EA030460B1 - Растения с увеличенным размером плода - Google Patents

Растения с увеличенным размером плода Download PDF

Info

Publication number
EA030460B1
EA030460B1 EA201291466A EA201291466A EA030460B1 EA 030460 B1 EA030460 B1 EA 030460B1 EA 201291466 A EA201291466 A EA 201291466A EA 201291466 A EA201291466 A EA 201291466A EA 030460 B1 EA030460 B1 EA 030460B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
slarf9
plant
plants
allele
fruits
Prior art date
Application number
EA201291466A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201291466A1 (ru
Inventor
Хендрик Виллем Фризен
Челестина Мариани
Маайке Дэ Ёнг
Original Assignee
Нунхемс Б.Ф.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Нунхемс Б.Ф. filed Critical Нунхемс Б.Ф.
Publication of EA201291466A1 publication Critical patent/EA201291466A1/ru
Publication of EA030460B1 publication Critical patent/EA030460B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/08—Fruits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8291—Hormone-influenced development
    • C12N15/8294—Auxins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области трансгенных и нетрансгенных растений с новыми фенотипами. В изобретении предложены белки Solanum lycopersicum фактора 9 ответа ауксина (SlARF9) и кодирующие их последовательности нуклеиновых кислот, которые пригодны в придании новых фенотипов растениям, в частности увеличенного размера плодов.

Description

Изобретение относится к области трансгенных и нетрансгенных растений с новыми фенотипами. В изобретении предложены белки Solanum lycopersicum фактора 9 ответа ауксина (SlARF9) и кодирующие их последовательности нуклеиновых кислот, которые пригодны в придании новых фенотипов растениям, в частности увеличенного размера плодов.
030460 B1
030460
Область изобретения
Изобретение относится к области биотехнологии и селекции растений. В изобретении предложены растения с увеличенным размером плодов, в частности растения томатов (Solanum lycopersicum) с увеличенным размером и массой плода, и способы получения генетически модифицированных или мутантных растений, производящих плоды большего размера. Настоящее изобретение предлагает новый вариант использования гена, именуемого S1ARF9, кодоирующего белок S1ARF9, который является отрицательным стабилизатором клеточного деления во время развития плода. Понижающая регуляция, модификация или сайленсинг гена SlARF9 приводят к получению растений, имеющих значительно увеличенные плоды на последнем этапе фазы роста плодов. Плоды становятся крупнее благодаря ускоренному клеточному делению тканей перикарпия, что ведет к крупным плодам с большим количеством клеток (и, таким образом, более высоким содержанием целлюлозы, геми-целлюлозы, пектина и т.д.). Также в настоящем изобретении предложены растения, семена, плоды и части растений, содержащие мутантный аллель SlARF9 (обозначенный в настоящем документе как slarf9) в их геноме и имеющие значительно более крупные плоды на последнем этапе фазы роста плодов в результате мутации(й) в аллеле(ях) slarf9. В другом варианте осуществления настоящее изобретение предлагает способы для создания или определения растений, содержащих одну или более мутантных аллелей slarf9 в своем геноме.
Предпосылки к созданию изобретения
Ангиоспермы, цветущие растения являются крупнейшей группой наземных растений. В ангиоспермах плодолистик является женским органом размножения, видоизмененным в рыльце, пестик и завязь, окружающую семяпочки. После успешного завершения опыления и оплодотворения семяпочки развиваются в семена, а завязь - в плод. Трансформация из завязи в быстро растущий плод включает молекулярные, биохимические и структурные изменения, которые должны быть тесно скоординированы. В зависисмости от фазы развития плодов временная и пространственная структура данных изменений осуществляется благодаря фитогормонам, таким как ауксин, гиббереллин, цитокинин, абсцизовая кислота и этилен. Еще в начале 20 века было установлено, что ауксин и гиббереллин также являются важными факторами в начале развития плодов. Тем не менее, сложная регуляторная сеть, контролируемая данными гормонами, до сих пор остается до конца не изученной.
"Завязывание плода" определяется как переход покоящейся завязи в быстро растущий молодой плод, что является важным процессом полового размножения цветковых растений. Томат обыкновенный (Solanum lycopersicum L.) является одним из наиболее изученных мясистых плодов, представляющий Solanaceae, семейство, которое включает несколько других важных культур, таких как баклажан (Solanum melongena L.) и перцы (Capsicum spp.). Биология томата является наиболее подходящей. У томата достаточно короткий жизненный цикл, он не требует особых условий для выращивания и, хотя является самоопылителем, он легко поддается перекрестному опылению. Более того, доступен широкий спектр генетических ресурсов, таких как фенотипические дивергентные сорта, перекрестные дикорастущие члены семейства, мутанты, а также геномные инструменты (Mueller et al., Plant Physiology 138, 1310-1317; Mueller et al., Comparative and Functional Genomics 6, 153-158), такие как библиотеки БПЗ и маркеры экспрессируемой последовательности (EST).
Завязывание плода томата очень чувствительно к условиям окружающей среды, в частности к слишком низким или слишком высоким температурам, влияющим на развитие пыльцы и раскрытие пыльника. Adams et al. (2001, Annals of Botany 88, 869-877) показал, что режим постоянной температуры 14 или 26°С ведет к значительному сокращению завязи плодов томата по сравнению с режимом 22°С. Тем не менее, оптимальная температура роста может отличаться в зависимости от сорта. В результате подобной температурной чувствительности эффективное производство томатов ограничено определенными климатическими зонами. Поэтому компании, производящие семена томатов, выращивают их в разных частях света для развития сортов, подходящих для оптимального производства плодов в местных климатических условиях. Тем не менее, даже с учетом оптимизированных условий часто не представляется возможным выращивать томаты в летний период в теплых регионах, таких как юг Европы. В более северных регионах выращивание томатов возможно только в теплый период и только в современных теплицах, затрачивая при этом огромное количество энергии для их отопления.
Завязь плода зависит от успешного завершения опыления и оплодотворения (Gillaspy et al., 1993, The Plant Cell 5, 1439-1451). Когда в период цветения цветок томата полностью раскрывается, совместимая пыльца должна прорастать на пестике и образовывать пыльцевую трубку. Затем данная пыльцевая трубка прорастает через пестик и овулярный семявход для доставки двух сперматогенных клеток в зародышевый мешок. Происходит двойное оплодотворение; одна из двух сперматогенных клеток оплодотворяет яйцеклетку, в то время как вторая связывается с двумя гаплоидными полярными ядрами в главной клетке. Следовательно, как зародыш, так и окружающие ткани могут генерировать сигналы, стимулирующие рост плода. Завязь томата состоит из двух или больше плодолистиков, которые окружают разделенные полости, содержащие семязачатки. После успешного оплодотворения развитие семязачатка в плод начинается в период клеточного деления, которое продолжается от 10 до 14 дней. В течение следующих 6-7 недель рост плода зависит, в основном, от роста клеток (Mapelli et al., 1978, Plant and Cell Physiology 19, 1281-1288; Bunger-Kibler and Bangerth, 1982, Plant Growth Regulation 1, 143-154; Gillaspy et
- 1 030460
al., 1993, supra). Плодолистик развивается в перикарпий, а плацента, с которой соединены семяпочки, развивается в гелеобразное вещество, состоящее из больших тонкостенных клеток, которые являются высоко вакуолизированными. В конце периода роста клетки плод достигает своего конечного размера и начинает созревать (Gillaspy et al., 1993, supra). Различают шесть стадий спелости: неспелый, спелый, спелый зеленый, молочный, розовый и красный. Созревшие томаты обычно собирают на красной стадии, в то время как томаты для продажи в свежем виде собираются раньше, либо на молочной стадии (когда не требуется обработка этиленом для созревания до красной стадии), либо на зеленой стадии (когда такая обработка необходима).
Несмотря на то что влияние на развитие плода таких фитогормонов, как ауксин и гиббериллин, было известно уже в начале 20 века (Gustafson, 1937, American Journal of Botany 24, 102-107; Gustafson 1939 American Journal of Botany 26, 135-138; Wittwer et al., 1957, Plant Physiology 32, 39-41), молекулярные механизмы, лежащие в основе завязывания плода, до сих пор в основном неизвестны и в настоящее время начинают осознаваться.
Ауксин действует как необходимый регулятор в большом количестве процессов развития в течение жизненного цикла растения, воздействуя на многие гены (Theologis, 1986, Annual Reviews of Plant Physiology 37, 407-438). Подобная управляемая ауксином генная экспрессия контролируется двумя семействами факторов транскрипции, факторами реакции ауксина (ARF) и ауксин/индол-3-уксусные кислоты (Aux/IAAs), которые представлены двумя большими семействами генов растительного вида, такими как арабидопсис и рис (Hagen and Guilfoyle, 2002, Plant Molecular Biology 49, 373-385, Plant Molecular Biology 49, 387-400; Liscum and Reed, 2002, infra; Wang et al., 2007, Gene 394, 13-24). Белки, закодированные этими семействами, имеют два консервативных С-терминальных домена, домены III и IV, выступающие в качестве доменов взаимодействия между Aux/IAA и ARF, которые способствуют взаимодействию ARFs и Aux/IAA с образованием гомо- и гетеродимеров, соответственно (Kim et al., 1997, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 94, 11786-11791; Ulmasov et al., 1997, Science 276, 1865-1868; Ulmasov et al., 1999, The Plant Journal 19, 309-319). Более того, ARF содержит N-терминал В3 производный ДНКсвязывающий домен (DBD), который связывает ответные элементы ауксина (AuxRE) на участках промотора, регулируемых ауксином генов (Ulmasov et al., 1999 supra), на среднем участке (MR), выполняющем функции транскрипционной активации или репрессивного домена, в зависимости от состава аминокислоты (Ulmasov et al., 1999, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 96, 5844-5849; Tiwari et al., 2003, The Plant Cell 15, 533-543). Белки Aux/IAA выступают в качестве репрессора путем блокировки транскрипционной активности ARF (Liscum and Reed, 2002, Plant Molecular Biology 49, 387-400). Репрессивная активность Aux/IAA придается N-терминальным доменом I (Tiwari et al., 2004, The Plant Cell 16, 533 - 543). В последнее время, Szemenyei et al. (2008, Science 319, 1384-1386) было установлено, что в нескольких Aux/IAA, данный домен содержит ассоциированный с ERF амфифильный репрессионный (EAR) мотив, использующий TOPLESS (TPL), транскрипционный корепрессор. Дополнительно, Aux/IAA содержит четвертый консервативный участок, домен II (Tiwari et al., 2001, The Plant Cell 13, 2809-2822). Ауксин усиливает взаимодействие данного домена и SCFTIR1 комплекса убиквитин-лигаза, содержащего F-бокс ауксиновый рецепторный белок TIR1 (TRANSPORT INHIBITOR RESISTANT1), что приводит к деградации Aux/IAA, опосредованной убиквитином (Dharmasiri et al., 2005, Nature 435, 441445; Kepinski and Leyser, 2005, Nature 435, 446-451; Tan et al., 2007, Nature 446, 640-645; dos Santos Maraschin et al., 2009, The Plant Journal 59, 100-109). Следовательно, ARF высвобождаются из репрессии, что ведет к транскрипции ауксинных ответных генов (Woodward and Bartel, 2005, Annals of Botany 95, 707735). Однако данная модель поддерживает только функцию транскрипционной активации ARF.
Механизм, с помощью которого репрессоры ARF регулируют экспрессию ауксин-зависимых генов, до сих пор не известен, так как их взаимодействие с Aux/IAA или с активириющими ARF является довольно незначительным (Tiwari et al., 2003, supra; Hardtke et al., 2004, Development 131, 1089-1100). В противном случае, репрессоры ARF могут конкурировать с активаторами ARF за связывающие участки AuxRE в промоторах ауксин ответных генов, ингибируя экспрессию данных генов независимо от Aux/IAA и предоставляя альтернативный механизм генной регуляции (Guilfoyle and Hagen, 2007, Plant Biology 10, 453-460).
В томатах ауксин играет важную роль в завязывании и развитии плода. Iwahori (1967, Plant and Cell Physiology 8, 15-22) и Mapelli et al. (1978, Plant and Cell Physiology 19, 1281-1288) показал, что после опыления концентрация ауксина в завязи быстро возрастает, достигая максимума на 7-8 день после опыления (DAP). Второй пик активности ауксина наблюдался на 30 день после опыления. Важность ауксина в завязи плодов томата была проиллюстрирована в экспрессии, специфической для завязи, генов iaaM или rolB агробактерии, влияющей на синтез ауксина или ответную реакцию, что привело в образованию бессемянных (партенокарпических) плодов томата (Ficcadenti et al., 1999, Molecular Breeding 5, 463-470; Carmi et al., 2003, Planta 217, 726-735). Применение ауксина на неопыленные завязи привело к формированию плодов без необходимости в опылении и оплодотворении (Gustafson, 1936, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 22, 628-636; Bunger-Kibler and Bangerth, 1982, supra). Обычно в течение первых 10-14 дней (после оплодотворения) развития рост плода томата, в основном, зависит от клеточного деления. В течение следующих 6-7 недель, рост плода во многом зависит от роста клеток (Mapelli et
- 2 030460
al., 1978, supra; Bunger-Kibler and Bangerth, 1982, supra; Gillaspy et al., 1993, supra). Тем не менее, в плодах, вызванных ауксин индол-3-уксусной кислотой (IAA) период клеточного деления был короче и длился всего 10 дней, несмотря на то что клеточное деление проходило быстрее, чем в опыленных контрольных плодах. Тем не менее, данные плоды, индуцированные IAA, оставались меньшего размера, по сравнению с контрольными плодами, так как рост клеток замедлялся (Bunger-Kibler and Bangerth, 1982, supra). Обработка синтетическими ауксинами стимулировала клеточное деление на продолжительный период, что привело к формированию плодов с большим числом клеток перикарпия (Bunger-Kibler and Bangerth, 1982, supra; Serrani et al., 2007, Journal of Plant Growth Regulation 26, 211-221). Данные результаты предполагают, что на ранних этапах развития плода томата активность клеточного деления строго регулируется ауксином.
Ранее для определения генов, выраженных во время завязывания плода, использовалось транс криптное профилирование, основанное на полиморфизме длины амплифицированных фрагментов кДНК (cDNA-AFLP) (Vriezen et al., 2008, New Phytologist 177, 60-76). Один из 874 генов, индуцированных в завязях путем опыления, имел сходство последовательности с арабидопсисом ARF9 (AtARF9), a также учетный номер GenBank BT013639.1 (клон томата с неизвестной генной функцией). Несмотря на не очень высокую аминокислотную идентичность AtARF9 (52% идентичности последовательности с использованием программы парной линейной последовательности Emboss "Needle"), ген был назван SlARF9 (Solanum lycopersicum ARF9).
Арабидопсис имеет 23 гена ARF. Предполагается, что AtARF9 вовлечен в гравитропную сигнальную трансдукцию, так как мутантная линия арабидопсиса arf9, у которой отсутствует 3' конец транскрипта, слишком остро реагировала после гравистимуляции (Roberts et al., 2007, Gravitational and Space Biology Bulletin 20, 103-104). Более того, было установлено, что ген AtARF9 экспрессируется в суспензоре эмбриона арабидопсиса и двойных выбитых линиях, в которых как ARF9, так и ARF13 были заглушены, AtARF9 необходим для контроля за развитием суспензора (Liu et al., 2008, 19th International Conference on Arabidopsis Research, Montreal, Canada). До сих пор единственным известным ARF, участвующим в процессе развития плода, является плод без оплодотворения (FWF)/ARF8, так как мутантные линии fwf/arf8 образуют партенокарпные стручки (Goetz et al., 2006, The Plant Cell 18, 1873-1886). У томатов трансгенные линии с сокращенными транскриптными уровнями S1ARF7 также формируют партенокарпные плоды, что указывает на то, что S1ARF7 выступает в качестве отрицательного регулятора завязывния плода (de Jong et al., 2009, The Plant Journal 57, 160-170). Другим единственным описанным в настоящее время членом семейства томатов ARF является развитый регулируемый ген 12 (DR12), гомолог AtARF4. Уровни мРНК DR12 увеличивались в процессе развития плода и достигли высшего уровня на ранней красной стадии плода. С помощью антисмыслового подхода понижающая регуляция данного гена воздействовала на твердость плода на красной стадии (Jones et al., 2002, The Plant Journal 32, 603613).
Несмторя на то что сходство последовательности SlARF9 с AtARF9 может предположить, что данные гены теоретически могут быть ортологами (несмотря на то что сходство последовательности несущественно) согласно настоящему изобретению SlARF9 выполняют совершенно другую функцию в отличие от AtARF9 и экспрессируется в другие ткани. Создатели настоящего изобретения установили, что ген SlARF9 кодирует белок фактора транскрипции, что отрицательно отражается на делении клеток в период роста плода. На трансгенных томатах, у которых транскриптный уровень SlARF9 мРНК сократился засчет РНК-интерференциии (сайленсинга генов), появлялись более крупные и тяжелые плоды по сравнению с диким типом контрольных линий. Для сравнения, сверхэкспрессирующие линии SlARF9 имели плоды меньшего размера и меньшей массы, чем дикорастущие. Кроме того, количество клеток и клеточных слоев в перикарпие значительно возросло в плодах SlARF9-RNA-интерференции, по сравнению с дикими типами плодов. Более крупные плоды с большим количествов меньших клеток имеют преимущество не только в увеличении урожайности, но и твердости компонентов (клеточных оболочек, содержащих пектин, геми-целлюлозу и целлюлозу).
Общие определения
Термин "последовательность нуклеиновой кислоты" (или молекула нуклеиновой кислоты) относится к молекуле ДНК или РНК в одной или двухцепочной форме, в частности ДНК, кодирующей белок или фрагмент белка согласно данному изобретению. "Изолированная последовательность нуклеиновой кислоты" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая больше не находится в природной среде, из которой она была выделена, например последовательности нуклеиновой кислоты в бактериальной клетке-реципиенте или в растительном ядерном или пластидном геноме.
Термины "белок" или "полипептид" являются взаимозаменяемыми и относятся к молекулам, состоящим из цепочки аминокислот, независимо от конкретного способа действия, размера, 3-мерной структуры и происхождения. "Фрагмент" или "часть" белка SlARF9, таким образом, может еще называться "белком". "Изолированный белок" используется для обозначения белка, который уже не находится в своей природной среде, например в искусственных условиях или в рекомбинантной бактериальной или растительной клетке-реципиенте.
Термин "ген" означает последовательность ДНК, содержащую участок (участок транскрипции), ко- 3 030460
торый записан в молекуле РНК (например, мРНК или молекуле РНКи) в клетке, функционально связанной с подходящими регулируемыми участками (например, промоторами). Ген может, таким образом, состоять из нескольких функционально связанных последовательностей, таких как промотор, 5 лидерная последовательность, включающая, например, последовательности, участвующие в инициации трансляции, а (белок) кодирующий участок (кДНК или геномной ДНК), а также 3'нетранслируемую последовательность, включающую например, сайты терминации транскрипции.
"Химерный ген" (или рекомбинантный ген) относится к любому гену, который обычно не встречается в природе в видах, в частности генах, в которых одна или несколько частей последовательности нуклеиновых кислот присутствуют, которые не связаны друг с другом в природе. Например, промотор не связан в природе с частью или целым транскрибируемым участком или с другим регуляторным участком. Термин "химерный ген" подразумевает включение экспрессии конструкции, в которых промотор или транскрипция регуляторной последовательности функционально связана с одной или несколькими кодирующими последовательностями или антисмысловой (обратным дополнением к смысловой нити) или последовательностью обращенных повторов (смысл и антисмысл, посредством чего РНК транскрипт формирует двухцепочную РНК на транскрипции). "Цис-ген" - это химерный ген, предпочтительно все последовательности генов, по меньшей мере, транскрибированная последовательность, растительного вида, совместимого для размножения с видом, в который введен ген.
"Экспрессия гена" означает процесс, в котором ДНК участок, который функционально связан с соответствующими регулирующими участками, в частности промотором, транскрибируется в РНК, которая является биологически активной, т.е. которая способна быть переведенной в биологически активный белок или пептид (или активный фрагмента пептида), либо быть активной (например, в посттранскрипционном сайленсинге генов или РНК-интерференции). Кодирующая последовательность может быть в смысловой ориентации и кодирует желаемый, биологически активный белок или пептид, или активный фрагмент пептида. В подходах сайленсинга генов ДНК последовательность предпочтительно присутствует в виде ДНК антисмысловых или инвертированных ДНК повторах, состоящих из короткой последовательности гена-мишени в антисмысловой или в смысловой и антисмысловой ориентации (инвертированный повтор). "Эктопическая экспрессия" относится к экспрессии в тканях, в которых ген, как правило, не выражен.
"Активный белок" или "функциональный белок" - это белок, который имеет активность белка, измеримой в искусственных условиях, например, при анализе активности в искусственных и/или в естественных условиях, например, по фенотипу, предоставляемому белком. Белок "дикого вида" представляет собой полностью функциональный белок, представленный в диком виде растений. "Мутантный белок" это белок, включающий одну или несколько мутаций в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белки, причем мутация приводит к (мутантных молекул нуклеиновой кислоты кодирования) "ограничению функций" или "потере функции" белка, как, например, измеримых активностью белка в искусственных условиях по сравнению с активностью белка дикого вида, например в анализе активности и/или в естественных условиях, например по фенотипу предоставляемых мутантным аллелем.
"Мутация" в молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, представляет собой изменение одного или нескольких нуклеотидов по сравнению с диким типом последовательности, например, путем замены, удаления или вставки из одного или нескольких нуклеотидов. "Точечная мутация" заключается в замене одного нуклеотида, или вставке или удалении одного нуклеотида.
"Несмысловая" мутация - это (точечная) мутация в последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих белок, в результате чего кодон превращается в терминирующий кодон. Это приводит к преждевременному терминирующему кодону, присутствующему в мРНК и в усеченном белке. Усеченный белок, возможно, имеет сниженную функцию или потерю функции.
"Миссенс" мутация - это (точечная) мутация в последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих белок, в результате чего кодон меняют для кодирования различных аминокислот. Полученный белок, возможно, имеет сниженную функцию или потерю функции.
"Сплайс-сайт" мутация - это мутация в последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих белок, в результате чего РНК сплайсинг пре-мРНК изменяется, что приводит к мРНК, имеющей различные нуклеотидные последовательности и белку, имеющему различные последовательности аминокислот по сравнению с диким видом. Полученный белок, возможно, имеет сниженную функцию или потерю функции.
Мутация "сдвига рамки" - это мутация последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих белки, в которых рамки считывания мРНК изменены, что ведет к различным последовательностям аминокислот. Полученный белок, возможно, имеет сниженную функцию или потерю функции.
Мутация в регуляторной последовательности, например, в промоторе гена, - это изменение одного или нескольких нуклеотидов, по сравнению с диким видом последовательности, например, путем замены, удаления или вставки из одного или нескольких нуклеотидов, что приводит, например, к снижению или к отсутствию мРНК транскрипта полученного гена.
"Сайленсинг" относится к понижающей регуляции или полному ингибированию экспрессии гена гена-мишени или семьи генов.
- 4 030460
"Ген-мишень" в подходах сайленсинга генов - это ген или семья генов (или один или несколько конкретных аллелей гена), из которых эндогенная экспрессия гена подавляется или полностью замедляется (подавляется), когда химерный ген сайленсинга (или "химерный ген РНК-интерференции") выражается, например, и производит сайленсинг РНК транскрипта (например, дсРНК или петля РНК способны к сайленсингу эндогенной экспрессии гена-мишени). В подходах мутагенеза, ген-мишень является эндогенным геном, который должен мутировать, что приводит к изменению (снижению или потере) экспрессии генов или изменения (снижения или потери) функции кодируемого белка.
"Смысловой" РНК транскрипт, как правило, получен путем соединения промотора в двухцепочную молекулу ДНК, в которой смысловая нить (кодирующая цепь) молекулы ДНК в 5' к 3' ориентации, так что при транскрипции РНК смысл транскрибируется, который имеет одинаковую последовательность нуклеотидов в смысловой ДНК нити (за исключением того, что Т заменяется U в РНК). "Антисмысловой" РНК транскрипт, как правило, получен путем соединения промотора в комплементарную нить (антисмысловую нить) смысловой ДНК, таким образом, при транскрипции антисмысловая РНК транскрибируется.
"Транскрипция регуляторной последовательности" здесь определяется как последовательность нуклеиновой кислоты, которая способна регулировать скорость транскрипции (кодирования) последовательности, функционально связанной с транскрипцией регуляторной последовательности. Транскрипция регуляторной последовательности, как определено в данном документе, таким образом, включает в себя все последовательности элементов, необходимых для инициации транскрипции (элементов промотора), для поддержания и регулирования транскрипции, включая, например, ослабители и усилители. Хотя, главным образом, растущая (5') транскрипция регуляторных последовательностей в кодирующей последовательности относится к регуляторнои последовательности, обнаруженной в снижении (3') кодирующей последовательности, также подпадает под это определение.
Используемый здесь термин "промотор" относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, которая контролирует транскрипцию одного или нескольких генов, расположенных выше по отношению направления транскрипции инициации транскрипции участка гена, и структурно определен наличием участков, связывающих ДНК-зависимую РНК-полимеразу, участки инициации транскрипции и любые другие последовательности ДНК, в том числе, но не ограничиваясь транскрипционными факторами участков связывания, репрессора и активатора связывания участков белка и любой другой последовательности, известному одной из способностей в уровне техники, чтобы прямо или косвенно регулировать количество транскрипции промотора. "Конститутивный" промотор - это промотор, активный в большинстве тканей в самых физиологических и развивающихся условиях. "Индуцируемый" промотор - это промотор, который физиологически (например, наружное применение некоторых соединений) или эволюционно регулируется. "Тканеспецифичный" промотор действует только в определенных типах тканей или клеток. "Тканепредпочтительный" промотор действует в определенных тканях (например, в развивающихся тканях плода), однако он также может действовать и в других тканях.
В соответствии с данным документом термин "функционально связанный" относится к соединению полинуклеотидных элементов в функциональной взаимосвязи. Нуклеиновая кислота "функционально связана", когда она находится в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновых кислот. Например, промотор, или, скорее, транскрипция регуляторной последовательности, функционально связан с кодирующей последовательностью, если это влияет на транскрипцию кодирующей последовательности. Функционально связан означает, что ДНК последовательности, будучи связанными, как правило, являются смежными и, при необходимости, объединяют два участка кодирования белка, смежных и в рамке считывания, чтобы произвести "химерный белок". "Химерный белок" или "гибридный белок" представляет собой белок, состоящий из различных белков "доменов" (или мотивов), который не был найден в качестве такового в природе, но который был объединен для формирования функционального белка, который показывает функциональность присоединенных доменов. Химерный белок также может быть гибридным белком двух или более белков, встречающихся в природе.
Термин "домен", используемый в настоящем документе, означает любую часть (части) или домен(ы) белка с определенной структурой или функцией, которые могут быть переданы другому белку для обеспечения нового гибридного белка, по крайней мере, с функциональной характеристикой домена. Конкретные домены могут также быть использованы для идентификации представителей белков, принадлежащих к группе белков S1ARF9, таких как варианты S1ARF9 томата или ортологи S1ARF9 других видов растений. Примеры доменов, найденных в белках S1ARF9, - это полученный из В3 ДНКсвязывающий домен, который включает в себя примерно 74-236 аминокислот из SEQ ID NO: 2 или ее вариантов, средний участок (MR), который включает в себя примерно 237-564 аминокислот из SEQ ID NO: 2 или ее вариантов, ответный участок ауксина, который включает в себя примерно 256-332 аминокислот из SEQ ID NO: 2 или ее вариантов, домены димеризации III или IV, которые включают в себя примерно 565-602 или 609-651 аминокислот из SEQ ID NO: 2, соответственно, либо ее варианты.
Термины "пептид-мишень" относится к аминокислотным последовательностям, которые нацелены на белки внутриклеточных органелл, таких как пластиды, предпочтительно хлоропласты, митохондрии, или в межклеточное пространство (секрецию сигнального пептида). Последовательность нуклеиновой
- 5 030460
кислоты, кодирующая пептид-мишень, может быть объединена (в рамке) в последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую терминальный конец аминокислоты (N-терминальный конец) белка.
"Конструкт нуклеиновой кислоты" или "вектор" в данном документе подразумеваются как искусственные молекулы нуклеиновой кислоты, которые получены в результате использования технологии рекомбинантной ДНК и которые используются для доставки экзогенной ДНК в клетку-реципиента. Основной вектор может быть, например, двоичном или супербинарным вектором (см. прим. US 5591616, US 2002138879 и WO 9506722), совместной интеграции вектора или Т-ДНК вектора, как известно в уровне техники и в данном документе, в который интегрирован химерный ген, или, если подходящая транскрипция регуляторной последовательности уже существует, только желаемая последовательность нуклеиновых кислот (например, кодирующая последовательность, антисмысловая или последовательность инвертированного повтора) интегрирована на выходе транскрипции регуляторной последовательности. Векторы обычно включают дальнейшие генетические элементы, чтобы облегчить их использование в молекулярном клонировании, такие как, например, селектируемые маркеры, несколько сайтов клонирования и т.п. (см. ниже).
"Клетка-хозяин" или "рекомбинантная клетка-хозяин" или "трансформированная клетка" - это термины, относящиеся к новой отдельной клетке (или организму), возникающей в результате по крайней мере из одной молекулы нуклеиновой кислоты, особенно содержащей химерный ген, кодирующий желаемый белок или последовательность нуклеиновых кислот, которые при транскрипции уступает антисмысловой РНК или РНК инвертированного повтора (или шпильки РНК) для сайленсинга целевого гена/семьи генов были введены в указанные клетки. Клетка-хозяин - это предпочтительно растительная клетка или бактериальная клетка. Клетка-хозяин может содержать конструкт нуклеиновой кислоты в качестве экстра-хромосомной (эписомной) репликации молекул, или, более предпочтительно, включает в себя интегрированный химерный ген в ядерном или пластидном геноме клетки-хозяина.
Термин "селектируемый маркер" - это термин подобен одному из обычных нововведений в уровне техники и используется здесь для описания любого генетического объекта, который, будучи выраженным, может быть использован, чтобы выбрать клетку или клетки, содержащие селективный маркер. Селектируемый маркер генных продуктов придает, например, устойчивость к антибиотикам, или, еще лучше, устойчивость к гербицидам или иным селектируемым свойствам, таким как фенотипическое свойство (например, изменение пигментации) или потребности в питании. Термин "репортер" в основном используется для обозначения видимых маркеров, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP), eGFP, люцифераза, GUS и т.д.
Термин "ортолог" гена или белка относится здесь к гомологичному гену или белку, найденному в другом виде, который имеет ту же функцию, что и ген или белок, но (обычно) разделившиеся в последовательности с момента времени, когда виды, скрывающие ген, разделяются (т.е. гены эволюционировали от общего предка при помощи видообразования). Ортологи гена томатов SlARF9, таким образом, можно определить и в других видах растений, основанных на последовательности сравнений (например, на основе процентной идентичности последовательности по всей последовательности и/или во всех определенных доменах) и/или функциональном анализе.
Термины "гомологичный" и "гетерологичный" относятся к взаимодействию между нуклеиновой кислотой или последовательностью аминокислоты и ее клетки-хозяина или организма, особенно в контексте трансгенных организмов. Гомологичная последовательность, таким образом, найдена в естественных условиях в видах хозяев (например, в растении томата, преобразованного геном томата), а гетерологичная последовательность найдена в естественных условиях в клетке-хозяине (например, растение томата преобразовано последовательностью из растения картофеля). В зависимости от контекста термин "гомолог" или "гомологичный" альтернативно может относиться к последовательностям, которые являются потомками от общей последовательности предков (например, они могут быть ортологами).
"Жесткие условия гибридизации" могут быть использованы для идентификации нуклеотидных последовательностей, которые существенно идентичны данной нуклеотидной последовательности. Жесткие условия зависят от последовательности и будут отличаться в различных обстоятельствах. Обычно жесткие условия следующие: 5°С ниже точки плавления (Tm) для определенной последовательности под определенной ионной прочностью и рН. Tm - это температура под определенной ионной прочностью и рН, при которой 50% целевой последовательности гибридизирует в идеально подходящий экземпляр. Обычно строгие условия будут выбраны таким образом, что концентрация солей составляет около 0,02 молярной при рН 7 и температуре менее 60°С. Снижение концентрации соли и/или повышение температуры увеличивает точность. Жесткие условия для РНК-ДНК гибридизации (Нозерн-блоттинг, используя, например, 100-й образец) - это, например, те, которые включают, по крайней мере, одну промывку в 0,2 х SSC при 63°С в течение 20 мин, или эквивалентных условиях. Жесткие условия для РНК-ДНК гибридизации (Southern blots, используя, например, 100-й образец) - это, например, те, которые включают, по крайней мере, одну промывку (обычно 2) в 0,2 х SSC при температуре, по крайней мере, 50, обычно при 55°С, в течение 20 мин или эквивалентных условиях. См. также Sambrook и др. (1989) и Sambrook и Russell (2001).
- 6 030460
"Идентичность последовательности" и "сходство последовательности" можно определить выравниванием двух пептидных или двух нуклеотидных последовательностей с использованием глобальных или локальных алгоритмов выравнивания. Последовательности могут затем считаться "практически идентичными" или "весьма подобными", когда они (оптимально выравнены, например, программой GAP или BESTFIT или фильтрующей программой "Needle" (с использованием параметров по умолчанию, см. ниже) разделяют, по крайней мере, определенный минимальный процент идентичности последовательности (как определено ниже). Эти программы используют глобальный алгоритм выравнивания НидлманаВунша для выравнивания двух последовательностей по всей длине, получая максимальное количество совпадений и сводя к минимуму количество пробелов. Обычно параметры по умолчанию используется с пробелом создания разрыва = 10 и пробелом расширение разрыва = 0,5 (как для нуклеотидного, так и белкового выравнивания). Для нуклеотидов используемый подсчет значений матрицы по умолчанию это nwsgapdna и для белков подсчет значений матрицы по умолчанию - это Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919). Выравнивания последовательности и показатели процентной идентичности последовательности, например, могут быть определены с помощью компьютерных программ, таких как пакет GCG Висконсин, версия 10.3, доступных из Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA or EMBOSS (http://www.ebi.ac.uk/Tools/webservices/services/emboss). Альтернативно сходство процентов или идентичность могут быть определены с помощью функции поиска в базах данных, таких как FASTA, BLAST и т.д., но совпадения должны быть получены и приведены в соответствие попарно, чтобы сравнить идентичность последовательности.
В данном документе и его формуле глагол "содержать" и его конъюгации используются в неограниченном смысле, это подразумевает то, что пункты после слова включены, но пункты, которые не были упомянуты, также не исключены. Кроме того, ссылка на элемент с помощью неопределенного артикля "а" или "an" не исключает возможности того, что более чем один элемент присутствует, если только в контексте четко не указано, что один и только один из элементов может быть. Неопределенный артикль "а" или "an", таким образом, обычно означает "по крайней мере, один". Далее подразумевается, что, когда речь идет о "последовательности" здесь, как правило, ссылаются на реальные физические молекулы с определенной последовательностью субъединиц (например, аминокислоты).
В соответствии с документом термин "растение" включает в себя целое растение или любые части или их производные, такие как органы растений (например, сжатый или несжатый запасающий орган, луковицы, клубни, плоды, листья и т. д.), растительные клетки, протопласты растений, растительные клетки или ткани культур, из которых целые растения могут быть восстановлены, растительные каллюсы, группа побегов растительных клеток и растительные клетки, которые являются неизменными в растениях или частях растений, таких как эмбрионы, пыльца, яйцеклетки, завязи, плоды (например, собранные ткани или органы, такие, как собранные томаты или его части), цветы, листья, семена, клубни, луковицы, клонально размноженные растения, корни, корневые штаммы, стебли, верхушки корня и тому подобное. Также включена любая стадия развития, например саженцы, незрелые и зрелые и т.д.
"Сорт растения" представляет собой группу растений в пределах одного ботанического таксона низшего класса известно, что (независимо от того, условия для признания права селекционера выполнены или нет) может быть определена на основе экспрессии характеристик, которые получаются из определенного генотипа или комбинации генотипов, может отличить от любой другой группы растений степенью выраженности, по крайней мере одна из этих характеристик, и может рассматриваться как единое целое, потому что это может быть умножено без изменений. Таким образом, термин "сорт растения" не может быть использован для обозначения группы растений, даже если они того же рода, если все они характеризуются наличием 1 локуса или гена (или ряда фенотипических характеристик в связи с одним локусом или геном), но в противном случае могут отличаться друг от друга чрезвычайно, что касается других локусов и генов.
"F1, F2 и т.д." относятся к последовательно связанным поколениям после скрещивания двух родительских растений или родительских линий. Растения, выращенные из семян, полученных путем скрещивания двух растений или линий, называются поколение F1. Самоопыление растений F1 приводит к поколению F2 и т.д. "Гибрид F1" растения (или семя F1) является поколением, полученным от скрещивания двух инбредных родительских линий. "Популяция M1" -это множество мутировавших семян/растений определенной растительной линии или сорта. "M1, М2, М3, М4, и т.д." относится к последовательным поколениям, полученным после самоопыления первых мутировавших семян/растений (M1).
Термин "аллель(и)" обозначает любую одну или несколько альтернативных форм гена в определенном локусе, все из которых относятся к аллели одного свойства или характеристике в определенном локусе. В диплоидной клетке организма, аллели данного гена находятся в определенном месте или локусе (loci plural) в хромосоме. Один аллель присутствует в каждой хромосоме пары гомологичных хромосом. Диплоидные растительные виды могут включать в себя большое число различных аллелей в определенном локусе. Они могут быть идентичными аллелями гена (гомозиготными) или двуми разными аллелями (гетерозиготными).
Термин "локус" (loci plural) означает определенное место или места, или участок на хромосоме, где
- 7 030460
найден, например, ген или генетический маркер. Локус S1PP2C1, таким образом, участок в геноме, где найден ген S1PP2C1. Без ограничения настоящего изобретения, предполагается, что локус S1ARF9 расположен в хромосоме 8 генома томата.
"Аллель дикого типа" (WT) относится здесь к версии гена, кодирующего функциональный белок (дикий тип белка). Аллель S1PP2C1 дикого типа томата сорта Moneymaker, например, представлен в SEQ ID NO: 1 (мРНК/кДНК) и SEQ ID NO: 3 (геномная ДНК, с кодирующей областью SlARF9 нуклеотида в пределах с 2005 до 5879). Аллель SlARF9 дикого типа томата сорта Heinz 1706 представлен в SEQ ID NO: 4 (геномная ДНК, с кодирующей областью SlARF9 нуклеотида в пределах с 1196 до 5869). "Мутантный аллель" относится здесь к аллелю в составе одной или нескольких мутаций в кодирующей последовательности (мРНК или кДНК, или геномной последовательности), по сравнению с диким типом аллеля. Такая мутация(и) (например, вставка, инверсия, удаление и/или замена одного или нескольких нуклеотидов) может привести к кодируемому белку, сократив в искусственных и/или в естественных условиях (снижение функции), либо не в искусственных и/или в естественных условиях (потеря функции), например, в связи с белком, будучи укороченным, или с аминокислотной последовательностью, в которой одна или более аминокислот удалены, вставлены или заменены. Такие изменения могут привести к белку, имеющему различные 3D-конформации, ставшим мишенью для различных субклеточных компартментов, имеющих измененный каталитический домен, имеющий изменение связывающей активности с нуклеиновыми кислотами или белками и т.д.
"Плоды большего размера" или "значительно увеличенные по размеру плоды", "значительно увеличенный размер плодов" или "растение, производящее плоды большего размера" в данном документе относится к значительно большему размеру плода (в среднем), по сравнению с подходящими контрольными растениями (например, растениями дикого типа), т.е. средний экваториальный диаметр и/или средний объем и/или средняя масса свежего плода значительно больше, чем у контрольного. Размер плода предпочтительно определяется в конце фазы роста (т.е. когда плод вырос до своего конечного размера), либо после нее (у выросшего плода, например, на молочной стадии).
"Большее количество клеток перикарпия" или "плоды с большим количеством клеток перикарпия" в данном документе относится к количеству клеток перикарпия и/или количеству клеточных слоев в перикарпие (включая эпидермис, экзокрпаий, мезокарпий и эндокарпий), которое значительно больше (в среднем), чем в контрольных плодах. Количество клеток предпочтительно определяется в конце фазы клеточного деления (т. е. на или после около 10 дня после опыления у томата) и/или в конце фазы роста плода или после нее (у выросшего плода, например, на молочной стадии томата).
"Небольшие клетки перикарпия" относится к среднему размеру клеток перикарпия, в частности к клеткам мезокарпия, которые значительно меньше, чем у контрольных плодов (например, у диких типов плодов). Размер клетки предпочтительно определяется в конце фазы клеточного деления (т.е. на или после около 10 дня после опыления у томата) и/или в конце фазы роста плода или после нее (у выросшего плода, например, на молочной стадии).
"Растение дикого типа" относится здесь к растению, включающему аллель SlARF9 дикого вида (WT), кодирующий функциональные белки (например, в отличие от "мутантных растений", включающих мутантный аллель slarf9). Такие растения, например, являются подходящими контрольными группами в фенотипических анализах. Предпочтительно растения дикого вида и/или мутанты - "культурные растения", т. е. разнообразие, линии разведения и сорта видов, культивируемые человеком и имеющие хорошие агрономические характеристики, предпочтительно такие растения - не "дикие растения", т.е. растения, которые обычно имеют намного хуже урожаи и агрономические характеристики, чем культурные растения и, например, растут естественно в диких популяциях. "Дикие растения" включают, например, экотипы, PI (интродукция растений) линии, местные сорта и дикие присоединения или дикие родственные формы видов, или так называемое видовое разнообразие или сорта, например разнообразие или сорта обычно выращены в более ранние периоды человеческой истории, но, которые не используются в современном сельском хозяйстве.
"Варианты" гена SlARF9 или белка включает как природные, так аллельные варианты, найденные в виде S. lycopersicum, а также ортологи, найденные в других видах растений, таких как другие виды двудольных или однодольных растений.
К диким родственным видам томата относятся S. arcanum, S. chmielewskii, S. neorickii (= L. parviflorum), S. cheesmaniae, S. galapagense, S. pimpinellifolium, S. chilense, S. corneliomulleri, S. habrochaites (= L. hirsutum), S. huaylasense, S. sisymbriifolium, S. peruvianum, S. hirsutum or S. pennellii.
"Средний" относится к арифметической величине.
Подробное описание изобретения
Авторы изобретения начали изучение генов, которые дифференциально выражены во множестве плодов томата, проводя анализ транскриптом (кДНК-AFLP) опыленных завязей и GAз(гибберелловой кислоты), обработанных завязей (Vriezen и др. 2008, New Phytologist 177:60-76). Один ген, который был высоко выражен в неопыленных завязях и менее выражен в опыленных завязях, характеризуется дальнейшим генерированием трансгенных растений, в целях изучения роли этого гена. Ген томата был назван SlARF9 (Solanum lycopersicum ARF9), так как он кодирует белок 658 аминокислот, содержащий по- 8 030460
следовательность аминокислоты, наиболее схожую с белком Arabidopsis ARF9 (52% идентичности аминокислотной последовательности и 61% идентичности последовательности кДНК, используя программу "needle", раскрытие GAP = 10 и растяжение GAP = 0,5).
Было установлено, что SlARF9 высоко выражен в семяпочке, плаценте и перикарпие опыленных завязей (см. фиг. 1). Более подробный анализ показал, что SlARF9 был также записан в другие ткани растения, такие как меристемы и корневые меристемы. Как правило, это ткани, в которых происходит многократное клеточное деление. Трансгенные растения с увеличенными уровнями SlARF9 мРНК формируют плоды, меньшие по размеру, чем плоды дикого типа. Так как плоды трансгенных линий, у которых уровни SlARF9 мРНК были сокращены, сформировали более крупные плоды, благодаря увеличению активности клеточного деления. Анализ экспрессии, а также фенотипный анализ трансгенных линий показал, что SlARF9 выступает в качестве репрессора клеточного деления в период развития плода. Примечательно, что сокращение SlARF9 иРНК путем постоянной экспрессии молекулы РНКи под контролем промотора CaMV 35S не вызвало появление других отрицательных фенотипов. Таким образом, несмотря на то, что ген SlARF9 не может считаться плод-специфическим геном, линии РНКи SlARF9 проявили только фенотип плода, указывая на то, что в других тканях растения SlARF9 может избыточно взаимодействовать с другими членами семейства белков ARF.
Сведения о том, что SlARF9 участвует в определении размера плода, могут использоваться для выращивания трансгенных и/или нетрансгенных растений с более крупными плодами либо путем сокращения количества белка SlARF9 дикого типа (или его вариантов или ортологов), либо функционирования белка дикого типа (или его вариантов или ортологов) в период роста плода, как будет указано ниже. В частности, увеличилось клеточное деление, что привело к значительному увеличению количества клеток и/или клеточных слоев в перикарпие и/или сокращению количества клеток в плоде. Таким образом, растения дают более крупные плоды с более твердыми компонентами.
Результаты исследования могут также использоваться для значительного уменьшения размера плода, по сравнению с контрольным (например, растение дикого типа) с помощью сверхэкспрессии гена SlARF9, варианта или ортолога, кодирующего функциональный белок SlARF9 (или вариант) в растении, как описано в данном документе.
Различные примеры осуществления изобретения описаны здесь ниже и в неограниченных примерах. Части, описанные здесь, применимые к трансгенным подходам, как правило, применимы и к нетрансгенным подходам и наоборот, если не указано иное.
В одном из вариантов осуществления изобретения, в котором эндогенная экспрессия SlARF9 снижается или регулируется, по крайней мере, в период роста плода, и на которых появляются более крупные плоды, представлены в данном документе. В другом варианте осуществления изобретения нетрансгенные растения, имеющие в составе один или несколько мутантных аллелей slarf9 (либо в гомозиготной или гетерозиготной форме) и отличающиеся тем, что мутантный аллель(и) кодирует(ют) белок SlARF9, который снизил функциональность в искусственных и/или в естественных условиях по сравнению с диким типом белка, или привел к отсутствию функциональности (например, с помощью трансляционного терминирующего кодона или мутации сдвига рамки), в то время как мутация выражается в растениях (мутантных линиях или его потомстве), имеющих существенно увеличенные плоды по сравнению с растениями с отсутствием мутантного аллеля (ей) (дикие виды растений), представлены в настоящем документе. Такие нетрансгенные, растения с более крупными плодами в одном из вариантов осуществления изобретения созданы или определены с помощью TILLING подхода или Eco-TILLING, но также могут быть созданы или определены с использованием других известных методов мутагенеза в сочетании с методами разведения. Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения мутантный аллель slarf9 индуцирован и/или определен людьми, используя методы мутагенеза ("индуцированный мутант"), а в другом варианте осуществления изобретения мутантный аллель slarf9 является "естественным мутантом", т.е. он определяется в естественных популяциях растения (таких как дикие виды томатов) и затем вводятся в элитную идиоплазму. "Индуцированные мутанты" предпочтительно генерируется в культивируемой зародышевой плазме и, таким образом, непосредственно присутствуют в агрономически ценных линиях. С другой стороны, "естественные мутанты" или "спонтанные мутанты" или "естественный варианты" или "естественные аллельные варианты/вариации" на основе естественной изменчивости (полиморфизма/мутаций), найденные в виде и, таким образом, вероятно, присутствуют в растительных материалов низших агрономического качества, не культивируются в современном сельском хозяйстве, например, в дикорастущих растениях. Позднее аллели должны быть переданы в культивируемые растения, имеющие хорошие агрономические характеристики, что и является одним из пунктов изобретения.
Применение последовательности нуклеиновых кислот и белков согласно изобретению.
В одном из вариантов осуществления изобретения последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотных последовательностей SlARF9 представлены в настоящем документе, а также методы выделения и определения их "вариантов", например, аллелей в пределах вида (Solanum Lycopersicum) или в пределах рода Solanum (например, дикие родственные виды томата, такие как S. pennelli, S. habrochaites и т.д.), или ортологов SlARF9 других видов растений, таких как другие виды овощных (например, виды
- 9 030460
семейства Solanaceae, например перец или баклажан; или Cucurbitaceae, например дыня, арбуз или огурец) или полевых культур (например, кукуруза, пшеница, рис).
Дикий тип S1ARF9 транскрипционного фактора белка, полученный из сорта томата Moneymaker (свежий томат) представлен в SEQ ID NO: 2. Это белок состоит из 658 аминокислот, который включает в себя несколько доменов, а именно а) ДНК-связывающий домен, расположенный на N-термигальном участке (аминокислоты 74-236 SEQ ID NO: 2), который способен связывать цис-регуляторные элементы на участке промотора генов, регулируемых ауксинов, b) средний участок ("MR", аминокислоты с 237 по 564 SEQ ID NO: 2) и с) два домена димеризации III (аминокислоты 565-602 SEQ ID NO: 2) и домен IV (аминокислоты с 609 по 651 SEQ ID NO: 2).
Белок процессингового томата сорта Heinz 1706 представлен в SEQ ID NO: 4. Он имеет идентичность последовательности 99,8% белка SEQ ID NO: 2, так как он содержит только одну отличающуюся аминокислоту. Последняя аминокислота, аминокислота 658, это гистидин (Гис) в сорте Moneymaker (SEQ ID NO: 2) и серии (Сер) в сорте Heinz 1706. Ген, кодирующий белок Heinz 1706, может, таким образом, считаться аллельным вариантом гена, найденного в свежем томате сорта Moneymaker.
"Белок SlARF9" (включая его "варианты", такие, как белки, кодируемые аллельными вариантами гена или ортологами гена) могут быть определены по их идентичности аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 2 по всей длине, т.е. белки, имеющие идентичность последовательности, по крайней мере 55, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99% или более SEQ ID NO: 2 (как определено попарным выравниванием, используя Emboss "Needle", 62 Blossum матрицу, пробел создания разрыва = 10, пробел расширения разрыва = 0,5) и имея в естественных условиях функцию, которая по существу аналогична SlARF9.
Также сюда включена потеря функции мутантов дикого типа SlARF9 белков (или их вариантов, как указано выше) или снижение функции мутантов дикого типа SlARF9 белков (или их варианты), как описано в другом месте, и растения, или части растений, в составе одного или нескольких нуклеотидных последовательностей, кодирующих такие мутанты, в которых мутантные аллели приводят к увеличению размере плодов, по сравнению с растениями, включающими последовательность еуклеиновой кислоты, кодирующей белок SlARF9 дикого типа. Более крупными плодами являются плоды массой (в среднем) по меньшей мере 105%, предпочтительно по меньшей мере 110, 120, 130, 140, 150% или более, средней массы свежего плода плодов растений дикого типа. В некоторых случаях диаметр среднего плода составляет 105, 110, 115% или более диаметра плода растений дикого типа.
В некоторых случаях среднее количество клеток в перикарпие ткани и/или количество клеточных слоев ткани перикарпия значительно больше, чем у контрольных растений (например, у плодов растений дикого типа). Также средний размер клеток перикарпия, в частности, мезокарпия, значительно меньше, чем у контрольных растений. Предпочтительно, среднее количество клеток перикарпия (на участок, см. примеры) составляет по меньшей мере около 105, 110, 120, 130, 140, 150, 160% или более контрольных растений. Предпочтительно, число клеточных слоев составляет, по меньшей мере, 105, 110, 120% или более контрольных растений. Предпочтительно также средний размер клеток перикарпия (в частности, клеток мезокарпия) составляет по меньшей мере около 95, 92, 90, 85, 75, 72% или менее среднего размера клеток контрольных растений.
"Функция, которая, по сути, похожа на функцию SlARF9" относится в данном документе к белку с проверенной функцией определения размера плода. Растения с гиперэкспрессией SlARF9, или ее вариантом, по меньшей мере, в развитии тканей плода, производят (в среднем) значительно меньшие по размеру плоды, по сравнению с контрольными растениями (например, растения дикого типа, трансформированные с пустым вектором). И наоборот, растения со сниженными уровнями полностью функционального (дикого типа) белка SlARF9, или его варианта, по крайней мере, в развивающейся ткани плода, производят (в среднем) более крупные плоды, по сравнению с контрольными растениями (например,растениями дикого типа или растениями, трансформированными с пустым вектором). Как показано в примере, средняя масса плода сверхэкспрессированных линий SlARF9 составила менее 75% массы дикого типа, средний диаметр плода составил менее 90% дикого типа. Для сравнения, средняя масса плода подавленных линий составила более 125% массы дикого типа, а диаметр - более 105% диаметра дикого типа.
Таким образом, функция (предполагаемого) белка SlARF9 может быть проверена, используя различные известные методы, например, путем сравнения фенотипа трансформированных клеток, конститутивно выражающих белок, прошедший тестирование фенотипом SlARF9 сверхэкспрессирующих трансформированных клеток того же вида реципиента (и сорта) (предпочтительно включающих химерный кодирующий ген SlARF9, устойчиво интегрированный в геном реципиента), что позволяет провести прямое сравнение функционального влияния на фенотип трансформированных клеткок.
Подобным образом, трансформированные клетки, в которых ген SlARF9 (или вариант) будет приглушен или подавлен (например, мРНК SlARF9 значительно снижается, по меньшей мере, в ткани развивающегося плода, по сравнению с диким видом или контрольной трансформированной клеткой) может быть использована для определения функции. "Значительное сокращение" мРНК транскрипта SlARF9 относится к мРНК мишени, присутствующей на уровне меньше или равном 90, 80, 70, 60, 50 40, 30, 20% или меньше (10, 5 или 0%) уровня транскрипта, находящегося в диком виде или контрольной трансфор- 10 030460
мированной клетке (например, пустой трансформированной клетке вектора). Понятно, что в любых преобразовательных экспериментах определенная степень изменения фенотипа трансформированных клеток видна, как правило, из-за позиции воздействия на геном и/или по количеству копий. Квалифицированный специалист знает, как сравнить трансформированные клетки друг с другом, например, выбрав одно число копий событий и анализируя их фенотипы. Другие методы определения или подтверждения в естественных условиях функции гена/белка включают поколение модифицированных мутантов или мутантов со сниженной функцией (например, TILLING подход) или переходные исследования экспрессии. Исследования экспрессии гена промотора-репортера могут также предоставлять информацию о пространственно-временном образце экспрессии и роли белка.
Приведенные выше методы могут быть использованы для проверки любых предполагаемых генов S1ARF9, таких как аллель диких видов томата или культивируемых растений томата или томатной линии разведения или PI (интродукция растений) линии или из другого вида (например, дыни или других фруктов или видов овощей или видов сельскохозяйственных культур) действительно вариант S1ARF9, который затем может быть использован для создания трансгенных и/или нетрансгенных растений, имеющих (значительно) более крупные плоды по сравнению с подходящими контрольными группами, такими, как растения дикого вида. Известно, что относительные трансгенные растения, преимущественно растения, имеющих хорошие агрономические характеристики, преобразованы и регенерированы, т.е. культивируемые растения (например, высокоурожайные сорта и селекционные линии), и что наиболее подходящие контрольные группы - пустые трансформированные клетки вектора той же линии или нескольких растений нетрансформированных линий как таковых.
Последовательности, представленные в данном документе, могут использоваться для определения, получения и/или разъединения других аллелей S1ARF9 или s1arf9 других растений томата, диких родственных видов томата, либо ортологи других видов. Таким образом, последовательности могут также использоваться для получения и/или определения растений, имеющих один или несколько мутантных аллелей s1arf9 в их геноме, где мутация ведет к значительному увеличению размеров плода. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения представлено применение гена SlARF9 для определения и/или получения растений, имеющих один или несколько мутантных аллелей s1arf9, способных производить более крупные плоды.
Предпочтительно, растения, согласно настоящему изобретению, имеют один или несколько мутантных аллелей s1arf9 (или вариантов) и производят более крупные плоды, но не производят меньше плодов, чем растения дикого типа. Таким образом, количество плодов на одном растении, предпочтительно, не уменьшилось. В одном варианте осуществления изобретения растения согласно настоящему изобретению производят плоды в конце периода производства плодов, которые имеют такой же размер, как плоды дикого типа в середине данного периода. Размер плода дикого типа томата в конце периода роста плода меньше по причине условий окружающей среды. Подобный эффект в конце сезона компенсируется растениями, согласно настоящему изобретению.
Другие предполагаемые гены/белки SlARF9 могут быть определены в кремнии, например, путем определения нуклеиновых кислот и белковых последовательностей в существующей нуклеиновой кислоте или базе данных белков (например, GenBank, SwissProt, TrEMBL) и с использованием стандартного программного обеспечения для анализа последовательностей, таких как последовательность инструментов поиска сходства (BLASTN, BLASTP, BLASTX, TBLAST, FASTA и т.д.). Предполагаемые аминокислотные последовательности или последовательности нуклеиновых кислот, включающие или кодирующие белок SlARF9 (как определено выше) выбраны, клонированные или синтезированные заново и проверены на функциональность в естественных условиях, например, путем сверхэкспрессии или сайленсинга в растении-реципиенте. Следует отметить, что назначение SlARF9 также используется в данном документе для белков, которые происходят из видов, кроме Solanum Lycopersicum, т.е. префикс Sl здесь не ограничивают белок какого-то конкретного вида.
В одном из вариантов осуществления изобретения предоставляются сниженная функция или потеря функций мутантных белков SlARF9 (включая варианты или ортологи, как определено в данном документе), а также растения и их части в составе одного или нескольких аллелей slarf9 в их геноме, которые кодируют сниженную функцию или потерю функции мутантов, где сниженная функция или потеря функции позволяет значительно увеличить размер плода, в с лучае их присутствия в геноме растения.
Любой тип мутации может привести к снижению функции или потере функции кодируемого белка SlARF9, например, вставки, удаления или замены одного или нескольких нуклеотидов в кДНК (SEQ ID NO: 1, или варианты), либо в соответствующей геномной последовательности SlARF9 (нуклеотиды 20055879 SEQ ID NO: 3, нуклеотиды 1198-5869 SEQ ID NO: 4 или ее варианты), в частности в любой из 14 последовательностей экзона (см. SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4) и/или пределы интрона/экзона белков SlARF9 (или их вариантов, включая ортологи). В предпочтительном варианте осуществления изобретения представлена последовательность нуклеиновой кислоты slarf9, способная увеличивать размер плода, при этом последовательность нуклеиновой кислоты кодирует сокращение или потерю функции белка SlARF9 по причине одной или нескольких мутаций на участке, кодирующем ДНК-связывающий домен (аминокислота 74-236 SEQ ID NO: 2, кодируемые экзонами 3-8), MR (аминокислоты 237-564 SEQ ID NO:
- 11 030460
2, кодируемые экзонами 8-12, а также в пределах MR аминокислот 256-332 наиболее предпочтительны, кодируемые экзонами 8-10), домен димеризации III (аминокислоты 565-602 SEQ ID NO: 2, кодируемые экзонами 12 и 13) и/или домен димеризации IV (аминокислоты 609-651 SEQ ID NO: 2, кодируемые экзонами 13 и 14).
Влияние мутации на функцию белка (сокращение или потеря функции) можно установить с помощью анализа SIFT (Pauline С. Ng and Henikoff 2003, Nucleic Acid. Research. Том. 31, стр. 3812-3814), либо определить путем оценки влияния на размер плода (определение фенотипа).
В естественных условиях сокращения или потери функции подобные белки могут быть проверены, как описано выше, путем определения влияния данного мутантного аллеля на увеличение размера плода. Растения, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую такие мутантные белки со сниженной функцией или с потерей функции и более крупными плодами, могут быть, например, созданы с помощью TILLING подхода или идентифицированы с помощью EcoTILLING подхода, как описано ниже.
В одном из случаев реализации изобретения (кДНК или геномные) последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих такие мутантные белки, состоят из одной или нескольких смысловых и/или несмысловых мутаций, например переходов (замена пурина с другим пуринов (А θ G) или пиримидина с другой пиримидином (С θ Т)) или трансверсией (замена пурина с пиримидином, или наоборот (С/Т θ A/G). В одном варианте осуществления изобретения несмысловая и/или неправильная смысловая мутация(и) нуклеотидной последовательности, кодирующей любой из экзонов SlARF9, более предпочтительно на участках, кодирующих указанные выше домены белка (ДНК-связывающий домен, MR, домен димеризации III и/или домен димеризации IV) или схожий домен варианта белка SlARF9, т.е. домен, содержащий по меньшей мере не менее 80, 90, 95, 98, 99% аминокислотной идентичности данного домена SEQ ID NO: 2).
В одном варианте осуществления изобретения представлена нуклеотидная последовательность slarf9, содержащая одну или несколько несмысловых мутаций и/или неправильных мутаций в экзоне 2-, экзоне 3-, экзоне 4-, экзоне 5-, экзоне 6- и/или экзоне 7-, кодирующем последовательность, а также растение, содержащее мутантный аллель и имеющее более крупные фрукты, чем растения, содержащие аллели только дикого типа (кодирующие функциональный белок SlARF9).
В определенном варианте осуществления изобретения представлены растения и части растения (плоды, семена и т.д.), содержащие мутантную потерю функции или сниженную функцию аллеля slarf9.
В одном варианте осуществления изобретения потеря функции или сниженная функция белка SlARF9 - это укороченный белок, т.е. фрагмент одного из белков SlARF9, определенных ранее (включая его варианты). В общем EMS (этилметансульфонат) индуцирует замены гуанин/цитозин аденином/тимином. В случае глютамин (Gln или Q, кодируемый нуклеотидами САА или CAG) или аргинин (Арг или R, кодируемый нуклеотидами CGA) кодон, замена цитозина в тимин может привести к введению в стоп-кодон в рамке считывания (например, CAA/CAG/CGA к TAA/TAG/TGA), в результате получая укороченный белок.
Также представляемые последовательности нуклеиновых кислот (геномная ДНК, кДНК, РНК), кодирующие белки SlARF9, такие как, например, SlARF9, представленный в SEQ ID NO: 2 или их вариантах, как указано выше (в том числе химерные или гибридные белки или мутировавшие белки или укороченные белки), или любом белке SlARF9 из других видов. В результате вырождения генетический код различных последовательностей нуклеиновых кислот может кодировать ту же аминокислотную последовательность. Любая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей белок SlARF9 (как определено выше, включая варианты) в данном документе называется SlARF9. Представленные последовательности нуклеиновых кислот включают условные, искусственные или синтетические последовательности нуклеиновых кислот. Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие SlARF9 представлены в SEQ ID NO: 1 (кДНК) и 3 (геномная последовательность томата сорта Moneymaker, в том числе нуклеотиды 2005-5879 представляют собой участок, кодирующий белок, с нитронами), а также в SEQ ID NO: 4 (геномная последовательность томата сорта Heinz 1706, в том числе нуклеотиды 1196-5869 представляют собой участок, кодирующий белок, с нитронами).
Известно, что, когда последовательности изображаются в качестве последовательности ДНК, а РНК называют, фактическая последовательность оснований молекулы РНК совпадает с той разницей, что тимин (Т) заменяет урацил (U).
Также представлены последовательности нуклеиновых кислот (геномная ДНК, кДНК, РНК), кодирующие мутировавшие белки SlARF9, т.е. белки со сниженной функцией или потерей функции белков SlARF9, как описано выше, а также растения и части растений, содержащие подобные мутантные последовательности. Например, последовательности нуклеиновой кислоты, состоящая из одной или нескольких смысловых и/или несмысловых мутаций в диком типе кодирующей последовательности SlARF9, передающей кодируемый белок, нефункциональный или с пониженной функцией в естественных условиях. Кроме того, представлены последовательности с другими мутациями, например сплайс-сайт мутанты, т.е. мутации в геномной последовательности slarf9, ведущей к аномальному сращиванию пре- 12 030460
мРНК и/или сдвига рамки мутации, и/или вставке (например, вставке транспозона) и/или удалению одной или нескольких нуклеиновых кислот.
В данном документе представлены две геномные последовательности S1ARF9 дикого типа, одна свежего томата сорта Moneymaker (SEQ ID NO: 3) и другие обработанного сорта Heinz 1706 (SEQ ID NO: 4). Как было указано, кодирующий участок идентичен, отличается только последний кодон, кодирующий гистидин в SEQ ID NO: 3 и сирин в SEQ ID NO: 4. Последовательности, кодирующие ДНК (без интронов), имеют идентичность последовательности 99,9%. Геномная кодирующая ДНК, включая интроны (нуклеотиды 2005-5879 SEQ ID NO: 3 и нуклеотиды 1196-5869 SEQ ID NO: 4) имеет идентичность последовательности 99,8%, так как в последовательностях интронов есть нуклеотидные различия. Промоторы генов (нуклеотиды 1-2004 SEQ ID NO: 3 и 1-1995 SEQ ID NO: 4) также имеют большую идентичность последовательности 98,7%.
Также включены варианты и фрагменты последовательностей нуклеиновой кислоты SlARF9, такие как последовательности нуклеиновых кислот с гибридизацией SlARF9 последовательностей нуклеиновых кислот, например, в SEQ ID NO: 1 или 3 (нуклеотиды 2005-5879), в жестких условиях гибридизации, как определено. Варианты последовательностей нуклеиновых кислот SlARF9 также включают последовательности нуклеиновых кислот, которые имеют идентичность последовательности SEQ ID NO: 1 или до SEQ ID NO: 3 (нуклеотиды 2005-5879) или до SEQ ID NO: 4 (нуклеотиды 1996-5869), по меньшей мере 60% или более, предпочтительно по меньшей мере 65, 70, 80, 85, 90, 95, 98, 99, 99% или более (как это определены Emboss "needle", используя параметры по умолчанию, т.е. пробел создания разрыва = 10, пробел расширения разрыва = 0,5, измеряемая матрица nwsgapdna). Как было описано, варианты также включают мутантные варианты slarf9. Понятно, что многие методы могут быть использованы для выявления, обобщения и выделения вариантов или фрагментов SlARF9 последовательностей нуклеиновых кислот, такие как гибридизация нуклеиновых кислот, PCR-технологии, анализ in silico и синтез нуклеиновых кислот и тому подобное. Варианты SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 (нуклеотиды 2005-5879) или SEQ ID NO: 4 (нуклеотиды 1996-5869) могут кодировать либо дикий тип функциональных белков SlARF9 (например, аллелей другого видового разнообразия томата или селекционных линий или диких присоединений или ортологов из других видов, чем томаты), либо они могут кодировать мутантные аллели со сниженной функцией или с потерей функции любого из них, как, например, подготовленных или определенных методами, такими как TILLING подход или EcoTILLING подход или другими способами.
Фрагменты включают части любых из вышеперечисленных последовательностей нуклеиновых кислот SlARF9 (или вариантов), которые могут, например, использоваться в качестве праймеров, или образцов, или конструкций подавления активности гена или для определения мутантных аллелей slarf9 (например, праймеров, используемых в TILLING подходе, например, праймеров SEQ ID NO: 15-22). Части могут быть смежными участками по меньшей мере около 10, 15, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 60, 100, 200, 300, 420, 450, 500, 600, 700, 800, 900 или более нуклеотидов в длину, либо кодирующей нити (смысловой нити) или комплементарной нити (антисмысловой нити). Также включены смысловые - антисмысловые конструкции таких фрагментов, способных образовывать двухспиральную РНК (либо со спейсерной областью между смысловым и антисмысловым фрагментом) при транскрибировании в клетку растения (см. сайленсинг гена). Таким образом, фрагменты последовательностей нуклеиновой кислоты SlARF9 включены, в результате чего фрагмент, по меньшей мере, около 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 100, 150, 200 300, 400, 420, 450, 500, 600, 700, 800, 900 нуклеотидов в длину составляет не менее 50, 60, 70, 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80, 90, 95, 98, 99% или более (100%) идентичности последовательности нуклеиновых кислот в другом фрагменте SlARF9 последовательности нуклеиновых кислот примерно такой же длины (как определено попарным выравниванием, используя Emboss "needle", параметры по умолчанию, т.е. пробел создания разрыва = 10, пробел расширения разрыва = 0,5, измеряемая матрица nwsgapdna).
Пары праймеров, которые могут быть использованы для PCR-амплификации транскриптов SlARF9 или slarf9 (мРНК или соответствующей кДНК или геномной ДНК) из растительных образцов ДНК тканей. Пары праймеров могут использоваться для определения и/или определения количества экспрессии SlARF9 или slarf9 (мРНК уровней) в ткани растения, например, в тканях плодов томата, например, для определения значительного сокращения эндрогенных уровней SlARF9 мРНК или наличия в геноме мутантного аллеля slarf9. Точно так же могут быть разработаны определенные специфические или вырожденные праймеры на основе SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 и используемые для усиления/определения вариантов аллелей SlARF9 (например, мутантные аллели slarf9) из/в других линиях томата, родственных видов дикого типа томата, либо других видов растения.
После того как ткань растения, содержащего конкретный мутантный аллель slarf9, был сформирован и/или определен (например, путем Тиллинг или EcoTILLING подходов), а также праймеров или образцов, специфичных для мутантного аллеля, может быть разработан, и также может быть разработан анализ, который обнаруживает присутствие и/или отсутствие мутантного аллеля в растении или части растения (с использованием аллеля конкретных анализов обнаружения). Молекулярные маркерные анализы для обнаружения и/или передачи (например, с помощью MAS, вспомогательной маркерной селекции) мутантного аллеля, могут получить развитие. Например, может быть разработан анализ SNP обна- 13 030460
ружения или CAPS маркер, который определяет наличие мутанта slarf9 нуклеиновой кислоты в ДНК растений и/или который может быть использован для передачи аллеля в другие растения.
В одном варианте осуществления изобретения представлен мутант последовательностей нуклеиновой кислоты slarf9, согласно которому последовательность нуклеиновой кислоты slarf9 состоит из одной или нескольких мутаций, приводящих либо к потере функции или снижению функции мутанта белка SlARF9. Этот аспект изобретения будет описан более подробно в данном документе далее.
Растения также могут быть определены или получены (например, с помощью гомологичной рекомбинации или вставки, удаления или замены одного или нескольких нуклеотидов и т.д.), которые имеют одну или несколько мутаций на регуляторном участке(ах) SlARF9, например, промоторе, в котором экспрессия генов SlARF9, т.е. уровни мРНК (SEQ ID NO: 1 или варианты) значительно сокращаются в растении по сравнению с диким типом и растение имет более крупные плоды, чем растение дикого типа, содержащее регуляторный участок дикого типа (например, промотор).
Участок промотора SlARF9 описан в нуклеотиды 1-2004 SEQ ID NO: 3 и нуклеотидах 1-1995 в SEQ ID NO: 4. Две данные последовательности промотора имеют идентичность последовательности 98,7%. Промотор SlARF9 томата дикого типа проявляет активность ранних стадиях развития плода (в перикарпие, семяпочках, плаценте опыленных завязей), в пазушных меристемах, кончиках корня, зародышевых боковых корнях. SEQ ID NO: 3 и 4 включают два ауксин-отвечающих элемента (AuxRE) на участке промотора, на позициях 612-617 (TGTCNC) и 1224-1229 (TGTCTN) SEQ ID NO: 3 и на позиции 612-617 (TGTCNC) и 1229-1234 ((TGTCTN) SEQ ID NO: 4. Кроме того, SEQ ID NO: 3 включает четыре элемента NTBBF1ARROLB (АСТТТА, в позициях 888-893, 1541-1546, 1824-1829 и 1831-1836), в то время как SEQ ID NO: 4 включает всего три таких элемента (в позициях 888-839, 1815-1820, 1824-1829 и 1822-1827). Данные cis-действующие регулирующие элементы могут приводить к регуляции транскрипции другими ARF и/или белками, подобными Dof. Мутации данных элементов могут снижать производство транскрипта SlARF9, ведущего к росту более крупных плодов на растениях. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения представлены растения, части растений или ткани, имеющие одну или несколько мутаций на эндогенном (дикого типа) участке промотора SlARF9, в частности в одном или нескольких AuxRE и/или элементах NTBBF1ARROLB, в которых данные растения имеют более крупные плоды. Подобные растения можно получить, например, с помощью TILLING подход. В частности, в данном документе указаны мутации (транзиции и трансверсии) в G в AuxRE и/или С в элементе(ах) NTBBF1ARROLB. Растения, включающие мутации в промоторе SlARF9, в которых активность промотора значительно снижена, по меньшей мере, во время раннего развития плода, в которых растение производит более крупные плоды можно определить с помощью, например, TILLING подхода или другими известными методами.
"Промотор SlARF9" согласно настоящему изобретению - это промотор, включающий по меньшей мере 90, 95, 98, 99 или 100% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты к нуклеотидам 12004 SEQ ID NO: 3 или нуклеотиды 1-1995 SEQ ID NO: 4 (используя программу попарного выравнивания Needle с настройками по умолчанию). Согласно настоящему изобретению в естественных условиях такой промотор ведет экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты SlARF9 или вариант (например, дикий тип SlARF9 или мутантный ген slarf9). В данном документе указаны мутантные промоторы SlARF9 (и содержащие их растения).
В данном документе также указаны химерные гены и векторы, содержащие промотор SlARF9, и трансгенные растения, содержащие промотор SlARF9, функционально связанный с белком, кодирующим нуклеиновую кислоту или ген сайленсинга конструкта (смысловая и/или антисмысловая последовательность). Промотор может использоваться для экспрессии химерных генов в развивающихся плодах. Активные фрагменты по меньшей мере 2000, 1700, 1600, 1500, 1200, 100, 800, 600, 500, 400, 300 нуклеотидов (полученных, например, путем удаления промотора на 5'-конце) промотора SlARF9 могут также подходить для предпочтительной экспрессии плода.
Последовательность нуклеиновой кислоты SlARF9, описанной выше, или ее фрагменты, в частности последовательности ДНК, кодирующие белки SlARF9 данного изобретения (или их варианты) могут быть вставлены в векторы экспрессии (в подавляющих подходах) или в векторы сайленсинга гена для получения растений с более крупными плодами.
В одном из вариантов осуществления изобретения экспрессия гена SlARF9 подавлена в клеткереципиенте, растении или конкретной ткани(ях), например, подходами RNAi, как это описано далее.
В другом варианте осуществления изобретения представлены растения, содержащие один или несколько мутантных аллелей slarf9, в которых мутация(и) дает более крупные плоды на растениях, по сравнению с растениями, у которых отсутствует мутантный аллель(и). Мутантные аллели предпочтительно полученные путем мутагенеза растений или семян, а также выявлением тех растений или семен, которые содержат одну или несколько мутаций в мишени аллеля(ий) SlARF9 и в которых мутация приводит к отмене транскрипции мРНК и/или трансляции (чтобы производство белка SlARF9 сократилось или прекратилось), или в трансляции мутантного аллеля slarf9, транслированные в белок SlARF9 со сниженной или потерей функции. Снижении или отмена функционального белка SlARF9 дикого типа, по меньшей мере, в ткани плода (предпочтительно, по меньшей мере, на раннем этапе развития плода), дает
- 14 030460
возможность получить значительно более крупные плоды на растении или семенах. В одном варианте осуществления изобретения растение имеет два эндогенных мутантных аллеля slarf9, т.е. является гомозиготным для slarf9. Такое растение можно получить с помощью самовоспроизводства растения с одним мутантным аллелем slarf9. Также представлены плоды и семена с по меньшей мере одним или двумя мутантными аллелями slarf9 в их геноме, у которых плоды значительно крупнее по сравнению с растениями, имеющими аллели дикого типа SlARF9 (кодирующими функциональный белок SlARF9).
В другом варианте осуществления изобретения предоставлены праймеры PCR и/или образцы и комплекты для обнаружения ДНК S1PP2C1 последовательности SlARF9 или slarf9. Вырожденные или пары праймеров PCR для амплификации ДНК SlARF9 или slarf9 из образцов могут быть синтезированы на основе SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 или 4, как известно, в уровне техники (см. Dieffenbach и Dveksler (1995) праймер PCR: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, and McPherson at al. (2000) PCR-Basics: From Background to Bench, First Edition, Springer Verlag, Germany). Кроме того, фрагменты ДНК SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 (или их варианты) могут быть использованы в качестве образцов гибридизации. Комплект обнаружения SlARF9 или slarf9 может состоять либо из SlARF9 и/или специфических праймеров slarf9 и/или специфических образцов slarf9, а также связанного протокола при использовании праймеров и образцов для обнаружения SlARF9 и/или slarf9ДНК в исследуемой пробе. Такой комплект обнаружения может, например, быть использован для определения того, было ли растение преобразовано с помощью гена SlARF9 (или его части) изобретения или включает в себя растение одну или несколько мутантных аллелей slarf9. В результате вырождения генетического кода некоторые аминокислоты кодонов могут быть заменены другими без изменения аминокислотной последовательности белка.
В другом варианте осуществления изобретения представлены антитела, которые специфически связываются с белком SlARF9 или мутантным белком SlARF9, согласно настоящему изобретению. В частности моноклональные или поликлональные антитела, которые связываются с SlARF9 или с фрагментами или их вариантами (например, мутантные белки), описаны в данном документе. Антитела могут быть получены с помощью белка SlARF9 согласно изобретению в качестве антигена в животных с использованием методов, известных в уровне техники, как, например, описанные в Harlow and Lane "Using Antibodies: A laboratory manual" (New York: Cold Spring Harbor Press 1998) и в Liddell and Cryer "A Practical Guide to Monoclonal Antibodies" (Wiley and Sons, 1991). Антитела могут быть впоследствии использованы для выделения, идентификации, определения свойств или очищения белка SlARF9, с которым он связывается, например, для обнаружения белка SlARF9 в исследуемой пробе, что позволяет формировать иммунокомплексы и обнаруживать присутствия иммунокомплексов, например, путем ELISA (иммуноферментного твердофазного анализа) или анализа иммуноблота. Кроме того, предоставлены иммунологические комплекты, полезные для определения белков SlARF9, белковых фрагментов или эпитопов в исследуемой пробе. Исследуемыми пробами могут быть клетки, клеточные супернатанты, суспензии клеток, тканей и т. д. Такой комплект включает в себя, по меньшей мере, антитело, которое специфически связывается с белком SlARF9 и один или несколько реагентов иммунодетекции. Антитела могут также быть использованы для выделения/выявления других белков SlARF9, например, с помощью ELISA или Western blotting.
Понятно, что многие методы могут быть использованы для выявления, обобщения и выделения вариантов или фрагментов последовательностей нуклеиновых кислот SlARF9 или slarf9, такие как гибридизация нуклеиновых кислот, PCR-технологии, анализ in silico и синтез нуклеиновых кислот и тому подобное. Таким образом, последовательность кодирования белка SlARF9 нуклеиновой кислоты может быть последовательностью, которая химически синтезирована или которая клонирована из любых видов растений.
Трансгенные растения с более крупными плодами.
В данном документе представлены трансгенные растения, семена и части растений, в которых приглушен SlARF9, предпочтительно, по меньшей мере, в ткани листа, которые имеют более крупные плоды по сравнению с диким типом (нетрансгенных) контрольных растений или других контрольных растений (например, пустых трансформированных клеток вектора) в результате сайленсинга гена SlARF9.
В одном варианте осуществления изобретения гомологичная или гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты используется для приглушения эндогенного гена(ов) SlARF9 видареципиента, который должен быть преобразован. Например, ген томата SlARF9 (или вариант или его фрагмент) может быть использован, чтобы приглушить экспрессию гена SlARF9 в трансгенных растениях томата, баклажана или арбуза. Кроме того, может быть использована гомологичная последовательность нуклеиновой кислоты SlARF9. Например, последовательность происходящих из конкретных видов растений (например, из томатов) будет восстановлена в указанных виды (томата). Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения ДНК SlARF9 соответствует, или является модификацией/вариантом, эндогенной ДНК SlARF9 видов, которые используются в качестве рецептивных видов в трансформации. Таким образом, кДНК SlARF9 томата или геномная ДНК (или вариант или ее фрагмент) предпочтительно используется для трансформации растений томата. Кроме того (для регуляторного одобрения и общественного принятия причин), гомологичная или гетерологичная последовательности
- 15 030460
нуклеиновых кислот могут быть функционально связаны с транскрипцией регуляторной последовательности, особенно промотора, который также происходит от вида растения или даже из того же растения, которое будет трансформировано. Например, может использоваться промотор S1ARF9, как описано выше.
Для создания растений, содержащих химерный ген, который в результате приводит к приглушению экспрессии эндогенного гена S1ARF9 или семейства генов, могут быть использованы методы, известные в уровне техники.
"Сайленсинг генов" относится к понижающей регуляции или полному подавлению экспрессии генов одного или нескольких генов-мишеней, например генов S1ARF9 в клетки-реципиенте или ткани. Понятно, что в любых преобразовательных экспериментах определенная степень изменения фенотипа трансформированных клеток видна, как правило, из-за позиции воздействия на геном и/или по количеству копий. Как правило, "слабый" и "сильный" сайленсинг генов растений отличается здесь (все из которых являются случаями реализации изобретения), в котором "слабый" сайленсинг гена (РНКинтерференция) относится к растениям или части растений, в которых эндогенная экспрессия генамишени снижается примерно на 15, 20 или 30% по сравнению с контрольной тканью и "сильный" сайленсинг генов (РНК-интерференция) относится к растениям или части растений, в которых ген эндогенной экспрессии гена-мишени снижен не менее чем на 50, 60, 70, 80, 90% или более по сравнению с контрольной тканью (например, диким видом). Сайленсинг может быть определен количественно, например, подсчитывая уровень транскрипта гена-мишени (например, с помощью количественного RT-PCR) и/или определяя и выборочно подсчитывая энзимную активность белка-мишени и/или оценивая и выборочно подсчитывая полученный фенотип (более крупные плоды).
Не ограничивая масштабы изобретения, растения, имеющие оптимальный уровень сайленсинга, могут быть выбраны так, чтобы в результате растения имели значительно более крупные плоды в климатических условиях, к которым они подвергаются в период развития плода, имея минимальные отрицательные побочные эффекты, такие как снижение урожайности и т. д. по сравнению с контрольной группой. Предпочтительно, в урожайность значительно возросла в приглушенных растениях SlARF9.
Применение ингибиторных РНК для сокращения или упразднения экспрессии генов хорошо известно в уровне техники и является предметом нескольких рецензий (например, Baulcombe 1996, Plant Cell 8(2):179-188; Depicker and Van Montagu, 1997, Curr. Opin. Cell Biol. 9(3): 373-82). Есть целый ряд доступных технологий для достижения сайленсинга генов в растениях, таких как химерные гены, которые производят антисмысловую РНК во всех или части гена-мишени (см., например, ЕР 0140308 В1, ЕР 0240208 В1 и ЕР 0223399 В1), которые производят или чувствительную РНК гена-мишени (также известную как "совместное подавление"), см. ЕР 0465572 В1.
Наиболее успешным подходом до сих пор является производство как смысловых и антисмысловых РНК гена-мишени ("инвертированные повторы"), который является двухцепочной РНК (дсРНК) или стволовым циклом структуры (петля РНК, вмRNA) в клетке и приглушает ген-мишень(и) при транскрипции из вышестоящего промотора. Методы и векторы дсРНК и вмРНК производства и сайленсинга генов были описаны в ЕР 1068311, ЕР 983370 А1, ЕР 1042462 А1, ЕР 1071762 А1 и ЕР 1080208 А1.
Химернный ген для трансформации растений может, таким образом, включать транскрипцию регуляторного участка, который активен в клетках растений, функционально связанных со смысловым и/или антисмысловым фрагментом ДНК (или полной последовательностью нуклеиновой кислоты), или комплиментарного или по существу аналогичного гена-мишени SLARF9 или семьи генов.
Обычно короткие (смысловые и антисмысловые) фрагменты секвенирования последовательности гена-мишени, такие как 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26 нуклеотиды, кодирующие и/или не кодирующие последовательности гена-мишени достаточны. Более длинные последовательности также могут быть использованы, например по крайней мере около 50, 100, 200, 250, 300, 400, 420, 450, 500, 1000 или более нуклеотидов. Даже с ДНК, соответствующими или комплиментарными, полный транскрипт РНК или мРНК может быть использован, чтобы создать смысловые и/или антисмысловые конструкции. Желательно, чтобы смысловые и антисмысловые фрагменты/последовательностей, разделены спейсером последовательности, такие как интрон, который образует петлю (или шпильку) на формирование дсРНК.
В принципе, любой ген SlARF9 или семейство гена может стать мишенью. Например, одна или несколько определенных аллелей SlARF9 может быть приглушена выбором участка нуклеиновой кислоты их первичных или мРНК транскриптов, специфичных для этих аллелей (см. Byzova et al. Plant 2004 218: 379-387 для специфического сайленсинга аллелей органичным определенным образом). Кроме того, вся семья гена может стать мишенью для сайленсинга, выбрав один или более закрепленных участков для создания конструкта сайленсинга. Как упоминалось выше, участок ДНК, используемый в смысловой и/или антисмысловой ориентации, не должны быть частью кодирующего участка, но также может соответствовать или дополнять части первичного транскрипта (включая 5' и 3' нетранслируемую последовательности и интроны; первичный транскрипт SlARF9 томата сорта Moneymaker, как указано в SEQ ID NO: 3, из нуклеотидов 1551-6323, кодирующий участок, присутствующий в нуклеотиде 2005-5879) или в частях транскрипта мРНК (где любые интроны были удалены и полиА окончание было добавлено). Известно, что в последовательности ДНК, которая соответствует последовательности РНК U, заменяется на
- 16 030460
Т. Также отмечено, что в химерном гене, который преобразовывает дсРНК или bmRNA мишени, способном к сайленсингу экспрессии генов S1ARF9 на транскрипцию в клетке-реципиенте, смысловые и антисмысловые участки не должны быть одинаковой длины и один участок может быть больше, чем другие.
Таким образом, например, SEQ ID NO: 1 или их варианты, как описано выше, или фрагменты любого из них, или геномная последовательность или первичная последовательность транскрипта SEQ ID NO: 3 или 4, может быть использована для создания сайленсинга гена S1ARF9 и вектора и трансгенного растения, в которых один или несколько генов S1ARF9 приглушены во всех или некоторых тканях или органах (предпочтительно, по меньшей мере, в развивающихся плодах), или по индукции (см., например, Wielopolska et al. Plant Biotechnol J. 2005 6:583-90). Пример вектора сайленсинга гена приведен в примерах, при этом инвертированный повтор фрагмента 420 bp среднего участка (MR) кодирующей части SEQ ID NO: 1 использовалась для приглушения эндогенного SlARF9 в томате с помощью конститутивной экспрессии под контролем промотора CaMV 35S.
Удобный способ создания шпильки конструкта заключается в использовании общих векторов, таких как pHANNIBAL, pHELLSGATE, pSTARGATE векторы на основе технологии the Gateway® (см. Wesley et al. 2004, Methods Mol. Biol. 265:117-30; Wesley et al. 2003, Methods Mol. Biol. 236:273-86 и Helliwell & Waterhouse 2003, Methods 30(4):289-95), указаны здесь в качестве ссылки. См. также http://www.pi.csiro.au/rnai/ других генных сайленсингов векторов, таких, как индуцируемый сайленсинг векторов и векторы для сайленсинга из нескольких генов-мишеней и программы MatchPoint, которая может быть использована, чтобы найти лучшую последовательность, чтобы использовать для сайленсинга гена-мишени.
При выборе консервативных последовательностей нуклеиновых кислот все члены семейства генов SlARF9 в растении-реципиенте могут быть приглушены. Сайленсинг всех представителей семейства растения-реципиента является конкретным случаем реализации.
В одном варианте осуществления изобретения промотор, который функционально связан со смысловой и/или антисмысловой последовательностью нуклеиновой кислотой (чтобы создать химерный сайленсинг/РНК-интерференции генов), выбирается из конститутивного промотора, индуцируемого промотора (например, химически индуцируемого и т.д.), гормона индуцируемого промотора (например, ауксин индуцируемого) конкретного промотора плода или промотора, регулируемого развитием (например, активного в период развития плода). Кроме того, промотор гена SlARF9 сам по себе может быть использован для подходов сайленсинга, т.е. как указано выше, промотор SlARF9. Дополнительно 3'UTR может быть функционально связан с 3' терминальным химерным геном, так что функционально взаимосвязанные элементы ДНК, включают промотор - SlARF9 RNAu ген - 3'UTR.
Предпочтительные конститутивные промоторы включают в себя сильные конститутивные промоторы 35S или усиленные промоторы 35S ("35S промоторы") мозаичного вируса цветной капусты (CaMV) изолированных СМ 1841 (Gardner et al., 1981, Nucleic Acids Research 9, 2871-2887), CabbB-S (Franck et al., 1980, Cell 21, 285-294) и CabbB-CO (Hull and Howell, 1987, Virology 86,482-493), 35S промотор, описанный Odell et al. (1985, Nature 313, 810-812) или в US 5164316, промоторах семейства убиквитина (например, убиквитин промотор Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18,675-689, EP 0342926, см. также Cornejo et al. 1993, Plant Mol. Biol. 23, 567-581), gos2 промотор (de Pater et al., 1992 Plant J. 2, 834-844), emu промотор (Last et al., 1990, Theor. Appl. Genet. 81,581-588), арабидопсис промоторы актина, таких как промотор, описаннный An et al. (1996, Plant J. 10, 107), рисовые промоторы актина, такие как промотор, описанный Zhang et al. (1991, The Plant Cell 3, 1155-1165) и промотор, описанный в US 5641876 или рисовый промотор 2 актина, как описано в WO 070067, промоторы мозаичного венозного вируса маниоки (WO 97/48819, Verdaguer et al. 1998, Plant Mol. Biol. 37, 1055-1067), pPLEX виды промоторов из подземного останавливающего развитие вируса клевера (WO 96/06932, в частности промотор S7), промотор алкогольдегидрогеназы, например, pAdh1S (регистрационные номера GenBank X04049, Х00581), a TR1 "промотор и промотор TR2" ("TR1 промотор" и "TR2 промотор" соответственно), которые управляют экспрессией 1 и 2 гена соответственно, Т-ДНК (Velten et al., 1984, EMBO J. 3, 2723-2730), промотор мозаичного вируса норичника, описанного в US 6051753 и ЕР 426641, промоторы генов гистонов, таких как Ph4a748 промотор из арабидопсиса (РМВ 8: 179-191) или другие.
В противном случае, может быть использован промотор, который не является конститутивным, а специфичным для одной или нескольких тканей и органов растений (ткань предпочтительная/ткань специфичная, в том числе промоторы, регулируемые развитием). Например, промотор, активный в ткани плода и/или в период развития плода. Например, может использоваться промотор SlARF9 или его активный фрагмент. В противном случае, может использоваться промотор TPTP-F1, который представляет собой завязь и специфический молодой плод. 200, supra) или другие.
Квалифицированный специалист может легко проверить различные промоторы на их специфику и целесообразность в методике согласно данному изобретению. Кроме того, специфика промотора может быть изменена путем удаления, добавления или замены части последовательности промотора. Такое изменение промоторов может быть функционально связано с генами-репортерами для проверки их пространственно-временной активности в трансгенных растениях.
Другая альтернатива - использование промотора, экспрессия которого индуцируема. Примеры ин- 17 030460
дуцируемых промоторов - химически индуцируемые промоторы, такие как дексаметазон, как описано Aoyama и Chua (1997, Plant Journal 11: 605-612) и в US6063985 или тетрациклин (TOPFREE или ТОР 10 промотор, Gatz, 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89-108 и Love et al. 2000, Plant J. 21:579-88).
По желанию, промотор-SlARF9 гена RNAu может дополнительно содержать 3-терминальную регуляцию транскрипции сигналов ("3' терминальная или 3' UTR") (т.е. формирование транскрипта и сигналы полиаденилирования). Сигналы полиаденилирования и транскрипта образования сигналов включают нопалин ген синтазы ("3' nos") (Depicker et al., 1982 J. Molec. Appl. Genetics 1, 561-573.), Октопин ген синтазы ("3'ocs") (Gielen et al., 1984, EMBO J. 3, 835-845) и Т-ДНК ген 7 ("3' ген 7") (Velten and Schell, 1985, Nucleic Acids Research 13, 6981-6998), которые действуют как 3'-нетранслируемые последовательности ДНК в трансформированных клетках растений и т.д. Кроме того, может использоваться 3'-конец гена SlARF9, т.е. последовательность, включающая или состоящая из нуклеотидов 5880-6323 SEQ ID NO: 3.
Химерный ген сайленсинга SlARF9 (т.е. промотор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая при транскрипции в растительной клетке способна к сайленсингу эндогенной экспрессии генов SlARF9) может быть включен обычным образом в ядерном геноме одной клетки растения, и так трансформированная растительная клетка может быть использована обычным способом для получения трансформированного растения, которое имеет измененный фенотип из-за сайленсинга SlARF91 в определенных клетках в определенное время. В этой связи Т-ДНК вектор, включающий промотор, функционально связанный со смысловой и/или антисмысловой последовательностью SlARF9 (и, возможно 3'UTR), может быть введен в Agrobacterium tumefaciens и использован для трансформации растительных клеток, а затем трансформированное растение может быть восстановлено из трансформированных клеток растений с использованием процедур, описанных, например, в ЕР 0116718, ЕР 0270822, РСТ публикации WO 84/02913 и опубликовано в заявке на европейский патент ЕР 0242246 и в et al. (1991, Plant Physiol. 95, 426-434). Конструкция Т-ДНК вектора для Agrobacterium, опосредованной растительной трансформацией, хорошо известна в уровне техники. Т-ДНК вектор может быть либо бинарным вектором, как это описано в ЕР 0120561 и ЕР 0120515 или совместно интегрированным вектором, который можно интегрировать в Agrobacterium Ti-плазмиду гомологичной рекомбинации, как описано в ЕР 0116718.
Предпочтительные векторы Т-ДНК содержат промотор, функционально связанный с сайленсингом гена SlARF9 между Т-ДНК пограничной последовательности, или, по меньшей мере, расположен слева от правой пограничной последовательности. Пограничная последовательность описана в Gielen et al. (1984, EMBO J. 3, 835-845). Конечно, другие виды векторов могут быть использованы для трансформации растительной клетки, используя процедуры, такие как прямой перенос генов (как это описано, например, в ЕР 0223247), опосредованная пыльцой трансформация (как это описано, например, в ЕР 0270356 и WO 85/01856), трансформация протопластов, как, например, описанный в US 4684611, растительный РНК вирус-опосредованной трансформации (как это описано, например, в ЕР 0067553 и US 4407956), липосомо-опосредованной трансформации (как описаны, например, в US 4536475), и другие методы, такие как те описанные методы для трансформации некоторых линий кукурузы (например, US 6140553; Fromm et al., 1990, Bio/Technology 8, 833-839; Gordon-Kamm et al., 1990, The Plant Cell 2, 603618) и рис (himamoto et al., 1989, Nature 338, 274-276; Datta et al. 1990, Bio/Technology 8, 736-740) и метод трансформации однодольных (РСТ публикация WO 92/09696). Трансформация хлопка описана в WO 00/71733, а трансформация риса и методы - WO 92/09696, WO 94/00977 и WO 95/06722. Трансформация сорго орписана, например, у Jeoung J.M. et al. 2002, Hereditas 137: 20-8 или Zhao Z.Y. et al. 2000, Plant Mol. Biol. 44:789-98). Трансформация томата или табака описана также в An G. et al., 1986, Plant Physiol. 81: 301-305; Horsch R.B. et al., 1988, In: Plant Molecular Biology Manual A5, Dordrecht, Netherlands, Kluwer Academic Publishers, стр. 1-9; Koornneef M. et al., 1986, In: Nevins D.J. and R.A. Jones, eds. Tomato Biotechnology, New York, NY, USA, Alan R. Liss, Inc. стр. 169-178).Трансформация картофеля описана, например, Sherman и Bevan (1988, Plant Cell Rep. 7: 13-16). Трансформация томатов и регенерация может осуществляться по De Jong et al. (2008) Plant Journal 57:160-170 и Sun et al. (2006) Plant Cell Physiol. 47: 426-431.
Кроме того, селекция и регенерация трансформированных растений из трансформированных клеток хорошо известны в уровне техники. Очевидно, что для разных видов и даже разных сортов или сортов одного вида протоколы специально приспособлены для регенерации трансформированных клеток на высоких частотах.
Кроме того, трансформация ядерного генома, а также трансформация пластидного генома, предпочтительно генома хлоропластов, включены в изобретение. Одно из преимуществ пластидной трансформации генома в том, что риск распространения трансгена(ов) может быть уменьшен. Пластидная трансформация генома может быть осуществлена, как известно в уровне техники, см., например, Sidorov V.A. et al. 1999, Plant J. 19: 209-216 или Lutz K.A. et al. 2004, Plant J. 37(6):906-13.
Любое растение может быть подходящим реципиентом, например однодольные или двудольные растения, но наиболее предпочтительно растения, которые выиграют от того, что имеют более крупные
- 18 030460
плоды, такие как, но не ограничиваясь ими: томат, перец, огурец, баклажан, дыня, арбуз, тыква, виноград и многие другие, например, кукуруза, пшеница, рис, сорго, подсолнечник, плодовые деревья, клубника, цитрусовые, фасоль, горох, соя и т.д. В общем, в данном документе в качестве хозяина указан любой вид цветущего растения, производящего съедобные плоды (в ботаническом смысле) из завязей. Наиболее предпочтительны виды с мясистыми плодами (плоды с мясисым перикарпием).
Предпочтительные реципиенты из семейства пасленовых, например виды рода Solanum, например томат (С. Lycopersicum), томатное дерево (С. betaceum, syn. Cyphomandra betaceae) и другие виды Solanum, такие как баклажан (Solanum melongena), пепино (S. muricatum), cocona (S. sessiliflorum) и naranjilla (S. quitoense). Семейство пасленовых также включает перцы (Capsicum annuum, Capsicum Frutescens).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения реципиент - семейство Solanaceae или Cucurbitaceae. В предпочтительном варианте осуществления изобретения реципиент - род Solanum. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения реципиент - вид S. lycopersicum. Желательно, чтобы реципиент - культивируемый томат вида S. lycopersicum, т.е. линия или разнообразие, приносящее высокие урожаи, таких как плоды, по крайней мере, 50 г среднего веса или более, например по крайней мере 80, 90, 100, 200, 300 или даже до 600 г (томаты мясистого типа). Кроме того, маленькие виды, такие как томаты черри или коктейльные томаты охватываются, как и наполненные мякотью томаты, такие как Nunhems разнообразие Intense, например, с нехваткой геля в семенной камере. Растениереципиент томата может быть определено или неопределено различными размерами и формами плодов, такими как тип Roma, тип гроздь, круглый тип. Это может быть переработанный типа томата или свежий рыночный тип. Также в данном документе охватываются как открыто-опыляющиеся растения, так и гибриды. В одном варианте осуществления изобретения растение томата - это гибрид растения F1, выращенного из гибридных семян F1. Для того чтобы создать гибридные семена F1 трансгенного растения согласно данному изобретению, могут быть созданы две инбредные родительские линии, каждая из которых содержит копии трансгена в геноме. Когда эти растения перекрестно опылялись, семена F1 были собраны, они производят трансгенные гибридные растения F1 с высокой урожайностью и крупными плодами благодаря трансгену.
Варианты, описанные в данном документе для "реципиента" растения, также относятся к нетрансгенным мутантным растениям, описанным здесь, в которых вместо трансгенов мутантный аллель slarf9 присутствует в геноме эндогенно.
Другие подходящие реципиенты других видов овощей и различных видов сочных фруктов (виноград, персики, сливы, клубники, манго, папайя и др.). Также Cucurbitaceae, например дыня (Citrullus lanatus, Cucumis Melo) и огурец (Cucumis sativus), тыква и кабачок (Cucurbita) являются подходящими реципиентами. Точно также Rosaceae являются подходящими реципиентами, например яблоки, груши, сливы и т. д.
Также согласно настоящему изобретению представлены полевые культуры с более крупными (сайленсингом SlARF9 или мутацией slarf9) или мелкими плодами (в ботаническом смысле). Например, маис/кукуруза (вида Zea, например, Z. mays, Z. diploperennis (chapule), Zea luxurians (Guatemalan teosinte), Zea mays subsp. huehuetenangensis (San Antonio Huista teosinte), Z. mays subsp. mexicana (Mexican teosinte), Z. mays subsp. parviglumis (Balsas teosinte), Z. perennis (perennial teosinte) и Z. ramosa), пшеница (Triticum species), ячмень (например, Hordeum vulgare), овес (например, Avena sativa), сорго (Sorghum bicolor), рожь (Secale cereale), соя (Glycine spp, например, G. max), хлопок (Gossypium species, например, G. hirsutum, G. barbadense), Brassica spp. (например, В. napus, В. juncea, В. oleracea, В. rapa, etc), рис (Oryza species, например, сортовая группа О. sativa indica или сортовая группа japonica), просо американское (Pennisetum spp. например, P. glaucum).
В принципе, любой вид растений сельскохозяйственных культур подходит. Хлебные злаки или культивируемые растения относятся к видам растений, которые культивируются и разводятся людьми и исключает сорняки, такие как Arabidopsis thaliana или дикие родственные формы, такие как томатные родственные формы и другие (хотя мутантные аллели slarf9 могут быть получены из таких растений и перенесены в культивируемые растения методами разведения, см. дальше). Культурное растение может быть выращено для пищевых целей (например, овощные культуры и полевые культуры), или для декоративных целей. Культурные растения, как определено здесь,- это также растения, из которых непродовольственные товары получают, такие как масло для топлива, пластиковые полимеры, фармацевтическую продукцию, пробки, волокна и тому подобное.
Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения трансгенные растения, включающие регуляторный элемент транскрипции (в частности, промотор, как описано выше), функционально связаны с молекулой нуклеиновой кислоты, которая при транскрипции способна заставить приглушить экспрессию эндогенного гена SlARF9 в клетках реципиента.
Конструкция химерных генов и векторов, желательно стабильное, введение сайленсинга гена SlARF9 в геном клетки-реципиента, как правило, известны в уровне техники. Для создания химерного гена смысловая и/или антисмысловая последовательность SlARF9 функционально связана с промотором, подходящим для экспрессии в клетке-реципиенте, используя стандартные методы молекулярной биоло- 19 030460
гии. Промотор, возможно, уже может присутствовать в векторе так, чтобы нуклеиновая последовательность просто вставляется в вектор на выходе из последовательности промотора. Вектор затем используют для трансформации клеток реципиента и химерного гена, вживляют в ядерный геном или в пластид, митохондриальный геном или геном хлоропластов, и выражается там с помощью подходящего промотора (например, Mc Bride et al., 1995 Bio/Technology 13, 362; US 5,693, 507).
Полученное трансформированное растение может быть использовано в обычной схеме селекции для получения более трансформированных растений с теми же характеристиками или ввести часть гена в другие разновидности одного и того же или родственных видов растений. Может быть выбрано "элитное событие", это трансформация с трансгеном, вставленным в определенном месте в геноме, что приводит к хорошей экспрессии желаемого фенотипа (например, оптимальному сайленсингу и более крупным плодам).
Трансгенные растения или их части, в которых приглушен SlARF9, имеют более крупные плоды, предпочтительно со значительно большим количеством клеток и/или клеточных слоев и/или значительно меньшим количеством клеток в ткани перикарпия. Значительно более крупные плоды (как описано выше) относятся в данном документе к большей средней массе плода и/или (дополнительно) диаметру плода и/или объему плода по сравнению с контрольными растениями. Массу плода можно, например, сравнивать в конце фазы роста плода, когда плод вырос до своего конечного размера. Диаметр легко измеряется у круглых плодов, у плодов другой формы - сложнее. Объем плода легко определить, например, измерив объем жидкости (например, воды) в контейнере, перемещенном плодами, либо другими методами.
Известно, что, когда мутантные растения анализируются на их фенотип, контрольные растения предпочтительно находятся около изогенных линий мутанта, который включает в себя дикий тип аллеля(ей).
В конце концов, полевые испытания используются, чтобы показать, что трансформированные клетки (или мутантные растения описаны ниже), имеют значительно более крупные плоды по сравнению с растениями дикого вида.
Как уже упоминалось, могут быть выбраны трансформированные клетки с оптимальным уровнем сайленсинга, например путем анализа количества копий (Саузерн-Блоттинг), транскриптных уровней мРНК (например, RT-PCR с использованием пары праймеров SlARF9), либо путем анализа наличия и/или уровня белков SlARF9 в различных тканях (например, SDS-PAGE, ELISA анализы и т.д.). Оптимальные трансгенные линии затем используются для дальнейшего получения пересечения/обратного скрещивания/самоопыления до высокой исполнительской элитной линии со стабильным трансгеном.
Трансформированные клетки, выражающие один или несколько генов SlARF9 (или гены сайленсинга) согласно данному изобретению, могут также содержать другие трансгены, такие как гены с засухоустойчивостью или с устойчивостью к биотическим или абиотическим стрессам, гербицидам и т.д. Для получения таких растений с "уложенными" трансгенами, другие трансгены могут быть либо интрогрессированы в трансформированные клетки SlARF9, либо трансформированные клетки могут быть преобразованы в дальнейшем с одним или несколькими другими генами, или же несколько химерных генов могут использоваться для преобразования растительной линии или разновидности. Например, несколько химерных генов могут присутствовать на одном векторе или на различных совместно трансформированных векторах. Кроме того, в растение могут вводится несколько химерных генов (см., например, Yu et al. 2007, PNAS 104: 8924-9 и Houben and Schubert 2007, Plant Cell 19: 2323-2327).
Целые растения, семена, клетки, ткани и потомства (такие как, семена F1, F2/растения и т.п.) любого из трансформированных растений, описанных выше, представлены в данном документе и могут быть идентифицированы наличием трансгенов в ДНК, например, PCR-анализом. Кроме того, могут быть разработаны "специфические линии" PCR диагностических методов, где PCR праймеры основаны на фланкирующей ДНК растения вставленного химерного гена, см. US 6563026. Подобным образом могут быть разработаны конкретные линии AFLP пептидной карты или RFLP пептидные карты, которые определяют трансгенное растение или любое растение, семена, ткани или клетки, полученные из них.
Известно, что трансгенные растения согласно данному изобретению не показывают нежелаемый фенотипы, такие как снижение качества плодов, меньше плодов на растении, усиленная восприимчивость к болезням и нежелательным структурным изменениям (карликовость, деформация) и т.д., и что, если такие фенотипы проявляются в первичных трансформированных клетках, они могут быть удалены обычным методом для разведения и селекции (скрещивание/обратное скрещивание/самоопыления и т.д.). Любое из трансгенных растений, описанных в данном документе, может быть гомозиготным или гемизиготных для трансгена.
Нетрансгенные растения с более крупными плодами и методов их получения.
Случаем реализации данного изобретения также является использование нетрансгенных методов, например систем поколения мутантов-мишеней поколения и идентификации, таких как TILLING подход (Targeting Induced Local Lesions IN Genomics; McCallum et al., 2000, Nat. Biotech. 18:455, и McCallum et al. 2000, Plant Physiol. 123, 439-442, Henikoff et al. 2004, Plant Physiol. 135: 630-636 включены в данный документ по ссылке) и селекция для получения растительных линий, которые включают по меньшей мере одну мутацию в эндогенном аллеле SlARF9 и в котором растения, составляющие мутантный аллель
- 20 030460
s1arf9 в гетерозиготных или гомозиготных формах, имеют значительно более крупные плоды по сравнению с растениями с нехваткой мутантного аллеля (с аллелем дикого вида(ов) в локусе SlARF9). Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения, растения, содержащие один или несколько мутантных аллелей s1arf9 в геноме и значительно более крупные плоды по сравнению с растениями с отсутствующим указанным мутантным аллелем (ями), но включающие аллели дикого вида вместо этого, представлены в настоящем документе, а также части растений (например, собранные плоды, собранные листья и т.д.), семена, клональное разведение таких растений, потомство таких растений, составляющих мутантный аллель.
"Плоды большего размера" в данном документе относится к значительно большему размеру плода (в среднем), по сравнению с подходящими контрольными растениями (например, растениями дикого типа), т.е. средний экваториальный диаметр и/или средний объем и/или средняя масса свежего плода значительно больше, чем у контрольных растений. Размер плода предпочтительно определяется в конце фазы роста плода, либо после нее (т.е. у плода, достигшего конечного размера). Например, размером плода томата по меньшей мере около 5, 8, 10, 15, 20 или большим количеством плодов на растении можно определить путем измерения средней сырой массы плода в конце фазы роста (например, молочная стадия) и/или измерения среднего экваториального диаметра, а также путем сравнения объемов с контрольными растениями (плоды растений, включающих аллели SlARF9 дикого типа в их геноме). Растения, имеющие значительно более крупные плоды, производят, например, плоды со средней массой, по меньшей мере, около 105, 110, 115, 120, 130, 140, 150% или больше от контрольных плодов. Дополнительно или в противном случае средний экваториальный диаметр составляет по меньшей мере около 105, 110, 115, 120% или более от экваториального диаметра контрольных плодов.
Кроме того, количество клеток и/или клеточных слоев в ткани перикарпия значительно возросло и/или размер клетки значительно меньше по сравнению с контрольными растениями (например, плоды дикого типа), как описано в другом документе.
Без ограничения настоящего изобретения считается, что плоды растений, включающих мутантные аллели slarf9, кодирующие белок SlARF9 с нефункциональной или сниженной функцией, значительно более крупные и имеют большее количество клеток, благодаря ускоренной фазе клеточного деления развития плода (т.е. в период фазы клеточного деления развития плода, например, в томате в первые 10-14 дней после оплодотворения).
Предпочтительно, растения с более крупными плодами, как описано выше, являются гомозиготными для мутантного аллеля slarf9, несмотря на то что гомозиготные растения могут также производить более крупные плоды. Для создания растений, включающих мутантный аллель в гомозиготной форме, самоопыление может быть использовано, при необходимости в сочетании с генотипированием (определяя наличие мутантного аллеля, например, PCR методом с использованием специфических праймеров аллеля и/или последовательности). Если TILLING подход используется мутантными растениями (M1) предпочтительно самоопыленные один или несколько раз для создания, например, М2 популяции или, предпочтительно, M3 или М4 популяции для фенотипа. В популяциях М2 мутантный аллель находится в соотношении 1 (гомозиготный для мутантного аллеля): к 2 (гетерозиготный для мутантного аллеля): 1 (гомозиготный для аллеля дикого типа). Сегрегация размера плодов должна коррелировать с сегрегацией мутантного аллеля.
Растение, включающее мутантный аллель slarf9, или его вариант, со значительно более крупными плодами может быть любого вида, как томатная последовательность, указанная в настоящем документе, может быть использована для создания и определения растений, включающих мутации в гомологах и ортологах гена, как описано ниже. Эндогенный вариант SlARF9 последовательности нуклеиновой кислоты в растении может быть идентифицирован, который затем может быть использован в качестве целевого гена в поколении и/или идентификации растений, включающих вариант SlARF9 мутантного аллеля. Таким образом, мутантное растение (т.е. растение, включающее мутантный аллель slarf9) может быть двудольного и однодольного вида. Предпочтительно, растение - это культурное растение, хотя это также случай реализации для определения мутантных аллелей в диких растениях или некультурных растениях и передачи этих методов путем селекции в культурные растения.
В одном варианте осуществления изобретения растение, содержащее по меньшей мере один мутантный аллель slarf9 (в гомозиготной или гетерозиготной форме) и имеющее значительно более крупные плоды, относится к семейству Solanaceae, т.е. охватывающий рода Solanum, Capsicum, Nicotiana и другие или Cucurbitaceae (включающее виды Cucumis, такие как дыня и огурец). В другом варианте осуществления изобретения растения рода Solanum, например охватывающие культивированные томаты, картофель, баклажаны и другие.
В особом случае варианта осуществления изобретения растение из вида S. lycopersicum. Любой Lycopersicum С. может быть создан и/или определен по меньшей мере одним мутантным аллелем slarf9 в своем геноме и в результате может производить более крупные плоды. Растение томата может, таким образом, быть любым культивируемым томатом любого коммерческие сорта, любой линии разведения или иначе, это может быть определенным или неопределенным, открыто опыляющимся или гибридом, производящим плоды любого цвета, формы и размера. Мутантный аллель, генерируемый и/или опреде- 21 030460
ленный, в частности, в растении томатов, или относительно совместим для скрещивания томата, может быть легко перенесен в любое другое растение томата путем разведения (скрещивание с растением, включающим мутантный аллель, а затем выбрав потомство, включающим мутантный аллель).
Растение может быть любого вида семейства Solanaceae или рода Solanum, вид которого либо мутировавший для генерирования мутантного аллеля (например, TILLING подход или другие методы) или в котором одна или несколько физических или спонтанных мутаций в гене slarf9 (или вариант) определены, например, Ecotilling подходом.
Также в варианте осуществления изобретения использование нуклеазы "цинковые пальцы" для создания мутаций в эндогенных генах SlARF9, как описано в Townsend et al. 2009, Nature 459: 442-445 и Shukla et al. 2009, Nature 459: 437-441.
Мутантный аллель, представленный в одном варианте осуществления изобретения, генерирован или определен в культурных растениях, но также может быть получен и/или определен в диких растениях или некультивируемых растениях, а затем перенесен в культурные растения с использованием, например, скрещивания и селекции (возможно использование межвидовых скрещиваний, например, со спасением зародыша для переноса мутантного аллеля). Таким образом, мутантный аллель slarf9 может быть генерирован (человечески-индуцированная мутация, использующая методы мутагенеза, чтобы мутагенезировать ген-мишень slarf9 или его вариант) и/или определен (спонтанный или природный вариант аллеля) в другие виды Solanum, включающие, например, дикие родственные виды томата, такие как S. cheesmanii, S. chilense, S. habrochaites (L. hirsutum), S. chmielewskii, S. Lycopersicum, S. peruvianum, S. glandulosum, S. hirsutum, S. minutum, S. parviflorum, S. pennellii, S. peruvianum, S. peruvianum var. humifusumand S. pimpinellifolium, и затем перенесен с помощью традиционных техник разведения в культурное растение Solanum, например Solanum lycopersicum. Термин "традиционные методы разведения" охватывает здесь скрещивание, самоопыление, селекцию, двойную гаплоидную производительность, спасение зародыша, слияния протопластов, перенос через мост вида и т.д., как известно селекционеру, т.е. методы, отличающиеся от генетической модификации, с помощью которой аллели могут быть перенесены.
Предпочтительно, мутация(ии) в аллеле slarf9 приводит к получению более крупных плодов на растении, по сравнению с растениями, у которых отсутствует мутантный аллель(и) (т.е. которые включают дикий тип аллеля SlARF9), как описано выше.
Без ограничения настоящего изобретения мутации в SlARF9(SEQ ID NO: 1 или ее варианты, либо в соответствующей геномной последовательности, например, геномная последовательность SEQ ID NO: 3 нуклеотиды 2005-5879 и SEQ ID NO: 4 нуклеотидов 1196-5869 или их вариантов), в результате сниженной функциональности или потери функции белка SlARF9, например, посредством одной базовой транзиции(ий), неправильных смысловых или несмысловых мутаций, или вставки или удаления одной или нескольких аминокислот или сдвига рамки в кодирующей последовательности, которая, в свою очередь, приводит к измененному фенотипу. Наличие и тип мутации(ий) могут быть проанализированы с помощью секвенирования генов с использованием SlARF9 и/или специфические праймеров slarf9. "Значительное сокращение" функциональности белка SlARF9, предпочтительно, определяется косвенно в естественных условиях фенотипом (т. е. значительно более крупными плодами) в гетерозиготных растениях или, предпочтительно, гомозиготных для мутантного аллеля. Фенотип большего размера плода выделяется вместе с мутантным аллелем.
В одном варианте осуществления изобретения представлено растение (предпочтительно растение томата), в состав которого входят одна или несколько мутаций в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 (нуклеотиды 2005-5879) или SEQ ID NO: 4 (нуклеотиды 1196-5869), или в соответствующую последовательность нуклеиновой кислоты, включающей по меньшей мере около 60, 62, 65, 70, 80, 90, 95, 97, 97.5, 98, 98.5, 99% или более идентичности последовательности любой из этих последовательностей (как указано), при этом мутация в кодируемом белке SlARF9 (или варианте) имеет сниженную активность (по сравнению с функциональным белком дикого типа) или активность в естественных условиях, при этом растение производит значительно более крупные плоды, по сравнению с растением (предпочтительно томатом), содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует дикий тип, функциональный белок SlARF9 (или вариант).
В одном варианте осуществления изобретения растения (предпочтительно растение томата) представлено, в состав которого входят одна или несколько мутаций в нуклеотидной последовательности, кодирующей белок SEQ ID NO: 2, или белок, включающий по меньшей мере 53, 54, 55, 58, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99% или более идентичности последовательности SEQ ID NO: 2 (как определено), и где (томат) растение имеет значительно более крупные плоды по сравнению с (томатом) растением с отсутствующей одной или несколькими указанными мутациями.
В одном варианте осуществления изобретения представлены растения с более крупными плодами (предпочтительно томат), включающие мутантный аллель slarf9, отличающийся тем, что мутации с потерей функции или сниженной функцией мутации закодированного белка SlARF9, указанный белок - это белок, включающий по меньшей мере 53, 54, 55, 58, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99% или более идентичности последовательности аминокислоты SEQ ID NO: 2.
- 22 030460
Растение (например, томат), предпочтительно гомозиготное для мутантного аллеля SLARF9.
С одной стороны представлено растение Solanum lycopersicum, включающее мутантный аллель slarf9 в своем геноме, в частности, аллель с одной или несколькими одноточечными мутациями, в любом экзоне SEQ ID NO: 3 (или ее вариантах), в частности в экзоне 2 и/или экзоне 7. С одной стороны, мутация в кодоне последовательности одной из следующих аминокислот: аминокислота 52, 191 и/или 193 SEQ ID NO: 2. Растения томата, включающие мутантный аллель slarf9 и производящие более крупные плоды, у которых мутантный аллель включает одну или несколько следующих мутаций, являются вариантом осуществления настоящего изобретения (обозначая первую аминокислоту в белке дикого типа SlARF9, который преобразуется в другую аминокислоту в мутанте на позиции, указанной в нижнем индексе): Gly52^Ser52, Arg191^Trp191 или His193^Tyr193. С одной стороны, мутация в последовательности, кодирующей консервативный домен белка SlARF9, в частности, в связывающем домене ДНК b3, т.е. аминокислоты 74-236 SEQ ID NO: 2 или их вариант. С одной стороны, растения томата, включающие мутантный аллель slarf9, получаемый из семян, обозначенных NCIMB 41827, 41828, 41829, 41839 и/или 41831 (или из растений, полученных из таких семян или потомства этих растений) представлены в данном документе, при этом плоды томата значительно крупнее плодов томата с аллелями дикого типа SlARF9 в локусе SlARF9.
В другом варианте осуществления изобретения растением, включающим эндогенный мутантный аллель slarf9, является арбуз, производящий более крупные плоды по сравнению с арбузом, включающим аллель дикого типа SlARF9. В еще одном варианте осуществления изобретения растение представляет собой огурец, дыня или перец.
Мутантные растения можно отличить от немутантов молекулярными методами, такими как мутация(и), присутствующие в геномной ДНК slarf9 или РНК (кДНК), уровнях белка SlARF9 и/или активности белка, и т. д., а также измененные фенотипические характеристики по сравнению с диким типом. Мутантный аллель может быть перенесен в другие растения, которые являются совместимыми для размножения с мутантным растением, используя традиционное скрещивание и селекцию. Таким образом, мутантный аллель может быть использован для создания томата любого вида с крупными плодами, например видовое разнообразие открытого опыления, гибридные сорта, гибриды F1, вид Roma, вид cherry, определенный или неопределенный виды и т.д. В одном варианте осуществления изобретения растение (предпочтительно С. Lycopersicum), содержащий мутантный аллель slarf9 и более крупные плоды, это гибрид растения F1 или семена F1, из которых выращивается растение F1 гибрид. Для получения гибрида F оба инбредных родителя включают один и тот же мутантный аллель slarf9 в своем геноме в гомозиготной форме.
В другом варианте осуществления изобретения растение, включающее мутантный аллель slarf9 (например, томат), скрещивают с другим растением того же вида или близкородственных видов для создания гибридного растения (гибридных семян), содержащего мутантный аллель slarf9. Такое гибридное растение также является вариантом осуществления изобретения. Также представлен метод переноса мутантного аллеля slarf9 на другое растение, включая предоставленное растение с мутантным аллелем slarf9 в своем геноме, в котором мутантный аллель способствует получению более крупных плодов (как описано выше), скрещивая указанное растение с другим растением и получая семена указанного скрещивания. Выборочно, растения, полученные из этих семян, могут дополнительно самоопыляться и/или скрещиваться, и выбирается такое потомство, которое имеет в составе мутантный аллель и более крупные плоды, благодаря присутствию мутантного аллеля по сравнению с растениями, включающими аллель SlARF9 дикого типа.
В одном варианте осуществления изобретения оба родители, чтобы получить гибрид F1, включают различные мутантные аллели slarf9 в гомозиготной форме, так что гибрид состоит из двух различных мутантных аллелей slarf9. Например, родитель 1 может включать потерею функции мутанта, в то время как родитель 2 включает сниженную функцию мутанта. Гибрид F1 затем содержит один аллель каждого родителя. Таким образом, здесь также представлены растения томатов, состоящие из двух различных мутантных аллелей slarf9 в локусе SlARF9 и имеющие более крупные С одной стороны, мутантный аллель, получаемый из семян, обозначенных NCIMB 41827, 41828, 41829, 41839 и/или 41831 (или растений, полученных из таких семян или потомства данных растений), могут быть гомозиготными в растении или могут сочетаться с аллелем дикого типа или с другим мутантным аллелем slarf9, например любыми аллелями, получаемых из семян, обозначенных NCIMB 41827, 41828, 41829, 41839 и/или 41831 (или из растений, полученных из таких семян или потомства этих растений). Таким образом, растение томата, включающее аллель, кодирующий мутацию Gly52 Ser52, могут сочетаться с аллелем Arg191
Trp191 или His193 Trp193. Подобным образом, мутантные аллели, кодирующие Arg191 Trp191 и His193
Trp193, могут сочетаться в одном растении. Также мутантный аллель сплайс-сайт, получаемый из семян и имеющий номер доступа NCIMB 41827, может быть гомозиготным или гетерозиготным, а также сочетаться с аллелем дикого типа SlARF9 или с другим мутантным аллелем slarf9, таким как аллель, кодирующий мутацию Gly52 Ser52, Arg191 Trp191 или His193 Tyr193, получаемый из семян, обозначенных
NCIMB 41828, 41829, 41839 и/или 41831 (или растений, полученных из таких семян или потомства дан- 23 030460
ных растений).
Растения, содержащие мутантный аллель slarf9, кодирующий потерю функции или снижение функции белка (например, укороченный белок в результате несмысловой мутации белка, белок с измененной последовательностью аминокислоты, в результате чего, например, изменяется каталитический участок, видоизмененное сворачивание и т.д., например, из-за неправильной смысловой мутации, мутации сдвига рамки и/или мутации участков сплайсинга), могут быть получены и/или определены с помощью методов мутагенеза или путем скрининга природных популяций для природных вариантов в аллеле slarf9. В одном варианте осуществления изобретения TILLING подход используется для создания таких растений и/или определения такого мутагенеза, индуцирующего мутации, и/или EcoTILLING подход используется для определения растений, таких как дикие растения или некультивируемые растения, включая естественные (спонтанные) мутации в генах slarf9, которые затем могут быть переданы в культивируемые растения традиционными методами селекции. Тем не менее, в данном документе представлен любой другой способ мутагенеза может быть использован, и понимается, что оба индуцированных человеком мутанта, UV или рентгеновский мутагенез, химические мутагены и т.д., и спонтанные мутанты гена slarf9, генерируемые в или переносимые в культивируемые растения или сельскохозяйственные культуры традиционной селекцией. Также нацеленный мутагенез, использующий, например, эндонуклеазу "цинковые пальцы", может использоваться для мутации эндогенного гена SlARF9, а также для получения аллелей slarf9, кодирующих снижение или потерю функции белков SlARF9 или мутации эндогенного промотора SlARF9, что ведет к снижению или отсутствию белка SlARF9, полученного, по меньшей мере, в период развития плода.
В особом варианте осуществления изобретения согласно настоящему изобретению мутантное растение (т.е. растение, включающее мутантный аллель slarf9 - это растение другого вида, чем томат, например однодольное культурное растение, предпочтительно рис, кукуруза, пшеница или ячмень, включающее мутантный аллель slarf9 в своем геноме, такое как арбуз, дыня, огурец, перец, тыква крупноплодная, тыква обыкновенная, земляника, фирма яблоко, персик, вишня, слива, виноград, лимон, апельсин, груша, малина, смородина, брусника и т.д. При использовании таких методов, как TILLING подход, усиление фрагмента гена-мишени может быть основано на SEQ ID NO: 1, или их фрагментах (например, с использованием специфических или вырожденных праймеров, например, разработанных на основе одного или нескольких консервативных доменов SlARF9), илиодин может сначала изолировать ортолог SlARF9 и состав базового праймера на ортологичной последовательности. Праймеры для усиления фрагмента гена-мишени могут также основываться на последовательнастях интронов или последовательностях границы интрона-экзона. Например, когда исследуется мутация в крупном экзоне, экзон может усиливаться с помощью двух реакций PCR и двух пар праймеров, при этом один или несколько праймеров могут находиться в последовательностях интрона, фланкирующих экзон. Следовательно, пары праймеров могут также основываться на геномной последовательности SlARF9, такой как описана в SEQ ID nO: 3 (особенно нуклеотиды в диапазоне с 1977 по 5940 или с 2005 по 5879) и SEQ ID NO: 4 (особенно нуклеотиды в диапазоне с 1950 по 5909 или с 1996 по 5869).
TILLING подход (ориентация индуцированных локальных повреждений в геномах) - это общий обратный генетический метод, который использует традиционные методы химического мутагенеза для создания библиотек мутировавших единиц, которые затем подвергаются высокому пропускному скринингу для обнаружения мутаций. TILLING подход сочетает химический мутагенез с мутацией скриннинга групп продуктов PCR, что приводит к изоляции неправильных смысловых и несмысловых мутантных аллелей генов-мишеней. Таким образом, TILLING подход использует традиционный химический мутагенез (например, мутагенез EMS или MNU) или другие методы мутагенеза (например, излучения, такие как UVUV), а затем скрининг с высокой пропускной способностью для мутаций в определенных генахмишенях, таких как SlARF9, согласно данному изобретению. S1 нуклеазы, такие как CEL1 или ENDO1, используются для расщепления гетеродуплексов мутантного и дикого вида ДНК мишени и выявления расщепления продуктов с использованием, например, электрофореза, таких как LI-COR гелевой анализатор системы, см., например, Henikoff et al. Plant Physiology 2004, 135: 630-636. TILLING подход был применен во многих видах растений, таких как томат (см. http://tilling.ucdavis.edu/index.php/Tomato_Tilling), рис (Till et al. 2007, ВМС Plant Biol. 7: 19), арабидопсис (Till et al. 2006, Methods Mol. Biol. 323: 127-35), Brassica, кукуруза (Till et al. 2004, BMC Plant Biol. 4: 12), и т.д.. Также EcoTILLING подход, в котором мутанты в природных популяциях не обнаружены, широко используется, см. Till et al. 2006 (Nat. Protoc. 1: 2465-77) и Comai et al. 2004 (Plant J. 37: 778-86). В одном варианте осуществления изобретения в данном документе может использоваться классический TILLING подход модифицируется, и вместо использования энзима, основанного на мутантном определении (ферментативное переваривание с одноцепочечной специфической нуклеазой и высокоразрешающим электрофорезом в полиакриламидном геле), двух различных системах высокопропускного определения, которые раньше использовались только на людях. Эти протоколы обнаружения представляют собой адаптации КЧКЭ (конформации чувствительной капиллярного электрофореза, см. Rozycka et al. 2000, Genomics 70, 34-40) или HRM (High Resolution Melting, см. Clin. Chem. 49, 853-860). См. Gady et al. 2009, Plant Methods 5:13.
Таким образом, здесь представлены нетрансгенные растения, семена и ткани, содержащие мутант- 24 030460
ный аллель slarf9 в одной или нескольких тканях и в составе одного или нескольких фенотипов, предоставляемых сниженной функцией или потерей функции белка SlARF9, согласно данному изобретению (например, более крупные плоды, как описано выше) и методы для создания и/или выявления таких растений.
Также представлен способ для создания и/или выявления мутантного аллеля slarf9 подходит для растений, производящих более крупные плоды, и/или способ получения растения, дающего более крупные плоды, включающий следующие этапы:
(a) мутирование семян растений (например, с помощью мутагенеза EMS) для создания популяции M1 или предоставления мутировавших семян растений, или предоставления растений, включающих естественные вариации,
(b) выборочное самоопыление растений (а) один или несколько раз для создания М2, M3 или семейств М4,
(c) подготовление ДНК растений (а) или (b) и объединение ДНК отдельных особей или объединение образцов тканей отдельных особей и подготавления ДНК из объединенных образцов,
(d) PCR-амплификация всех или части гена-мишени SlARF9 (геномной или кДНК) или ее варианта из ДНК групп, пулов ДНК или ДНК объединенных образцов ткани,
(e) обнаружение присутствия мутировавшего аллеля(ей) slarf9 в продуктах PCR-амплификации и тем самым в пулах ДНК или в ДНК из объединенных образцов ткани,
(f) выбор соответствующих отдельных растений, имеющих мутантный аллель(и) slarf9,
(g) выборочное секвенсирование мутантного аллеля slarf9 растения;
(h) фенотипирование растений (f), или их потомства для получения более крупных плодов и
(i) выращивание растений с более крупными плодами по сравнению с контрольнвми растениями, а также
(j) разведение с растением (i) для создания культурных растений, производящих более крупные плоды и имеющих хорошие агрономические характеристики.
Между шагами (е) и (f) можно дополнительно провести анализ SIFT для определения того, какая мутация приведет к увеличению размера плодов растений.
На этапе (d) праймеры, которые усиливают все или часть гена-мишени SlARF9 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 или 4) или его варианта, разработаны с использованием стандартных методов, таких, как CODDLE (http://www.proweb.org/doddle). Праймеры могут быть разработаны для усиления, например, по меньшей мере около 50, 100, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 800 bp или по меньшей мере до 1000 bp или более гена-мишени, т.е. SEQ ID NO: 1, 3 или 4 или варианты SEQ ID NO: 1, 3 или 4. Предпочтительно фрагмент, содержащий весь или часть закрепленного домена белка SlARF9, усиливается праймером, например фрагмент кодирует весь или часть ДНК-связывающего домена, MR, домен димеризации III или домен димеризации IV.
Для видов растений, кроме томата, желательно сначала определить последовательность эндогенного гена SlARF9 для того, чтобы быть в состоянии проектировать хорошие последовательности праймеров. Последовательность может быть идентифицирована in silico или, например, разработана вырожденными PCR праймерами и усиливающими весь или часть варианта гена SlARF9 (ортолог гена SlARF9 томата) генома растений. Последовательность эндогенного гена SlARF9 затем, предпочтительно, использована для разработки подходящих праймеров для TILLING подхода.
Этап (е) может использовать нуклеазы S1, такие как CEL1 для обнаружения несоответствия между продуктом PCR амплификации, т.е. между диким типом SlARF9 PCR продукта и мутантом slarf9 PCR продукта, которые формируют гетеродуплексы. Кроме того, этап (е) может для обнаружения использовать CSCE или HRM. В CSCE формируются гомодуплексах (WT/WT или мутант/фрагменты мутанта) и гетеродуплексы (мутант/WT фрагменты). Из-за сформированного несоответствия гетеродуплексы мигрируют с другой скоростью, чем гомодуплексы через капилляры, что позволяет идентифицировать пулы, содержащие мутацию в пределах фрагмента-мишени. HRM также является неэнзимной технологией. В PCR-амплификации фрагменты гена-мишени LCgreen Plus+ TM молекулы включены между гибридизированной парой оснований двухцепочной молекулы ДНК, которые - когда найдены в молекуле - будут излучать флуоресценцию. LightScanner фиксирует интенсивность флуоресценции, в то время как пластинка постепенно нагревается. При определенной температуре продукты PCR начинают плавиться и выделяют LCgreen Plus+ TM, в которой флуоресценция уменьшается. Определены пулы ДНК, содержащие мутации (гетеродуплексы), так как их температура плавления ниже, чем у гомодуплексов.
Этап (j) может включать в себя традиционные методы разведения и фенотипические и/или маркерные методы селекции. Многие виды, которые включают один или несколько мутантных аллелей slarf9 и производят значительно более крупные плоды по сравнению с растениями, включающими один или несколько аллелей SlARF9 дикого типа, могут быть выведены таким образом.
Были опубликованы обширные протоколы для проведения TILLING подхода, см., например, http://blocks.fhcrc.org/%7Esteveh/TILLING_publications.html и Till et al. (2006) Nature Protocols 1:24652477; Till et al. (2006) Methods Mol. Biol. 323:127-135 и Till et al. (2003) Methods Mol. Biol. 236:205-220, все указаны в данном документе в ссылке.
- 25 030460
После того как растение, включающее мутантный аллель, который дает желаемый фенотип, был определен, этот аллель может быть передан другим растениям традиционными методами селекции, например, путем скрещивания растений с другим растением и сбором потомства скрещивания. На этапе (j) аллель, таким образом, может быть использован для создания растений, имеющих более крупные плоды, которые обеспечивают хорошие агрономические характеристики.
Как уже упоминалось, следует понимать, что другие методы мутагенеза и/или селекции могут также быть использованы для создания мутантных растений согласно данному изобретению. Семена могут быть, например, облучены или химически обработаны для получения мутантных популяций. Кроме того, прямое секвенирование гена slarf9 может быть использовано для скриннинга мутировавших растительных популяций для мутантных аллелей. Например, Keypoint скрининг - основанный на последовательности метода, который может быть использован для идентификации растений, включающих мутантные аллели slarf9 ((Rigola et al. PloS One, March 2009, том 4(3):е4761).
Таким образом, представлены нетрансгенные мутантные растения, которые производят более низкие уровни (функциональные) дикого вида белка SlARF9 в одной или нескольких тканях (в частности, по меньшей мере, в ткани плода), или которые полностью лишены функционального белка SlARF9 в определенных тканях, которые производят нефункциональный белок SlARF9 в некоторых тканях, например, в связи с мутациями в одном или нескольких эндогенных аллелях slarf9. Эти мутанты могут быть получены с помощью методов мутагенеза, таких как TILLING подход или его вариантов, или они могут быть определены EcoTILLING подходом или любым другим способом. Аллели Slarf9, кодирующие нефункциональные или со сниженной функциональностью белок SlARF9, могут быть выделены, упорядочены или перенесены на другие растения традиционными методами селекции.
Представлена любая часть растения или его потомства, в том числе включая собранные плоды, собранные ткани или органы, семена, пыльцу, цветы, завязи и т.д., включающие мутантный аллель slarf9 в геноме, согласно настоящему изобретению. Представлены все культуры клеток растения или культуры тканей растения, включающие в их геноме мутантный аллель slarf9. Предпочтительно, культуры клеток растения или культуры тканей растения могут быть регенерированы в целые растения, включающие геноме мутантный аллель slarf9 в своем геноме. В данном документе также указаны двойные гаплоидные растения (и семена, из которых можно вырастить гаплоидные растения), полученные путем удвоения хромосом гаплоидных клеток, включающих мутантный аллель slarf9, любые гибридные растения (а также семена, из которых можно вырастить гибридные растения), которые включают мутантный аллель slarf9 в своем геноме, при этом двойные гаплоидные растения и гибридные растения производят значительно более крупные плоды, согласно настоящему изобретению.
Также представлены комплекты для определения наличия или отсутствия в растении мутантного аллеля slarf9, согласно настоящему изобретению. Такой комплект может включать в себя PCR-праймеры и зонды выявления аллелей в образце ткани или ДНК или РНК, полученных из данной ткани.
Предпочтительно, мутантные растения также имеют другие хорошие агрономические характеристики, т. е. они не сократили количество плодов и/или качество плодоа по сравнению с растениями дикого вида. Предпочтительно, урожайность таких растений высока благодаря более крупным плодам. Также большее количество клеток и/или их меньший размер в ткани перикарпия приводит к более высокому содержанию твердого вещества (больше клеточных оболочек на грамм веса сырой ткани). Таким образом, содержание растворимого и нерастворимого твердого вещества выше. В предпочтительном варианте осуществления изобретения растение - растение томата и плод - плод томата, такой как обработанный томат, свежий рыночный томат любой формы, или размера, или цвета. Таким образом, представлены также собранные продукты растений или части растений, включающие один или два мутантных аллеля slarf9. Это включает в себя переработанные продукты, такие как томатная паста, кетчуп, томатный сок, разрезанные плоды томата, консервированные овощи, сухофрукты, очищенные фрукты и т.д. То же самое относится к другим видам растений. Продукты можно определить по наличию мутантного аллеля в их геномной ДНК.
Другие варианты использования согласно изобретению.
Согласно настоящему изобретению представлено использование последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок SlARF9 для модификации размера плодов растений. В предпочтительном варианте осуществления изобретения подобное использование включает изменение (увеличение или снижение) уровня функционального белка в растении или в определенных частях растения (например, по меньшей мере, в плодах).
В одном варианте осуществления изобретения представлено использование последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок SlARF9 для создания трансгенных или нетрансгенных растений с более крупными плодами, характеризующихся тем, что белок SlARF9 содержит по меньшей мере 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. В данном документе подобное использование включает любое использование, включающее растения, семена или растения или клетки растения аллелем slarf9 в геноме, согласно настоящему изоберетению, с целью получения или использования более крупных плодов.
Подобным образом представлено использование последовательности нуклеиновой кислоты, коди- 26 030460
рующей белок SlARF9 для увеличения размера плодов, при этом белок SlARF9 включает по меньшей мере 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичности последовательности аминокислоты SEQ ID NO: 2.
В одном случае в данном документе представлено использование растения или семян, включающих мутантный аллель slarf9 для получения плодов большего размера, при этом аллель slarf9 представляет собой аллель, который кодирует белок, включающий по меньшей мере 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичности последовательности аминокислоты SEQ ID NO: 2. В результате одной или нескольких указанных мутаций растение, включающее указанный мутантный аллель в своем геноме производит значительно более крупные плоды по сравнению с растением, включающим аллель SlARF9 дикого типа в своем геноме.
В другом случае в данном документе представлено использование клетки растения в искусственных условиях или культуры ткани, включающей мутантный аллель slarf9 для производства растений с более крупными плодами, при этом аллель slarf9 представляет собой аллель, который кодирует белок, включающий по меньшей мере 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичности последовательности аминокислоты SEQ ID NO: 2. Клетки растения или культура клеток может быть регенерирована в целое растение с использованием известных методов.
Подобным образом представлено использование плодов большего размера, включаюших в геноме мутантный аллель slarf9 для получения урожая, хранения, обработки или продажи, при этом аллель slarf9 представляет собой аллель, который кодирует белок, включающий по меньшей мере 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичности последовательности аминокислоты SEQ ID NO: 2.
Также в данном документе представлено использование последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок для производста трансгенных и нетрансгенных растений, которые производят более мелкие плоды. Экспрессия белка SlARF9 увеличина, как описано в другом месте данного документа, а белок SlARF9 это функциональный белок, который включает по меньшей мере 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичности последовательности аминокислоты SEQ ID NO: 2.
Растение, предпочтительно, рода Solanum, Capsicum или Cucumis. В одном варианте растение, предпочтительно, томат, перец, огурец или дыня.
В одном случае, мутантный аллель slarf9 представляет собой получаемые из растений, выращиваются из семян с номером доступа NCIMB 41827, 41828, 41829, 41830 или 41831.
Таким образом, в данном документе представлено применение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный аллель slarf9, для производства нетрансгенных растений с крупными плодами, а также в одном варианте мутантный аллель slarf9 представляет собой аллель, получаемый из вышеупомянутых семян.
Последовательности
SEQ ID NO 1: последовательность кДНК аллеля SlARF9 дикого типа из томата сорта Moneymaker.
SEQ ID NO 2: белковая последовательность белка SlARF9 дикого типа, кодируемого SEQ ID NO: 1. Аминокислоты 74-236 включают полученный из B3 связывающий домен ДНК. Аминокислоты 237-564 включают средний участок (MR). Аминокислоты 256-332 включают предполагаемая область ответа ауксина. Аминокислоты 565-602 включают домен димеризации III. Аминокислотные последовательности 609-651 включают домен димеризации IV.
SEQ ID NO 3: регион промотора (нуклеотиды 1-2004) и геномная ДНК дикого типа SlARF9 томата сорта Moneymaker. Начало транскрипции (мРНК) находится на нуклеотиде 1551, а конец транскрипции на 6323, стартовым кодоном трансляции является ATG на позиции 2005-2007, терминирующим кодоном является ТАА на позиции 5877-5879. Таким образом, 5' нетранслируемая область из основы с 1551 по 2004, а также 3'нетранслируемая область из основы с 5880 по 6323.
SEQ ID NO 4: регион промотора (нуклеотиды 1-1995) и геномная ДНК дикого типа SlARF9 томата сорта Heinz1706. Начало транскрипции (мРНК) находится на нуклеотиде 1543, а конец транскрипции на 6313, стартовым кодоном трансляции является ATG на позиции 1996-1998, терминирующим кодоном является ТАА на позиции 5867-5869. Таким образом 5' нетранслируемая область из основы с 1543 по 1995, а также 3'нетранслируемая область из основы с 5870 по 6313.
SEQ ID NO 5: праймер актина, прямой.
SEQ ID NO 6: праймер актина, обратный.
SEQ ID NO 7: праймер SlARF9, прямой, для обнаружения мРНК.
SEQ ID NO 8: праймер SlARF9, обратный, для обнаружения мРНК.
SEQ ID NO 9: праймер SlARF9, прямой, для амплификации кодирующей последовательности.
SEQ ID NO 10: праймер SlARF9, обратный, для амплификации кодирующей последовательности.
SEQ ID NO 11: праймер SlARF9, прямой, для амплификации фрагмента РНКи.
SEQ ID NO 12: праймер SlARF9, обратный, для амплификации фрагмента РНКи.
SEQ ID NO 13: промотор праймера SlARF9, прямой, для амплификации промотора.
SEQ ID NO 14: промотор праймера SlARF9, обратный, для амплификации промотора.
SEQ ID NO 15: прямой праймер для скрининга популяций растений для мутаций в экзоне 2.
SEQ ID NO 16: обратный праймер для скрининга популяций растения для мутаций в экзоне 2.
- 27 030460
SEQ ID NO 17: прямой праймер для скрининга популяций растений для мутаций в экзоне 2.
SEQ ID NO 18: обратный праймер для скрининга популяций растения для мутаций в экзоне 2.
SEQ ID NO 19: прямой праймер для скрининга популяций растения для мутаций в экзоне 6.
SEQ ID NO 20: обратный праймер для скрининга популяций растения для мутаций в экзоне 6.
SEQ ID NO 21: прямой праймер для скрининга популяций растения для мутаций в экзоне 7.
SEQ ID NO 22: обратный праймер для скрининга популяций растения для мутаций в экзоне 7. Условные обозначения чертежей
Фиг. 1 - относительные уровни мРНК SlARF9 в период завязывания плода.
(a) Уровень экспрессии SlARF9 количественной ПЦР в реальном времени, 1, 2 и 3 дня (дн.) после обработки, в плаценте вместе с овулярной тканью и стенке завязи. Тотальная РНК была изолирована в цветках с удаленными несозревшими пестиками (контрольные растения), в цветках с удаленными несозревшими пестиками, обработанных гиббереллиновой кислотой (GA3), цветках с удаленными несозревшими пестиками после ручного опыления (Pollinat.).
(b) Относительные уровни мРНК SlARF9 в завязях томата, собранных на семи различных стадиях развития цветка. На стадиях 1-4, размеры бутона соответствовали указанным. На стадии 4 представлен цветок на этапе удаления несозревшего пестика. На стадии 5 цветок полностью раскрывается (период цветения). Для 6 стадии цветки собирались на 3 день после цветения (DAA). Для 7 стадии цветки собирались на 3 день после опыления. Стандартные погрешности указаны (n = 2).
(c) Относительные уровни мРНК SlARF9 неопыленных завязей томата на стадии цветения и завязи, собранных спустя 3 дня после ручного опыления, разрезались на образцы завязи, плаценты и ткань стенок завязи. Стандартные погрешности указаны (n = 2).
(d) Относительные уровни мРНК SlARF9 в завязях цветков томата с удаленными несозревшими пестиками, собранных спустя 6 или 24 ч после обработки ауксином (IAA). Необработанные заязи использовались в качестве контрольной группы. Стандартные погрешности указаны (n = 2).
(e) Относительные уровни мРНК SlARF9 в молодых почках, неопыленных завязях и других частях цветка, собранных из цветков на стадии удаления несозревших пестиков, опыления завязей (3 дня после опыления), а также в гипоктиле и корнях 10-дневных всходов. Стандартные погрешности указаны (n = 2).
В каждой из вышуказанных фигур (а)-(е), высшее значение было установлено на равное 1; фиг. 2 - уровни мРНК SlARF9 в развивающихся трансгенных плодах дикого типа.
(a) Относительные уровни мРНК SlARF9 в завязях и плодах, собранных на линиях дикого типа и SlARF9-OE. Стандартные погрешности указаны (n = 2). Уровни дикого типа в плодах 3-4 мм (6 дней после опыления) были установлены на 1.
(b) Относительные уровни мРНК SlARF9 в завязях и плодах, собранных на линиях дикого типа и РНКи SlARF9. Стандартные погрешности указаны (n = 2). Уровни дикого типа в плодах 3-4 мм (6 дней после опыления) были установлены на 1;
фиг. 3 - фотографии плода томата растения S1ARF9-РНКи (слева) и контрольного растения дикого типа (справа);
фиг. 4 - микроснимок клеток перикарпия плода томата (10 дней после опыления) растения SlARF9РНКи (слева) и контрольного растения дикого типа (справа).
Следующие неограничивающие примеры описывают применение генов SlARF9 и slarf9 модификации фенотипов растения. Если не указано иное в примерах, все рекомбинантные ДНК технологии осуществляется согласно стандартным протоколам, как описано в Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, и Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; и в томах 1 и 2 Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Стандартные материалы и методы для молекулярной работы с растениями описаны в Plant Molecular Biology Labfax (1993) by R.D.D. Cray, совместно опубликованной ООО BIOS Scientific Publications (Великобритания) и Blackwell Scientific Publications (Великобритания).
Депонирование семян.
Репрезентативный образец семян пяти мутантов томата TILLING подхода согласно примеру 3 был отложен на хранение Nunhems B.V. 14 апреля 2011 года в NCIMB Ltd. (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn Aberdeen, Scotland AB21 9YA, UK), согласно Будапештскому договору, на основании экспертного решения (ЕРС 2000, Правило 32(1)). Семена были присвоены следующие депозитные номера: NCIMB 41827 (мутант 1719), NCIMB 41828 (мутант 2484), NCIMB 41829 (мутант 3175), NCIMB 41830 (мутант 6725) и NCIMB 41831 (мутант 6932).
По требованию зявителя образцы биологического материала и любого материала, полученного из него, могут передаваться уполномоченному эксперту в соответствии с Правилом 32(1) ЕРС или соответствующим законодательством стран или договорами с установленными требованиями и положениями, до тех пор пока упоминание выдачи патента, либо 20 лет с даты подачи заявления, если заявка была отклонена, отозвана или считалась отозванной.
SEQ ID NO: 1 - Solanum lycopersicum ARF9, кодирующая последовательность сорта Moneymaker
- 28 030460
atggcaacta taaatgggtg gtgttatgag tctcagccga atatgaattc tccaggtaaa aaagatgctc tgtatcatga gctatggcag ttgtgtgcag gtccagtagt tgatgttccc agggaaggag aaagagttta ttattttcct caaggccaca tggaacaatt ggtagcatca attaatcaag aaatggatca aagagttcca tcattcaatc tcaaatcaaa ggtcctttgt cgagttatca atagtcattt cctggctgaa gaagacaatg atgaggtcta tgtccagatc actttgatgc cagaggcacc acatgtaccc gagccgacta ctccggatcc attaattccg caggatgtaa agcctagatt ccattctttc tgcaaggtcc tgacagcctc cgatacaagc actcatggtg gattttctgt tctaaggaaa catgctaatg aatgccttcc tccattggac ttgaaccagc agactccgac ccaggaattg attgcgaaag accttcatga cgtggagtgg cgcttcaagc atatatttag aggccaacct cggagacatt tacttaccac agggtggagt acctttgttt cttcaaagaa attagtggca ggggattctt ttgtattctt gaggggtaat aatggacagc tgcgagttgg ggtcaaaagg cttgttcgcc agcagagctc aatgccgtca tcggtgatgt caagccagag catgcaccta ggagtcttgg ctacagcatc tcatgctgtt
acaacccaga caatgtttgt tgtttactac aaaccgagaa ccactcagtt catcgtaggc gtcaacaaat acttagaggc tcttaaacat gaatatgcag ttggcatgcg attcaaaatg cagtttgaag ccgaagggaa tcctgataga agatttatgg gcactatagt tggaattgat gatctttctt cacagtggaa aaattctgcg tggcgatcct tgaaggtccg atgggacgag cctgcagcca ttgcaaggcc tgacagagtt tctccttggg aaattaaacc ttatgtgtgt tcaattccaa atgtccttgt cccaccaacc gcagagaaga acaaaaggca tcggctacat agtgaaatca aaatatcaga acaaccttca tcctcaaatg cttcggcggt ttggaatcct tcccttcgat cgcctcagtt taacaccttt ggcatcaaca gcagtactaa ttgcgcatta gcgtctctta cagagagtgg ttggcagctt cctcatttaa atacttcagg tatgcttgtg gatgagccag aagacggtag gagtgctcca acttggtgtg gttttccatg cgttttggcc ccgcagttcg gtcaagggac taatcagccg attgttattc ctactgatgg gagaaaatgt gataccaaaa aaacctgtag attatttggt attgacttga aaagttcctc aattagcact actgaggcac gactacagct acagccagcc ggcatttctt gtgtctttgc agagagagca cctccaaaca cggtgcctgc tggtgattca gatcaaaagt ctgagctttc agtagacttc aaagatcaaa tgcaaggcca tttgcggtta cccctaaagg aggttcaaag caagcagagt tgttccacca ggtctcgcac aaaggtgcaa atgcaaggcg tagctgtagg tcgtgcagtg gatttaacca tattgaaagg atacgatgag cttacaaagg agcttgagga gatgtttgaa atccaaggag agcttcagtc acgacagaaa tgggggatct tgtttacaga tgatgaaggg gatacaatgc ttatgggtga ttatccgtgg caagactttt gcaatgtggt gaggaagatt ttcatttgtt caagtcagga tatgaaaaaa ttgaccctgt ctcgcgcaga ccattaa
SEQ ID NO: 2 - Solanum lycopersicum ARF9 белок сорта Moneymaker;
домен (74)...(236) производный В3 ДНК-связывающий домен;
домен (237)...(564) средний участок (MR);
домен (256)...(332) область ответа ауксина, часть среднего участка (MR);
DOMAIN (565)...(602) домен димеризации III;
DOMAIN(609)...(651) домен димеризации IV.
Met Ala Thr Ile Asn Gly Trp Cys Tyr Glu Ser Gln Pro Asn Met Asn
1 5 10 15
Ser Pro Gly Lys Lys Asp Ala Leu Tyr His Glu Leu Trp Gln Leu Cys
20 25 30
Ala Gly Pro Val Val Asp Val Pro Arg Glu Gly Glu Arg Val Tyr Tyr
35 L 10 45
Phe Pro Gln Gly His Met Glu Gln Leu Val Ala Ser Ile Asn Gln Glu
50 55 60
Met Asp Gln Arg Val Pro Ser Phe Asn Leu Lys Ser Lys Val Leu Cys
65 70 75 80
Arg Val Ile Asn Ser His Phe Leu Ala Glu Glu Asp Asn Asp Glu Val
- 29 030460
85 90 95
Tyr Val Gln 100 Ile Thr Leu 105 Met Pro 110 Glu Ala Pro His Val Pro Glu Pro
Thr Thr Pro Asp Pro Leu Ile Pro Gln Asp Val Lys Pro Arg Phe His
115 120 125
Ser Phe Cys Lys Val Leu Thr Ala Ser Asp Thr Ser Thr His Gly Gly
130 135 140
Phe Ser Val Leu Arg Lys His Ala Asn Glu Cys Leu Pro Pro Leu Asp
145 : 150 155 160
Leu Asn Gln Gln Thr Pro Thr Gln Glu Leu Ile Ala Lys Asp Leu His
165 170 175
Asp Val Glu Trp Arg Phe Lys His Ile Phe Arg Gly Gln Pro Arg Arg
180 185 190
His Leu Leu Thr Thr Gly Trp Ser Thr Phe Val Ser Ser Lys Lys Leu
195 200 205
Val Ala Gly Asp Ser Phe Val Phe Leu Arg Gly Asn Asn Gly Gln Leu
210 215 220
Arg Val Gly Val Lys Arg Leu Val Arg Gln Gln Ser Ser Met Pro Ser
225 : 230 235 240
Ser Val Met Ser Ser Gln Ser Met His Leu Gly Val Leu Ala Thr Ala
245 250 255
Ser His Ala Val Thr Thr Gln Thr Met Phe Val Val Tyr Tyr Lys Pro
260 265 270
Arg Thr Thr Gln Phe Ile Val Gly Val Asn Lys Tyr Leu Glu Ala Leu
275 280 285
Lys His Glu Tyr Ala Val Gly Met Arg Phe Lys Met Gln Phe Glu Ala
290 295 300
Glu Gly Asn Pro Asp Arg Arg Phe Met Gly Thr Ile Val Gly Ile Asp
305 : 310 315 320
Asp Leu Ser Ser Gln Trp Lys Asn Ser Ala Trp Arg Ser Leu Lys Val
325 330 335
Arg Trp Asp Glu Pro Ala Ala Ile Ala Arg Pro Asp Arg Val Ser Pro
3 40 3 45 350
Trp Glu Ile Lys Pro Tyr Val Cys Ser Ile Pro Asn Val Leu Val Pro
355 360 365
Pro Thr Ala Glu Lys Asn Lys Arg His Arg Leu His Ser Glu Ile Lys
370 375 380
Ile Ser Glu Gln Pro Ser Ser Ser Asn Ala Ser Ala Val Trp Asn Pro
385 : 390 395 400
Ser Leu Arg Ser Pro Gln Phe Asn Thr Phe Gly Ile Asn Ser Ser Thr
405 410 415
- 30 030460
Asn Cys Ala Leu Ala Ser Leu Thr 430 Glu Ser Gly Trp Gln Leu Pro His
420 425
Leu Asn Thr Ser Gly Met Leu Val Asp Glu Pro Glu Asp Gly Arg Ser
435 440 445
Ala Pro Thr Trp Cys Gly Phe Pro Cys Val Leu Ala Pro Gln Phe Gly
450 455 460
Gln Gly Thr Asn Gln Pro Ile Val Ile Pro Thr Asp Gly Arg Lys Cys
465 470 475 480
Asp Thr Lys Lys Thr Cys Arg Leu Phe Gly Ile Asp Leu Lys Ser Ser
485 490 495
Ser Ile Ser Thr Thr Glu Ala Arg Leu Gln Leu Gln Pro Ala Gly Ile
500 505 510
Ser Cys Val Phe Ala Glu Arg Ala Pro Pro Asn Thr Val Pro Ala Gly
515 520 525
Asp Ser Asp Gln Lys Ser Glu Leu Ser Val Asp Phe Lys Asp Gln Met
530 535 540
Gln Gly His Leu Arg Leu Pro Leu Lys Glu Val Gln Ser Lys Gln Ser
545 550 555 560
Cys Ser Thr Arg Ser Arg Thr Lys Val Gln Met Gln Gly Val Ala Val
565 570 575
Gly Arg Ala Val Asp Leu Thr Ile Leu Lys Gly Tyr Asp Glu Leu Thr
580 585 590
Lys Glu Leu Glu Glu Met Phe Glu Ile Gln Gly Glu Leu Gln Ser Arg
595 600 605
Gln Lys Trp Gly Ile Leu Phe Thr Asp Asp Glu Gly Asp Thr Met Leu
610 615 620
Met Gly Asp Tyr Pro Trp Gln Asp Phe Cys Asn Val Val Arg Lys Ile
625 630 635 640
Phe Ile Cys Ser Ser Gln Asp Met Lys Lys Leu Thr Leu Ser Arg Ala
645 650 655
Asp His
Примеры
Пример 1. Выделение и характеристика SlARF9.
1. 1. Материалы и методы.
1.1.1. Растительные материалы и условия роста.
Растения томатов (Solanum lycopersicum L. cv. Moneymaker) выращивались, как описано в de Jong et al. (2009, The Plant Journal 57, 160-170). Также культура в искусственных условиях была проведена согласно протоколу в de Jong et al. (2009, supra). Для анализа экспрессии SlARF9 в завязях, цветах были удалены несозревшие пестики 3 дня (дн.) до периода цветения. Ручное опыление или обработка гормонами проводились в период цветения. Экспрессия SlARF9 под влиянием ауксина исследовалась в завязях цветков, обработанных 2 мкл 1 мМ 4-C1-IAA (Sigma-Aldrich, http://www.sigmaaldrich.com) в 12% этанола. Обработка повториласт спустя 6 ч после первого нанесения. Контрольные растения были собраны в период цветения.
Для анализа экспрессии в трансгенных линиях была собрана ткань перикарпия из завязей и плодов, которые сформировались вторым поколением (Т2) линий SlARF9-OE lines (сверхэкспрессирующие линии), а также первым поколением (Т1) линий РНКи SlARF9. Все собранные ткани были заморожены в N2 и хранились при температуре -80°С до извлечения РНК.
1.1.2. Количественная ПЦР в реальном времени.
Тотальная РНК была извлечена из замороженных тканей растения томата с использованием NucleoSpin® набора растения РНК (Macherey-Nagel, http://www.macherey-nagel.com) и обработана RNasefree DNase I (Fermentas, http://www.fermentas.com). Тотальная РНК без ДНК (400 нг) использовалась в качестве матрицы для синтеза кДНК (набор синтеза кДНК template, Bio-Rad, http://www.bio-rad.com).
Для количественной ПНР в реальном времени 5 мкл 25-кратная растворенная ДНК использовались в 25 мкл реакции ПЦР, содержащей 400 нМ каждого праймера и 12,5 мкл iQTM SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Реакции ПЦР проводились в 96-well iCycler (Bio-Rad), с программой температуры, начинающейся с 3 мин при 95°С, затем 40 циклов по 15 с при 95°С и 45 с при 60°С. В конце температура плавления продукта должна определять специфику амплифицированного фрагмента.
Праймеры, использованные для количественной ПЦР в реальном времени, были разработаны с помощью компьютерной программы ((Beacon Designer 5.01, Premier Biosoft International,
- 31 030460
http://www.premierbiosoft.com), как указано ниже. Прямой праймер слактина
Обратный праймер слактина
5'-CCGTTCAGCAGTAGTGGTG-3' (SEQ ID NO: 6)
Прямой праймер SlARF9
Обратный праймер SlARF9
Пара праймера SlARF9 амплифицирует 146 фрагмент нуклеотида транскрипта мРНК SlARF9 (нуклеотиды 834-979 SEQ ID NO: 1).
1.1.3. Выделение геномных последовательностей SlARF9.
Для структурной характеристики SlARF9 несколько продуктов ПНР амплифицировали на геномном томате ДНК, изолированном из молодой ткани листа. Праймеры, полученные из кодирующей последовательности SlARF9 (Genbank номер доступа ВТ013639). Продукты ПНР были полностью уполрядочены и выравнены для получения информации о структуре экзон-интрона SlARF9. Геномная последовательность представлена в SEQ ID NO: 3. Геномная последовательность сорта Heinz 1706 (SEQ ID NO: 4) была получена из базы данных SGN, скелет 03sc03144 (http:solgenomics.net).
Прогулка по геному (Универсальный набор для прогулки по геному, BD бионауки, http://www.bdbiosciences.com) на SnaI (Fermentas) библиотека геномной прогулки с использованием генноспецифического праймера
а также внутренний праймер
5'-GGAGAATTCATATTCGGCTGAGAC-3' (обратный),
что привело к веделению 3 kb фрагменту, включающему промотор SlARF9 (указанный в SEQ ID NO: 3, выше кодона ATG). Система The Erase-a-Base (Promega, http://www.promega.com) использовалась для получения субклона, содержащего прогрессивные однонаправленные делеции данного фрагмента. Следовательно, данные субклоны были упорядочены и выстроены, с использованием ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalW).
1.1.4. Растительная трансформация.
Для получения сверхэкспрессирующих линий SlARF9 (ОЕ), кодирующая последовательность SlARF9 (прямая
5'- CACCATGGCAACTATAAATGGGTGGTG-3'
(SEQ ID NO: 9), обратная
5'- TTAACTGTCTGCGCGAGACAGGG-3'
SEQ ID NO: 10) была клонирована в pENTR™/D-TOPO исходный вектор (Invitrogen). Данный клон был рекомбинантным с бинарным вектором pGD625 (Dr S. de Folter, Wageningen University, Нидерланды), в котором вирус мозаики цветной капусты (CaMV) промотор 35S был заменен на завязь и молодой специфический промотор плодов TPRP-F1 (Carmi et al., 2003, supra) M. Busscher (Plant Research International, Нидерланды).
Для получения линий РНКи SlARF9, фрагмент кДНК среднего участка SlARF9 (аминокислоты 367506, прямой
5’- AAAAAGC AGGCTGTCCC ACC A ACCGCAGAGAAGAAC-3'
SEQ ID NO: 11; обратный
5'-AGAAAAGCTGGGTGCTGTAGTCGTGCCTCAGTAGTGC-3'
SEQ ID NO: 12) клонировали в исходный вектор pDONR™221 (Invitrogen), который затем был рекомбинирован с бинарным вектором pK7GWIWG2(I) (Karimi et al., 2002, Trends in Plant Sciences 7, 193195) как в смысловой, так и антисмысловой ориентации согласно регуляции транскрипции промотора CaMV 35S и терминатора.
Для получения линий pSlARF9::GUS, фрагмент промотора SlARF9 (2200 bp, прямой 5'-CACCTTTTCAAAGAGGTGTGACATTTTCAATAAC-3'
SEQ ID NO: 13; обратная
5'-CAACCTTCAATTCCAAAAACTAAAGAACACCC-3'
SEQ ID NO: 14) была клонирована в pENTR™/D-TOPO исходный вектор. Данный исходный клон был рекомбинантным с конечным вектором pKGWFS7 (Karimi et al., 2002, supra).
Трансгенные растения томатов были генерированы путем Agrobacterium tumefaciensопосредованной трансформации, как описано в de Jong et al. (2009, supra). Также выращивается на камамицин содержащее вещество, возможные выпуски были обнаружены ПНР с праймерами, специфическими для канамицин устойчивого гена (прямой
5'-GACTGGGCACAACAGACAATCG-3'
- 32 030460
обратный
5'. GCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGG-3')
на геномной ДНК.
Следовательно, линии тестировались на тетраплоидию, так как только диплоидный линии использовались для дальнейшего анализа.
1.1.5. Гистохимический анализ активности GUS.
Ткани взрослых растений первого поколения (Т1) и 15 дневные всходы (Т2) растения линий pSlARF9::GUS были погружены в GUS-окрашенный буфер, содержащий 0,1% Тритон Х-100, 0,5 мМ Fe2+CN, 0,5 мМ Fe3+CN, 10 мМ EDTA, 1 мг мл-1 X-Gluc, 0,1 мг мл-1 в 50 мМ фосфатный буфер, рН 7.0. После инкубации при 37°С ткани прочистили 70% этанолом и исследовали под стереомикроскопом (Leica MZFL III, Leica Microsystems, http://leica-microsystems.com). Для более подробного анализа боковых корней и семяпочек световой микроскопией, GUS-помеченные ткани были вложены в Technovit 7100 (Heraeus Kulzer, http://www.heraeus-kulzer.com). Вложенные ткани были разрезаны на секции в 5 мкМ. Секции боковых корней были контроастно окрашены 0,5% сафранином, затем частично обесцвечены 70% этанолом. Секции были изучны под микроскопом Leitz Orthoplan (микросистемы Leica). С помощью цифровой фотокамеры Leica были сделаны фотографии (модель DFC 420C; микросистемы Leica).
1.1.6. Квалификационная методология площади клетки и количество клеточных слоев.
Ткани перикарпия плодов 7-8 мм в диаметре фиксировались в 2% глютаральдегида, 0,1М фосфатномт буфере растворе рН 7,2 на ночь при температуре 4°С. Следовательно, ткани дегидратировались в серии этанола и помещены в Spurr. Секции 1 мкМ окрашивались в растворе толуидинового синего (0,1% в 1% бура).
Ткань перикарпия созревшего плода на молочной стадии фиксировался в FAA (5% уксусная кислота, 3,7-4,1% раствора формальдегида и 50% этанола), дегидратирована в серии этанола и затем помещена в Technovit. Секции 5 мкМ окрасили в растворе толуидинового синего. Секции были изучны под микроскопом Leitz Orthoplan (микросистемы Leica), а также были сделаны микроснимки цифровой камерой (модель DFC 420C; микросистемы Leica). Данные микроснимки использовались для дальнейшего анализа.
Для анализа 7-8 мм плодов поперечные сечения 0,16 мм были разграничены и расположены примерно в 0,1 мм от внутреннего перикарпия, включая эпидермальныи слои. Для анализа созревших плодов, секции в 9 мм были разграничены и расположены примерно в 1 мм от внутреннего перикарпия. Затем было подсчитано общее количество клеток в данных квадратах. Были включены клетки, расположенные в секциях для 2/3 их размера или более. Для оценки количества клеточных слоев в перикарпие, линия была проведена поперек секций перикарпия, а также было отмечено число клеточных слоев вдоль данной линии, включая клеточные слои эпидермиса, экзокарпия, мезокарпия и эндокарпия. В общей сложности был изучен 1 участок на каждом плоде и 5 плодов на линии.
1.2. Результаты.
1.2.1. Экспрессия SlARF9 в томате.
Относительные уровни транскрипции SlARF9, увеличенные в течение 2 дней после опыления, но не после обработки растительным гормоном гиббереллиновой кислоты (GA3). SlARF9 был экспрессирован в плацентарных и овулярных тканях, а также в стенке завязи. См. количественная ПЦР в реальном времени фиг. 1а.
Анализ мРНК завязи, собранной на различных стадиях развития цветка, показал, что транскрипт SlARF9 также присутствовал в избыточном количестве на ранних этапах развития цветка, однако снизилось на последних стадиях, в период цветения имеет низшее значение (фиг. 1b). Уровень транскрипции SlARF9 остался низким, если успешное опыление и оплодотворение не произошло. Данные процессы усилили уровни транскрипции SlARF9, в основном, в плацентарной ткани и стенке завязи (схема 1с).
Несмотря на то что обработка GA неопыленных созревших завязей не имела эффекта, использование ауксина (IAA) вызвало экспрессию SlARF9 (фиг. 1d), предполагая, что сам SlARF9 является чувствительным к ауксину. До сих пор было установлено, что только генные экспрессии AtARF4, AtARF19 и Oryza sativa ARF23 являются чувствительными к ауксину (Ulmasov et al., 1999, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 96, 5844-5849; Okushima et al., 2005, The Plant Cell 17, 444-463; Overvoorde et al., 2005, The Plant Cell 17, 3282-3300; Wang et al., 2007, Gene 394, 13-24).
В других тканях растения уровни транскрипции SlARF9 были очень низкими (фиг. 1е), предполагая, что функция SlARF9 может быть преимущественно плод-специфической.
Для более детального исследования экспрессии SlARF9 было проведено слияние SlARF9 промотора-GUS с использованием 2200 bp 5 фланкирующей последовательности кодирующая область SlARF9, перевязанная перед β-глюкорунидазой (GUS), кодирующей последовательность. Впоследствии данный конструкт pSlARF9::GUS был введен в томат Agrobacterium-опосредованной передачей генов. В 7 из 14 полученных независимых линиях наблюдалась экспрессия GUS в нескольких тканях, которые исследовались после гистохимического GUS окрашивания.
В плодах томата 5-6 мм диаметром, что соответствует приблизительно 8 DAP (дней после опыления), GUS окрашивание наблюдалось в перикарпие, во внешних клеточных слоях плаценты, которые
- 33 030460
развились в гелеподобное вещество, в завязях (данные не указаны).
Микроскопическое исследование поперечных разрезов через семяпочки показало, что GUS окрашивание расположено на микрокопилярном конце зародышевого мешка. Область и участок окрашивания предполагают, что GUS не была экспрессирована самим зародышем, находящемся на 4-16 клеточной стадии развития (Al-Hammadi et al., 2003, Plant Physiology 133, 113-125), однако она была экспрессирована суспензором или приростом стенки, которая быстро развилась вокруг своей основы (Briggs, 1995, Annals of Botany 76, 429-439). GUS была также экспрессирована в железистых волосках на поверхности листа и корня, а также в аксиллярных меристемах, расположенных в ростке на в основании листьев. Кроме того, GUS окрашивание наблюдалось на кончике стержневого корня, ранних завязях бокового корня и перепосших боковых корнях. Окрашенный участок находился в зоне мерисемы кончиков корня, в перицикле, а также в нескольких клеточных слоях паренхимы.
В целом, данные результаты показали, что активность промотора SlARF9 не ограничена плодом. Что интересно, большинство тканей, в которых данный ген транскрибирован, ткани, в которых происходит многократное клеточное деление.
1.2.2. Сверхэкспрессия и сайленсинг SlARF9 в томате.
Для изучения физиологической роли SlARF9 в завязи плода томата и его развитии были получены трансгенные линии томата, в которых ген был сверхэкспрессирован. Для производства сверхэкспрессированных линий SlARF9 (SlARF9-OE), кодирующая последовательность была привязана к промотору TPRP-F1, специфичному для завязи и молодых плодов (Carmi et al., 2003, supra). Из 11 полученных независимых трансгенных линий две линии SlARF9-OE с самой высокой экспрессией -4 и -5, соответственно, были выбраны для дальнейшего анализа.
В дополнение, были получены линии трансгенного томата, в которых ген SlARF9 прошел сайленсинг путем интерференции РНК (РНКи) с использованием фрагмента 420 п.о., основанного на среднем участке SlARF9 (аминокислоты 367-506). Специфичность данного фрагмента тестировалась с помощью анализа Саузерн-Блоттинга ДНК, который привел к получению одного сильного сигнала гибридизации (данные не указаны).
Фрагмент был клонирован в бинарный вектор РНКи согласно транскрипционной регуляции промотора CaMV 35S, а также был перенесен в томат путем Agrobacterium-опосредованной трансформации. В двух из 12 полученных трансгенных линиях были снижены транскриптные уровни SlARF9. Две данные линии РНКи SlARF9 -6 и -12 использовались для дальнейшего анализа.
Анализ экспрессии SlARF9 в течение нескольких стадий раннего развития плода показал, что в диком типе относительный уровень мРНК SlARF9 быстро увеличился после опыления и оплодотворения, а также достиг высшего значения в плодах 3-4 мм в диаметре, что соответствует 6 дням после опыления. На последующих стадиях уровни транскрипта вновь снизились (фиг. 2).
В линиях SlARF9-OE транскриптные уровни SlARF9 в период цветения уже были высокими, независимо от опыления, и оставались таковыми более продолжительный период времени, по сравнению с транскриптными уровнями в плодах дикого типа (фиг. 2а).
В линиях РНКи SlARF9 уровень экспрессии SlARF9 был таким же, как в диком типе, однако общий транскриптный уровень был снижен до 40-70% (фиг. 2b).
Несмотря на то что конструкт РНКи регулировался конститутивным промотором 35S без вегетативных фенотипов, например они наблюдались в развитии корня или разветвлении ростков. Тем не менее, обе линии SlARF9-OE и РНКи SlARF9 показали чистый фенотип в развитии плода. Были изучены гистологические поперечные разрезы плодов, которые составили 7-8 мм в диаметре. Данные плоды были собраны приблизительно 10 дней после опыления, в конце фазы клеточного деления. Было определено количество клеток на единицу поверхности, а также количество клеточных слоев в перикарпие. В общем, в перикарпие выделяют три слоя: эедокарпий, мезокарпий и экзокарпий (Gillaspy et al., 1993, supra). В перикарпие плодов SlARF9-OE количество клеток мезокарпия на мм2 оказалось значительно ниже (Р< 0,05, критерий Стьюдента), по сравнению с числом клеток мезокарпия в плодах дикого типа, в то время как количество клеток на мм2 в перикарпие линий РНКи SlARF9 было значительно выше (Р < 0,05, критерий Стьюдента) (табл. 1). Более того, на количество клеточных слоев в перикарпие трансгенных плодов было оказано воздействие. В плодах SlARF9-OE данное количество было ниже, чем в плодаз дикого типа, в то время как у плодов РНКи SlARF9 данное количество увеличилось. Тем не менее, благодаря большому разнообразию плодов данные различия не являлись статистически значительными для всех трансгенных линий (табл. 1).
- 34 030460
Таблица 1
Определение количества клеток на единицу поверхности или количество клеточных слоев в перикарпие дикого, типа, а также трансгенных плодов 7-8 мм в . диаметре (10 дней после опыления)
Линия Клетки/мм2 Количество клеточных слоёв
Процентное соотношение мас.% Процентное соотношение мас.%
Дикий тип (контрольные растения) 781+50 100% 29 + 1 100%
S1ARF9-OE-4 452 ± 70 (Р < 0.05) 58% 27 + 2(Р = 0.41) 93%
S1ARF9-OE-5 353 ± 88 (Р < 0.05) 54% 22 + 2 (Р < 0.05) 76%
РНКи S1ARF9-6 1246 ± 54 (Р < 0.05) 160% 35 + 1 (Р < 0.05) 121%
РНКи S1ARF9-12 1256 ± 151 (Р < 0.05) 161% 32 + 1 (Р = 0.13) 110%
Данные представляют вид ± стандартная погрешность пяти плодов. Для всех измерений разница между линиями дикого типа и трансгенными линиями тестировались для определения статистического уровня значимости. Р-значения (критерий Стьюдента) указаны.
В общем, данные результаты предполагают, что сверхэкспрессия SlARF9, общее количество клеток в перикарпие уменьшилось, в то время как снижение транскриптных уровней SlARF9 с помощью подхода РНКи, общее количество клеток в перикарпие увеличилось.
Анализ массы плода и диаметра созревших плодов на молочной стадии показал, что плоды линий SlARF9-OE был значительно ниже (масса Р<0,05, диаметр Р<0,05, критерий Стьюдента) чем плоды дикого типа. В противном случае, плоды линий РНКи SlARF9 были значительно больше (масса Р< 0,05, диаметр Р< 0,05) чем плоды дикого типа (табл. 2).
Таблица 2
Анализ массы плода, а также размер (диаметра) созревших плодов дикого типа и трансгенных плодов, собранных на молочной стадии
Линия Масса (г) Диаметр (мм)
мас.% мас.%
Дикий тип (контрольные растения) 77 ± 3.0 100% 54 ±0.9 100%
S1ARF9-OE-4 53 + 3.4 67% 48 ± 1.1 89%
S1ARF9-OE-5 55 ±3.6 71% 48 ± 1.2 89%
РНКи S1ARF9-6 119 + 13.3 154% 63 ±2.5 117%
РНКи S1ARF9-12 102 + 7.2 132% 59 ± 1.4 109%
Данные представляют вид ± стандартная погрешность 5-20 плодов. Для всех измерений разница между линиями дикого типа и трансгенными линиями была статистически значима (Р<0,05, критерий Стьюдента).
Более того, микроскопный анализ показал, что количество клеточных слоев в перикарпие плодов РНКи SlARF9, а также количество клеток на единицу поверхности было выше, чем у плодов дикого типа (таблица 3). Больший размер плодов РНКи SlARF9 (см. фиг. 3) возможно вызван антиклинальным клеточным делением в перикарпие.
Микроснимки также показали, что клеток перикарпия РНКи SlARF9 плодов было не только больше, но и меньше по размеру, чем плоды дикого типа (см. фиг. 4). В табл. 3 размер клеток (поверхность
- 35 030460
клетки) была расчитана клетки/мм2.
Таблица 3
Определение количества клеток на единицу поверхности или количество клеточных слоев в перикарпие зрелых плодов дикого типа , и плодах , РНКи SlARF9, собранных на молочной ст адии
Линия Клетки/мм2 % дикого типа (мас.%) Поверхность клетки (мм2) % дикого типа (мас.%) Количество клеточных слоёв % дикого типа (мас.%)
Дикий тип 6.88+0.51 100% 0.15+0.01 100% 27 + 2 100%
РНКи 7.44 + 0.55 108% 0.13+0.01 87% 32 + 3 118%
S1ARF9-6 (Р = 0.48) (Р = 0.20)
РНКи 9.60 + 1.19 139% 0.10+0.01 67% 33+2 122%
S1ARF9-12 (Р = 0.08) (Р = 0.05)
Данные представляют вид ± стандартная погрешность пяти плодов. Р-значения (Р; критерий Стьюдента) были указаны.
Обсуждение
Когда завязь трансформируется в плод после опыления и оплодотворения, индуцируется несколько генов, участвующих в цикле клетки и росте клетки (Vriezen et al., 2008, supra; Pascual et al., 2009, BMC Plant Biology 9, 67; Wang et al., 2009, The Plant Cell 21, 1428-1452). Индукция данных генов, возможно, опосредована гормонами ауксина и гиббереллина, так как обработка неопыленных завязей с ауксином, привело к образованию плодов с большим количеством клеток перикарпия, в то время как перикарпий GA-индуцированных плодов содержал меньшее количество больших клеток hunger - Kibler and Bangerth, 1982, supra; Serrani et al., 2007, supra). В соответствии с нашей предыдущей работой по определению генов, участвующих в завязи плода, которая показало, что экспрессия как ауксин-, так и GAсвязанных генов была активирована после опыления (Vriezen et al., 2008, supra).
В данном документе мы описываем функциональный анализ гена SlARF9. В Arabidopsis, AtARF9 характеризовался как транскрипционный репрессор (Ulmasov et al., 1999 supra; Tiwari et al., 2003, supra), однако функция данного транскриптного фактора все еще остается по большей частью неизвестной, так как большинство Т-ДНК мутантных линий вставки не проявило очевидного фенотипа (Okushima et al., 2005, supra). Тем не менее, мутантные линии с отсутствующим 3'-концом транскрипта остро реагировали после гравистимуляции, предполагая, что AtARF9 может быть вовлечен в гравитропную сигнальную трансдукцию. Более того, было установлено, что AtARF9 экспрессируется в суспензоре эмбриона арабидопсиса и двойных выбитых линиях, в которых как ARF9, так и ARF13 были заглушены, AtARF9 необходим для контроля за развитием суспензора (Liu et al., 2008, supra).
Функция AtARF9 не связана с развитием плода Arabidopsis. До сих пор единственным известным ARF, участвующим в процессе "плод без оплодотворения" (FWF)/ARF8, так как мутантные линии fwf/arf8 сформировали партенокарпные стручки (Goetz et al., 2006, supra). У томатов трансгенные линии с сокращенными транскриптными уровнями S1ARF7 также формируют партенокарпные плоды, что указывает на то, что S1ARF7 выступает в качестве отрицательного регулятора завязывния плода (de Jong et al., 2009, supra). Другим единственным описанным в настоящее время членом семейства томатов ARF является развитый регулируемый ген 12 (DR12), гомолог AtARF4. Уровни мРНК DR12 увеличивались в процессе развития плода и достигли высшего уровня на ранней красной стадии плода. С помощью антисмыслового подхода понижающая регуляция данного гена воздействовала на твердость плода на красной стадии (Jones et al., 2002, supra).
В противном случае, было установлено, что SlARF9 был экспрессирован на ранних стадиях развития плода. Данные стадии соответствуют периоду, в котором рост плода во многом зависит от клеточного деления (Mapelli et al., 1978, supra; Bunger-Kibler и Bangerth, 1982, supra; Gillaspy et al., 1993, supra). Экспрессия SlARF9 была также индуцирована в неопыленных завязях, обработанных ауксином, в то время так транскриптные уровни SlARF9 не увеличились в партенокарпические плоды, сформированные после нанесения гиббереллина.
Кроме того, результаты GUS показали, что SlARF9 были также экспрессирован в других тканях растения, в которых произошло многократное клеточное деление. В целом, данные результаты предполагают, что SlARF9 регулирет активность клеточного деления.
Несмотря на то что ген SlARF9 не может считаться плод-специфическим геном, линии РНКи SlARF9 проявили только фенотип плода, указывая на то, что в других тканях растения SlARF9 может
- 36 030460
избыточно взаимодействовать с другими членами семейства белков ARF.
Сниженные транскриптные уровни SlARF9 привели к формированию значительно больших плодов возможно, благодаря добавочному антиклинальному клеточному делению в перикарпие, в то время как увеличенные транскриптные уровни SlARF9 привели к образованию меньших по размеру плодов по сравнению с диким типом. Это указывает на то, что SlARF9 регулирует клеточное деление, т.е. белок SlARF9 является отрицательным регулятором (репрессором) клеточного деления.
Результаты, показавшие, что понижающая регуляция SlARF9 приводит к значительно более крупным плодам, по сравнению с растениями дикого типа, делает данный ген полезным для изменения размера плода в растениях, либо трансгенно, либо посредством снабжения (нетрансгенных) растений, включающих мутантные аллели slarf9 или мутации в промоторе SlARF9, при этом транскриптные уровни SlARF9 и белковые уровни снижаются, либо исчезают.
Пример 2. Анализ промотора SlARF9 в Arabidopsis.
2.1. Материалы и методы.
2.1.1. Растительные материалы и условия роста.
Трансгенные растения Arabidopsis thaliana в окружении Col-0 выращивались в стандартизированных тепличных условиях, при температуре 22°С, 16 ч на свету/8 ч в темноте. Семена, появившиеся в результате трансформации погружения, были стерилизованы путем обработки 100% этанолом в течение 1 мин, а также 2% раствором гипохлорида в течение 10 мин. После трех раз промывки стерильной дистиллированной водой семена посеяли в 1/2 культурную среду Murashige и Skoog (MS), включая витамины Gamborg B5, 0,05% (мас./об.), 0,7% (мас./об.) фитоагара, а также 20 мг L-1 канамицина, рН 5,7. После 10 дней инкубации в вегетационной камере (16 ч на свету/8 ч в темноте, при температуре 22°С), устойчивые растения были перемещены в почву. Растения томатов (Solanum lycopersicum cv. Moneymaker) выращивались, как было описано в de Jong et al. (2009, supra). Для анализа экспрессии генов ответа ауксина, завязи цветов с удаленными несозревшими пестиками обработали 2 мкл 1 мМ 4-C1-IAA (Sigma-Aldrich, http://www.sigmaaldrich.com) в 2% этанола. Обработка повториласт спустя 6 ч после первого нанесения. Контрольные растения были собраны в период цветения. Собранные ткани были заморожены в N2 и хранились при температуре -80°С до извлечения РНК.
2.1.2. Растительная трансформация.
Для получения трансгенного промотора линий ::uidA фрагменты промотора SlARF9 (2200 bp, прямой
5 - CACCTTTTCAAAGAGGTGTGAC АТТТТСААТААС-3 ’
SEQ ID NO: 13; обратная
5'-CAACCTTCAATTCCAAAAACTAAAGAACACCC-3'
SEQ ID NO: 14) и AtARF9 (2466 bp, forward
5'-AAAAAGCAGGCTTGGTGGTGGGTTTTAAGGCATC-3' AGAAAAGCTGGGTCACACAGTCTCTCTATCTCTCTCC-3')
были клонированы в pENTR™/D-TOPO или pDONR™221 исходный вектор (Invitrogen, http://www.invitrogen.com). Впоследствии, исходные клоны были рекомбинантными с конечными векторами pKGWFS7 (Karimi et al., 2002, Trends in Plant Sciences 7, 193-195). Данные конструкты были трансформированы в цепь Agrobacterium tumefaciens EHA105 с использованием трансформации замерзания и оттаивания (Chen et al., 1994, Biotechniques 16, 664-670). Трансформация растений Arabidopsis проводилась с помощью цветочного метода окраски погружением в краситель, как описано Clough и Bent (1998, The Plant Journal 16, 735-743).
2.1.3. Проба гормонального ответа.
Для тестирования чувствительности промоторов SlARF9 и AtARF9 на ауксин 10 дневные ростки и созревшие листья линий Arabidopsis pSlARF9::GUS выводили в 0,05% этанола или 50 мкМ гетероауксина (IAA) в 0,05% этанола. После 3 и 9 ч ткани были заморожены в N2 и хранились при температуре -80°С до извлечения РНК.
2.1.4. Количественная ПЦР в реальном времени.
Тотальная РНК была изолирована и обратно транскрибировна с кДНК согласно протоколу, описанному в примере 1.1.2. Также для количественной ПЦР в реальном времени были использованы такие же условия, как в примере 1.1.2. Последовательности праймеров, использованных для количественной ПЦР реального времени включают SEQ ID NO 7 и 8 для A1ARF9, а также следующую последовательность для
Прямой 5'-AGAAGCCATGAGCAATAAGTTCTCTGTAGG-3'
Обратный R 5'-GGGAGCAGTCTTTCACACCAATAACC-3'
Также для GUS (uidA)
- 37 030460
Прямой 5'-CTCCTACCGTACCTCGCATTAC-3'
Обратный 5'-CCGTTGACTGCCTCTTCGC-3'
2.1.5. Гистохимический анализ активности GUS.
Ткани взрослых растений (Т1) и 10 дневные всходы (Т2) линий Arabidopsis pSlARF9::GUS и pAtARF9::GUS были погружены в GUS-окрашенный буфер, содержащий 0,1% Тритон Х-100, 0,5 мМ Fe2+CN, 0,5 мМ Fe3+CN, 10 мМ EDTA, 1 мг мл-1 X-Gluc, 0,1 мг мл-1 в 50 мМ фосфатный буфер, рН 7,0. После инкубации при 37°С ткани прочистили 70% этанолом. Окрашенная ткань исследовалась под стереомикроскопом (Leica MZFL III, http:/leica-microsystems.com). С помощью цифровой фотокамеры Leica были сделаны фотографии (модель DFC 420C; микросистемы Leica).
2.1.6. Анализ промотора in silico.
Последовательности промотора SlARF9 и AtARF9 (At4g2323980), включая 5'нетранслируемые участки данных генов, исследовались с посмощью PlantCARE (Lescot et al., 2002 Nucleic Acids Research 30, 325-327 http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html) и PLACE (Higo et al., 1999, Nucleic Acids Research 27, 297-300, http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/).
2.2. Результаты.
2.2.1. Промоторный анализ in silico SlARF9 и AtARF9.
Уровни транскрипции Solanum lycopersicum ARF9 (SlARF9) возросли в течение 48 ч после опыления. Однако экспрессия SlARF9 была также включена в неопыленные завязи, обработанные гормональным ауксином (фиг. 1с). До сих пор было установлено, что только генные экспрессии AtARF4, AtARF19 и Oryza sativa ARF23 являются индуцированными ауксином (Ulmasov et al., 1999, supra; Okushima et al., 2005, supra; Overvoorde et al., 2005, supra; Wang et al., 2007, supra). В данном исследовании мы анализировали 1500 п.о. 5' участок выше гена SlARF9 с PlantCARE (Lescot et al., 2002, supra) и PLACE (Higo et al., 1999, supra) программным обеспечением для присутствия связанных с ауксином цис-действующих элементов, что привело к определению двух вырожденных элементов ответа ауксина (AuxREs). Данные элементы обычно расположены в последовательностях промотора генов ауксинного ответа и связаны факторами транскрипции ARF (Ulmasov et al., 1999, supra). Более того, промоторная последовательность содержала несколько NTBBFlARROLB-элементов. Данные элементы были вначале определены в промоторной последовательности rolB, один из онкогенов, присутствующих в последовательности Т-ДНК Agrobacterium rhizogenes и участвующих в индуцируемой ауксином экспрессии rolB в растениях (Baumann et al., 1999, The Plant Cell 11, 323-333). Элементы как AuxRE, так и NTBBF1ARROLB были также перепредставлены в промоторных последовательностях SlIAA2 и SlIAA14. Данные гены являются двумя членами семейства генов Aux/IAA томата, семейства транскрипционных репрессоров, которые регулируют экспрессией ауксин-отвечающих генов. Тем не менее, многие Aux/IAA сами индуцируются ауксином (Reed, 2001, Trends in Plant Science 6, 420-425). Экспрессия SlIAA2 и SlIAA14 была активирована после опыления (Vriezen et al., 2008, supra), а также в неопыленных завязях, обработанных ауксином, подобно SlARF9 (фиг. 1). Анализ промоторной последовательности AtARF9 привел к определению нескольких связанных с ауксином цис-действующих элементов (результаты не указаны). Присутствовали AuxRE, вырожденные AuxRE, а также NTBBF1ARROLB-элементы. Кроме того, элемент ASF1MOTIFCAMV был перепредставлен. Данный элемент был обнаружен в нескольких чувствительных к ауксину генах, первоначально был обнаружен в промоторе CaMV 35S (Liu and Lam, 1994, The Journal of Biological Chemistry 269, 668-675). Подобные связанные с ауксином элементы присутствовали в промоторных последовательностях индуцированных ауксином AtIAA1 и AtIAA5 (Abel et al., 1995, Journal of Molecular Biology 251, 533-549).
Анализ промотора in silico показал, что 5'-конец верхних участков генов ARF9 имеет те же связанные с ауксином цис-действующие элементын, такие как найденные на участках промотора генов Aux/IAA, индуцируемых ауксоном, предполагая, что экспрессия как SlARF9, так и AtARF9 регулируется ауксином. Более того, большая часть обнаруженных цис-элементов сходна в промоторных последовательностях томата и Arabidopsis.
2.2.2. Экспрессия индуцированных ауксином SlARF9 и AtARF9.
Так как подобные связанные с ауксином цис-действующие элементы были обнаружены в последовательностях промотора SlARF9 и AtARF9, можно ожидать, что способность ауксина к индуцированию промотора SlARF9 поддерживается Arabidopsis. Таким образм, 2200 п.о. 5'-конец фланкирующей последовательности SlARF9 кодирующей области был привязан перед β-глюкорунидазой (GUS), кодирующей последовательность гена uidA. Впоследствии, данный конструкт pSlARF9::uidA был введен в Arabidopsis с помощью Agrobacterium-опосредованной передачей генов. Созревшие розетки листьев полученных трансгенных линий были ложно обработаны или дествительно обработаны 50 мкМ гетероауксином (IAA). После 3 и 9 ч инкубации образцы листа исследовались на экспрессию uidA с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Кроме того, данные образцы ткани использовались для изучения способности ауксина к индуцированию экспрессии AtARF9.
Несмотря на возможность определения экспрессии uidA для достоверного определения количества
- 38 030460
уровни были слишком низкими. Напротив, определение количества транскриптных уровней AtARF9 представляется возможным. Транскриптные уровни AtARF9 возросли через 3 и 9 ч после обработки IAA. Тем не менее, экспрессия была также активирована в ложно обработанных образцах (данные не указаны). Таким образом, были изучены экспрессии Al и AtIAA5. Транскриптные уровни данных генов были сильно индуцированы в IAA-обработанных образцах, в то время как транскриптные уровни остались низкими в ложно обработанных образцах (данные не указаны). Данные результаты показали, что эксперементальная организация была верной. Тот же эксперимент повторился на 10-дневных ростках линий pSlARF9::uidA, однако были получены подобные результаты. Результаты указывают на то, что предполагаемые элементы, связанные с ауксином, присутствовали в промоторной последовательности, экспрессия AtARF9 не индуцируется ауксином.
2.2.3. Наборы экспрессии SlARF9 и AtARF9 в Arabidopsis.
Так как экспрессия линий pSlARF9::uidA была слишком низкой для определения, возник вопрос, присутствуют ли регуляторные элементы в промоторной последовательности SlARF9 были функциональными в Arabidopsis. Следовательно, линии pSlARF9::uidA были исследованы после гистохимического окрашивания GUS. В 10-дневных ростках прилистники, молодые развивающиеся листья, трихомы развивающихся листьев, молодые зачатки боковых корней, а также кончики боковых корней были окрашены голубым. Более того, активность GUS была обнаружена в нескольких тканях в период морфогенеза. Самые молодые почки не проявили активность GUS, однако в более крупных почках экспрессия GUS наблюдалась в рыльце и на кончике чашелистика. После опыления активность GUS также наблюдалась в развивающихся семенах. Однако в стручках, собранных приблизительно спустя 6 дней после опыления (DAP), не было обнаружено активности GUS.
Для более детального исследования экспрессии AtARF9 были созданы трансгенные линии, с использованием 2466 п.о. 5'-конца фланкирующей последовательности AtARF9 кодирующей области, привязанной перед кодирующей последовательностью uidA, а также изучено после гистохимического окрашивания GUS. В 10-дневных ростках были окрашены прилистники и трихомы развивающихся листьев. Более того, окрашивание GUS могло быть обнаружено в центральном цилиндре корней. Во время цветочного морфогенеза GUS экспрессия не наблюдалась в самых молодых почках. В более крупных почках окрашивались только тычинки. Более подробное изучение показало, что данный окрашенный участок находился в развивающихся пыльцевых зернах, клетках тапетума и паренхимных клетках пыльников. В созревших почках, собранных прямо перед цветением, экспрессия GUS в тычинке была снижена, однако возросла в гинецее. После опыления экспрессия GUS гинецея стала более заметной и поддерживалась в развивающемся стручке. Кроме того, был окрашен отделительный слой стручка.
Данные результаты показали, что регуляторные элементы, присутствующие в промоторной последовательности SlARF9, были все еще функциональными в Arabidopsis. Тем не менее, промотор SlARF9 и промотор AtARF9 являются активными в разных тканях.
Пример 3. TILLING подход мутантов slarf9.
3.1. TILLING подход популяции томата.
Крайне гомозиготная инбредная линия, используемая в коммерческом обработанном разведении томата, была использована для мутагенеза следующим протоколом. После прорастания семян на влажной бумаге Ватмана® в течение 24 ч, ~ 20000 семян, разделенных на 8 партий по 2500, соответственно, были вымочены в 100 мл особо чистой воды и этилметансульфонате (EMS) в концентрации 1% в конических колбах. Колбы осторожно встряхивали в течение 16 ч при комнатной температуре. Наконец, EMS промыли под проточной водой. После обработки EMS, семена непосредственно высеивали в теплице. Из 60% семян, которые проросли, 10600 побегов были пересажены в поле. Из 8810 линий M1, которые дали плоды, были собраны два плода с растения. ДНК была выделена из семян из первого плода, составляющих популяцию М2 запаса ДНК. Они были самоопыленные, и семена M3 были выделены из плодов, и семена были использованы для ДНК выделения и образования популяции M3 банка ДНК.
3.2. Ген-мишень SlARF9 для ПЦР усиления популяции из Тиллинг подхода.
ДНК популяция томата TILLING подхода, описанная выше, прошла скриннинг для одиночных нуклеотидных полиморфизмов в гене-мишени SlARF9. Для этой цели были разработаны следующие пары праймеров для амплификации консервативных частей N-терминального B3 суперсемейства ДНКсвязывающего домена (DBD). Мутации на данном участке могут привести к замещению консервативных остатков, что ведет к снижению сходства мутантного белка SlARF9 для промоторных последовательностей генов-мишений. В дополнение, потенциального терминирующего кодона в данный участок приведет к очень короткому укеченному белку SLARF9, который, вероятно, будет неактивным/нефункциональным.
- 39 030460
Праймеры, созданные для скрининга мутировавшей популяции томата EMS для мутаций в S1ARF9 ДНК-связывающий домен. Б=прямой праймер; й=обратный праймер. АА нацеленные это остатки, закодированные продуктом амплификации.
имя праймера Последовательность праймеров 5'-3'конец экзон № нацеленные AA нацеленн ые
F-4008 AATTTGAGAATTTTGGAGCTTTTT (SEQ ID NO: 15) 2 K20-Q56
R-4009 AGAACTTAGCCTTGAATCAACCA (SEQ ID NO: 16) 2 K20-Q56
F-4010 TGAGTTTCAGGTAAAAAAGATGC (SEQ ID NO: 17) 2 K20-Q56
R-4011 ACAGAAAAAAACAACAACACAG AA (SEQ ID NO: 18) 2 K20-Q56
F-4030 CCCCTGTTTTGACAAGTTGTTG (SEQ ID NO: 19) 6 DI 60R187
R-4031 CATTGATATCTTCTGTTACACTCT AC (SEQ ID NO: 20) 6 DI 60R187
F-4032 GTAGAGTGTAACAGAAGATATCA ATG (SEQ ID NO: 21) 7 G188R218
R-4033 CCAGAGAGAGATACCTCAAGAAT AC (SEQ ID NO: 22) 7 G188R218
Другие пары праймеров были разработаны для исследования, при необходимости, консервативных частей.
Пары праймеров были использованы для усиления мишени последовательности из М2 и M3 ДНК TILLING популяции и гетеродуплексов между мутантом и мишенью последовательности дикого вида, обнаруженной с помощью CSCE и HRM, как описано ниже. Идентификационный номер ДНК образцов связан с партиями семян растений, несущих аллель дикого вида или мутировавшего аллеля либо в гетерозиготной, либо в гомозиготной форме.
Семена проросли, и наличие конкретной мутации в отдельных растениях было подтверждено с помощью PCR, используя праймеры, фланкирующие мутировавший участок и геномную ДНК этих растений в качестве шаблонов. ДНК секвенирование фрагментов определило гомозиготные и гетерозиготные мутанты для ожидаемой мутации. Гомозиготные мутанты были выбраны или получены после самоопыления и последующей селекции, и влияние мутации на соответствующие белки и фенотип растения.
Следущие мутанты были определены с помощью пары праймеров SEQ ID NO: 19 и 22 (мутант 1719, мутант 2484, мутант 6725 и мутант 6932) или пара праймеров SEQ ID NO: 15 и 16 (мутант 3175) и семена получили номера доступа NCIMB, указанные ниже.
- 40 030460
Растение Номер доступа Мутация в ARF9 Мутация в белке
мутантного томата NCIMB геномной ДНК (SEQ ID NO: 3) ARF9 (SEQ ID N0: 2 или 3)
Мутант 1719 NCIMB 41827 Нуклеотид 3529 меняется с с на а: cag aag В интроне между экзонами 6 и 7, рядом с нуклеотидами ag, необходимо для правильного сращивание премРНК
Мутант 2484 NCIMB 41828 нуклеотид 3540 меняется с с на t: egg tgg аминокислота 191 в экзоне 7 меняется с Arg на Тгр
Мутант 3175 NCIMB 41829 Нуклеотид 2254 меняется с g на а: ggc age аминокислота 52 в экзоне 2 меняется с His на Туг
Мутант 6725 NCIMB 41830 Нуклеотид 3546 меняется с с на t: cat tat аминокислота 193 в экзоне 7 меняется с His на Туг
Мутант 6932 NCIMB 41831 Нуклеотид 3546 меняется с с на t: cat tat аминокислота 193 в экзоне 7 меняется с His на Туг
Таким образом, один мутант slarf9 может повлиять на сплайсинг пре-мРНК (мутант 1719), один мутант находится в экзоне 2 (мутант 3175) и три мутанта в экзоне 7 (мутанты 2484, 6725 и 6932), который является частью b3-полученного ДНК-связывающего домена SlARF9.
Растения, включающие мутации в целевой последовательности, такие как вышеуказанные мутантные растения или растения, полученные из них (например, путем самоопыления или скрещивания) и включающие мутантный аллель slarf9, проходили фенотипный скрининг для развития значительно более крупных плодов.
Два мутантных аллеля могут также сочетаться в одном растении путем скрещивания растений с разными мутациями для определения влияния на размер плода.
3.3. Конформация чувствительного капиллярного электрофореза (КЧКЭ).
Мультиплекс PCR реакции проводятся в 10 мкл объеме с 0,15 нг, 4-кратной сгруппированной геномной ДНК. Маркированные праймеры были добавлены в PCR подготовленную смесь к концентрации в 5 раз ниже (1 мкм), чем у немаркированных праймеров. Пост PCR образцы были разбавлены 10 раз.
До выполнения КЧКЭ 2 мкл разбавленных продуктов добавили к 38 мкл MQ воды. Образцы вводятся в 50 см капилляры (время инъекции и напряжения: 16 с, 10 кВ; запуск напряжения: 15 кВ) из аппарата ABI 3130x1, заполненного полу-денатурирующими полимерами в следующем составе: 5 г конформационного аналитического полимера (CAP) (Applied Biosystems, 434037, 9%), 2,16 г Ureum, 0,45 г 20хТТЕ (национальная диагностика, ЕС-871), дополненных водой MQ до 9 г. Текущий буфер подготовлен с 1х разбавленной ТТЕ и 10% глицерином. Температура в печи установлена на 18°С).
Исходные данные анализируются с гетеродуплексным анализом (HDA) с программным обеспечением BioNumerics, программа отличает пиковые формы гетеро-дуплексных (мутантн) и гомодуплексных молекул (дикого вида), обеспечивая тем самым возможность выбора ДНК-групп, содержащих отдельные линии, мутировавшие в ген-мишень.
3.4. Анализ высокого разрешения кривых плавления (HRM).
LCgreen PCRs выполняется на 8 плотно прилегающих группах в FramStar 96 колодцах пластинок
- 41 030460
(4titude, Великобритания). 2 мкл (15 нг) сгруппированных ДНК смешиваются с 2 мкл F-524 Phire™ 5х буфером реакции (FINNZYMES, Финляндия), 0.1 мкл Phire™ Hot Start ДНК-полимеразой (FINNZYMES, Финляндия), 1 мкл LCGreen™ Plus+ (BioChem, США), 0.25 мкЛ 5 мм праймерами, и дополнены 10 мкл с MQ водой) согласно рекомендациям производителя. Группы, содержащие мутации, проходят скриннинг с помощью LightScanner® System (Idaho Technology Inc, США). Положительные группы выбираются на основе анализа профилей температуры плавления, когда группа содержит мутации, она покажет более низкую температуру плавления.
Пример 4. Перенос мутантного аллеля slarf9 в сорта томата.
Мутанты TILLING подхода, содержащие мутантный аллель slarf9, такие как любой из вышеперечисленных мутантных аллелей, пересекаются с различными линиями томатов для переноса мутантного аллеля в эти линии, генерируя томаты с хорошими агрономическими характеристиками и значительно более крупными плодами.
TaqMan® SNP маркер анализа генотипирования (Applied Biosystems) разработан для определения наличия модифицированного нуклеотида. Этот анализ используется для маркерно-вспомогательной приоритетной селекции, который эффективен для переноса рецессивных генов в необходимую среду, например коммерческих родительских линий томата, так как их классический перенос требует дополнительных периодически повторяющихся поколений самоопыления (Ribaut et al. Plant Molecular Biology Reporter 15:154-162).
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Нунхемс Б.Ф.
<120> Растения с увеличенным размером плода
<130> BCS10-2006 PCT
<150> EP10005603.5
<151> 2010-05-28
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1977
<212> ДНК
<213> не известно
<220>
<223> Solanum lycopersicum ARF9 кодирующая последовательность из cv Moneymaker
<400> 1
atggcaacta taaatgggtg gtgttatgag tctcagccga atatgaattc tccaggtaaa 60
aaagatgctc tgtatcatga gctatggcag ttgtgtgcag gtccagtagt tgatgttccc 120
agggaaggag aaagagttta ttattttcct caaggccaca tggaacaatt ggtagcatca 180
attaatcaag aaatggatca aagagttcca tcattcaatc tcaaatcaaa ggtcctttgt 240
cgagttatca atagtcattt cctggctgaa gaagacaatg atgaggtcta tgtccagatc 300
actttgatgc cagaggcacc acatgtaccc gagccgacta ctccggatcc attaattccg 360
caggatgtaa agcctagatt ccattctttc tgcaaggtcc tgacagcctc cgatacaagc 420
actcatggtg gattttctgt tctaaggaaa catgctaatg aatgccttcc tccattggac 480
ttgaaccagc agactccgac ccaggaattg attgcgaaag accttcatga cgtggagtgg 540
- 42 030460
cgcttcaagc atatatttag aggccaacct cggagacatt tacttaccac agggtggagt 600
acctttgttt cttcaaagaa attagtggca ggggattctt ttgtattctt gaggggtaat 660
aatggacagc tgcgagttgg ggtcaaaagg cttgttcgcc agcagagctc aatgccgtca 720
tcggtgatgt caagccagag catgcaccta ggagtcttgg ctacagcatc tcatgctgtt 780
acaacccaga caatgtttgt tgtttactac aaaccgagaa ccactcagtt catcgtaggc 840
gtcaacaaat acttagaggc tcttaaacat gaatatgcag ttggcatgcg attcaaaatg 900
cagtttgaag ccgaagggaa tcctgataga agatttatgg gcactatagt tggaattgat 960
gatctttctt cacagtggaa aaattctgcg tggcgatcct tgaaggtccg atgggacgag 1020
cctgcagcca ttgcaaggcc tgacagagtt tctccttggg aaattaaacc ttatgtgtgt 1080
tcaattccaa atgtccttgt cccaccaacc gcagagaaga acaaaaggca tcggctacat 1140
agtgaaatca aaatatcaga acaaccttca tcctcaaatg cttcggcggt ttggaatcct 1200
tcccttcgat cgcctcagtt taacaccttt ggcatcaaca gcagtactaa ttgcgcatta 1260
gcgtctctta cagagagtgg ttggcagctt cctcatttaa atacttcagg tatgcttgtg 1320
gatgagccag aagacggtag gagtgctcca acttggtgtg gttttccatg cgttttggcc 1380
ccgcagttcg gtcaagggac taatcagccg attgttattc ctactgatgg gagaaaatgt 1440
gataccaaaa aaacctgtag attatttggt attgacttga aaagttcctc aattagcact 1500
actgaggcac gactacagct acagccagcc ggcatttctt gtgtctttgc agagagagca 1560
cctccaaaca cggtgcctgc tggtgattca gatcaaaagt ctgagctttc agtagacttc 1620
aaagatcaaa tgcaaggcca tttgcggtta cccctaaagg aggttcaaag caagcagagt 1680
tgttccacca ggtctcgcac aaaggtgcaa atgcaaggcg tagctgtagg tcgtgcagtg 1740
gatttaacca tattgaaagg atacgatgag cttacaaagg agcttgagga gatgtttgaa 1800
atccaaggag agcttcagtc acgacagaaa tgggggatct tgtttacaga tgatgaaggg 1860
gatacaatgc ttatgggtga ttatccgtgg caagactttt gcaatgtggt gaggaagatt 1920
ttcatttgtt caagtcagga tatgaaaaaa ttgaccctgt ctcgcgcaga ccattaa 1977
<210> 2 <211> 658 <212> PRT <213> не известно
<220> <223> Solanum lycopersicum ARF9 белок из cv Moneymaker
<220>
<221> ДОМЕН
<222> (74)..(236)
<223> полученный из B3 ДНК-связывающий домен
- 43 030460
<220>
<221> ДОМЕН
<222> (237)..(564)
<223> Средний участок (MR)
<220>
<221> ДОМЕН
<222> (256)..(332)
<223> участок характеристики ауксина, часть среднего участка (MR)
<220>
<221> ДОМЕН
<222> (565)..(602)
<223> Домен димеризации III
<220>
<221> ДОМЕН
<222> (609)..(651)
<223> Домен димеризации IV
<400> 2
Met 1 Ala Thr Ile Asn Gly 5 Trp Cys Tyr Glu 10 Ser Gln Pro Asn Met 15 Asn
Ser Pro Gly Lys Lys Asp Ala Leu Tyr His Glu Leu Trp Gln Leu Cys
20 25 30
Ala Gly Pro Val Val Asp Val Pro Arg Glu Gly Glu Arg Val Tyr Tyr
35 40 45
Phe Pro Gln Gly His Met Glu Gln Leu Val Ala Ser Ile Asn Gln Glu
50 55 60
Met Asp Gln Arg Val Pro Ser Phe Asn Leu Lys Ser Lys Val Leu Cys
65 70 75 80
Arg Val Ile Asn Ser His Phe Leu Ala Glu Glu Asp Asn Asp Glu Val
85 90 95
Tyr Val Gln Ile Thr Leu Met Pro Glu Ala Pro His Val Pro Glu Pro
100 105 110
Thr Thr Pro Asp Pro Leu Ile Pro Gln Asp Val Lys Pro Arg Phe His
115 120 125
Ser Phe Cys Lys Val Leu Thr Ala Ser Asp Thr Ser Thr His Gly Gly
130 135 140
Phe Ser Val Leu Arg Lys His Ala Asn Glu Cys Leu Pro Pro Leu Asp
145 150 155 160
Leu Asn Gln Gln Thr Pro Thr Gln Glu Leu Ile Ala Lys Asp Leu His
- 44 030460
165 170 175
Asp Val Glu Trp 180 Arg Phe Lys His Ile 185 Phe Arg Gly Gln Pro 190 Arg Arg
His Leu Leu Thr Thr Gly Trp Ser Thr Phe Val Ser Ser Lys Lys Leu
195 200 205
Val Ala Gly Asp Ser Phe Val Phe Leu Arg Gly Asn Asn Gly Gln Leu
210 215 220
Arg Val Gly Val Lys Arg Leu Val Arg Gln Gln Ser Ser Met Pro Ser
225 230 235 240
Ser Val Met Ser Ser Gln Ser Met His Leu Gly Val Leu Ala Thr Ala
245 250 255
Ser His Ala Val Thr Thr Gln Thr Met Phe Val Val Tyr Tyr Lys Pro
260 265 270
Arg Thr Thr Gln Phe Ile Val Gly Val Asn Lys Tyr Leu Glu Ala Leu
275 280 285
Lys His Glu Tyr Ala Val Gly Met Arg Phe Lys Met Gln Phe Glu Ala
290 295 300
Glu Gly Asn Pro Asp Arg Arg Phe Met Gly Thr Ile Val Gly Ile Asp
305 310 315 320
Asp Leu Ser Ser Gln Trp Lys Asn Ser Ala Trp Arg Ser Leu Lys Val
325 330 335
Arg Trp Asp Glu Pro Ala Ala Ile Ala Arg Pro Asp Arg Val Ser Pro
340 345 350
Trp Glu Ile Lys Pro Tyr Val Cys Ser Ile Pro Asn Val Leu Val Pro
355 360 365
Pro Thr Ala Glu Lys Asn Lys Arg His Arg Leu His Ser Glu Ile Lys
370 375 380
Ile Ser Glu Gln Pro Ser Ser Ser Asn Ala Ser Ala Val Trp Asn Pro
385 390 395 400
Ser Leu Arg Ser Pro Gln Phe Asn Thr Phe Gly Ile Asn Ser Ser Thr
405 410 415
- 45 030460
Asn Cys Ala Leu Ala 420 Ser Leu Thr Glu 425 Ser Gly Trp Gln Leu 430 Pro His
Leu Asn Thr Ser Gly Met Leu Val Asp Glu Pro Glu Asp Gly Arg Ser
435 440 445
Ala Pro Thr Trp Cys Gly Phe Pro Cys Val Leu Ala Pro Gln Phe Gly
450 455 460
Gln Gly Thr Asn Gln Pro Ile Val Ile Pro Thr Asp Gly Arg Lys Cys
465 470 475 480
Asp Thr Lys Lys Thr Cys Arg Leu Phe Gly Ile Asp Leu Lys Ser Ser
485 490 495
Ser Ile Ser Thr Thr Glu Ala Arg Leu Gln Leu Gln Pro Ala Gly Ile
500 505 510
Ser Cys Val Phe Ala Glu Arg Ala Pro Pro Asn Thr Val Pro Ala Gly
515 520 525
Asp Ser Asp Gln Lys Ser Glu Leu Ser Val Asp Phe Lys Asp Gln Met
530 535 540
Gln Gly His Leu Arg Leu Pro Leu Lys Glu Val Gln Ser Lys Gln Ser
545 550 555 560
Cys Ser Thr Arg Ser Arg Thr Lys Val Gln Met Gln Gly Val Ala Val
565 570 575
Gly Arg Ala Val Asp Leu Thr Ile Leu Lys Gly Tyr Asp Glu Leu Thr
580 585 590
Lys Glu Leu Glu Glu Met Phe Glu Ile Gln Gly Glu Leu Gln Ser Arg
595 600 605
Gln Lys Trp Gly Ile Leu Phe Thr Asp Asp Glu Gly Asp Thr Met Leu
610 615 620
Met Gly Asp Tyr Pro Trp Gln Asp Phe Cys Asn Val Val Arg Lys Ile
625 630 635 640
Phe Ile Cys Ser Ser Gln Asp Met Lys Lys Leu Thr Leu Ser Arg Ala
645 650 655
Asp His
- 46 030460
<210> 3
<211> 7510
<212> ДНК
<213> не известно
<220>
<223> ARF9 промотор и ген из Solanum lycopersicum cv
Moneymaker
<220>
<221> Промотор
<222> (1)..(2004)
<223> ARF9 промотор
<220>
<221> misc_feature
<222> (612)..(617)
<223> AuxRE элемент
<220>
<221> misc_feature
<222> (888)..(893)
<223> NTBBF1ARROLB элемент
<220>
<221> misc_feature
<222> (1224)..(1229)
<223> AuxRE элемент
<220>
<221> misc_feature
<222> (1541)..(1546)
<223> NTBBF1ARROLB элемент
<220>
<221> misc_feature
<222> (1824)..(1829)
<223> NTBBF1ARROLB элемент
<220>
<221> misc_feature
<222> (1831)..(1836)
<223> NTBBF1ARROLB элемент
<220>
<221> экзон
<222> (2005) ..(2059)
<223> Экзон 1 из ATG инициирующего трансляцию кодона
<220>
<221> экзон
<222> (2156) ..(2268)
<223> Экзон 2
<220>
<221> экзон
<222> (2495) ..(2590)
<223> Экзон 3
<220>
<221> экзон
<222> (2949) ..(3008)
- 47 030460
<223> Экзон 4
<220>
<221> экзон
<222> (3095) ..(3247)
<223> Экзон 5
<220>
<221> экзон
<222> (3347) ..(3431)
<223> Экзон 6
<220>
<221> экзон
<222> (3532) ..(3622)
<223> Экзон 7
<220>
<221> экзон
<222> (3765) ..(3929)
<223> Экзон 8
<220>
<221> экзон
<222> (4054) ..(4167)
<223> Экзон 9
<220>
<221> экзон
<222> (4433) ..(4505)
<223> Экзон 10
<220>
<221> экзон
<222> (4581) ..(4734)
<223> Экзон 11
<220>
<221> экзон
<222> (4843) ..(5387)
<223> Экзон 12
<220>
<221> экзон
<222> (5495) ..(5682)
<223> Экзон 13
<220>
<221> экзон
<222> (5795) ..(5879)
<223> Экзон 14 до терминирующего трансляцию кодона
<400> 3
acagagtcac tcgtaatgta aattttttca tatctaatat ttaatttaat gttctcgatt 60
tagagtaaag aattctcaac atgataatta gtacttttta attttcgcac gcttttactt 120
tttaatatga tagcggagtc acttatgacg taaatttctc cacatctaag actacaaatc 180
taatgtcttc gattgagact taagaattct caccgttaca tattaaatta taatcttgac 240
ttttatgcaa tttttacggt agttattcca ccattacacg acaggcggtg ttaactttac 300
- 48 030460
ttagttaata accagcccgc tacttaccca accaacgccc cacacactta aatccaaggt 360
ccccaattaa gactacagaa attttgccgt tacataataa ttaattctct tgactttcac 420
acttttttac ttcttaataa tataacagag tcacccgtaa cgtaaatttt tccatatcta 480
agatttaaat ctaatgtcct cgattaagag caaaaaactc ccaccattac atgataatta 540
gtactttttg actttcgcac gctttcactt tttaatacaa taacgggatc actcctaagt 600
cgtaacataa atgtcaccgc atctaacact taaatctaat atcctctatt aagactaaag 660
aaatccaacc attacatgat aattagtact tctcgagttt cgcacgcttt tacttcttaa 720
cataataact gagtcatttg taacgtaaat ttctccacat ctaaaactca catccaatat 780
ctttgattaa gacttaagaa ttctcaccgt tacataataa ttaataatct tgacttttat 840
gcaattttta cggtagttgt tccaccattg cttgacaggt ggtgttaact ttacttagtt 900
aataaccacc cgttacttac ccaaccaacc cccccccccg cacacacact taaatccaag 960
gtccccgatt aaagactaaa gaaatctcgc cgttacataa taattaatac tcttgacttt 1020
cacacctttt tacttcttaa tacaataaca ctcgtaacgt aaatttttcc atatctaaga 1080
tttaaatcta atgtcctcga ttaagagtaa aatctcttac cattacatga taattagtac 1140
tttttgactt tcgcacgctt ttacttttta atacaataac ggggtcactt ccaattagtc 1200
gtaacgtaaa tatcaccgca tctaagacat aaatccaatg tactcgatta agactaaaaa 1260
aatccaacca ttacatgata attaacactt ctggactttc gcacgctttt acttcttaac 1320
acaaataatg gagtcacttg taaaccataa atttctccac ctttaacact caaatctact 1380
atctccgatt aggactaaaa aacaaaaaac tccacggtta catactaatt aatatgtttg 1440
acttttaacc acaatttttt acagtagtta ttccgcccaa tacacgaaag cggggtttac 1500
tctactttta accaagctta taaaacccaa ccaacccccc actttacttc acactacaca 1560
gatgaaaaaa aggagagaaa cacgttctct gcagggagcg gtagaaagca acaaatcaag 1620
ccatatatta agctgttttt gggtaaactc cgttacagag ttttctcttt ctctctctca 1680
ctttctctct ttctctcacg tacaaaatag aaagaaaaaa aaaatgaaat tattaagctg 1740
ttgcttcttc tgttgttgct cctgtttgtt ccagtagaac tagtactact attgttagtt 1800
aatttttttt tatattcagc actactttaa actttatttt tagttgttgg gggtgtttct 1860
ttaaggcttt tttatgtgtt gttgttatag cagggaagaa atgtggtgaa ttttagctag 1920
ttttgtgatg tttttttgag ctaattactt gattttgaat tctgggtgtt ctttagtttt 1980
tggaattgaa ggttgattat actc atg gca act ata aat ggg tgg Met Ala Thr Ile Asn Gly Trp tgt tat Cys Tyr 2031
1 5
gag tct cag ccg aat atg aat tct cca g gtgaaagttt gattttttga 2079
Glu Ser Gln Pro Asn Met Asn Ser Pro 10 15
- 49 030460
agtttaattt gagaattttg gagctttttt tgtttttttt gtttaaaatg tggatttttt 2139
attttttgag tttcag gt aaa aaa gat gct ctg tat cat gag cta tgg cag 2190
Gly Lys Lys Asp Ala Leu Tyr His Glu Leu Trp Gln
20 25 30
ttg tgt gca ggt cca gta gtt gat gtt ccc agg gaa gga gaa aga gtt 2238
Leu Cys Ala Gly Pro Val Val Asp Val Pro Arg Glu Gly Glu Arg Val
35 40 45
tat tat ttt cct caa ggc cac atg gaa caa gtaaaaaatt ttattttaaa 2288
Tyr Tyr Phe Pro Gln Gly His Met Glu Gln
50 55
aaaataattg aattctgtgt ttttttttct ttctgtttta ggtgaatctg gttgattcaa 2348
ggctaagttc ttgtttttga gttatggagt tgtgaatttt tattgaattt ctcaatttga 2408
gtgtatattt ttagttatgt tttctgggga ttgtaaaatc tgtatctttc tctttttgtc 2468
tcactttttt tggttttgtg gaaaag ttg gta gca tca att aat caa gaa atg 2521
Leu Val Ala Ser Ile Asn Gln Glu Met
60 65
gat caa aga gtt cca tca ttc aat ctc aaa tca aag gtc ctt tgt cga 2569
Asp Gln Arg Val Pro Ser Phe Asn Leu Lys Ser Lys Val Leu Cys Arg
70 75 80
gtt atc aat agt cat ttc ctg gtatgtttat atttcatggt gttatttgat 2620
Val Ile Asn Ser His Phe Leu
85
cagtttattt tacatacatt gtattcatac ttgttagtaa ttcatccaaa aaaagtgatg 2680
aatttattgt tgggttcaaa attcaaacat cggaaggtga gccttggcgt attcgtagct 2740
ggcaaagttg tcggtttgtc gccaagtgaa cgaccatgag gtcaccgttc aatgcgtgta 2800
agcaatctct tgcagaaatg cagggtaagg ttgtgtccaa cagaccctta tagtccagtc 2860
tagcgggagc tttagtgcac ctgaatgcgt gtaaagttca tacaattttg tatttgaaat 2920
gtaaaatgtt tttgatgatt gcttgtag gct gaa gaa gac aat gat gag gtc 2972
Ala Glu Glu Asp Asn Asp Glu Val
90 95
tat gtc cag atc act ttg atg cca gag gca cca cat gtaagaagtt 3018
Tyr Val Gln Ile Thr Leu Met Pro Glu Ala Pro His
100 105
aaaattgttg tagtattcac ttgtttatat gcattttatt gatcaatttg gttttaatta 3078
ttgatctgat ttttag gta ccc gag ccg act act ccg gat cca tta att ccg 3130
Val Pro Glu Pro Thr Thr Pro Asp Pro Leu Ile Pro
110 115 120
cag gat gta aag cct aga ttc cat tct ttc tgc aag gtc ctg aca gcc 3178
Gln Asp Val Lys Pro Arg Phe His Ser Phe Cys Lys Val Leu Thr Ala
125 130 135
tcc gat aca agc act cat ggt gga ttt tct gtt cta agg aaa cat gct 3226
Ser Asp Thr Ser Thr His Gly Gly Phe Ser Val Leu Arg Lys His Ala
- 50 030460
140 145 150
aat gaa tgc ctt cct cca ttg gtaatataag tgtgatcatt ttgtataggc 3277
Asn Glu Cys Leu Pro Pro Leu
155
tagactacgt ttccccccct gttttgacaa gttgttgaat tagctgtcgt gtttgttata 3337
ctttgttag gac ttg aac cag cag act ccg acc cag gaa ttg att gcg aaa 3388
Asp Leu Asn Gln Gln Thr Pro Thr Gln Glu Leu Ile Ala Lys
160 165 170
gac ctt cat gac gtg gag tgg cgc ttc aag cat ata ttt aga g 3431
Asp Leu His Asp Val Glu Trp Arg Phe Lys His Ile Phe Arg
175 180 185
gtaattgttt tgtttgtaga gtgtaacaga agatatcaat gaagctttat catgtattgt 3491
aaaggtcaaa agtcatccgt ctttgtttta attataacag gc caa cct cgg aga 3545
Gly Gln Pro Arg Arg
190
cat tta ctt acc aca ggg tgg agt acc ttt gtt tct tca aag aaa tta 3593
His Leu Leu Thr Thr Gly Trp Ser Thr Phe Val Ser Ser Lys Lys Leu
195 200 205
gtg gca ggg gat tct ttt gta ttc ttg ag gtatctctct ctggtcctag 3642
Val Ala Gly Asp Ser Phe Val Phe Leu Arg
210 215
cttctcgtat gagtatgata tttgattgca ttgtctatca ctattgcatg tcatgtcata 3702
tatccagaac agttaatgtt ggtttgttaa taatcatatt ctaatggata tgtacgctct 3762
ag g ggt aat aat gga cag ctg cga gtt ggg gtc aaa agg ctt gtt cgc 3810
Gly Asn Asn Gly Gln Leu Arg Val Gly Val Lys Arg Leu Val Arg
220 225 230
cag Gln cag Gln 235 agc Ser tca Ser atg Met ccg Pro tca Ser 240 tcg gtg atg tca Ser agc Ser 245 cag Gln agc Ser atg Met cac His 3858
Ser Val Met
cta gga gtc ttg gct aca gca tct cat gct gtt aca acc cag aca atg 3906
Leu Gly Val Leu Ala Thr Ala Ser His Ala Val Thr Thr Gln Thr Met
250 255 260 265
ttt gtt gtt tac tac aaa ccg ag gtttgtcaca tacacctcct ttcaattatc 3959
Phe Val Val Tyr Tyr Lys Pro Arg
270
ccgtcatcct tacgcagtag agatcatttt catgccagag aacatactaa atctttcata 4019
tgctcttcca attttctgct ttgacaacct tcag a acc act cag ttc atc gta 4072
Thr Thr 275 Gln Phe Ile Val
ggc gtc aac aaa tac tta gag gct ctt aaa cat gaa tat gca gtt ggc 4120
Gly Val Asn Lys Tyr Leu Glu Ala Leu Lys His Glu Tyr Ala Val Gly
280 285 290 295
atg cga ttc aaa atg cag ttt gaa gcc gaa ggg aat cct gat aga ag 4167
Met Arg Phe Lys Met Gln Phe Glu Ala Glu Gly Asn Pro Asp Arg Arg
300 305 310
- 51 030460
gtagtgatat caattactcg ctagctccat tttgatttat ctgtcttact ttcctttata 4227
gtttgtttaa aagaatgcat ctttcccttt ttggctttaa ttcaacttaa atcccgtgcc 4287
aagttaaaac cagcaaataa attgaaatgg tgggagtatt cagaagtcct ccaattagat 4347
gtggaagtct ttgatcaaga tgtttatttg ccaactgctt agttctgaca tgtatttgtt 4407
tgggctctcc cctattattt ctcag a ttt atg ggc act ata gtt gga att gat 4460
Phe Met Gly Thr Ile Val Gly Ile Asp
315 320
gat ctt tct tca cag tgg aaa aat tct gcg tgg cga tcc ttg aag 4505
Asp Leu Ser Ser Gln Trp Lys Asn Ser Ala Trp Arg Ser Leu Lys
325 330 335
gttgatatct acatttatat ttcagcaata ttctttaagt tcaattggaa atcaccaatt 4565
ctcccttcgt tccag gtc cga tgg gac gag cct gca gcc att gca agg cct 4616
Val Arg Trp Asp Glu Pro Ala Ala Ile Ala Arg Pro 340 345
gac Asp aga Arg gtt Val 350 tct Ser cct Pro tgg Trp gaa Glu att Ile 355 aaa Lys cct Pro tat Tyr gtg Val tgt Cys 360 tca Ser att Ile cca Pro 4664
aat gtc ctt gtc cca cca acc gca gag aag aac aaa agg cat cgg cta 4712
Asn Val Leu Val Pro Pro Thr Ala Glu Lys Asn Lys Arg His Arg Leu
365 370 375
cat agt gaa atc aaa ata tca g gtctgaatga aaattctcaa cagcatggtg 4764
His Ser Glu Ile Lys Ile Ser
380 385
gtttttcatg tgttggttgc tgatatttta atttccattt tcattttctt aattatcttg 4824
cctttctttt cctgttag aa Glu caa Gln cct Pro tca Ser 390 tcc Ser tca Ser aat Asn gct Ala tcg Ser 395 gcg Ala gtt Val 4874
tgg aat cct tcc ctt cga tcg cct cag ttt aac acc ttt ggc atc aac 4922
Trp Asn Pro Ser Leu Arg Ser Pro Gln Phe Asn Thr Phe Gly Ile Asn
400 405 410
agc agt act aat tgc gca tta gcg tct ctt aca gag agt ggt tgg cag 4970
Ser Ser Thr Asn Cys Ala Leu Ala Ser Leu Thr Glu Ser Gly Trp Gln
415 420 425
ctt cct cat tta aat act tca ggt atg ctt gtg gat gag cca gaa gac 5018
Leu Pro His Leu Asn Thr Ser Gly Met Leu Val Asp Glu Pro Glu Asp
430 435 440 445
ggt agg agt gct cca act tgg tgt ggt ttt cca tgc gtt ttg gcc ccg 5066
Gly Arg Ser Ala Pro Thr Trp Cys Gly Phe Pro Cys Val Leu Ala Pro
450 455 460
cag ttc ggt caa ggg act aat cag ccg att gtt att cct act gat ggg 5114
Gln Phe Gly Gln Gly Thr Asn Gln Pro Ile Val Ile Pro Thr Asp Gly
465 470 475
aga aaa tgt gat acc aaa aaa acc tgt aga tta ttt ggt att gac ttg 5162
Arg Lys Cys Asp Thr Lys Lys Thr Cys Arg Leu Phe Gly Ile Asp Leu
- 52 030460
480 485 490
aaa agt tcc tca att agc act act gag gca cga cta cag cta cag cca 5210
Lys Ser 495 Ser Ser Ile Ser Thr Thr Glu 500 Ala Arg Leu Gln Leu Gln Pro 505
gcc ggc att tct tgt gtc ttt gca gag aga gca cct cca aac acg gtg 5258
Ala Gly 510 Ile Ser Cys Val Phe Ala Glu 515 Arg Ala Pro Pro Asn Thr Val 520 525
cct gct ggt gat tca gat caa aag tct gag ctt tca gta gac ttc aaa 5306
Pro Ala Gly Asp Ser 530 Asp Gln Lys Ser Glu Leu Ser Val Asp Phe Lys 535 540
gat caa atg caa ggc cat ttg cgg tta ccc cta aag gag gtt caa agc 5354
Asp Gln Met Gln Gly 545 His Leu Arg Leu 550 Pro Leu Lys Glu Val Gln Ser 555
aag cag Lys Gln agt tgt tcc Ser Cys Ser 560 acc agg tct cgc Thr Arg Ser Arg 565 aca aag gtattaaatc aaaagccaaa 5407 Thr Lys
aaattgcatt cttaccaact cattttcgcc acaaaacata ttattaaact ctctaacatc 5467
ttttcacatg tggaatccct tgagaag gtg caa atg caa ggc gta gct gta ggt 5521
Val Gln Met Gln Gly Val Ala Val Gly
570 575
cgt gca gtg gat tta acc ata ttg aaa gga tac gat gag ctt aca aag 5569
Arg Ala Val Asp Leu Thr Ile Leu Lys Gly Tyr Asp Glu Leu Thr Lys
580 585 590
gag ctt gag gag atg ttt gaa atc caa gga gag ctt cag tca cga cag 5617
Glu Leu Glu Glu Met Phe Glu Ile Gln Gly Glu Leu Gln Ser Arg Gln
595 600 605
aaa tgg ggg atc ttg ttt aca gat gat gaa ggg gat aca atg ctt atg 5665
Lys Trp Gly Ile Leu Phe Thr Asp Asp Glu Gly Asp Thr Met Leu Met
610 615 620 625
ggt gat tat ccg tgg ca gtaagttctc tctcacttaa aaaaatttaa 5712
Gly Asp Tyr Pro Trp Gln
630
gactgaatac atatacaacc actgcataag atcttttcta caacctgtaa tttaacacat 5772
cacttaaatc acttaattgc ag a gac ttt tgc aat gtg gtg agg aag att 5822
Asp Phe Cys Asn Val Val Arg Lys Ile
635 640
ttc att tgt tca agt cag gat atg aaa aaa ttg acc ctg tct cgc gca 5870
Phe Ile Cys Ser Ser Gln Asp Met Lys Lys Leu Thr Leu Ser Arg Ala
645 650 655
gac cat taa gcagctcctt tcaaatgaaa tgatggcgga agatggtgaa 5919
Asp His
agttaaagac tccgcctttt gaagtggtac cgttttgtga tctctttggc ttcattctct 5979
atatatagta ggaaagaacg acaggttgtt gacatagcaa ggcgtagaag cttgttttta 6039
cgctcttttt agcctagtgc agctccgttt tgagagcagt taagtaagta actagttata 6099
- 53 030460
ataggataag actagtaaaa atatagtact agaagtagta aaaagttaag ggtgttctct 6159
aatggggagt ctatatagta gtagtttatg tagttttcta ttcgcgcgtt aacctgtaaa 6219
tactcatgtg ccattgtagt attctggaaa tactacaatg tatggtcttg ttaacgtgct 6279
ttatgcctta tcttatatga aaactccatg gtggagattg ctctgtactt gctctttctg 6339
tatgactttt gtgatgcaca atagggattt cttgtctaaa tttagactct tttggcacaa 6399
tcatgcatca ctttgtaact ttccccttta ctgaacaaaa aaatctttca aaacgctcct 6459
tcgcgtgtgt gtttgtttta ttctttgcta aagggtgatc ctaacattta aattagatac 6519
cgttttcttt actataaggg tgacttgaac tcaaaacctg ttttattagt atgttactct 6579
atttagaagt ttaataattt attagatatg acatttctat ttaccttgct atttctttta 6639
acaatattta cctttagatt tatataagtt tttgattcat taactgactt tggttaagat 6699
gttgagtgca aaataaatag atggttcatc ttttgagcta gcgtagagtc attttccttt 6759
aaactttata aagcacttac aatcacatat ttgtgcattc ttagtgcacg tttgaccatg 6819
gataattttc actattttat ggaactgtat attataattt ttttggaatt agaagaactc 6879
aaaaagactc ttttcataat tttattccga atcactcgta caaaaatcaa aaaacaattt 6939
caagttgtat tcattttcaa gcaaaagttc aatttgtcac tatcacttgt aacacaaata 6999
ttttcccttt cgaatttcac aattttaata ttctaagttc ctttttgaga acttttagtg 7059
aaaggaaaat tgggctttgt gaattgtttg gtcttcaata tccctatcct agctaggaag 7119
agtgtccata tagtcatggg cctcatgagt tgtcaaatgt tacgtaaagg tatttatctt 7179
tgcatgagtg tttggtcacg ctcaaaactt ctttattata agtctgagtc tttgtgttat 7239
gtatccatgc ttggcttgca tgatgtttgt gtcattccta atcttattga atggactata 7299
aaggacttag tcaagtataa ctataaaatg acgatagctt atagacaact tcgtagttgt 7359
tggagtatac aacacgctga catcgacttc ttggagttta gtaatcataa ttttttttaa 7419
aaaaaacaaa tctcctcaat caacttcttg attttagtag taatccatcg attcaggtac 7479
attcatgacg tgatgtgttc gattaatatt t 7510
<210> 4
<211> 7500
<212> ДНК
<213> не известно
<220>
<223> ARF9 промотор и ген из Solanum lycopersicum cv Heinz 1706
<220>
<221> Промотор <222> (1)..(1995)
- 54 030460
<220>
<221> misc_ feature
<222> (612) ..(617)
<223> AuxRE
<220> <221> misc_ feature
<222> (888) ..(893)
<223> NTBBF1ARROLB элемент
<220> <221> misc_ feature
<222> (1229 )..(1234)
<223> AuxRE
<220> <221> misc_ feature
<222> (1815 )..(1820)
<223> NTBBF1ARROLB элемент
<220> <221> misc_ feature
<222> (1822 )..(1827)
<223> NTBBF1ARROLB элемент
<220> <221> экзон
<222> (1996 )..(2050)
<223> экзон 1
<220> <221> экзон
<222> (2146 )..(2258)
<223> экзон 2
<220> <221> экзон
<222> (2485 )..(2580)
<223> экзон 3
<220> <221> экзон
<222> (2939 )..(2998)
<223> экзон 4
<220> <221> экзон
<222> (3085 )..(3237)
<223> экзон 5
<220> <221> экзон
<222> (3337 )..(3421)
<223> экзон 6
<220> <221> экзон
<222> (3522 )..(3612)
<223> экзон 7
<220> <221> экзон
<222> (3755 )..(3919)
- 55 030460
<223> экзон 8
<220>
<221> экзон
<222> (4044) ..(4157)
<223> экзон 9
<220>
<221> экзон
<222> (4423) ..(4495)
<223> экзон 10
<220>
<221> экзон
<222> (4571) ..(4724)
<223> экзон 11
<220>
<221> экзон
<222> (4833) ..(5377)
<223> экзон 12
<220>
<221> экзон
<222> (5485) ..(5672)
<223> экзон 13
<220>
<221> экзон
<222> (5785) ..(5869)
<223> экзон 14 до терминирующего трансляцию кодона
<400> 4
acagagtcac tcgtaatgta aattttttca tatctaatat ttaatttaat gttctcgatt 60
tagagtaaag aattctcaac atgataatta gtacttttta attttcgcac gcttttactt 120
tttaatatga tagcggagtc acttatgacg taaatttctc cacatctaag actacaaatc 180
taatgtcttc gattaagact taagaattct caccgttaca tattaaatta taatcttgac 240
ttttatgcaa tttttacggt agttattcca ccattacacg acaggcggtg ttaactttac 300
ttagttaata accagcccgt tacttaccca accaacgccc cacacactta aatccaaggt 360
ccccaattaa gactacagaa attttgccgt tacataataa ttaattctct tgactttcac 420
acttttttac ttcttaataa tataacagag tcacccgtaa cgtaaatttt tccatatcta 480
agatttaaat ctaatgtcct cgattaagag caaaaaactc ccaccattac atgataatta 540
gtactttttg actttcgcac gctttcactt tttaatacaa taacgggatc actcctaagt 600
cgtaacataa atgtcaccgc atctaacact taaatctaat atcctctatt aagactaaag 660
aaatccaacc attacatgat aattagtact tctcgagttt cgcacgcttt tacttcttaa 720
cataataact gagtcatttg taacgtaaat ttctccacat ctaaaactca catccaatat 780
ctttgattaa gacttaagaa ttctcaccgt tacataataa ttaataatct tgacttttat 840
gcaattttta cggtagttgt tccaccattg cttgacaggt ggtgttaact ttacttagtt 900
- 56 030460
aataaccacc cgttacttac ccaaccaacc cccccccccc ccccgcacac acacttaaat 960
ccaaggtccc cgattaaaga ctaaagaaat ctcgccgtta cataataatt aatactcttg 1020
actttcacac ctttttactt cttaatacaa taacactcgt aacgtaaatt tttccatatc 1080
taagatttaa atctaatgtc ctcgattaag agtaaaatct cttaccatta catgataatt 1140
agtacttttt gactttcgca cgcttttact ttttaataca ataacggggt cacttccaat 1200
tagtcgtaac gtaaatatca ccgcatctaa gacataaatc caatgtactc gattaagact 1260
aaaaaaatcc aaccattaca tgataattaa cacttctgga ctttcgcacg cttttacttc 1320
ttaacacaat aatggagtca cttgtaacat aaatttctcc acctttaaca ctcaaatcta 1380
ctatctccga ttaggactaa aacaaaactc acggttacat actaattaat atgtttgact 1440
tttacacaat ttttacagta gttattccgc caatacacga aagcggtgtt aactctactt 1500
ctaaccaagc ttataaaacc caaccaaccc cccactctac ttcacactac acagatgaaa 1560
aaaggagaga aacacgttct ctgcagggag cggtagaaag caacaaatca agccatatat 1620
taagctgttt ttgggtaaac tccgttacag agttttctct ttctctctct cactttctct 1680
ctttctctca catacaaaat agaaagaaaa aaaaaatgaa attattaagc tgttgcttct 1740
tctgttgttg ctcctgtttg ttccagtaga actagtacta ctattgttag ttaatttttt 1800
ttatattcag cactacttta aactttattt ttagttgttg ggggtgtttc tttaaggctt 1860
ttttatgtgt tgttgttata gcagggaaga aatgtggtga attttagcta gttttgtgat 1920
gtttttttga gctaattact tgattttgaa ttctgggtgt tctttagttt ttggaattga 1980
aggttgatta tactc atg gca act ata aat ggg tgg tgt tat gag tct cag 2031
Met Ala Thr Ile Asn Gly Trp Cys Tyr Glu Ser Gln
1 5 10
ccg aat atg aat tct cca g gtgaaagttt gattttttga agtttaattt 2080
Pro Asn Met Asn Ser Pro
15
gagaattttg gagctttttt tgtttttttg tttaaaatgt ggatttttta ttttttgagt 2140
ttcag gt aaa aaa gat gct ctg tat cat gag cta tgg cag ttg tgt gca 2189
Gly Lys Lys Asp Ala Leu Tyr His Glu Leu Trp Gln Leu Cys Ala
20 25 30
ggt cca gta gtt gat gtt ccc agg gaa gga gaa aga gtt tat tat ttt 2237
Gly Pro Val Val Asp Val Pro Arg Glu Gly Glu Arg Val Tyr Tyr Phe
35 40 45
cct caa ggc cac atg gaa caa gtaaaaaatt ttattttaaa aaaataattg 2288
Pro Gln Gly His Met Glu Gln 50 55
aattctgtgt tgttgttttt ttctgtttta ggtgaatctg gttgattcaa ggctaagttc 2348
ttgtttttga gttatggagt tgtgaatttt tattgaattt ctcaatttga gtgtatattt 2408
ttagttatgt tttctgggga ttgtaaaatc tgtatctttc tctttttgtc tcactttttt 2468
- 57 030460
tggttttgtg gaaaag ttg gta gca tca att aat caa gaa atg gat caa aga 2520
Leu Val Ala Ser Ile Asn Gln Glu Met Asp Gln Arg
60 65
gtt cca tca ttc aat ctc aaa tca aag gtc ctt tgt cga gtt atc aat 2568
Val Pro Ser Phe Asn Leu Lys Ser Lys Val Leu Cys Arg Val Ile Asn
70 75 80
agt cat ttc ctg gtatgtttat atttcattgt gttatttgat cagtttattt 2620
Ser His Phe Leu 85
tacatacatt gtattcatac ttgttagtaa ttcatccaaa aaaagtgatg aatttattgt 2680
tgggttcaaa attcaaacat cggaaggtga gccttggcgt attcgtagct ggcaaagttg 2740
tcggtttgtc gccaagtgaa cgaccatgag gtcaccgttc aatgcgtgta agcaatctct 2800
tgcagaaatg cagggtaagg ttgtgtccaa cagaccctta tagtccagtc tagcgggagc 2860
tttagtgcac ctgaatgcgt gtaaagttca tacaattttg tatttgaaat gtaaaatgtt 2920
tttgatgatt gcttgtag gct gaa gaa gac aat gat gag gtc tat gtc cag 2971
Ala Glu Glu Asp Asn Asp Glu Val Tyr Val Gln
90 95
atc act ttg atg cca gag gca cca cat gtaagaagtt aaaattgttg 3018
Ile Thr Leu Met Pro Glu Ala Pro His 100 105
tagtattcac ttgtttatat gcattttatt gatcaatttg gttttaatta ttgatctgat 3078
ttttag gta ccc gag ccg act act ccg gat cca tta att ccg cag gat 3126
Val Pro Glu Pro Thr Thr Pro Asp Pro Leu Ile Pro Gln Asp
110 115 120
gta aag cct aga ttc cat tct ttc tgc aag gtc ctg aca gcc tcc gat 3174
Val Lys Pro Arg Phe His Ser Phe Cys Lys Val Leu Thr Ala Ser Asp
125 130 135
aca agc act cat ggt gga ttt tct gtt cta agg aaa cat gct aat gaa 3222
Thr Ser Thr His Gly Gly Phe Ser Val Leu Arg Lys His Ala Asn Glu
140 145 150
tgc ctt cct cca ttg gtaatataag tgtgatcatt ttgtataggc tagactacgt 3277
Cys Leu Pro Pro Leu
155
ttccccccct gttttgacaa gttgttgaat tagctgtcgt gtttgttata ctttgttag 3336
gac ttg aac cag cag act ccg acc cag gaa ttg att gcg aaa gac ctt 3384
Asp Leu Asn Gln Gln Thr Pro Thr Gln Glu Leu Ile Ala Lys Asp Leu
160 165 170 175
cat gac gtg gag tgg cgc ttc aag cat ata ttt aga g gtaattgttt 3431
His Asp Val Glu Trp Arg Phe Lys His Ile Phe Arg
180 185
tgtttgtaga gtgtaacaga agatatcaat gaagctttat catgtattgt aaaggtcaaa 3491
agtcatccgt ctttgtttta attataacag gc caa cct cgg aga cat tta ctt 3544
Gly Gln Pro Arg Arg His Leu Leu
- 58 030460
190 195
acc aca ggg tgg agt acc ttt gtt tct tca aag aaa tta gtg gca ggg 3592
Thr Thr Gly Trp Ser Thr Phe Val Ser Ser Lys Lys Leu Val Ala Gly
200 205 210
gat tct ttt gta ttc ttg ag gtatctctct ctggtcctag cttctcgtat 3642
Asp Ser Phe Val Phe Leu Arg
215
gagtatgata tttgattgca ttgtctatca ctattgcatg tcatgtcata tatccagaac 3702
agttaatgtt ggtttgttaa taatcatatt ctaatggata tgtacgctct ag g ggt 3758
Gly
aat aat gga cag ctg cga gtt ggg gtc aaa agg ctt gtt cgc cag cag 3806
Asn Asn Gly Gln Leu Arg Val Gly Val Lys Arg Leu Val Arg Gln Gln
220 225 230 235
agc tca atg ccg tca tcg gtg atg tca agc cag agc atg cac cta gga 3854
Ser Ser Met Pro Ser Ser Val Met Ser Ser Gln Ser Met His Leu Gly
240 245 250
gtc ttg gct aca gca tct cat gct gtt aca acc cag aca atg ttt gtt 3902
Val Leu Ala Thr Ala Ser His Ala Val Thr Thr Gln Thr Met Phe Val
255 260 265
gtt tac tac aaa ccg ag gtttgtcaca tacacctcct ttcaattatc 3949
Val Tyr Tyr Lys Pro Arg
270
ccgtcatcct tacgcagtag agatcatttt catgccagag aacatactaa atctttcata 4009
tgctcttcca attttctgct ttgacaacct tcag a acc act cag ttc atc gta 4062
Thr Thr Gln Phe Ile Val
275
ggc gtc aac aaa tac tta gag gct ctt aaa cat gaa tat gca gtt ggc 4110
Gly Val Asn Lys Tyr Leu Glu Ala Leu Lys His Glu Tyr Ala Val Gly
280 285 290 295
atg cga ttc aaa atg cag ttt gaa gcc gaa ggg aat cct gat aga ag 4157
Met Arg Phe Lys Met Gln Phe Glu Ala Glu Gly Asn Pro Asp Arg Arg
300 305 310
gtagtgatat caattactcg ctagctccat tttgatttat ctgtcttact ttcctttata 4217
gtttgtttaa aagaatgcat ctttcccttt ttggctttaa ttcaacttaa attccgtgcc 4277
aagttaaaac cagcaaataa attgaaatgg tgggagtatt cagaagtcct ccaattagat 4337
gtggaagtct ttgatcaaga tgtttatttg ccaactgctt agttctgaca tgtatttgtt 4397
tgggctctcc cctattattt ctcag a ttt atg ggc act ata gtt gga att gat 4450
Phe Met Gly Thr Ile Val Gly Ile Asp
315 320
gat ctt tct tca cag tgg aaa aat tct gcg tgg cga tcc ttg aag 4495
Asp Leu Ser Ser Gln Trp Lys Asn Ser Ala Trp Arg Ser Leu Lys
325 330 335
gttgatatct acatttatat ttcagcaata ttctttaagt tcaattggaa atcaccaatt 4555
- 59 030460
ctcccttcgt tccag gtc cga tgg gac gag cct gca gcc att gca agg cct 4606
Val Arg Trp Asp Glu Pro Ala Ala Ile Ala Arg Pro
340 345
gac Asp aga Arg gtt Val 350 tct Ser cct Pro tgg Trp gaa Glu att Ile 355 aaa Lys cct Pro tat Tyr gtg Val tgt Cys 360 tca Ser att Ile cca Pro 4654
aat gtc ctt gtc cca cca acc gca gag aag aac aaa agg cat cgg cta 4702
Asn Val Leu Val Pro Pro Thr Ala Glu Lys Asn Lys Arg His Arg Leu
365 370 375
cat agt gaa atc aaa ata tca g gtctgaatga aaattctcaa cagcatggtg 4754
His Ser Glu Ile Lys Ile Ser
380 385
gtttttcatg tgttggttgc tgatatttta atttccattt tcattttctt aattatcttg 4814
cctttctttt cctgttag aa Glu caa Gln cct Pro tca Ser 390 tcc Ser tca Ser aat Asn gct Ala tcg Ser 395 gcg Ala gtt Val 4864
tgg aat cct tcc ctt cga tcg cct cag ttt aac acc ttt ggc atc aac 4912
Trp Asn Pro Ser Leu Arg Ser Pro Gln Phe Asn Thr Phe Gly Ile Asn
400 405 410
agc agt act aat tgc gca tta gcg tct ctt aca gag agt ggt tgg cag 4960
Ser Ser Thr Asn Cys Ala Leu Ala Ser Leu Thr Glu Ser Gly Trp Gln
415 420 425
ctt cct cat tta aat act tca ggt atg ctt gtg gat gag cca gaa gac 5008
Leu Pro His Leu Asn Thr Ser Gly Met Leu Val Asp Glu Pro Glu Asp
430 435 440 445
ggt agg agt gct cca act tgg tgt ggt ttt cca tgc gtt ttg gcc ccg 5056
Gly Arg Ser Ala Pro Thr Trp Cys Gly Phe Pro Cys Val Leu Ala Pro
450 455 460
cag ttc ggt caa ggg act aat cag ccg att gtt att cct act gat ggg 5104
Gln Phe Gly Gln Gly Thr Asn Gln Pro Ile Val Ile Pro Thr Asp Gly
465 470 475
aga aaa tgt gat acc aaa aaa acc tgt aga tta ttt ggt att gac ttg 5152
Arg Lys Cys Asp Thr Lys Lys Thr Cys Arg Leu Phe Gly Ile Asp Leu
480 485 490
aaa agt tcc tca att agc act act gag gca cga cta cag cta cag cca 5200
Lys Ser Ser Ser Ile Ser Thr Thr Glu Ala Arg Leu Gln Leu Gln Pro
495 500 505
gcc ggc att tct tgt gtc ttt gca gag aga gca cct cca aac acg gtg 5248
Ala Gly Ile Ser Cys Val Phe Ala Glu Arg Ala Pro Pro Asn Thr Val
510 515 520 525
cct gct ggt gat tca gat caa aag tct gag ctt tca gta gac ttc aaa 5296
Pro Ala Gly Asp Ser Asp Gln Lys Ser Glu Leu Ser Val Asp Phe Lys
530 535 540
gat caa atg caa ggc cat ttg cgg tta ccc cta aag gag gtt caa agc 5344
Asp Gln Met Gln Gly His Leu Arg Leu Pro Leu Lys Glu Val Gln Ser
545 550 555
- 60 030460
aag cag agt tgt tcc acc agg tct cgc aca aag gtattaaatc aaaagccaaa 5397
Lys Gln Ser Cys Ser Thr Arg Ser Arg Thr Lys
560 565
aaattgcatt cttaccaact cattttcgcc acaaaacata ttattaaact ctctaacatc 5457
ttttcacatg tggaatccct tgagaag gtg caa atg caa ggc gta gct gta ggt 5511
Val Gln Met Gln Gly Val Ala Val Gly
570 575
cgt gca gtg gat tta acc ata ttg aaa gga tac gat gag ctt aca aag 5559
Arg Ala Val Asp Leu Thr Ile Leu Lys Gly Tyr Asp Glu Leu Thr Lys
580 585 590
gag ctt gag gag atg ttt gaa atc caa gga gag ctt cag tca cga cag 5607
Glu Leu Glu Glu Met Phe Glu Ile Gln Gly Glu Leu Gln Ser Arg Gln
595 600 605
aaa tgg ggg atc ttg ttt aca gat gat gaa ggg gat aca atg ctt atg 5655
Lys Trp Gly Ile Leu Phe Thr Asp Asp Glu Gly Asp Thr Met Leu Met
610 615 620 625
ggt gat tat ccg tgg ca gtaagttctc tctcacttaa aaaaatttaa 5702
Gly Asp Tyr Pro Trp Gln
630
gactgaatac atatacaacc actgcataag atcttttcta caacctgtaa tttaacacat 5762
cacttaaatc acttaattgc ag a gac ttt tgc aat gtg gtg agg aag att 5812
Asp Phe Cys Asn Val Val Arg Lys Ile
635 640
ttc att tgt tca agt cag gat atg aaa aaa ttg acc ctg tct cgc gca 5860
Phe Ile Cys Ser Ser Gln Asp Met Lys Lys Leu Thr Leu Ser Arg Ala
645 650 655
gac agt taa gcagctcctt tcaaatgaaa tgatggcgga agatggtgaa 5909
Asp Ser
agttaaagac tccgcctttt gaagtggtac cgttttgtga tctctttggc ttcattctct 5969
atatatagta ggaaagaacg acaggttgtt gacatagcaa ggcgtagaag cttgttttta 6029
cgctcttttt agcctagtgc agctccgttt tgagagcagt taagtaagta actagttata 6089
ataggataag actagtaaaa atatagtact agaagtagta aaaagttaag ggtgttctct 6149
aatggggagt ctatatagta gtagtttatg tagttttcta ttcgcgcgtt aacctgtaaa 6209
tactcatgtg ccattgtagt attctggaaa tactacaatg tatggtcttg ttaacgtgct 6269
ttatgcctta tcttatatga aaactccatg gtggagattg ctctgtactt gctctttctg 6329
tatgactttt gtgatgcaca atagggattt cttgtctaaa tttagactct tttggcacaa 6389
tcatgcatca ctttgtaact ttccccttta ctgaacaaaa aaatctttca aaacgctcct 6449
tcgcgtgtgt gtttgtttta ttctttgcta aagggtgatc ctaacattta aattagatac 6509
cgttttcttt actataaggg tgacttgaac tcaaaacctg ttttattagt atgttactct 6569
atttagaagt ttaataattt attagatatg acatttctat ttaccttgct atttctttta 6629
- 61 030460
acaatattta cctttagatt tatataagtt tttgattcat taactgactt tggttaagat 6689
gttgagtgca aaataaatag atggttcatc ttttgagcta gcgtagagtc attttccttt 6749
aaactttata aagcacttac aatcacatat ttgtgcattc ttagtgcacg tttgaccatg 6809
gataattttc actattttat ggaactgtat attataattt ttttggaatt agaagaactc 6869
aaaaagactc ttttcataat tttattccga atcactcgta caaaaatcaa aaaacaattt 6929
caagttgtat tcattttcaa gcaaaagttc aatttgtcac tatcacttgt aacacaaata 6989
ttttcccttt cgaatttcac aattttaata ttctaagttc ctttttgaga acttttagtg 7049
aaaggaaaat tgggctttgt gaattgtttg gtcttcaata tccctatcct agctaggaag 7109
agtgtccata tagtcatggg cctcatgagt tgtcaaatgt tacgtaaagg tatttatctt 7169
tgcatgagtg tttggtcacg ctcaaaactt ctttattata agtctgagtc tttgtgttat 7229
gtatccatgc ttggcttgca tgatgtttgt gtcattccta atcttattga atggactata 7289
aaggacttag tcaagtataa ctataaaatg acgatagctt atagacaact tcgtagttgt 7349
tggagtatac aacacgctga catcgacttc ttggagttta gtaatcataa ttttttttaa 7409
aaaaaacaaa tctcctcaat caacttcttg attttagtag taatccatcg attcaggtac 7469
attcatgacg tgatgtgttc gattaatatt t 7500
<210> 5
<211> 21
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> праймер Slactin прямой
<400> 5
ggactctggt gatggtgtta g 21
<210> 6
<211> 19
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> праймер Slactin обратный
<400> 6
ccgttcagca gtagtggtg 19
<210> 7
<211> 26
<212> ДНК
<213> Синтетическая Sequence
<220>
<223> праймер SlARF9 прямой
- 62 030460
<400> 7
cgtaggcgtc aacaaatact tagagg 26
<210> 8
<211> 28
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> праймер S1ARF9 обратный
<400> 8
tccactgtga agaaagatca tcaattcc 28
<210> 9
<211> 27
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> праймер S1ARF9 прямой
<400> 9
caccatggca actataaatg ggtggtg 27
<210> 10
<211> 23
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> праймер S1ARF9 обратный
<400> 10
ttaactgtct gcgcgagaca ggg 23
<210> 11
<211> 36
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> праймер S1ARF9 прямой
<400> 11
aaaaagcagg ctgtcccacc aaccgcagag aagaac 36
<210> 12
<211> 37
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> праймер S1ARF9 обратный
<400> 12
agaaaagctg ggtgctgtag tcgtgcctca gtagtgc 37
- 63 030460
<210> 13
<211> 34
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> праймер SlARF9 промотор прямой
<400> 13
caccttttca aagaggtgtg acattttcaa taac 34
<210> 14
<211> 32
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> праймер SlARF9 промотор обратный
<400> 14
caaccttcaa ttccaaaaac taaagaacac cc 32
<210> 15
<211> 24
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> прямой праймер F-4008
<400> 15
aatttgagaa ttttggagct tttt 24
<210> 16
<211> 23
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> обратный праймер R-4009
<400> 16
agaacttagc cttgaatcaa cca 23
<210> 17
<211> 23
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> Прямой праймер F-4010
<400> 17
tgagtttcag gtaaaaaaga tgc 23
<210> 18
- 64 030460
<211> 24
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> обратный праймер R-4011
<400> 18
acagaaaaaa acaacaacac agaa 24
<210> 19
<211> 22
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> Прямой праймер F-4030
<400> 19
cccctgtttt gacaagttgt tg 22
<210> 20
<211> 26
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> обратный праймер R-4031
<400> 20
cattgatatc ttctgttaca ctctac 26
<210> 21
<211> 26
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> Прямой праймер F-4032
<400> 21
gtagagtgta acagaagata tcaatg 26
<210> 22
<211> 25
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> обратный праймер R-4033
<400> 22
ccagagagag atacctcaag aatac 25
<210> 23
<211> 33
<212> ДНК
<213> синтетическая
- 65 030460
<220>
<223> ген-специфический праймер для прогулки по геному
<400> 23
ttcttcagcc aggaaatgac tattgataac tcg
<210> 24
<211> 24
<212> ДНК
<213> синтетическая
<220>
<223> вложенный праймер для прогулки по геному
<400> 24
ggagaattca tattcggctg agac
<210> 25
<211> 22
<212> ДНК
<213> синтетическая
<220>
<223> прямой праймер для канамицин-устойчивого гена
<400> 25
gactgggcac aacagacaat cg
<210> 26
<211> 24
<212> ДНК
<213> синтетическая
<220>
<223> обратный праймер для канамицин-устойчивого гена
<400> 26
gctcagaaga actcgtcaag aagg
<210> 27
<211> 34
<212> ДНК
<213> синтетическая
<220>
<223> прямой праймер для AtARF9 увеличения промотора
<400> 27
aaaaagcagg cttggtggtg ggttttaagg catc
<210> 28
<211> 37
<212> ДНК
<213> синтетическая
<220>
<223> обратный праймер для AtARF9 увеличения промотора
33
24
22
24
34
- 66 030460
<400> 28
agaaaagctg ggtcacacag tctctctatc tctctcc 37
<210> 29
<211> 30
<212> ДНК
<213> синтетическая
<220>
<223> прямой праймер для AtARF9 RT-PCR
<400> 29
agaagccatg agcaataagt tctctgtagg 30
<210> 30
<211> 26
<212> ДНК
<213> синтетическая
<220>
<223> обратный праймер для AtARF9 RT-PCR
<400> 30
gggagcagtc tttcacacca ataacc 26
<210> 31
<211> 22
<212> ДНК
<213> синтетическая
<220>
<223> прямой праймер uidA
<400> 31
ctcctaccgt acctcgcatt ac 22
<210> 32
<211> 19
<212> ДНК
<213> синтетическая
<220>
<223> обратный праймер uidA
<400> 32
ccgttgactg cctcttcgc 19

Claims (11)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Нетрансгенное растение семейства Solanaceae (пасленовых) или рода Solanum, содержащее аллель Фактора 9 Ответа Ауксина (slarf9) в своем геноме, причем аллель slarf9 представляет собой аллель, кодирующий белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, отличающееся тем, что указанный аллель slarf9 содержит одну или более мутаций в его нуклеотидной последовательности, причем указанные мутации в аллеле slarf9 локализованы в экзоне 2 или в экзоне 7 или на границах интрона/экзона экзона 2 или экзона 7, и в результате указанных мутаций происходит замена глицина на серин в положении 52, и/или замена аргинина на триптофан в положении 191, и/или замена гистидина на тирозин в положении 193 последовательности SEQ ID NO: 2, и в результате указанных мутаций указанное растение, содержа- 67 030460
    щее указанный мутантный аллель в своем геноме, дает плоды значительно большего размера по сравнению с растением, содержащим аллель slarf9 дикого типа в своем геноме, причем плоды значительно большего размера являются плодами, у которых средний экваториальный диаметр, и/или средний объем, и/или средняя масса свежего плода значительно больше, чем у плодов растений, содержащих аллель slarf9 дикого типа в своем геноме.
  2. 2. Растение по п.1, в котором мутации в аллеле slarf9 локализованы на границах интрона/экзона экзона 7.
  3. 3. Растение по п.1 или 2, в котором указанный мутантный аллель slarf9 присутствует в гомозиготной форме.
  4. 4. Растение по любому из предыдущих пунктов, средний размер плода которого составляет по меньшей мере 110% размера плода растения, содержащего аллель slarf9 дикого типа.
  5. 5. Растение по любому из предыдущих пунктов, которое представляет собой гибридное растение.
  6. 6. Часть растения, в том числе плод или семя, по любому из предыдущих пунктов, содержащая в своем геноме указанный мутантный аллель slarf9.
  7. 7. Растение по п.1, причем указанное растение является растением вида Solanum Lycopersicum.
  8. 8. Растение по п.1, где среднее количество клеток в ткани перикарпия плодов и/или количество клеточных слоев в ткани перикарпия значительно больше, чем в плодах растений, имеющих аллель slarf9 дикого типа в своем геноме.
  9. 9. Применение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок SlARF9 (мутантной аллели slarf9), для получения нетрансгенных растений семейства Solanaceae (пасленовых) или рода Solanum, которые дают плоды большего размера по сравнению с растениями дикого типа, причем белок SlARF9 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты содержит одну или более мутаций, локализованных в экзоне 2 или в экзоне 7 или на границах интрона/экзона экзона 2 или экзона 7, и в результате указанных мутаций происходит замена глицина на серин в положении 52, и/или замена аргинина на триптофан в положении 191, и/или замена гистидина на тирозин в положении 193 последовательности SEQ ID NO: 2, и в результате указанных мутаций указанное растение, содержащее указанный мутантный аллель в своем геноме, дает плоды значительно большего размера по сравнению с растением, содержащим аллель slarf9 дикого типа в своем геноме, причем плоды значительно большего размера являются плодами, у которых средний экваториальный диаметр, и/или средний объем, и/или средняя масса свежего плода значительно больше, чем у плодов растений, содержащих аллель slarf9 дикого типа в своем геноме.
  10. 10. Применение по п.9, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок SlARF9, представляет собой аллель slarf9, получаемый из растений, выращиваемых из семян, депонированных под номерами NCIMB 41827, 41828, 41829, 41830 или 41831.
  11. 11. Применение по п.9 или 10, где указанное растение является растением вида Solanum Lycopersicum.
    - 68 030460
    (а)
    (е)
    bud - почка
    ovary unpollinat - завязь неопыленная ovary pollinat - завязь опыленная anther - пыльник
    petal - лепесток
    sepal - чашелистик
    pedicel - плодоножка
    hypocotyl - гипокотиль
    root - корень
EA201291466A 2010-05-28 2011-05-27 Растения с увеличенным размером плода EA030460B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10005603 2010-05-28
PCT/EP2011/058731 WO2011147968A1 (en) 2010-05-28 2011-05-27 Plants with increased fruit size

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201291466A1 EA201291466A1 (ru) 2013-05-30
EA030460B1 true EA030460B1 (ru) 2018-08-31

Family

ID=42738838

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201291466A EA030460B1 (ru) 2010-05-28 2011-05-27 Растения с увеличенным размером плода

Country Status (6)

Country Link
US (2) US20130145499A1 (ru)
EP (1) EP2575430A1 (ru)
CN (2) CN107974457A (ru)
EA (1) EA030460B1 (ru)
MX (1) MX344585B (ru)
WO (1) WO2011147968A1 (ru)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITMI20120376A1 (it) * 2012-03-09 2013-09-10 Metapontum Agrobios S R L Varianti alleliche del gene iaa9 e loro usi per la costituzione di piante partenocarpiche di pomodoro
CN105087636B (zh) * 2015-09-22 2018-05-22 江苏农林职业技术学院 基于农杆菌注射法的番茄果实基因转化方法
IL266136A (en) * 2019-04-17 2020-10-28 Univ Ramot Conjugates of auxin analogues
CN110408650B (zh) * 2019-07-25 2021-04-23 中国农业大学 NOR-like1基因及其编码的蛋白质在调控番茄果实产量中的应用
CN110698551B (zh) * 2019-11-14 2021-06-08 中国科学院东北地理与农业生态研究所 大豆生长素响应基因或其蛋白的应用
CN112048510B (zh) * 2020-09-11 2022-12-20 浙江师范大学 一个基因在增大番茄果实中的应用
CN115851823B (zh) * 2022-07-06 2023-05-30 南京林业大学 一种春兰CgARF18基因及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005001050A2 (en) * 2003-06-06 2005-01-06 Arborgen, Llc. Transcription factors

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4407956A (en) 1981-03-13 1983-10-04 The Regents Of The University Of California Cloned cauliflower mosaic virus DNA as a plant vehicle
CA1192510A (en) 1981-05-27 1985-08-27 Lawrence E. Pelcher Rna plant virus vector or portion thereof, a method of construction thereof, and a method of producing a gene derived product therefrom
NL8200523A (nl) 1982-02-11 1983-09-01 Univ Leiden Werkwijze voor het in vitro transformeren van planteprotoplasten met plasmide-dna.
US4536475A (en) 1982-10-05 1985-08-20 Phytogen Plant vector
EP0290799B9 (en) 1983-01-13 2004-09-01 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Transgenic dicotyledonous plant cells and plants
DE3484215D1 (de) 1983-01-17 1991-04-11 Monsanto Co Chimaerische gene geeignet zur expression in pflanzenzellen.
DE3464841D1 (en) 1983-01-27 1987-08-27 Gen Foods Corp Water-agglomeration method for depeptide sweetened products
NL8300699A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; werkwijze voor het produceren van agrobacterium tumefaciens bacterien; stabiele cointegraat plasmiden; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
EP0140308B2 (en) 1983-10-20 2001-10-17 The Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition utilizing mRNA interfering complementary RNA
EP0160692A1 (en) 1983-11-03 1985-11-13 DE WET, Johannes Martenis Jacob Method for the transfer of exogenous genes in plants using pollen as a vector
US6617496B1 (en) 1985-10-16 2003-09-09 Monsanto Company Effecting virus resistance in plants through the use of negative strand RNAs
FI864720A (fi) 1985-11-22 1987-05-23 Ciba Geigy Ag Direkt gentransmission i plasticider och mitokondrier.
ES2018274T5 (es) 1986-03-11 1996-12-16 Plant Genetic Systems Nv Celulas vegetales resistentes a los inhibidores de glutamina sintetasa, preparadas por ingenieria genetica.
IL81737A (en) 1986-03-28 1992-11-15 Calgene Inc Regulation of gene expression in plant cells
EP0265556A1 (en) 1986-10-31 1988-05-04 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Stable binary agrobacterium vectors and their use
IL84459A (en) 1986-12-05 1993-07-08 Agracetus Apparatus and method for the injection of carrier particles carrying genetic material into living cells
US5164316A (en) 1987-01-13 1992-11-17 The University Of British Columbia DNA construct for enhancing the efficiency of transcription
ATE112314T1 (de) 1988-05-17 1994-10-15 Lubrizol Genetics Inc Pflanzliches ubiquitinpromotorsystem.
US5693507A (en) 1988-09-26 1997-12-02 Auburn University Genetic engineering of plant chloroplasts
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US6051753A (en) 1989-09-07 2000-04-18 Calgene, Inc. Figwort mosaic virus promoter and uses
ATE196318T1 (de) 1989-10-31 2000-09-15 Monsanto Co Promotor für transgene pflanzen
US5641876A (en) 1990-01-05 1997-06-24 Cornell Research Foundation, Inc. Rice actin gene and promoter
EP0955371B1 (en) 1990-11-23 2006-02-22 Bayer BioScience N.V. Process for transforming monocotyledonous plants
EP0604662B1 (en) 1992-07-07 2008-06-18 Japan Tobacco Inc. Method of transforming monocotyledon
WO1995006722A1 (fr) 1993-09-03 1995-03-09 Japan Tobacco Inc. Procede permettant de transformer une monocotyledone avec un scutellum d'embryon immature
WO1996006932A1 (en) 1994-08-30 1996-03-07 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Plant transcription regulators from circovirus
BR9709814A (pt) 1996-06-20 1999-08-10 Scripps Research Inst Promotores do vírus mosaico na nervura da mandioca e usos dos mesmos
DK0900279T3 (da) 1997-02-20 2005-01-31 Bayer Bioscience Nv Forbedret fremgangsmåde til transformation af planter
US6369298B1 (en) 1997-04-30 2002-04-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Agrobacterium mediated transformation of sorghum
GB9710475D0 (en) 1997-05-21 1997-07-16 Zeneca Ltd Gene silencing
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
US6063985A (en) 1998-01-28 2000-05-16 The Rockefeller University Chemical inducible promotor used to obtain transgenic plants with a silent marker
CN1796556A (zh) 1998-03-20 2006-07-05 联邦科学和工业研究组织 控制基因表达
CA2325344C (en) 1998-04-08 2017-12-05 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods and means for obtaining modified phenotypes
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
AU772686B2 (en) 1999-05-19 2004-05-06 Bayer Cropscience Nv Improved method for Agrobacterium mediated transformation of cotton
US6506963B1 (en) 1999-12-08 2003-01-14 Plant Genetic Systems, N.V. Hybrid winter oilseed rape and methods for producing same
WO2007000067A1 (en) 2005-06-27 2007-01-04 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Method and system for acquiring azimuth information using signals provided by satellites
CN101451138A (zh) * 2008-12-25 2009-06-10 浙江省农业科学院 一种植物单性结实调控基因及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005001050A2 (en) * 2003-06-06 2005-01-06 Arborgen, Llc. Transcription factors

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE EMBL 1 January 2006 (2006-01-01), LU G, WU J: "Solanum lycopersicum cultivar Zhongshu No. 6 auxin response factor 9 (ARF9) mRNA, complete cds.", XP002605507 *
DATABASE EMBL 11 May 2004 (2004-05-11), "Lycopersicon esculentum clone 132441R, mRNA sequence.", XP002605508 *
DE JONG MAAIKE, ET AL: "The Solanum lycopersicum auxin response factor 7 (SlARF7) regulates auxin signaling during tomato fruit set and development", THE PLANT JOURNAL, BLACKWELL SCIENTIFIC PUBLICATIONS, OXFORD., GB, vol. 57, no. 1, 7 October 2008 (2008-10-07), GB, pages 160 - 170, XP002605509, ISSN: 0960-7412, DOI: 10.1111/J.1365-313X.2008.03671.X *
JONES BRIAN, ET AL: "Down-regulation of DR12, an auxin-response-factor homolog, in the tomato results in a pleiotropic phenotype including dark green and blotchy ripening fruit.", THE PLANT JOURNAL, BLACKWELL SCIENTIFIC PUBLICATIONS, OXFORD., GB, vol. 32, no. 4, 1 November 2002 (2002-11-01), GB, pages 603 - 613, XP002605510, ISSN: 0960-7412 *
OKUSHIMA YOKO, ET AL: "Functional genomic analysis of the AUXIN RESPONSE FACTOR gene family members in Arabidopsis thaliana: Unique and overlapping functions of ARF7 and ARF19", THE PLANT CELL, AMERICAN SOCIETY OF PLANT BIOLOGISTS, US, vol. 17, no. 2, 1 February 2005 (2005-02-01), US, pages 444 - 463, XP002605511, ISSN: 1040-4651, DOI: 10.1105/TPC.104.028316 *
ROBERTS D R, NADELLA V, WYATT S E: "ARF9 and the gravity persistent signal response", GRAVITATIONAL AND SPACE BIOLOGY BULLETIN, AMERICAN SOCIETY OF GRAVITATIONAL AND SPACE BIOLOGY, US, vol. 20, no. 2, 1 June 2007 (2007-06-01), US, pages 103 - 104, XP002605512, ISSN: 1089-988X *
WANG, D. PEI, K. FU, Y. SUN, Z. LI, S. LIU, H. TANG, K. HAN, B. TAO, Y.: "Genome-wide analysis of the auxin response factors (ARF) gene family in rice (Oryza sativa)", GENE., ELSEVIER, AMSTERDAM., NL, vol. 394, no. 1-2, 20 April 2007 (2007-04-20), NL, pages 13 - 24, XP022060277, ISSN: 0378-1119, DOI: 10.1016/j.gene.2007.01.006 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107974457A (zh) 2018-05-01
WO2011147968A1 (en) 2011-12-01
MX2012013786A (es) 2012-12-17
US20130145499A1 (en) 2013-06-06
US20160333368A1 (en) 2016-11-17
EA201291466A1 (ru) 2013-05-30
CN103220905A (zh) 2013-07-24
EP2575430A1 (en) 2013-04-10
MX344585B (es) 2016-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20160333368A1 (en) Plants with increased fruit size
US9062323B2 (en) Identification and use of KRP mutants in wheat
JP2011527891A (ja) 突然変異株ＩＮＤＥＨＩＳＣＥＮＴアレルを有するアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物
JP2008502358A (ja) 転写因子のｓｈｉｎｅクレードおよびその使用
EP2440664B1 (en) Drought tolerant plants
US11447791B2 (en) Methods and means for modulating flowering time in monocot plants
US11643665B2 (en) Nucleotide sequences encoding Fasciated EAR3 (FEA3) and methods of use thereof
WO2014069339A1 (ja) 植物に多収性を付与する核酸、収量が増加した形質転換植物を作製する方法、植物の収量を増大させる方法
US20160017347A1 (en) Terminating flower (tmf) gene and methods of use
JP2010538679A (ja) 植物の形態を改変するための組成物及び方法
JP2011507506A (ja) トリコーム特異的なプロモーター
JP2009540822A (ja) 植物の構造及び成長を調節するための植物クロマチンリモデリング遺伝子の使用
US7309816B1 (en) Zinc finger proteins expressed in plant meristem
WO2015093946A2 (en) New effects of plant ahl proteins
US20150156978A1 (en) Drought tolerant plants
US20150033415A1 (en) Nucleotide sequences encoding fasciated ear4 (fea4) and methods of use thereof
Ji Comparative genetic analyses of WOX3 and WOX4 functions during plant development
Condello et al. Characterization and function of homeobox genes encoding class2 KNOX transcription factors involved in the development of aerial organs in Prunus persica (L. Batsch)
WO2007139385A1 (en) Methods for modulating potato tuber cooking type and plant tissue texture

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU