ES2229472T3 - Metodo mejorado de transformacion para plantas. - Google Patents
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Abstract
PROCESO PARA INTEGRAR UN FRAGMENTO DE DNA EN EL GENOMA DE UNA CELULA DE UNA PLANTA MONOCOTILEDONEA, COMPRENDIENDO EL PROCESO LOS PASOS DE: 1) INCUBAR, ANTES DE PONERLO EN CONTACTO CON EL FRAGMENTO DE DNA, UN CULTIVO DE CELULAS NO TRANSFORMADAS DE PLANTAS MONOCOTILEDONEAS EN UN MEDIO DE CULTIVO QUE COMPRENDE UN COMPUESTO FENOLICO VEGETAL, DURANTE UN PERIODO DE TIEMPO SUFICIENTE PARA ESTIMULAR LA DIVISION CELULAR Y FOMENTAR LA COMPETENCIA PARA LA INTEGRACION DEL DNA EXTRAÑO; Y 2) PONER LAS CELULAS NO TRANSFORMADAS EN CONTACTO CON EL FRAGMENTO DE DNA, EN CONDICIONES EN LAS QUE EL FRAGMENTO DE DNA ES RECIBIDO POR LAS CELULAS NO TRANSFORMADAS E INTEGRADO DE FORMA ESTABLE EN EL GENOMA DE LAS CELULAS NO TRANSFORMADAS, A FIN DE GENERAR CELULAS TRANSFORMADAS.
Description
Método mejorado de transformación para
plantas.
La presente invención se refiere a cultivos de
tejidos de células vegetales, particularmente células de plantas
monocotiledóneas, muy particularmente células de maíz, arroz, trigo
y cebada, y técnicas mejoradas para obtener células vegetales y
plantas transformadas genéticamente.
A lo largo de los años se han desarrollado muchas
técnicas para la transformación genética de plantas. Estos métodos
tienen como su meta última la obtención de una planta transgénica,
en la cual todas las células contengan un DNA extraño que comprende
un gen de interés (el denominado transgén) integrado de manera
estable en su genoma, particularmente su genoma nuclear.
La transformación es un proceso complejo que
implica siempre la puesta en contacto de células de partida con un
DNA, usualmente un DNA que comprende uno o más genes extraños de
interés. La puesta en contacto de las células con el DNA se lleva a
cabo en condiciones que promueven la captura del DNA por las células
y la integración del DNA, que incluye el o los genes de interés en
el genoma de la célula.
Las células de partida para la transformación son
usualmente células que se han cultivado in vitro durante
algún tiempo. Después del contacto de las células con el DNA, las
células transformadas necesitan por lo general ser cultivadas in
vitro durante cierto periodo de tiempo a fin de separar las
células transformadas de las células no transformadas y regenerar
plantas transformadas a partir de las células transformadas.
Se han descrito diferentes métodos de
transformación de plantas, los cuales pueden clasificarse en
métodos de transferencia directa de DNA (v.g. electroporación,
captura de DNA mediada por PEG, biolística) o transferencia de DNA
mediada por Agrobacterium. Vasil (1994) y Christou (1994) han
revisado los métodos de transformación de plantas disponibles para
cereales. La transferencia de DNA mediada por Agrobacterium
es uno de los medios más eficientes de transferencia de DNA a
células vegetales, y requiere probablemente el mínimo soporte
físico tecnológico de los diferentes métodos de transformación.
Asimismo, cuantitativamente, las plantas transformadas obtenidas
por transferencia de DNA mediada por Agrobacterium son
superiores, en el sentido de que comprenden un menor número de
transgenes insertados en diferentes posiciones en el cromosoma, y
en que los transgenes aberrantes tienen una menor aparición. La
transformación del DNA de plantas mediada por Agrobacterium
está basada en la capacidad de ciertas cepas de
Agrobacterium para introducir una parte de su plásmido Ti, es
decir el T-DNA, en células vegetales e integrar
este T-DNA en el genoma nuclear de las células. Se
ha encontrado que la parte del plásmido Ti que se transfiere y se
integra está delineada por secuencias de DNA específicas, las
denominadas secuencias de borde izquierdo y derecho de
T-DNA, y que las secuencias naturales de
T-DNA entre estas secuencias de borde pueden
reemplazarse por DNA extraño (Publicación de Patente Europea
"EP" 116718; Deblaere et al. 1987).
La transformación mediada por
Agrobacterium de plantas monocotiledóneas ha sido consignada
varias veces (véase infra). La aplicabilidad de los métodos
consignados ha estado limitada, sin embargo, a especies o genotipos
específicos, o ha requerido el uso de tejidos específicos, o cepas
especializadas de Agrobacterium. Sin embargo, para la
mayoría de los métodos consignados, la eficiencia de transformación
puede mejorarse notablemente.
Hooykaas-Van Slogteren et
al. (1984), describen la detección de la expresión del gen del
plásmido Ti en dos especies de monocotiledóneas (Chlorophytum
capense y Narcissus cv 'Paperwhite') infectadas con cepas
tumorígenas de Agrobacterium.
Hernalsteens et al. (1984) y Bytebier
et al. (1987), describen la transformación de Asparagus
officinalis utilizando materiales aislados naturales de
Agrobacterium tumefaciens, así como cepas de Agrobacterium
tumefaciens que comprenden un T-DNA no
oncogénico.
La Patente U.S. No. 5.164.310 describe un método
para transformar plantas (que comprenden maíz y trigo) por
inoculación de ápices de brotes cortados y cultivados de las
plantas con Agrobacterium tumefaciens.
Las Patentes U.S. Núms. 5.187.073 y 5.177.010
describen un método de producción de Gramíneas (cereales)
transformadas que comprende producir una lesión en una planta de
semillero en un área de la planta de semillero que contiene células
que se dividen rápidamente e inocular la lesión con Agrobacterium
tumefaciens vir+.
La publicación de patente PCT WO 92/09696
describe el uso de un callo embriogénico compacto (es decir callo
tipo I en el maíz) y embriones inmaduros (lesionados mecánica o
enzimáticamente) de plantas monocotiledóneas (v.g. maíz y trigo)
como material de partida para procedimientos de transformación.
El documento EP 0604662 A1 describe un método de
transformación de tejidos cultivados de una monocotiledónea en o
después de diferenciación con una bacteria del género
Agrobacterium que contiene genes deseados. El documento EP
0672752 A1 describe un método de transformación de un escudete de un
embrión inmaduro no desdiferenciado de una monocotiledónea con un
Agrobacterium. Ambas solicitudes describen el uso de cepas
de Agrobacterium que tienen un plásmido que contiene un
fragmento de DNA procedente de la región de virulencia del plásmido
Ti pTiBo542 además del plásmido Ti o Ri.
Raineri et al. (1990) describen la
transformación de cultivos derivados de embriones de dos variedades
cultivadas de arroz, lesionadas en la región del escudete,
utilizando un sistema de transferencia génica mediado por
Agrobacterium.
Chan et al. (1993) describen un método
para transformar embriones inmaduros de arroz que se han cultivado
durante 2 días en presencia de ácido
2,4-diclorofenoxi-acético
("2,4-D") por inoculación con cepas de
Agrobacterium en un medio que contiene células de cultivo de
patata en suspensión.
Mooney et al. (1991) describen un método
para introducción mediada por Agrobacterium de un gen
resistente a la kanamicina en embriones de trigo tratados con
enzima.
Ha sido comunicada la introducción de los genes
vir de plásmidos Ti o plásmidos adyuvantes de cepas de
Agrobacterium por incubación de las bacterias con
acetosiringona antes de cocultivo para mejorar la transformación, y
adición de acetosiringona durante el cocultivo de las células
vegetales con las bacterias (Van Wordragen y Dons, 1992; Jacq et
al. 1993; James et al. 1993).
Guivarc'h et al. (1993) describen la
mejora de la transformación transitoria mediada por
Agrobacterium de discos de raíz de zanahoria por un
pretratamiento breve de estos discos durante 10 minutos con
acetosiringona.
Se proporciona un proceso para integración de un
fragmento de DNA en el genoma de una célula de una planta
monocotiledónea, particularmente maíz, arroz, trigo o cebada, que
comprende los pasos de:
- 1)
- incubar, antes del contacto con el fragmento de DNA, un cultivo de células de planta monocotiledónea no transformadas en un medio que comprende un compuesto fenólico vegetal, particularmente un compuesto fenólico vegetal seleccionado del grupo de acetosiringona, \alpha-hidroxi-acetosiringona, ácido sinápico, ácido siríngico, ácido ferúlico, catecol, ácido p-hidroxibenzoico, ácido \beta-resorcílico, ácido protocatéquico, ácido pirogálico, ácido gálico y vainillina, durante un periodo de tiempo suficiente para estimular la división celular y mejorar la competencia para integración de DNA extraño, con preferencia durante aproximadamente 1 a 10 días, y en particular durante aproximadamente 4 a 5 días; y
- 2)
- poner en contacto las células no transformadas con el fragmento de DNA en condiciones en las cuales el fragmento de DNA es capturado por las células no transformadas y se integra de manera estable en el genoma de las células no transformadas, para generar células transformadas, particularmente por medio de electroporación, transferencia génica directa utilizando polietilenglicol, bombardeo con microproyectiles recubiertos con DNA o por co-cultivo con una cepa de Agrobacterium que comprende el fragmento de DNA.
Opcionalmente, las células transformadas pueden
regenerarse en una planta monocotiledónea transgénica.
Se proporciona adicionalmente un proceso para
integrar un fragmento de DNA en el genoma de una célula de una
planta de maíz, que comprende los pasos de:
- incubar, antes del contacto con el fragmento de DNA, un callo tipo I, preferiblemente un callo tipo I que se ha cortado en fragmentos, particularmente fragmentos que tienen una longitud máxima de 0,5 a 5 mm, con un compuesto fenólico vegetal, particularmente un compuesto fenólico vegetal seleccionado del grupo de acetosiringona, \alpha-hidroxi-acetosiringona, ácido sinápico, ácido siríngico, ácido ferúlico, catecol, ácido p-hidroxibenzoico, ácido \beta-resorcílico, ácido protocatéquico, ácido pirogálico, ácido gálico y vainillina, durante un periodo de tiempo suficiente para estimular la división celular y mejorar la competencia para integración de DNA extraño, con preferencia durante aproximadamente 1 a 10 días, y en particular durante aproximadamente 4 a 5 días; o
- incubar, antes del contacto con el fragmento de DNA, un callo tipo I, en un medio que comprende un compuesto fenólico vegetal durante un periodo de tiempo suficiente para estimular la división celular y mejorar la competencia para la integración de DNA extraño antes de cortar el callo tipo I en fragmentos, particularmente fragmentos que tienen una longitud máxima de 0,5 a 5 mm; y
- 2)
- poner en contacto las células no transformadas con el fragmento de DNA en condiciones en las cuales el fragmento de DNA es capturado por las células no transformadas y se integra de manera estable en el genoma de las células no transformadas, para generar células transformadas, particularmente por medio de electroporación, transferencia génica directa utilizando polietilenglicol, bombardeo con microproyectiles recubiertos con DNA o por co-cultivo con una cepa de Agrobacterium que comprende el fragmento de DNA.
Se proporciona también un método de aumentar la
frecuencia de la transformación estable en plantas monocotiledóneas
en presencia de un compuesto fenólico vegetal, en el cual el
compuesto fenólico vegetal se incluye en el medio en el cual se
cultivan las células vegetales antes del contacto del tejido
cultivado con el DNA extraño.
Se proporcionan adicionalmente composiciones de
medios vegetales que comprenden al menos dos compuestos fenólicos
vegetales.
La invención está basada en la observación
inicial de que el cultivo de callos vegetales, particularmente
callos de maíz, muy particularmente fragmentos cortados finamente
de callos de maíz tipo I, en un medio de cultivo que comprende
compuestos fenólicos vegetales, tales como acetosiringona, durante
aproximadamente 5 días, estimulaba notablemente la división celular,
produciendo reproduciblemente callos con competencia mejorada para
integración en el genoma del DNA extraño transferido a la célula
por transformación mediada por Agrobacterium, como se
reflejaba por el número de células y plantas transformadas que se
recuperaban en condiciones normalizadas.
"Células no transformadas", tal como se
utiliza en esta memoria, hace referencia a células que no se han
puesto en contacto con el fragmento de DNA particular que se
utilizará cuando se aplica el método de la invención. Es innecesario
decir que dichas células pueden derivarse también de una planta o
tejido vegetal transgénico(a), transformado(a)
previamente con un fragmento de DNA diferente o similar.
La "eficiencia de transformación" o
"frecuencia de transformación", tal como se utiliza en esta
memoria, puede medirse por el número de células transformadas (u
organismos transgénicos desarrollados a partir de células
transformadas individuales) que se recuperan en condiciones
experimentales estándar (es decir estandarizadas o normalizadas con
respecto a la cantidad de células puestas en contacto con el DNA
extraño, cantidad de DNA suministrado, tipo y condiciones de
suministro del DNA, condiciones generales de cultivo, etc.). Por
ejemplo, cuando se utilizan fragmentos de callo como material de
partida para la transformación, la frecuencia de transformación
puede expresarse como el número de líneas de planta transgénica
obtenidas por 100 fragmentos de callo transformados. Se obtuvieron
frecuencias de transformación de aproximadamente 1% o mayores
utilizando el método de la invención.
Una "línea de planta" transgénica, tal como
se utiliza en esta memoria, está constituida por un grupo de plantas
transgénicas, originadas a partir de una sola unidad de células
cultivadas, v.g., un fragmento de callo transformado, obtenido
durante el proceso de regeneración. En general, plantas procedentes
de una sola línea vegetal son genéticamente idénticas, y se
originan a partir de un solo suceso de transformación, que
comprende por tanto los mismos transgenes integrados en las mismas
posiciones genómicas. Sin embargo, las plantas individuales
procedentes de una sola línea vegetal como se define en esta
memoria pueden originarse a partir de sucesos de transformación
independientes, particularmente cuando se utiliza transferencia de
DNA mediada por Agrobacterium, y pueden diferir por tanto
unas de otras. Cuando las frecuencias de transformación se expresan
por el número de líneas de plantas/100 fragmentos iniciales de
callo, es posible que las frecuencias reales de transformación
(sucesos de transformación/100 fragmentos iniciales de callo) sean
mayores aún.
"Compuestos fenólicos vegetales" o
"materiales fenólicos vegetales" adecuados para la invención
son aquellas moléculas fenólicas sustituidas aisladas que son
capaces de inducir una respuesta quimiotáctica positiva,
particularmente aquéllas que son capaces de inducir la expresión
incrementada del gen vir en una especie de
Agrobacterium que contiene plásmido Ti, particularmente un
Agrobacterium tumefaciens que contiene plásmido Ti.
Métodos para medir las respuestas quimiotácticas hacia compuestos
fenólicos vegetales han sido descritos por Ashby et al.
(1988) y métodos para medir la inducción de la expresión del gen
vir son también bien conocidos (Stachel et al. 1985;
Bolton et al. 1986).
Se cree que el efecto beneficioso sobre la
eficiencia de transformación por incubación de los tejidos vegetales
en un medio que contiene un compuesto fenólico vegetal es debido en
gran parte a la inducción de la división celular y el aumento de la
competencia para incorporación de DNA extraño en el genoma de la
célula vegetal. Se sabe que la mayoría de las plantas
monocotiledóneas, particularmente los cereales, después de una
lesión no responden de manera similar a la observaba en la mayoría
de las plantas dicotiledóneas (Potrykus, 1991). Se cree que el
suministro exógeno de compuestos fenólicos vegetales puede
desencadenar una respuesta semejante a una lesión y,
particularmente cuando se aplica a plantas monocotiledóneas. La
inducción de genes vir por concentraciones residuales de
compuestos fenólicos vegetales absorbidos por los tejidos de las
plantas pretratadas, cuando se utiliza transferencia de DNA mediada
por Agrobacterium, puede afectar también a la eficiencia de
transformación, pero se cree que este efecto es menos importante.
De hecho, se observó también una mejora similar de la
transformación cuando se utilizaron métodos de transferencia
directa de DNA.
Compuestos fenólicos vegetales preferidos son los
encontrados en exudados de lesiones de células vegetales. Uno de los
compuestos fenólicos vegetales mejor conocidos es la
acetosiringona, que está presente en numerosas células lesionadas e
intactas de diversas plantas, aunque en concentraciones diferentes.
Sin embargo, la acetosiringona
(3,5-dimetoxi-4-hidroxiacetofenona)
no es el único compuesto fenólico vegetal que puede inducir la
expresión de genes vir. Otros ejemplos son
\alpha-hidroxi-acetosiringona,
ácido sinápico (ácido
3,5-dimetoxi-4-hidroxicinámico),
ácido siríngico (ácido
4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzoico),
ácido ferúlico (ácido
4-hidroxi-3-metoxicinámico),
catecol (1,2-dihidroxibenceno), ácido
p-hidroxibenzoico (ácido
4-hidroxibenzoico), ácido
\beta-resorcílico (ácido
2,4-dihidroxibenzoico), ácido protocatéquico (ácido
3,4-dihidroxibenzoico), ácido pirogálico (ácido
2,3,4-trihidroxibenzoico), ácido gálico (ácido
3,4,5-trihidroxibenzoico) y vainillina
(3-metoxi-4-hidroxibenzaldehído),
y estos compuestos fenólicos se sabe que son o se espera que sean
capaces de reemplazar la acetosiringona en los medios de cultivo
con resultados similares. Tal como se utilizan en esta memoria, se
hace referencia a las moléculas mencionadas como compuestos
fenólicos vegetales.
Los compuestos fenólicos vegetales pueden
añadirse al medio de cultivo de plantas sea solos o en combinación
con otros compuestos fenólicos vegetales. Una combinación
particularmente preferida de compuestos fenólicos vegetales
comprende al menos acetosiringona y ácido
p-hidroxibenzoico, pero se espera que otras
combinaciones de dos, o más, compuestos fenólicos vegetales actúen
también sinérgicamente en la mejora de eficiencia de
transformación.
Además, se espera que ciertos compuestos, tales
como osmoprotectores (v.g. L-prolina, con
preferencia a una concentración de aproximadamente 700 mg/l o
betaína), fitohormonas (inter alia NAA), opinas, o azúcares,
actúen sinérgicamente cuando se añaden en combinación con
compuestos fenólicos vegetales.
Aunque la invención es particularmente útil para
la transferencia mejorada de DNA mediada por Agrobacterium a
células vegetales, particularmente células de maíz, cultivos de
células vegetales, particularmente de plantas monocotiledóneas, que
han sido pretratadas con materiales fenólicos vegetales pueden
emplearse también para obtener eficiencia mejorada de transformación
utilizando métodos de transferencia directa de DNA, tales como
transferencia de DNA mediada por PEG, bombardeo con partículas o
electroporación. Básicamente, la presente invención proporciona por
tanto una mejora de los procedimientos existentes para la
transformación genética de células vegetales, particularmente
células de plantas monocotiledóneas, muy particularmente células de
maíz, por inclusión en el medio en el que se cultivan dichas células
de un compuesto fenólico vegetal tal como acetosiringona, durante
un periodo de tiempo definido. En particular, las células vegetales
o tejidos vegetales se cultivan durante 5 días en un medio de
cultivo que contiene acetosiringona (100-200 \muM)
antes del momento en el cual las células se ponen en contacto con
el DNA extraño, que se introduce en las células sea directamente
por electroporación, transferencia de DNA mediada por PEG o
bombardeo con partículas, o preferiblemente por la vía de
transferencia de DNA mediada por Agrobacterium.
En una realización preferida, el método de la
invención se utiliza para mejorar la frecuencia de transformación
de la transferencia de DNA mediada por Agrobacterium a
células vegetales, particularmente células de maíz.
En muchos procedimientos convencionales para
transformación genética de células vegetales, particularmente
células vegetales de monocotiledóneas, se utilizaran como
materiales vegetales células cultivadas, tejidos o explantes, y las
células se pondrán en contacto en tales cultivos con DNA extraño
que comprende al menos un gen de interés (es decir el transgén) en
condiciones que promoverán la captura de DNA extraño en el genoma
de las células. Medios adecuados para el cultivo de células
vegetales, tejidos, órganos o explantes se conocen generalmente en
la técnica. Medios de cultivo de plantas preferidos son medios de
cultivo definidos para los cuales se conoce la composición
química.
En una realización de la invención, se prefiere
que el compuesto fenólico vegetal, particularmente acetosiringona,
se añada al medio durante un periodo de aproximadamente 4 a 5 ó 6
días, con preferencia al menos aproximadamente 5 días, antes del
contacto de las células con el DNA extraño. El periodo exacto
durante el cual las células cultivadas se incuban en el medio que
contiene el compuesto fenólico vegetal tal como acetosiringona, se
cree que no es crítico, pero probablemente no debería exceder de
dos semanas. Parece ser que 1-10 días,
particularmente 3-7 días, es un periodo óptimo y se
obtuvieron los mejores resultados con un periodo de incubación de
aproximadamente 4 a 5 ó 6 días antes del momento de contacto.
Generalmente, se cree que aproximadamente 5 días es un periodo útil
para que el compuesto fenólico vegetal se añada al medio de cultivo
ante del momento de contacto.
Debería tenerse en cuenta que el tejido cultivado
podría exhibir pardeo o incluso necrosis limitada después de
incubación en el medio que contiene el compuesto fenólico vegetal,
particularmente cuando se incluye ácido gálico en el medio de
cultivo. Sin embargo, puede obtenerse una eficiencia de
transformación mejorada utilizando estas células, tejidos o
explantes cultivados.
Se cree también que la concentración del
compuesto fenólico vegetal en el medio tiene cierto efecto sobre el
desarrollo de competencia para la transformación integradora, que
varía dependiendo de la naturaleza de las células (especie,
explante de tejido, condiciones generales de cultivo, etc.). Sin
embargo, dentro de ciertos intervalos de concentración, el efecto
es mínimo, especialmente cuando las células cultivadas no se
incuban durante más de 7 días. El intervalo óptimo de concentración
de compuestos fenólicos vegetales en el medio puede variar
dependiendo de la especie de la cual se deriva el tejido, la célula
o el cultivo de células, o del tipo de tejido utilizado, pero se
espera que aproximadamente 100 \muM-200 \muM
sea una concentración adecuada para muchos propósitos (v.g. para uso
con material derivado de maíz). La concentración óptima puede
depender también de la naturaleza del compuesto fenólico vegetal
específico utilizado, en particular de su fuerza de promoción de la
división celular.
Se ha encontrado, por ejemplo, que la
concentración óptima para acetosiringona es aproximadamente 200
\muM, pero pueden utilizarse concentraciones tan bajas como
aproximadamente 25 \muM para obtener un efecto satisfactorio sobre
la eficiencia de transformación. Análogamente, se espera que
concentraciones mayores, hasta aproximadamente 400 \muM,
produzcan efectos similares.
Concentraciones comparables se aplican también a
otros compuestos fenólicos vegetales, y las concentraciones óptimas
pueden ser establecidas fácilmente por experimentación de acuerdo
con esta invención.
Como se ha expuesto anteriormente, los
procedimientos de transformación de plantas incluyen generalmente el
cultivo de células, cultivos celulares, tejido o explantes antes de
la puesta en contacto del tejido cultivado con el DNA extraño. Se
han descrito varios tejidos como material de partida para los
procedimientos de transformación, con inclusión, pero sin carácter
limitante, de semillas secas, embriones inmaduros, inflorescencias
inmaduras, anteras, microsporas, escudetes, nudos, bases de hojas
jóvenes, explantes de hipocotilos, raíces (particularmente puntas de
raíces, callos embriogénicos compactos (v.g. tipo I en el maíz),
callos embriogénicos friables (tipo II en el maíz), cultivos de
suspensión, cultivos de agregados celulares suspendidos, embriones
somáticos y ápices de brotes. Se espera que la inclusión de
compuestos fenólicos vegetales, particularmente acetosiringona, en
el medio en el que se incuban estos tejidos, células, cultivos
celulares o explantes antes del contacto con el DNA extraño,
mejorará la eficiencia de transformación, particularmente cuando se
utiliza transformación mediada por Agrobacterium.
Está claro que siempre que se utilice la
"incubación en un medio (vegetal)", el medio puede ser líquido
o sólido. En el marco de las invenciones, los medios vegetales
comprenden al menos un compuesto fenólico vegetal.
Es innecesario decir que, en los casos en la que
la meta final del procedimiento de transformación es regenerar
plantas transgénicas, particularmente plantas fenotípicamente
normales, el material de partida debería ser capaz de regeneración,
como está documentado extensamente en la técnica anterior.
En una realización particularmente preferida,
células vegetales competentes en transformación, preferiblemente
células vegetales competentes en transformación de
Agrobacterium, se generan por incubación de callos compactos
regenerables, tales como callos de maíz tipo I en un medio que
comprende un compuesto fenólico vegetal, preferiblemente
acetosiringona. A este fin, el callo compacto se divide por corte
en fragmentos más pequeños. El callo resultante debería comprender,
totalmente o al menos en parte, los sectores o partes regenerables
(v.g. embriogénicos) del callo. Los fragmentos de callo tienen
también preferiblemente una longitud máxima media de 0,5 a 5 mm,
particularmente 1 a 2 mm, y más particularmente 1,25 a 1,75 mm, y
preferiblemente tienen una longitud mínima de aproximadamente 0,1
mm. Sin embargo, es factible utilizar fragmentos de callo tipo I
mayores, de hasta aproximadamente 1 cm. Después de cultivo en el
medio que comprende el compuesto fenólico vegetal, los callos
pueden ponerse en contacto con el DNA extraño, preferiblemente con
las agrobacterias que comprenden el DNA extraño, sin lesión o
pretratamiento enzimático adicional.
Alternativamente, el callo compacto puede
incubarse, sin ser lesionado (es decir cortado), en un medio que
comprende un compuesto fenólico vegetal, y subsiguientemente puede
lesionarse, es decir, cortarse en fragmentos más pequeños,
particularmente fragmentos que tienen las dimensiones arriba
mencionadas antes del paso de puesta en contacto.
En otra realización, células competentes en
transformación, particularmente competentes en transformación por
Agrobacterium, se generan por incubación de embriones
inmaduros, preferiblemente embriones inmaduros de maíz en un medio
que comprende un compuesto fenólico vegetal, preferiblemente
acetosiringona. A este respecto, para plantas tales como el maíz,
se prefiere que los embriones inmaduros tengan una longitud máxima
de aproximadamente 0,5 a 2 mm, preferiblemente 0,5 a 1,5 mm, aun
cuando pueden utilizarse embriones más pequeños con longitudes de
0,5 a 1 mm. Después de cultivo en el medio que comprende el
material fenólico vegetal, los embriones inmaduros pueden ponerse
en contacto con el DNA extraño, preferiblemente con las
Agrobacterias que comprenden el DNA extraño sin lesión o
pretratamiento enzimático adicional.
Se ha encontrado que, utilizando esta invención,
diferentes genotipos de maíz son susceptibles de transferencia de
DNA mediada por Agrobacterium, particularmente maíz PHH
[(Pa91xH99)xH99], Pa91 He89 o PHP [(Pa91xH99)xPa91].
Por esta razón, se espera que la invención pueda emplearse sin
limitaciones de genotipo, particularmente para la transformación de
maíz.
El precultivo de las células vegetales,
particularmente células de maíz de acuerdo con la invención,
aumenta la eficiencia de transformación de la transferencia de DNA
medida por Agrobacterium, y se espera que este efecto sea
independiente de los antecedentes cromosómicos del hospedador de
Agrobacterium, el tipo de plásmido Ti, plásmido adyuvante o
vector de T-DNA utilizado. El método de la
invención expande por tanto la gama de cepas de
Agrobacterium que pueden utilizarse eficientemente.
Sustratos cromosómicos bacterianos
particularmente preferidos son proporcionados por A.
tumefaciens C58C1 (van Larebeke et al. 1974), A136
(Watson et al. 1975) o LBA4011 (Klapwijk et al.
1980).
En una realización preferida, la cepa de
Agrobacterium utilizada para transformar el tejido vegetal
precultivado con el compuesto fenólico vegetal contiene un plásmido
Ti de tipo L,L-succinamopina, preferiblemente
desactivado, tal como pEHA101.
En otra realización preferida, la cepa de
Agrobacterium utilizada para transformar el tejido vegetal
precultivado con el compuesto fenólico vegetal contiene un plásmido
Ti de tipo octopina, preferiblemente desarmado, tal como pAL4404.
Generalmente, cuando se utilizan plásmidos Ti de tipo octopina o
plásmidos adyuvantes, se prefiere que el gen virF esté
delecionado o desactivado (Jarschow et al. 1991).
El método de la invención puede utilizarse
también en combinación con cepas particulares de
Agrobacterium, para aumentar adicionalmente la eficiencia de
transformación, tales como cepas de Agrobacterium en las
cuales la expresión del gen vir y/o la inducción del mismo
está alterada debido a la presencia de genes virA o
virG mutantes o quiméricos (v.g. Hansen et al. 1994;
Chen y Winans 1991; Scheeren-Groot et al.
1994).
En otra realización, cepas de
Agrobacterium que comprenden copias adicionales del gen
virG, particularmente el denominado gen super virG
derivado de pTiBo542, enlazadas preferiblemente a un plásmido de
copias múltiples, pueden utilizarse para aumentar adicionalmente la
eficiencia de transformación.
En otra realización adicional de la invención,
las cepas de Agrobacterium utilizadas comprenden una copia
extra del gen virB11, particularmente el gen virB11
derivado de pTiBo542, que se expresa en Agrobacterium. Esto
puede realizarse preferiblemente proporcionando un gen quimérico
que comprende la región codificante de virB11 enlazada
operativamente a un promotor susceptible de expresión en
Agrobacterium, tal como un promotor virB aislado, sin
otras regiones codificantes intermedias del operón virB.
Las células de Agrobacterium a
co-cultivar con las células vegetales, en particular
con las células de maíz, pueden preincubarse con acetosiringona u
otro compuesto fenólico vegetal, como es conocido por las personas
expertas en la técnica, o bien utilizarse directamente después de
aislamiento a partir de su medio de cultivo. Condiciones de
inducción particularmente adecuadas para Agrobacterium
tumefaciens han sido descritas por Vernade et al.
(1988).
El método de la presente invención puede
utilizarse en principio para transformar células vegetales,
particularmente células de maíz, con cualquier DNA extraño.
Generalmente, el DNA extraño comprende al menos un gen de interés
que comprende 1) una región promotora con un promotor capaz de
dirigir la transcripción de DNA en un RNA en células de la especie
eucariota, v.g. especie de planta que se desea transformar, y 2)
una región codificante que codifica un RNA (v.g., un RDNA
antisentido o una ribozima) o proteína. En la mayoría de los casos,
el gen de interés comprenderá también 3) una región 3' sin traducir
de un gen eucariota que contiene una señal de poliadenilación. El
promotor puede seleccionarse para dirigir la expresión en tejidos
seleccionados del organismo eucariota. Por ejemplo, se conocen
promotores que dirigen selectivamente la expresión en células
estaminales de una planta (v.g. el tapete) y tales promotores se
han utilizado para producir plantas masculinas estériles y otras
plantas útiles para producir híbridos (documentos EP 344029; EP
412911; WO 9213956; WO 9213957; Mariani et al. 1990; Mariani
et al. 1992).
El DNA extraño utilizado en el método de esta
invención comprende también preferiblemente un gen marcador
seleccionable cuya expresión permite la selección de células (u
organismos) transformadas (os) a partir de células (u organismos)
no transformadas (os). Dicho gen marcador seleccionable codifica por
regla general una proteína que confiere a la célula resistencia a
un antibiótico u otro compuesto químico que es normalmente tóxico
para las células. En las plantas, el gen marcador seleccionable
puede codificar también por tanto una proteína que confiere
resistencia a un herbicida, tal como un herbicida que comprende un
inhibidor de la glutamina-sintetasa (v.g.
fosfinotricina) como ingrediente activo. Un ejemplo de tales genes
son genes que codifican
fosfinotricina-acetil-transferasa
tales como los genes sfr o sfrv (documentos EP
242236; EP 242246; De Block et al. 1987).
Esta invención proporciona por tanto un método
rápido, eficiente y reproducible para aumentar la eficiencia de
transformación de la transferencia de DNA, particularmente
transferencia de DNA de células vegetales mediada por
Agrobacterium, particularmente de células de plantas
monocotiledóneas, muy particularmente de células de maíz, pero
también de células de arroz, trigo o cebada. Además, los métodos de
transformación mediados por Agrobacterium producen un número
mayor de plantas transgénicas, particularmente plantas de maíz, con
un número limitado de copias del transgén, particularmente con una
sola copia del transgén, integrada en el genoma de sus células, que
lo hacen los métodos de transferencia directa de genes.
Adicionalmente, las plantas transgénicas, particularmente las
plantas transgénicas de maíz, obtenidas por transformación mediada
por Agrobacterium, que tienen más de una copia del transgén
integrada en su genoma, producen frecuentemente plantas de progenie
en las cuales las diferentes copias del transgén se heredan
independientemente, permitiendo la segregación de las diferentes
copias del transgén en las plantas descendientes. Por esta razón,
se espera que se encontrará una mayor proporción de plantas
transgénicas de "élite" con las características deseadas, en
una población de plantas transgénicas obtenidas por los métodos de
transformación de la invención que en una población de plantas
transgénicas obtenidas por métodos de transferencia génica directa.
Aunque la invención es particularmente útil para plantas
monocotiledóneas, es de esperar que se obtengan resultados similares
cuando se utilicen células cultivadas de plantas dicotiledóneas
como el material de partida para el método de la invención.
Los ejemplos siguientes describen en detalle los
métodos de la invención. A no ser que se indique otra cosa en los
ejemplos, todas las técnicas de DNA recombinante se llevan a cabo
de acuerdo con protocolos estándar como los descritos en Sambrook
et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY y en los
Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols
in Molecular Biology, Current Protocols, EE.UU. Materiales y
métodos estándar para trabajo molecular con vegetales se describen
en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy,
publicado conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd.
(Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications, Reino Unido.
En los ejemplos y en la descripción de la
invención, se hace referencia a las secuencias siguientes del
Listado de Secuencias:
- SEQ ID No. 1:
- secuencia de nucleótidos del T-DNA de pGVS71
- SEQ ID No. 2:
- secuencia de nucleótidos de la región codificante del gen bar que comprende el intrón adh1
- SEQ ID No. 3:
- secuencia de nucleótidos del T-DNA de pGVS8
- SEQ ID No. 4:
- secuencia de nucleótidos del oligonucleótido VG40
- SEQ ID No. 5:
- secuencia de nucleótidos del oligonucleótido vg41
Experimental
A lo largo de los ejemplos, se utilizaron los
medios siguientes para cultivo de tejidos vegetales:
- -
- Mahi1VII: medio N6 (Chu et al. 1975) complementado con 100 mg/l de hidrolizado de caseína, L-prolina 6 mM, 0,5 g/l de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), manitol 0,2M, sacarosa al 2%, 1 mg/l de ácido 2,4-diclorofenoxi-acético (2,4-D), 2,5 g/l de Gelrite, ajustado a pH 5,8.
- -
- LSIDhy1.5VII: sales MS (Murashige y Skoog, 1968) complementado con 0,5 mg/l de ácido nicotínico, 0,5 mg/l de piridoxina.HCl, 1 mg/l de tiamina.HCl, 100 mg/l de mio-inositol, L-prolina 6 mM, 0,5 g/l de MES, 20 g/l de sacarosa, 10 g/l de glucosa, 1,5 mg/l de 2,4-D, 2,5 g/l de Gelrite, ajustadas a pH 5,2.
- -
- LSI: sales MS, complementadas con vitaminas como en LSIDhy 1.5VII, 1 g/l de casamino-ácidos, sacarosa 0,2M, glucosa 0,2M, 1,5 mg/l de 2,4-D, 2,5 g/l de Gelrite, ajustadas a pH 5,2.
- -
- Ahx1.5VIIp500ino1000ppT10: sales MS, complementadas con 100 mg/l de mio-inositol, 0,5 g/l de MES, 30 g/l de sacarosa, 10 g/l de glucosa, 1,5 mg/l de 2,4-D, 2,5 g/l de Phytagel, 10 mg/l de glufosinato-amonio, 500 mg/l de carbenicilina, ajustadas a pH 5,8.
- -
- Mh1VIIp500ppT5: medio N6 complementado con 0,5 g/l de MES, 20 g/l de sacarosa, 1 mg/l de 2,4-D, 5 mg/l de glufosinato-amonio, 500 mg/l de carbenicilina, ajustado a pH 5,8.
- -
- A37VIIp500ppT2: medio MS complementado con 0,5 g/l de MES, 30 g/l de sacarosa, 5 mg/l de zeatina, 2,5 g/l de Phytagel, 2 mg/l de glufosinato-amonio, 500 mg/l de carbenicilina, ajustado a pH 5,8.
- -
- LSIIDhy1.5XI: lo mismo que el medio LSIDhy1.5VII, pero en el cual la L-prolina 6 mM ha sido reemplazada por 1 g/l de casamino-ácidos y los 2,5 g/l de Gelrite han sido reemplazados por 0,5% de agarosa BRL Ultra Pura.
- -
- A6%VIIp500ppT2: medio MS complementado con 0,5 g/l de MES, 60 g/l de sacarosa, 2,5 g/l de Phytagel, 2 mg/l de glufosinato-amonio, 500 mg/l de carbenicilina, ajustado a pH 5,8.
A lo largo de los ejemplos, se utilizaron los
vectores T-DNA siguientes:
- -
- pGSV71: es un vector de T-DNA derivado de pGSC1700 (Cornelissen y Vandewiele, 1989) que difiere por la ausencia del gen de \beta-lactamasa y la presencia del T-DNA caracterizado por la secuencia de SEQ ID No. 1. pGVS71 comprende el gen marcador bar quimérico seleccionable, enlazado operativamente a un promotor CaMV35S y el extremo 3' del gen de la nopalina-sintasa.
- -
- pTCO114: es un vector de T-DNA, similar a pGSV71, que comprende un T-DNA en el cual la secuencia codificante del gen bar (secuencia nucleotídica de SEQ ID No. 1 desde la posición del nucleótido 1437 a la posición del nucleótido 1988) ha sido reemplazada por la secuencia de un gen bar que comprende un intrón del gen adh1 del maíz (secuencia nucleotídica de SEQ ID No. 2).
- -
- pTC0121: un vector de T-DNA que lleva el gen extra virG de pTiBo542 comprendido en un fragmento BglII-SphI de aproximadamente 1,3 kb, derivado de pTiBo542. El T-DNA es esencialmente similar al de pTCO114. El vector se construyó de la manera siguiente:
- Se purificó un fragmento BglII-SphI de aproximadamente 1,3 kb a partir de pCNL2 (Liu et al. 1992). Este fragmento comprende el extremo 3' del operón virB, el gen virG completo y el extremo 3' del operón virC de pTiBo542. El fragmento se hizo romo en los extremos por tratamiento con polimerasa T4 y se ligó a pGSV8 linealizado con XbaI y tratado con Klenow, produciendo pGSV15. pGSV8 es un vector de T-DNA derivado de pGSC1700 (Cornelissen y Vandewiele, 1989) que difiere por la ausencia del gen de \beta-lactamasa y la presencia del T-DNA caracterizado por la secuencia de SEQ ID No. 3. En un paso siguiente, se introdujo en pGSV15 un T-DNA que llevaba el marcador bar quimérico seleccionable. A este fin, el fragmento EcoRI-BstEII de aproximadamente 1,2 kb de pGSV15 (el sitio EcoRI está dentro del T-DNA de pGSV15), se reemplazó por el fragmento EcoRI-BstEII de aproximadamente 4 kb de pTCO114 que comprende el T-DNA (excepto el borde derecho), dando como resultado pTCO121.
- -
- pVE200: un vector de T-DNA que lleva el mismo T-DNA que pTCO121, y un fragmento pTiBo542 similar que comprende el extremo 3' del operón virB (con inclusión del marco de lectura abierto de virB11), el gen virG completo y el extremo 3' del operón virC, pero en el cual el extremo 3' del operón virB está enlazado operativamente (es decir precedido) por un fragmento promotor virB amplificado por PCR. El vector se construyó de la manera siguiente:
- -
- un fragmento promotor virB se amplificó por la reacción en cadena estándar de la polimerasa utilizando los iniciadores VG40 (SEQ ID No. 4) y VG41 (SEQ ID No. 5) y el DNA total de A348 (pSM30) (Stachel y Nester, 1986) como molde. El fragmento de aproximadamente 390 pb resultante (correspondiente esencialmente a la secuencia de EMBL No. de Acceso J03216 desde el nucleótido 475 al nucleótido 764) comprende un promotor virB descrito por Das et al. (1986) se digirió con XbaI y NheI y se ligó a pCNL2 linealizado con XbaI (Liu et al. 1992), dando como resultado pVE194. En pVE194, el extremo 3' del operón virB se encuentra bajo regulación transcripcional del promotor virB.
- -
- El fragmento de DNA que comprendía el extremo 3' del operón virB de pTiBo542 bajo control de un promotor virB y el gen virG de pTiBo542 se introdujo subsiguientemente en un vector de T-DNA por ligación de 3 vías entre el fragmento XbaI-BglII de aproximadamente 1,6 kb de pVE194, el fragmento BglII-SphI de aproximadamente 1,3 kb de pVE194 y el fragmento XbaI-SphI de aproximadamente 7,2 kb de pGSV8, que comprende el T-DNA. El plásmido resultante se designó pTVE197. El gen marcador seleccionable de pTCO114 se introdujo en pTVE197 por ligación de los tres fragmentos siguientes:
- i)
- el fragmento BanII-BstEII de aproximadamente 5,3 kb de pTVE197, que comprende el extremo 3' del gen virB y el gen virG;
- ii)
- el fragmento BanII-EcoII de aproximadamente 3,7 kb de pTVE197, que comprende el borde derecho del T-DNA;
- iii)
- el fragmento EcoRI-BstEII de aproximadamente 4 kb de pTCO114, que comprende el gen bar quimérico seleccionable y el borde izquierdo del T-DNA;
dando como resultado el vector
pVE200 del
T-DNA.
Los vectores de T-DNA pGSV71,
pTCO114, pTCO121, y pVE200 se introdujeron en cepas de
Agrobacterium LBA4404 que comprendía el plásmido Ti adyuvante
pAL4404 o EHA101, que comprendía el plásmido adyuvante pEHA101,
utilizando el protocolo de apareamiento triparental (Ditta et
al. 1980), que selecciona para resistencia a estreptomicina
(300 \mug/ml) y espectinomicina (100 \mug/ml).
A lo largo de los ejemplos se utilizaron las
cepas siguientes.
Cepa A3593: LBA4404 que comprendía pGSV71
Cepa A3532: LBA4404 que comprendía pTCO121
Cepa A3638: LBA4404 que comprendía pVE200
Cepa A3460: EHA101 que comprendía pTCO114
Cepa A3533: EHA101 que comprendía pTCO121
Cepa A3637: EHA101 que comprendía pVE200
Se obtuvieron fragmentos de callo tipo I
esencialmente como se describe en el documento WO 92/09696.
Embriones inmaduros de la línea de maíz (Pa91xH99)xH99 (línea
PHH) se cortaron del grano 9-12 días después de la
polinización, se esterilizaron en la superficie y se extendieron en
medio Mahi1VII para la inducción de callo tipo I. El callo tipo I
se subcultivó en el mismo medio con intervalos de un mes durante
aproximadamente 2 a 6 meses. A continuación, el callo tipo I se
cortó finamente en fragmentos con una longitud media de
aproximadamente 1,5 mm, y los fragmentos resultantes se incubaron
durante 5 días sobre sustrato LSIDhy1.5VII complementado con
acetosiringona 100-200 \muM. Los fragmentos de
callo pre-inducidos se recogieron y, sin lesión
adicional, se sumergieron en una suspensión de la cepa apropiada de
Agrobacterium durante aproximadamente 3 a aproximadamente 20
minutos. La suspensión bacteriana se obtuvo de la manera siguiente:
se cultivaron las bacterias durante 3 a 6 días sobre medio MAG
[medio A mínimo (Jeffrey Miller, 1972) complementado con 2 g/l de
glucosa] o medio AB (Chilton et al. 1974). Se cosecharon las
bacterias, y se suspendieron nuevamente en sustrato líquido LSI
complementado con acetosiringona 100-200 \muM, a
una concentración de aproximadamente 5 x 10^{9} células/ml.
Después de la inmersión en la suspensión
bacteriana, los fragmentos de callo se co-cultivaron
en medio LSII-Dhy1.5XI, complementado con
acetosiringona 100-200 \muM, a aproximadamente
25ºC durante 3 a 6 días (3 días para la cepa de tipo LBA, 6 días
para la cepa de tipo EHA).
Después del co-cultivo, el tejido
se transfirió a Ahx1.5VIIp500ino1000ppT10 y se cultivó durante 3 a 4
semanas. Los callos que proliferaron, resistentes a fosfinotricina
(PPT) se cortaron y subcultivaron al menos dos veces, con
intervalos de subcultivo de tres semanas sobre Mh1VIIp500ppT5. Los
callos embriogénicos resistentes a PPT se extendieron en placas
sobre medio de regeneración (A37VIIp500 ppT2.), y el tejido
embriogénico se subcultivó dos veces, con intervalos de 10 a 14
días, en el mismo medio. Las pequeñas plantas se transfirieron a
recipientes de vidrio que contenían sustrato A6%VIIp500ppT2 para
su crecimiento ulterior, y los brotes que se desarrollaron se
transfirieron luego a medio MS de la mitad de concentración
complementado con sacarosa al 1,5% para permitir el alargamiento
ulterior de los brotes así como el enraizamiento. Las plantas se
ensayaron respecto a actividad de
fosfinotricina-acetil-transferasa
(PAT), y las plantas PAT-positivas se transfirieron
al invernadero. Las plantas PAT-positivas se
ensayaron en cuanto a la presencia del transgén por hibridación
Southern.
En experimentos de control, en los cuales los
fragmentos de callo tipo I no se pretrataron por incubación en
medios que contenían acetosiringona, y co-cultivo
con las cepas de Agrobacterium descritas en la sección
experimental, la frecuencia media de transformación no excedía
nunca de 0,1% (véase Tabla I) aunque se obtuvieron en todos los
casos plantas PAT-positivas.
El pretratamiento con acetosiringona permitió un
aumento de al menos 3 veces en la eficiencia de transformación del
callo tipo I por co-cultivo con cepas de
Agrobacterium. El co-cultivo de
aproximadamente 1700 fragmentos de callo pretratados con
acetosiringona con la cepa A3460, dio como resultado cinco líneas
PAT-positivas (frecuencia media de transformación de
aproximadamente 0,3%, véase Tabla I).
El co-cultivo de aproximadamente
4000 fragmentos de callo pretratados (para cada serie de
experimentos) con las cepas de Agrobacterium A3638, A3533 y
A3637 dio como resultado respectivamente 37, 30 y 33 líneas de
plantas PAT-positivas (frecuencias medias de
transformación de aproximadamente 1%). En estos experimentos, la
eficiencia de transformación se mejoró por tanto aproximadamente en
7 a 10 veces.
La mejora de la frecuencia de transformación se
obtuvo también para el co-cultivo de callos tipo I
obtenidos de las líneas de plantas de maíz (Pa91xH99)xPa91
(PHP) y Pa91 por pre-tratamiento con
acetosiringona).
Se obtuvieron fragmentos de callo tipo I como se
ha descrito en el Ejemplo 1 y se incubaron durante 5 días sobre
sustrato LSIDhy1.5VII complementado con 100 \muM de
acetosiringona, seguido por co-cultivo con las cepas
de Agrobacterium A3532 y A3638. Para la cepa A3532
únicamente se obtuvo una planta PAT-positiva,
incluso en el caso de pretratamiento con acetosiringona (frecuencia
de transformación < 0,1%). Sin embargo, la presencia del promotor
funcional virB que precedía al marco de lectura abierto
virB11 en el vector T-DNA, mejoraba la
eficiencia de transformación (véase Tabla I) al menos casi 10
veces.
Se obtuvieron fragmentos de callo tipo I como se
describe en el Ejemplo 1 y se incubaron durante 5 días sobre
sustrato LSIDhy1.5VII complementado con 100 \muM de los
compuestos fenólicos vegetales de la Tabla II. Aproximadamente 200
fragmentos de callo pre-inducidos se
co-cultivaron con la cepa de Agrobacterium
A3637 (o A3638). El número de líneas PAT-positivas y
las frecuencias de transformación obtenidas se resumen en la Tabla
II.
Fragmentos de callo finamente cortados, derivados
de callo tipo I y pre-incubados durante 5 días sobre
medio que contenía acetosiringona 100 \muM, como se describe en
el Ejemplo 1, se sometieron sin lesión ulterior a electroporación
como se describe en el documento WO 92/09696. Resumidamente, se
resuspendieron aproximadamente 50 fragmentos de callo en 100 \mul
de tampón EPM-KCl y se sometieron a
pre-plasmólisis durante 3 h a la temperatura
ambiente. A continuación, los fragmentos de callo se lavaron en
tampón EPM+KCl y se transfirieron a una electrocubeta en tampón
EPM+KCl. Se añadió DNA plasmídico (10 \mug de pDE110), y se
incubó el DNA con los fragmentos de callo durante aproximadamente 1
h a la temperatura ambiente. La electroporación se llevó a cabo
utilizando condiciones estándar (1 pulso con intensidad inicial de
campo 375 V/cm procedente de un condensador de 900 \muF). Los
callos no se mantuvieron nunca en hielo. Se seleccionaron callos
resistentes a fosfinotricina y se regeneraron plantas como se ha
descrito (documento WO 92/09696). Se detectó la actividad de
fosfinotricin-acetil-transferasa
como se ha descrito (WO 92/09696).
En tanto que se obtuvieron trece plantas
PAT-positivas por electroporación de control de
aproximadamente 5640 fragmentos de callo que no se
pre-trataron con acetosiringona (aproximadamente
0,23%) se obtuvieron 4 plantas PAT-positivas por
electroporación de aproximadamente 530 fragmentos de callo
pre-tratados con acetosiringona (aproximadamente
0,75%). Las frecuencias de transformación eran por tanto
aproximadamente 3 veces mayores cuando los fragmentos de callo tipo
I finamente cortados se pretrataron por incubación durante 5 días
en el medio que contenía acetosiringona 100 \muM.
Se obtuvieron fragmentos de callo tipo I como se
describe en el Ejemplo 1 y se incubaron durante 5 días sobre
sustrato LSIDhy1.5VII complementado con acetosiringona 200 \muM o
con una combinación de acetosiringona 100 \muM y ácido
p-hidroxibenzoico 100 \muM. Se
co-cultivaron aproximadamente 250 fragmentos de
callo con la cepa A3533 de Agrobacterium. En tanto que se
obtuvieron 2 líneas que regeneraban brotes (que comprendían una
línea PAT-positiva) en el medio que contenía PPT
después de pre-inducción en acetosiringona
(frecuencia aproximada 1%), se obtuvieron 7 líneas que regeneraban
brotes (que comprendían 5 líneas PAT-positivas) en
el medio que contenía PPT después de pre-inducción
en acetosiringona más ácido p-hidroxibenzoico
(frecuencia aproximada 3%).
Las plantas transgénicas de maíz de los ejemplos
anteriores se analizaron por análisis Southern.
En el primer caso, se comprobó si todas las
plantas transgénicas que se regeneraban a partir de una sola línea
de callo transgénica eran idénticas o si las mismas podían haberse
originado a partir de sucesos de transformación independientes.
Todas las plantas regeneradas obtenidas a partir de 24 líneas de
callos transgénicos independientes se analizaron por Southern y se
identificaron 37 tipos diferentes de integración de
T-DNA. Dicho de otro modo, las 24 líneas de plantas
(como se definen en la descripción) representaban al menos 37
sucesos de transformación independientes. Las frecuencias de
transformación expresadas como el número de líneas de plantas
transgénicas obtenidas por 100 fragmentos de callo transformados son
por consiguiente subestimaciones de las frecuencias de
transformación reales.
A continuación, se analizaron los s de copias de
los transgenes en diferentes líneas de maíz por hibridación
Southern. La mayoría de las líneas transformadas analizadas (T0)
mostraban un patrón de integración de T-DNA bastante
simple (menos de 4 copias). Aproximadamente 1/3 de las líneas
transgénicas analizadas (56/148) tenían integración de
T-DNA de una sola copia. Sólo un número limitado de
líneas (<10%) tenían un patrón de integración de
T-DNA más complejo (>4 copias).
Las plantas transgénicas de maíz de los ejemplos
previos se analizaron también en cuanto a patrón de segregación de
los transgenes en la progenie. Se utilizó una pulverización de
herbicida Basta para monitorizar la segregación de la actividad de
PAT en 113 plantas regeneradas a partir de 57 líneas de callo
transgénicas independientes. En la progenie de 74 plantas
regeneradas a partir de 32 líneas de callo transgénicas
independientes, se observó una segregación 1:1 de la actividad de
PAT, lo que indicaba que en las plantas T0 el transgén resistente al
herbicida estaba presente en una sola copia o en varias copias
estrechamente ligadas. En la progenie de 31 plantas regeneradas a
partir de 18 líneas de callo transgénicas independientes, todas las
plantas eran tolerantes a la pulverización del herbicida Basta o el
número de plantas tolerantes era significativamente mayor que el de
las plantas susceptibles, lo que indicaba que en las plantas T0
estaban presentes dos o más copias no ligadas del transgén. Por
último, en la progenie de 14 plantas regeneradas a partir de 7
líneas de callo transgénicas independientes, no se observó planta
tolerante alguna el número de plantas sensibles era
significativamente mayor que el de las plantas tolerantes. Estas
últimas plantas no se analizaron ulteriormente.
El análisis Southern de 2 plantas de la progenie
T1 resistente al herbicida Basta para cada una de 53 plantas de maíz
transformadas independientemente (T0) reveló que en aproximadamente
el 70% de los casos analizados (35/53) ambas plantas de la progenie
tenían un patrón de integración del T-DNA idéntico
al de la línea de plantas T0 paterna. Se observó segregación en
aproximadamente 18% de los casos (10/53).
Ashby et al. (1988) J.
Bacteriol. 170: 4181-4187
Ausubel et al. (1994)
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Plant Genetic Systems N.V.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Jozef Plateaustraat 22
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Gante
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Bélgica
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): B-9000
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 32 9 235 84 54
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 32 9 223 19 23
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Método mejorado de transformación de plantas
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2345 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "T-DNA de pGSV71"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: -
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:1..25
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/marcador= RB/nota= "borde derecho de T-DNA"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: -
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:53..1436
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/nota = "promotor CaMV35S P3"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:1437..1988
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto = "fosfinotricina acetiltransferasa"
\hskip2,8cm/marcador= bar
\hskip2,8cm/nota= "región codificante para fosfino-acetiltransferasa"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: -
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:2007..2266
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/marcador= 3'nos
\hskip2,8cm/nota= ``región 3' no traducida que contiene la señal de poliadenilación del gen de nopalina-sintasa
\hskip2,8cmde T-DNA de Agrobacterium''
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: -
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:2321..2345
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/marcador = LB
\hskip2,8cm/nota = "borde izquierdo de T-DNA"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1086 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "región codificante del gen bar que comprende el intrón adh1"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:1..233
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto = "fosfinotricina-acetil-transferasa (mitad N-terminal)"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: intrón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:234..769
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/nombre_estándar = "intrón adh1"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:770..1086
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto = "fosfinotricina-acetil-transferasa (mitad C-terminal)"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 108 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "T-DNA de pGSV8"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: -
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:1..25
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/marcador = RB /nota = "secuencia del borde derecho del T-DNA de pGSV8"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: -
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:26..83
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/marcador = MCS /nota = Sitio de clonación múltiple''
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: -
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:84..108
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/marcador = LB /nota = "secuencia del borde izquierdo del T-DNA de pGSV8"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTACAACG GTATATATCC TGCCAGTACT CGGCCGTCGA CCGCGGTACC CGGAATTCCG
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGAAGCTTA GATCCATGGA GCCATTTACA ATTGAATATA TCCTGCCG
\hfill108
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido VG40"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCAAAAAGT TTGATCTAGA GCATTTTCG
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido VG41"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGACCCCGC TAGCTTAAAC AAAGCTTATC TCC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (13)
1. Un proceso para integrar un fragmento de DNA
en el genoma de una célula de una planta de maíz, comprendiendo
dicho proceso los pasos de:
- 1)
- incubar, antes de la puesta en contacto con dicho fragmento de DNA, un cultivo de células de plantas de maíz no transformadas que es un callo tipo I en un medio que comprende un compuesto fenólico vegetal, durante un periodo de aproximadamente 1 a 10 días; y
- 2)
- poner en contacto dichas células no transformadas con dicho fragmento de DNA en condiciones en las cuales dicho fragmento de DNA es capturado por dichas células no transformadas y se integra de manera estable en el genoma de dichas células no transformadas, para generar células transformadas; y
- 3)
- regenerar una planta transgénicas de maíz a partir de dichas células transformadas.
2. El proceso de la reivindicación 1, en el cual
dicho compuesto fenólico vegetal es acetosiringona,
\alpha-hidroxi-acetosiringona,
ácido sinápico, ácido siríngico, ácido ferúlico, catecol,
ácidop-hidroxibenzoico, ácido
\beta-resorcílico, ácido protocatéquico, ácido
pirogálico, ácido gálico o vainillina.
3. El proceso de la reivindicación 2, en el cual
dicho compuesto fenólico vegetal es acetosiringona.
4. El proceso de la reivindicación 2, en el cual
dicho compuesto fenólico vegetal es una mezcla que comprende al
menos dos compuestos fenólicos vegetales seleccionados del grupo de
acetosiringona,
\alpha-hidroxi-acetosiringona,
ácido sinápico, ácido siríngico, ácido ferúlico, catecol, ácido
p-hidroxibenzoico, ácido
\beta-resorcílico, ácido protocatéquico, ácido
pirogálico, ácido gálico y vainillina.
5. El proceso de la reivindicación 4, en el cual
dicho compuesto fenólico vegetal comprende al menos acetosiringona y
ácido p-hidroxibenzoico.
6. El proceso de la reivindicación 1, en el cual
dicho callo tipo I se ha cortado en fragmentos antes del paso de
puesta en contacto.
7. El proceso de la reivindicación 6, en el cual
dichos fragmentos de callo tipo I tienen una longitud máxima de 0,5
a 5 mm.
8. El proceso de la reivindicación 1, en el cual
dichas células no transformadas se incuban en un medio que contiene
dicho compuesto fenólico vegetal durante un periodo de tiempo de
aproximadamente 4 a 5 días antes de dicha puesta en contacto con
dicho fragmento de DNA.
9. El proceso de la reivindicación 1, en el cual
dichas células no transformadas se ponen en contacto con dicho
fragmento de DNA por medio de electroporación, transferencia génica
directa utilizando polietilenglicol o bombardeo con microproyectiles
recubiertos con DNA.
10. El proceso de la reivindicación 1, en el cual
dichas células no transformadas se ponen en contacto con dicho
fragmento de DNA, por co-cultivo con una cepa de
Agrobacterium que comprende dicho fragmento de DNA.
11. El proceso de la reivindicación 10, en el
cual dicha cepa de Agrobacterium comprende adicionalmente una
copia extra del gen virG.
12. El proceso de la reivindicación 11, en el
cual dicho gen virG se deriva de pTiBo542.
13. El proceso de la reivindicación 12, en el
cual dicha cepa de Agrobacterium comprende adicionalmente una
copia extra de un gen quimérico que comprende una región codificante
virB11 enlazada operativamente a un promotor virB.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
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