM011的土壤杆菌菌株感染马铃薯茎外植体，将感染的外植体置于协同培养平板上4小时，然后用LifeSupport载体重新感染，发现了顺序感染的令人惊奇的效果。在这个实施例中，如前面描述的方法处理双重感染的外植体。如表13所示，在两个不同的感染之间4小时的滞后时间导致马铃薯中无标记转化事件的频率增加2倍。
实施例11
用pSIM340进行精确育种
这个实施例表明精确育种的效率。通过将马铃薯的遗传元件插入到马铃薯中（见实施例1、4和7），使用无标记转化（实施例10）来提高马铃薯植株的健康和农艺特性。
通过将突变型PPO和转化酶抑制剂两者的表达盒插入到双载体pSIM112’中，产生含有在P－DNA末端之间插入的转化酶抑制剂和突变型多酚氧化酶基因两个表达盒的双载体，称为pSIM340（图1）。用pSIM340和进一步改进的LifeSupport载体同时感染马铃薯茎外植体。接着共培养感染的外植体，进行短暂选择，以及诱导繁殖和产生前面讨论过的枝条。3个月后，将小枝条转移到新的培养基中并允许其再生长3周。然后根据实施例2和3中描述的方法，对枝条进行表型分析，收集叶片材料用于分子分析以确定是否存在主链、标记基因以及具有兴趣序列的P－DNA。如表14所示，1.2％的事件代表含有pSIM340的修饰P－DNA但无LifeSupport的植株。这种无标记转化的频率低于使用T－DNA转化的频率，这再次表明在P－DNA和T－DNA之间存在功能上有差别。
实施例12
选择抗LifeSupport T－DNAs的稳定整合
这个实施例表明，通过使用细菌的胞嘧啶脱氨酶基因来选择抗LifeSupport T－DNAs的稳定整合可以提高精确育种方法的效率。
前面的实施例表明，使用修饰的P－DNA的无标记转化的效率比使用常规的T－DNA的低几倍。为了提高产生仅含有修饰P－DNA枝条的效率，在LifeSupport载体的T－DNA边缘序列之间插入包括细菌胞嘧啶脱氨酶（codA）和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶（upp）基因（InvivoGen，CA）的自杀基因融合的表达盒，产生pSIM346（图5）。用一个含有pSIM340的菌株和另一个含有pSIM346的菌株感染马铃薯的茎外植体，随后置于下列培养基中：（1）协同培养基中2天，（2）CIMTK培养基中以选择短暂的标记基因表达5天，（3）CIMT培养基中以允许短暂表达的标记基因的植物细胞繁殖30天，（4）含有500mg/L无毒的5－氟胞嘧啶（5－FC）的SIMT培养基中，其中无毒的5－氟胞嘧啶通过植物细胞表达codA：upp而转化成有毒的5－氟尿嘧啶（5－FU），以选择抗LifeSupport T－DNA的稳定整合。胼胝体在4周内在SIMT中产生枝条。将这些枝条转移到含有替卡西林－克拉维酸（timentine）的MS培养基中，并允许生长直到获得足够的用于PCR分析的组织。然后从100个枝条中提取DNA并用于确定是否存在P－DNA、LifeSupport和主链。如表15所示，被分析的枝条中没有一个含有LifeSupport T－DNA，第一次表明，可将codA：upp基因融合用作再生前的阴性选择性标记。更重要地是，我们的结果表明，抗LifeSupport T－DNA整合的阴性选择提高仅含有修饰的P－DNA的枝条的频率。通过将短暂的标记基因表达的阳性选择与抗codA：upp基因融合的稳定整合的阴性选择结合，仅含有修饰P－DNA枝条的频率比仅使用短暂标记基因表达的阳性选择高约5倍（表15）。
通过使用LifeSupport载体pSIM350（图5），无标记转化的效率甚至得到极度增加，该载体与pSIM346类似但含有取代codA：upp基因融合的codA基因。如上面描述的方法处理用pSIM340和pSIM350同时感染的马铃薯的茎外植体，用分子学的方法检验所得到的51个枝条是否发生仅含有pSIM340的T－DNA区的事件。有趣地是，这种PCR分析显示一些枝条含有codA基因（表15）。这个发现表明，在植物中codA与codA：upp不一样，不是紧密的阴性选择标记。更重要地是，显示大量枝条（29％）代表无标记转化的事件。
不是同时用pSIM340和pSIM350感染外植体，而是顺序地感染可进一步提高效率。通过用pSIM340感染外植体以及4小时后用pSIM350再感染，预期无标记转化的频率将是大约30－40％。
实施例13
减少LifeSupport T－DNAs的整合
这个实施例表明，通过使用Ω突变的virD2基因减少LifeSupport T－DNA整合到植物基因组中，可以提高精确育种方法的效率。
一直显示土壤杆菌蛋白vird2的Ω区域对于该蛋白支持将T－DNA整合到植物基因组中的能力很重要（Mysore等，Mol Plant Microbe Interact11：668－83，1998）。基于这个观察，产生了含有插入到它们的主链序列中SacII位点上的Ω突变的virD2蛋白表达盒的修饰的LifeSupport载体。通过从质粒pCS45（Walt Ream博士赠送，俄勒冈州大学，OR，USA－，SEQ ID NO.：36）中扩增2.2kb DNA片段而获得该表达盒。使用称为pSIM401Ω（图5）的含有这种表达盒的LifeSupport衍生物，来支持用pSIM340的经过修饰的P－DNA对马铃薯植株的转化。在短暂选择和枝条诱导后，用分子学方法检验100个枝条是否存在转基因。如表15中所示，4.4％的枝条仅含有修饰的P－DNA，这表明使用Ω－virD2将无标记转化的效率提高了约4倍（表15）。
通过将LifeSupport T－DNA的大小从3.7kb（在pSIM401Ω中）增加到8.1kb（在被称为pSIM341Ω的pSIM401Ω衍生物中；图5）来进一步提高效率。通过从用pSIM340和pSIM341Ω同时感染的马铃薯茎外植体中再生枝条，显示81个分析事件中的7个（7％）代表无标记转化的事件（表15）。
通过用pSIM340和LifeSupport顺序感染外植体而不是同时感染，可获得进一步提高。以与实施例10中描述的类似方式，通过用pSIM340感染外植体，4小时后用LifeSupport再感染，仅含有修饰的P－DNA植株的频率可增加约一倍。
实施例14
开发使用1个菌株的方法
这个实施例表明，也可以通过使用含有P－DNA载体和LifeSupport两者的单个土壤杆菌菌株获得高频率的无标记转化。
产生可同时在土壤杆菌中维持的两个相容的双载体。使用这种系统用于仅整合修饰的P－DNA，而不是用于稳定整合两个分别含有兴趣DNA和标记基因的T－DNAs（Komari等，美国专利5731179，1998）。
第一个载体，被称为pSIM356，含有在P－DNA末端之间插入的包括被Ubi7启动子驱动的GUS基因以及随后的UbiT的表达盒。这个载体的主链部分含有来自pVS1和pBR322的细菌复制起点、用于细菌选择的壮观霉素抗性基因、以及能够在植物中选择抗主链整合的IPT基因的表达盒（图1）。第二个载体，被称为pSIM363，含有在常规T－DNA边缘序列之间插入的包括被Ubi7启动子驱动的NPTII基因以及随后的酵母ADH1终止子的表达盒（图5）。这个载体的主链部分含有ColE1（基因库号V00268）和ori V（基因库号M20134）的细菌复制起始点，以及用于细菌选择的卡那霉素抗性基因。
在100个烟草枝条中检验使用pSIM356和pSIM363来提高无标记转化频率的思想。如表16中所示，约19％的再生枝条含有无标记基因的兴趣DNA。通过将这种使用1个菌株的方法用于马铃薯，发现也能够提高无标记转化的效率。经检验的60个独立枝条中的9个（15％）含有pSIM340T－DNA而缺乏LifeSupport T－DNA（表16）。
可将使用1个菌株的方法与实施例12中描述的方法联合以使短暂的标记基因表达的阳性选择与抗codA基因稳定整合的阴性选择相结合。为了这个目的，开发了LifeSupport载体pSIM36（图5）。可使用一起含有这种载体和P－DNA载体的土壤杆菌菌株来有效地产生仅含有位于稳定整合在它们基因组的P－DNA内的兴趣基因表达盒的植株。
实施例15
依靠天然标记的精确育种方法
除了用仅含有期望序列的P－DNAs转化农作物以引入有益的特性外，本发明也提供用含有另外的天然标记基因的P－DNAs转化这类植物的方法。我们选择的新的和天然的标记基因是拟南芥（Arabidopsis）液泡Na＋/H＋逆向转运蛋白基因和苜蓿alfin－1基因的马铃薯同系物。这些基因的表达不仅允许鉴定转化事件，而且也给转化植物提供耐盐性。因此在面积逐渐增加的农田中，高盐度水平将较小地影响含耐盐性标记的马铃薯植株。
使用寡核苷酸对：5’―CCCGGGATGGCTTCTGTGCTGGCT―3’（SEQ ID NO.89）和5’―GGTACCTCATGGACCCTGTTCCGT―3’（SEQID NO.90），在从美国马铃薯基因库（WI）中获得的称为“LBR4”的晚疫抗性品种的cDNA中扩增两种形式的液泡Na＋/H＋逆向转运蛋白同系物，称为Pst（马铃薯耐盐性）。它们的序列显示为SEQ ID NO.：37和38。使用引物5’－CCCGGGTATGGAAAATTCGGTACCCAGGACTG―3’（SEQID NO.91）和5’－ACTAGTTAAACTCTAGCTCTCTTGC―3’（SEQ IDNO.92）从LBR4马铃薯DNA中扩增与alfin－1同源的第三个基因（SEQID NO.：39）。通过在修饰的pSIM341载体的常规T－DNA边缘序列之间插入与Ubi7启动子的融合，评价Pst基因作为转化标记的效率。在短暂的选择期后，允许卡那霉素抗性细胞增殖和发育成枝条。然后将这些枝条转移到含有100－150mM氯化钠的培养基中。耐盐性的枝条代表含有修饰的pSIM341的T－DNA的转化事件。
实施例16
块茎特异性的启动子
新分离的块茎特异性的启动子可取代使用的GBSS启动子以发展在前面的实施例中描述的表达盒。通过用马铃薯蛋白酶抑制剂基因（基因库登记号D17332）（SEQ ID NO.39）的特异性的引物，使用反向聚合酶链反应从Russet Burbank马铃薯植株的基因组中分离这种启动子。通过产生含有由这种启动子驱动的GUS基因以及NPTII标记基因表达盒的双载体来检验PIP启动子的效率。使用含有用GBSS启动子取代PIP启动子的相似构建物作为对照。通过用含有双载体的土壤杆菌菌株感染茎外植体，共培养2天，并在CIMTK培养基上选择2个月而获得转化枝条。将这些枝条转移到新培养基中以诱导形成根，然后种植在土壤中。在温室中生长3个月后可检测块茎的GUS表达。
实施例17
精确育种的优选构建物和转化方法
除了pSIM340，可以使用许多的其它载体，通过用修饰P－DNAs转化来改善马铃薯植株。这类载体中的两种含有与除了在表皮外，在所有块茎组织中都表达的PPO基因相关的尾随序列的正义和反义拷贝的表达盒（见实施例8）。载体pSIM370含有另外一个与磷酸化酶基因相关的前导序列的正义和反义拷贝的表达盒（见实施例6）。载体pSIM371含有马铃薯alfin－1同系物的第三个表达盒（图1）。
第三个可选择的载体，称为pSIM372，含有马铃薯alfin－1同系物表达盒以及与PPO相关的尾随序列、与R1相关的前导序列和与磷酸化酶相关的前导序列的融合体的正义和反义拷贝的表达盒。
对于使用1个菌株的方法，优选的LifeSupport载体是pSIM365。对于使用2个菌株的方法，优选的载体是pSIM367，其在质粒主链中含有在T－DNA边缘序列之间的NPTII和codA的表达盒以及另一个ΩvirD2的表达盒（图5）。
用含有pSIM365以及载体pSIM370、371和372中的任何一个载体的1个菌株感染马铃薯的茎外植体，或者用分别含有pSIM366和优选的兴趣载体中的任何一个的2个菌株顺序地感染马铃薯茎外植体。共培养2天以及短暂地选择5天后，将外植体转移到培养基中进行增殖/再生以及除去土壤杆菌（Agrobacterium）。30天后，将外植体再次转移到相同的但现在也含有5－FU的培养基中以除去含有LifeSupport T－DNAs的事件。将随后在胼胝体上长出的枝条转移到可能含有100－200mM盐的再生培养基中以筛选耐盐性事件。允许IPT阴性的枝条生根并发育成成熟的植株。预计这些植株中的大部分（10％－100％）代表含有具有稳定整合到它们基因组中的兴趣核苷酸序列的P－DNA的无标记的和无主链的植株。
表1.在反义马铃薯系中潜在表达未表征过的多肽
Figure BDA00002344442100741
Figure BDA00002344442100751
表3.转化效率
  双载体   胼胝体/烟草叶外植体±SE   胼胝体/马铃薯茎外植体±SE
  pBI121   7.8±0.6   0.31±0.10
  pSIM108   10.2±0.6   0.59±0.07
  pSIM109   12.8±0.6   0.47±0.05
表4.从Russet Ranger转化中得到的主链整合
Figure BDA00002344442100752
NA：不能应用的
表5.从Russet Burbank转化中得到的主链整合
  双载体   总数   IPT表型
  pSIM108   79   49（60％）
  pSIM109   72   60（84％）
表6.来自经冷藏的pSIM320小块茎的法国油炸食品中的丙烯酰胺水平
  品系   葡萄糖mg/g（降低的％）  丙烯酰胺（PPB）
  未转化的   10.2   469
  载体对照   10.2   NA
  320－2   5.4（47％）   95
  320－4   5.8（43％）   107
  320－7   8.7（14％）   353
  320－9   7.4（27％）   137
  320－17   6.0（41％）   506
  320－21   8.5（16％）   428
  320－33   6.6（35％）   516
NA：不能得到的
表7.来自未转化的成熟块茎的法国油炸食品中的丙烯酰胺水平
  在18℃贮藏（颜色id.*）   在4℃贮藏（颜色id.*）
  葡萄糖水平   <0.1mg/g   3.4mg/g
  漂白8分钟   53PPB（78）   603PPB（56）
  漂白12分钟   28PPB（84）   244PPB（71）
*：值越高表明完成的油炸产品的颜色越亮
表8.在冷藏的pSIM332小块茎中的葡萄糖水平
  品系   葡萄糖mg/g(减少的％)
  未转化的对照   11.6±0.5
  载体对照   11.5±0.5
  332－1   5.4（53％）
  332－2   4.8（58％）
  332－4   7.0（39％）
  332－5   5.8（50％）
  332－6   6.9（40％）
  332－7   6.0（48％）
  332－8   6.8（41％）
  332－9   6.6（43％）
  332－10   5.4（53％）
  332－11   6.1（47％）
  332－12   6.4（44％）
  332－13   6.4（44％）
  332－15   7.7（33％）
  332－16   6.5（43％）
  332－17   5.3（54％）
  332－18   7.1（38％）
  332－21   6.3（46％）
  332－22   5.4（53％）
  332－23   4.2（63％）
  332－31   6.0（48％）
  332－34   6.2（48％）
  332－35   6.4（44％）
  332－39   6.7（41％）
  332－40   7.5（35％）
  332－41   5.7（50％）
表.9在冷藏的pSIM216小块茎中的葡萄糖水平
  品系   葡萄糖mg/g(减少的％)
  未转化的对照   11.6±0.5
  载体对照   11.5±0.5
  216－2   5.5（52％）
  216－3   8.8（23％）
  216－4   7.4（36％）
  216－5   5.8（50％）
  216－8   8.4（27％）
  216－10   5.1（56％）
  216－11   10.1（19％）
  216－12   9.3（19％）
  216－13   6.4（44％）
  216－15   8.8（23％）
  216－16   9.7（16％）
  216－17   6.4（44％）
  216－19   8.7（24％）
  216－21   3.2（72％）
  216－24   9.4（18％）
  216－26   9.3（19％）
  216－29   7.1（38％）
  216－30   8.2（29％）
  216－32   9.3（19％）
  216－34   7.1（38％）
  216－35   7.8（32％）
  216－38   7.1（38％）
  216－42   8.1（30％）
  216－44   9.4（18％）
  216－45   10.2（11％）
表10.表达修饰PPO基因马铃薯系的PPO活性
表11.在表达与PPO基因相关的修饰的尾随序列的马铃薯小块茎中的PPO活性
  品系   OD－410/克（减少的％）
  未转化的对照   20.6±1.3
  载体对照   17.9±2.1
  217－1   12.5（39.4％）
  217－4   12.6（38.6％）
  217－5   11.3（45.0％）
  217－6   6.1（70.4％）
  217－7   5.7（72.5％）
  217－9   10.4（49.6％）
  217－10   15.2（26.3％）
  217－11   15.2（26.3％）
  217－12   6.6（67.9％）
  217－14   15.4（25.4％）
  217－15   13.5（34.6％）
  217－16   6.0（71％）
  217－17   9.7（53.0％）
  217－19   8.6（58.4％）
  217－21   14.2（31.1％）
  217－22   9.7（53.0％）
  217－23   15.2（26.3％）
  217－24   8.2（60.1％）
  217－25   11.9（42.2％）
  217－26   3.1（84.8％）
  217－27   6.2（69.9％）
  217－29   7.2（65.1％）
表12.用LifeSupport载体＋pSIM011进行的无标记转化
  植物   共转化   仅有标记   仅有兴趣基因   未转化
  马铃薯   0％   33％   11％   56％
  烟草   20％   26％   18％   36％
共转化的：对于GUS和NPT PCR均呈阳性
仅有兴趣基因：对于GUS PCR呈阳性
未转化的：对于GUS和NPT PCR均呈阴性的植物
表13.用LifeSupport载体和pSIM011顺序转化马铃薯
  时间窗口   共转化的   仅有标记   仅有兴趣基因   未转化的
  0小时   9％   36％   9％   46％
  4小时   20％   30％   20％   30％
未转化：对于标记和兴趣基因PCR呈阴性的植株
表14.用P－DNA载体pSIM340＋LifeSupport进行的无标记转化
  植物   共转化的   仅有标记   仅有兴趣基因   未转化的
  马铃薯   17％   52.8％   1.2％   29％
共转化：对于pSIM340的PPO基因以及LifeSupport的NPT基因PCR都呈阳性
未转化：对于PPO和NPTII PCR均呈阴性的植物
表15.用pSIM340＋改善的LifeSupport载体进行的无标记的马铃薯转化
  LifeSupport载体   共转化   仅有标记   仅有兴趣基因   未转化
  pSIM346   0%   0%   4%   96%
  pSIM350   10%   10%   29%   51%
  pSIM401Ω   6%   34%   5%   55%
  pSIM341Ω   16%   23%   7%   54%
共转化：对于pSIM340的PPO基因和LifeSupport的NPT基因PCR均呈阳性
未转化：对于PPO和NPTII PCR均呈阴性的植物
表16.用含有pSIM356和pSIM363的单个土壤杆菌菌株进行的无标记的马铃薯转化
  植物   共转化   仅有标记   仅有兴趣基因   未转化
  烟草   50％   15％   19％   16％
  马铃薯   22％   5％   15％   58％
共转化：对于pSIM356的GUS基因和LifeSupport的NPT基因PCR均呈阳性
未转化：对于PPO和NPTII PCR均呈阴性的植物
SEQ ID Nos
SEQ ID No.：1：马铃薯P－DNA。SEQ ID NO.1的粗体下划线部分分别代
               表P－DNA的左（5’－）和右（3’－）边缘样序列.
SEQ ID No.：2：小麦的P－DNA
SEQ ID No.：3：IPT基因的表达盒
SEQ ID No.：4：双载体pSIM111
SEQ ID No.：5：马铃薯的转化酶抑制的基因
SEQ ID No.：6：马铃薯的GBSS启动子
SEQ ID No.：7：马铃薯的泛素－3基因的终止子
SEQ ID No.：8：与R1基因相关的马铃薯前导序列
SEQ ID No.：9：马铃薯的泛素内含子
SEQ ID No.：10：与R1基因相关的前导序列的正义和反义拷贝的表达盒
SEQ ID No.：11：间隔区
SEQ ID No.：12：与R1基因相关的前导序列的正义和反义拷贝的可选择的
                表达盒
SEQ ID No.：13：较长的马铃薯GBSS启动子
SEQ ID No.：14：与R1基因相关的前导序列的正义和反义拷贝的可选择的
                表达盒
SEQ ID No.：15：与R1基因相关的前导序列的正义和反义拷贝的可选择的
                表达盒
SEQ ID No.：16：与R1基因相关的马铃薯尾随序列
SEQ ID No.：17：与R1基因相关的尾随序列的正义和反义拷贝的表达盒
SEQ ID No.：18：与R1基因相关的尾随序列的正义和反义拷贝的表达盒
SEQ ID No.：19：与R1基因相关的尾随序列的正义和反义拷贝的表达盒
SEQ ID No.：20：与R1基因相关的尾随序列的正义和反义拷贝的表达盒
SEQ ID No.：21：与L葡聚糖磷酸化酶基因相关的马铃薯前导序列
SEQ ID No.：22：与L葡聚糖磷酸化酶基因相关的马铃薯尾随序列
SEQ ID No.：23：与L葡聚糖磷酸化酶基因相关的前导序列的正义和反义拷
                贝的表达盒
SEQ ID No.：24：与L葡聚糖磷酸化酶基因相关的前导序列的正义和反义拷
                贝的可选择的表达盒
SEQ ID No.：25：与L葡聚糖磷酸化酶基因相关的前导序列的正义和反义拷
                贝的可选择的表达盒
SEQ ID No.：26：与L葡聚糖磷酸化酶基因相关的前导序列的正义和反义拷
                贝的可选择的表达盒
SEQ ID No.：27：马铃薯的PPO基因
SEQ ID No.：28：修饰的无活性的马铃薯PPO基因
SEQ ID No.：29：与PPO基因相关的马铃薯尾随序列
SEQ ID No.：30：与PPO基因相关的尾随序列的正义和反义拷贝的表达盒
SEQ ID No.：31：与PPO基因相关的尾随序列的正义和反义拷贝的可选择的
                表达盒
SEQ ID No.：32：与PPO基因相关的尾随序列的正义和反义拷贝的可选择的
                表达盒
SEQ ID No.：33：与PPO基因相关的尾随序列的正义和反义拷贝的可选择的
                表达盒
SEQ ID No.：34：与淀粉分支酶基因相关的马铃薯尾随序列
SEQ ID No.：35：与淀粉分支酶基因相关的马铃薯尾随序列
SEQ ID No.：36：Ω突变的virD2基因的表达盒
SEQ ID No.：37：马铃薯的耐盐性基因Pst1
SEQ ID No.：38：马铃薯的耐盐性基因Pst2
SEQ ID No.：39：马铃薯的耐盐性基因Pst3
SEQ ID No.：40：马铃薯块茎的特异启动子
SEQ ID No.：56：酵母ADH的终止子
SEQ ID No.：94：小麦的左边缘样序列
SEQ ID No.：95：小麦的右边缘样序列
SEQID1
Figure BDA00002344442100851
GAGGTATAGAGGCATGACTGGCATGATCACTAAATTGATGCCCACAGAGGAGACTTATAACCTACAGGGGCACGTAGTTCTAGGACTTGAAAGTGACTGACCGTAGTCCAACTCGGTATAAAGCCTACTCCCAACTAAATATATGAAATTTATAGCATAACTGCAGATGAGCTCGATTCTAGAGTAGGTACCGAGCTCGAATTCCTTACTCCTCCACAAAGCCGTAACTGAAGCGACTTCTATTTTTCTCAACCTTCGGACCTGACGATCAAGAATCTCAATAGGTAGTTCTTCATAAGTGAGACTATCCTTCATAGCTACACTTTCTAAAGGTACGATAGATTTTGGATCAACCACACACACTTCG
Figure BDA00002344442100852
SEQID2
TGGCAGGATATATGAGTGTGTAAACAACCATAATCAGGCTGTAATTATCAAGAGAACTAATGACAAGAAGCAGAGCTTATCAAGTGTTTCGTCCAGCTGTAACATGGGCACAAAAGCTTGCTTGATGCATGTCTGGCTTTTCAAAGAGCAATGTATTCTCAGGTACCTGCACGTTTGATCCCCTACCACGTACAAGACGAGCAGAAAGGACATGTCTGCAGAAACTTAGACACATCCATTGCAGACTCGTTCCGAAGCATCAGGAGAGTAGTCAGCAATGGTCATCTGCTGATGTAAATTAATTGATTGTTGGTAATCAAATTTTAACAGCAATATATATAATATATCAATAGTATATTGAACTATGAAAGACTGTAATCATATATAACAGCATACAAATTGTCGTGGAAACAAGAGGAGCTCATCAAGTGTTTAGTTCAGAAATAGCTAACCAAGAATGCAATATAATAGGGGTACTGAGCTCCCTTCAAAATTACTAACTTCAGAAATAGCTAACCAAGAATGCAATGGCATTGCATAATTTAAACAACTGTCAGCACCAATCTCTGACTGAAGGCAGTTTACCCATTCAGAAGAGCACACATTTTCTGAACGACAACTCTGAGCGGGGATTGTTGACAGCAGCAATTAATCTGGCCTCAAGATGGTTTCCAACAACATAGATCAGATACAGCACTCAAGCACCCAATAATCAGCCAGTACTGATCTGGTTACCACTGCAATTGATTAACAGATGAACTGTGAAATTAAGATTTAACTGACAGTAATATATACCAGTTGGCAGGATATATCCCTCTGTAAAC
SEQID3
CTGCAGCCAAAGCACATACTTATCGATTTAAATTTCATCGAAGAGATTAATATCGAATAATCATATACATACTTTAAATACATAACAAATTTTAAATACATATATCTGGTATATAATTAATTTTTTAAAGTCATGAAGTATGTATCAAATACACATATGGAAAAAATTAACTATTCATAATTTAAAAAATAGAAAAGATACATCTAGTGAAATTAGGTGCATGTATCAAATACATTAGGAAAAGGGCATATATCTTGATCTAGATAATTAACGATTTTGATTTATGTATAATTTCCAAATGAAGGTTTATATCTACTTCAGAAATAACAATATACTTTTATCAGAACATTCAACAAAGTAACAACCAACTAGAGTGAAAAATACACATTGTTCTCTAAACATACAAAATTGAGAAAAGAATCTCAAAATTTAGAGAAACAAATCTGAATTTCTAGAAGAAAAAAATAATTATGCACTTTGCTATTGCTCGAAAAATAAATGAAAGAAATTAGACTTTTTTAAAAGATGTTAGACTAGATATACTCAAAAGCTATCAAAGGAGTAATATTCTTCTTACATTAAGTATTTTAGTTACAGTCCTGTAATTAAAGACACATTTTAGATTGTATCTAAACTTAAATGTATCTAGAATACATATATTTGAATGCATCATATACATGTATCCGACACACCAATTCTCATAAAAAGCGTAATATCCTAAACTAATTTATCCTTCAAGTCAACTTAAGCCCAATATACATTTTCATCTCTAAAGGCCCAAGTGGCACAAAATGTCAGGCCCAATTACGAAGAAAAGGGCTTGTAAAACCCTAATAAAGTGGCACTGGCAGAGCTTACACTCTCATTCCATCAACAAAGAAACCCTAAAAGCCGCAGCGCCACTGATTTCTCTCCTCCAGGCGAAGATGCAGATCTTCGTGAAGACCCTAACGGGGAAGACGATCACCCTAGAGGTTGAGTCTTCCGACACCATCGACAATGTCAAAGCCAAGATCCAGGACAAGGAAGGGATTCCCCCAGACCAGCAGCGTTTGATTTTCGCCGGAAAGCAGCTTGAGGATGGTCGTACTCTTGCCGACTACAACATCCAGAAGGAGTCAACTCTCCATCTCGTGCTCCGTCTCCGTGGTGGTGGATCCATGGACCTGCATCTAATTTTCGGTCCAACTTGCACAGGAAAGACGACGACCGCGATAGCTCTTGCCCAGCAGACAGGGCTTCCAGTCCTTTCGCTTGATCGGGTCCAATGCTGTCCTCAACTATCAACCGGAAGCGGACGACCAACAGTGGAAGAACTGAAAGGAACGACGCGTCTCTACCTTGATGATCGGCCTCTGGTGGAGGGTATCATCGCAGCCAAGCAAGCTCATCATAGGCTGATCGAGGAGGTGTATAATCATGAGGCCAACGGCGGGCTTATTCTTGAGGGAGGATCCACCTCGTTGCTCAACTGCATGGCGCGAAACAGCTATTGGAGTGCAGATTTTCGTTGGCATATTATTCGCCACAAGTTACCCGACCAAGAGACCTTCATGAAAGCGGCCAAGGCCAGAGTTAAGCAGATGTTGCACCCCGCTGCAGGCCATTCTATTATTCAAGAGTTGGTTTATCTTTGGAATGAACCTCGGCTGAGGCCCATTCTGAAAGAGATCGATGGATATCGATATGCCATGTTGTTTGCTAGCCAGAACCAGATCACGGCAGATATGCTATTGCAGCTTGACGCAAATATGGAAGGTAAGTTGATTAATGGGATCGCTCAGGAGTATTTCATCCATGCGCGCCAACAGGAACAGAAATTCCCCCAAGTTAACGCAGCCGCTTTCGACGGATTCGAAGGTCATCCGTTCGGAATGTATTAGGTTACGCCAGCCCTGCGTCGCACCTGTCTTCATCTGGATAAGATGTTCGTAATTGTTTTTGGCTTTGTCCTGTTGTGGCAGGGCGGCAAATACTTCCGACAATCCATCGTGTCTTCAAACTTTATGCTGGTGAACAAGTCTTAGTTTCCACGAAAGTATTATGTTAAATTTTAAAATTTCGATGTATAATGTGGCTATAATTGTAAAAATAAACTATCGTAAGTGTGCGTGTTATGTATAATTTGTCTAAATGTTTAATATATATCATAGAACGCAATAAATATTAAATATAGCGCTTTTATGAAATATAAATACATCATTACAAGTTGTTTATATTTCGGGTGGACTAGTTTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGGAATTC
SEQID4
AGCTTTGGCAGGATATATACCGGTGTAAACGAAGTGTGTGTGGTTGATCCAAAATCTATCGTACCTTTAGAAAGTGTAGCTATGAAGGATAGTCTCACTTATGAAGAACTACCTATTGAGATTCTTGATCGTCAGGTCCGAAGGTTGAGAAAAATAGAAGTCGCTTCAGTTACGGCTTTGTGGAGGAGTAAGGGTACCTACTCTAGAATCGAGCTCATCGTTATGCTATAAATTTCATATATTTAGTTGGGAGTAGGCTTTATACCGAGTTGGACTACGGTCAGTCACTTTCAAGTCCTAGAACTACGTGCCCCTGTAGGTTATAAGTCTCCTCTGTGGGCATCAATTTAGTGATCATGCCAGTCATGCCTCTATACCTCTGACAGGATATATGGTACTGTAAACACTAGTTGTGAATAAGTCGCTGTGTATGTTTGTTTGAGATCTCTAAGAGAAAAGAGCGTTTATTAGAATAACGGATATTTAAAAGGGCGTGAAAAGGTTTATCCGTTCGTCCATTTGTATGTGGTCACCTATCTCGAGCATGCCAACCACAGGGTTCCCCTCGGGATCAAAGTACTTTGATCCAACCCCTCCGCTGCTATAGTGCAGTCGGCTTCTGACGTTCAGTGCAGCCGTCTTCTGAAAACGACATGTCGCACAAGTCCTAAGTTACGCGACAGGCTGCCGCCCTGCCCTTTTCCTGGCGTTTTCTTGTCGCGTGTTTTAGTCGCATAAAGTAGAATACTTGCGACTAGAACCGGAGACATTACGCCATGAACAAGAGCGCCGCCGCTGGCCTGCTGGGCTATGCCCGCGTCAGCACCGACGACCAGGACTTGACCAACCAACGGGCCGAACTGCACGCGGCCGGCTGCACCAAGCTGTTTTCCGAGAAGATCACCGGCACCAGGCGCGACCGCCCGGAGCTGGCCAGGATGCTTGACCACCTACGCCCTGGCGACGTTGTGACAGTGACCAGGCTAGACCGCCTGGCCCGCAGCACCCGCGACCTACTGGACATTGCCGAGCGCATCCAGGAGGCCGGCGCGGGCCTGCGTAGCCTGGCAGAGCCGTGGGCCGACACCACCACGCCGGCCGGCCGCATGGTGTTGACCGTGTTCGCCGGCATTGCCGAGTTCGAGCGTTCCCTAATCATCGACCGCACCCGGAGCGGGCGCGAGGCCGCCAAGGCCCGAGGCGTGAAGTTTGGCCCCCGCCCTACCCTCACCCCGGCACAGATCGCGCACGCCCGCGAGCTGATCGACCAGGAAGGCCGCACCGTGAAAGAGGCGGCTGCACTGCTTGGCGTGCATCGCTCGACCCTGTACCGCGCACTTGAGCGCAGCGAGGAAGTGACGCCCACCGAGGCCAGGCGGCGCGGTGCCTTCCGTGAGGACGCATTGACCGAGGCCGACGCCCTGGCGGCCGCCGAGAATGAACGCCAAGAGGAACAAGCATGAAACCGCACCAGGACGGCCAGGACGAACCGTTTTTCATTACCGAAGAGATCGAGGCGGAGATGATCGCGGCCGGGTACGTGTTCGAGCCGCCCGCGCACGTCTCAACCGTGCGGCTGCATGAAATCCTGGCCGGTTTGTCTGATGCCAAGCTGGCGGCCTGGCCGGCCAGCTTGGCCGCTGAAGAAACCGAGCGCCGCCGTCTAAAAAGGTGATGTGTATTTGAGTAAAACAGCTTGCGTCATGCGGTCGCTGCGTATATGATGCGATGAGTAAATAAACAAATACGCAAGGGGAACGCATGAAGGTTATCGCTGTACTTAACCAGAAAGGCGGGTCAGGCAAGACGACCATCGCAACCCATCTAGCCCGCGCCCTGCAACTCGCCGGGGCCGATGTTCTGTTAGTCGATTCCGATCCCCAGGGCAGTGCCCGCGATTGGGCGGCCGTGCGGGAAGATCAACCGCTAACCGTTGTCGGCATCGACCGCCCGACGATTGACCGCGACGTGAAGGCCATCGGCCGGCGCGACTTCGTAGTGATCGACGGAGCGCCCCAGGCGGCGGACTTGGCTGTGTCCGCGATCAAGGCAGCCGACTTCGTGCTGATTCCGGTGCAGCCAAGCCCTTACGACATATGGGCCACCGCCGACCTGGTGGAGCTGGTTAAGCAGCGCATTGAGGTCACGGATGGAAGGCTACAAGCGGCCTTTGTCGTGTCGCGGGCGATCAAAGGCACGCGCATCGGCGGTGAGGTTGCCGAGGCGCTGGCCGGGTACGAGCTGCCCATTCTTGAGTCCCGTATCACGCAGCGCGTGAGCTACCCAGGCACTGCCGCCGCCGGCACAACCGTTCTTGAATCAGAACCCGAGGGCGACGCTGCCCGCGAGGTCCAGGCGCTGGCCGCTGAAATTAAATCAAAACTCATTTGAGTTAATGAGGTAAAGAGAAAATGAGCAAAAGCACAAACACGCTAAGTGCCGGCCGTCCGAGCGCACGCAGCAGCAAGGCTGCAACGTTGGCCAGCCTGGCAGACACGCCAGCCATGAAGCGGGTCAACTTTCAGTTGCCGGCGGAGGATCACACCAAGCTGAAGATGTACGCGGTACGCCAAGGCAAGACCATTACCGAGCTGCTATCTGAATACATCGCGCAGCTACCAGAGTAAATGAGCAAATGAATAAATGAGTAGATGAATTTTAGCGGCTAAAGGAGGCGGCATGGAAAATCAAGAACAACCAGGCACCGACGCCGTGGAATGCCCCATGTGTGGAGGAACGGGCGGTTGGCCAGGCGTAAGCGGCTGGGTTGTCTGCCGGCCCTGCAATGGCACTGGAACCCCCAAGCCCGAGGAATCGGCGTGACGGTCGCAAACCATCCGGCCCGGTACAAATCGGCGCGGCGCTGGGTGATGACCTGGTGGAGAAGTTGAAGGCCGCGCAGGCCGCCCAGCGGCAACGCATCGAGGCAGAAGCACGCCCCGGTGAATCGTGGCAAGCGGCCGCTGATCGAATCCGCAAAGAATCCCGGCAACCGCCGGCAGCCGGTGCGCCGTCGATTAGGAAGCCGCCCAAGGGCGACGAGCAACCAGATTTTTTCGTTCCGATGCTCTATGACGTGGGCACCCGCGATAGTCGCAGCATCATGGACGTGGCCGTTTTCCGTCTGTCGAAGCGTGACCGACGAGCTGGCGAGGTGATCCGCTACGAGCTTCCAGACGGGCACGTAGAGGTTTCCGCAGGGCCGGCCGGCATGGCCAGTGTGTGGGATTACGACCTGGTACTGATGGCGGTTTCCCATCTAACCGAATCCATGAACCGATACCGGGAAGGGAAGGGAGACAAGCCCGGCCGCGTGTTCCGTCCACACGTTGCGGACGTACTCAAGTTCTGCCGGCGAGCCGATGGCGGAAAGCAGAAAGACGACCTGGTAGAAACCTGCATTCGGTTAAACACCACGCACGTTGCCATGCAGCGTACGAAGAAGGCCAAGAACGGCCGCCTGGTGACGGTATCCGAGGGTGAAGCCTTGATTAGCCGCTACAAGATCGTAAAGAGCGAAACCGGGCGGCCGGAGTACATCGAGATCGAGCTAGCTGATTGGATGTACCGCGAGATCACAGAAGGCAAGAACCCGGACGTGCTGACGGTTCACCCCGATTACTTTTTGATCGATCCCGGCATCGGCCGTTTTCTCTACCGCCTGGCACGCCGCGCCGCAGGCAAGGCAGAAGCCAGATGGTTGTTCAAGACGATCTACGAACGCAGTGGCAGCGCCGGAGAGTTCAAGAAGTTCTGTTTCACCGTGCGCAAGCTGATCGGGTCAAATGACCTGCCGGAGTACGATTTGAAGGAGGAGGCGGGGCAGGCTGGCCCGATCCTAGTCATGCGCTACCGCAACCTGATCGAGGGCGAAGCATCCGCCGGTTCCTAATGTACGGAGCAGATGCTAGGGCAAATTGCCCTAGCAGGGGAAAAAGGTCGAAAAGGTCTCTTTCCTGTGGATAGCACGTACATTGGGAACCCAAAGCCGTACATTGGGAACCGGAACCCGTACATTGGGAACCCAAAGCCGTACATTGGGAACCGGTCACACATGTAAGTGACTGATATAAAAGAGAAAAAAGGCGATTTTTCCGCCTAAAACTCTTTAAAACTTATTAAAACTCTTAAAACCCGCCTGGCCTGTGCATAACTGTCTGGCCAGCGCACAGCCGAAGAGCTGCAAAAAGCGCCTACCCTTCGGTCGCTGCGCTCCCTACGCCCCGCCGCTTCGCGTCGGCCTATCGCGGCCGCTGGCCGCTCAAAAATGGCTGGCCTACGGCCAGGCAATCTACCAGGGCGCGGACAAGCCGCGCCGTCGCCACTCGACCGCCGGCGCCCACATCAAGGCACCCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAA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SEQID5
ATGAGAAATTTATTCCCCATATTGATGCTAATCACCAATTTGGCACTCAACAACGATAACAACAACAACAACAACAACAACAATAATTATAATCTCATACACGCAACGTGTAGGGAGACCCCATATTACTCCCTATGTCTCACCACCCTACAATCCGGTCCACGTAGTAACGAGGTTGAGGGTGGTGATGCCATCACCACCCTAGGCCTCATCATGGTGGACGCGGTGAAATCAAAGTCCATAGAAATAATGGAAAAAATAAAAGAGCTAGAGAAATCGAACCCTGAGTGGCGGGCCCCACTTAGCCAGTGTTACGTGGCGTATAATGCCGTCCTACGAGCCGATGTAACGGTAGCCGTTGAAGCCTTAAAGAAGGGTGCCCCCAAATTTGCTGAAGATGGTATGGATGATGTTGTTGCTGAAGCACAAACTTGTGAGTATAGTTTTAATTATTATAATAAATTGGATTTTCCAATTTCTAATTTGAGTAGGGAAATAATTGAACTATCAAAAGTTGCTAAATCCATAATTAGAATGTTATTATGA
SEQID6
GAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAACAAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGGTAG
SEQID7
TTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAG
SEQID8
ACCTTATTTCACTACCACTTTCCACTCTCCAATCCCCATACTCTCTGCTCCAATCTTCATTTTGCTTCGTGAATTCATCTTCATCGAATTTCTCGACGCTTCTTCGCTAATTTCCTCGTTACTTCACTAAAAATCGACGTTTCTAGCTGAACTTGAGTGAATTAAGCCAGTGGGAGGAT
SEQID9
GTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCGAATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTTTTTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAG
SEQID10
GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCACCTTATTTCACTACCACTTTCCACTCTCCAATCCCCATACTCTCTGCTCCAATCTTCATTTTGCTTCGTGAATTCATCTTCATCGAATTTCTCGACGCTTCTTCGCTAATTTCCTCGTTACTTCACTAGAAATCGACGTTTCTAGCTGAACTTGAGTGAATTAAGCCAGTGGGAGGATGAATTCAAGGTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCGAATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTTTTTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGATGGATATCATCCTCCCACTGGCTTAATTCACTCAAGTTCAGCTAGAAACGTCGATTTCTAGTGAAGTAACGAGGAAATTAGCGAAGAAGCGTCGAGAAATTCGATGAAGATGAATTCACGAAGCAAAATGAAGATTGGAGCAGAGAGTATGGGGATTGGAGAGTGGAAAGTGGTAGTGAAATAAGGTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGA
SEQID11
GTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAG
SEQID12
GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCACCTTATTTCACTACCACTTTCCACTCTCCAATCCCCATACTCTCTGCTCCAATCTTCATTTTGCTTCGTGAATTCATCTTCATCGAATTTCTCGACGCTTCTTCGCTAATTTCCTCGTTACTTCACTAGAAATCGACGTTTCTAGCTGAACTTGAGTGAATTAAGCCAGTGGGAGGATGAATTCGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGATATCATCCTCCCACTGGCTTAATTCACTCAAGTTCAGCTAGAAACGTCGATTTCTAGTGAAGTAACGAGGAAATTAGCGAAGAAGCGTCGAGAAATTCGATGAAGATGAATTCACGAAGCAAAATGAAGATTGGAGCAGAGAGTATGGGGATTGGAGAGTGGAAAGTGGTAGTGAAATAAGGTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGA
SEQID13
GAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAACAAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGGTAGATTCCCCTTTTTGTAGACCACACATCAC
SEQID14
GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCTCATATTCTAGTTGTATGTTGTTCAGAGAAGACCACAGATGTGATCATATTCTCATTGTATCAGATCTGTGACCACTTACCTGATACCTCCCATGAAGTTACCTGTATGATTATACGTGATCCAAAGCCATCACATCATGTTCACCTTCAGCTATTGGAGGAGAAGTGAGAAGTAGGAATTGCAATATGAGGAATAATAAGAAAAACTTTGTAAAAGCTAAATTAGCTGGGTATGATATAGGGAGAAATGTGTAAACATTGTACTATATATAGTATATACACACGCATTATGTATTGCATTATGCACTGAATAATACCGCAGCATCAAAGAAGGAATTCAAGGTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCGAATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTTTTTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGATGGATATCCTTCTTTGATGCTGCGGTATTATTCAGTGCATAATGCAATACATAATGCGTGTGTATATACTATATATAGTACAATGTTTACACATTTCTCCCTATATCATACCCAGCTAATTTAGCTTTTACAAAGTTTTTCTTATTATTCCTCATATTGCAATTCCTACTTCTCACTTCTCCTCCAATAGCTGAAGGTGAACATGATGTGATGGCTTTGGATCACGTATAATCATACAGGTAACTTCATGGGAGGTATCAGGTAAGTGGTCACAGATCTGATACAATGAGAATATGATCACATCTGTGGTCTTCTCTGAACAACATACAACTAGAATATGAAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGA
SEQID15
GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCTCATATTCTAGTTGTATGTTGTTCAGAGAAGACCACAGATGTGATCATATTCTCATTGTATCAGATCTGTGACCACTTACCTGATACCTCCCATGAAGTTACCTGTATGATTATACGTGATCCAAAGCCATCACATCATGTTCACCTTCAGCTATTGGAGGAGAAGTGAGAAGTAGGAATTGCAATATGAGGAATAATAAGAAAAACTTTGTAAAAGCTAAATTAGCTGGGTATGATATAGGGAGAAATGTGTAAACATTGTACTATATATAGTATATACACACGCATTATGTATTGCATTATGCACTGAATAATACCGCAGCATCAAAGAAGGAATTCGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGATATCCTTCTTTGATGCTGCGGTATTATTCAGTGCATAATGCAATACATAATGCGTGTGTATATACTATATATAGTACAATGTTTACACATTTCTCCCTATATCATACCCAGCTAATTTAGCTTTTACAAAGTTTTTCTTATTATTCCTCATATTGCAATTCCTACTTCTCACTTCTCCTCCAATAGCTGAAGGTGAACATGATGTGATGGCTTTGGATCACGTATAATCATACAGGTAACTTCATGGGAGGTATCAGGTAAGTGGTCACAGATCTGATACAATGAGAATATGATCACATCTGTGGTCTTCTCTGAACAACATACAACTAGAATATGAAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGA
SEQID16
TCATATTCTAGTTGTATGTTGTTCAGAGAAGACCACAGATGTGATCATATTCTCATTGTATCAGATCTGTGACCACTTACCTGATACCTCCCATGAAGTTACCTGTATGATTATACGTGATCCAAAGCCATCACATCATGTTCACCTTCAGCTATTGGAGGAGAAGTGAGAAGTAGGAATTGCAATATTGAGGAATAATAAGAAAAACTTTGTAAAAGCTAAATTAGCTGGGTATGATATAGGGAGAAATGTGTAAACATTGTACTATATATAGTATATACACACGCATTATGTATTGCATTATGCACTGAATAATACCGCAGCATCAAAGAAG
SEQID17
GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCTCATATTCTAGTTGTATGTTGTTCAGAGAAGACCACAGATGTGATCATATTCTCATTGTATCAGATCTGTGACCACTTACCTGATACCTCCCATGAAGTTACCTGTATGATTATACGTGATCCAAAGCCATCACATCATGTTCACCTTCAGCTATTGGAGGAGAAGTGAGAAGTAGGAATTGCAATATGAGGAATAATAAGAAAAACTTTGTAAAAGCTAAATTAGCTGGGTATGATATAGGGAGAAATGTGTAAACATTGTACTATATATAGTATATACACACGCATTATGTATTGCATTATGCACTGAATAATACCGCAGCATCAAAGAAGGAATTCAAGGTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCGAATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTTTTTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGATGGATATCCTTCTTTGATGCTGCGGTATTATTCAGTGCATAATGCAATACATAATGCGTGTGTATATACTATATATAGTACAATGTTTACACATTTCTCCCTATATCATACCCAGCTAATTTAGCTTTTACAAAGTTTTTCTTATTATTCCTCATATTGCAATTCCTACTTCTCACTTCTCCTCCAATAGCTGAAGGTGAACATGATGTGATGGCTTTGGATCACGTATAATCATACAGGTAACTTCATGGGAGGTATCAGGTAAGTGGTCACAGATCTGATACAATGAGAATATGATCACATCTGTGGTCTTCTCTGAACAACATACAACTAGAATATGAAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGA
SEQID18
GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCTCATATTCTAGTTGTATGTTGTTCAGAGAAGACCACAGATGTGATCATATTCTCATTGTATCAGATCTGTGACCACTTACCTGATACCTCCCATGAAGTTACCTGTATGATTATACGTGATCCAAAGCCATCACATCATGTTCACCTTCAGCTATTGGAGGAGAAGTGAGAAGTAGGAATTGCAATATGAGGAATAATAAGAAAAACTTTGTAAAAGCTAAATTAGCTGGGTATGATATAGGGAGAAATGTGTAAACATTGTACTATATATAGTATATACACACGCATTATGTATTGCATTATGCACTGAATAATACCGCAGCATCAAAGAAGGAATTCGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGATATCCTTCTTTGATGCTGCGGTATTATTCAGTGCATAATGCAATACATAATGCGTGTGTATATACTATATATAGTACAATGTTTACACATTTCTCCCTATATCATACCCAGCTAATTTAGCTTTTACAAAGTTTTTCTTATTATTCCTCATATTGCAATTCCTACTTCTCACTTCTCCTCCAATAGCTGAAGGTGAACATGATGTGATGGCTTTGGATCACGTATAATCATACAGGTAACTTCATGGGAGGTATCAGGTAAGTGGTCACAGATCTGATACAATGAGAATATGATCACATCTGTGGTCTTCTCTGAACAACATACAACTAGAATATGAAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGAT GTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGA
SEQID19
GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAACAAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGGTAGATTCCCCTTTTTGTAGACCACACATCACGGATCCTCATATTCTAGTTGTATGTTGTTCAGAGAAGACCACAGATGTGATCATATTCTCATTGTATCAGATCTGTGACCACTTACCTGATACCTCCCATGAAGTTACCTGTATGATTATACGTGATCCAAAGCCATCACATCATGTTCACCTTCAGCTATTGGAGGAGAAGTGAGAAGTAGGAATTGCAATATGAGGAATAATAAGAAAAACTTTGTAAAAGCTAAATTAGCTGGGTATGATATAGGGAGAAATGTGTAAACATTGTACTATATATAGTATATACACACGCATTATGTATTGCATTATGCACTGAATAATACCGCAGCATCAAAGAAGGAATTCAAGGTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCGAATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTTTTTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGATGGATATCCTTCTTTGATGCTGCGGTATTATTCAGTGCATAATGCAATACATAATGCGTGTGTATATACTATATATAGTACAATGTTTACACATTTCTCCCTATATCATACCCAGCTAATTTAGCTTTTACAAAGTTTTTCTTATTATTCCTCATATTGCAATTCCTACTTCTCACTTCTCCTCCAATAGCTGAAGGTGAACATGATGTGATGGCTTTGGATCACGTATAATCATACAGGTAACTTCATGGGAGGTATCAGGTAAGTGGTCACAGATCTGATACAATGAGAATATGATCACATCTGTGGTCTTCTCTGAACAACATACAACTAGAATATGAAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGA
SEQID20
GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCTCATATTCTAGTTGTATGTTGTTCAGAGAAGACCACAGATGTGATCATATTCTCATTGTATCAGATCTGTGACCACTTACCTGATACCTCCCATGAAGTTACCTGTATGATTATACGTGATCCAAAGCCATCACATCATGTTCACCTTCAGCTATTGGAGGAGAAGTGAGAAGTAGGAATTGCAATATGAGGAATAATAAGAAAAACTTTGTAAAAGCTAAATTAGCTGGGTATGATATAGGGAGAAATGTGTAAACATTGTACTATATATAGTATATACACACGCATTATGTATTGCATTATGCACTGAATAATACCGCAGCATCAAAGAAGGAATTCGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGATATCCTTCTTTGATGCTGCGGTATTATTCAGTGCATAATGCAATACATAATGCGTGTGTATATACTATATATAGTACAATGTTTACACATTTCTCCCTATATCATACCCAGCTAATTTAGCTTTTACAAAGTTTTTCTTATTATTCCTCATATTGCAATTCCTACTTCTCACTTCTCCTCCAATAGCTGAAGGTGAACATGATGTGATGGCTTTGGATCACGTATAATCATACAGGTAACTTCATGGGAGGTATCAGGTAAGTGGTCACAGATCTGATACAATGAGAATATGATCACATCTGTGGTCTTCTCTGAACAACATACAACTAGAATATGAAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGA
SEQID21
TTAGAGTGTGGGTAAGTAATTAAGTTAGGGATTTGTGGGAAATGGACAAATATAAGAGAGTGCAGGGGAGTAGTGCAGGAGATTTTCGTGCTTTTATTGATAAATAAAAAAAGGGTGACATTTAATTTCCACAAGAGGACGCAACACAACACACTTAATTCCTGTGTGTGAATCAATAATTGACTTCTCCAATCTTCATCAATAAAATAATTCACAATCCTCACTCTCTTATCACTCTCATTCGAAAAGCTAGATTTGCATAGAGAGCACAAA
SEQID22
GAGGGGGAAGTGAATGAAAAATAACAAAGGCACAGTAAGTAGTTTCTCTTTTTATCATGTGATGAAGGTATATAATGTATGTGTAAGAGGATGATGTTATTACCACATAATAAGAGATGAAGAGTCTCATTTTCTGCTTAAAAAAACAATTCACTGGC
SEQID23
GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCGAGTGTGGGTAAGTAATTAAGTTAGGGATTTGTGGGAAATGGACAAATATAAGAGAGTGCAGGGGAGTAGTGCAGGAGATTTTCGTGCTTTTATTGATAAATAAAAAAAGGGTGACATTTAATTTCCACAAGAGGACGCAACACAACACACTTAATTCCTGTGTGTGAATCAATAATTGACTTCTCCAATCTTCATCAATAAAATAATTCACAATCCTCACTCTCTTATCACTCTCATTCGAAAAGCTAGATTTGCATAGAGAGCACAGAATTCAAGGTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCGAATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTTTTTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGATGGATATCTGTGCTCTCTATGCAAATCTAGCTTTTCGAATGAGAGTGATAAGAGAGTGAGGATTGTGAATTATTTTATTGATGAAGATTGGAGAAGTCAATTATTGATTCACACACAGGAATTAAGTGTGTTGTGTTGCGTCCTCTTGTGGAAATTAAATGTCACCCTTTTTTTATTTATCAATAAAAGCACGAAAATCTCCTGCACTACTCCCCTGCACTCTCTTATATTTGTCCATTTCCCACAAATCCCTAACTTAATTACTTACCCACACTCTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGA
SEQID24
GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCGAGTGTGGGTAAGTAATTAAGTTAGGGATTTGTGGGAAATGGACAAATATAAGAGAGTGCAGGGGAGTAGTGCAGGAGATTTTCGTGCTTTTATTGATAAATAAAAAAAGGGTGACATTTAATTTCCACAAGAGGACGCAACACAACACACTTAATTCCTGTGTGTGAATCAATAATTGACTTCTCCAATCTTCATCAATAAAATAATTCACAATCCTCACTCTCTTATCACTCTCATTCGAAAAGCTAGATTTGCATAGAGAGCACAGAATTCGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGATATCTGTGCTCTCTATGCAAATCTAGCTTTTCGAATGAGAGTGATAAGAGAGTGAGGATTGTGAATTATTTTATTGATGAAGATTGGAGAAGTCAATTATTGATTCACACACAGGAATTAAGTGTGTTGTGTTGCGTCCTCTTGTGGAAATTAAATGTCACCCTTTTTTTATTTATCAATAAAAGCACGAAAATCTCCTGCACTACTCCCCTGCACTCTCTTATATTTGTCCATTTCCCACAAATCCCTAACTTAATTACTTACCCACACTCTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGA
SEQID25
GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAACAAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGGTAGATTCCCCTTTTTGTAGACCACACATCACGGATCCGAGTGTGGGTAAGTAATTAAGTTAGGGATTTGTGGGAAATGGACAAATATAAGAGAGTGCAGGGGAGTAGTGCAGGAGATTTTCGTGCTTTTATTGATAAATAAAAAAAGGGTGACATTTAATTTCCACAAGAGGACGCAACACAACACACTTAATTCCTGTGTGTGAATCAATAATTGACTTCTCCAATCTTCATCAATAAAATAATTCACAATCCTCACTCTCTTATCACTCTCATTCGAAAAGCTAGATTTGCATAGAGAGCACAGAATTCAAGGTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCGAATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTTTTTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGATGGATATCTGTGCTCTCTATGCAAATCTAGCTTTTCGAATGAGAGTGATAAGAGAGTGAGGATTGTGAATTATTTTATTGATGAAGATTGGAGAAGTCAATTATTGATTCACACACAGGAATTAAGTGTGTTGTGTTGCGTCCTCTTGTGGAAATTAAATGTCACCCTTTTTTTATTTATCAATAAAAGCACGAAAATCTCCTGCACTACTCCCCTGCACTCTCTTATATTTGTCCATTTCCCACAAATCCCTAACTTAATTACTTACCCACACTCTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGA
SEQID26
GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAACAAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGGTAGATTCCCCTTTTTGTAGACCACACATCACGGATCCGAGTGTGGGTAAGTAATTAAGTTAGGGATTTGTGGGAAATGGACAAATATAAGAGAGTGCAGGGGAGTAGTGCAGGAGATTTTCGTGCTTTTATTGATAAATAAAAAAAGGGTGACATTTAATTTCCACAAGAGGACGCAACACAACACACTTAATTCCTGTGTGTGAATCAATAATTGACTTCTCCAATCTTCATCAATAAAATAATTCACAATCCTCACTCTCTTATCACTCTCATTCGAAAAGCTAGATTTGCATAGAGAGCACAGAATTCGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGATATCTGTGCTCTCTATGCAAATCTAGCTTTTCGAATGAGAGTGATAAGAGAGTGAGGATTGTGAATTATTTTATTGATGAAGATTGGAGAAGTCAATTATTGATTCACACACAGGAATTAAGTGTGTTGTGTTGCGTCCTCTTGTGGAAATTAAATGTCACCCTTTTTTTATTTATCAATAAAAGCACGAAAATCTCCTGCACTACTCCCCTGCACTCTCTTATATTTGTCCATTTCCCACAAATCCCTAACTTAATTACTTACCCACACTCTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGA
SEQID27
ATGGCAAGCTTGTGCAATAGTAGTAGTACATCTCTCAAAACTCCTTTTACTTCTTCCTCCACTTCTTTATCTTCCACTCCTAAGCCCTCTCAACTTTTCATCCATGGAAAACGTAACCAAATGTTCAAAGTTTCATGCAAGGTTATCAATAATAACGGTGACCAAAACGTTGAAACGAATTCTGTTGATCGAAGAAATGTTCTTCTTGGCTTAGGTGGTCTTTATGGTGTTGCTAATGCTATACCATTAGCTGCATCCGCTGCTCCAACTCCACCTCCTGATCTCTCGTCTTGTAGTATAGCCAGGATTAACGAAAATCAGGTGGTGCCGTACAGTTGTTGCGCGCCTAAGCCTGATGATATGGAGAAAGTTCCGTATTACAAGTTCCCTTCTATGACTAAGCTCCGTGTCCGTCAGCCTGCTCATGAAGCTAATGAGGAGTATATTGCCAAGTACAATCTGGCGATTAGTCGAATGAGAGATCTTGATAAGACACAACCTTTAAACCCTATTGGTTTTAAGCAACAAGCTAATATACATTGTGCTTATTGTAATGGTGCTTATAGAATTGGTGGCAAAGAGTTACAAGTTCATAATTCTTGGCTTTTCTTCCCGTTCCATAGATGGTACTTGTACTTCCACGAGAGAATCGTGGGAAAATTCATTGATGATCCAACTTTCGCTTTGCCATATTGGAATTGGGACCATCCAAAGGGTATGCGTTTTCCTGCCATGTATGATCGTGAAGGGACTTCCCTTTTCGATGTAACACGTGACCAAAGTCACCGAAATGGAGCAGTAATCGATCTTGGTTTTTTCGGCAATGAAGTCGAAACAACTCAACTCCAGTTGATGAGCAATAATTTAACACTAATGTACCGTCAAATGGTAACTAATGCTCCATGTCCTCGGATGTTCTTTGGTGGGCCTTATGATCTCGGGATTAACACTGAACTCCCGGGAACTATAGAAAACATTCCTCACGGTCCTGTCCACATCTGGTCTGGTACAGTGAGAGGTTCAACTTTGCCCAATGGTGCAATATCAAACGGTGAGAATATGGGTCATTTTTACTCAGCTGCTTTGGACCCGGTTTTCTTTTGCCATCACAGCAATGTGGATCGGATGTGGAGCGAATGGAAAGCGACAGGAGGGAAAAGAACAGATATCACACATAAAGGTTGGTTGAACTCCGAGTTCTTTTTCTATGATGAAAATGAAAACCCTTACCGTGTGAAAGTCCGAGACTGTTTGGACACGAAGAAGATGGGGTATGATTATGCACCAATGGCCACCCCGTGGCGTAACTTCAAGCCAATAACAAAAACTACAGCTGGGAAAGTGAATACAGCTTCTCTTCCGCCAGCTAGCAATGTATTCCCAGTGGCTAAACTCGACAAAGCAATTTCGTTTTCCATCAATAGGCCGACTTCGTCAAGGACTCAACAAGAGAAAAATGCACAAGAGGAGATGTTGACATTCAGTAGCATAAGATATGATAACAGAGGGTACATAAGGTTCGATGTGTTCCTGAACGTGGACAATAATGTGAATGCGAATGAGCTTGACAAGGCGGAGTTTGCGGGGAGTTATACTAGTTTGCCACATGTTCATAGAGCTGGTGAGACTAATCATATCGCGACTGTTGATTTCCAGCTGGCGATAACGGAACTGTTGGAGGATATTGGTTTGGAAGATGAAGATACTATTGCGGTGACTCTGGTGCCAAAGAGAGGTGGTGAAGGTATCTCCATTGAAAGTGCGACGATCAGTCTTGCAGATTGTTAA
SEQID28
ATGGCAAGCTTGTGCAATAGTAGTAGTACATCTCTCAAAACTCCTTTTACTTCTTCCTCCACTTCTTTATCTTCCACTCCTAAGCCCTCTCAACTTTTCATCCATGGAAAACGTAACCAAATGTTCAAAGTTTCATGCAAGGTTATCAATAATAACGGTGACCAAAACGTTGAAACGAATTCTGTTGATCGAAGAAATGTTCTTCTTGGCTTAGGTGGTCTTTATGGTGTTGCTAATGCTATACCATTAGCTGCATCCGCTGCTCCAACTCCACCTCCTGATCTCTCGTCTTGTAGTATAGCCAGGATTAACGAAAATCAGGTGGTGCCGTACAGTTGTTGCGCGCCTAAGCCTGATGATATGGAGAAAGTTCCGTATTACAAGTTCCCTTCTATGACTAAGCTCCGTGTCCGTCAGCCTGCTCATGAAGCTAATGAGGAGTATATTGCCAAGTACAATCTGGCGATTAGTCGAATGAGAGATCTTGATAAGACACAACCTTTAAACCCTATTGGTTTTAAGCAACAAGCTAATATACAGTGGGCTTATGGTAATGGTGCTTATAGAATTGGTGGCAAAGAGTTACAAGTTCATAATTCTTGGCTTTTCTTCCCGTTCCATAGATGGTACTTGTACTTCCACGAGAGAATCGTGGGAAAATTCATTGATGATCCAACTTTCGCTTTGCCATATTGGAATTGGGACCATCCAAAGGGTATGCGTTTTCCTGCCATGTATGATCGTGAAGGGACTTCCCTTTTCGATGTAACACGTGACCAAAGTCACCGAAATGGAGCAGTAATCGATCTTGGTTTTTTCGGCAATGAAGTCGAAACAACTCAACTCCAGTTGATGAGCAATAATTTAACACTAATGTACCGTCAAATGGTAACTAATGCTCCATGTCCTCGGATGTTCTTTGGTGGGCCTTATGATCTCGGGATTAACACTGAACTCCCGGGAACTATAGGAAACATTCCTCTCGGTCCTGTCCACATCTGGTCTGGTACAGTGAGAGGTTCAACTTTGCCCAATGGTGCAATATCAAACGGTGAGAATATGGGTCATTTTTACTCAGCTGCTTTGGACCCGGTTTTCTTTTGCCATCACAGCAATGTGGATCGGATGTGGAGCGAATGGAAAGCGACAGGAGGGAAAAGAACAGATATCACACATAAAGGTTGGTTGAACTCCGAGTTCTTTTTCTATGATGAAAATGAAAACCCTTACCGTGTGAAAGTCCGAGACTGTTTGGACACGAAGAAGATGGGGTATGATTATGCACCAATGGCCACCCCGTGGCGTAACTTCAAGCCAATAACAAAAACTACAGCTGGGAAAGTGAATACAGCTTCTCTTCCGCCAGCTAGCAATGTATTCCCAGTGGCTAAACTCGACAAAGCAATTTCGTTTTCCATCAATAGGCCGACTTCGTCAAGGACTCAACAAGAGAAAAATGCACAAGAGGAGATGTTGACATTCAGTAGCATAAGATATGATAACAGAGGGTACATAAGGTTCGATGTGTTCCTGAACGTGGACAATAATGTGAATGCGAATGAGCTTGACAAGGCGGAGTTTGCGGGGAGTTATACTAGTTTGCCACATGTTCATAGAGCTGGTGAGACTAATCATATCGCGACTGTTGATTTCCAGCTGGCGATAACGGAACTGTTGGAGGATATTGGTTTGGAAGATGAAGATACTATTGCGGTGACTCTGGTGCCAAAGAGAGGTGGTGAAGGTATCTCCATTGAAAGTGCGACGATCAGTCTTGCAGATTGTTAA
SEQID29
TTAGTCTCTATTGAATCTGCTGAGATTACACTTTGATGGATGATGCTCTGTTTTTGTTTTCTTGTTCTGTTTTTTCCTCTGTTGAAATCAGCTTTGTTGCTTGATTTCATTGAAGTTGTTATTCAAGAATAAATCAGTTACAATTATGTTTGGG
SEQID 30
GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCTTAGTCTCTATTGAATCTGCTGAGATTACACTTTGATGGATGATGCTCTGTTTTTGTTTTCTTGTTCTGTTTTTTCCTCTGTTGAAATCAGCTTTGTTGCTTGATTTCATTGAAGTTGTTATTCAAGAATAAATCAGTTACAATTATGGAATTCAAGGTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCGAATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTTTTTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGATGGATATCCTTCTTTGATGCTGATCCATAATTGTAACTGATTTATTCTTGAATAACAACTTCAATGAAATCAAGCAACAAAGCTGATTTCAACAGAGGAAAAAACAGAACAAGAAAACAAAAACAGAGCATCATCCATCAAAGTGTAATCTCAGCAGATTCAATAGAGACTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGA
SEQID31
GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCTTAGTCTCTATTGAATCTGCTGAGATTACACTTTGATGGATGATGCTCTGTTTTTGTTTTCTTGTTCTGTTTTTTCCTCTGTTGAAATCAGCTTTGTTGCTTGATTTCATTGAAGTTGTTATTCAAGAATAAATCAGTTACAATTATGGAATTCGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGATATCCTTCTTTGATGCTGATCCATAATTGTAACTGATTTATTCTTGAATAACAACTTCAATGAAATCAAGCAACAAAGCTGATTTCAACAGAGGAAACAGAACAAGAAAACAAAAACAGAGCATCATCCATCAAAGTGTAATCTCAGCAGATTCAATAGAGACTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGA
SEQID32
GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAACAAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGGTAGATTCCCCTTTTTGTAGACCACACATCACGGATCCTTAGTCTCTATTGAATCTGCTGAGATTACACTTTGATGGATGATGCTCTGTTTTTGTTTTCTTGTTCTGTTTTTTCCTCTGTTGAAATCAGCTTTGTTGCTTGATTTCATTGAAGTTGTTATTCAAGAATAAATCAGTTACAATTATGGAATTCAAGGTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCGAATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTTTTTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGATGGATATCCTTCTTTGATGCTGATCCATAATTGTAACTGATTTATTCTTGAATAACAACTTCAATGAAATCAAGCAACAAAGCTGATTTCAACAGAGGAAAAAACAGAACAAGAAAACAAAAACAGAGCATCATCCATCAAAGTGTAATCTCAGCAGATTCAATAGAGACTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGA
SEQID33
GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAACAAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGGTAGATTCCCCTTTTTGTAGACCACACATCACGGATCCTTAGTCTCTATTGAATCTGCTGAGATTACACTTTGATGGATGATGCTCTGTTTTTGTTTTCTTGTTCTGTTTTTTCCTCTGTTGAAATCAGCTTTGTTGCTTGATTTCATTGAAGTTGTTATTCAAGAATAAATCAGTTACAATTATGGAATTCGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGATATCCTTCTTTGATGCTGATCCATAATTGTAACTGATTTATTCTTGAATAACAACTTCAATGAAATCAAGCAACAAAGCTGATTTCAACAGAGGAAAAAACAGAACAAGAAAACAAAAACAGAGCATCATCCATCAAAGTGTAATCTCAGCAGATTCAATAGAGACTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGA
SEQID34
GTCCATGATGTCTTCAGGGTGGTAGCATTGACTGATGGCATCATAGTTTTTTTTTTAAAAGTATTTCCTCTATGCATATTATTAGTATCCAATAAATTTACTGGTTGTTGTACATAGAAAAAGTGCATTTGCATGTATGTGTTTCTCTGAAATTTTCCCCAGTTTTTGGTGCTTTGCCTTTGGAGCCAAGTCTCTATATGTATAAGAAAACTAAGAACAATCACATATATCAAATATTAG
SEQID35
ACGAACTTGTGATCGCGTTGAAAGATTTGAACGCTACATAGAGCTTCTTGACGTATCTGGCAATATTGCATCAGTCTTGGCGGAATTTCATGTGACAACAAGGTTTGCAATTCTTTCCACTATTAGTAGTGCAACGATATACGCAGAGATGAAGTGCTGAACAAACATATGTAAAATCGATGAATTTATGTCGAATGCTGGGACGGGCTTCAGCAGGTTTTGCTTAGT
SEQID36
CCGCGGTTTTCTCTCCATCGCGTCAGAGGCCGGTTTTCGTCGGCATCGAAGAGGGCCACTCGTTTACCGTCATTTGCCAAAGCAGCGCAAAGGCCCATGAGTGCGGTGGTTTTGCCAGCACCCCCTTTGAAAGAGCAAAACGTCAAAAGTTGCATATTCTGATCCCGCCTGTCCTGTGAAACGGAGTGCATTTGTATTTTTGTTCGTATAAATGTTTTTGTGATTATCGATGAGTAAAAGCGTTGTTACACTATTTTTTATTTCAAATTCGTTATAATTAAATTGCAATTGTAGCAATTATATTCGGTTTTTCCTGTAAATATACTGTTGATTTCATATCGAGTAGGGCTAGACTTTAATCTGTCTACCCGGGCACATTTCGTGCTGGAGTATTCAGACCTTCCGCTTTTTTTGGAGGAAGCTATGTCAAAACACACCAGAGTCACGTCGAGTGAGACTGCCATCAACCAGCATCGATCCCTGAACGTTGAAGGGTTTAAGGTCGTGAGTGCCCGTCTGCGATCGGCCGAGTATGAAACCTTTTCCTATCAAGCGCGCCTGCTGGGACTTTCGGATAGTATGGCAATTCGCGTTGCGGTGCGTCGCATCGGGGGCTTTCTCGAAATAGATGCACACACCCGAGAAAAGATGGAAGCCATACTTCAGTCCATCGGAATACTCTCAAGTAATGTATCCATGCTTCTATCTGCCTACGCCGAAGACCCTCGATCGGATCTGGAGGCTGTGCGAGATGAACGTATTGCTTTTGGTGAGGCTTTCGCCGCCCTCGATGGCCTACTCCGCTCCATTTTGTCCGTATCCCGGCGACGGATCGACGGTTGCTCGCTATTGAAAGGTGCCTTGTAGCACTTGACCACGCACCTGACGGGAGAAAATTGGATGCCCGATCGCGCTCAAGTAATCATTCGCATTGTGCCAGGAGGTGGAACCAAGACCCTTCAGCAGATAATCAATCAGTTGGAGTACCTGTCCCGTAAGGGAAAGCTGGAACTGCAGCGTTCAGCCCGGCATCTCGATATTCCCGTTCCGCCGGATCAAATCCGTGAGCTTGCCCAAAGCTGGGTTACGGAGGCCGGGATTTATGACGAAAGTCAGTCAGACGATGATAGGCAACAAGACTTAACAACACACATTATTGTAAGCTTCCCCGCAGGTACCGACCAAACCGCAGCTTATGAAGCCAGCCGGGAATGGGCAGCCGAGATGTTTGGGTCAGGATACGGGGGTGGCCGCTATAACTATCTGACAGCCTACCACGTCGACCGCGATCATCCACATTTACATGTCGTGGTCAATCGTCGGGAACTTCTGGGGCACGGGTGGCTGAAAATATCCAGGCGCCATCCCCAGCTGAATTATGACGGCTTACGGAAAAAGATGGCAGAGATTTCACTTCGTCACGGCATAGTCCTGGATGCGACTTCGCGAGCAGAAAGGGGAATAGCAGAGCGACCAATCACATATGCTGAACATCGCCGCCTTGAGCGGATGCAGGCTCAAAAGATTCAATTCGAAGATACAGATTTTGATGAGACCTCGCCTGAGGAAGATCGTCGGGACCTCAGTCAATCGTTCGATCCATTTCGATCGGACCCATCTACCGGCGAACCGGACCGTGCAACCCGACATGACAAACAACCGCTTGAACAGCACGCCCGTTTCCAGGAGTCCGCCGGCTCCAGCATCAAAGCCGACGCACGGATCCGCGTATCATTGGAGAGCGAGCGGAGTGCCCAACCATCCGCGTCCAAAATCCCTGTAATTGGGCATTTCGGGATTGAGACTTCCTATGTCGCTGAAGCCAGCGTGCGCAAACGAAGCGGCATTTTCGGTACTTCTCGCCCGGTGACTGACGTTGCCATGCACACAGTCAAGCGCCAGCAGCGATCAAAACGACGTAATGACGAGGAGGCAGGTCCGAGCGGAGCAAACCGTAAAGGATTGAAGGCTGCGCAAGTTGATTCCGAGGCAAATGTCGGTGAGCAAGACACTCGCGATGACAGCAACAAGGCGGCTGATCCGGTGTCTGCTTCCATCGGTACCGAGCAACCGGAAGCTTCTCCAAAGCGTCCGCGTGACCGTCACGATGGAGAATTGGGTGGACGCAAACGTGCAAGAGGTAATCGTCGCTCGAGCTCGAGCGGGGGGACCTAGAGACAGGAAGGACCGAATAATGGCCGCGG
SEQID37
ATGGCTTCTGTGCTGGCTTCTCTGTTTCCAAAACTGGGCTCTTTGGGTACTTCAGATCATGCTTCTGTTGTATCCATCAACCTCTTTGTGGCACTCCTTTGTGCTTGCATCATCATTGGTCATCTCTTGGAGGAGAACCGCTGGGTTAATGAGTCCATTACTGCCCTCATAATTGGTTTGTGTACAGGAGTGGTTATCTTGCTCGTAAGTGGTGGAAAGAGCTCACACCTTCTGGTTTTCAGTGAAGATCTCTTTTTCATATATGTACTTCCTCCAATCATATTTAATGCAGGGTTTCAGGTAAAAAAGAAGCAATTTTTCGTAAACTTCATTACTATAATGATGTTCGGAGCCATTGGTACCCTGGTCTCATGTGCCATTATATCATTAGGTGCCATTCAAACTTTCAAGAAGTTGGACATTGAATTTCTAGATATTGGGGATTATCTTGCAATTGGAGCAATATTTGCTGCCACAGATTCCGTCTGCACATTGCAGGTCCTACATCAGGATGAGACACCCCTCCTTTACAGTCTTGTATTTGGAGAAGGAGTTGTAAATGATGCTACATCGGTGGTGCTTTTCAATGCTATTCAAAACTTCGACCTTACGAGCATGAATCCCAGTATAGCCCTCAGTTTCCTTGGCAACTTCTTCTATCTGTTCCTTGCTAGCACTTTACTGGGAGCAGGAACTGGTCTTCTTAGTGCTTACATTATCAAGAAGCTATATTTTGGCAGGCACTCCACAGATCGTGAGGTTGCCCTTATGATGCTCATGGCTTACTTATCATACTTGCTGGCCGAATTATTCTATTTGAGTGGGATTCTCACCGTCTTTTTCTGTGGTATTGTAATGTCTCACTACACTTGGCACAATGTGACCGAGAGTTCAAGAGTCACTACAAGGCACACTTTTGCAACTTTGTCATTTCTTGCAGAGACTTTCCTCTTCCTCTATGTCGGCATGGATGCTTTGGATATCGAGAAGTGGAAATTTGTTGGTGACAGGCCTGGATTATCAATTTCCGTGAGTTCAATACTGATGGGACTAATCTTGCTTGGGAGAGCTGCCTTTGTTTTTCCATTATCATTCTTATCCAACTTAATGAAGAAATCCTCGGAGCAAAAAATTACCTTTAGGCAGCAAGTGATAATATGGTGGGCAGGTTTGATGAGAGGCGCAGTGTCCATGGCACTGGCATATAATAAGTTCACTCGTGGGGGACACACTCAACTGCAGGACAATGCAATAATGATTACCAGCACGATAACCATTGTTCTATTCAGCACAATGGTATTCGGTTTAATGACAAAACCCCTTATAAGTCTCCTGCTGCCACCACAGAGGCAATTGAGTACAGTGTCATCAGGCGCAAATACTCCAAAGTCTCTAACAGCCCCACTCCTAGGCAGTCGAGAGGACTCTGAAGTTGATTTAAATGTTCCAGATCTTCCTCACCCACCAAGTTTGAGGATGCTACTTACCGCACCAAGTCATAAAGTGCATCGGTACTGGCGCAAGTTTGACGATGCATTCATGCGCCCTATGTTTGGTGGTCGGGGATTTGCTCCTCCTGCCCCTGGTTCTCCAACGGAACAGGGTCCATGAGGTACCAATC
SEQID38
ATGGCTTCTGTGCTGGCTTCTCTGTTTCCAAAACTGGGCTCTTTGGGTACTTCAGATCATGCTTCTGTTGTATCCATCAACCTCTTTGTGGCACTCCTTTGTGCTTGCATCATCATTGGTCATCTCTTGGAGGAGAACCGCTGGGTTAATGAGTCCATTACTGCCCTCATAATTGGTTTGTGTACAGGAGTGGTTATCTTGCTCGTAAGTGGTGGAAAGAACTCACACCTTCTGGTTTTCAGTGAAGATCTCTTTTTCATATATGTACTTCCTCCAATCATATTTAATGCAGGGTTTCAGGTAAAAAAGAAGCAATTTTTCGTGAACTTCATTACTATAATGATGTTCGGAGCCATTGGTACCCTGGTCTCATGTGCCATTATATCATTAGGTGCAATTCAAACTTTCAAGAAGTTGGACATTGAATTTCTAGATATTGGGGATTATCTTGCAATTGGAGCAATATTTGCTGCCACAGATTCCGTCTGCACATTGCAGGTCCTACATCAGGATGAGACACCCCTCCTTTACAGTCTTGTATTTGGAGAAGGAGTTGTAAATGATGCTACATCGGTGGTGCTTTTCAATGCTATTCAAAACTTTGACCTTACGAGCGTGAATCCCAGTATAGCCCTCAGTTTCCTTGGCAACTTCTTCTATCTGTTCCTTGCTAGCACTTTACTGGGAGCAGGAACTGGTCTTCTTAGTGCTTACATTATCAAGAAGCTGTATTTTGGCAGGCACTCCACAGATCGTGAGGTTGCCCTTATGATGCTCATGGCTTACTTATCATACATGCTGGCTGAACTATTCTATTTGAGTGGGATTCTCACTGTATTTTTCTGTGGTATTGTAATGTCTCATTACACTTGGCACAATGTGACCGAGAGTTCAAGAGTCACTACAAGGCACGCTTTTGCAACTTTGTCATTTCTTGCAGAGACTTTCCTCTTCCTCTATGTCGGCATGGATGCTTTGGATATCGAGAAGTGGAAATTTGTTGGTGACAGGCCTGGATTATCAATTTCCGTGAGTTCAATACTGATGGGATTAATCTTGCTGGGGAGAGCTGCCTTTGTTTTTCCATTATCATTCTTCTCCAACTTAATGAAGAAATCCTCGGAGCAAAAAATTACCTTTAGGCAGCAAGTGATAATATGGTGGGCAGGTTTGATGAGAGGCGCAGTGTCCATGGCACTGGCATATAATAAGTTCACTCGTGGGGGACACACTCAACTGCAGGACAATGCAATAATGATTACCAGCACGATAACCATTGTTCTATTCAGCACAATGGTATTCGGTTTAATGACAAAACCCCTTATAAGTCTCCTGCTGCCACCACAGAGGCAATTGAGTACAGTGTCATCAGGTGCAAATACTCCAAAGTCTCTAACAGCCCCACTCCTAGGCAGTCGAGAGGACTCTGAAGTTGATTTAAATGTTCCAGATCTTCCTCACCCACCAAGTTTGAGGATGCTACTTACCGCACCAAGTCATAAAGTGCATCGGTACTGGCGCAAGTTTGACGATGCATTCATGCGCCCTATGTTTGGTGGTCGGGGATTTGCTCCTCCTGCCCCTGGTTCTCCAACGGAACAGGGTCCATGAGGTACAATC
SEQID39
ATGGAAAATTCGGTACCCAGGACTGTAGAAGAAGTATTCAACGATTTCAAAGGTCGTAGAGCTGGTTTAATCAAAGCACTAACTACAGATGTCGAGAAGTTTTATCAATCGTGTGATCCTGAAAAGGAGAACTTGTGTCTCTATGGGCTTCCTAATGAAACATGGGAAGTAAACCTCCCTGTAGAGGAGGTGCCTCCAGAACTTCCGGAGCCAGCATTGGGCATAAACTTCGCACGTGATGGAATGCAAGAGAAAGACTGGTTATCACTTGTTGCTGTTCACAGTGATTCATGGCTGCTTTCTGTTGCATTTTACTTTGGTGCAAGGTTTGGGTTCGGCAAGAGTGAAAGGAAGAGGCTTTTCCAAATGATAAATGATCTCCCAACAGTGTTTGAAGTTGTTACCGGAGCTGCTAAACAGACACGTGATCCCCCTCACAACAATAGCAACAAAAGCAAATCAAGTGGAAAGCCTCGACAGCCAGAGTCCCAACTCAAGGCAGTAAAGGTGTCTCCACCTAAAATGGAGAACGACAGTGGGGAGGAGGAAGAAGAAGAAGAGGATGAACAAGGAGCAACTCTCTGTGGAGCTTGTGGTGATAATTATGCCACTGATGAATTCTGGATTTGCTGTGATATTTGTGAGAGATGGTTCCATGGCAAATGTGTGAAGATTACCCCAGCAAAAGCTGAGCATATCAAGCAGTACAAGTGTCCTAGTTGCAGTAGCAAGAGAGCTAGAGTTTAA
SEQID40
TGACATCTGCCAATAAAGCCAAGAATAATTGGCATTAACATGACCAAAAAAATGGTTTGGCAGCATTAAGTCAAATAAAAAAGCTACTTTAATATAAAATAATATTAAAATGCTTAATAACCAACAGTTTATAAGAAGGTTAATGTTAACATGGATGAGGAATGACCAAAAGGGGAATTATATATTAACCTTTAAATCAATCTAATTCTCTCTTTTTGTTTCTAGCTATATTTACTCGATAGATAAACTCTCTTACTTGACGAATTTTTTGATACAAGAAGACATATTTCATCATGATTTTAATTCGTCGTGTCAAATTTATTAAATAGTTTAATTTTAATCGTAAATTTAGATATGAAATTTAAAAAAAAATAAATATATACATATTTGAAGAATACATAAAAAGTACATATAAATCACAAATATTTAATAATTCAAGATATTAAAACACATAGAAAAATAATTACTTACAAAGAAATTCTTATTTGAATCCTCTAAATTCGAGAAGTGCAACACAAACTGAGACGAAGAAAATGAATAATATTTGATAAGAAATTTATTATAATTGAATGACCATTTAAGTAATTACGGGTAATAACAACACAATAAGGAACTGTAGTCATTTTTAATACATGGCAAGGAATATGAGAGTGTGATGAGTCTATAAATAGAAGGCTTCATTAGTGTAGAGGAGTCACAAACAAGCAATACACAAATAAAATTAGTAGCTTAAACAAGATG
SEQID56
TTCTTCGCCAGAGGTTTGGTCAAGTCTCCAATCAAGGTTGTCGGCTTGTCTACCTTGCCAGAAATTTACGAAAAGATGGAAAAGGGTCAAATCGTTGGTAGATACGTTGTTGACACTTCTAAATAAGCGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTATTATTAAATAAGTTATAAAAAAAATAAGTGTATACAAATTTTAAAGTGACTCTTAGGTTTTAAAACGAAAATTCTTATTCTTGAGTAACTCTTTCCTGTAGGTCAGGTTGCTTTCTCAGGTATAGCATGAGGTCGCTC
SEQID 94
TGGCAGGATATATGAGTGTGTAAAC
SEQID 95
TTGGCAGGATATATCCCTCTGTAAAC
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Claims (10)

1.修饰所选植物特性的方法，包括：
a.用期望的多核苷酸稳定地转化所选植物的细胞，其中所述的期望的多核苷酸基本上由所选植物、相同种植物或与所选植物性互交可孕的植物的天然核酸序列构成，
b.从所述转化的植物细胞中获得稳定转化的植物，其中所述的转化植物含有稳定地整合到基因组中的所述的期望的多核苷酸，其中所述的期望的多核苷酸修饰所述的特性。
2.根据权利要求1的方法，进一步包括用在所述的植物细胞中短暂表达的选择性标记基因共转染所述的植物细胞，鉴定转化的植物细胞，从所述的转化的植物细胞中获得转化植物，其中不稳定地整合所述的选择性标记基因，并且将所述的期望的多核苷酸稳定地整合到基因组中。
3.权利要求1的方法，其中所述的植物是单子叶植物。
4.权利要求3的方法，其中所述的单子叶植物从由小麦、草皮、草坪草、谷类植物、玉米、水稻、燕麦、小麦、大麦、高梁、兰花、蝴蝶花、百合、洋葱、香蕉、甘蔗、高梁、以及棕榈构成的组中选择。
5.权利要求1的方法，其中所述的植物是双子叶植物。
6.权利要求5的方法，其中所述的双子叶植物从由马铃薯、烟草、番茄、甜菜、花茎甘蓝、木薯、甘薯、胡椒、棉花、一品红、豆科植物、苜蓿、大豆、胡萝卜、草莓、莴苣、橡树、枫树、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雏菊、以及仙人掌构成的组中选择。
7.权利要求1的方法，其中所述的特性从由提高的健康和营养特性、改善的贮藏性、提高的产量、增强的耐盐性、增强的对重金属的耐受性、提高的对干旱的耐受性、提高的对疾病的耐受性、提高的对昆虫的耐受性、提高的对水应力的耐受性、增强的对冷和霜冻的耐受性、增加的颜色、增加的甜味、提高的活力、改善的口味、改善的结构、降低的磷酸盐含量、提高的发芽率、提高的微营养摄入、改善的淀粉组成、提高的花的寿命构成的组中选择。
8.根据权利要求1的方法，其中所述的期望的多核苷酸包括P－DNA、GBSS启动子、Ubi7启动子、Ubi3启动子、PIP启动子、修饰的PPO基因、转化酶抑制剂基因、耐盐性基因、与R1相关的前导序列、与磷酸化酶相关的前导序列、与R1相关的尾随序列、与SBE相关的尾随序列、Ubi内含子、GBSS间隔区、UbiT。
9.权利要求1的方法，其中通过土壤杆菌介导的转化来转化所述的植物细胞。
10.权利要求9的方法，其中土壤杆菌介导的转化依赖于使用至少一个双载体。
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