ES2602133T3 - Reproducción precisa - Google Patents

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ES2602133T3
ES2602133T3 ES10008266.8T ES10008266T ES2602133T3 ES 2602133 T3 ES2602133 T3 ES 2602133T3 ES 10008266 T ES10008266 T ES 10008266T ES 2602133 T3 ES2602133 T3 ES 2602133T3
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ES
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dna
plant
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ES10008266.8T
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Caius M. T. Rommens
Jingsong Ye
Hua Yan
Kathleen M. Swords
Jaime Menendez-Humara
W. Leigh Brinkerhoff
Craig Richael
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JR Simplot Co
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JR Simplot Co
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Abstract

Un método de reducción de la acumulación de acrilamida producida por la reacción de Maillard durante la fritura, que comprende transformar en un genoma de vegetal de cultivo un casete de expresión que comprende una secuencia que, tras la expresión, (a) silencia un gen R1 endógeno, (b) silenciar un gen de fosforilasa de tipo L endógeno, y/o (c) sobreexpresar un gen inhibidor de invertasa.

Description

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DESCRIPCIÓN
Reproducción precisa
Campo de la invención
La presente descripción se relaciona con métodos para mejorar las características nutricionales, de salud y agronómicas de una planta mediante modificación específica, de ADN bien caracterizado en el genoma de la planta. A diferencia de una reproducción de planta clásica, el proceso no incluye genes tóxicos desconocidos o potenciales en la composición genética la planta. Adicionalmente, el método, a diferencia de estrategias de ingeniería genética convencionales, no incorpora ácidos nucleicos de especies foráneas, es decir, especies que no son interfértiles con la planta para ser modificadas mediante ingeniería genética, en el genoma de la planta. Las plantas desarrolladas a través de este proceso de reproducción de planta muestran características agronómicas mejoradas. Las plantas preferidas particularmente incluyen patatas que exhiben mejoras en salud y características de almacenamiento de tubérculo, y céspedes que exhiben mejoras en la tolerancia a enfermedades y sequías.
Antecedentes
El desempeño agronómico de plantas ha sido mejorado típicamente ya sea por reproducción de planta clásica o ingeniería genética. La reproducción clásica típicamente resulta en la transferencia de ácidos nucleicos desconocidos de una planta a otra. Las técnicas de ingeniería genética introducen ácidos nucleicos foráneos en el genoma la planta, es decir, ADN que no es de una planta que es infértil naturalmente con la planta que va a ser modificadas mediante ingeniería genética. Por ejemplo, la ingeniería genética introduce ácidos nucleicos no vegetales en un genoma de planta. Tanto las estrategias de reproducción clásica como de ingeniería genética crean genomas de planta que contienen material genético no deseado e innecesario, y las plantas cruzadas o transgénicas resultantes pueden exhibir rasgos no favorables. Las insuficiencias de ambas estrategias pueden resultar perjudiciales para las plantas transgénicas, así como para los animales y humanos que consumen tales productos.
La reproducción convencional se basa en la transferencia de ADN desconocido
La reproducción de planta típicamente se basa en la recombinación aleatoria de cromosomas de planta para crear variedades que tienen características nuevas y mejoradas. De esta forma, mediante cribado de poblaciones grandes de progenie que resultan de cruces de plantas, los reproductores pueden identificar aquellas plantas que muestran un rasgo deseado, tal como un aumento del rendimiento, vigor mejorado, mayor resistencia a las enfermedades e insectos, o mayor capacidad de sobrevivir en condiciones de sequía. Sin embargo, los métodos de reproducción clásica son laboriosos y consumen mucho tiempo, y nuevas variedades típicamente muestran únicamente mejoras modestas relativamente.
Adicionalmente, la reproducción de planta clásica típicamente resulta en la transferencia de cientos de genes desconocidos en un genoma de planta. Es probable que algunos de estos genes transferidos codifiquen alérgenos potencialmente dañinos, tal como patatina, lectinas, quitinasas, proteasas, proteínas como taumatina, proteínas de transferencia de lípidos, amilasas, inhibidores de tripsina, y proteínas de almacenamiento de semillas (Breiteneder et al., J Allergy Clin Immunol 106: 27-36).
Similarmente, la introgresión de genes puede estar implicada en la biosíntesis de toxinas que incluye latirógenos, hidrazinas, glucosinolatos y goitrógenos, cumarinas, saponinas, alcaloides, glicoalcaloides, aminas biogénicas, inhibidores de enzimas, tales como lectinas (hemaglutininas), inhibidores de tripsina, sustancias quelantes tales como fitatos y oxalatos, ribotoxinas, péptidos antimicrobianos, aminoácidos tales como beta-N-oxalilamino-L-alanina, atractilosida, oleandrina, taxol, e isoquinolina (Pokorny, Cas Lek Cesk 136: 267-70, 1997). El riesgo de introducir inadvertidamente tales tóxicos en el suministro de alimentos humanos y animales se incrementa adicionalmente a través de esfuerzos por "enderezar" la diversidad genética de cultivos silvestres emparentados que no han sido usados antes para el consumo de alimentos (Hoisington et al., Proc Natl Acad Sci U S A 96: 5937-43, 1999).
Aunque la reproducción de planta clásica puede introducir fácilmente genes implicados en compuestos antinutricionales no deseados en cultivos de alimentos y plantas, no se puede eliminar fácilmente. Por ejemplo, tomo aproximadamente 15 años reducir niveles de fitato dañinos en maíz y arroz mediante la inactivación de genes Lpa (Raboy, J Nutr 132: 503S-505S, 2002). El largo marco de tiempo para la realización de resultados positivos no es práctico, especialmente ya que existe una necesidad urgente de métodos que mejoren más efectivamente y eficientemente la calidad de los cultivos de alimentos. Por ejemplo un gen que sólo recientemente se ha encontrado que se asocia con la síntesis de compuestos antinutricionales es el gen de oxidasa de polifenol (PPO), que oxida ciertos compuestos fenólicos para producir agentes mutagénicos, carcinogénicos y citotóxicos como radicales de fenoxilo y derivados quinoides (Kagan et al., Biochemistry 33: 9651-60, 1994). La presencia de múltiples copias de este gen en el genoma de plantas tales como patatas hace particularmente difícil reducir la actividad de PPO a través de reproducción.
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Se necesita aún más tiempo para la eliminación de compuestos antinutricionales si se conoce poco o nada acerca de sus bases genéticas. Por ejemplo, no se han vinculado genes a la acumulación de altas concentraciones de acrilamida, una neurotoxina potente y mutagen, en algunas patatas que son calentadas a 160°C o más alto (Tareke et al., J Agric Food Chem. 50: 4998-5006, 2002). Es por lo tanto muy difícil desarrollar eficientemente nuevas variedades de patatas que producen menos acrilamida durante el procesamiento usando reproducción convencional. Así, existe una necesidad de cultivar patatas y otros alimentos ricos en carbohidratos, tales como trigo con niveles reducidos de tales compuestos dañinos, pero sin el uso de ácidos nucleicos desconocidos o foráneos.
Otros compuestos antinutricionales que pueden acumularse durante el procesamiento y son difíciles de minimizar o eliminar a través de la reproducción incluyen los productos de la reacción de Maillard N-Nitroso-N-(3-ceto-1,2butanediol)-3’-nitrotiramina (Wang et al., Arch Toxicol 70: 10-5, 1995), y 5-hidroximetil-2-furfural (Janzowski et al., Food Chem Toxicol 38: 801-9, 2000). Los productos de reacción Maillard adicionales que no han sido bien caracterizados son también conocidos para mostrar propiedades mutagénicas (Shibamoto, Prog Clin Biol Res 304: 359-76, 1989).
Puede ser igualmente difícil incrementar rápidamente los niveles de compuestos nutricionales positivos en cultivos de alimentos debido a la imprecisión inherente de la reproducción de planta convencional. Por ejemplo, sería deseable aumentar los niveles de "almidón resistente" (Topping et al., Physiol Rev 81: 1031-64, 2001) en una variedad de cultivos. Tal almidón es responsable en última instancia de promover respuestas inmunes, suprimiendo patógenos potenciales, y que reducen la incidencia de enfermedades que incluyen cáncer colorrectal (Bird et al., Curr Issues Intest Microbiol 1: 25-37, 2000). Sin embargo, las únicas plantas disponibles para aumentar los niveles de almidón resistente son variedades de rendimiento bajo como los mutantes de maíz "extendedor de amilosa" de mutante de maíz, "insípido", y "azucarado-2." La creación de nuevas fuentes de almidón de alta resistencia, tal como patatas, permitiría la incorporación dietaría más amplia de este componente que promueve la salud.
La incapacidad para manipular de manera segura los fenotipos de plantas usualmente lleva al uso de sustancias químicas externas para inducir un fenotipo deseado. A pesar de numerosos programas de reproducción para retrasar la germinación de tubérculos, por ejemplo, no hay disponible comercialmente variedades de patatas que puedan ser almacenadas por meses sin el tratamiento con inhibidores de germinación. Esto último, tal como isopropil-N-clorofenil-carbamato (CIPC), está ligado a la toxicidad aguda y desarrollo de tumor, y puede estar presente en alimentos de patatas procesados en concentraciones entre 1 mg/kg y 5 mg/kg.
La ingeniería genética se basa en la transferencia de ADN foráneo
La ingeniería genética se puede usar para modificar, producir, o eliminar ciertos rasgos de plantas. Mientras ha existido progreso limitado en mejorar el valor nutricional y características de salud de las plantas, la mayoría de mejoras se dirigen a rasgos de plantas que promueven facilidad de cultivo. Así, ciertas plantas son resistentes al herbicida de glifosato porque contienen el gen bacteriano 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa (Padgette et al., Arch Biochem Biophys. 258: 564-73, 1987). Similarmente, la ingeniería genética ha producido variedades de plantas resistentes a insectos, virus, hongos (Shah et al., Trends in Biotechnology 13: 362-368, 1995; Gao et al., Nat Biotechnol. 18: 1307-10, 2000; Osusky et al., Nat Biotechnol. 18: 1162-6, 2000 and WO 99/53050), pero pocas con beneficios de nutrición o salud mejorados.
La ingeniería genética ha, sin embargo, sido usada para disminuir el contenido de azúcar en el tejido de planta con el fin de reducir la ocurrencia de la reacción de Maillard (documento U.S. No. 6,207,880, Lorbeth et al., Nature Biotechnology 16 : 473-477,1998, documento EP 0 628 636 y Coetzer et al.) Journal of Agriculture and Food Chemistry 49 : 52-657, 2001).
De acuerdo con técnicas estándar, bien conocidas, se insertan "casetes de expresión” genética, que comprende genes y elementos regulatorios dentro de las fronteras de los ADN de transferencia de Agrobacterium aislado ("T-ADN") integrados en los genomas de plantas. De esta forma, la transferencia mediada por Agrobacterium de material de T-ADN típicamente comprende los siguientes procedimientos estándar: (1) recombinación in vitro de elementos genéticos, al menos uno de los cuales es de origen foráneo, para producir un casete de expresión para selección de transformación, (2) inserción de este casete de expresión, usualmente junto con al menos un casete de expresión diferente que contiene ADN foráneo, en una región de T-ADN de un vector binario, que usualmente consiste en varios cientos de pares base de ADN de Agrobacterium flanqueado por secuencias de frontera de T-ADN, (3) transferencia de las secuencias localizadas entre las fronteras de T-ADN, usualmente acompañadas con alguna o todas las secuencias de vector binario adicionales de Agrobacterium a la célula de planta, y (4) selección de células de planta transformadas establemente. véase, por ejemplo, los documentos U.S. Nos. 4,658,082, 6,051,757, 6,258,999, 5,453,367, 5,767,368, 6,403,865, 5,629,183, 5,464,763, 6,201,169, 5,990,387, 4,693,976, 5,886,244, 5,221,623, 5,736,369, 4,940,838, 6,153,812, 6,100,447, 6,140,553, 6,051,757, 5,731,179, 5,149,645 y EP 0 120,516, EP 0 257,472, EP 0 561,082, 1,009,842A1, 0 853,675A1, 0 486,233B1, 0 554,273A1, 0 270,822A1, 0 174,166A1, y WO 01/25459.
De esta forma, los métodos de ingeniería genética se basan en la introducción de ácidos nucleicos foráneos en el suministro de alimentos. Aquellas técnicas transfieren fusiones complejas de unos pocos o más de 20 elementos
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genéticos aislados de virus, bacterias, y plantas, que no son nativos de las especies vegetales transformadas. Tales elementos foráneos incluyen elementos regulatorios tales como promotores y terminadores, y genes que están implicados en la expresión de un nuevo rasgo o funcionan como marcadores para identificar o seleccionar para eventos de transformación. A pesar de las pruebas de alimentos que contienen ADN foráneo para seguridad antes de la aprobación regulatoria, muchos consumidores están preocupados acerca de los efectos a largo plazo de consumir alimentos que expresan proteínas foráneas, que son producidas por genes obtenidos de otras especies, no vegetales.
Un elemento regulatorio usado comúnmente es el promotor “súper” 35S del virus mosaico de coliflor (CaMV), que es típicamente usado en ingeniería de planta para inducir altos niveles de expresión de transgenes al cual está directamente ligado. Sin embargo, el promotor 35S también puede mejorar la expresión de genes nativos en su vecindad (Weigel et al., Plant Physiol., 122: 1003-13, 2000). Tales promotores pueden inducir de esta manera alteraciones impredecibles en la expresión de genes endógenos, posiblemente que resultan en efectos indeseados tal como incremento de la producción de alcaloides. Los promotores "fuertes" preferidos son generalmente aquellos aislados de virus, tal como el virus baciliforme del tungro del arroz, virus del rayado del maíz, virus de las venas de la yuca, virus mirabilis, caliomovirus de raya clorótico de maní, virus del mosaico de Escrofularia y virus de chorella. Otros promotores usados frecuentemente son clonados de especies bacterianas e incluyen los promotores del gen de sintasa de nopalina y sintasa de octapina.
Para obtener la terminación apropiada de traducción de gen, las secuencias terminadoras son fusionadas al extremo 3’ de transgenes e incluyen elementos genéticos de los genes de sintasa de nopalina y sintasa de octopina de Agrobacterium. Se pueden usar otros elementos genéticos para mejorar aún más la expresión de gen o dirigir la proteína expresada a ciertos compartimientos celulares. Estos elementos incluyen intrones para impulsar la expresión transgénica y secuencias de péptido de señal para dirigirlas al gen foráneo para ciertos compartimientos celulares, usualmente derivados de especies vegetales foráneas.
Ciertos genes implicados en la expresión de un nuevo rasgo son más frecuentemente derivados de fuentes foráneas. Si se usan genes nativos, están usualmente invertidos para silenciar la expresión de aquel gen en las plantas transgénicas y cotransformadas con ADN foráneo tal como un marcador seleccionable. La principal desventaja de esta tecnología de "antisentido" es que el ADN invertido usualmente contiene marcos nuevos de lectura abierta y no caracterizados insertados entre un promotor y un terminador. De esta forma, las plantas de patatas que fueron genéticamente modificadas con constructos antisentido derivados del gen R1 relacionado de almidón (Kossmann et al., documento US 6,207,880), los genes de glucano fosforilasa de tipo L y H (Kawchuk et al., documento US 5,998,701, 1999), el gen de oxidasa de polifenol (Steffens, documento US 6,160,204, 2000), y genes para almidón que ramifican enzimas I y II (Schwall et al., Nature Biotechnology 18: 551-554, 2000) todos potencialmente expresan nuevos péptidos que consisten en al menos 50 aminoácidos (Tabla 1). Estos nuevos péptidos pueden interferir con el desarrollo de la planta y/o reducir el valor nutricional de la patata, y por lo tanto son indeseables.
Los genes marcadores convencionales están incorporados en constructos genéticos y son usados para seleccionar para eventos de transformación. Estos confieren ya sea resistencia antibiótica o herbicida (documento U.S. No. 6,174,724), una ventaja metabólica (documento U.S. No. 5,767,378), o un fenotipo subnormal morfológicamente (documento U.S. No. 5,965,791) para la planta transformada. Tales marcadores son típicamente derivados de fuentes bacterianas.
Adicionalmente, a causa de la infidelidad de transferencia de T-ADN, aproximadamente 75% de los eventos de transformación en plantas tales como tomate, tabaco, patata contienen secuencias de "columna vertebral" de plásmido adicionalmente a la T-ADN (Kononov et al., Plant J.11: 945-57, 1997). La presencia de tales secuencias de columna vertebral es indeseable porque son foráneas y típicamente contienen orígenes de replicación y marcadores de gen de resistencia antibiótica.
Existen varios métodos para eliminar elementos como genes marcadores foráneos, pero pocos son fácilmente aplicables a ingeniería genética de plantas. De acuerdo con uno de tales métodos, el gen marcado y gen deseado o secuencias de nucleótidos están ubicados en diferentes vectores. La infección de plantas con ya sea una cepa de Agrobacterium que lleva ambos vectores (documento U.S. No. 6,265,638) o dos cepas de Agrobacterium donde cada una lleva uno de los vectores puede ocasionalmente resultar en eventos de integración no vinculada, que pueden ser separadas genéticamente a través de exogamia. La principal desventaja de este método es que la separación genética de loci puede ser muy laboriosa y consumir mucho tiempo, especialmente si están vinculados los eventos de integración de T-ADN. Adicionalmente, este método no es ampliamente aplicable en plantas apomícticas, que se reproducen asexualmente, tal como pasto azul de Kentucky, o cultivos propagados vegetativamente tal como patatas, que no pueden ser engendrados rápidamente debido a depresión endogámica, altos niveles de heterocigosidad, y los bajos niveles de fertilidad.
Otro método para eliminar elementos genéticos foráneos se basa en insertar el gen foráneo, como el gen marcador seleccionable, en un elemento de transposición. El elemento de transposición modificado puede entonces ser empalmado fuera del genoma a frecuencias bajas. Se deben realizar entonces los cruces tradicionales con plantas
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no transformadas para separar el elemento transpuesto del huésped (documento U.S. No. 5,482,852). Como se describió por el método anterior, este método alternativo no puede ser usado para sistemas de plantas de propagación vegetativa o apomícticos.
Un tercer método para eliminar un marcador usa el sistema de recopilación de sitio específico Cre/lox de bacteriófago P1 (Dale & Ow, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, 88: 10558-62, 1991). La inserción de un gen marcador junto con el gen Cre recombinasa y un gen quimérico implicado en la inducción de Cre (ambos con sus propios promotores y terminadores) entre dos sitios lox, lleva a la escisión de la región delineada por los sitios lox durante el proceso de regeneración (Zuo et al., Nat. Biotechnol., 19: 157-61, 2001). Este proceso complicado es ineficiente y no confiable, y puede causar inestabilidad del genoma.
Estudios recientes reportan que algunos genes de planta por sí mismos pueden ser usados como marcadores de transformación. Los ejemplos de tales marcadores de planta incluyen Pga22 (Zuo et al., Curr Opin Biotechnol. 13: 173-80, 2002), Cki1 (Kakimoto, Science 274: 982-985, 1996) y Esr1 (Banno et al., Plant Cell 13: 2609-18, 2001). Todos los genes, sin embargo, disparan respuestas de citoquinina, que confieren un fenotipo indeseable a la planta transformada. Adicionalmente, tales marcadores de planta aún necesitarían ser eliminados después de la transformación por cualquiera de los métodos descritos anteriormente.
Los métodos alternativos para transformar plantas también están basados en la recombinación in vitro de elementos genéticos foráneos, y se basan en secuencias de plásmidos bacterianos para la conservación en E. coli, partes de las cuales están cointegradas durante el procedimiento de transformación. Se describen los ejemplos de tales métodos para transformar plantas con ADN foráneo en los documentos U.S. Nos. 5,591,616, 6,051,757, 4,945,050, 6,143,949, 4,743,548, 5,302,523, y 5,284,253.
También se pueden obtener las plantas transgénicas libres de marcadores mediante la omisión de cualquier procedimiento de selección antes de la regeneración. Una desventaja de este método es que la mayoría de eventos generados a través de este método representarán plantas no transformadas o quiméricas porque estas usualmente no serán derivadas de células vegetales transformadas individuales. Es extremadamente difícil y laborioso usar un procedimiento de marcadores libres para la identificación de plantas transgénicas contiene las mismas inserciones de ADN en todas sus células.
De esta forma, existe una necesidad muy importante de mejorar plantas más allá de lo que puede lograrse a través de cruces de reproducción clásicos y técnicas de ingeniería genética convencionales, y que no están basadas en la inserción de ácido nucleico desconocido o foráneo en un genoma de planta. En consecuencia, la presente descripción proporciona métodos y composiciones para modificar precisamente un material genético propio de plantas. De esta forma, la estrategia de "reproducción precisa" inventiva no incluye fenotipos indeseables y no introduce ácido nucleico desconocido o foráneo en un genoma de planta.
Resumen
La presente divulgación proporciona métodos de mejorar genéticamente el valor nutricional y desempeño agronómico de una planta sin la incorporación permanente o estable de ya sea ADN desconocido o foráneo en el genoma de aquella planta. De acuerdo con estos métodos, se aíslan ácidos nucleicos específicos, bien caracterizados, elementos de genes, y genes de una especie vegetal deseada o de una especie planta que es sexualmente compatible con la planta deseada, modificada, y después son reinsertados nuevamente en el genoma de la especie vegetal deseada. La modificación puede implicar la mutación de la secuencia de ácido nucleico aislada, eliminación de partes del ácido nucleico aislado, o simplemente unión del ácido nucleico a otro polinucleótido, tal como subclonación del ácido nucleico aislado en un vector de plásmido.
En consecuencia, las plantas transgénicas producidas por la metodología no poseen genomas que comprenden cualquier ácido nucleico de especie foránea. De esta forma, el método produce una planta transgénica cuyo genoma no comprende un promotor de especie no vegetal, no comprende un terminador de especie no vegetal, no comprende una región no traducida 5’ de especie no vegetal, no comprende una región no traducida 3’ de especie no vegetal, no comprende un gen marcador de especie no vegetal, no comprende un elemento regulatorio de especie no vegetal, no comprende un gen de especie no vegetal, y no comprende cualquier otro polinucleótido que es obtenido de un genoma de especie no vegetal.
De esta forma, la presente ubicación proporciona un método para producir una planta transgénica estable que exhibe un fenotipo modificado que no es exhibido por la planta no transformada, que comprende (a) transformar células de planta con un polinucleótido; (b) cultivar plantas con las células transformadas; y (c) seleccionar una planta transformada establemente con el dicho polinucleótido deseado que exhibe un nuevo fenotipo que no esté exhibido por plantas cultivadas a partir de las células vegetales no transformadas correspondientes. Preferiblemente, el polinucleótido deseado consiste esencialmente en (i) secuencias de ácido nucleico que son aisladas desde y/o nativas al genoma de las células vegetales, o a otras fuentes de la misma especie, o son aisladas de y/o nativas al genoma de una especie planta que es sexualmente compatible con la planta de la que se aislaron las células de planta; y (ii) al menos una secuencia de ADN que es una secuencia de bordes similar que tiene una secuencia que
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es nativa al genoma de dichas células de planta de la misma especie, o es nativa a una planta que es sexualmente compatible con la planta de la que se aislaron las células de la planta, y en la que la secuencia de frontera similar es capaz de integrar establemente el polinucleótido deseado en el genoma de dichas células de planta.
Un método preferido implica producir una planta transgénica que exhibe un fenotipo modificado que no es exhibido por la planta no transformada, que comprende (a) infectar plantas con Agrobacterium que llevan (i) un vector de "P-ADN", que contiene un polinucleótido que es nativo a la planta transgénica, y (ii) un vector de "LifeSupport" que contiene un casete de expresión que contiene un gen marcador seleccionable; (b) seleccionar para la expresión transitoria del gen marcador seleccionable, preferiblemente por 1-10 días, por 3-7 días, o por 4-5 días; (c) transferir explantes a medios de regeneración para permitir la formación de brotes; (d) cribar poblaciones de brotes para determinar cuál comprende al menos una copia del polinucleótido deseado en sus genomas y, de aquellos, que brotes no contienen ningún ácido nucleico foráneo, tal como el gen marcador seleccionable, en sus genomas; y (e) permitir que los brotes que contienen el polinucleótido deseado en sus genomas pero ningún gen marcador de ADN, para desarrollar en plantas completas, en el que las plantas completas resultantes exhiben un fenotipo modificado que no es exhibido por plantas cultivadas a partir de células vegetales no transformadas de la misma especie.
De acuerdo con tal método, el polinucleótido deseado (i) consiste esencialmente en únicamente elementos que son aislados de y/o nativos al genoma de las especies de células de planta o especies compatible sexualmente de la misma; (ii) comprende al menos un elemento frontera que tiene una secuencia que es aislada de, o nativa a, el genoma de la especie de célula de planta o especies compatibles sexualmente de la misma, y es capaz de integrar establemente el polinucleótido deseado en el genoma de una célula de planta expuesta al vector; y (iii) es integrada establemente en el genoma de la planta transformada; en la que el método no integra ADN de especies no vegetales o foráneos en el genoma de la planta transformada.
Adicionalmente, se puede seleccionar cualquier gen marcador seleccionable como un indicador de transformación satisfactoria. Por ejemplo, un gen marcador de "neomicina fosfotransferasa", o puede ser usado un gen marcador "hpt" para conferir resistencia a antibióticos aminoglucósidos, kanamicina e higromicina respectivamente. Otros genes marcadores incluyen el gen marcador "bar", que confiere resistencia al herbicida fosfinotricina; el gen marcador "DHFR", que confiere resistencia a metotrexato; y el gen marcador "ESPS", que confiere resistencia al herbicida reunido. Es bien conocido en la técnica como seguir la expresión de tales genes marcadores para determinar si o no fue expresado establemente en el genoma de un célula de planta transformada. En consecuencia, el experto en la técnica conoce como seguir la expresión del gen marcador para determinar que el gen marcador es únicamente expresado transitoriamente en la célula de planta transformada.
También se proporciona un método para hacer una planta transformada establemente que comprende los pasos de:
(1)
identificar un gen objetivo; (2) aislar una secuencia líder o remolque de ADN asociada con dicho gen objetivo; (3) opcionalmente modificar dicho ADN líder o remolque; (4) operablemente vincular dicho ADN líder o remolque a elementos regulatorios nativos para formar un casete de expresión; (5) insertar dicho casete de expresión en una P-ADN que está localizada en un vector binario, en el que el vector binario también lleva un gen de citoquinina operable tal que la inserción inadvertida de secuencias de vector binario adicionales, que son de origen foráneo, son detectadas por expresión del gen de citoquinina; (6) introducir el vector binario modificado en Agrobacterium; (7) integrar establemente el ADN nativo reorganizado en los genomas de células de planta que usan transformación mediada de LifeSupport; (8) regenerar células de planta que contienen un ADN nativo reorganizado; (9) descartar plantas que muestran un fenotipo de sobrereproducción de citoquinina y que no se regeneran completamente; y (10) mantener parálisis adicional las plantas deseables que son indistinguibles de plantas no transformadas.
También se describe, se proporciona un método para modificar la expresión de un rasgo en una especie vegetal seleccionada. El método puede comprender (1) identificar el rasgo que va a ser modificado; (2) construir una molécula de ADN recombinante que consiste esencialmente en elementos genéticos aislados de, o nativos a, las especies vegetales seleccionadas, en las que la molécula de ADN recombinante, cuando se integró en el genoma de las especies vegetales seleccionadas, modifica la expresión del rasgo en las especies vegetales transformadas;
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integrar establemente la molécula de ADN recombinante en las células de las especies vegetales seleccionadas que usan la transformación mediada de LifeSupport; y (4) identificar plantas transformadas que exhiben la expresión modificada del rasgo.
Preferiblemente, se insertan el polinucleótido que es nativa a una planta deseada en el genoma de la planta deseada por medio de infección de explantes con dos cepas diferentes de Agrobacterium. Una primera cepa de Agrobacterium es capaz de transferir el ADN nativo de vectores de P-ADN a células vegetales; una segunda cepa puede transferir una T-ADN que lleva un casete de expresión para un gen marcador seleccionable para células de planta. Los ejemplos de este último vector incluyen los llamados, vectores de "LifeSupport" descritos aquí. Mediante la selección preferiblemente de plantas que expresan transitoriamente el gen marcador por 1-10 días, por 3-7 días, o por 4-5 días, y posteriormente que transfieren explantes a medios de regeneración, se obtiene una población de eventos, parte de la cual representa plantas que contienen al menos una copia del polinucleótido, pero que carecen de cualquier copia de la T-ADN o gen marcador.
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Se puede usar una cepa individual de Agrobacterium que lleva tanto un vector P-ADN, que alberga el gen deseado, nativo de interés o polinucleótido entre secuencias de borde similar de P-ADN, como un vector de LifeSupport, que contiene un gen marcador. El gen marcador puede, o puede no, estar insertado entre secuencias de borde similar de P-ADN, secuencias de borde de T-ADN, u otras secuencias de borde similar a T-ADN.
De esta forma, preferiblemente, el vector de P-ADN contiene al menos dos casetes de expresión, uno de los cuales comprende un gen marcador nativo que se puede cribar o seleccionable dirigido por un promotor nativo y seguido por un terminador nativo.
Al seleccionar preferiblemente por al menos 2 días y más preferiblemente por al menos 5 días para expresión de gen marcador nativo y posteriormente transferir explantes a medios de regeneración, se obtiene una población de eventos que representa plantas que contienen al menos una copia del ADN introducido establemente integrado en sus genomas. Preferiblemente, el gen marcador derivado de planta codifica una sintasa de ácido 5-enolpiruvul-3fosfosiquímico mutante o triptófano descarboxilasa. Más preferiblemente, el gen marcador seleccionable codifica para la tolerancia a la sal. Más preferiblemente, el gen de tolerancia a la sal tiene las secuencias de nucleótidos mostrada en SEQ ID 35 y se usa para seleccionar para eventos de transformación en patatas.
La expresión modificada del rasgo puede estar caracterizada por un incremento en la expresión, una disminución en la expresión, o en la expresión indetectable.
Una planta puede estar hecha por el método de (1) identificar el rasgo que va a ser modificado; (2) construir una molécula de ADN recombinante que consiste esencialmente en elementos genéticos aislados de las especies vegetales seleccionadas, en las que la molécula de ADN recombinante cuando fue integrada en el genoma de las especies vegetales seleccionadas, modifica la expresión del rasgo en las especies vegetales transformadas; (3) integra establemente la molécula de ADN recombinante en células de las especies vegetales seleccionadas a través de transformación mediada de LifeSupport; y (4) se proporciona identificación de plantas transformadas que exhiben expresión modificada del rasgo.
Adicionalmente, se proporciona un método de modificación de expresión de un rasgo en una especie vegetal seleccionada. Este método comprende (1) identificar el rasgo que va a ser modificado; (2) construir una molécula de ADN recombinante que consiste esencialmente en (a) elementos genéticos aislados de las especies vegetales seleccionadas, en las que los elementos genéticos cuando fueron integrados en el genoma de las especies vegetales seleccionadas, modificaron la expresión del rasgo en las especies vegetales transformadas; y (b) un gen marcador seleccionable que es aislado de las mismas especies vegetales; (3) integrar establemente la molécula de ADN recombinante en células de las especies vegetales seleccionadas a través de la transformación mediada de LifeSupport; (4) detectar el gen marcador seleccionable; y (5) identificar plantas transformadas que exhiben expresión modificada del rasgo.
También se proporciona una planta que exhibe una expresión modificada de un rasgo. La planta puede haber integrado de manera estable en su genoma una molécula de ADN recombinante que consiste esencialmente en elementos genéticos aislados de una planta de la misma especie, o de una planta que es sexualmente compatible con aquellas especies, en las que la molécula de ADN recombinante modifica la expresión del rasgo.
También se proporciona una secuencia de nucleótidos denominada como "planta-ADN" ("P-ADN"). Preferiblemente, el propio P-ADN carece de los genes o partes del mismo y está delineado por el terminal, las secuencias de " borde similar" de T-ADN que comparten al menos 50%, al menos 75%, al menos 90% o al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de las fronteras de T-ADN de cualquier cepa de Agrobacterium virulento, y que soporta una transferencia eficiente del P-ADN entero de Agrobacterium a células de planta.
Preferiblemente una secuencia de "frontera similar" promueve y facilita la integración de un polinucleótido al cual está vinculado. Adicionalmente, cada secuencia terminal del P-ADN modificado puede estar entre 5-100 pb en longitud, 10-80 pb en longitud, 15-75 pb en longitud, 15-60 pb en longitud, 15-50 pb en longitud, 15-40 pb en longitud, 15-30 pb en longitud, 16-30 pb en longitud, 20-30 pb en longitud, 21-30 pb en longitud, 22-30 pb en longitud, 23-30 pb en longitud, 24-30 pb en longitud, 25-30 pb en longitud, o 26-30 pb en longitud. Más preferiblemente, la secuencia de frontera similar está entre 20 y 28 nucleótidos en longitud.
Las secuencias de frontera izquierdas y derechas de P-ADN de la presente invención pueden ser aisladas de y/o son nativas al genoma de una planta que se va a modificar y nos son idénticas en la secuencia de nucleótidos a cualquier secuencia de frontera de T-ADN derivada de Agrobacterium conocida. De esta forma, una secuencia de frontera de P-ADN puede poseer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o más nucleótidos que son diferentes de una secuencia de frontera de T-ADN de una especie de Agrobacterium, tal como Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. Alternativamente, una frontera de P-ADN o una secuencia de frontera similar de la presente invención tiene al menos 95%, al menos 90%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 60% o al menos 50% de identidad de secuencia con una secuencia de frontera de T-ADN de una especie de Agrobacterium, tal como Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. Más preferiblemente, una secuencia de frontera de P-ADN de planta nativa que comparte mayor que o igual al 99%,
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Una secuencia de borde similar puede ser aislada de un genoma de planta y después modificada o mutada para cambiar la eficiencia por la cual es capaz de integrar una secuencia de nucleótidos en otras secuencias de nucleótidos. Se pueden añadir otras secuencias de polinucleótidos a o incorporar dentro de una secuencia de borde similar de la presente invención. De esta forma, se puede modificar una frontera izquierda de P-ADN o una frontera derecha de P-ADN de manera que posee sitios de clonación múltiple 5’-3’-, o sitios de restricción adicionales. Adicionalmente, una secuencia de frontera de P-ADN puede ser modificada para incrementar la probabilidad que la columna vertebral de ADN que acompaña no está integrado en el genoma de la planta.
Aún más preferiblemente, se aísla el P-ADN de cualquier planta mediante el uso de cebadores degenerados en una reacción de cadena de polimerasa. El P-ADN puede ser derivado de patatas, puede ser delineado por terminales de 25-pb con 80 y 88% de identidad para fronteras convencionales de T-ADN, respectivamente, y puede tener las secuencias de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO. 1. Alternativamente, el P-ADN puede ser derivado de trigo, puede ser delineado por terminal de 25-pb con 72% y 92% de identidad con fronteras convencionales de T-ADN, respectivamente, y puede contener las secuencias de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO. 34.
Tal P-ADN puede ser modificado de manera que comprende otros polinucleótidos posicionados entre las secuencias de frontera similar. Preferiblemente, el P-ADN modificado consiste esencialmente en, en la dirección 5’ a 3’, una primera secuencia de frontera similar que promueve transferencia de ADN, un promotor, un polinucleótido deseado que esta operablemente vinculado al promotor, un terminador y una segunda secuencia de frontera similar que también promueve transferencia de ADN. Alternativamente, el polinucleótido deseado representa una o varias copias de un líder, un remolque o un gen en orientaciones de sentido y/o antisentido.
Preferiblemente, el P-ADN modificado contiene casetes de expresión para tanto un gen PPO mutante como un gen inhibidor de invertasa.
Así, el polinucleótido deseado puede comprender una secuencia de sentido o antisentido de una secuencia líder. Más preferiblemente, la secuencia líder está asociada con un gen que es endógeno a una célula de las especies vegetales seleccionadas. Aún más preferiblemente, el líder está asociado con un gen que es seleccionado del grupo que consiste en un gen PPO, un gen R1, un gen de la glucano alfa fosforilasa de tipo L o H, un gen de la UDP glucosa glucosiltransferasa, un gen HOS1, gen de la S-adenosilhomocisteína hidrolasa, un gen de la cinamato 4hidroxilasa clase II, un gen de la cinamoílo-coenzima A reductasa, un gen de la cinamoílo alcohol deshidrogenasa, un gen de la cafeoil coenzima A O-metiltransferasa, un gen del factor de despolimerización de la actina, un gen Nin88, un gen Lol p 5, un gen de alérgeno, un gen de la P450 hidroxilasa, un gen de la ADP-glucosa pirofosforilasa, un gen de la prolina deshidrogenasa, un gen de la endo-1,4-beta-glucanasa, un gen de la zeaxantina epoxidasa, y un gen del 1-aminociclopropano-1-carboxilato sintasa.
Preferiblemente, la secuencia del polinucleótido deseado comprende un gen de secuencia sentido y antisentido de una secuencia remolque. La secuencia remolque puede estar asociada con un gen seleccionado de un grupo que consiste en un gen PPO, un gen R1, un gen de la alfa glucano fosforilasa de tipo L o H, un gen de la UDP glucosa glucosiltransferasa, un gen HOS1, gen de la S-adenosilhomocisteína hidrolasa, un gen de la cinamato 4-hidroxilasa clase II, un gen de la cinamoílo-coenzima A reductasa, un gen de la cinamoílo alcohol deshidrogenasa, un gen de la cafeoil coenzima A O-metiltransferasa, un gen del factor de despolimerización de la actina, un gen Nin88, un gen Lol p 5, un gen de alérgeno, un gen de la P450 hidroxilasa, un gen de la ADP-glucosa pirofosforilasa, un gen de la prolina deshidrogenasa, un gen de la endo-1,4-beta-glucanasa, un gen de la zeaxantina epoxidasa, y un gen del 1aminociclopropano-1-carboxilato sintasa.
Preferiblemente, el polinucleótido deseado, tal como un gen, es aislado de, y/o es nativo a la planta que va a ser transformada. Alternativamente, el polinucleótido deseado es modificado o mutado. Una mutación para el polinucleótido aislado pueda hacer al nucleótido deseado mayor que o igual a 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, o 60% disímil a su forma no multada.
El promotor de una expresión de casete localizado dentro de una P-ADN puede ser un promotor constitutivo. Preferiblemente, el promotor constitutivo es el promotor del gen Ubiquitina-3 de patata. Aún más preferiblemente, el promotor constitutivo es el promotor del gen Ubiquitina-7 de patata.
El promotor de un casete de expresión localizado dentro de una P-ADN puede ser un promotor regulable. Preferiblemente, el promotor regulable es sensible a la temperatura. Aún más preferiblemente, el promotor regulable es un promotor ci21A o un promotor C17, cada uno aislado a partir de patata (Schneider et al., Plant Physiol. 113: 335-45, 1997; Kirch et al., Plant Mol Biol 33: 897-909, 1997).
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El promotor de un casete de expresión localizado dentro de un P-ADN puede ser regulado en una forma temporal. Preferiblemente, el promotor es un promotor rbcS (Ueda et al., Plant Cell 1: 217-27, 1989).
El promotor de un casete de expresión localizado dentro de un P-ADN puede ser regulado por uno cualquiera de ácido abscísico, lesiones, jasmonato de metilo o ácido giberélico. Este promotor puede ser un promotor seleccionado de ya sea un promotor de gen Rab 16A, un promotor de gen de α-amilasa o un promotor de gen pin2.
El promotor de un casete de expresión localizado dentro de un P-ADN puede ser un promotor de tejido específico. Preferiblemente, este promotor es un promotor GBSS aislado partir de S. tuberosum.
La presente descripción describe un vector P-ADN que es capaz de replicar tanto en E.coli como Agrobacterium, y contiene ya sea un P-ADN o un P-ADN modificado. En una realización preferida, este vector también contiene un casete de expresión para un gen de citoquinina en su columna vertebral para permitir la selección contra eventos de integración de columna vertebral.
La secuencia de nucleótidos deseada puede comprender adicionalmente un elemento espaciador. El elemento espaciador puede ser una secuencia de intrón Ubi o una secuencia espaciadora GBSS.
La secuencia de nucleótidos deseada puede comprender un gen nativo mutado que codifica una proteína inactiva funcionalmente, que reduce la actividad total de aquella proteína si es expresada en plantas transgénicas. Este gen mutado puede codificar una oxidasa de polifenol inactiva funcionalmente que carece de un dominio de unión de cobre.
La secuencia de nucleótidos deseada puede comprender un gen nativo que codifica una proteína activa funcionalmente. Preferiblemente, este gen codifica para una proteína con homología para el inhibidor de invertasa vacuolar de tabaco.
El terminador de un casete de expresión localizado dentro de un P-ADN puede ser una secuencia de terminador Ubi3 o una región no traducida 3’ de un gen de una especie planta seleccionada.
También está descrito aquí, se proporciona un método para modificar una célula de planta objetivo. En una realización, el método comprende: (1) insertar un P-ADN modificado en el genoma de al menos una célula en la célula de la planta objetivo que usa transformación mediada de LifeSupport; y (2) observar si hay un cambio fenotípico en la célula de planta objetivo; en la que el promotor en el P-ADN modificado transcribe las secuencias no traducidas sentido y/o antisentido asociadas con un gen nativo para reducir la expresión de aquel gen nativo, por lo tanto modificar la célula de planta objetivo. En otra realización preferida, el promotor en el P-ADN modificado transcribe un gen para sobreexpresar aquel gen en la célula de planta objetivo.
También se describe un método de fabricación de una célula de planta transgénica de una especie vegetal seleccionada que contiene un P-ADN modificado. El método comprende cotransferir una célula de planta de una especie vegetal seleccionada con un vector P-ADN y un vector de LifeSupport que comprende un gen marcador flanqueado por una frontera izquierda de T-ADN y una frontera derecha de T-ADN y un gen virD2 mutante insertado en la columna vertebral del vector, y seleccionar para una célula de planta que expresa transitoriamente el gen marcador, y aislar una célula de planta que contiene el P-ADN modificado integrado en su genoma pero no contienen ningún nucleótido del vector de vida soporte. Preferiblemente, el gen marcador confiere resistencia a la kanamicina. Más preferiblemente, el terminador ADH de levadura sigue el gen de resistencia de kanamicina.
La célula de planta de la especie vegetal seleccionada objetivo para transformación puede estar en cultivo. Alternativamente, la célula de planta de la especie vegetal seleccionada objetivo para transformación está dentro de una planta.
Esta descripción también divulga una planta de la especie seleccionada que comprende al menos una célula con un genoma que contiene un P-ADN modificado. El P-ADN modificado puede consistir esencialmente en, la dirección 5’ a 3’, un primer término que funciona como una frontera T-ADN por secuencias P-ADN, un promotor, una secuencia de nucleótidos deseada operablemente vinculada tanto a un promotor, un terminador como secuencias P-ADN adicionales delineadas por un segundo terminal. En otra realización, el polinucleótido deseado representa una o varias copias de un líder, un remolque y un gen en la orientación sentido y/o antisentido.
También se prevé una planta que comprende al menos una célula con un genoma que contiene un P-ADN modificado.
También se divulga, se proporciona un método para reducir la expresión de un gen en una especie vegetal seleccionada. El método comprende la transformación mediada de LifeSupport de una célula de planta de una especie vegetal seleccionada con un vector P-ADN, en la que el P-ADN modificado de este vector está integrado establemente en el genoma de una célula de planta. También se divulga un P-ADN modificado que comprende un polinucleótido deseado que reduce la expresión de un gen endógeno de la especie vegetal seleccionada.
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También se divulga un gen nativo para la especie vegetal seleccionada que puede ser mutado y reintroducido en la planta que usa los métodos descritos aquí. Preferiblemente, el gen mutado, por ejemplo un gen PPO mutado, está integrado en el genoma de la célula de planta que usa un vector P-ADN vector.
La presente invención también proporciona un método para reducir la expresión indeseable del gen de oxidasa de polifenol en una especie vegetal seleccionada. Preferiblemente, el método comprende integrar en un genoma de una especie vegetal seleccionada un P-ADN modificado compuesto únicamente de secuencias de nucleótidos aisladas de las especies vegetales seleccionadas o de una planta que es sexualmente compatible con la especie vegetal seleccionada, que consiste esencialmente en, en la dirección 5’ a 3’, un primer terminal P-ADN que funciona como una frontera T-ADN seguido por flanqueo de secuencias P-ADN; un promotor; un nucleótido deseado que es una secuencia de nucleótidos de remolque orientada en sentido asociada con un gen PPO especifico; una secuencia orientada antisentido de la secuencia de nucleótidos remolque del gen PPO especifico; una secuencia de terminación, y secuencias P-ADN adicionales delineadas por un segundo terminal que funciona como una frontera T-ADN, en las que el promotor produce una molécula de ARN de cadena doble que reduce la expresión del gen PPO especifico, reduciendo de este modo los hematomas de manchas negras en tejidos específicos de la planta. También se describe el hecho que las secuencias nucleótidos orientadas en sentido y antisentido de la secuencia de nucleótidos líder se obtienen a partir de la región no traducida 5’-que precede al gen PPO específico. Se puede separar la secuencia líder o remolque orientada en sentido y antisentido asociada con el gen PPO por otra secuencia de polinucleótido, indicada aquí, como ya sea un intrón o un "espaciador”. Preferiblemente, la secuencia líder o remolque está asociada con un gen PPO de patata. Más preferiblemente, la secuencia líder o remolque está asociada con un gen PPO de patata que está expresado en tubérculos de patata. Más preferiblemente, la secuencia líder o remolque está asociada con un gen PPO de patata que está expresado en todas partes del tubérculo de patata excepto por la epidermis.
La presente divulgación también describe un método para reducir la producción de acrilamida, inducción de brote durante el almacenamiento, acumulación de fosfato, y/o edulcorante inducido por frio en tubérculos de una especie planta seleccionada.
El método puede comprender la transformación mediada de LifeSupport de una especie vegetal seleccionada con un P-ADN modificado compuesto únicamente de secuencias de nucleótidos aisladas de las especies vegetales seleccionadas, o de plantas que son sexualmente compatibles con las especies vegetales seleccionadas, que consiste esencialmente en, en la dirección 5’-a 3’-, un primer P-ADN con una secuencia de frontera similar izquierda, un promotor, una secuencia de nucleótidos deseada, que es una secuencia de nucleótidos desde la secuencia líder, una secuencia de terminación, una secuencia de frontera similar derecha. Tras la expresión, se produce un duplex de ARN que reduce la expresión del gen R1, por lo tanto que reduce edulcorante inducido por frio en la planta. Las secuencias deseadas de nucleótidos orientadas en sentido y antisentido representan el remolque asociado con el gen R1. El líder o remolque orientado en sentido o antisentido asociado con R1 puede ser separado por otra secuencia de polinucleótido, indicada aquí, como ya sea un intrón o un "espaciador."
El método puede comprender la transformación mediada de LifeSupport de una especie vegetal seleccionada con un P-ADN modificado que es similar a uno descrito anteriormente pero contiene una secuencia líder o remolque asociada con un gen de glucano alfa fosforilasa.
El método puede comprender la transformación mediada de LifeSupport de una especie vegetal seleccionada con un P-ADN modificado que contiene un gen inhibidor de invertasa.
El P-ADN modificado descrito en los parágrafos precedentes puede ser usado para reducir la acumulación de productos indeseables adicionales de la reacción Maillard, que ocurre durante el calentamiento de alimentos ricos en carbohidratos tales como tubérculos de patatas. Estos productos indeseables incluyen productos finales de glicación avanzada (AGE) que han sido asociados con diferentes patologías.
La presente descripción también divulga un método para incrementar los niveles de almidón resistente en los órganos de almacenamiento de plantas y cultivos de alimentos.
El método puede comprender la transformación mediada de LifeSupport de una especie vegetal seleccionada con un P-ADN modificado que contiene un casete de expresión para una fusión de las secuencias de remolque asociadas con los genes I y II de la enzima de ramificación de almidón.
La presente descripción también divulga secuencias de nucleótidos aisladas que comprenden el promotor del gen GBSS de patata y el gen inhibidor de proteinasa de patata, que están expresados predominantemente en tubérculos. Los promotores aislados tienen la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO.: 6 y SEQ ID NO.:40, respectivamente.
La presente descripción describe un método de modificación de un rasgo de una planta seleccionada que comprende:
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a. transformación de células establemente de la planta seleccionada con un polinucleótido deseado, en la que el polinucleótido deseado consiste esencialmente en una secuencia de ácido nucleico que es nativa a la planta seleccionada, nativa a la planta de la misma especie, o es nativa a una planta que es sexualmente interfértil con la
5 planta seleccionada,
b. obtención de una planta transformada establemente de las células de planta transformada en el que la planta transformada contiene el polinucleótido deseado integrado establemente en el genoma y en la que el polinucleótido deseado modifica el rasgo.
10 Preferiblemente, el método comprende adicionalmente co-transfección de células de planta con un gen marcador seleccionable que es expresado transitoriamente en las células de planta, y que identifica células de plantas transformadas, y plantas transformadas obtenidas de las células vegetales transformadas, en las que el gen marcador no es integrado establemente y el polinucleótido deseado es integrado establemente en el genoma.
15 El polinucleótido deseado puede comprender un P-ADN, promotor GBSS, promotor Ubi7, promotor Ubi3, promotor PIP, gen PPO modificado, gen inhibidor de invertasa, gen de tolerancia a la sal, líder asociado R1, fosforilasa asociada al líder, remolque asociado R1, remolques asociados SBE, intrón Ubi, espaciador GBSS, UbiT.
20 Una "planta" de la presente invención puede ser una planta monocotiledónea, seleccionada del grupo que consiste en trigo, césped, césped de turba, cereales, maíz, arroz, avena, trigo, cebada, sorgo, orquídea, iris, lirio, cebolla, plátano, caña de azúcar, sorgo y palma.
Una "planta" de la presente invención también puede ser una planta dicotiledónea, seleccionada del grupo que
25 consiste en aguacate, papa, tabaco, tomate, remolacha, brócoli, yuca, camote, chile, algodón, poinsetta, legumbres, alfalfa, soja, zanahoria, fresa, lechuga, roble, arce, nogal, rosa, menta, calabaza, margarita, y cactus.
Células vegetales y plantas pueden ser transformadas a través de transformación mediada de Agrobacterium. Preferiblemente, la transformación mediada de Agrobacterium se basa en el uso de al menos un vector binario. El
30 método de transformación mediada de Agrobacterium puede usar un primer vector binario y un segundo vector binario. El primer vector binario puede contener el polinucleótido deseado y el segundo vector binario puede contener un gen marcador seleccionable, en el que el gen marcador seleccionable es vinculado operablemente a un promotor y a un terminador.
35 De acuerdo con métodos de la presente invención, el rasgo que es modificado es seleccionado del grupo que consiste en características de mejora de salud y nutricionales, mejora del almacenamiento, mejora del rendimiento, tolerancia a la sal mejorada, mayor tolerancia a metales pesados, aumenta la tolerancia a la sequía, aumento de la tolerancia a la enfermedad, aumento de la tolerancia a insectos, una mayor tolerancia de tensión de agua, aumento de la tolerancia al frío y las heladas, mejora de color, una mayor dulzura, mayor vigor, mejor sabor, mejor textura,
40 disminución del contenido de fosfato, aumento de la germinación, aumento de la captación de micronutrientes, mejora de la composición de almidón, mejora de la longevidad de la flor.
La presente descripción también abarca una planta hecha por los presentes metros.
45 También se proporciona un método de modificación de un rasgo en una planta seleccionada que comprende:
(a)
identificación del rasgo que va a ser modificado;
(b)
construcción de un primer polinucleótido que consiste esencialmente en elementos genéticos nativos aislados de
50 la planta seleccionada, una planta de la misma especie, o una planta que es sexualmente interfértil con la planta seleccionada, en que los elementos genéticos nativos son capaces de modificar la expresión de un gen que controla el rasgo
(c) construcción de un segundo polinucleótido que comprende un gen marcador seleccionable que es vinculado 55 operablemente a un promotor y a un terminador;
(d)
co-transfección de células de planta de la planta seleccionada con el primer y segundo polinucleótidos;
(e)
selección para la expresión transeúnte del gen marcador seleccionable;
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(f) cribado para células de planta transformadas establemente con el primer polinucleótido pero que no contiene la segunda molécula de ADN integrada en el genoma; y
(g) obtención de una planta transformada establemente de las células vegetales transformadas que exhiben una 65 expresión modificada del rasgo.
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Los elementos genéticos pueden comprender al menos uno de un promotor, secuencia de interés, terminador, potenciador, intrón, espaciador, o elementos reguladores. Las células vegetales pueden ser transferidas con el primer polinucleótido antes que el segundo polinucleótido o viceversa.
La secuencia de interés puede ser un gen. El gen puede ser un gen de oxidasa de polifenol de tipo silvestre o un gen mutado o R1 de tipo silvestre. La secuencia de interés puede ser una secuencia líder o remolque, en la que la secuencia líder o remolque representa una secuencia corriente arriba o corriente abajo de un gen que es nativo a la célula de planta. La secuencia de interés puede comprender una secuencia líder orientada en sentido vinculada operablemente a una secuencia líder antisentido. La secuencia de interés puede comprender una secuencia remolque orientada en sentido vinculada operablemente a una secuencia remolque antisentido. En otra realización, el promotor es un promotor inducible. En otra realización, el terminador es una secuencia terminadora ADH de levadura.
También se describe un constructo líder que comprende en dirección 5’ a 3’, un promotor, una secuencia líder orientada en sentido, la secuencia antisentido del remolque, y un terminador, en el que la expresión de un constructo remolque produce una molécula de RNA de cadena doble que facilita la baja regulación de expresión del gen al cual está asociado. La secuencia remolque puede estar asociada con, y corriente arriba localizada de, la región que codifica del gen PPO, el R1, un gen de fosforilasa de tipo L, y un gen de glucano alfa fosforilasa.
También se describe un constructo líder que comprende en dirección 5’ a 3-, un promotor, una secuencia remolque orientada en sentido, la secuencia antisentido del líder, y un terminador, en el que la expresión de un constructo líder produce una molécula de RNA de cadena doble que facilita la baja regulación de expresión del gen al cual está asociado. La secuencia líder puede estar asociada con, y corriente arriba localizada de, la región que codifica del gen PPO, el R1, un gen de fosforilasa de tipo L, y un gen de glucano alfa fosforilasa.
El método comprende adicionalmente exponer la célula de planta a un segundo vector que comprende un elemento marcador, en el que el marcador es expresado transitoriamente en la planta transformada y no está integrado establemente en el genoma de la planta transformada. En una realización, el marcador es un gen de resistencia a herbicidas, un gen de resistencia a antibióticos, o NPTII.
Preferiblemente, las células vegetales son transformadas a través de transformación mediada de Agrobacterium. La transformación mediada de Agrobacterium puede basarse en el uso de al menos un vector binario. El método de transformación mediada de Agrobacterium puede usar un primer vector binario y un segundo vector binario. El primer vector binario puede llevar el primer polinucleótido y el segundo vector binario puede llevar el segundo polinucleótido.
La presente descripción también describe otro método de modificación de la expresión de un gen en una planta seleccionada que comprende:
(a)
identificación del gen funcional;
(b)
construcción de un primer polinucleótido que consiste esencialmente en elementos genéticos nativos aislados de la planta seleccionada, una planta de la misma especie como la planta seleccionada, o una planta que es sexualmente interfértil con la planta seleccionada, en que los elementos genéticos nativos son capaces de modificar la expresión de un gen;
(c)
construcción de un segundo polinucleótido que comprende un gen marcador seleccionable funcional;
(d)
co-transfección de células de planta de la planta seleccionada con el primer y segundo polinucleótidos;
(e)
selección para la expresión transeúnte del gen marcador seleccionable;
(f)
cribado para células de planta transformadas establemente con el primer polinucleótido pero que no contiene el segundo polinucleótido integrado en el genoma; y
(g)
obtención de una planta transformada establemente de las células vegetales transformadas que exhiben una expresión modificada del gen.
Preferiblemente, las células vegetales son transformadas a través de transformación mediada de Agrobacterium. La Transformación mediada de Agrobacterium puede basarse en el uso de al menos un vector binario. El método de transformación mediada de Agrobacterium puede usar un primer vector binario y un segundo vector binario. El primer vector binario puede llevar el primer polinucleótido y el segundo vector viario puede llevar el segundo polinucleótido.
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El Primer polinucleótido puede comprender al menos un P-ADN, promotor GBSS, promotor Ubi7, promotor Ubi3, promotor PIP, gen PPO modificado, gen inhibidor de invertasa, gen de tolerancia a la sal, líder asociado R1, fosforilasa asociada al líder, remolque asociado R1, remolques asociados SBE, intrón Ubi, espaciador GBSS, UbiT.
El segundo polinucleótido puede comprender al menos uno de un gen marcador seleccionable, un polinucleótido virD2 mutado omega, un polinucleótido codA, y un polinucleótido fusión codA::upp.
Asimismo, se prevé una planta hecha por tal método.
Se puede proporcionar una planta transgénica que exhibe una expresión modificada de un rasgo comparado con la planta no transgénica de la cual fue derivada, en la que se transforma establemente la planta transgénica con un polinucleótido deseado que consiste esencialmente en elementos nativos genéticos aislados de la planta, una planta en la misma especie, o una planta que es sexualmente interfértil con la planta, y en la que el polinucleótido modifica la expresión del rasgo.
Preferiblemente, la "planta" una planta monocotiledónea, seleccionada del grupo que consiste en trigo, césped, césped de turba, cereales, maíz, arroz, avena, trigo, cebada, sorgo, orquídea, iris, lirio, cebolla, plátano, caña de azúcar, sorgo y palma.
Alternativamente, la "planta" puede ser una planta dicotiledónea, seleccionada del grupo que consiste en aguacate, patata, tabaco, tomate, remolacha, brócoli, yuca, camote, chile, algodón, poinsetta, legumbres, alfalfa, soja, zanahoria, fresa, lechuga, roble, arce, nogal, rosa, menta, calabaza, margarita, y cactus.
El rasgo puede ser seleccionado del grupo que consiste en características de mejora de salud y nutricionales, mejora del almacenamiento, mejora del rendimiento, tolerancia a la sal mejorada, mayor tolerancia a metales pesados, aumenta la tolerancia a la sequía, aumento de la tolerancia a la enfermedad, aumento de la tolerancia a insectos, una mayor tolerancia de tensión de agua, aumento de la tolerancia al frío y las heladas, mejora de color, una mayor dulzura, mayor vigor, mejor sabor, mejor textura, disminución del contenido de fosfato, aumento de la germinación, aumento de la captación de micronutrientes, mejora de la composición de almidón, mejora de la longevidad de la flor.
El polinucleótido deseado puede comprender al menos uno de un P-ADN, promotor GBSS, promotor Ubi7, promotor Ubi3, promotor PIP, gen PPO modificado, gen inhibidor de invertasa, gen de tolerancia a la sal, líder asociado R1,fosforilasa asociada al líder, remolque asociado R1, remolques asociados SBE, intrón Ubi, espaciador GBSS, UbiT.
También está incluida una secuencia aislada, nucleótida de frontera similar que varía en tamaño desde 20 hasta 100 pb que comparte entre 52% y 96% de identidad de secuencia con una secuencia de frontera T-ADN de Agrobacterium tumafaciens. Preferiblemente, se aísla la secuencia de nucleótidos aislada de una planta monocotiledónea, seleccionada del grupo que consiste en trigo, césped, césped de turba, cereales, maíz, arroz, avena, trigo, cebada, sorgo, orquídea, iris, lirio, cebolla, plátano, caña de azúcar, sorgo y palma. Alternativamente, la secuencia de nucleótidos puede ser aislada de una planta dicotiledónea seleccionada del grupo que consiste en patata, tabaco, tomate, remolacha, brócoli, yuca, camote, chile, algodón, poinsetta, legumbres, alfalfa, soja, zanahoria, fresa, lechuga, roble, arce, nogal, rosa, menta, calabaza, margarita, y cactus.
También se puede aislar la secuencia de nucleótidos a partir de patata, y tiene una secuencia de nucleótidos mostrada en ya sea SEQ ID NO. 94 o 95. La secuencia de nucleótidos puede compartir 52% de identidad de secuencia con una secuencia de frontera T-ADN de Agrobacterium tumafaciens. También se abarca un vector que comprende tales secuencias de nucleótidos.
La presente descripción también divulga un método para producir una planta transformada establemente con un polinucleótido deseado que comprende:
(a)
aislar un P-ADN que está flanqueado por secuencias de frontera similar de la planta en el que las secuencias de frontera similar comparten entre 52% y 96% de identidad de secuencia con una secuencia de frontera similar T-ADN de Agrobacterium tumafaciens;
(b)
insertar el polinucleótido deseado entre las secuencias de frontera similar de P-ADN para formar un constructo P-ADN; y
(c)
transformar una célula de planta de la planta con el constructo P-ADN; y
(d)
recuperar una planta de la célula de planta transformada establemente con el constructo de P-ADN.
Se puede llevar el constructo de P-ADN en un vector que comprende un gen marcador de integración de columna vertebral y se pueden seleccionar células vegetales transformadas que no contienen el gen marcador de integración
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de columna vertebral. Preferiblemente, el gen marcador de integración de columna vertebral es un gen de citoquinina. Preferiblemente, no se seleccionan los brotes de planta que exhiben un fenotipo de sobreproducción de citoquinina. Alternativamente, el gen marcador de integración de columna vertebral es el gen IPT, y no se seleccionan brotes de planta que exhiban un fenotipo anormal o que no puede desarrollar raíces.
Las células vegetales pueden ser de una planta monocotiledónea seleccionada del grupo que consiste en trigo, césped, césped de turba, cereales, maíz, arroz, avena, trigo, cebada, sorgo, orquídea, iris, lirio, cebolla, plátano, caña de azúcar, sorgo y palma.
Las células vegetales pueden ser de una planta dicotiledónea seleccionada del grupo que consiste en patata, tabaco, tomate, remolacha, brócoli, yuca, camote, chile, algodón, poinsetta, legumbres, alfalfa, soja, zanahoria, fresa, lechuga, roble, arce, nogal, rosa, menta, calabaza, margarita, y cactus.
Preferiblemente, las células vegetales son transformadas a través de transformación mediada de Agrobacterium. La transformación mediada de Agrobacterium puede basarse en el uso de al menos un vector binario. El método de transformación mediada de Agrobacterium puede usar un primer vector binario y un segundo vector binario. El primer vector binario puede llevar el primer polinucleótido y el segundo vector binario puede llevar el segundo polinucleótido. El segundo vector binario puede comprender al menos un gen marcador seleccionable negativo y un gen virD2 mutado omega, en el que el gen marcador seleccionable negativo está posicionado dentro de la frontera T-ADN derecha y la frontera T-ADN izquierda, y en la que el gen virD2 mutado omega está posicionado dentro de la columna vertebral del segundo vector binario. Preferiblemente, el segundo vector binario comprende tanto un gen marcador seleccionable negativo posicionado dentro de la frontera T-ADN derecha como de la frontera T-ADN izquierda, y un gen virD2 mutado omega posicionado dentro de la columna vertebral del segundo vector binario.
La presente divulgación también describe un P-ADN que consiste esencialmente en, en la dirección 5’ a 3’, una primer secuencia de frontera similar T-ADN una secuencia de polinucleótido deseada vinculada operablemente al promotor, un terminador, y una segunda secuencia de frontera similar T-ADN, en la que las secuencias de frontera similar tienen menos de 100% de identidad de secuencia con las secuencias de frontera T-ADN.
Preferiblemente, las secuencias de frontera similar T-ADN, el promotor, el polinucleótido deseado, y el terminador, están todos aislados a partir de la misma planta, la misma especie planta, o plantas que son sexualmente interfértiles.
El P-ADN puede consistir esencialmente en un gen marcador seleccionable.
Las secuencias de frontera similar T-ADN, el promotor, el polinucleótido deseado, el terminador y el gen marcador seleccionable, pueden ser todos aislados a partir de la misma planta, la misma especie planta, o plantas que son sexualmente interfértiles.
La secuencia del polinucleótido deseada en el P-ADN puede ser una secuencia corriente arriba o corriente abajo de la región que codifica de un gen, en la que la secuencia corriente arriba es una secuencia líder, y en la que la secuencia corriente abajo es una secuencia remolque. Las secuencias de frontera similar T-ADN, el promotor, la secuencia líder, la secuencia remolque, el terminador y el gen marcador seleccionable son todos aislados a partir de la misma planta, la misma especie vegetal, o plantas que son sexualmente interfértiles.
Se divulgan aquí los vectores que comprenden tales constructos P-ADN.
El promotor puede ser un promotor regulable. El promotor regulable puede ser sensible a la temperatura. Preferiblemente, el promotor regulable es un promotor wcs120 de trigo. El promotor puede estar bajo regulación temporal. El promotor puede ser un promotor de carboxilasa. El promotor de carboxilasa puede ser un promotor de carboxilasa de maíz.
El promotor puede ser regulado por uno cualquiera de los ácidos abscísicos, herida, jasmonato de metilo o ácido giberélico. El promotor puede ser un promotor seleccionado de ya sea un promotor de gen Rab 16A, un promotor de gen α-amilasa o un promotor gen pin2. El promotor puede ser un promotor específico de tejido.
La secuencia líder puede ser una región no traducida 5’-de un gen que es endógeno a la célula de la especie vegetal seleccionada. La región 5’ no traducida puede estar corriente arriba de un codón de inicio de un gen que es seleccionado del grupo que consiste en un gen PPO, un gen R1, un gen de la alfa glucano fosforilasa de tipo L o H, un gen de la UDP glucosa glucosiltransferasa, un gen HOS1, gen de la S-adenosilhomocisteína hidrolasa, un gen de la cinamato 4-hidroxilasa clase II, un gen de la cinamoílo-coenzima A reductasa, un gen de la cinamoílo alcohol deshidrogenasa, un gen de la cafeoil coenzima A O-metiltransferasa, un gen del factor de despolimerización de la actina, un gen Nin88, un gen Lol p 5, un gen de alérgeno, un gen de la P450 hidroxilasa, un gen de la ADP-glucosa pirofosforilasa, un gen de la prolina deshidrogenasa, un gen de la endo-1,4-beta-glucanasa, un gen de la zeaxantina epoxidasa, y un gen del 1-aminociclopropano-1-carboxilato sintasa.
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La secuencia remolque puede ser parte de la región no traducida 3’ de un gen que esta corriente abajo de un codón de terminación de un gen seleccionado del grupo que consiste en un gen PPO, un gen R1, un gen de la alfa glucano fosforilasa de tipo L o H, un gen de la UDP glucosa glucosiltransferasa, un gen HOS1, gen de la Sadenosilhomocisteína hidrolasa, un gen de la cinamato 4-hidroxilasa clase II, un gen de la cinamoílo-coenzima A reductasa, un gen de la cinamoílo alcohol deshidrogenasa, un gen de la cafeoil coenzima A O-metiltransferasa, un gen del factor de despolimerización de la actina, un gen Nin88, un gen Lol p 5, un gen de alérgeno, un gen de la P450 hidroxilasa, un gen de la ADP-glucosa pirofosforilasa, un gen de la prolina deshidrogenasa, un gen de la endo-1,4-beta-glucanasa, un gen de la zeaxantina epoxidasa, y un gen del 1-aminociclopropano-1-carboxilato sintasa.
El presente vector puede comprender adicionalmente un elemento espaciador que es ya sea una secuencia intrón Ubi o una secuencia espaciadora GBSS. El vector puede comprender un terminador que es una secuencia terminadora Ubi3 una región no traducida 3’ de un gen de planta endógena.
El vector puede comprender un gen marcador seleccionable vinculado operablemente a un promotor constitutivo y a un gen Cre vinculado operablemente a un promotor inducible, en el que el gen marcador seleccionable y el gen Cre son flanqueados por un primer sitio de reconocimiento de recombinasa y un segundo sitio de reconocimiento de recombinasa. El primer sitio de reconocimiento de recombinasa y el segundo sitio de reconocimiento de recombinasa pueden ser los sitios lox.
El promotor inducible puede ser un promotor sensible a la temperatura, un promotor inducido químicamente, un promotor temporal. El promotor inducible puede ser un promotor Ha hsp17.7 G4, un promotor was120 de trigo, un promotor de gen Rab 16A, un promotor de gen de α-amilasa, un promotor de gen de pin2, un promotor de carboxilasa. Puede comprender adicionalmente un gen marcador derivado de planta. El gen marcador derivado de planta puede ser un gen de sintasa de ácido enolpiruvil-3-fosfoshikimico.
Se proporciona un método para modificar una célula de planta, que comprende integrar una secuencia P-ADN en el genoma de una célula de planta, en el que el P-ADN consiste esencialmente en, en la dirección 5’-a 3’-, una primer secuencia de frontera similar T-ADN, un promotor, una secuencia de polinucleótido deseada vinculada operablemente al promotor, un terminador, y una segunda secuencia de frontera similar T-ADN, en el que las secuencias de frontera similar tienen menos de 100% de identidad de secuencia con secuencias de frontera T-ADN, y en el que las secuencias de frontera similar T-ADN, el promotor, el polinucleótido deseado, un terminador, son todos aislados a partir de o nativas al genoma de la célula de planta, en el que el polinucleótido deseado comprende secuencia sentido y antisentido de una secuencia líder o secuencia remolque que están asociadas con las regiones que no codifican corriente arriba o corriente abajo de un gen en la planta, y en el que la expresión del polinucleótido deseado produce una transcripción de ARN de cadena doble que dirige el gen asociado con el polinucleótido deseado, por lo cual modifica la célula de planta.
También está divulgado un método para modificar una planta, que comprende:
(i)
transfección de al menos una célula en la planta con el vector de la presente invención;
(ii)
selección de una célula que expresa el marcador seleccionable funcional;
(iii)
aislamiento de la célula que expresa el marcador seleccionable funcional;
(iii)
inducción de la expresión del gen Cre funcional en la célula aislada;
(iv)
cultivo de la célula aislada; y
(ii)
observación del fenotipo de células cultivadas; en el que un fenotipo que es diferente a una célula de planta no transfectada indica que la célula de planta ha sido modificada.
Preferiblemente, se realiza el paso de selección de este y otros métodos divulgados aquí identificando que células son resistentes a un antibiótico.
También se divulga un método para identificar una célula de planta objetivo cuyo genoma contiene un P-ADN, que comprende cotransfección de una célula objetivo de planta con el vector descrito aquí y un segundo vector derivado de Agrobacterium que comprende un gen marcador flanqueado por una frontera izquierda T-ADN y una frontera derecha T-ADN y un gen virD2 mutado omega, en el que el P-ADN está integrado en el genoma de la célula objetivo de planta, y de que ninguna parte del segundo vector derivado de Agrobacterium está integrado en el genoma de la célula objetivo del planta. Preferiblemente, el marcador en el segundo vector derivado de Agrobacterium es un gen de neomicina fosfotransferasa.
También se describe un método para identificar una célula de planta objetivo cuyo genoma contiene al menos una parte de un casete de integración, que comprende finalmente selección de células que sobreviven a crecimiento temporal en un medio que contiene kanamicina, en el que los genomas de las células seleccionadas contienen únicamente el casete de integración. La célula de planta objetivo puede estar dentro de una planta. También se divulga una planta que comprende al menos una célula cuyo genoma comprende tal P-ADN.
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5 También se abarca una planta que comprende al menos una célula cuyo genoma es manipulado artificialmente para contener únicamente ácidos nucleicos derivados de plantas, en el que ninguna célula de la planta contiene ácidos nucleicos foráneos integrados en el genoma de la célula.
También se abarca una secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO. 93, en la que el polinucleótido está entre 20 y
10 80 nucleótidos en longitud. En una realización, el polinucleótido está entre 21 y 70 nucleótidos en longitud, entre 22 y 50 nucleótidos en longitud, entre 23 y 40 nucleótidos en longitud, o entre 24 y 30 nucleótidos en longitud.
También se abarca un promotor específico de tubérculos como se muestra en SEQ ID NO. 40.
15 También se describe un método basado en Agrobacterium de producción de células vegetales transgénicas que no contiene un gen marcador seleccionable integrado establemente en un ADN nuclear que comprende:
a. construir un primer vector binario compuesto de un polinucleótido que consiste esencialmente en un gen funcional
deseado vinculado operablemente a secuencias de fronteras T-ADN o fronteras similares T-ADN en los extremos 5’ 20 y 3’ del gen funcional deseado;
b. construir un segundo vector binario compuesto de un gen marcador seleccionable funcional vinculado secuencias de fronteras T-ADN o fronteras similares T-ADN en los extremos 5’ y 3’ del gen marcador seleccionable funcional;
25 c. incubar células de planta con:
i. una cepa de Agrobacterium que lleva el primer y segundo vectores binarios; o
ii. una primera cepa de Agrobacterium que lleva el primer vector binario y una segunda cepa de Agrobacterium que 30 lleva el segundo vector binario;
d. seleccionar células de planta en las que el gen funcional deseado está integrado en el ADN nuclear de planta sin integración del gen marcador seleccionable en el ADN nuclear de la planta seguido por incubación por un periodo de tiempo apropiado en un medio que contiene un agente de selección apropiado.
35 Preferiblemente, el gen marcador seleccionable es un gen de resistencia al herbicida o un gen de resistencia al antibiótico. Preferiblemente, el gen de resistencia antibiótico es el gen nNPTII. Preferiblemente, el gen de resistencia al antibiótico es el gen estructural npt II vinculado operablemente al promotor del gen Ubiquitina-7 y terminador del gen 1 (ADH1) de deshidrogenasa de alcohol de levadura. De acuerdo con este método, se incuban primero las
40 células de planta con la primera cepa de Agrobacterium y posteriormente se incuban con la segunda cepa de Agrobacterium o viceversa.
El primer vector binario puede comprender adicionalmente un gen marcador de integración binaria que puede ser usado para detectar células de planta transformadas establemente con secuencias de columna vertebral de vector
45 binario. Se puede seleccionar el gen marcador de integración de vector binario del grupo que consiste en gen de resistencia al herbicida, gen de resistencia al antibiótico, o NPTII. El segundo vector viario puede comprender adicionalmente una fusión de gen entré los genes de citosina bacteriana desaminasa (codA) y uracilo fosforribosiltransferasa (upp), que están insertados entre las secuencias T-ADN o de frontera similar T-ADN, y se exponen las células de planta a 5-fluorocitosina seguido por incubación con la primera y segundas cepas de
50 Agrobacterium con el fin de seleccionar contra aquellas células de planta transformadas con el segundo vector binario.
El vector binario secundario puede comprender adicionalmente un gen que reduce la probabilidad de integración de columna vertebral. Tal gen puede ser el gen virD2 omega mutado, en el que el gen virD2 omega mutado reduce la
55 frecuencia integración del gen marcador seleccionable en el ADN nuclear de planta.
También se divulga una secuencia de nucleótidos aislada que comprende el promotor GBSS aislado de S. tuberosum. Preferiblemente, esta secuencia de nucleótidos aislada tiene la secuencia de nucleótidos que es SEQ ID. NO. 6 o 13.
60 En un primer aspecto de la invención, se proporciona un método de reducción de la acumulación de acrilamida producida por la reacción Maillard durante fritura, que comprende la transformación en un genoma de planta de cultivo un casete de expresión que comprende una secuencia que, después de la expresión, (a) silencia un gen R1 endógeno, (b) silencia un gen de fosforilasa de tipo L endógeno, y/o (c) sobre expresa un gen inhibidor de invertasa.
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Las realizaciones preferidas de la invención en uno de sus diferentes aspectos están como se describen abajo o como se define en las reivindicaciones secundarias.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Ilustración esquemática de algunos vectores de P-ADN usados en la presente invención. La región de P-ADN está indicada como una caja gris. "ipt" = casete de expresión para el gen; "npt" = casete de expresión para el gen nptII; "mPPO" = casete de expresión para un gen PPO modificado; "INH" = casete de expresión para un gen inhibidor de invertasa; "GUS" = casete de expresión para el gen GUS; "LPPO" = casete de expresión para una copia sentido y antisentido del líder asociado con un gen PPO; "LPH" = casete de expresión para una copia sentido y antisentido del líder asociado con un gen de fosforilasa; "Alf" = casete de expresión para un homólogo Alfin de patata. Véase el texto para detalles.
Figura 2. Casetes de expresión de gen libre
Figura 3. Alineamiento de proteínas inhibidoras de invertasa de patata y tabaco. "St" = Solanum tuberosum (patata); "Nt" = Nicotiana tabacum (tabaco)
Figura 4. Alineamiento de remolques asociados con varios genes PPO.
Figure 5. Ilustraciones esquemáticas de algunos vectores de LifeSupport en la presente invención. "codA" es un casete de expresión para el gen codA; "codA::upp" es un casete de expresión para el gen fusionado a upp; "ΩvirD2" es un casete de expresión para el gen ΩvirD2.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
La estrategia de "reproducción precisa" descrita aquí mejora el desempeño agronómico, valor nutricional, y características de salud de plantas y cultivos sin introducir ácido nucleico desconocido, o ácido nucleico de una especie foránea en un genoma de especie vegetal, y sin producir fenotipos indeseados o efectos secundarios dañinos.
De esta forma, se proporciona una planta transgénica, y métodos para producir tal planta que no integran ácidos nucleicos de especies no vegetales en el genoma de las plantas. Los ácidos nucleicos, promotores, elementos regulatorios, otras secuencias de gen que no codifican, marcadores, polinucleótidos, y genes que están integrados en el genoma de la planta seleccionada están todos aislados preferiblemente a partir de la planta que va a ser transformada, plantas de la misma especie que van a ser transformadas, o plantas que son sexualmente interfértiles con la planta que va a ser transformada. Se pueden mutar tales ácidos nucleicos "nativos", modificados o covinculados con otros ácidos nucleicos nativos en un casete de expresión y reintegrados en el genoma de la planta seleccionada, de acuerdo con los métodos descritos aquí. En consecuencia, el genotipo y fenotipo de la planta transgénica es alterado usando únicamente aquel ácido nucleico propio de planta seleccionado, o que usa ácido nucleico de una planta que es sexualmente compatible con la planta seleccionada.
Para facilitar la producción de tales plantas transgénicas, se hace uso del hecho de que no todos los vectores T-ADN usados en la transformación mediada de Agrobacterium están realmente integrados en el genoma de la planta; es decir, mientras un vector puede ser absorbido por la célula de planta, puede no ocurrir un evento de integración real. De acuerdo con la presente invención, se puede usar tal vector para llevar un gen marcador seleccionable en una célula de planta. Se puede entonces cribar las células de planta para determinar si el marcador se ha integrado establemente en el genoma de la planta mediante la determinación de cuánto tiempo se expresa el gen marcador. En consecuencia, son deseadas las células de planta que únicamente se expresan transitoriamente porque estas representan células que se tomaron, pero no integraron en sus genomas, el gen marcador seleccionable.
De esta forma, mediante cotransformación de una planta con tal “vector marcador” y también con otro vector que contiene el gen nativo deseado o polinucleótido, también se pueden seleccionar células vegetales que tomaron ambos vectores y, de aquellos, se determinó que células poseen genomas que contienen únicamente el gen deseado o polinucleótido. Se puede modificar el “vector marcador” para reducir adicionalmente la posibilidad de que el marcador sea integrado en el genoma de la planta. La presente descripción proporciona tales "vectores marcadores" en la forma de vectores de “LifeSupport”.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos científicos y técnicos usados aquí tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien de destreza ordinaria en la técnica a la que está invención pertenece. Generalmente, la nomenclatura usada aquí, a los procedimientos de laboratorio en el cultivo de célula, genética molecular, y química de ácido nucleico e hibridización descrita aquí, son aquellos bien conocidos y comúnmente empleados en la técnica. Se usan técnicas estándar para métodos de ácido nucleico recombinante, síntesis de polinucleótidos, cultivo microbiano, cultivo celular, cultivo de tejido, transformación, transfección, transducción, química analítica, química sintética orgánica, síntesis químicas, análisis químico, y formulación y entrega farmacéutica. Generalmente, se realizan reacciones enzimáticas y pasos de purificación y/o aislamiento de acuerdo
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a especificaciones de los fabricadores. Las técnicas y procedimientos son generalmente realizadas de acuerdo con metodologías convencionales divulgadas, por ejemplo, en Molecular cloning a laboratory manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), y Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons, Baltimore, MD (1989).
Secuencia del aminoácido: cómo se usa aquí, incluye un oligopéptido, péptido, polipéptido, o proteína y fragmentos de los mismos, que son aislados de, nativos a, o que ocurren naturalmente en una planta o están hechos sintéticamente pero comprenden la secuencia de ácido nucleico de la contraparte endógena.
Manipulado artificialmente: cómo se usa aquí, "manipulado artificialmente" indica mover, organizar, operar o controlar por medio de las manos o por medios mecánicos o medios recombinantes, tal como por técnicas de ingeniería genética, una planta o célula de planta, de manera que produce una planta o célula de planta que tiene un fenotipo y/o genotipo diferente biológico, bioquímico, morfológico o fisiológico en comparación con contrapartes no manipuladas, que ocurren naturalmente.
Propagación asexual: que produce progenie generado en la planta completa a partir de esquejes de hoja, esquejes de vastago, estaquillas de raíz, ojos de tubérculos, estolones, protoplastos de células de planta individuales, callos y similares, que no implican fusión de gametos.
Columna vertebral: secuencia de ácido nucleico de un vector binario que excluye la secuencia T-ADN o P-ADN prevista para la transferencia.
Secuencias de frontera y frontera similar: "secuencias de frontera" son secuencias específicas derivadas de Agrobacterium. Típicamente, una secuencia de frontera izquierda y una secuencia de frontera derecha flanqueada a un T-ADN y ambas funcionan como sitios de reconocimiento para reacciones de formación de muescas catalizadas de virD2. Tal actividad libera ácido nucleico que está posicionado entre tales fronteras. Véase la Tabla 2 abajo para ejemplos de secuencias de frontera. El ácido nucleico liberado, acomplejado con virD2 y virE2, es dirigido a núcleos celulares de planta donde el ácido nucleico está usualmente integrado en el genoma de la célula de planta. Usualmente, se usan dos secuencias de frontera, una de frontera izquierda y una de frontera derecha, para integrar una secuencia de nucleótidos que está localizada entre ellas en otra secuencia de nucleótida. También es posible usar únicamente una frontera, o más de dos fronteras, para lograr la integración de un ácido nucleico deseado de tal manera.
En consecuencia, una secuencia de "frontera similar" está aislada a partir de la especie vegetal seleccionada que va a ser modificada, o de una planta que es sexualmente compatible con la especie vegetal que va a ser modificada, y funciona como las secuencias de frontera de Agrobacterium. Es decir, una secuencia de frontera similar promueve y facilita la integración de un polinucleótido al cual está vinculado. Un ADN de planta, es decir, P-ADN, como se describió aquí preferiblemente contiene secuencias de frontera similar.
Una secuencia de frontera similar de un P-ADN está entre 5-100 pb en longitud, 10-80 pb en longitud, 15-75 pb en longitud, 15-60 pb en longitud, 15-50 pb en longitud, 15-40 pb en longitud, 15-30 pb en longitud, 16-30 pb en longitud, 20-30 pb en longitud, 21-30 pb en longitud, 22-30 pb en longitud, 23-30 pb en longitud, 24-30 pb en longitud, 25-30 pb en longitud, o 26-30 pb en longitud.
Las secuencias de frontera similar pueden ser aisladas a partir de cualquier planta, tal como patatas o trigo. Véase SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 34, para secuencias que contienen, en cada extremo, las secuencias de frontera similar aisladas a partir de patata y trigo respectivamente. De esta forma, una secuencia de frontera izquierda o derecha de P-ADN de uso está aislada de y/o nativa al genoma de una planta que va a ser modificada. Una secuencia de frontera similar de P-ADN no es idéntica en secuencias de nucleótidos a cualquier secuencia conocida de frontera de T-ADN derivada Agrobacterium. De esta forma, una secuencia de frontera similar de P-ADN puede poseer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o más nucleótidos que son diferentes de una secuencia de frontera de T-ADN de una especie de Agrobacterium, tal como Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. Es decir, una secuencia de frontera, o frontera similar de P-ADN tiene al menos 95%, al menos 90%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 60% o al menos 50% de identidad de secuencia con una secuencia de frontera de T-ADN de una especie de Agrobacterium, tal como Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes, pero no 100% de identidad de secuencia. Como se usa aquí, son intercambiables los términos descriptivos "frontera de PADN" y "frontera similar de P-ADN".
Una secuencia de frontera de P-ADN nativa es mayor que o igual a 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52%, 51% o 50% similar en secuencias de nucleótidos a una secuencia de frontera de T-ADN de Agrobacterium. Una secuencia de frontera similar puede, por lo tanto, es aislada a partir de un genoma de planta y es modificada o mutada para cambiar la eficiencia por la cual estas son capaces de integrar una secuencia de nucleótidos en otra secuencias de nucleótidos. Se pueden añadir o incorporar otras secuencias de polinucleótidos dentro de una secuencia de frontera similar. De esta forma, se puede modificar una frontera izquierda de P-ADN o una frontera derecha de P-ADN de manera que poseen sitios de clonación múltiple 5’-y 3’-, o sitios de restricción adicional. Una secuencia de frontera de P-ADN puede ser modificada para incrementar la probabilidad que el ADN de columna vertebral del vector que acompaña no esté integrado en el genoma de la planta.
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5 La Tabla 2 abajo describe las secuencias de secuencias de frontera de T-ADN conocidas identificadas aquí como secuencias de frontera similar. Ninguna de estas secuencias identificadas como de "de frontera similar" en la Tabla 2 han sido identificadas previamente como que tienen una estructura de frontera similar de T-ADN. Se aislaron las secuencias de frontera similar de patatas por los métodos descritos aquí usando cebadores degenerados en reacciones de cadena de polimerasa de ADN genómico de patata. Se abarca el uso de cualquier secuencia de
10 frontera similar de P-ADN para transferir un polinucleótido covinculado en el genoma de una célula de planta.
De hecho, se abarca cualquier secuencia de frontera similar que tiene la estructura de secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 93: ANGATNTATN6GT (SEQ ID NO. 93), donde "N" es cualquier nucleótido, tal como aquellos representados por "A," "G," "C," o "T." Esta secuencia representa la secuencia de consenso de ácidos nucleicos de
15 frontera similar identificados aquí.
Tabla 2. Secuencias de "Frontera" y "Frontera similar"
Fronteras de T-ADN de Agrobacterium
TGACAGGATATATTGGCGGGTAAAC (SEQ ID NO.41)
Cepas de nopalina de Agrobacterium (RB)
TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAAC (SEQ ID NO.42)
Cepas de nopalina de Agrobacterium (LB)
TGGCAGGATATATACCGTTGTAATT (SEQ ID NO.43)
Cepas de octopina de Agrobacterium (RB)
CGGCAGGATATATTCAATTGTAATT (SEQ ID NO.44)
Cepas de octopina de Agrobacterium (LB)
Fronteras de T-ADN de Agrobacterium
TGGTAGGATATATACCGTTGTAATT (SEQ ID NO.45)
Mutante LB
TGGCAGGATATATGGTACTGTAATT (SEQ ID NO.46)
Mutante LB
YGRYAGGATATATWSNVBKGTAAWY (SEQ ID NO.47)
Patrón de frontera
Secuencias de frontera similar
CGGCAGGATATATCCTGATGTAAAT (SEQ ID NO.48)
R. leguminosarum
TGGCAGGAGTTATTCGAGGGTAAAC (SEQ ID NO.49)
T. tengcongensis
TGACAGGATATATCGTGATGTCAAC (SEQ ID NO.50)
Arabidopsis thaliana
GGGAAGTACATATTGGCGGGTAAAC (SEQ ID NO.51)
A. thaliana CHR1v07142002
TTACAGGATATATTAATATGTATGA (SEQ ID NO.52)
Oryza sativa AC078894
TAACATGATATATTCCCTTGTAAAT (SEQ ID NO.53)
Clon HQ0089 de Homo sapiens
TGACAGGATATATGGTAATGTAAAC (SEQ ID NO.54)
patata (secuencia de frontera izquierda)*
TGGCAGGATATATACCGATGTAAAC (SEQ ID NO.55)
patata (secuencia de frontera derecha)*
Y= C o T; R= A o G; K= G o T; M= A o C; W= A o T; S= C o G; V= A, C, o G; B= C, G, o T. Los números de acceso para la secuencias de frontera similar son: secuencias genómica de 10 BAC OSJNBa0096G08 de cromosoma de Oryza sativa (AC078894.11); cromosoma de Arabidopsis thaliana 3 (NM_114337.1); cromosoma de Arabidopsis thaliana c 1 (NM_105664.1); cepa MB4T de T. tengcongensis, sección 118 de 244 de genoma completo (AE013091.1); clon HQ0089 de Homo sapiens (AF090888.1); clon de Rhizobium: rhiz98e12.qlk. *secuencias de frontera derecha e izquierda de patata se obtuvieron y aislaron de acuerdo con los métodos inventivos descritos aquí.
20 ADN vehículo: un "ADN vehículo" es un segmento de ADN que es usado para llevar ciertos elementos genéticos y entregarlos en una célula de planta. En transferencia de ADN foráneo convencional, este ADN vehículo es usualmente el T-ADN de Agrobacterium, delineado por secuencias de frontera. El ADN vehículo descrito aquí se obtiene a partir de las especies vegetales seleccionadas que van a ser modificadas y contiene extremos que pueden ser estructuralmente y funcionalmente diferentes de las fronteras de T-ADN pero comparten con tales T-ADN la
25 habilidad de soportar ambas la transferencia de ADN de Agrobacterium al núcleo de células de planta o ciertas otras eucariotas y la integración posterior de este ADN en el genoma de tales eucariotas.
Que consiste esencialmente en: una composición "que consiste esencialmente en" ciertos elementos está limitada a la inclusión de aquellos elementos, así como a aquellos elementos que no afectan materialmente las características 30 básicas y novedosas de la composición inventiva. De esta forma, siempre que la composición no afecte las
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características básicas y novedosas de la presente invención, es decir, no contiene ADN foráneo que no es de especies vegetales seleccionadas o una planta que es sexualmente compatible con las especies vegetales seleccionadas, entonces aquella composición puede ser considerada un componente de una composición inventiva que está caracterizada por lenguaje de "que consiste esencialmente en".
Cebador degenerado: un "cebador degenerado" es un oligonucleótido que contiene suficientes variaciones de nucleótidos que pueden ajustarse a los desajustes de base cuando se hibridizan a secuencias de homología similar, pero no exacta.
Dicotiledónea (dicot): una planta que florece cuyos embriones tienen dos hojas de semilla o cotiledones. Los ejemplos de dicots incluyen, pero no están limitados a, tabaco, tomate, patata, batata, tapioca, legumbres que incluyen alfalfa y soja, zanahoria, fresa, lechuga, roble, arce, nogal, color de rosa, menta, calabaza, margarita, y cactus.
Secuencias regulatorias: se refiere a aquellas secuencias que son estándar y conocidas por aquellos en la técnica, que pueden estar incluidas en los vectores de expresión para aumentar y/o maximizar la transcripción de un gen de interés o traducción del ARN resultante en un sistema de planta. Esto incluye, pero no está limitado a, promotores, secuencias de señal de exportación de péptidos, intrones, poliadenilación, y sitios de terminación de transcripción. Son también conocidos generalmente en la técnica métodos de modificación de constructos de ácido nucleico para aumentar los niveles de expresión en plantas (véase, por ejemplo Rogers et al., 260 J. Biol. Chem. 3731-38, 1985; Cornejo et al., 23 Plant Mol. Biol. 567: 81,1993). En la ingeniería de un sistema de planta para afectar la rata de transcripción de una proteína, puede tener un impacto varios factores conocidos en la técnica, que incluyen secuencias regulatorias tales como secuencias que actúan positivamente o negativamente, potenciadores y silenciadores, así como la estructura de cromatina. La presente invención proporciona que se puede usar al menos uno de estos factores en ingeniería de plantas para expresar una proteína de interés. Las secuencias regulatorias de la presente invención son elementos genéticos nativos, es decir, están aislados de las especies vegetales seleccionadas que van a ser modificadas.
Foráneo: "foráneo", con respecto a un ácido nucleico, indica que aquel ácido nucleico es derivado de organismos no vegetales, o derivado de una planta que no es la misma especie como la planta que va a ser transformada o no es derivado de una planta que no es interfértil con la planta que va a ser transformada, no corresponde a las especies de la planta objetivo.
De acuerdo con la presente descripción, ADN o ARN foráneo representa ácidos nucleicos que están ocurriendo naturalmente en la composición genética de hongos, bacterias, virus, mamíferos, peces o aves, pero que no están ocurriendo naturalmente en la planta que va a ser transformada. De esta forma, un ácido nucleico foráneo es uno que codifica, por ejemplo, un polipéptido que no es producido naturalmente por la planta transformada. Un ácido nucleico foráneo no tiene que codificar un producto de proteína. De acuerdo con la presente descripción, una planta transgénica deseada es una que no contienen ningún ácido nucleico foráneo integrado en su genoma.
Los elementos genéticos nativos, por otra parte, puede ser incorporados e integrados en un genoma de especie vegetal seleccionada de acuerdo con la presente descripción. Los elementos genéticos nativos son aislados de plantas que pertenecen a las especies vegetales seleccionadas o de plantas que son sexualmente compatibles con las especies vegetales seleccionadas. Por ejemplo, ADN nativo incorporado en patata cultivada (Solanum tuberosum) puede ser derivado de cualquier genotipo de S. tuberosum o cualquier genotipo de especie de patata silvestre que es sexualmente compatible con S. tuberosum (por ejemplo, S. demissum).
Gen: "gen" se refiere a la región que codifica y no incluye secuencias de nucleótidos que son 5’ o 3’ para aquella región. Un gen funcional es la región que codifica vinculada operablemente a un promotor o terminador.
Reorganización genética: se refiere a la reasociación de elementos genéticos que pueden ocurrir espontáneamente in vivo así como in vitro que introducen una nueva organización de material genético. Por ejemplo, el empalme junto de polinucleótidos en diferentes loci cromosómicos, puede ocurrir espontáneamente in vivo durante tanto el desarrollo de la planta como la recombinación sexual. En consecuencia, la recombinación de elementos genéticos por técnicas de modificación genética no naturales in vitro es similar a los eventos de recombinación que también ocurren a través de recombinación sexual in vivo.
En marco: se traducen tripletes nucleótidos (codones) en una secuencia de aminoácidos naciente de la proteína recombinante deseada en una célula de planta. Específicamente, la presente invención contempla un primer ácido nucleico vinculado en el marco de lectura a un segundo ácido nucleico, en el que la primera secuencias de nucleótidos es un gen y un segundo nucleótido es un promotor o elemento regulatorio similar.
Integrar: se refiere a la inserción de una secuencia de ácido nucleico de una especie planta seleccionada, o de una planta que es de la misma especie como la planta seleccionada, o de una planta que es sexualmente compatible con la especie vegetal seleccionada, en el genoma de una célula de una especie vegetal seleccionada. "Integración" se refiere a la incorporación de únicamente elementos genéticos nativos en un genoma de célula de planta. Con el
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fin de integrar un elemento genético nativo, tal como por recombinación homóloga, la presente divulgación puede "usar" ADN no nativo como un paso en tal procedimiento. De esta forma, la presente descripción distingue entre el "uso de" una molécula de ADN particular y la “integración" de una molécula de ADN particular en un genoma de célula de planta.
Introducción: como es usado aquí, se refiere a la inserción de una secuencia de ácido nucleico en una célula, por métodos que incluyen infección, transfección, transformación o transducción.
Aislado: "aislado" se refiere a cualquier ácido nucleico compuesto que es separado físicamente de su ambiente normal, nativo. El material aislado puede ser manipulado en una solución adecuada que contiene, por ejemplo, un solvente, un amortiguador, un ion, u otro componente, y puede estar en forma purificada, o no purificada.
Líder: secuencia transcrita pero no traducida que precede (o 5’ a) un gen.
Vector de LifeSupport: un vector de LifeSupport es un constructo que contiene un gen marcador seleccionable expresable, tal como un marcador de fosfotransferasa de neomicina, que está posicionado entre fronteras T-ADN o fronteras similares de T-ADN. El vector de LifeSupport puede ser modificado para limitar integración de tal marcador, así como otros polinucleótidos, que están situados entre las secuencias de frontera o frontera similar, en un genoma de planta. Por ejemplo, un vector de LifeSupport puede comprender un virD2, fusión codA::upp, o cualquier combinación de tales elementos genéticos. De esta forma, una proteína virD2 modificada seguirá soportando la transferencia de T-ADN a un núcleo de planta pero limitará la eficiencia de la integración genómica posterior de T-ADN (Shurvinton et al., Proc Natl Acad Sci EEUU, 89: 11837-11841, 1992; Mysore et al., Mol Plant Microbe Interact,
11: 668-683, 1998). Alternativamente, se puede usar la fusión de gen de codA::upp como marcador seleccionable negativo antes de la regeneración. En un constructo preferido, el vector de LifeSupport comprende el marcador npt vinculado operablemente al elemento terminador de ADH de levadura.
Monocotiledónea (monocot): una planta que florece cuyos embriones tienen un cotiledón u hoja de semilla. Ejemplos de monocots incluyen, pero no están limitados a césped de turba, maíz, arroz, avena, trigo, cebada, sorgo, orquídea, iris, lirio, cebolla, y palma.
Nativo: un elemento genético "nativo" se refiere a un ácido nucleico que existen naturalmente en, originado de, o pertenece al genoma de una planta que va a ser transformada. De esta forma, cualquier molécula de ácido nucleico, gen, polinucleótido, ADN, ARN, mARN, o cADN que es aislada ya sea del genoma de una planta o especie vegetal que va a ser transformada o es aislada de una planta o especie que es sexualmente compatible o interfértil con la especie vegetal que va a ser transformada, es "nativa" a, es decir, autóctona a, la especie vegetal. En otras palabras, un elemento genético nativo representa todo el material genético que es accesible para los reproductores de plantas para la mejora de plantas a través de reproducción de planta clásica. Cualquier variante de un ácido nucleico nativo es considerada "nativa" de acuerdo con la presente invención. A este respecto, un ácido nucleico "nativo" también puede ser aislado a partir de una planta o especie compatible sexualmente de las mismas y modificado o mutado de manera que la variante resultante es mayor o igual que 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, o 60% similar en la secuencia de nucleótidos al ácido nucleico no modificado, nativo aislado de una planta. Una variante de ácido nucleico nativo también puede ser menos de aproximadamente 60%, menos de aproximadamente 55%, o menos de aproximadamente 50% similar en la secuencia de nucleótidos.
Un ácido nucleico "nativo" aislado de una planta también puede codificar una variante del producto de proteína que ocurre naturalmente transcrito y traducido de aquel ácido nucleico. De esta forma, un ácido nucleico nativo puede codificar una proteína que es mayor que o igual a 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, o 60% similar en la secuencia de aminoácido a la proteína no modificada, nativa expresada en la planta de la cual el ácido nucleico fue aislado.
Ácido nucleico que ocurre naturalmente: esta fase indica que el ácido nucleico se encuentra dentro del genoma de una especie vegetal seleccionada y puede ser una molécula de ADN o una molécula de ARN. La secuencia de un sitio de restricción que está normalmente presente en el genoma de una especie planta puede ser diseñada en una molécula de ADN exógena, tal como un vector u oligonucleótido, a pesar que el sitio de restricción no fue aislado físicamente de aquel genoma. De esta forma, la presente invención permite la creación sintética de una secuencia de nucleótidos, tal como una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción, siempre y cuando la secuencia ocurra naturalmente en el genoma de la especie vegetal seleccionada o en una planta que es sexualmente compatible con la especie vegetal seleccionada que va a ser transformada.
Vinculado operablemente: que combina dos o más moléculas de tal manera que en combinación estas funcionan apropiadamente en una célula de planta. Por ejemplo, un promotor está vinculado operablemente a un gen estructural cuando el promotor controla la transcripción del gen estructural.
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P-ADN: de acuerdo con la presente invención, P-ADN ("planta-ADN") es aislado de un genoma de planta y comprende en cada extremo, o únicamente en un extremo, una secuencia de frontera similar de T-ADN. La secuencia de frontera similar preferiblemente comparte al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90% o al menos 95%, pero menos de 100% de identidad de secuencia, con una secuencia de frontera de T-ADN de una especie de Agrobacterium, tal como Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. De esta forma, los P-ADN pueden ser usados en cambio de los T-ADN para transferir una secuencia de nucleótidos de Agrobacterium a otra secuencia de polinucleótidos. Se puede modificar el P-ADN para facilitar la transición y debe preferiblemente no codificar naturalmente proteínas o partes de proteínas. El P-ADN está caracterizado en que contiene, en cada extremo, al menos una secuencia de frontera, indicada como ya sea una "secuencia de frontera de P-ADN " o "secuencia de frontera similar de P-ADN", que son términos intercambiables. Véase la definición de una "secuencia de frontera" y "frontera similar" anteriormente. Un P-ADN también puede ser considerado como una secuencia de "T-ADN similar", véase la definición abajo.
Planta: incluye las angiospermas y gimnospermas, como patata, tomate, tabaco, alfalfa, lechuga, zanahoria, fresa, remolacha dulce, yuca, batata, soja, maíz, césped de turba, trigo, arroz, cebada, sorgo, avena, roble, eucalipto, nogal, y la palma. De esta forma, una planta puede ser un monocot o un dicot. La palabra "planta", como es usada aquí, también abarca células de planta, semilla, progenie de planta, propágulos ya sean generados sexualmente o asexualmente, y descendientes de cualquiera de éstos, tales como esquejes o semillas. Las células de planta incluyen cultivos de suspensión, callo, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen, semillas y microsporas. Las plantas pueden estar en varias etapas de maduración y pueden ser desarrolladas en un cultivo líquido o sólido, o en medios de suelo o adecuados en materas, invernaderos o campos. La expresión de una secuencia líder, un remolque o gen introducido en plantas puede ser transeúnte o permanente. Una "especie vegetal seleccionada" puede ser, pero no está limitada a, una especie de una cualquiera de estas "plantas."
Reproducción precisa: se refiere a la mejora de plantas por introducción estable de ácidos nucleicos, tal como genes nativos y elementos regulatorios aislados de la especie vegetal seleccionada, o de otra planta en la misma especie como la planta seleccionada, o de especies que son compatibles sexualmente con las especies vegetales seleccionadas, en células de planta individuales, y regeneración posterior de estas células de planta modificadas genéticamente en plantas completas. Ya que no se incorpora permanentemente ácido nucleico desconocido o foráneo en el genoma de la planta, la tecnología hace uso del mismo material genético que también es accesible a través de reproducción de planta convencional.
Especies vegetales: el grupo de plantas que pertenece a diferentes especies vegetales de nombre oficial que muestran al menos alguna compatibilidad sexual.
Transformación de planta y cultivo celular: se refiere ampliamente al procedimiento por el cual las células de planta son modificadas genéticamente y transferidas a un medio de cultivo de planta apropiado para mantenimiento, crecimiento adicional, y/o desarrollo adicional.
Recombinante: como es usado aquí, describe ampliamente diferentes tecnologías por las cuales se pueden genes, se puede secuenciar ADN, y se pueden producir productos de proteína. Como es usado aquí, el término también describe proteínas que han sido producidas después de la transferencia de genes en las células de sistemas anfitriones de planta.
Marcador seleccionable: un "marcador seleccionable" es típicamente un gen que codifica para una proteína que confiere algún tipo de resistencia a un antibiótico, herbicida o compuesto tóxico, y es usado para identificar eventos de transformación. Los ejemplos de marcadores seleccionables incluyen el gen de la estreptomicina fosfotransferasa (spt) que codifica resistencia a estreptomicina, el gen de fosfomanosa isomerasa (pmi) que convierten manosa-6fosfato en fructosa-6-fosfato; el gen de la neomicina fosfotransferasa (nptII) que codifica kanamicina y la resistencia a geneticina, el gen de la higromicina fosfotransferasa (hpt o aphiv) que codifica resistencia a higromicina, genes de acetolactato sintasa (ALS) que codifican resistencia a herbicidas de tipo sulfonlurea, genes que codifican resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de glutamina sintasa, tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar), u otros genes similares conocidos en la técnica.
Supresión de sentido: reducción en expresión de un gen endógeno por expresión de una o más copias adicionales de todo o parte de aquel gen en plantas transgénicas.
T-ADN-similar: una secuencia "T-ADN-similar" es un ácido nucleico que es aislado de una especie vegetal seleccionada, o de una planta que es sexualmente compatible con la especie vegetal seleccionada, y que comparte al menos 75%, 80%, 85%, 90%, o 95%, pero no 100%, de identidad de secuencia con T-ADN de especies de Agrobacterium. La secuencia de T-ADN-similar puede contener una o más secuencias de frontera o frontera similar donde cada una es capaz de integrar una secuencia de nucleótidos en otro polinucleótido. Un "P-ADN," como es usado aquí, es un ejemplo de una secuencia de T-ADN-similar.
Remolque: la secuencia transcrita pero no traducida siguiendo (o 3’a) un gen.
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ADN transcrito: ADN que comprende tanto un gen como la secuencia líder no traducida y remolque que está asociada con aquel gen, que está transcrita como un mARN individual por la acción del promotor que precede.
Terminadores de transcripción y traducción: los vectores de expresión descritos aquí típicamente tienen una región de terminación de transcripción en el extremo opuesto de la región regulatoria de iniciación de transcripción. La región de terminación de transcripción puede ser seleccionada, para estabilidad del mARN para mejorar la expresión y/o para la adición de colas de poliadenilación añadidas al producto de transcripción de gen (Alber & Kawasaki, Mol. & Appl. Genetics 4: 19-34, 1982). Las regiones de terminación de transcripción ilustrativas incluyen la secuencia E9 del gen RBCS de arveja (Mogen et al., Mol. Cell Biol., 12: 5406-14, 1992) y las señales de terminación de diferentes genes de ubiquitina.
Transformación de células de planta: un procedimiento por el cual el ADN es integrado establemente en el genoma de una célula de planta. "Establemente" se refiere a la retención permanente, o no transeúnte y/o expresión de un polinucleótido en y por un genoma celular. De esta forma, un polinucleótido integrado establemente es uno que es fijo dentro de un genoma celular transformado y puede ser replicado y propagado a través de progenie sucesiva de la célula o planta transformada resultante. La transformación puede ocurrir bajo condiciones naturales o artificiales que usa diferentes métodos bien conocidos en la técnica. La transformación puede basarse en un método conocido para la inserción de secuencias de ácido nucleico en la célula anfitriona procariota o eucariota, que incluyen protocolos de transformación mediada de Agrobacterium, infección viral, bigotes, electroporación, choque térmico, lipofección, tratamiento con polietilenglicol, microinyección, y bombardeo de partículas.
Transgén: un gen que será insertado en un genoma anfitrión, que comprende una región que codifica proteína. En el contexto de la presente descripción, se aíslan los elementos que comprenden el transgén del genoma anfitrión.
Planta transgénica: una planta modificada genéticamente que contiene al menos un transgén.
Uso/Uso de: la presente descripción vislumbra el uso de ácidos nucleicos de especies diferentes a aquellas de las especies vegetales seleccionadas que van a ser transformadas para facilitar la integración de elementos genéticos nativos en un genoma de planta de seleccionada, siempre que tal ácido nucleico foráneo no está integrado establemente en el genoma de la misma planta anfitriona. Por ejemplo, el plásmido, vector o constructo que clona en el que se clonan, se posicionan o manipulan elementos genéticos nativos, pueden ser derivados de una especie diferente a aquella de la cual se derivaron los elementos genéticos nativos.
Variante: una "variante," como es usado aquí, se entiende para indicar una secuencia de nucleótidos o de aminoácido que se desvía de lo normal, o dadas, secuencias de nucleótidos o aminoácidos de una proteína o gen particular. Los términos, "isoforma," "isotipo," y "análogo" también se refieren a formas "variantes" de una secuencia de nucleótidos o de aminoácido. Una secuencia de aminoácido que es alterada por la adición, eliminación o sustitución de uno o más aminoácidos, o un cambio en la secuencia de nucleótidos, puede ser considerada una secuencia "variante". La variante puede tener cambios "conservadores", en los que un aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares, por ejemplo, reemplazo de leucina con isoleucina. Una variante puede tener cambios "no conservadores", por ejemplo, reemplazo de una glicina con un triptófano. Las variaciones menores análogas pueden también incluir eliminaciones o inserciones de aminoácidos, o ambas. Se puede encontrar la orientación en la determinación de que residuos pueden ser sustituidos, insertados, o eliminados usando programas de ordenador bien conocidos en la técnica tal como software Vector NTI Suite (InforMax, MD).
Vectores de P-ADN
Los métodos de transformación mediada de Agrobacterium son los medios preferidos de incorporación de ADN recombinante en células de planta. De acuerdo con la presente descripción, se desarrolló un vector binario para producir plantas de patatas modificadas genéticamente que contienen únicamente ácidos nucleicos de patata nativos. tal vector difiere de los vectores convencionales, de transformación mediada de Agrobacterium en tres formas: (1) en cambio de una secuencia de T-AND derivada de Agrobacterium delineada por las fronteras de T-ADN, el presente vector contiene un fragmento de ADN de planta nativo (P-ADN) que es flanqueado por las secuencias de frontera similar, que soportan transferencia de P-ADN de Agrobacterium a células de planta aunque son estructuralmente y funcionalmente diferentes de las fronteras de T-ADN, (2) la columna vertebral del presente vector puede contener un marcador que, si está integrado en el genoma de las células de planta, previene que estas células se desarrollen en plantas maduras, y (3) el presente vector no contiene un gen marcador seleccionable foráneo entre terminal de P-ADN.
Se muestra aquí, sorprendentemente, que los fragmentos de P-ADN flanqueados por las secuencias de frontera similar soportan la transferencia de ADN de Agrobacterium en células de planta. Se puede aislar el P-ADN del genoma de cualquier planta mediante uso de cebadores que están diseñados en la base de homología entre el terminal de fronteras de P-ADN de patata y de T-ADN convencional. Tales fragmentos pueden ser entonces probados y, si son eficaces, usarlos para transformar aquella planta con ADN nativo exclusivamente. También es posible buscar bases de datos genómicas de planta para fragmentos de ADN para regiones que muestran
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homología con fronteras de T-ADN mediante el uso de programas tales como ’blastn’ (Altschul et al., J Mol. Biol 215: 403-10, 1990). Los P-ADN identificados pueden ser modificados para incrementar su utilidad. Por ejemplo, se pueden eliminar fragmentos internos de los P-ADN aislados y se pueden añadir sitios de restricción para facilitar la clonación. También puede ser eficaz introducir mutaciones de punto en las secuencias terminales para hacer el P-ADN más efectivo en la transferencia de ADN.
Se puede insertar cualquier casete expresión de gen entre las secuencias de frontera similar de P-ADN. Para transformación de patatas, tal casete de expresión puede consistir en un promotor de patata, vinculado operablemente a un gen de patata y/o secuencia líder o remolque asociada con aquel gen, y seguido por un terminador de patata. El casete de expresión puede contener elementos genéticos de patata adicionales tal como una secuencia de péptido de señal fusionada en marco al extremo 5’ del gen, y un intrón de patata que puede, por ejemplo, ser ubicado entre el promotor y un gen de interés para mejorar la expresión. Para transformación de trigo con un P-ADN modificado, todos los elementos genéticos que son insertados en el P-ADN de trigo, que incluyen el propio P-ADN serán derivados de trigo o especies vegetales que son sexualmente compatibles con trigo.
Otra forma para aislar los P-ADN es mediante la generación de una librería de cepas de Agrobacterium que contienen fragmentos de ADN de planta aleatorios en cambio de un T-ADN que flanquea un gen marcador seleccionable. Se pueden ubicar loss explantes infectados con esta librería en medios de proliferación que contienen un agente seleccionable apropiado por identificar los P-ADN que soporta la transferencia del gen marcador del vector en Agrobacterium a la célula de planta.
Es posible no solamente cotransferir el P-ADN modificado nativo, sino también secuencias de plásmidos adicionales de Agrobacterium a células de planta durante el procedimiento de transformación. Para propósitos de la presente descripción, este es un procedimiento indeseable debido a que las secuencias de "columna vertebral" de plásmido representan ADN no vegetal, foráneo, tal como ADN bacteriano. La presente descripción previene que las células vegetales transformadas que contienen secuencias de columna vertebral se desarrollen en plantas maduras. De esta forma, la presente descripción hace posible distinguir eventos de transformación que contienen columna vertebral y libre de columna vertebral durante la fase de brote regenerado.
El método para seleccionar o cribar contra eventos de integración de columna vertebral se basa en la presencia de un casete de expresión para un marcador, tal como el gen de isopentenil fosfotransferasa (IPT), en la columna vertebral de vector, fuera del P-ADN. Tras la integración de columna vertebral, la acumulación de citoquina inducida de IPT-i alterará la forma de brotes transformados, y evitará que estos brotes desarrollen raíces. En cambio del gen de IPT, se puede usar cualquier otro gen que altere la forma, textura o color de las hojas de plantas transformadas, raíces, vástago, altura o alguna otra característica morfológica para cribar y/o seleccionar contra los eventos de integración de columna vertebral. Se indica tal gen aquí como un "marcador de integración de columna vertebral". De esta forma, la planta transformada que exhibe una característica morfológica alterada atribuible a la expresión del gen marcador de integración de columna vertebral es conocida para, contener en su genoma ADN foráneo en adición al P-ADN deseado. En consecuencia, no son deseadas las plantas que exhiben un fenotipo deseado con el marcador de integración de columna vertebral.
La presente descripción no está limitada al uso únicamente de un gen de IPT como un marcador de integración de columna vertebral; se pueden usar otros genes de tal manera. Por ejemplo, un marcador de integración de columna vertebral puede ser un gen de transzeatina sintasa de Agrobacterium (TZS) (Krall et al., FEBS Lett 527: 315-8, 2002)
o un hoc1 de gen de Arabidopsis recesivo (Catterou et al., Plant J 30: 273-87, 2002). Este método puede ser más fácilmente aplicado a algunos métodos que insertan genes tóxicos en secuencias de columna vertebral de vector. Véase, por ejemplo, el documento EP 1 009,842.
Mediante posicionamiento de un gen marcador de integración de columna vertebral, tal como un gen de citoquina funcional corriente arriba o corriente abajo del P-ADN, es sencillo para distinguir entre eventos de transformación. Las plantas transformadas que exhiben una característica morfológica alterada están descartadas porque estas contienen secuencias de ADN no nativo integradas en el genoma.
Otra estrategia para identificar plantas que son transformadas establemente con únicamente ADN nativo, es emplear la reacción de cadena de polimerasa. Mediante el uso de cebadores que están específicamente diseñados para detectar secuencias de columna vertebral, se pueden identificar plantas y descartar que contengan secuencias de columna vertebral foránea adicionalmente al P-ADN. Otros conjuntos de cebadores pueden ser usados posteriormente para confirmar la transferencia intacta del P-ADN. De esta forma, ya sea mediante el uso de la expresión de un gen para cambiar una característica morfológica de una planta, o mediante cribado para integrar establemente ADN foráneo en una planta transformada, se pueden identificar y seleccionar plantas transformadas establemente con únicamente secuencias de ADN nativo.
Se pueden insertar los elementos genéticos de una planta anfitriona particular en la secuencia de P-ADN de un vector binario capaz de replicarse en tanto E. coli como Agrobacterium. Se puede lograr la introducción de los vectores resultantes en las cepas de Agrobacterium desarmadas tal como LBA4404 a través de electroporación, apareamiento triparental o tratamiento de choque térmico de células de componente químico. Se pueden usar las
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nuevas cepas para transformar células de planta individuales a través de infección de plantas completas o explantes.
Se pueden insertar los elementos genéticos de una planta anfitriona particular en la secuencia del P-ADN de un vector binario capaz de replicarse en tanto E. coli como Agrobacterium. Se puede lograr la introducción de los vectores resultantes en las cepas de Agrobacterium como LBA4404 a través de electroporación, apareamiento triparental o tratamiento de choque térmico de células de componente químico. Se pueden usar las nuevas cepas para transformar células de planta individuales a través de infección de plantas completas o explantes. El LBA4404 contiene los pAL4404 de Ti-plásmido desarmado, que lleva las funciones de virulencia y un gen de resistencia a la estreptomicina.
Vectores de LifeSupport
Aunque la integración estable de genes marcadores bacterianos en los genomas de células de planta facilita los eventos de identificación o transformación, no se desean tales modificaciones de genomas de planta porque los genes marcadores representan ADN foráneo. Se puede evitar el uso de un gen marcador mediante el desarrollo de nuevos métodos de transformación basados en Agrobacterium.
Una realización preferida es un método novedoso que se basa en el uso de dos cepas de Agrobacterium: una cepa que contiene un vector binario con un gen marcador seleccionable previsto para la expresión transeúnte en un núcleo de planta, y otras cepa que lleva el P-ADN con las secuencias reales de interés previstos para integración estable en el genoma de planta (véase Ejemplo 7).
Tras la co-infección con las cepas de Agrobacterium, algunas células de planta recibirán tanto un T-ADN con el gen marcador como un P-ADN con las secuencias de interés. En cambio de seleccionar posteriormente para la integración estable del gen marcador mediante el sometimiento de los explantes infectados por un periodo de tiempo largo para el antibiótico apropiado, los explantes únicamente se exponen brevemente al antibiótico. De esta forma, sobrevivirán todas las células vegetales que expresan transitoriamente el gen marcador. Debido a que los TADN en la mayoría de los casos se degradarán debido a las actividades de nucleasa endógena en vez de integrarse establemente en el genoma del anfitrión, se muestran aquí la mayoría de plantas que sobrevivieron a la selección transeúnte para desarrollarse en los brotes que carecen de un gen marcador. La presente divulgación adicionalmente, demuestra que una proporción significativa de estos brotes libres de marcador P-ADN integrados establemente.
Existen varias herramientas para mejorar la eficiencia de la transformación libre de marcador. Primero, la presente divulgación demuestra que esta frecuencia puede ser aumentada mediante la infección de manera secuencial de explantes con dos cepas de Agrobacterium que llevan el T-ADN/marcador y P-ADN/secuencia de interés, respectivamente. Se infectan primero los explantes con la cepa de P-AND, y después por aproximadamente 4 a 6 con la cepa de T-ADN.
Segundo, se puede modificar la cepa de T-ADN para expresar un gen de virD2 omega mutado. La proteína de virD2 modificada soportará la transferencia de T-ADN a el núcleo de planta pero limitará la eficiencia de una integración genómica posterior de los T-ADN (Shurvinton et al., Proc Natl Acad Sci EEUU, 89: 11837-11841, 1992; Mysore et al., Mol Plant Microbe Interact, 11: 668-683, 1998). El método más preferido de expresión de un gen virD2 es mediante la inserción de un gen virD2 omega mutado dirigido por el promotor virD en la columna vertebral del vector de T-ADN.
Tercero, se puede dañar adicionalmente la integración de T-ADN estable mediante la inserción de secuencias teloméricas cerca de las secuencias de frontera izquierda y derecha del T-ADN (Chiurazzi & Signer, Plant Mol. Biol.,
26: 923-934, 1994).
Cuarto, se puede aumentar el tamaño de la región de T-ADN que lleva el gen marcador para mejorar la frecuencia de T-ADN y P-ADN moviéndose juntas en el núcleo de células de planta, y para reducir la frecuencia de integración genómica del T-ADN.
Quinto, se puede mejorar también la frecuencia de T-ADN y P-ADN moviéndose juntos en el núcleo de células de planta mediante el uso de una cepa individual de Agrobacterium que lleva dos vectores binarios compatibles con el T-ADN y P-ADN, respectivamente. Un ejemplo de dos vectores bienes compatibles es un vector derivado de pSIM 1301 y un vector derivado de pBI121.
Debido a que el gen marcador expresado transitoriamente usualmente no se integrará en el genoma de la planta, no es necesario que tanto este gen como sus secuencias regulatorias representen ADN nativo. De hecho, puede ser ventajoso para el uso de secuencias regulatorias foráneas para promover altos niveles de expresión de gen transeúnte en células de planta infectada. Un descubrimiento sorprendente de la presente invención es que se expresó transitoriamente un casete de expresión que contiene el gen GUS seguido por el terminador de la deshidrogenasa 1 de alcohol de levadura (ADH1) a niveles altos en células de patata. Sin embargo no funcionó
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adecuadamente un constructo similar con el terminador de CYC1 de levadura. También puede ser posible mejorar los niveles de expresión transeúnte mediante vincular operablemente un gen marcador a un promotor no nativo. Los ejemplos de tales promotores son, por ejemplo, promotores sintéticos tales como promotores inducibles por glucocorticoides (Mori et al., Plant J., 27: 79-86, 2001; Bohner et al., Mol. Gen. Genet., 264: 860-70 2001), y promotores no nativos tales como los promotores 35S del virus mosaico de coliflor y el virus mosaico de Escrofularia y promotores fúngicos.
Como una alternativa al enfoque de transformación mediada de dos cadenas de Agrobacterium descrito anteriormente, las plantas también pueden ser transformadas con una cadena individual que contiene un P-ADN con tanto un gen marcador nativo como las secuencias actuales de interés. La presente invención de muestra que es posible usar genes de tolerancia a la sal como marcadores nativos para la transformación. Tales genes de tolerancia a la sal incluyen cultivos homólogos de los genes SOS1 de Arabidopsis (Shi et al., Nat Biotechnol. 2002), AtNHX1 (Apse et al., Science. 285: 1256-8, 1999), Avp1 (Gaxiola et al., Proc Natl Acad Sci EEUU. 98: 11444-9, 2001), y CBF3 (Kasuga et al., Nat Biotechnol. 17: 287-91, 1999).
También puede ocurrir espontáneamente el reordenamiento de elementos genéticos logrado a través de la metodología de Reproducción Precisa a través del procedimiento de recombinación genética. Por ejemplo, todas las plantas contienen elementos que pueden transponer de una a otra locación cromosómica. Mediante la inserción en promotores o genes, tales elementos de transposición pueden mejorar, alterar, y/o reducir la expresión del gen. Por ejemplo, la inserción de AMu4 del elemento Mutador de maíz en el promotor del gen P-wr regulador transcripcional causa provoca pericarpio rojo a rayas. La inserción del mismo elemento en el promotor del gen ZMM19 de hojas específicas MADS-box resultó en la expresión de este gen en las inflorescencias de maíz, que provoca un alargamiento como follaje de hoja de las glumas y otros cambios en las inflorescencias masculinas y femeninas, que resulta en el famoso fenotipo de maíz de vaina. Debido a sus extrañas borlas y oídos, el maíz de vaina fue de significancia religiosa para ciertas tribus americanas nativas. Muchos genes son reorganizados a través de otras modificaciones introducidas por transposiciones tal como inversiones, deleciones, adiciones, y recombinaciones ectópicas (Bennetzen, Plant Mol Biol 42: 251-69, 2000). Adicionalmente, reorganizaciones de ADN de planta frecuentemente ocurren a través del proceso de recombinación intragénica. Por ejemplo, mediante recombinación de genes implicados en resistencia contra patógenos específicos, las plantas son capaces de desarrollar genes de resistencia con nuevas especificidades y, de esta forma, co-evolucionar con sus patógenos (Ellis et al., Trends Plant Sci 5: 373-9, 2000). Otro ejemplo de recombinación intragénica se relaciona con cómo se reproducen las plantas: la transición de plantas de fertilización cruzada a autofertilización mediante recombinación de genes implicados en la auto-incompatibilidad (Kusaba et al., Plant Cell 13: 627-43, 2001). Otros procedimientos que promueven la evolución genómica incluyen, por ejemplo, rotura de cromosomas y recombinación intercromosómica.
Aumentar el valor nutricional de las plantas y cultivos alimentarios
Para modificar rasgos negativos tales como acumulación de acrilamida durante el procesamiento de, acumulación de glicoalcaloide, acumulación de productos de glicación avanzados indeseables, acumulación de CIPC, bajos niveles de almidón resistente, susceptibilidad al hematoma, edulcorante inducido por frio, susceptibilidad a la enfermedad, baja producción y baja calidad en plantas de cultivo a través de reproducción precisa, se incorpora al menos un casete de expresión específico en un genoma anfitrión. Se usan tres métodos diferentes para eliminar rasgos negativos: (1) sobreexpresión de genes para prevenir la ocurrencia de rasgos negativos, (2) sobreexpresión de versiones mutadas de genes asociados con rasgos negativos con el fin de valorar los productos de gen de tipo silvestre con proteínas no funcionales, y (3) silenciar genes específicos que están asociados con un rasgo negativo mediante expresión de al menos una copia de un fragmento líder o remolque asociado con aquel gen en la orientación sentido y/o antisentido.
Un ejemplo de un gen endógeno está asociado con un rasgo negativo en patata y puede ser modificado in vitro de manera que codifica una proteína no funcional, es el gen de polifenol oxidasa (PPO). Tras la lesión de impacto, se libera el producto de gen PPO del plástido en el citoplasma (Koussevitzky et al., J. Biol. Chem., 273: 27064-9, 1998), donde mediara la oxidación de fenoles para crear una variedad de radicales de fenoxilo y derivados quinoides, que son tóxicos y/o en última instancia forman polímeros indeseables que dejan decoloraciones oscuras, o "manchas negras "en el cultivo.
La sobreexpresión de un gen PPO mutante que contiene un dominio de unión de cobre no funcional puede disminuir la actividad de todos los genes que están principalmente expresados en tubérculos y órganos asociados tales como brotes. Las mutaciones hacen a la proteína de oxidasa de polifenol inactiva porque no es capaz de unir cobre. La persona experta sabrá dónde hacer mutaciones de punto que podría, en este caso, comprender la función de un producto de gen. Los solicitantes identificaron el dominio de unión de cobre en PPO de patata mediante el alineamiento de la secuencia de proteína de PPO de patata con una secuencia proteína de PPO de batata (Klabunde et al., Nat Struct. Biol., 5:1084-90, 1998). Las áreas de conservación, particularmente aquellas que contienen residuos de histidina conservados en sitios de unión de cobre, fueron dirigidos para inactivar el producto de transgén. Debido a la ausencia casi completa de actividad de PPO en tales órganos, se puede impactar negativamente la habilidad de la planta para resistir patógenos, la presente invención también describe un método mejorado de únicamente disminuir un gen PPO específico que es predominantemente expresado en todas partes
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del tubérculo maduro excepto para la epidermis. El silenciamiento de este gen PPO especifico mediante el uso de una secuencia remolque asociada con el gen no reduce la expresión de PPO en la epidermis de tubérculos, la parte del tubérculo que está lo más directamente expuesta patógenos que intentan infectar.
El pardeamiento enzimático inducido por el gen PPO no solamente reduce la calidad de los tubérculos de patata; también afecta negativamente cultivos de alimentos tales como trigo, aguacate, banano, lechuga, manzana, y peras.
Otros genes que están asociados con rasgos negativos pueden ser silenciados mediante el uso de las secuencias líder o remolque asociadas con aquellos genes, incluyen el gen R1 de patata y genes de fosforilasa de tipo L. Ambos genes están implicados en la degradación de almidón para reducir azúcares, tales como glucosa y fructosa, que tras el calentamiento participan en la reacción de Maillard para producir productos tóxicos tales como acrilamida. La presente descripción demuestra que una reducción de edulcorante inducido por frio mediante la disminución de la actividad de R1 o fosforilasa lleva a una reducción de tanto acumulación de pardeamiento no enzimático como de acrilamida durante el procedimiento de fritura de patatas.
La presente divulgación también demuestra la utilidad de sobreexpresar ciertos genes nativos en cultivos modificados genéticamente. Los niveles de productos de reacción de Maillard tal como acrilamida se redujeron significativamente mediante la disminución de la conversión de sacarosa para reducir azúcares a través de sobreexpresión de un gen inhibidor de invertasa vacuolar recién aislado en la patata.
La presente descripción también predicen que los tubérculos de patata que muestran ya sea un nivel aumentado de expresión de inhibidor de invertasa o un nivel reducido de expresión de R1 o fosforilasa no requerirán el tratamiento intensivo con inhibidores de germinación química tales como CIPC antes de almacenamiento debido a sus niveles reducidos de azúcares reductores (1) retrasarán el brote, y (2) permiten almacenamiento a temperaturas más bajas, retrasando de esta forma adicionalmente el brote. Los niveles de residuo de CIPC altamente reducidos, o la ausencia de los mismos, mejora adicionalmente el valor nutricional de alimentos procesados derivados de plantas que contienen ciertos P-ADN modificados descritos aquí.
De esta forma, patatas fritas o chips derivados de tubérculos que contienen el P-ADN modificado contendrán niveles de residuo de CIPC reducidos fuertemente, incrementando adicionalmente su valor nutricional.
El efecto de disminuir simultáneamente la regulación de la expresión del PPO y ya sea genes de R1 o fosforilasa en tubérculos de patata es sinergístico debido a que los azúcares reductores no solamente son necesarios para pardeamiento no enzimático a través de la reacción de Maillard sino también para pardeamiento mediado por la enzima de PPO. Los niveles disminuidos de azúcares reductores en tubérculos de patata transgénicos, también limitarán la actividad de PPO y la susceptibilidad de hematoma de mancha negra. De esta forma, los genes de PPO, R1, y fosforilasa, y/de las secuencias líder o remolque que están asociadas con estos genes, representa segmentos de ADN de interés que pueden ser aislados, modificados y reintroducidos de nuevo en la planta para disminuir la regulación de la expresión de estos genes.
Aparte de desarrollar resistencia al hematoma y reducir edulcorante inducido por frio, existen muchos otros rasgos que pueden ser introducidos a través de Reproducción Precisa sin usar ADN foráneo. Por ejemplo, se pueden aislar genes de resistencia a la enfermedad de especies de patata silvestre e insertar en los genomas de las variedades susceptibles a la enfermedad.
Los beneficios ambientales de plantas y cultivos modificados
Como se describió anteriormente, los niveles reducidos de ya sea R1 o fosforilasa resultan en una fosforilación reducida de almidón. Esta reducción en fosforilación de almidón resulta en una disminución del 90% en contenido de fosfato de tubérculos de patatas (Vikso-Nielsen, Biomacromolecules, 2: 836-43, 2001). Esto resultará en la reducción de los niveles fosfato en aguas residuales de plantas de procesamiento de patatas, que son actualmente de aproximadamente 25-40 mg/L. De esta forma, el uso de tubérculos bajos en fosfato reducirá la liberación de fosfatos en el medioambiente y ayudan a proteger ecosistemas importantes. Adicionalmente, las patatas bajas en fosfato requerirán menos fertilización de fosfato para el crecimiento óptimo y producción, que apoyará una agricultura más sostenible al retrasar el agotamiento de los recursos de fosfato disponibles.
Mejora del desempeño agrícola de cultivos de plantas y de alimentos
A parte de reducir la susceptibilidad al hematoma y reducir edulcorante en frio, que son dos rasgos de procesamiento importantes, la presente descripción también proporciona tolerancia a la sal, un rasgo de entrada cada vez más importante. Algunos de los constructos de PADN modificados descritos aquí contienen un gen de tolerancia a la sal como marcador nativo para la transformación. De manera importante, la utilidad de este gen está limitada a un paso de cribado en el procedimiento de transformación. La sobreexpresión del gen de tolerancia a la sal en plantas de patatas reduce síntomas de presión inducidos por niveles de salinidad del suelo elevados, y hará posible desarrollar nuevas variedades que contienen un P-ADN modificado en un porcentaje creciente de tierras
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agrícolas que contienen niveles de salinidad que exceden el máximo de 2 millimhos/cm de niveles de conductividad eléctrica que son óptimos para desarrollar variedades convencionales.
Uso de elementos regulatorios aislados de una especie vegetal seleccionada o de una especie sexualmente compatible con las especies vegetales seleccionadas
Una vez se ha aislado el gen líder, o remolque de la especie vegetal de interés, y modificado opcionalmente, puede estar vinculado operablemente a un promotor de planta o elemento regulatorio similar para expresión apropiada en plantas. Los elementos regulatorios tales como estos sirven para expresar secuencias no traducidas asociadas con un gen de interés en tejidos específicos o en ciertos niveles o en tiempos particulares.
Dependiendo de la estrategia implicada en la modificación del rasgo, será necesario limitar el silenciamiento a una región particular de la planta. El promotor que normalmente dirige la expresión del gen endógeno puede no ser adecuado para expresión específica de tejido. Como se describió en la sección anterior, la integración estable de componentes regulatorios bacterianos o virales, tal como el promotor “súper” 35S de virus mosaico de coliflor, puede resultar en eventos impredecibles e indeseables. De esta forma, los promotores de la presente divulgación que están aislados de las especies vegetales anfitrionas seleccionadas.
Preferiblemente, para uso en S. tuberosum, las secuencias líder o remolque asociadas con R1, fosforilasa, y genes de PPO están vinculadas operablemente al promotor del gen sintasa de almidón unido a gránulo (Rohde et al., J Gen & Breed, 44, 311-315, 1990). Este promotor ha sido usado frecuentemente por otros para dirigir la expresión de gen y es particularmente activo en tubérculos de patata (van der Steege et al., Plant Mol Biol, 20: 19-30, 1992; Beaujean et al., Biotechnol. Bioeng, 70: 9-16, 2000; Oxenboll et al., Proc Natl Acad Sci EEUU, 9: 7639-44, 2000). También se puede usar este promotor, preferiblemente, para expresión de las secuencias líder o remolque modificadas de genes de R1, fosforilasa, y PPO.
Alternativamente, se puede vincular operablemente otros promotores de patata a secuencias de interés de patata. Tales promotores incluyen el promotor de gen de patatina (Bevan et al., Nucleic Acids Res, 14: 4625-38, 1986), o un fragmento del mismo, que promueve la expresión en tubérculos de patata, el promotor de gen de UDP-glucosa pirofosforilasa (documento U.S. No. 5,932,783) y el promotor del gen de ubiquitina (Garbarino et al., Plant Physiol,
109: 1371-8, 1995).
Se puede regular también la transcripción de líderes y/o secuencias mediante el uso de promotores inducibles y regiones regulatorias que están vinculadas operablemente en un constructo a un polinucleótido de interés. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen aquellos que son sensibles a temperatura, tales como promotores de choque térmico o frío. Por ejemplo, los promotores ci21A-, y C17-de patata son inducibles en frío (Kirch et al., Plant Mol. Biol, 33: 897-909, 1997; Schneider et al., Plant Physiol, 113: 335-45, 1997).
Se pueden usar otros promotores inducibles que son sensibles a ciertos sustratos como antibióticos, u otras sustancias químicas, o pH. Por ejemplo, son conocidos el ácido abscísico y ácido giberélico para afectar el pH intracelular de células de planta y al hacerlo, regulan el gen Rab 16A y el promotor 1/6-4 de alfa-amilasa Heimovaara-Dijkstra et al., Plant Mol Biol, 4 815-20, 1995). Son conocidos ácido abscísico, lesiones y jasmonato de metilo para inducir el promotor pin2 de patata (Lorberth et al., Plant J, 2: 477-86, 1992).
En otro ejemplo, algunas secuencias de nucleótidos están bajo regulación temporal y son activadas para expresar una secuencia corriente abajo únicamente durante una cierta etapa de desarrollo de la planta o durante ciertas horas del día. Por ejemplo, el promotor de patata de la subunidad pequeña del gen de ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa (rbcS) puede direccionar la célula específica, la expresión regulada de luz (Fritz et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88: 4458-62, 1991). La persona experta está bien versada en estas formas a manera de ejemplo de promotores inducibles y secuencias regulatorias.
El uso de ciertas señales de poliadenilación puede ser útil en regular la expresión, mediante la variación de la estabilidad de la transcripción de ARNm. En particular, algunas señales de poliadenilación cuando se vincularon operablemente al extremo ’3 de un polinucleótido causaron que la transcripción de mARN se volviera accesible para degradación.
De esta forma, es posible regular la expresión de un gen al vincularlo operablemente con uno o más de tales promotores, secuencias regulatorias, o señales de poliadenilación 3’, regiones no traducidas 3’, péptido señal y similares. En consecuencia, se obtienen las secuencias de ADN y elementos regulatorios tales como aquellos descritos aquí, y que en última instancia se integrarán en un genoma de planta, a partir de ADN de la especie vegetal seleccionada que va a ser modificada mediante el procedimiento de Reproducción Precisa. Es decir, las secuencias de ADN y elementos regulatorios que son derivados, aislados y clonados de otras especies, tales como de bacterias, virus, organismos, mamíferos, pájaros, reptiles y especies vegetales sexualmente incompatibles no están integrados en el genoma de la planta transformada. Se puede usar el ADN foráneo para el genoma de la especie vegetal seleccionada para crear un constructo de transformación, siempre y cuando aquel ADN foráneo no esté integrado en un genoma de planta.
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No solamente la presente divulgación suministra un método para transformación de una especie vegetal mediante integración de ADN obtenido de la especie vegetal seleccionada, o de una planta que es compatible sexualmente con las especies vegetales seleccionadas, también suministra un medio por el cual se puede regular la expresión de aquel ADN. En consecuencia, es posible optimizar la expresión de una cierta secuencia, ya sea por tejido específico
o alguna otra estrategia, como se describió anteriormente.
Uso de secuencias terminadoras 3’ aisladas de una especie planta seleccionada
Adicionalmente a elementos regulatorios para iniciar la transcripción, el casete de expresión nativo también requiere elementos que terminen la transcripción en el extremo 3’ de la región regulatoria de iniciación de transcripción. Se pueden obtener la región de terminación de transcripción y la región de iniciación de transcripción del mismo gen o de diferentes genes. Se puede seleccionar la región de terminación de transcripción, particularmente para estabilizar del mARN para mejorar la expresión.
Este elemento particular, la llamada "región no traducida 3’" es importante en transportar, estabilizar, localizar y terminar la transcripción del gen. En este respecto, es bien conocido por aquellos en la técnica, que la región no traducida 3’ puede formar cierto bucle de horquilla. En consecuencia, se prevé la posibilidad de vincular operablemente una región no traducida 3’ al extremo 3’ de un polinucleótido clonado tal como el transcrito de ARNm resultante, puede estar expuesta a factores que actúan sobre secuencias y estructuras conferidas por la región no traducida 3’.
Este elemento particular, la llamada "región no traducida 3’" es importante en transportar, estabilizar, localizar y terminar la transcripción del gen. En este respecto, es bien conocido por aquellos en la técnica, que la región no traducida 3’ puede formar cierto bucle de horquilla. En consecuencia, se prevé la posibilidad de vincular operablemente una región no traducida 3’ al extremo 3’ de un polinucleótido clonado tal como el transcrito de ARNm resultante, puede estar expuesta a factores que actúan sobre secuencias y estructuras conferidas por la región no traducida 3’.
Una secuencia 3’ del gen de ubiquitina puede ser subclonada de la especie vegetal de la cual el promotor y transgén fue aislado e insertado corriente abajo, de un transgén para asegurar la terminación apropiada de la transcripción. Se pueden fusionar ambos transgenes a manera de ejemplo a la secuencia terminador del gen de ubiquitina de patata (Ubi3) independiente de que promotor se use para dirigir su expresión.
Ejemplos
Ejemplo 1
Clonación de P-ADN
Este ejemplo muestra que las fronteras de T-ADN son específicas para Agrobacterium. También muestra que las plantas contienen secuencias de frontera similar de T-ADN, y suministra la secuencia de fragmentos de ADN aislados de patata y trigo que son delineados por tales secuencias de frontera similar.
Los sistemas de transformación convencional usan T-ADN derivados de Agrobacterium como vehículos para la transferencia de ADN foráneo de Agrobacterium a células de planta (Schilperoort et al., documento US 4940838, 1990). Aunque los T-ADN usualmente comprenden varios cientos de pares de base, delineados por una frontera izquierda (LB) y una frontera derecha (RB) repetir, también se pueden consistir meramente en tales fronteras. Las fronteras de T-ADN juegan un papel esencial en el procedimiento de transferencia de ADN debido a que estas funcionan como sitios de reconocimiento específico para reacción de formación de muescas de virD2 catalizado. Se transfiere el ADN de cadena individual liberado, acomplejado con agrobacterias virD2 y virE2 a núcleos de células de planta donde usualmente se integran satisfactoriamente en el genoma la planta. Todas las fronteras de T-ADN que han sido usadas para la transferencia de ADN foráneo son derivadas de cadenas de nopalina y octapina de Agrobacterium tumefaciens y A. rhizogenes (Tabla 2). Estas fronteras y usualmente algunos ADN de Agrobacterium flanqueados están presentes en cientos de vectores binarios que incluyen, por ejemplo, pPAM (AY027531), pJawohl (AF408413), pYL156 (AF406991), pINDEX (AF294982), pC1300 (AF294978), pBI121 (AF485783), pLH9000 (AF458478), pAC161 (AJ315956), BinHyg-TOp (Z37515), pHELLSGATE (AJ311874), pBAR-35S (AJ251014), pGreen (AJ007829), pBIN19 (X77672), pCAMBIA (AF354046), pX6-GFP (AF330636), pER8 (AF309825), pBI101 (U12639), pSKI074 (AF218466), pAJ1 (AC138659), pAC161 (AJ315956), pSLJ8313 (Y18556), y pGV4939 (AY147202). Recientemente, se identificaron dos homólogos de fronteras de T-ADN en el pTiChry5 Ti de plásmido de tipo chrisopina (Palanichelvam et al., Mol Plant Microbe Interact 13: 1081-91, 2000). El homólogo de frontera izquierda es idéntico a un homólogo de frontera inactivo localizado en la mitad del T-ADN de pTi15955. El homólogo de frontera derecha es inusualmente divergente de la secuencia de las fronteras de T-ADN funcional. Es por lo tanto improbable que estos homólogos estén activos funcionalmente en el soporte de transferencia de ADN de pTiChry5 a células de planta.
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El desarrollo de un nuevo método que hace posible transformar plantas con únicamente ADN nativo requiere, en primer lugar, un reemplazo del T-ADN que incluye LB y RB. Desafortunadamente, las búsquedas BLAST avanzadas de bases de datos públicas que incluyen aquellas mantenidas por el National Center For Biotechnology Information, el Institute for Genomic Research, y SANGER fallaron en identificar cualquier secuencia de frontera en plantas. Fue por lo tanto necesario considerar secuencias de ADN de planta que son similares pero no idénticas a las fronteras de T-ADN, designadas aquí como de "frontera similar" (frontera similar). Se muestran los ejemplos de las secuencias de frontera similar de planta que fueron identificados en las bases de datos en la Tabla 2. El reto en tratar de reemplazar las fronteras de T-ADN con secuencias de fronteras similares es que las secuencias de frontera son altamente conservadas (véase Tabla 2). Una larga parte de estas secuencias es también altamente conservadas en la regiones de muesca de otros sistemas de transferencia de ADN bacteriano tales como aquellos de IncP, PC 194, y φ 
Basado en la homología entre secuencias de frontera, se identificó un patrón de frontera de T-ADN (Tabla 2). Aunque estos patrones comprenden 13,824 variantes, muchos de los cuales puede no funcionar -o pueden ser inadecuados-en la transferencia de ADN, representan la definición posible más amplia de lo que una secuencia de frontera de T-ADN es o puede ser. Se usó éste patron de frontera para buscar bases de datos de ADN disponibles públicamente para homólogos que usan el "Motif Alignment and Search Tool" (Bailey y Gribskov, Bioinformatics 14: 48-54, 1998) y "BLASTN avanzado" (" penalización por falta de coincidencia de nucleótidos " = -1; "esperar" = 105; Altschul et al., Nucleic Acids Res 25: 3389-3402, 1997). Nuevamente, estas búsquedas no identificaron ninguna coincidencia idéntica en organismos diferentes a Agrobacterium.
Para tratar de aumentar la posibilidad de aislar un fragmento de ADN de patata que contienen secuencias de frontera similar que corresponden al patrón de frontera, se aisló el ADN de 100 adhesiones diversas genéticamente (la llamada "colección de núcleo," proporcionada por el US Potato Genebank, WI). Este ADN se reunió y usó como plantilla para reacciones de cadena de polimerasa que usan una variedad de oligonucleótidos diseñados para hibridar con las secuencias de frontera o frontera similar. Los fragmentos amplificados de secuencia analizada, y después se confirmó la secuencia que usa PCR inverso con cebadores anidados. Uno de los fragmentos de ADN de patata que fue de particular interés contiene una secuencia novedosa sin grandes marcos de lectura abierta, que está delineada por las secuencias de frontera similar (Tabla 2). Una de las secuencias de frontera similar de éste fragmento contiene al menos 5 desajustes con fronteras de T-ADN; la otra secuencia de frontera similar contiene al menos 2 desajustes. Aunque ambas de estas contienen un desajuste con el patrón de frontera, fueron evaluadas por su habilidad para soportar la transferencia de ADN. Para este propósito, se redujo primero el fragmento en tamaño a
o 0.4-kilo pares de base llevando a cabo una deleción interna (SEQ ID NO.: 1). El fragmento resultante se designó "P-ADN" (planta ADN) para distinguirlo del T-ADN derivado de Agrobacterium. Se aisló un fragmento similar del genoma de la variedad de patata Russet Ranger, pero no ha sido usado para experimentos adicionales.
Basado en la divergencia entre fronteras de P-ADN y T-ADN, se usó el sistema de amplificación de elongasa Life Technologies) con los siguientes cebadores degenerados para aislar un P-ADN de trigo: 5’-GTTTACANHNBNATATATCCTGYCA -3’ (Bor-F) (SEQ ID NO. 56), y 5’-TGRCAGGATATATNVNDNTGTAAAC -3’ (Bor-R) (SEQ ID NO. 57). Se muestra el fragmento 825-pb resultante en SEQ ID NO.: 2, y se usó para reemplazar el T-ADN de un vector binario convencional. Se puede probar la eficacia de este constructo mediante la inserción de un casete de expresión para el gen GUS entre el terminal de PADN, y de infección del trigo con una cepa de Agrobacterium que lleva el vector resultante.
Ejemplo 2
Transformación de tabaco con vectores de P-ADN
Este ejemplo demuestra que, a pesar de diferencias estructurales (divergencia de secuencia) y funcionales (frecuencia de transformación) entre el terminal de P-ADN y fronteras de T-ADN, se puede usar un P-ADN en una forma similar como un T-ADN para transferir ADN de Agrobacterium a células de tabaco.
Se obtuvo un vector libre de T-ADN que puede ser mantenido en tanto E. coli como A. tumefaciens mediante la eliminación de la región de T-ADN completa del vector binario convencional pCAMBIA1301 (Cambia, AU). Esto fue logrado mediante ligación simultánea de un fragmento de SacII -SphI de 5.9 kb de pSIM1301 con 2 fragmentos amplificados de pCAMBIA1301 que usan pares de oligonucleótidos: 5’-CCGCGGTGATCACAGGCAGCAAC -3’ (SEQ ID NO. 58) y 5’-AAGCTTCCAGCCAGCCAACAGCTCCCCGAC-3’ (SEQ ID NO. 59), y 5’ AAGCTTGGCTACTAGTGCGAGATCTCTAAGAGAAAAGAGCGTTTA-3’ (SEQ ID NO. 60), y 5’-GCATGCTCGAGATAGGTGACCACATACAAATGGACGAACGG-3’ (SEQ ID NO. 61), respectivamente.
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Para que sea posible cribar contra los eventos de integración de columna vertebral, un casete de expresión que comprende el gen de isopentenil transferasa de Agrobacterium (IPT) dirigido por el promotor Ubi3 y seguido por el terminador Ubi3 (SEQ ID NO.: 3) como fragmento SacII de 2.6 kpb en la columna vertebral del vector libre de T-ADN descrito anteriormente, que produce pSIM100-OD-IPT. Las células de planta transformadas que expresan el gen IPT se espera que acumulen citoquininas y crezcan en brotes anormales que no pueden desarrollar raíces.
Se insertó el fragmento P-ADN de 0.4 kb descrito en el Ejemplo 1 en pSIM100-OD-IPT para generar pSIM111 (Figura 1; SEQ ID NO.: 4).
Para evaluar si pSIM111 se puede usar para obtener plantas transformadas que llevan P-ADN (que incluye cualquier secuencia localizada entre el terminal P-ADN) si la columna vertebral de vector adicional, se insertó un casete de expresión de gen de neomicina fosfotransferasa (NPTII) en el P-ADN de pSIM111 para crear pSIM108 (Figure 1).
Se probó la eficacia de terminal de P-ADN en el soporte de transferencia de ADN mediante la comparación de frecuencia de transformación entre pSIM108 y un vector de control que contiene un P-ADN modificado con fronteras de T-ADN convencionales. Este vector de control, designado pSIM109, fue generado por amplificación del P-ADN completo que contiene el casete de expresión de gen NPTII con los pares de oligonucleótidos: 5’-ACTAGTGTTTACCCGCCAATATATCCTGTCAGAG-3’ (SEQ ID NO. 62), y 5’-AAGCTTTGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACGAAG-3’ (SEQ ID NO. 63). Un segundo vector de control que fue usado para estos experimentos es el vector binario pBI121 (Genbank número de acceso AF485783), que contiene el mismo casete de expresión de NPTII insertado en un T-ADN regular. Se introdujeron los vectores binarios en células de LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens como sigue. Se incubaron las células LB4404 competentes (50 uL) por 5 minutos a 37°C en la presencia de 1 µg de ADN vector, congeladas por aproximadamente 15 segundos en nitrógeno líquido (aproximadamente -196°C), e incubadas nuevamente a 37 °C por 5 minutos. Después de añadir 1 mL de caldo líquido (LB), se desarrollaron las células tratadas por 3 horas a 28°C y chapadas en LB/agar que contienen estreptomicina (100 mg/L) y kanamicina (100 mg/L). Se aislaron entonces vectores de ADN de cultivos durante una noche de colonias LBA4404 individuales y examinados por análisis de restricción para confirmar la presencia de ADN de plásmido intacto.
Se llevaron a cabo transformaciones de prueba del modelo de planta de tabaco mediante crecimiento de una dilución de 10 veces de células LBA4404::pSIM108 de crecimiento de una noche por 5-6 horas, precipitando las células por 15 minutos a 2,800 RPM, lavándolas con medio líquido MS (Phytotechnology) suplementadas con sacarosa (3%, pH 5.7) y resuspensión de las células en el mismo medio a un OD600nm de 0.2. Se usó la suspensión para infectar explantes de hoja de plantas de tabaco de Nicotiana desarrolladas in vitro de 4 semanas de edad. Se incubaron los explantes de tabaco por 2 días en medios de cultivo (1/10 MS de sales, 3% de sacarosa, pH 5.7) que contienen 6 g/L de agar 25°C en una cámara de crecimiento Percival (16 horas de luz) y posteriormente transferidas a un medio de M401/agar que contiene timentina (150 mg/L) y kanamicina (100 mg/L). El número de callo por explanta que se desarrolló dentro de las siguientes 4 semanas se muestra en la Tabla 3. Éstos datos demuestran que los P-ADN delineados por ya sea terminal nativo o fronteras de T-ADN son aproximadamente 50% más efectivos en la transformación de tabaco que los T-ADN. La eficiencia aumentada de la transferencia de P-ADN puede ser debido a ya sea a su contenido CG diferente u otras características estructurales desconocidas del PADN.
Ejemplo 3
Transformación de patata con vectores de P-ADN
Este ejemplo demuestra que se puede usar un P-ADN en una forma similar como un T-ADN para transferir a ADN de Agrobacterium a células de patata.
Se llevó a cabo la transformación de patata mediante infección de explantes de vástagos de plántulas de Russet Ranger desarrolladas in vitro de 4 semanas de edad con cepas de Agrobacterium de acuerdo con el siguiente procedimiento. Se desarrollaron diluciones de diez veces de cultivos desarrollados durante la noche por 5-6 horas, precipitados por 15 minutos a 2,800 RPM, lavadas con medio líquido MS (Phytotechnology) suplementadas con sacarosa (3%, pH 5.7) y resuspensión en el mismo medio a un DO600nm de 0.2. Se usaron entonces las células resuspendidas para infectar 0.4-0.6 mm de segmentos internodales de patata. Se incubaron vástagos infectados por 2 días en medio de cocultivo (1/10 MS de sales, 3% de sacarosa, pH 5.7) que contienen 6 g/L de agar a 22°C en una cámara de crecimiento Percival (16 horas de luz) y posteriormente transferidas a medios de inducción de callos (medios CIM, MS suplementados con 3% de sacarosa 3, 2.5 mg/L de ribósido de zeatina, 0.1 mg/L de ácido acético de naftaleno, y 6g/L de agar) que contienen timentina (150 mg/L) y kanamicina (100 mg/L). Después de 1 mes de cultivo en CIM, se transfirieron los explantes a medio de inducción de brote (medio SIM, MS suplementado con 3% de sacarosa, 2.5 mg/L de ribósido de zeatina, 0.3 mg/L de ácido giberélico GA3, y 6g/L de agar) que contienen timentina y kanamicina (150 y 100 mg/L respectivamente). Después de 3-4 semanas, se contó el número de explantes que desarrollaron callos transgénicos y/o brotes. Como se mostró en el tabaco, el número de explantes de vástagos infectados con pSIM108 que mostró callos fue más alto que aquellos en experimentos de control con el vector binario convencional pBI121 (Tabla 3). Los brotes que posteriormente surgieron de estos callos pueden ser
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agrupados en dos clases diferentes. La primera clase de brotes fue fenotípicamente indistinguible de brotes de control transformados con LBA::pBI121. La segunda clase de brotes mostró un fenotipo IPT. Los brotes de la última clase se atrofian en crecimiento, contuvieron únicamente hojas muy pequeñas, mostraron un color verde claro a amarillo, y fueron incapaces arraigar después de transferencia a un medio libre de hormonas. Para confirmar que los brotes con un fenotipo IPT contuvieron el gen IPT integrado establemente en sus genomas, se transfirieron todos los brotes a cajas Magenta que contienen medio MS suplementado con 3% de sacarosa y 150 mg/L de timentina, permitiendo el crecimiento por 3 a 4 semanas adicionales, y usados para aislar ADN. Este ADN de planta sirvió como plantilla en reacciones de PCR con un par de oligonucleótidos diseñados para hibridar a el gen IPT: 5’-GTC CAA CTT GCA CAG GAA AGA C-3’, y 5’-CAT GGA TGA AAT ACT CCT GAG C-3’. Como se muestra en la Tabla 4, el experimento de PCR confirmó una estricta correlación entre el fenotipo IPT y la presencia del gen IPT. También se examinó la presencia de ADN de columna vertebral en plantas obtenidas de una transformación con pBI121. Esto fue hecho mediante la realización de reacciones de PCR en ADN aislado de los eventos de transformación con los ’cebadores de columna vertebral de pBI121’: 5’-CGGTGTAAGTGAACTGCAGTTGCCATG-3’ (SEQ ID NO. 64), y 5’-CATCGGCCTCACTCATGAGCAGATTG-3’ (SEQ ID NO. 65). La amplificación de una banda de 0.7 kpb es indicativa de integración de columna vertebral. Mediante la comparación de los datos presentados en la Tabla 4, se puede concluir que las frecuencias de integración de columna vertebral son similares para vectores P-ADN y vectores T-ADN.
Se llevó a cabo un segundo experimento de PCR para probar si las plantas libres de IPT no contenían ninguna otra secuencia de columna vertebral. Debido a que el casete de expresión de IPT está posicionado cerca de las secuencias de frontera similar izquierdas, se designó el par de oligonucleótidos para este experimento para hibridar para secuencias de columna vertebral cerca de secuencias de frontera similar derechas: 5’-CACGCTAAGTGCCGGCCGTCCGAG-3’ (SEQ ID NO. 66), y 5’-TCCTAATCGACGGCGCACCGGCTG-3’ (SEQ ID NO. 67). Los datos de este experimento confirman que las plantas que son positivas para el gen IPT también son positivas para esta otra parte de la columna vertebral.
Se llevaron a cabo experimentos similares con la variedad de patata Russet Burbank. Sobre la base de una evaluación de los fenotipos IPT, se mostró que las frecuencias de integración de columna vertebral para pSIM108 y pSIM109 son comparables a aquellas en Russet Ranger (véase Tablas 4 y 5).
Ejemplo 4
Gen inhibidor de invertasa de patata
Mediante el uso de métodos de transformación convencional, este Ejemplo demuestra que la sobreexpresión de un gen inhibidor de invertasa de patata novedoso mejora las características de procesamiento y de salud de los tubérculos de patata.
Se diseñaron los siguientes cebadores para amplificar un homólogo de patata nuevo del inhibidor de invertasa vacuolar de tabaco (Greiner et al., Nature Biotechnology, 17, 708-711,1999): 5’-AAAGTTGAATTCAAATGAGAAATTTATTC-3’ (SEQ ID NO. 68), y 5’-TTTTAAGCTTTCATAATAACATTCTAAT -3’ (SEQ ID NO. 69). Se realizó la reacción de amplificación mediante mezcla de los siguientes componentes: 4 µl de ADN de planta, 2 µl de cebador directo (10 pM/ml), 2 µl de cebador inverso, 25 µl de mezcla Hot Start Master (Qiagen Catalog Nr. 203443), y 17 µl de agua. Se sometió esta mezcla de reacción a las siguientes condiciones de reacción de cadena de polimerasa (PCR) que usa un termociclador PTC-100 (MJ Research): (1) 5 minutos a 95°C (1 ciclo), (2) 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 45°C y 4 minutos a 72°C (35 ciclos), y (3) 10 minutos a 72OC (1 ciclo). Se cargó el producto total en un gel de agarosa de 0.8%, y se purificó una banda de 540 pares de bases de gel que usa Kit de Extracción de Gel QIAquick (Qiagen, CA). Se ligó entonces éste fragmento purificado en pGEM-T Easy (Promega, WI) y se transformó en DH5-alfa de E. coli que usa Células de Competencia de Máxima Eficiencia (GibcoBRL, MD). El análisis de secuencia de ADN de plásmido recombinante aislado de DH5-alfa transformado revelo la presencia de un marco de lectura abierta individual que consiste en 543 pares de base que codifican para una proteína de aminoácido 181 putativa (SEQ ID NO.: 5); el alineamiento Clustal reveló 70% de homología para Ntinhh (Figura 2). Este alto nivel de homología se extiende para el dominio terminal en N del aminoácido 15, que indica que el homólogo de patata es dirigido a la vacuola. Interesantemente, el homólogo inhibidor de invertasa de patata, designado Stinh1, comparte únicamente 43% de homología con el inhibidor de invertasa de pared celular de tabaco patentado, designado Nt-inh1 (documento WO98/04722; Figura 2).
Aunque el gen St-inh1 está presente en tubérculos de patata no modificados, su nivel de expresión es inadecuado para inhibición completa de invertasa y edulcorante inducido por frio reducido. Para aumentar las características de almacenamiento de la patata, se fusionó el gen Stinh1 a un promotor de tubérculo mejorado nuevo del gen de sintasa de almidón unido de gránulo (GBSS), que es conocido para promover niveles altos de expresión de gen en tubérculos. Se aisló el promotor GBSS de la variedad de patata Russet Ranger llevando a cabo una reacción de PCR que usa el cebador directo 5’-GAACCATGCATCTCAATC-3’ (SEQ ID NO. 70) y el cebador inverso 5’-GTCAGGATCCCTACCAAGCTACAGATGAAC-3’ (SEQ ID NO. 71). El análisis de secuencia del producto amplificado clonado en pGEM-T demuestra que este nuevo promotor contiene 658 pares de base (SEQ ID NO.: 6). Se ligó entonces la fusión de promotor/gen resultante a la secuencia regulatoria 3’ del gen de ubiquitina de patata
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(UbiT; SEQ ID NO.: 7), de esta forma asegurando terminación apropiada de transcripción del gen inhibidor de invertasa.
Se insertó este casete expresión entre las fronteras de T-ADN de un vector binario, y se usó el vector pSIM320 resultante para transformar Russet Ranger como se describió anteriormente. Se plantaron tres cortes de nueve líneas transgénicas independientes en el suelo y se desarrollaron por cuatro semanas en una cámara de crecimiento (11 horas de luz; 20°C). Se recogieron al menos 3 tuberculillos de cada línea y se transfirieron a un refrigerador configurado a 4°C para inducir edulcorante en frio. Después de 4 semanas, se determinaron los niveles de glucosa en estos tuberculillos almacenados en frío mediante el uso de ya sea un metro Accu-Chek y tiras de prueba (Roche Diagnostics, IN) o un reagente de oxidasa/peroxidasa de glucosa (Megazyme, Irlanda). Se compararon estos niveles con los niveles de glucosa promedio en tanto 6 líneas no transformadas como 6 líneas transformadas de "vector de control" con un vector derivado de pSIM110 que carece de gen inhibidor de invertasa. Como se muestra en la Tabla 6, tres líneas transgénicas acumularon menos de 40% de la glucosa en las líneas de "vector de control" que demuestra que el homólogo inhibidor de invertasa está funcionalmente activo.
Los siguientes experimentos mostraron que la cantidad de azúcares reductores presentes en tubérculos se correlaciona con la producción de acrilamida durante el procesamiento de tubérculos. Se recolectaron recientemente los tubérculos de patata Russet Ranger del campo y se almacenaron a 4°C para inducir edulcorante en frio; se almacenaron tubérculos de control a 18°C. Después de 4 semanas, se determinaron los niveles de glucosa en ambos grupos de tubérculos. posteriormente, se lavaron los tubérculos, blanqueadas por ya sea 8 minutos o 12 minutos a 165°F, cortados en tiras de cinta de zapatos de 0.290 x 0.290, sumergidos en una solución de pirofosfato de ácido de sodio del 1% a 160°F, secados a 160°F hasta que se logra 14 ± 2% de pérdida de peso de secado, fritos a 390°F por 40 segundos para alcanzar 64 ± 2% de primera humedad de fritura, y congelados por 20 minutos a 15°F, agitando la bandeja 2-3 veces en los primeros 6 minutos. Se analizaron las patatas fritas para determinar niveles de acrilamida por el laboratorio Covance (WI). Como se muestra en la Tabla 7, los niveles de glucosa en tubérculos almacenados a 18°C estuvieron debajo de los niveles de detección de 0.1 mg/g mientras los tubérculos almacenados en frío contuvieron en promedio 3.4 mg/g de glucosa. Esta tabla también muestra que las patatas fritas producidas a partir de las últimas patatas contenían aproximadamente 10 veces mayores niveles de acrilamida que las patatas fritas producidas a partir de patatas almacenadas a 18°C. Incluso mediante el uso de un tiempo de blanqueo más corto para patatas almacenadas a 18°C que para patatas almacenadas a 4°C, para producir patatas fritas con un color similar (ids de color de 78 y 71, respectivamente), se obtuvo una diferencia de 5 veces en acumulación de acrilamida (Tabla 7). De esta forma, parece existir una correlación directa entre la cantidad de azúcares reductores tales como glucosa en tubérculos y la acumulación de acrilamida en patatas fritas derivada de estos con tubérculos.
Para determinar si los niveles de glucosa reducidos en las líneas pSIM320 limitarán la acumulación inducida de procesamiento de acrilamida, tuberculillos se procesaron pSIM320 almacenados en frío mediante corte en trozos, blanquear por 8 minutos, sumergir en 0.5% de SAPP por 30 segundos, secar por 4.5 minutos a 160°F, freír por 40 segundos a 380°F, congelar por minutos a -15°F, y finalmente secar por 3 minutos y 10 segundos a 160°F. El material procesado fue enviado al laboratorio Covance para determinaciones de acrilamida. Como se muestra en la Tabla 6, las patatas fritas obtenidas de tuberculillos con las cantidades más bajas de glucosa acumularon los niveles más bajos de acrilamida. Una reducción de 40% en los niveles de glucosa en las líneas "320-2" y "320-4" está asociado con una reducción de 5 veces en niveles de acrilamida.
Ejemplo 5
Las secuencias líder de remolque asociadas con el gen R1 de patata
Mediante el uso de métodos de transformación convencional, este Ejemplo demuestra que se puede usar efectivamente una secuencia líder novedosa asociada con el gen R1 de patata para mejorar las características de procesamiento y salud de los tubérculos de patata. También predice que un remolque novedoso asociado con ese mismo gen puede ser explotado de la misma manera.
Como una alternativa para la sobreexpresión del gen inhibidor de invertasa, se desarrollaron métodos para limitar la producción de acrilamida sin el uso de ninguna secuencia de genes real. Tal método está basado en silenciar el gen R1 de tubérculo expresado. Previamente, se mostró que éste gen relacionado de almidón puede ser silenciado a través de expresión antisentido de un fragmento de gen de 1.9-kb derivado de aquel gen (Kossmann et al., documento US 6,207,880). Sin embargo, la expresión antisentido de fragmentos de ADN grandes es indeseable debido a que tales fragmentos contienen nuevos marcos de lectura abierta (Tabla 1). Como un enfoque seguro a aquel descrito anteriormente, se aisló una secuencia líder pequeña asociada con el gen R1 gene de patata. Se obtuvo este líder mediante la realización de amplificación rápida de extremos de cADN con el kit RACE 5’ suministrado por GIBCO BRL en ARN total de tubérculos de las plantas de patata Russet Ranger. Los análisis de secuencia demostraron que el líder R1 asociado consiste en 179 pares de base (SEQ ID NO.: 8). Se ubicó tanto una copia sentido como antisentido de esta secuencia líder, separada por el intrón de Ubiquitina de patata (SEQ ID NO.: 9), entre el promotor GBSS y UbiT. Se muestra el casete de expresión resultante para la secuencia líder asociada con R1 en Figura 3 (SEQ ID NO.: 10). Se muestra un casete similar que contiene un espaciador derivado
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del promotor GBSS (SEQ ID NO.: 11) -en cambio del intrón de Ubi que separa las copias sentido y antisentido del remolque R1 en (Figura 3; SEQ ID NOs.: 12). Se muestran las variantes adicionales con una versión más grande del promotor GBSS (SEQ ID NO.: 13) en la Figura 3 (SEQ ID NOs.: 14-15).
Para probar la eficacia del líder R1 asociado en limitar la producción de acrilamida, se insertó el casete de expresión mostrado en la Figura 3 como fragmento KpnI-XbaI entre las fronteras de T-ADN de un vector binario. Se usó una cepa LBA4404 de Agrobacterium que lleva el vector pSIM332 resultante para transformar la patata Russet Ranger. Para inducir la formación de tubérculo, se transfirieron 25 brotes que representan eventos de transformación independiente al suelo y se ubicaron en una cámara de crecimiento (11 horas de luz, 25°C). Después de tres semanas, se almacenaron al menos 3 tuberculillos/línea por 4 semanas a 4°C para inducir la movilización del almidón. Se determinaron posteriormente los niveles de glucosa en estos tuberculillos almacenados en frío como se describe en el Ejemplo 4, y comparados con los niveles de glucosa promedio en plantas no transformadas y controles de vector. Como se muestra en la Tabla 8, los tuberculillos derivados de todas las 25 líneas mostraron niveles reducidos de glucosa después del almacenamiento en frío. Una reducción de aproximadamente 2 veces en niveles de acrilamida en espera en patatas fritas derivadas de tuberculillos que mostraron niveles de expresión R1 reducidos, comparados con controles. Se anticiparon efectos mucho más fuertes de la expresión del gen R1 de disminución de regulación en tubérculos maduros.
Como una alternativa para el enfoque basado en líder, se generaron los casetes de expresión que contuvieron tanto una copia sentido como antisentido de la secuencia remolque asociada con R1. Este remolque es obtenido mediante realización de una reacción de cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) en ARN total aislado de tuberculillos de la variedad de papa Russet Ranger. Se generó ADN complementario que usa el kit Omniscript RT Kit (Qiagen, CA) y a continuación usado como una plantilla para la reacción de PCR con polimerasa de ADN de Hot start (Qiagen, CA) con el cebador R1-1 inverso de gen específico (5’-GTTCAGACAAGACCACAGATGTGA-3’). Los análisis de secuencia del fragmento de ADN amplificado, clonado en pGEM-T demostró que el remolque asociado con R1 consiste en 333 pares de base (SEQ ID NO.: 16). Se separaron las copias sentido y antisentido del remolque por ya sea el intrón Ubi o el espaciador GBSS -e intercaladas entre el promotor GBSS y el terminador Ubi3 (Figura 3; SEQ ID NOs.: 17-18). Se muestran las versiones similares con el promotor GBSS en la Figura 3 (SEQ ID NOs.: 19-20).
Se pueden determinar los niveles de glucosa y acrilamida como se describió anteriormente. Se espera que los tubérculos que muestran aproximadamente 50% o reducciones mayores en concentraciones de glucosa también acumulen aproximadamente 50% menos acrilamida durante el procedimiento de freído. Se pueden confirmar las características de salud y almacenamiento mejoradas de plantas modificadas en tubérculos cultivados en campo maduros.
Se pueden determinar los niveles de fosfato en tubérculos de patata mediante el uso de Método 995.11 de Fosforo (Total) en Alimentos de AOAC (45.1.33 Official Methods of Analysis of AOAC International, 17va Edición). Se prepararon mezclas por incineración en seco en un horno de mufla seguido por una digestión de ácido. Las muestras disueltas son entonces neutralizadas y tratadas con una solución de ácido molibdato-ascórbico y comparadas con una serie de estándares de fósforo (tratado similarmente). Se utilizara un espectrofotómetro de doble haz para el análisis colorimétrico a 823 nanómetros. Se espera una disminución significativa en el contenido de fosfato, que es beneficioso para el medio ambiente.
Ejemplo 6
Secuencia líder asociada con el gen de glucano alfa fosforilasa L
Mediante el uso de métodos de transformación convencional, este ejemplo demuestra que se puede usar una secuencia líder novedosa asociada con el gen de glucano alfa fosforilasa L de patata para mejorar efectivamente las características de procesamiento y salud de tubérculos de patata.
Previamente, se mostró que edulcorante inducido por frio puede ser reducida a través de expresión antisentido de fragmentos de 0.9-kb derivados de genes de glucano alfa fosforilasa (Kawchuk et al., documento US 5,998,701, 1999). Sin embargo, la expresión antisentido de estos fragmentos de ADN relativamente grandes es indeseable debido a que contienen marcos de lectura abierta nuevos y no caracterizados que pueden impactar la calidad nutricional de alimentos si son expresados en plantas transgénicas (Tabla 1).
Como un enfoque más seguro al descrito anteriormente, se aislaron las secuencias líder y remolque pequeñas que están asociadas con un gen de glucano fosforilasa de tipo L de ARN de tubérculos maduros. El par de cebadores usados para este propósito es: 5’-GGATCCGAGTGTGGGTAAGTAATTAAG-3’ (SEQ ID NO. 72), y 5’-GAATTCTGTGCTCTCTATGCAAATCTAGC-3’ (SEQ ID NO. 73). Se aplicó la secuencia líder resultante de 273 pb y es mostrada en SEQ ID NO.: 21. Similarmente, se usó el cebador "directo", 5’-GGAACATTGAAGCTGTGG-3’ (SEQ ID NO. 74), con un cebador oligo-dT para amplificar una “secuencia de remolque” de 158 pb que está asociada con el gen de fosforilasa de tipo L (SEQ ID NO.: 22).
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Se diseñaron entonces los casetes de expresión que usan estas secuencias de remolque o líder para modificar la expresión del gen de fosforilasa de tipo L y, de este modo, que disminuyen los niveles de acrilamida en productos fritos mediante la limitación de la movilización del almidón. Se construyeron estos casetes en una forma similar como se describe en el Ejemplo 5, y son representados en la Figura 3 (SEQ ID Nos.: 23-26). Se usó una cepa de Agrobacterium que contiene un vector binario con este casete de expresión, designado pSIM216, para infectar vástagos de patata, y generar 25 plantas transgénicas. Se almacenaron tuberculillos derivados de estas plantas por 4 semanas a 4°C para inducir edulcorante en frio. Se analizaron entonces los tuberculillos almacenados en frío para determinar los niveles de glucosa. Como se muestra en la Tabla 9, los tuberculillos de todas las líneas transgénicas mostraron niveles de glucosa reducidos.
Se usaron cuatro líneas que mostraron al menos 50% de concentraciones de glucosa reducidas (líneas 216-2, 2165, 216-10, y 216-21) para evaluar los niveles de acrilamida de procesamiento inducidos. Aunque los niveles de acrilamida en tubérculos fritos derivados de las tres primeras líneas fueron similares a aquellos de controles, las patatas fritas que fueron derivadas de la línea 216-21, acumularon únicamente 45% de los niveles de acrilamida de tipo silvestre (136 vs. 305 partes por billón). Éstos resultados confirmaron los experimentos descritos en el Ejemplo 4 para tubérculos que sobreexpresaron el gen inhibidor de invertasa de patata, en estas reducciones relativamente grandes en concentraciones de glucosa (y fructosa) es necesario limitar la acumulación de acrilamida inducida por calentamiento en tuberculillos almacenados en frío. Debido al silenciamiento del gen de fosforilasa, se espera que sea más efectivo en tubérculos "216" maduros, también se anticipan las reducciones en niveles de acrilamida para ser más pronunciadas en patatas fritas producidas de tales tubérculos. Se pueden confirmar las características de salud y almacenamiento mejoradas de las plantas modificadas en tubérculos maduros.
Ejemplo 7
Gen de oxidasa de polifenol modificado
Mediante uso de métodos de transformación convencionales, este Ejemplo demuestra que un gen de oxidasa de polifenol modificado que carece de un sitio de unión de cobre funcional puede ser usado efectivamente para reducir la susceptibilidad al hematoma en tubérculos.
Previamente, se mostró que se puede reducir la susceptibilidad de hematoma de mancha negra a través de expresión antisentido del gen PPO de 1.8-kb (Steffens, documento US 6,160,204, 2000). Sin embargo, es indeseable la expresión del complemento inverso de este gen más grande de expresión debido a que contiene marcos de lectura abierta nuevos y no caracterizados que codifican péptidos que consisten en más de 100 aminoácidos, que pueden impactar potencialmente la calidad nutricional de alimentos (Tabla 1). Como un enfoque más seguro al descrito anteriormente, se modificó el gen PPO para codificar una proteína no funcional.
Se aisló el gen PPO de patata de tipo silvestre de Russet Ranger mediante el uso de un método de reacción de cadena de polimerasa (PCR). Primero, se aisló el ADN genómico de brotes de Russet Ranger. Se amplió entonces el gen PPO de patata de ADN genómico de patata que usa cebadores de polimerasa y oligonucleótidos 5’: CGAATTCATGGCAAGCTTGTGCAATAG-3’ (PPO-F) (SEQ ID NO. 75), y 5’-CGAATTCTTAACAATCTGCAAGACTGATCG-3’ (PPO-R) (SEQ ID NO. 76). Estos fueron diseñados para complementar los extremos 5’-y 3’-del gen PPO de patata. Se clono el fragmento de 1.6 kb amplificado en un vector pGEM-T EASY (Promega) y se confirmó para representar un gen PPO funcional mediante análisis de secuencia (SEQ ID NO.: 27).
Se identificó el dominio de unión de cobre en PPO de patata con una proteína de PPO de batata que se mostró que contenía residuo de Cisteína (Cys) conservada en la posición 92, residuo de Glutamina (Glu) en la posición 236, y residuos de Histidina (His) en las posiciones 88, 109, 118, 240, 244 y 274 que coordina dos cobres de sitio activos (Klabunde et al., Nature Structural Biol., 5: 1084-1090, 1998). Estos residuos de Cys, Glu, y His también están presentes en PPO.
Se creó el gen PPO inactivo mediante uso de un enfoque de reemplazo de mutación de PCR m. Se amplificaron tres fragmentos por Proof Start Taq ADN Polymerase (Qiagen) que usan 3 pares de cebadores y PPO de Russet Ranger de tipo silvestre como una plantilla. Las secuencias del primer par, designadas P1-F y P2-R, respectivamente, son: 5’-GAGAGATCTTGATAAGACACAACC-3’ (SEQ ID NO. 77), y 5’-CATTACC1ATAAGCC2CAC3TGTATATTAGCTTGTTGC-3’ (SEQ ID NO. 78) (1: mutación "A" a "C", que resulta sustitución de Cisteína a Glicina en la posición 186; 2: mutación "A" a "C", que resulta en sustitución de Cisteína a Triptófano en la posición 183; 3: mutación "A" a "C", que resulta sustitución de Histina a Glutamina en la posición 182). Estas secuencias del segundo par, designadas P3-F y P4-R, respectivamente, son 5’-GTGCTTATAGAATTGGTGGC-3’ (SEQ ID NO. 79), y 5’-TAGTTCCCGGGAGTTCAGTG -3’ (SEQ ID NO. 80). Las secuencias del tercer par, designadas P5-F y P6-R, respectivamente, son 5’-CTCCCGGGAACTATAGG4AAACATTCCTCT5CGGTCCTGTCCACATCTGGTC -3’ (SEQ ID NO. 81) y 5’-GTGTGATATCTGTTCTTTTCC-3’ (SEQ ID NO. 82) (4: mutación "A" a "G", que resulta en sustitución de Glutamina a Glicina en la posición 326; 5: mutación "A" a "T", que resulta en sustitución de Histina a Leucina en la posición 330).
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Se amplificó un fragmento de 80 pb usando el cebador P1-F y P2-R y digerido con BglII. Este fragmento contiene un extremo pegajoso (BglII) y un extremo romo, lleva tres mutaciones en sitio de unión de cobre I. Se amplificó un fragmento de 0.4 kb usando el cebador P3-F y P4-R y digerido con XmaI, contiene un extremo romo y un extremo pegajoso (XmaI). Se amplificó un fragmento de 0.2 Kb usando el cebador P5-F y P6-R y digerido con XmaI y EcoRV. Este tercer fragmento con un extremo pegajoso (XmaI) y un extremo romo (EcoRV) tiene dos mutaciones en sitio de unión de cobre II. Se reemplazó entonces el fragmento BglII y EcoRV de PPO de patata de tipo silvestre clonado con los tres fragmentos anteriores amplificados de PCR ligados. Se confirmó la presencia de un total de 5 mutaciones de punto en el gen PPO modificado mediante análisis de secuencia (SEQ ID NO.: 28). Para crear un casete de expresión para PPO modificado (mPPO), se ligaron simultáneamente los siguientes cuatro fragmentos: (1) un fragmento de BamHI-HindIII que contiene el promotor GBSS, (2) un fragmento de HindIII-SacI que contiene el mutante PPO, (3) un fragmento de SacIKpnI que contiene el terminador Ubi-3, y (4) pBluescript plásmido, digerido KpnI y BamHI. Se insertó entonces del casete de expresión entre las fronteras de un vector binario para crear pSIM314.
Se evaluó la eficacia del casete de expresión de gen mPPO mediante la transformación de explantes de vástago de Russet Ranger con pSIM314. Se ubicaron los cortes nodales de plantas transgénicas que contienen este casete de expresión en medio MS suplementados con 7% de sacarosa. Después de un periodo de 5 semanas de incubación en la oscuridad a 18°C, se aislaron y ensayaron los tuberculillos para determinar actividad de PPO. Para este propósito, se pulverizó 1 g de tubérculos de patata en nitrógeno líquido. Este polvo fue entonces añadido a 5 ml de 50 mM de amortiguador (pH 6.5) de MOPS (ácido 3-(N-morfolino) propano-sulfónico) que contiene 50 mM de catecol, e incubados a temperatura ambiente con rotación por aproximadamente de 1 hora. La fracción sólida fue entonces precipitada, y se transfirió el sobrenadante a otro tubérculo para determinar la actividad de PPO mediante la medición del cambio de OD-410 a través del tiempo. Como se mostró en la Tabla 10, los tuberculillos aislados de algunas de las líneas transgénicas mostraron una actividad de oxidasa de polifenol reducida significativamente comparada con ya sea controles no transformados o controles transformados con un constructo que no contiene el gen PPO mutante. La reducción más fuerte en la actividad de PPO se observó en las líneas "314-9", "314-17", y "314-29". Para probar si la expresión del gen PPO mutante también redujo la actividad de PPO en tuberculillos, se plantaron plántulas enraizadas de líneas transgénicas en suelo e incubadas en una cámara de crecimiento por 4 semanas. Un ensayo de PPO en tuberculillos aislados demostró que la actividad de PPO reducida se correlacionó en la mayoría de los casos con actividades reducidas en minituberculillos (Tabla 10). Las líneas transgénicas que muestran una actividad de PPO reducida pueden ambas ser propagadas y probadas en el invernadero y el campo para confirmar el fenotipo de "bajo hematoma" en los tubérculos maduros. Debido a que tubérculos micro y mini expresan una variedad de oxidasas de polifenol, algunos de los cuales comparten únicamente homología de secuencia limitada con la oxidasa de polifenol objetivo que es predominantemente expresada en tubérculos maduros, se puede anticipar una reducción aún más profunda de la actividad de PPO en tubérculos maduros de líneas tales como "314-9" y "314-17". Los datos indican que la sobreexpresión inactiva de un gen PPO funcionalmente puede resultar en susceptibilidad reducida de hematoma. Las características de salud y almacenamiento mejoradas de plantas modificadas también pueden ser confirmadas en tubérculos crecidos en campo maduros.
Ejemplo 8
La secuencia remolque de un gen de oxidasa de polifenol que es específica para los tejidos no epidérmicos de tubérculos de patata
Mediante el uso de métodos de transformación convencional, este Ejemplo demuestra que una secuencia remolque novedosa asociada con el gen PPO de patata puede ser usada efectivamente para reducir susceptibilidad de hematoma en los tubérculos.
Se usó PCR de transcripción inversa para aislar también la secuencia de remolque asociada con el gen PPO expresado en tubérculos de patata. Los cebadores para la primera reacción de PCR fueron PPO-1 (5’-GAATGAGCTTGACAAGGCGGAG-3’, (SEQ ID NO. 83)) y oligo-dT; cebadores para una segunda reacción de PCR anidada fueron PPO-2 (5’-CTGGCGATAACGGAACTGTTG-3’, (SEQ ID NO. 84)) y oligo-dT. El análisis de secuencia de los fragmentos de ADN amplificados clonados en pGEM-T revelaron una secuencia de un remolque de 154-pb (SEQ ID NO.: 29). Una copia sentido y antisentido de este remolque, separadas por el intrón Ubi, fue entonces fusionada al promotor GBSS y al terminador Ubi3 como se describió anteriormente para generar un casete de expresión mostrado en la Figura 3 (SEQ ID NO.: 30). Un constructo alternativo que contiene los segmentos remolque separados por un espaciador GBSS mostrado en la Figura 3 (SEQ ID NO.: 31). Se muestran las versiones similares con el promotor GBSS más grande en la Figura 3 (SEQ ID NOs.: 32-33). Interesantemente, el remolque de un gen PPO que es expresado predominantemente en tubérculos maduros (indicado con P-PPO3 en la Figura 4) es diferente del remolque de los genes PPO que son predominantemente expresados en otros tejidos que incluyen tuberculillos (indicado con PPOM-41 y PPOM-44 en la Figura 4). Debido a la baja homología entre los remolques asociados con genes PPO diferentes, el uso del remolque P-PPO3 resultará únicamente en un silenciamiento del gen PPO de tubérculo específico maduro. Este silenciamiento de gen muy específico será difícil de lograr con secuencias derivadas del propio gen PPO, de este modo demostrando la ventaja de usar secuencias que no
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codifican para el silenciamiento de genes. Para visualizar la extensión de la actividad de PPO, se pipeteó 0.5 mL de 50 mM catecol en la superficie de corte de los tuberculillos rebanados modificados genéticamente. Comparado con controles, el oscurecimiento visual de las regiones de tubérculos fue aproximadamente 5 a 10 10 veces reducida. Interesantemente, aunque, no se observó oscurecimiento en la piel de patata. Parece ser que la secuencia remolque usada específicamente silenció el gen PPO, que está predominantemente expresado en la corteza y médula pero no en la piel epidérmica. Este hallazgo inesperado puede ser benéfico para tubérculos para protegerlos contra algunos patógenos que intentan infectar a través de la piel porque el gen PPO puede jugar algún papel en ciertas respuestas de defensa. Para determinar cuantitativamente la actividad de PPO, se realizó un ensayo como se describió en el Ejemplo 7. La Tabla 11 muestra reducción de hasta el 80% de actividad de PPO en tuberculillos transformados comparados con controles no transformados. Se espera que el nivel de reducción sea aún más grande en tubérculos maduros porque estos tubérculos expresan el gen PPO objetivo más predominantemente que tubérculos mini y micro. Éstas características de líneas tales como "217-7" y "217-26" pueden ser confirmadas en tubérculos maduros.
Ejemplo 9
Un casete de expresión para aumentar los niveles de almidón resistente
Aumentar las proporciones de amilosa/amilopectina en tubérculos puede mejorar adicionalmente el valor nutricional de los productos de patata. Un método que hace posible incrementar el contenido de amilosa está basado en la expresión antisentido de genes que codifican para la enzima que ramifica almidón (SBE) I y II (Schwall et al., Nature Biotechnology 18: 551-554, 2000). Las desventajas de este método son que (1) la eficiencia de silenciar simultáneamente dos genes diferentes a través de explotación de tecnologías antisentido es muy baja, (2) la expresión antisentido de las secuencias SBE-I y SBE-II relativamente grandes resultan en la expresión indeseable de marcos de lectura abierta (Tabla 1) (3) los constructos correspondientes que albergan dos casetes de expresión antisentido son innecesariamente grandes y complejos, de esta forma, que aumenta las posibilidades de recombinación y que disminuye las frecuencias de transformación.
El enfoque para aumentar el contenido de amilosa en patatas está basado en la expresión de la secuencia remolque que está asociada con ambos genes. Estos remolques (SEQ ID No.:34 y 35) se aislaron con los pares de cebadores 5’-GTCCATGATGTCTTCAGGGTGGTA-3’ (SEQ ID NO. 85), y 5’-CTAATATTTGATATATGTGATTGT -3’ (SEQ ID NO. 86), y 5’-ACGAACTTGTGATCGCGTTGAAAG -3’ (SEQ ID NO. 87), y 5’-ACTAAGCAAAACCTGCTGAAGCCC 3’ (SEQ ID NO. 88). Un promotor individual dirige la expresión de una fusión sentido y antisentido de ambos remolques, separados por el intrón de Ubiquitina-7, y seguido por el terminador de Ubiquitina-3. El tamaño del casete de expresión completo es únicamente 2.5-kb.
Ejemplo 10
Desarrollo de métodos de transformación de marcador libre
Este ejemplo demuestra que se pueden transformar plantas efectivamente sin la necesidad de integración estable de genes de marcadores seleccionables.
Este método es el primero en tomar ventaja del fenómeno que los ADN dirigidos al núcleo de células de planta usualmente fallan en integrarse posteriormente en el genoma de célula vegetal. Los inventores hicieron el sorprendente descubrimiento, que es posible seleccionar para células que expresan temporalmente un T-ADN de no integración que contiene un gen marcador seleccionable mediante la ubicación de explantes infectados por 5 días en un medio de planta con el agente selectivo apropiado. Un segundo fenómeno que fue aplicado para desarrollar el método actual, es aquél T-ADN de diferentes vectores binarios usualmente dirige el mismo núcleo célula de planta. Mediante el uso de dos vectores binarios diferentes, uno que contiene el marcador seleccionable en un T-ADN, y otro que lleva un T-ADN o P-ADN con las secuencias actuales de interés, fue posible aplicar un sistema de selección transeúnte y obtener poblaciones de callos, brotes o plantas, un fragmento significativo del cual representa eventos de transformación libres de marcador.
Se usó un vector convencional designado pSIM011 para representar el vector con la "secuencia de interés", que es, en este caso de prueba, un casete de expresión para el gen de beta glucuronidasa (GUS) localizado en un T-ADN convencional. El segundo vector binario que fue usado para estos experimentos contiene un casete de expresión que comprende el gen de neomicina fosfotransferasa (NPTII) dirigido por el promotor fuerte del gen de Ubiquitina-7 y seguido por las secuencias terminadoras del gen de nopalina sintasa (nos) entre las fronteras del T-ADN de un pSIM011 derivado.
Sorprendentemente, también se puede obtener un nivel fuerte de niveles de expresión del gen NPTII transeúnte mediante el reemplazamiento del terminador nos con el terminador del gen de deshidrogenasa de alcohol de levadura 1 (ADH1) (Genbank número de acceso V01292, SEQ ID NO. 56). Este hallazgo es interesante porque el terminador ADH1 de levadura no comparte homología con ningún terminador de planta. De manera importante, se debe notar aquí que muchos terminadores de levadura no funcionan adecuadamente en plantas. Por ejemplo, no se observó casi ninguna expresión del gen GUS en un experimento similar como se describió anteriormente con el gen
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GUS seguido por el terminador iso-1-citocromo c (CYC1) de levadura (Genbank número de acceso SCCYT1). Se generó un vector mejorado que lleva el gen NPTII marcador seleccionable mediante reemplazamiento del terminador nos con el terminador ADH1 de levadura. El vector binario que contiene un gen marcador seleccionable para transformación transeúnte es designado "LifeSupport" (Figura 5).
Se infectaron simultáneamente explantes de vástagos de patata con dos cepas LBA4404 de A. tumefaciens que contienen pSIM011 y LifeSupport, respectivamente. Se desarrolló una dilución de A 1/10 de cultivos desarrollados durante la noche de cada cepa por 5-6 horas antes de que fueran precipitadas, lavadas y resuspendidas en DO600nm de 0.4 como se describió en el Ejemplo 3. Se usaron después las células resuspendidas para infectar segmentos de patata intermodales de 0.4-0.6 cm en una densidad final de cada bacteria de 0.2 (DO600nm). Se trataron los vástagos infectados como en el Ejemplo 3 con una diferencia principal: se limitó la selección con kanamicina a los primeros 5 días de cultivo en medio de inducción de callo. Después, se les permitió a los explantes desarrollarse adicionalmente en CIM fresco y SIM que contienen únicamente 150 mg/L de timentina pero no antibiótico selectivo. Dentro de aproximadamente 3 meses desde el día de infección, se ensayaron hojas de brotes derivados de callos desarrollados en 40-60% de los vástagos infectados tanto para determinar expresión de GUS como PCR analizado para identificar eventos que contenían las secuencias de interés pero no gen marcador. Como se muestra en la Tabla 12, 11% de los brotes representaron eventos de transformación de marcador libre.
También se usó el enfoque de dos cadenas descrito anteriormente para transformar tabaco. Los brotes que se desarrollaron dentro de aproximadamente 2 meses fueron ensayados en GUS y analizadas por PCR. La frecuencia alta de eventos de transformación de marcador libre identificada (18%) implica que el método desarrollado es aplicable a especies vegetales diferentes a patata (Tabla 12).
De manera importante, la infección secuencial en vez de simultánea con dos cepas diferentes de Agrobacterium resultó en un incremento en la eficiencia de la transformación del marcador libre. Se descubrió el efecto sorprendente de infecciones secuenciales mediante la infección de explantes de vástagos de patata con la cepa de Agrobacterium que contienen pSIM011, que ubica los explantes infectados en placas de co-cultivo por 4 horas, y después infectadas nuevamente con el vector LifeSupport. Se trataron los explantes infectadas doblemente como se describió previamente en este ejemplo. Como se mostró en la Tabla 13, el tiempo de retraso de 4 horas entre las dos infecciones diferentes resultó en una frecuencia aumentada 2 veces de eventos de transformación de marcador libre en patata.
Ejemplo 11
Reproducción precisa con pSIM340
Este ejemplo demuestra la eficacia de reproducción precisa. Se mejoraron las características de salud y agronómicas de plantas de patata mediante la inserción de elementos genéticos de patata (véanse Ejemplos 1, 4, y 7) en patatas, que usan transformación de marcador libre (Ejemplo 10).
Se creó un vector binario que contiene dos casetes de expresión para el inhibidor de invertasa y genes de oxidasa de polifenol mutantes insertados entre el terminal deP-ADN, designado pSIM340 (Figura 1), mediante la inserción de ambos casetes de expresión de PPO mutante e inhibidor de invertasa en un vector binario pSIM 112’. Se infectaron los explantes de vástagos de patata simultáneamente con pSIM340 y un vector LifeSupport mejorado adicionalmente. Se cocultivaron entonces los explantes infectados, sometidos a selección transeúnte, e inducidos para proliferar y desarrollar brotes como se discutió anteriormente. Después de 3 meses, se transfirieron pequeños brotes a medios nuevos y se les permitió crecer por 3 semanas adicionales. Se analizaron entonces fenotípicamente los brotes, y se recolectó el material de hoja para análisis molecular para determinar la presencia de columna vertebral, gen marcador y P-ADN con las secuencia de interés, como se describió en los Ejemplos 2 y 3. Como se mostró en la Tabla 14, 1.2% de los eventos representaron una planta que contenía el P-ADN modificado de pSIM340 sin LifeSupport. Esta frecuencia de transformación de marcador libre es menor que la encontrada para un T-ADN, que revela nuevamente una diferencia funcional entre P-ADN y T-ADN.
Ejemplo 12
Seleccionar contra integración estable de T-ADN de LifeSupport
Este ejemplo demuestra que la eficiencia de los métodos de reproducción precisa puede ser incrementada mediante selección contra integración estable de T-ADN de LifeSupport que usan el gen bacteriano de citosina desaminasa.
El ejemplo anterior demuestra que la eficiencia de la transformación de marcador libre es varias veces inferior con un P-ADN modificado que con un T-ADN convencional. Para mejorar la eficiencia de generación de brotes que contienen únicamente un P-ADN modificado, se insertó un casete de expresión para una fusión de gen suicida que comprende los genes de citosina desaminasa bacteriana (codA) y uracilo fosforribosiltransferasa (UPP) (InvivoGen, CA) entre las fronteras de T-ADN del vector LifeSupport, que genera pSIM346 (Figura 5). Se infectaron los explantes de vástago de patata con una cepa que lleva pSIM340 y otra que lleva pSIM346, y posteriormente ubicadas en los
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siguientes medios: (1) medio de co-cultivo por 2 días, (2) medio CIMTK para seleccionar expresión de gen marcador transeúnte por 5 días, (3) medio CIMT para permitir la proliferación de células de planta que expresan transitoriamente el gen marcador por 30 días, (4) medio SIMT con 500 mg/L de 5-fluorocitosina (5-FC) no tóxica, que será convertida por células de planta que expresan codA::upp en el 5-fluorouracilo (5-FU) tóxico, para seleccionar contra integración estable de TADN de LifeSupport. El callo dio lugar a brotes en SIMT dentro de 4 semanas. Se transfirieron estos brotes a medio MS con timentina y se permitió que crecieran hasta que estuvo disponible el tejido suficiente para análisis de PCR. Se extrajo entonces el ADN de 100 brotes y se usó para determinar la presencia de P-ADN, LifeSupport columna vertebral. Como se mostró en la Tabla 15, ninguno de los brotes analizados contenía un T-ADN de LifeSupport, que indica, por primera vez que, se puede usar la fusión de gen codA::upp como marcador seleccionable negativo antes de la regeneración. De manera más importante, los resultados demostraron que una selección negativa contra integración T-ADN de LifeSupport aumenta la frecuencia de brotes que únicamente contienen un P-ADN modificado. Mediante acoplamiento de una selección positiva para la expresión del gen marcador transeúnte con una selección negativa contra integración estable de la fusión de gen codA::upp, la frecuencia de brotes que contenía únicamente un P-ADN modificado es aproximadamente 5 veces más alta que al emplear únicamente la selección positiva para la expresión del gen marcador transeúnte (Tabla 15).
Se obtuvo un incremento aún mayor en la eficiencia de la transformación libre de marcador mediante uso del vector pSIM350 de LifeSupport (Figura 5), que es similar a pSIM346 pero contiene el gen codA en cambio de la fusión del gen codA::upp. Los explantes de vástagos de patata simultáneamente infectadas con pSIM340 y pSIM350 se trataron como se describió anteriormente, y se probaron molecularmente 51 brotes resultantes para determinar la ocurrencia de eventos que contienen únicamente la región de T-ADN de pSIM340. De manera interesante, este análisis de PCR reveló que algunos brotes contenían el gen codA (Tabla 15). Este hallazgo demuestra que codA no es tan apretado como un marcador seleccionable negativo como codA::upp en plantas. De manera más importante, se mostró un número grande de brotes (29%) para representar eventos de transformación libre de marcador.
Las eficiencias pueden ser incrementadas adicionalmente al no infectar explantes simultáneamente con pSIM340 y pSIM350 sino secuencialmente. Mediante la infección de explantes con pSIM340 e infectándolas nuevamente con pSIM350 después de 4 horas, se espera que las frecuencias de transformación de marcador libre sean aproximadamente 30-40%.
Ejemplo 13
Perjudicar la integración de T-ADN de LifeSupport
Este ejemplo demuestra que la eficiencia de los métodos de reproducción precisa puede ser incrementada al perjudicar la integración de los T-ADN de LifeSupport en el genoma la planta que usa un gen virD2 omega mutado.
Se ha demostrado que el dominio omega de la proteína VirD2 de Agrobacterium es importante para la capacidad de que la proteína soporte la integración de T-ADN en genomas de plantas (Mysore et al, Mol Plant Microbe Interact 11:. 668-83, 1998). Basado en esta observación, se crearon los vectores LifeSupport modificados que contienen un casete de expresión para una proteína virD2 omega mutada insertada en el sitio SacII en secuencias de columna vertebral. El casete de expresión fue obtenido mediante amplificación de un fragmento de ADN de 2.2-kb del plásmido pCS45 (cortesía de Dr. Walt Ream -Oregon State University, OR, EEUU-, SEQ ID NO.: 36). Se usó un derivado de LifeSupport que lleva este casete de expresión, designado pSIM401Ω (Figura 5), para soportar la transformación de plantas de patata con el P-ADN modificado de pSIM340. Después de selección transeúnte e inducción de brote, se probaron molecularmente 100 brotes para determinar la presencia de transgenes. Como se muestra en la Tabla 15, 4.4% de los brotes únicamente contenían el P-ADN modificado, que indica que el uso de omega-virD2 aumenta la vigencia de transformación de marcador libre aproximadamente 4 veces (Tabla 15).
Se mejoran adicionalmente las eficiencias mediante el incremento del tamaño del T-ADN de LifeSupport de 3.7 kb (en pSIM401Ω) a 8.1 kb (en el pSIM401Ω derivado designado pSIM341Ω; Figura 5). Mediante la regeneración de brotes de explantes de vástagos de patata simultáneamente infectados con pSIM340 y pSIM341Ω, se mostraron 7 de 81 de eventos analizados (7%) para representar eventos de transformación de marcador libre (Tabla 15).
Se puede obtener una mejora adicional mediante la infección de explantes secuencialmente en vez de simultáneamente con pSIM340 y LifeSupport. En una forma similar como se describió en el Ejemplo 10, la frecuencia de plantas que contienen únicamente un P-ADN modificado puede ser aproximadamente doblada mediante infección de explantes con pSIM340 e infectadas nuevamente con LifeSupport después de 4 horas.
Ejemplo 14
Desarrollo de un enfoque de 1-cepa
Este ejemplo demuestra que también se pueden obtener altas frecuencias de transformación de marcador libre mediante el uso de una cepa de Agrobacterium individual que contiene tanto el vector P-ADN como LifeSupport
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Se crearon dos vectores binarios compatibles que puede ser mantenidos simultáneamente en Agrobacterium. En cambio usar este sistema para integrar establemente dos T-ADN que llevan el ADN de interés y un gen marcador, respectivamente (Komari et al. documento US 5731179, 1998), este destino para integración de únicamente el P-ADN modificado.
El primer vector, designado pSIM356, contiene un casete de expresión que comprende un gen GUS dirigido por el promotor Ubi7 y seguido por UbiT entre el terminal de P-ADN. El fragmento de columna vertebral de este vector contiene orígenes bacterianos de replicación de pVS1 y pBR322, un gen de resistencia a espectinomicina para selección bacteriana, y un casete de expresión para el gen IPT para permitir la selección contra integración de columna vertebral en plantas (Figura 1). El segundo vector, designado pSIM363, que contiene un casete de expresión que comprende el gen NPTII dirigido por el promotor Ubi7 y seguido por el terminador ADH1 de levadura insertados entre fronteras convencionales de T-ADN (Figura 5). El fragmento de columna vertebral de este vector contiene orígenes bacterianos de replicación de ColE1 (Genbank número V00268) y ori V (Genbank número M20134), y un gen de resistencia a la kanamicina para selección bacteriana.
Se probó el concepto de aumentar las secuencias de transformación de marcador libre que usan pSIM356 y pSIM363 en 100 brotes de tabaco. Como se mostró en la Tabla 16, aproximadamente 19% de brotes regenerados contenían el ADN de interés sin contenidos sin gen marcador. También se encontró un incremento en la eficiencia de transformación de marcador libre mediante aplicación de este enfoque de 1-cepa a patata. Nueve de 60 brotes independientes probados (15%) contenían el pSIM340 T-ADN y carecían del T-ADN de LifeSupport (Tabla 16).
El enfoque de 1-cepa puede ser combinada con el método descrito en el Ejemplo 12 para acoplar una selección positiva para expresión de gen marcador transeúnte con una selección negativa contra integración estable del gen codA. Para este propósito, se desarrolló el vector pSIM365 de LifeSupport (Figura 5). Se puede usar una cepa de Agrobacterium que lleva este vector junto con un vector de P-ADN para desarrollar eficientemente plantas que únicamente contienen un casete de interés de expresión localizado dentro de un P-ADN establemente integrado en sus genomas.
Ejemplo 15
Método de reproducción precisa que se basa en un marcador nativo
A parte de transformar plantas de cultivo con P-ADN que únicamente contienen las secuencias deseables para introducir rasgos benéficos, la presente descripción también proporciona un método de transformación de tales plantas con P-ADN que contienen un gen marcador nativo adicional. Los genes marcadores novedosos y nativos de elección son homólogos de patata de gen detoxificador Na+/H+ vacuolar de Arabidopsis y gen alfin-1 de alfalfa. La expresión de estos genes no solamente permite la identificación de eventos de transformación, sino también proporciona tolerancia a la sal de la planta son formadas. Los niveles altos de salinidad en un aumento de la superficie cultivada de tierra agrícola por lo tanto afectarán plantas de patata que contienen el marcador de tolerancia a la sal.
Se amplificaron dos versiones de un homólogo detoxificador Na+/H+ vacuolar, designado Pst (tolerancia a la sal de patata) de cADN de una variedad resistente plaga tardía obtenida de US Potato Genbank (WI), designado "LBR4", que usan el par de oligonucleótido 5’-CCCGGGATGGCTTCTGTGCTGGCT -3’ (SEQ ID NO. 89) y 5’-GGTACCTCATGGACCCTGTTCCGT-3’ (SEQ ID NO. 90). Se muestran estas secuencias en SEQ ID NO.:37 y 38. Se amplificó un tercer gen (SEQ ID NO.:39) con homología para alfin-1 de ADN de patata de LBR4 que usan cebadores 5’-CCCGGGTATGGAAAATTCGGTACCCAGGACTG-3’ (SEQ ID NO. 91) y 5’-ACTAGTTAAACTCTAGCTCTCTTGC -3’ (SEQ ID NO. 92). Se evaluó la eficacia de estos genes Pst para funcionar como marcadores de transformación mediante la inserción de una fusión con el promotor Ubi7 entre fronteras de T-ADN convencionales de un vector pSIM341 modificados. Después de un periodo de selección transeúnte, se les permite a las células resistentes a la kanamicina para proliferar y desarrollar brotes. Se transfieren entonces estos brotes a medio que contiene 100-150 mM de cloruro de sodio. Los brotes tolerantes a la sal representan eventos de transformación que contienen el T-ADN del pSIM341modificado.
Ejemplo 16
Promotor específico de tubérculos
Un promotor específico de tubérculos aislado recientemente puede reemplazar el promotor GBSS usado para desarrollar los casetes de expresión descritos en ejemplos anteriores. Se aisló el promotor del genoma de patata Russet Burbank mediante uso de reacción de cadena de polimerasa inversa conservadores específicos para el gen inhibidor de proteinasa de patata (adhesión Genbank D 17332) (SEQ ID NO. 39). Se probó la eficacia del promotor PIP mediante el crecimiento de un vector binario que contiene el gen GUS dirigido por este promotor y un casete de expresión para el gen marcador NPTII. Se usó un constructo similar con el promotor PIP reemplazado por el promotor GBSS como control. Se obtuvieron los brotes transformados mediante infección de explantes de vástagos con cepas de Agrobacterium que llevan los vectores binarios, co-cultivo por 2 días, y selección en medio CIMTK por 2 meses. Se transfirieron estos brotes a nuevos medios para inducir formación de raíz, y después plantar en el suelo. Se pueden evaluar los tubérculos por expresión de GUS después de un periodo de crecimiento de 3 meses en el invernadero.
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5 Ejemplo 17
Constructos preferidos y métodos de transformación para reproducción precisa
Una parte de pSIM340, se pueden usar muchos lectores para mejorar plantas de patata mediante transformación de
10 estas con P-ADN modificados. Dos de tales vectores contienen un casete de expresión para una copia sentido y antisentido del remolque asociado con un gen PPO que es expresada en todos los tubérculos excepto para la epidermis (véase Ejemplo 8). El vector pSIM370 contiene un casete de expresión adicional para una copia sentido y antisentido del líder asociado con el gen de fosforilasa gene (véase Ejemplo 6). El vector pSIM371 contiene un tercer casete de expresión para el homólogo alfin-1 de patata (Figura 1).
15 Un tercer vector alternativo, designado pSIM372, contiene tanto un casete de expresión para el homólogo alfin-1 de patata, como un casete de expresión para una copia sentido y antisentido de una fusión del remolque asociado, líder R1 asociado, y líder de fosforilasa asociado.
20 El vector LifeSupport preferido para un enfoque 1-cepa es pSIM365. Para un enfoque 2-cepa, el vector preferido es pSIM367, que contiene casetes de expresión para tanto NPTII como codA entre las fronteras de T-ADN, un casete de expresión adicional para virD2 omega en la columna vertebral de plásmido (Figure 5).
Los explantes de vástagos de patata están infectados con 1 cepa que lleva tanto pSIM365 como cualquier otro los
25 vectores pSIM370, 371, y 372, o secuencialmente con 2 cepas que lleva pSIM366 y uno de los vectores de interés preferidos, respectivamente. Después de un co-cultivo de 2 días y un periodo de selección transeúnte de 5 días, se transfirieron los explantes a medios para proliferación/regeneración y eliminación de Agrobacterium. Treinta días después, se transfirieron los explantes nuevamente al mismo medio pero ahora que contiene 5-FU para eliminar eventos que contienen T-ADN de LifeSupport. Se transfirieron brotes que surgen posteriormente en callos para
30 medio de regeneración que puede contener 100-200 mM de sal para cribar para eventos tolerantes a la sal. Se permite a los brotes negativos de IPT arraigarse y desarrollarse en plantas maduras. Se predice una proporción grande de estas plantas (10%-100%) para representar plantas de marcador libre y columna libre que contienen un P-ADN con secuencias de nucleótidos de interés integrados establemente en sus genomas.
35 Tabla1. Péptidos no caracterizados expresados potencialmente en líneas de patata antisentido
Gen (tamaño o fragmento usado)
Péptidos predichos codificados por ORF en ADN complementado reverso
R1 (1.9-kb)
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MSSESTFSKT PNGRATDVGI PTEEGTFPFR YAILRDLAPT ISLVNSSADI A
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GLTP (1kb)
VCSPALKADK SKSADGTCVD HSRRLIWLV LYPGMGTSYA TAFISSPPIQ YLFPSDPVET FP
MLGSLVLPKS PENRKQAVPN PHFQEQHLVP EKPHFLDCGQ GFSKLPQMHQ
MVNFLTQGIV DMETAFGSPK MGGFGKEQFG ACVSRSEMDE SGIGAVMVEQ VCSICSRHFV LSMQI
GHTP (0.9-kb)
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MKLCSSIILS IIKQKQVEIL RACFGFPETK TISVFSSVSW NWHIICKSL
MTKKPDRKDN IMPYNFPGTK FLQPIFRNFF LPSLCDKLLK KSISVPQAIT PCWKVQCGHG IKKA
PPO (1.8kb)
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SBE (1.2-kb)
A imagen41
MKFRYPSPPN PIVTSLIILC NAIPRSINDV DGLSRAIKSY ISLSISQNAI VLSPTRA
SBE (2.6-kb)
B MVNIMTSSSM ATKFPSITVQ CNSVLPWQVT SNFIPFVCVL WVEVEYKYQV TTFKHNNLII IIHAAYYLFS
MAKLVTHEIE VPLSSQGHCE KMDHLVKRNS SINNRRSICQ ARHARIHLFV H
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MLYTSLYISY LSNSMLLPSW TNLHHSYSLN NLSTYLGLPL PGGNQNQFLP QKQAGQGPAY QKHLRQ
Tabla 3. Eficiencia de transformación
Vector binario
Explantes + SE de hoja de callo/tabaco Explante de vástago callo/patata + SE
pBI121
7.8 + 0.6 0.31 + 0.10
pSIM108
10.2 + 0.6 0.59 + 0.07
pSIM109
12.8 + 0.6 0.47 + 0,05
Tabla 4. Integración de columna vertebral que resulta de transformación de Russet Ranger
Vector binario
Total Nr. Fenotipo IPT PCR+ para IPT PCR+ para fragmento de columna vertebral de 0.6 kb
pBI121
98 NA NA 54 (55%)
pSIM108
193 138 (71%) 137 (71%) NA
pSIM109
133 82 (62%) 80 (60%) NA
NA: no aplicable
Tabla 5.Integración de columna vertebral que resulta de transformación de Russet Burbank
Vector binario
Total Nr. Fenotipo IPT
PSIM108
79 49 (60%)
PSIM109
72 60 (84%)
Tabla 6. Niveles de acrilamida en patatas fritas derivadas de tuberculillos pSIM320 almacenados en frio
Línea
Glucosa mg/g (%-reducido) Acrilamida (PPB)
No transformada
10.2 469
Control de vector
10.2 NA
320-2
5.4 (47%) 95
320-4
5.8 (43%) 107
320-7
8.7 (14%) 353
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320-9
7.4 (27%) 137
320-17
6.0 (41%) 506
320-21
8.5 (16%) 428
320-33
6,6 (35%) 516
NA: no disponible
Tabla 7.Niveles de acrilamida en patatas fritas derivadas de tubérculos maduros no transformados
Almacenada a 18°C (color id. *)
Almacenada a 4°C (color id. *)
Niveles de glucosa
<0.1 mg/g 3.4 mg/g
Blanqueo de 8 minutos
53 PPB (78) 603 PPB (56)
Blanqueo de 12 minutos
28 PPB (84) 244 PPB (71)
*: un valor más alto indica un color más brillante del producto frito terminado
Tabla 8. Niveles de glucosa en tuberculillos pSIM332 almacenados en frio
Línea
Glucosa mg/g (%-reducida)
Control no transformado
11.6 + 0.5
Control de vector
11.5 + 0.5
332-1
5.4 (53%)
332-2
4.8 (58%)
332-4
7.0 (39%)
332-5
5.8 (50%)
332-6
6.9 (40%)
332-7
6.0 (48%)
332-8
6.8 (41%)
332-9
6.6 (43%)
332-10
5.4 (53%)
332-11
6.1 (47%)
332-12
6.4 (44%)
332-13
6.4 (44%)
332-15
7.7 (33%)
332-16
6.5 (43%)
332-17
5.3 (54%)
332-18
7.1 (38%)
332-21
6.3 (46%)
332-22
5.4 (53%)
332-23
4.2 (63%)
332-31
6.0 (48%)
332-34
6.2 (48%)
imagen44
332-35
6.4 (44%)
332-39
6.7 (41%)
332-40
7.5 (35%)
332-41
5.7 (50%)
Tabla 9. Niveles de glucosa en tuberculillos pSIM216 almacenados en frio Tabla11. Actividad de PPO en tuberculillos de patata que expresa una secuencia remolque modificada asociada con el gen PPO
Línea
Glucosa mg/g (%-reducida)
Control no transformado
11.6 + 0.5
Control de vector
11.5 + 0.5
216-2
5.5 (52%)
216-3
8.8 (23%)
216-4
7.4 (36%)
216-5
5.8 (50%)
216-8
8.4 (27%)
216-10
5.1 (56%)
216-11
10.1 (19%)
216-12
9.3 (19%)
216-13
6.4 (44%)
216-15
8.8 (23%)
216-16
9.7 (16%)
216-17
6.4 (44%)
216-19
8.7 (24%)
216-21
3.2 (72%)
216-24
9.4 (18%)
216-26
9.3 (19%)
216-29
7.1 (38%)
216-30
8.2 (29%)
216-32
9.3 (19%)
216-34
7.1 (38%)
216-35
7.8 (32%)
216-38
7.1 (38%)
216-42
8.1 (30%)
216-44
9.4 (18%)
216-45
10.2 (11%)

Tabla 10. Actividad de PPO en líneas de patata que expresan un gen PPO modificado
Línea
DO-410/gramo
tuberculillos (%reducido)
tuberculillos (%-reducido)
Controles no transformados
24.59 + 2.22 20.07 + 1.21
Controles de vectores
22.59 + 3.36 19.55 + 1.43
imagen45
314-1
2.36 (90%) 17.8 (11%)
314-2
41.52 (-76%) 21.3 (-7%)
314-4
18.40 (22%) 5.4 (73%)
314-5
8.49 (64%) 19.1 (4%)
314-7
16.04 (32%) 16 (20%)
314-8
14.86 (37%) 17 (15%)
314-9
5.43 (77%) 4.3 (78%)
314-12
19.35 (18%) 19.6 (2%)
314-13
18.17 (23%) 15.4 (23%)
314-14
18.64 (21%) 17.32 (13%)
314-16
13.92 (41%) 18.2 (9%)
314-17
5.19 (78%) 2.4 (88%)
314-20
26.66 (-13%) 13.2 (34%)
314-21
11.32 (52%) 17.6 (12%)
314-22
13.45 (43%) 18.8 (6%)
314-23
5.19 (78%) 20.4 (-2%)
314-24
15.10 (36%) 19.6 (2%)
314-25
23.12 (2%) 19 (5%)
314-26
13.45 (43%) 17.8 (11%)
314-27
26.42 (-12%) 19.4 (3%)
314-28
31.85 (-35%) 19.4 (3%)
314-29
3.77 (84%) 14.8 (26%)
314-31
23.83 (-1%) 21.2 (-6%)
314-32
28.78 (-22%) 20 (0%)
Línea
DO-410/gramo (% -reducido)
Controles no transformados
20.6 + 1.3
Controles de vector
17.9 + 2.1
217-1
12.5 (39.4%)
217-4
12.6 (38.6%)
217-5
11.3 (45.0%)
217-6
6.1 (70.4%)
217-7
5.7 (72.5%)
217-9
10.4 (49.6%)
217-10
15.2 (26.3%)
217-11
15.2 (26.3%)
217-12
6.6 (67.9%)
imagen46
217-14
15.4 (25.4%)
217-15
13.5 (34.6%)
217-16
6.0 (71.0%)
217-17
9.7 (53.0%)
217-19
8.6 (58.4%)
217-21
14.2 (31.1%)
217-22
9.7 (53.0%)
217-23
15.2 (26.3%)
217-24
8.2 (60.1%)
217-25
11.9 (42.2%)
217-26
3.1 (84.8%)
217-27
6.2 (69.9%)
217-29
7.2 (65.1%)

Tabla 12. Transformación de marcador libre con el vector LifeSupport + pSIM011
Planta
Co-transformado Únicamente marcador Gen de interés únicamente No transformado
Patata
0% 33% 11% 56%
Tabaco
20% 26% 18% 36%
Cotransformado: PCR-positivo para tanto GUS como NPT Gen-de-interés únicamente: PCR-positivo para GUS No transformado: Plantas son negativas en PCR para tanto GUS como NPT

Tabla 13. Transformación de patata secuencial con el vector LifeSupport y pSIM011
Ventana de tiempo
Co-transformado Únicamente marcador Gen de interés únicamente No transformado
O hrs
9% 36% 9% 46%
4 hrs
20% 30% 20% 30%
No transformado: Plantas son negativas en PCR para marcador y gen de interés

Tabla 14. Transformación de marcador libre con el vector pSIM340 + LifeSupport de P-ADN
Planta
Co-transformado Únicamente marcador Gen de interés únicamente No transformado
Patata
17% 52.8% 1.2% 29%
Cotransformado: positivo en PCR para tanto el gen PPO de pSIM340 como No transformado: Plantas son negativas en PCR por PPO y NPTII
gen NPT de LifeSupport
Tabla15. Transformación de patata de marcador libre con vectores pSIM340 + LifeSupport mejorado
46

Claims (9)

  1. imagen1
    Reivindicaciones
    1.
    Un método de reducción de la acumulación de acrilamida producida por la reacción de Maillard durante la fritura, que comprende transformar en un genoma de vegetal de cultivo un casete de expresión que comprende una secuencia que, tras la expresión, (a) silencia un gen R1 endógeno, (b) silenciar un gen de fosforilasa de tipo L endógeno, y/o (c) sobreexpresar un gen inhibidor de invertasa.
  2. 2.
    El método de la reivindicación 1, en el que el casete de expresión silencia un gen R1.
  3. 3.
    El método de la reivindicación 1, en el que el casete de expresión silencia un gen de fosforilasa de tipo L.
  4. 4.
    El método de la reivindicación 1 o 2, en el que el casete de expresión comprende:
    (a)
    un constructo líder que comprende en dirección 5’ a 3’ un promotor, una secuencia líder orientada en sentido, la secuencia antisentido del líder, y un terminador, en el que la expresión de las secuencias produce una molécula de ARN de cadena doble que facilita la regulación reducida de expresión del gen al cual está asociado, en el que la secuencia líder está asociada con, y localizada corriente arriba de, la región que codifica del gen R1; o
    (b)
    un constructo remolque que comprende en dirección 5’ a 3’ un promotor, una secuencia remolque orientada en sentido, la secuencia antisentido remolque, y un terminador, en el que la expresión del constructo remolque produce una molécula de ARN de cadena doble que facilita la regulación reducida de expresión del gen al cual está asociado, en el que la secuencia remolque está asociada con, y localizada corriente abajo de, la región que codifica del gen R1.
  5. 5. El método de la reivindicación 1 o 3, en el que el casete de expresión comprende:
    (a)
    un constructo líder que comprende en dirección 5’ a 3’ un promotor, una secuencia líder orientada en sentido, la secuencia antisentido del líder, y un terminador, en el que la expresión de las secuencias produce una molécula de ARN de cadena doble que facilita la regulación reducida de expresión del gen al cual está asociado, en el que la secuencia líder está asociada con, y localizada corriente arriba de, la región que codifica de un gen de fosforilasa de tipo L; o
    (b)
    un constructo remolque que comprende en dirección 5’ a 3’ un promotor, una secuencia remolque orientada en sentido, la secuencia antisentido remolque, y un terminador, en el que la expresión del constructo remolque produce una molécula de ARN de cadena doble que facilita la regulación reducida de expresión del gen al cual está asociado, en el que la secuencia remolque está asociada con, y localizada corriente abajo de, la región que codifica
    de un gen de fosforilasa de tipo L
  6. 6.
    El método de la reivindicación 4, en el que el R1 o líder o remolque orientado en sentido y antisentido están separadas por una secuencia de polinucleótidos espaciadores.
  7. 7.
    El método de la reivindicación 5, en el que el gen de fosforilasa de tipo L o secuencias líder o remolque están separadas por una secuencia de polinucleótidos espaciadores.
  8. 8.
    El método de una cualquiera de las anteriores reivindicaciones, en el que la planta de cultivo es una planta de patata.
  9. 9.
    El método de la reivindicación 8, en el que dicho método comprende adicionalmente freír una patata de la planta de patata.
    95
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