JP2000509612A - 植物の改良された形質転換法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 単子葉植物細胞のゲノムへのＤＮＡ断片の組み込み法であって、１）ＤＮＡ断片との接触の前に、植物性フェノール性化合物を含む培地上で、非形質転換単子葉植物細胞の培養物を、細胞分裂を刺激し外来ＤＮＡの組み込み能を増強するのに充分な時間、インキュベートする工程；および２）ＤＮＡ断片が非形質転換細胞により摂取され、非形質転換細胞のゲノムに安定に組み込まれる条件下で、非形質転換細胞にＤＮＡ断片を接触させて形質転換細胞を産生する工程、を含んでなる、上記方法

Description

【発明の詳細な説明】 植物の改良された形質転換法発明の背景 （ｉ）発明の分野 本発明は、植物細胞特に単子葉植物細胞（特に、トウモロコシ、イネ、コムギ およびオオムギ細胞）の組織培養、および遺伝的に形質転換された植物細胞およ び植物を得るための改良法に関する。 （ii）関連技術の説明 長年の間、植物の遺伝的形質転換のために多くの技術が開発されてきた。これ らの方法の究極の目標は、すべての細胞が、ゲノム（特に、核ゲノム）内に安定 に組み込まれた目的の遺伝子（いわゆるトランス遺伝子）を含む外来ＤＮＡを含 有する、トランスジェニック植物を得ることである。 形質転換は、出発細胞を絶えずＤＮＡ（通常、目的の外来遺伝子を含むＤＮＡ ）に接触させる複雑なプロセスである。ＤＮＡへの細胞の接触、細胞によるＤＮ Ａの摂取およびＤＮＡの組み込み（細胞のゲノムへの目的の遺伝子の組み込みを 含む）を促進する条件下で行われる。 形質転換の出発細胞は、通常インビトロでしばらく培養された細胞である。細 胞をＤＮＡに接触させた後、形質転換された細胞は一般に、形質転換された細胞 を形質転換されていない細胞から分離するために、および形質転換された細胞か ら形質転換された植物を再生するために、インビトロで一定期間培養する必要が ある。 植物の異なる形質転換法が記載されており、直接ＤＮＡ移動法（例えば、電気 穿孔法、ＰＥＧ−介在ＤＮＡ摂取、バイオリスティックス（biolistics））、ま たはアグロバクテリウム（Agrobacterium）−介在ＤＮＡ移動法に分類される。 バシル（Vasil）（１９９４）とクリストウ（Christou）（１９９４）は、穀類 について入手できる植物形質転換法を概説している。 アグロバクテリウム−介在ＤＮＡ移動法は、植物細胞へのＤＮＡ移動の最も効 率的な方法の１つであり、必要とする技術的ハードウェアはおそらく、種々の形 質転換法の中で最も少ないであろう。また定量的には、アグロバクテリウム−介 在ＤＮＡ移動法により形質転換された植物は、染色体中の異なる位置に挿入され るトランス遺伝子の数が少ないこと、および異常なトランス遺伝子の発生頻度が 低いことで 、優れている。植物のアグロバクテリウム−介在ＤＮＡ形質転換は、あるアグロ バクテリウム株が、そのＴｉ−プラスミドの一部（すなわち、Ｔ−ＤＮＡ）を植 物細胞に導入する能力、および細胞の核ゲノム内にこのＴ−ＤＮＡを組み込む能 力に基づく。移送され組み込まれるＴｉ−プラスミドの部分は、特異的なＤＮＡ 配列（いわゆる、左および右のＴ−ＤＮＡボーダー配列）により区別され、これ らのボーダー配列の間の天然のＴ−ＤＮＡ配列は、外来ＤＮＡで置換することが できることがわかった（ヨーロッパ特許公報ＥＰ１１６７１８；デブラエレ（De blaere）ら、１９８７）。 単子葉植物のアグロバクテリウム−介在形質転換は、数回報告されている（下 記参照）。しかし、報告された方法の使用は、特定の種または遺伝子型に限定さ れているか、または特定の組織もしくは特殊なアグロバクテリウム株の使用が必 要である。報告された方法の大部分では、形質転換効率はまだ改良の余地が大き い。 フーイカース−バンスログテレン（Hooykaas-Van Slogteren）ら（１９８４） は、発ガン性のアグロバクテリウム株で感染された２つの単子葉植物種（クロロ フィツム・カペンセ（Chlorophytum capense）とスイセン属の栽培品種「ペーパ ーホワイト」（Narcissus cv 'Pagerwhite'））における、Ｔｉ−プラスミド遺 伝子発現の検出を記載している。 ヘルナルスティーンズ（Hernalsteens）ら（１９８４）とビテビアー（Bytebi er）ら（１９８７）は、天然のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agroba cterium tumefaciens）単離株ならびに非発ガン性のＴ−ＤＮＡを含むアグロバ クテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を使用する、ア スパラガス・オフィシナリス（Asparagus officinalis）の形質転換を記載して いる。 米国特許第５，１６４，３１０号は、切り出し培養した植物の苗条の頂点にア グロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を接種す る、植物（トウモロコシとコムギを含む）の形質転換法を記載している。 米国特許第５，１８７，０７３号と第５，１７７，０１０号は、急速に分裂し ている細胞を含む苗の部分で苗に傷をつけ、この傷にｖｉｒ＋アグロバクテリウ ム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を接種することを含んで なる、形質転換されたイネ科植物（トウモロコシ）の産生方法を記載している。 ＰＣＴ特許公報ＷＯ９２／０９６９６は、形質転換法の出発物質として、単子 葉植物（例えば、トウモロコシおよびイネ）の−緻密な胚発生カルス（すなわち 、トウモロコシのＩ型カルス）および未成熟胚（機械的または酵素的に傷をつけ た）の使用を記載している。 ＥＰ０６０４６６２Ａ１は、目的の遺伝子を含有するアグロバクテリウム属の 細菌による脱分化中または脱分化後に、単子葉植物の培養組織を形質転換する方 法を記載している。ＥＰ０６７２７５２Ａ１は、単子葉植物の未分化未成熟胚の 胚盤をアグロバクテリウムで形質転換する方法を記載している。いずれの特許出 願も、Ｔｉ−プラスミドまたはＲｉプラスミド以外に、Ｔｉ−プラスミドｐＴｉ Ｂｏ５４２の毒性の強い領域に由来するＤＮＡ断片を含有するプラスミドを有す るアグロバクテリウム株の使用を記載している。 ライネリ（Raineri）ら（１９９０）は、胚盤部分を傷つけたイネの２つの品 種の胚由来の培養物の、アグロバクテリウム介在遺伝子移動システムを使用する 形質転換を記載している。 チャン（Chan）ら（１９９３）は、ジャガイモ懸濁培養細胞を含有する培地上 でアグロバクテリウム株を接種して、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（「２, ４−Ｄ」）の存在下で２日間培養したイネの未成熟胚を形質転換する方法を記載 している。 ムーネイ（Mooney）ら（１９９１）は、コムギの酵素処理した胚へのカナマイ シン耐性遺伝子の、アグロバクテリウム−介在導入法を記載している。 形質転換を増強するための同時培養の前の、アセトシリンゴン（acetosyringo ne）とのアグロバクテリウム株のインキュベート、およびこの細菌との植物細胞 の同時培養の間のアセトシリンゴンの添加による、アグロバクテリウム株のＴｉ −プラスミドまたはヘルパープラスミドのｖｉｒ遺伝子の誘導が、報告されてい る（バン・ウォルドラゲンとドンス（Van Wordragen and Dons）、１９９２；ジ ャック（Jacq）ら、１９９３；ジェームス（James）ら、１９９３）。 グイバルチ（Guivarc'h）ら（１９９３）は、ニンジンの根の円盤状組織をア セトシリンゴンで１０分間という短時間だけ前処理する、この組織の一過性アグ ロバクテリウム−介在形質転換の改良を記載している。発明の要約と目的 単子葉植物細胞（特に、トウモロコシ、イネ、コムギまたはオオムギ細胞）の ゲノムへのＤＮＡ断片の組み込み法であって、 １）ＤＮＡ断片との接触の前に、植物性フェノール性化合物（特に、アセトシ リンゴン、α−ヒドロキシ−アセトシリンゴン、シナピン酸、シリンジ酸（syri ngic acid）、フェルリ酸（ferulic acid）、カテコール、ｐ−ヒドロキシ安息 香酸、β−レソルシル酸（β-resorcylic acid）、プロトカテク酸、ピロガロー ル酸、没食子酸、およびバニリンから選択される植物性フェノール性化合物）を 含む培地上で、非形質転換単子葉植物細胞の培養物を、細胞分裂を刺激し外来Ｄ ＮＡの組み込み能を増強するのに充分な時間、好ましくは約１〜１０日間、特に 約４〜５日間、インキュベートする工程；および ２）ＤＮＡ断片が非形質転換細胞により摂取され、非形質転換細胞のゲノムに 安定に組み込まれる条件下で、非形貫転換細胞にＤＮＡ断片を接触させて、特に 電気穿孔法、ポリエチレングリコールを使用する直接遺伝子移動、ＤＮＡコーテ ィングしたマイクロプロジェクタイルによる衝撃、またはＤＮＡ断片を含むアグ ロバクテリウム株との同時培養法により、形質転換細胞を産生する工程、 を含んでなる、上記方法が提供される。 場合により、形質転換した細胞は再生して、トランスジェニック単子葉植物に することができる。 さらに、トウモロコシ植物の細胞のゲノム内にＤＮＡ断片を組み込むための方 法であって、 ＤＮＡ断片と接触させる前に、Ｉ型カルス、特に断片（特に、最大０．５〜５ mmの長さの断片）に切断したＩ型カルスを、植物性フェノール性化合物（アセト シリンゴン、α−ヒドロキシ−アセトシリンゴン、シナピン酸、シリンジ酸（sy ringic acid）、フェルリ酸（ferulic acid）、カテコール、ｐ−ヒドロキシ安 息香酸、β−レソルシル酸（β-resorcylic acid）、プロトカテク酸、ピロガロ ール酸、没食子酸、およびバニリンから選択される植物性フェノール性化合物） と、細胞分裂を刺激し外来ＤＮＡの組み込み能を増強するのに充分な時間、好ま しくは約１〜１０日間、特に約４〜５日間、インキュベートする工程；または ＤＮＡ断片と接触させる前に、Ｉ型カルスを、植物性フェノール性化合物を含 む培地上で、細胞分裂を刺激し外来ＤＮＡの組み込み能を増強するのに充分な時 間インキュベートした後、Ｉ型カルスを断片（特に、最大０．５〜５mmの長さの 断片）に切断する工程；および ２）ＤＮＡ断片が非形質転換細胞により摂取され、非形質転換細胞のゲノムに 安定に組み込まれる条件下で、非形質転換細胞にＤＮＡ断片を接触させて、特に 電気穿孔法、ポリエチレングリコールを使用する直接遺伝子移動、ＤＮＡコーテ ィングしたマイクロプロジェクタイルによる衝撃、またはＤＮＡ斯片を含むアグ ロバクテリウム株との同時培養法により、形質転換細胞を産生する工程、 を含んでなる、上記方法が提供される。 また、植物性フェノール性化合物の存在下で単子葉植物中の安定な形質転換の 頻度を増加させる方法が提供され、ここで植物性フェノール性化合物は、培養組 織に外来ＤＮＡを接触させる前に植物細胞が培養される培地中に含有される。 さらに、少なくとも２つの植物性フェノール性化合物を含む植物培地組成物が 提供される。好適な実施態様の詳細な説明 本発明は、植物のカルス、特にトウモロコシのカルス（特に、トウモロコシの 細かく切断したＩ型カルス）を、植物性フェノール性化合物（例えば、アセトシ リンゴン）を含む培地上で約５日間培養すると、細胞分裂が大きく刺激され、ア グロバクテリウム−介在形質転換により細胞内に移送された外来ＤＮＡのゲノム 中への組み込み能が増強されたカルスを再現性良く産生する（これは標準的条件 下で回収された形質転換細胞および植物の数に反映される）という観察に基づく 。 本明細書において使用される「非形質転換細胞」とは、本発明の方法を応用す る時使用されるであろう特定のＤＮＡ断片に接触していない細胞を意味する。こ のような細胞はまた、異なるかまたは同じＤＮＡ断片であらかじめ形質転換した トランスジェニック植物または植物組織から得られることは言うまでもない。 本明細書において使用される「形質転換の効率」または「形質転換の頻度」と は、標準的実験条件下（すなわち、外来ＤＮＡと接触した細胞の量、送達された ＤＮＡの量、ＤＮＡ送達のタイプと条件、および一般的培養条件など）で回収さ れる形 質転換細胞（または、個々の形質転換細胞から増殖させたトランスジェニック生 物）の数により測定することができる。例えば、カルス断片が形質転換の出発物 質として使用される時、形質転換の頻度は、形質転換された１００個のカルスに ついて得られるトランスジェニック植物株の数で表現することができる。本発明 の方法を使用して、約１％またはそれ以上の形質転換頻度が得られた。 本明細書において使用されるトランスジェニック「植物株」は、再生プロセス の間に得られたある単位の培養細胞（例えば、１つの形質転換されたカルス片） 由来の、トランスジェニック植物の群から構成される。一般に、１つの植物株か らの植物は遺伝的に同一であり、１つの形質転換事象に由来し、従って同じゲノ ム位置に組み込まれた同じトランス遺伝子を含む。しかし、本明細書で定義され た１つの植物株からの個々の植物は、特にアグロバクテリウム−介在ＤＮＡ移動 法を使用する時、独立した形質転換に由来することができ、従って互いに異なる こともある。形質転換頻度を１００個の最初のカルス片当たりの植物株の数で表 すと、実際の形質転換頻度（形質転換の頻度／１００個の最初のカルス片）はさ らに高くなる。 本発明に適した「植物性フェノール性化合物」または「植物のフェノール性物 質」とは、陽性の走化性応答を誘導することができる、単離され置換されたフェ ノール性分子、特にアグロバクテリウム種を含有するＴｉ−プラスミド（特に、 アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を含有 するＴｉ−プラスミド）中でｖｉｒ遺伝子発現の増加を誘導することができるも のである。植物性フェノール性化合物に対する走化性応答を測定する方法は、ア シュビ（Ashby）ら（１９８８）により記載され、ｖｉｒ遺伝子発現の誘導を測 定する方法も公知である（スタチェル（Stachel）ら、１９８５；ボルトン（Bol ton）ら、１９８６）。 植物性フェノール性化合物を含有する培地上の植物組 織のインキュベーションが形質転換効率に及ぼす有効な作用は、主に細胞分裂の 誘導および植物細胞のゲノム内への外来ＤＮＡの取り込み能の増強が原因である と考えられている。多くの単子葉植物（特に、穀類植物）は傷がつくと、多くの 双子葉植物で観察されたものと類似の方法では応答しない（ポトリクス（Potryk us）、１９９１）。植物性フェノール性化合物を外から供給すると、特に単子葉 植物に適用した時に傷様の応答を引き起こすことがあることが知られている。前 処理した植物組織に摂取される植物性フ ェノール性化合物の残存濃度によるｖｉｒ遺伝子の誘導はまた、形質転換効率に 影響を及ぼすが、この作用はあまり重要ではないと考えられている。確かに、直 接ＤＮＡ移動法を使用して、形質転換の同様の増強が観察された。 好適な植物性フェノール性化合物は、植物細胞の傷滲出液中に存在するもので ある。最もよく知られている植物性フェノール性化合物の１つは、アセトシリン ゴンであり、これは濃度が異なるが、種々の多くの植物の傷ついた細胞および無 傷の細胞中に存在する。しかし、アセシリンゴン（３，５−ジメトキシ−４−ヒ ドロキシアセトフェノン）は、ｖｉｒ遺伝子の発現を誘導することができる唯一 の植物性フェノール性物質ではない。他の例には、α−ヒドロキシ−アセトシリ ンゴン、シナピン酸（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸）、シリン ジ酸（syringic acid）（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸）、フ ェルリ酸（ferulic acid）（４−ヒドロキシ−３−メトキシケイ皮酸）、カテコ ール（１，２−ジヒドロキシベンゼン）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸（４−ヒドロ キシ安息香酸）、β−レソルシル酸（β-resorcylic acid）（２，４−ジヒドロ キシ安息香酸）、プロトカテク酸（３，４−ジヒドロキシ安息香酸）、ピロガロ ール酸（２，３，４−トリヒドロキシ安息香酸）、没食子酸（３，４，５−トリ ヒドロキシ安息香酸）、およびバニリン（３−メトキシ−４−ヒドロキシベンズ アルデヒド）があり、これらの植物性フェノール性化合物は、培地中のアセトシ リンゴンの代わりに使用しても同様の結果が得られることが知られているかまた は得られることが期待される。本明細書において使用される上記の分子は、植物 性フェノール性化合物と呼ぶ。 植物性フェノール性化合物は、単独でまたは他の植物性フェノール性化合物と 組合せて、植物の培地に加えることができる。植物性フェノール性化合物の特に 好適な組合せは、少なくともアセトシリンゴンとｐ−ヒドロキシ安息香酸とを含 有するが、２つまたはそれ以上の植物性フェノール性化合物の他の組合せも、相 乗的に作用して形質転換効率を増強するであろう。 さらに、浸透圧保護物質（例えば、Ｌ−プロリン、好ましくは約７００mg/lの 濃度、またはベタイン）、植物ホルモン（特に、ＮＡＡ）、オピネス（opines） 、または糖などの化合物は、植物性フェノール性化合物と一緒に添加されると相 乗作用を示すと予想される。 本発明は、植物細胞（特に、トウモロコシ細胞）への改良されたアグロバクテ リウムー介在ＤＮＡ移動法に特に有川であるが、植物性フェノール性化合物で前 処理した植物細胞（特に、単子葉植物）の培養物もまた、直接ＤＮＡ移動法（例 えば、ＰＥＧ介在ＤＮＡ移動、粒子衝撃法または電気穿孔法）を使用して、形質 転換の効率を改良するのに使用することができる。すなわち、基本的には本発明 は、細胞が培養される培地中に、一定時間植物性フェノール性化合物（例えば、 アセトシリンゴン）を含有させることにより、植物細胞（特に、単子葉植物細胞 、特にトウモロコシ細胞）の遺伝的形質転換のための既存法の改良を提供する。 特に植物細胞または植物組織は、アセトシリンゴン（１００〜２００μＭ）を含 有する培地で５日間培養した後、細胞を外来ＤＮＡと接触させて、これを直接ま たは電気穿孔法、ＰＥＧ介在ＤＮＡ移動または粒子衝撃法、または好ましくはア グロバクテリウム−介在ＤＮＡ移動法により、細胞に導入する。 好適な実施態様において本発明の方法は、植物細胞（特に、トウモロコシ細胞 ）へのアグロバクテリウム−介在ＤＮＡ移動の形質転換頻度を改良するために使 用される。 植物細胞、特に単子葉植物細の遺伝的形質転換のための多くの従来法では、培 養細胞、組織または外植体が出発物質として使用され、このような培養物中の細 胞は、細胞のゲノム内への外来ＤＮＡの摂取を促進する条件下で、少なくとも１ つの目的の遺伝子（すなわち、トランス遺伝子）を含む外来ＤＮＡと接触させら れるであろう。植物細胞、組織、器官または外植体の培養に適した培地は、一般 に当該分野で公知である。好適な植物培地は、化学的組成が公知の規定培地であ る。 本発明のある実施態様において、植物性フェノール性化合物特にアセトシリン ゴンは、約４〜５または６日間（好ましくは、少なくとも５日間）培地に加えた 後、細胞を外来ＤＮＡと接触させることが好ましい。培養細胞をアセトシリンゴ ンのような植物性フェノール性化合物を含有する培地中でインキュベートする正 確な期間は、決定的に重要ではないと考えられているが、おそらく２週間を超え ない方がよい。１〜１０日間（特に，３〜７日間）が最適な期間であるが、約４ 〜５または６日間インキュベートした後に接触させると最良の結果が得られるよ うである。一般に、接触時間の前に、約５日間植物性フェノール性化合物を培地 に添加することが 有用な期間であると考えられている。 培養組織は、植物性フェノール性化合物含有培地（特に培地に没食子酸を加え た時）でインキュベートすると褐色化または限定的壊死を示すことがあることに 注意されたい。しかし、これらの培養細胞、組織または外植体を使用すると、形 質転換効率が改良される。 培地中の植物性フェノール性化合物の濃度はまた、組み込み形質転換能の進展 に影響を与えると考えられ、これは細胞の性質（種、組織外植体、一般的培養条 件など）に依存して変化する。しかし、ある濃度範囲内では、特に培養細胞が７ 日を超えてインキュベートされない時は、その作用は小さい。培地中の植物性フ ェノール性化合物の最適濃度範囲は、その組織、細胞または細胞培養物が得られ る種、または使用される組織のタイプにより変動するが、多くの目的（例えば、 トウモロコシ由来の物質と使用する時）にとって約１００μＭ〜２００μＭが適 当な濃度であると予測される。最適濃度はまた、使用する特定の植物性フェノー ル性化合物の性質、特にその細胞分裂促進能に依存する。 例えば、アセトシリンゴンの最適濃度は、約２００μＭであることが見いださ れたが、形質転換効率に対する良好な作用を得るのに、約２５μＭという低い濃 度が使用できる。同様に、約４００μＭまでの高い濃度が同様の作用を示すと予 測される。 他の植物性フェノール性化合物にも同様の濃度が適用され、本発明に従う実験 により最適濃度は容易に確立することができる。 上記のように、植物形質転換法は一般に、培養組織に外来ＤＮＡを接触させる 前に、細胞、細胞培養物、組織または外植体の培養を行う。形質転換法の出発物 質としていくつかの組織が記載されており、例えば、乾燥種子、未成熟胚、未成 熟の花、葯、花粒粉、胚盤、節、若い葉の基部、胚軸外植体、根（特に、根の先 端）、緻密な胚カルス（例えば、トウモロコシのＩ型）、もろい胚カルス（例え ば、トウモロコシのII型）、懸濁培養物、懸濁細胞凝集物の培養物、体細胞胚お よび苗条頂端があるが、これらに限定されない。外来ＤＮＡに接触させる前に、 これらの組織、細胞、細胞培養物または外植体がインキュベートされる培地中に 植物性フェノール性化合物（特に、アセトシリンゴン）を含有させると、特にア グロバクテリウム− 介在形質転換を使用する時に、形質転換効率が改善されるであろう。 「（植物）培地上でインキュベートする」という用語を用いる時はいつも、培 地は液体または個体であることは明白である。本発明の範囲において、植物培地 は、少なくとも１つの植物性フェノール性化合物を含む。 形質転換法の究極的目標が、植物特に表現型が正常な植物を再生することであ る時、出発物質は、先行技術で広く記録されているような再生能があることは当 然である。 特に好適な実施態様において、形質転換能のある植物細胞、好ましくはアグロ バクテリウム形質転換能のある植物細胞は、植物性フェノール性化合物（好まし くはアセトシリンゴン）を含有する培地上に、緻密な再生可能なカルス（例えば 、トウモロコシＩ型カルス）を含有させることにより産生できる。この目的のた めに、緻密なカルスは、小さい断片に切断することにより分割される。得られる カルスは、全体または少なくとも一部が、カルスの再生可能な（例えば、胚形成 性）部分を含む。カルス断片はまた、好ましくは最大長が０．５〜５mm、特に１ 〜２mm、さらに詳しくは１．２５〜１．７５mmであり、好ましくは最小長が約０ ．１mmである。しかし、約１cmまでの大きなＩ型カルス断片を使用することが好 ましい。植物性フェノール性化合物含有培地で培養した後、さらに傷つけたり酵 素的前処理をすることなく、カルスを外来ＤＮＡ、好ましくは外来ＤＮＡを含有 するアグロバクテリウムに接触させる。 あるいは、傷つける（すなわち、切断する）ことなく、植物性フェノール性化 合物を含有する培地上で緻密なカルスをインキュベートし、次に傷をつけ、すな わち小さい断片（特に、上記サイズを有する断片）に切断してから、接触工程を 行う。 別の実施態様において、形質転換能のある、特にアグロバクテリウム−形質転 換能のある細胞を、植物性フェノール性化合物（好ましくはアセトシリンゴン） 含有培地上で、未成熟胚（好ましくは、トウモロコシの未成熟胚）をインキュベ ートして作成する。この点でトウモロコシのような植物については、未成熟胚は 、最大長が約０．５〜２mm、好ましくは０．５〜１．５mmであることが好ましい が、０．５〜１mmの長さの小さい胚も使用することができる。植物性フェノール 性化合物含有培地で培養後、さらに傷害または酵素的前処理をすることなく、未 成熟胚を外来Ｄ ＮＡ（好ましくは、外来ＤＮＡを含むアグロバクテリウム）と接触させることが できる。 本発明を使用して、異なる遺伝子型のトウモロコシ、特に、トウモロコシ、Ｐ ＨＨ［（Ｐａ９１×Ｈ９９）×Ｈ９９］、Ｐａ９１ ＨＥ８９またはＰＨＰ［（ Ｐａ９１×Ｈ９９）×Ｈ９１］に、アグロバクテリウム−介在ＤＮＡ移動を行う ことができる。従って、本発明は遺伝子型に制限されることなく、特にトウモロ コシの形質転換に使用することができると考えられる。 植物細胞特に本発明のトウモロコシ細胞を前培養すると、アグロバクテリウム −介在ＤＮＡ移動の形質転換効率が上昇し、この作用は、アグロバクテリウム宿 主の染色体バックグランド、使用されるＴｉ−プラスミド、ヘルパー−プラスミ ドまたはＴ−ＤＮＡベクターのタイプに依存しない。従って本発明の方法は、効 率的に使用できるアグロバクテリウム株の範囲を拡大する。 特に好適な細菌の染色体バックグランドは、アグロバクテリウム・ツメファシ エンス（A．tumefaciens）Ｃ５８Ｃ１（バン・ラレベケ（Van Larebeke）ら、１ ９７４）、Ａ１３６（ワトソン（Watson）ら、１９７５）、またはＬＢＡ４０１ １（クラプウィジク（Klapwijk）ら、１９８０）により提供される。 好適な実施態様において、植物性フェノール性化合物とともに前培養される植 物組織を形質転換するのに使用されるアグロバクテリウム株は、Ｌ，Ｌ−スクシ ンアモピン型Ｔｉ−プラスミド（好ましくは、武装していない（disarmed）もの 、例えばｐＥＨＡ１０１）を含有する。 別の好適な実施態様において、植物性フェノール性化合物とともに前培養した 植物組織を形質転換するのに使用されるアグロバクテリウム株は、オクトピン型 Ｔｉ−プラスミド（好ましくは、武装していない（disarmed）もの、例えばｐＡ Ｌ４４０４）を含有する。一般にオクトピン型Ｔｉ−プラスミドまたはヘルパー プラスミドを使用する時は、ｖｉｒＦ遺伝子は削除されるかまたは不活性化され ることが好ましい（ジャルスチョウ（Jarschow）ら、１９９１）。 本発明の方法はまた、特定のアグロバクテリウム株と組合せて使用して、さら に形質転換効率を上げることができ、例えば、ｖｉｒ遺伝子発現および／または その誘導が、突然変異またはキメラｖｉｒＡもしくはｖｉｒＧ遺伝子の存在のた めに変 化しているアグロバクテリウム株が使用できる（例えば、ハンセン（Hansen）ら 、１９９４；チェンとウィナンス（Chen and Winans）、１９９１；シェーレン −グルート（Scheeren-Groot）ら、１９９４）。 別の実施態様において、迫加のｖｉｒＧ遺伝子コピー（特に、ｐＴｉＢｏ５４ ２由来のいわゆるスーパーｖｉｒＧ遺伝子）（好ましくは、多重コピープラスミ ドに連結している）を含有するアグロバクテリウム株は、形質転換効率をさらに 上げるために使用することができる。 本発明のさらに別の実施態様において、使用されるアグロバクテリウム株は、 アグロバクテリウム中で発現される追加のｖｉｒＢ１１遺伝子コピー（特に、ｐ ＴｉＢｏ５４２由来のｖｉｒＢ１１遺伝子）を含有する。これは、ｖｉｒＢオペ レーターの他の介在コード領域の無い、アグロバクテリウム中で発現可能なプロ モーター（例えば、単離したｖｉｒＢプロモーター）に機能的に結合したｖｉｒ Ｂ１１コード領域を含むキメラ遺伝子を提供することにより行われる。 植物細胞特にトウモロコシ細胞と同時培養されるアグロバクテリウム細胞は、 当業者に公知の如く、アセトシリンゴンまたは他の植物性フェノール性化合物と ともにプレインキュベートされるか、またはその培地から単離した後直接使用す ることができる。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tume faciens）の特に好適な誘導条件は、ベルナーデ（Vernade）ら（１９８８）によ り記載されている。 本発明の方法は原理的に、植物細胞特にトウモロコシ細胞を任意の外来ＤＮＡ で形質転換するために使用することができる。一般に外来ＤＮＡは、１）形質転 換される種である真核細胞（例えば、植物）中でＤＮＡからＲＮＡへの転写を指 令することができるプロモーターを有するプロモーター領域と、２）ＲＮＡ（例 えば、アンチャンスＲＮＡまたはリボザイム）またはタンパク質をコードするコ ード領域とを含む、目的の少なくとも１つの遺伝子を含む。目的の遺伝子はまた しばしば、３）ポリアデニル化シグナルを含有する真核生物遺伝子の３’非翻訳 領域を含む。プロモーターは、真核生物の選択された組織中で発現を指令するた めに選択することができる。例えば、植物のおしべ細胞中で選択的に発現を指令 するプロモーター（例えば、タペツム（tapetum））が知られており、このよう なプロモーターは、雄の 不稔植物と、ハイブリッドを産生するのに有用な他の植物とを産生するのに使用 されている（ＥＰ３４４０２９；ＥＰ４１２９１１；ＷＯ９２１３９５６：ＷＯ ９２１３９５７；マリアニ（Mariani）ら、１９９０；マリアニ（Mariani）ら、 １９９２）。 本発明の方法で使用される外来ＤＮＡはまた好ましくは、その発現が、非形質 転換細胞（または生物）から形質転換細胞（または生物）を選択することを可能 にする選択マーカー遺伝子を含有する。このような選択マーカー遺伝子は一般に 、通常は細胞にとって毒性である抗生物質または他の化学的化合物に対して、細 胞に耐性を与えるタンパク質をコードする。従って植物において選択マーカー遺 伝子は、除草剤、例えば活性成分としてグルタミンシンターゼインヒビター（例 えば、ホスヒノトリシン（phosphinothricin））を含有する除草剤に対して耐性 を与えるタンパク質もコードする。このような遺伝子の例は、ｓｆｒ遺伝子また はｓｆｒｖ遺伝子のようなホスヒノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコー ドする遺伝子である（ＥＰ２４２２３６；ＥＰ２４２２４６；デブロック（De B lock）ら、１９８７）。 従って本発明は、ＤＮＡ移動、特に植物細胞（特に、単子葉植物細胞、特にト ウモロコシ細胞、しかしイネ、コムギまたはオオムギ細胞も含む）のアグロバク テリウム−介在ＤＮＡ移動の形質転換効率を上昇させるための、迅速かつ効率的 で再現性のある方法を提供する。さらにアグロバクテリウム−介在形質転換法は 、直接遺伝子移動法より、細胞のゲノムに組み込まれるトランス遺伝子コピー数 の限定された（特に、１つのトランス遺伝子コピーを有する）、より多数のトラ ンスジェニック植物（特に、トウモロコシ植物）を生成する。さらに、そのゲノ ム内に２つ以上のトランス遺伝子コピーが組み込まれている、アグロバクテリウ ム−介在形質転換により得られるトランスジェニック植物（特に、トランスジェ ニックトウモロコシ植物）は、異なるコピーが独立に遺伝される子孫植物をしば しば産生し、子孫植物中の異なるトランス遺伝子コピーの分離を可能にする。従 って、直接遺伝子移動法で得られるトランスジェニック植物の集団より、本発明 の形質転換法により低レベルトランスジェニック植物の集団中に、目的の特徴を 有する高い比率の「エリート」トランス遺伝子植物が見いだされると予測される 。本発明は単子葉植物に特に有 用であるが、本発明の方法の出発物質として双子葉植物の培養細胞を使用しても 、同様の結果が得られると予測される。 以下の例において本発明を詳細に説明する。以下の例において特に明記しなけ れば、すべての組換えＤＮＡ法は、サムブルーク（Sambrook）ら（１９８９）モ レキュラークローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning：A Laborator y Manual）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold S pring Harbor Laboratory Press）、ニューヨーク、およびアウスベル（Ausubel ）ら（１９９４）、カレントプロトコールズインモレキュラーバイオロジー、カ レントプロトコールズ（Current Protocols in Molecular Biology，Current Pr otocols）、アメリカ合衆国、に記載の標準的方法に従って行う。植物の分子学 的作業の標準的材料や方法は、アール・ディー・ディー・クロイ（R.D.D．Croy ）のプラントモレキュラーバイオロジーラボファックス（Plant Molecular Biol ogy Labfax）（１９９３）Ｉビオスサイエンティフィック出版（BIOS Scientifi c Publications Ltd）（英国）とブラックウェルサイエンティフィック出版（Bl ackwell Scientific Publications）（英国）との共同出版］に記載されている 。 本発明の例および説明において、配列リストの以下の配列が参照される： 配列番号１：ｐＧＶＳ７１のＴ−ＤＮＡのヌクレオチド配列 配列番号２：ａｄｈｌイントロンを含むｂａｒ遺伝子のコード領域のヌクレオチ ド配列 配列番号３：ｐＧＶＳ８のＴ−ＤＮＡのヌクレオチド配列 配列番号４：オリゴヌクレオチドＶＧ４０のヌクレオチド配列 配列番号５：オリゴヌクレオチドＶＧ４１のヌクレオチド配列 実験：例で使用される培地、プラスミドおよび細菌株１．１．培地 例を通して、植物組織の培養のために以下の培地を使用した： − Ｍａｈｉｌ VII：Ｎ６培地（チュー（Chu）ら、１９７５）に、１００mg/l カゼイン加水分解物、６mM Ｌ−プロリン、０．５g/l ２−（Ｎ−モルホリノ） エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、０．２Ｍマンニトール、２％シヨ糖、１mg/l ２ ，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、２．５g/l ゲルライト（Gelrit e）を補足し 、ｐＨ５．８に調整する。 − ＬｓＩＤｈｔ１．５VII：ＭＳ塩（ムラシゲとスクーグ（Murashige and Sko og）、１９６８）に、０．５mg/lニコチン酸,０．５mg/l ピリドキシンＨＣｌ 、１mg/lチアミンＨＣｌ １００mg/lミオ−イノシトール、６mM Ｌ−プロリン 、０．５g/l ＭＥＳ、２０g/lショ糖、１０g/lグルコース、１．５mg/l ２，４ −Ｄ、２．５g/lゲルライト（Gelrite）を補足し、ｐＨ５．２に調整する。 − ＬＳＩ：ＭＳ塩に、ＬＳＩＤｈｙ１．５VIIのビタミン、１g/lのカザミノ酸 、０．２Ｍショ糖、０．２Ｍグルコース、１．５mg/l ２，４−Ｄ、２．５g/l ゲルライト（Gelrite）を補足し、ｐＨ５．２に調整する。 − Ａｈｘ１．５Vllｐ５００ｉｎｏ１０００ｐｐＴ１０:ＭＳ塩に、１０００mg /lミオ−イノシトール、０．５g/l ＭＥＳ、３０g/lショ糖、１０g/lグルコース 、１．５mg/l ２，４−Ｄ、２．５g/lフィタゲル（Phytagel）、１０mg/lグル ホシネート−アンモニウム、５００mg/lカルベニシリンを補足し、ｐＨ５．８に 調整する。 − Ｍｈ１VII ｐ５００ｐｐＴ５：Ｎ６培地に、０．５g/lＭＥＳ、２０g/lショ 糖、１mg/l ２，４−Ｄ、５g/lグルホシネート−アンモニウム、５００mg/lカ ルベニシリンを補足し、ｐＨ５．８に調整する。 − Ａ３７VII ｐ５００ｐｐＴ２：ＭＳ塩に、０．５g/l ＭＥＳ、３０g/lショ 糖、５mg/lゼアチン、２．５g/lフィタゲル（Phytagel）、２mg/lグルホシネー ト−アンモニウム、５００mg/lカルベニシリンを補足し、ｐＨ５．８に調整する 。 − ＬＳIIＤｈｙ１．５XI：ＬＳＩＤｈｙ１．５VII培地と同様であるが、６mM Ｌ−プロリンの代わりに１g/lのカサイノー酸（casaino acids）、そして２．５ g/lゲルライト（Gelrite）の代わりに０．５％アガロースＢＲＬウトルラピュア （BRL Utlra Pure）を使用した。 − Ａ６％Vll ｐ５００ｐｐＴ２：ＭＳ塩に、０．５g/l ＭＥＳ、６０g/lショ 糖、２．５g/lフィタゲル（Phytagel）、２mg/lグルホシネート−アンモニウム 、５００mg/lカルベニシリンを補足し、ｐＨ５．８に調整する。１．２． Ｔ−ＤＮＡベクター： 例を通して、以下のＴ−ＤＮＡベクターを使用した： − ｐＧＳＶ７１：ｐＧＳＣ１７００（コルネリセンとバンデビーレ（Cornelis sen and Vandewiele）、１９８９）由来のＴ−ＤＮＡベクターであるが、β−ラ クタマーゼ遺伝子が欠如していることと、Ｔ−ＤＮＡが存在することで異なり、 配列番号１の配列を特徴とする。ｐＧＶＳ７１は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター に機能的に結合した選択性キメラｂａｒマーカー遺伝子と、ノパリンシンターゼ 遺伝子の３’末端を有する。 − ｐＴＣＯ１１４：ｐＧＶＳ７１に類似のＴ−ＤＮＡベクターであるが、ｂａ ｒ遺伝子のコード配列（ヌクレオチド１４３７位からヌクレオチド１９８８位ま での配列番号１のヌクレオチド配列）が、トウモロコシのａｄｈ１遺伝子のイン トロンを含むｂａｒ遺伝子の配列（配列番号２のヌクレオチド配列）により置換 されている。 − ｐＴＣＯ１２１：約１．３kbのＢｇｌII−ＳｐｈＩ断片上にｐＴｉＢｏ５４ ２由来の追加のｖｉｒＧ遺伝子を有するＴ−ＤＮＡベクター。Ｔ−ＤＮＡは基本 的にｐＴＣＯ１１４と同じである。このベクターは以下の方法で作製された： 約１．３kbのＢｇｌII−ＳｐｈＩ断片を、ｐＣＮＬ２（リウ（Liu）ら、１９ ９２）から精製した。この断片は、ｖｉｒＢオペロンの３’末端、完全なｖｉｒ Ｇ遺伝子、およびｐＴｉＢｏ５４２からのｖｉｒＣオペロンの３’末端を有する 。この断片をＴ４ポリメラーゼで処理して平滑末端とし、ＸｂａＩで線状化しク レノウで処理したｐＧＳＶ８に連結し、ｐＧＳＶ１５を得た。ｐＧＳＶ８は、ｐ ＧＳＣ１７００（コルネリセンとバンデビーレ（Cornelissen and Vandewiele） 、１９８９）由来のＴ−ＤＮＡベクターであるが、β−ラクタマーゼ遺伝子が欠 如していることと、Ｔ−ＤＮＡが存在することで異なり、配列番号３の配列を特 徴とする。次の工程で、キメラ選択性ｂａｒマーカーを有するＴ−ＤＮＡをｐＧ ＳＶ１５に導入した。このために、ｐＧＳＶ１５の約１．２kbのＥｃｏＲＩ−Ｂ ｓｔＥII断片（ｐＧＳＶ１５のＴ−ＤＮＡ内のＥｃｏＲＩ部位）を、Ｔ−ＤＮＡ を含むｐＴＣＯ１１４（右の境界を除く）からの約４kbのＥｃｏＲＩ−ＢｓｔＥ II断片で置換し、ｐＴＣＯ１２１を得た。 − ｐＶＥ２００：ｐＴＣＯ１２１として同じＴ−ＤＮＡを有するＴ−ＤＮＡベ クターであり、ｖｉｒＢオペロン（ｖｉｒＢ１１読みとり枠を含む）の３’末端 、完 全なｖｉｒＧ遺伝子、およびｖｉｒＣオペロンの３’末端を含む、類似のｐＴｉ Ｂｏ５４２断片を有するが、ｖｉｒＢオペロンの３’末端は、ＰＣＲ増幅したｖ ｉｒＢプロモーター断片により機能的に結合（すなわち、これに先行される）さ れている。このベクターは以下の方法で作製した： − プライマーＶＧ４０（配列番号４）とＶＧ４１（配列番号５）および鋳型と してＡ３４８（ｐＳＭ３０）（スタチェルとネスター（Stachel and Nester）、 １９８６）からの総ＤＮＡを使用して標準的ポリメラーゼチェイン反応により、 ｖｉｒＢプロモーター断片を増幅した。ダス（Das）ら（１９８６）が記載した ｖｉｒＢプロモーターを含む、約３９０塩基対の得られた断片（基本的に、ＥＭ ＢＬ受け入れ番号Ｊ０３２１６のヌクレオチド４７５〜ヌクレオチド７６４の配 列に対応する）を、ＸｂａＩとＮｈｅＩで消化し、Ｘｂａｌで線状化したｐＣＮ Ｌ２（リウ（Liu）ら、１９９２）に連結して、ｐＶＥ１９４を得た。ｐＶＥ１ ９４では、ｖｉｒＢオペロンの３’末端は、ｖｉｒＢプロモーターの転写制御下 にある。 − 次に、ｖｉｒＢプロモーターの制御下にあるｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＢオ ペロンの３’末端とｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＧ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ｐ ＶＥ１９４の約１．６kbのＸｂａＩ−ＢｇgｌII断片、ｐＶＥ１９４の約１．３k bのＢｇｌII−ＳｐｈＩ断片、およびｐＧＳＶ８からの約７．２kbのＸｂａＩ− ＳｐｈＩ断片の間で、３者連結を行い、Ｔ−ＤＮＡを有するＴ−ＤＮＡベクター に導入した。得られたプラスミドを、ｐＴＶＥ１９７と命名した。 − ｐＴＣＯ１１４の選択マーカー遺伝子を、以下の３つの断片の連結により、 ｐＴＶＥ１９７に導入し： ｉ）ｖｉｒＢの３’末端とｖｉｒＧ遺伝子を含む、ｐＴＶＥ１９７の約５．３kb のＢａｎII−ＢｓｔＥII断片； ii）右のＴ−ＤＮＡ境界を有する、ｐＴＶＥ１９７の約３．７kbのＢａｎII−Ｅ ｃｏＲＩ断片； iii）キメラ選択ｂａｒ遺伝子と左のＴ−ＤＮＡ境界を有する、ｐＴＣＯ１１４ の約４kbのＥｃｏＲＩ−ＢｓｔＥII断片、 そして、Ｔ−ＤＮＡベクターｐＶＥ２００を得た。１．３． アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefacien s） 株 Ｔ−ＤＮＡベクターであるｐＧＳＶ７１、ｐＴＣＯ１１４、ｐＴＣＯ１２１、 およびｐＶＥ２００を、３親（triparental）接合プロトコール（ディッタ（Dit ta）ら、１９８０）を使用して、ストレプトマイシン（３００μg/ml）とスペク チノマイシン（１００μg/ml）に対する耐性について選択して,ヘルパープラス ミドｐＥＨＡ１０１を有するヘルパーＴｉ−プラスミドｐＡＬ４４０４またはＥ ＨＡ１０１を含むアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４に導入した。 例を通して、以下の株を使用した： Ａ３５９３株：ｐＧＳＶ７１を含むＬＢＡ４４０４ Ａ３５３２株：ｐＴＣＯ１２１を含むＬＢＡ４４０４ Ａ３６３８株：ｐＶＥ２００を含むＬＢＡ４４０４ Ａ３４６０株：ＰＴＣＯ１１４を含むＥＨＡ１０１ Ａ３５３３株：ＰＴＣＯ１２１を含むＥＨＡ１０１ Ａ３６３７株：ｐＶＥ２００を含むＥＨＡ１０１ 例例１．トウモロコシからのアセトシリンゴン前処理したＩ型カルスのアグロバク テリウムー介在形質転換 Ｉ型カルス断片は、基本的にＷＯ９２／０９６９６に記載のように得た。受粉 の９〜１２日後に、トウモロコシ株（Ｐａ９１×Ｈ９９）×Ｈ９９（ＰＨＨ−株 ）からの未成熟胚を穀粒から切り出し、表面を滅菌し、Ｉ型カルスの誘導のため にＭａｈｉｌVII上に広げた。Ｊ型カルスを、１ヶ月間隔で約２〜６ヶ月間、同 じ培地で継代した。次に、Ｉ型カルスを、平均長さ約１．５mmの断片に細かく切 断し、得られた断片を、１００〜２００μＭアセトシリンゴンを補足したＬＳＩ Ｄｈｙ１．５ＶII基質上で５日間インキュベートした。あらかじめ誘導したカル ス片を集め、さらに傷害することなく、適当なアグロバクテジウム株の懸濁液に 約３〜約２０分間浸漬した。細菌懸濁液を以下の方法で得た：ＭＡＧ培地［２g/ lグルコースを補足した最小Ａ培地（ジェフリー・ミラー（Jeffrey Miller）、 １９７２）］、またはＡＢ培地（チルトン（Chilton）ら、１９７４）で、細菌 を３〜６日間増殖させた。細菌を採取し、１００〜２００μＭアセトシリンゴン を補足した液体ＬＳＩ基質に、 約５×１０⁹細胞/mlの濃度で再懸濁した。 細菌懸濁液中に浸漬後、カルス断片を、１００〜２００μＭアセトシリンゴン を補足したＬＳIIＤｈｙ１．５XI培地上で、約２５℃で３〜６日間同時培養した （ＬＢＡ−型株については３日間、ＥＨＡ−型株については６日間）。 同時培養後、組織をＡｈｘ１．５VII ｐ５００ｉｎｏ１０００ｐｐＴ１０に移 し、３〜４日間培養した。増殖しているホスフィノトリシン（ＰＰＴ）−耐性カ ルスを切り出し、ＭｈｌVIIｐ５００ｐｐＴ５上で３週間の継代間隔で少なくと も２回継代した。胚形成性ＰＰＴ−耐性カルスを,再生培地（Ａ３７VIIｐ５００ ｐｐＴ２．）上に広げ、同じ培地上で１０〜１４日間の間隔で胚形成性組織を２ 回継代した。小さい植物を、Ａ６％VIIｐ５００Ｔ２基質を含有するガラス容器 に移してさらに増殖させ、次に、成長してくる苗条を１．５％ショ糖を補足した 半強度のＭＳ培地に移して、さらに苗条の伸長と根の成長をさせた。ホスフィノ トリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）活性について植物を試験し、Ｐ ＡＴ陽性植物を温室に移した。ＰＡＴ陽性植物を、サザンハイブリダイゼーショ ンによりトランス遺伝子の存在について試験した。 表１．ＰＨＨトウモロコシ株のＩ型カルスのアグロバクテリウム−介在形質転換 の平均形質転換頻度の要約、アセトシリンゴン前処理有りまたは無し Ｉ型カルス断片がアセトシリンゴン含有培地でのインキュベーション（実験欄 で記載したアグロバクテリウム株による同時培養）により前処理されなかった対 照実験では、平均形質転換頻度は０．１％を超えなかった（表１を参照）が、Ｐ ＡＴ陽性植物が各ケースで得られた。 アセトシリンゴンを用いる前処理により、アグロバクテリウム株との同時培養 によるＩ型カルスの形質転換効率が少なくとも３倍上昇した。アセトシリンゴン で前 処理した約１７００のカルス断片をＡ３４６０株と同時培養すると、５つのＰＡ Ｔ陽性株が得られた（平均形質転換頻度は約０．３％；表１を参照）。 （各シリーズの実験について）約４０００の前処理カルス断片をアグロバクテ リウム株Ａ３６３８、Ａ３５３３およびＡ３６３７と同時培養すると、それぞれ ３７、３０および３３のＰＡＴ陽性植物株が得られた（平均形質転換頻度は約１ ％）。従ってこれらの実験において、形質転換効率は少なくとも約７〜１０倍改 良された。 アセトシリンゴンとの前処理によりトウモロコシ植物株（Ｐａ９１×Ｈ９９） ×Ｐａ９１（ＰＨＰ）から得られたＩ型カルスとＰａ９１の同時培養について、 形質転換頻度が増強された。例２．追加のキメラｖｉｒＢ１１遺伝子の存在は、アグロバクテリウム−介在形 質転換頻度を改良する Ｉ型カルス断片は、例１に記載のように得られ、１００μＭのアセトシリンゴ ンを補足したＬＳＩＤｈｙ１．５VII基質で５日間インキュベートし、次にアグ ロバクテリウム株Ａ３５３２とＡ３６３８とともに同時培養した。Ａ３５３２株 についてはアセトシリンゴン前処理を行ってもＰＡＴ陽性株が１つのみしか得ら れなかった（形質転換頻度＜０．１％）。しかし、Ｔ−ＤＮＡベクターのｖｉｒ Ｂ１１読みとり枠に先行する機能性ｖｉｒＢプロモーターの存在は、形質転換効 率を少なくともほとんど１０倍改良した（表１を参照）。例３．異なる植物性フェノール性化合物で前処理したトウモロコシからのＩ型カ ルスのアグロバクテリウム−介在形質転換 Ｉ型カルス断片は、例１に記載のように得られ、表IIに記載の１００μＭの植 物性フェノール性化合物を補足したＬＳＩＤｈｙ１．５VII基質で５日間インキ ュベートした。約２００のあらかじめ誘導したカルス断片を、アグロバクテリウ ム株Ａ３６３７（またはＡ３６３８）で同時培養した。得られたＰＡＴ陽性株の 数と形質転換頻度を、表IIに要約する。 表II. アグロバクテリウム−介在形質転換頻度に及ぼす異なる植物性フェノ ール性化合物の作用 例４．アセトシリンゴンによるトウモロコシのＩ型カルスの前処理は電気穿孔法 による形質転換頻度を改良する 例１に記載のように、Ｉ型カルスから得られ、１００μＭアセトシリンゴン含 有培地で５日間プレインキュベートした、細かく切断したカルスを、さらに傷害 することなく、ＷＯ９２／０９６９６に記載の電気穿孔法に付した。簡単に説明 すると、約５０のカルス片を、１００μｌのＥＰＭ−ＫＣｌ緩衝液に再懸濁し、 室温で３時間あらかじめ原形質分離した。次にカルス片をＥＰＭ＋ＫＣｌ緩衝液 で洗浄し、エレクトロキュベットのＥＰＭ＋ＫＣｌ緩衝液に移した。プラスミド ＤＮＡ（１０μｇのｐＤＥ１１０）を加え、ＤＮＡをカルス断片で室温で約１時 間インキュベートした。標準的条件（９００μＦコンデンサーからの初期電界強 度３７５Ｖ／cmで１パルス）で電気穿孔法を行った。カルスは決して氷上には置 かなかった。ホスフィノトリシン耐性カルスを選択し、既に記載されている（Ｗ Ｏ９２／０９６９６）ように植物を再生した。既に記載されている（ＷＯ９２／ ０９６９６）ように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性を検 出した。 アセトシリンゴン（約０．２３％）で前処理しなかった約５６４０のカルス片 の対照電気穿孔法により１３のＰＡＴ陽性植物が得られたが、アセトシリンゴン （約０．７５％）で前処理した約５３０のカルス片の電気穿孔法により４つのＰ ＡＴ陽性植物が得られた。すなわち、細かく切断したＩ型カルスを１００μＭア セトシリンゴン含有培地で５日間インキュベートして前処理した時、形質転換頻 度は約３倍高かった。例５．植物性フェノール性化合物の組合せは形質転換頻度をさらに上げる Ｉ型カルス断片を例１に記載のように得て、２００μＭアセトシリンゴン、又 は １００μＭアセトシリンゴンと１００μＭ ｐ−ヒドロキシ安息香酸の組合せで 補足したＬＳＫＤｈｙ１．５VII基質で５日間インキュベートした。約２５０の カルス片をアグロバクテリウムＡ株３５３３と同時培養した。アセトシリンゴン でプレ誘導後ＰＰＴ含有培地で２つの苗条再生株（１つのＰＡＴ陽性株を含む） が得られ（頻度約１％）、アセトシリンゴン＋ｐ−ヒドロキシ安息香酸でプレ誘 導後ＰＰＴ含有培地で７つの苗条再生株（５つのＰＡＴ陽性株を含む）が得られ た（頻度約３％）。例６．例１〜５のアグロバクテリウム−介在形質転換により得られたトランスジ ェニックトウモロコシ植物の解析 前述の例のトランスジェニックトウモロコシ植物を、サザン解析により解析し た。 第１の例において、単一のトランスジェニックカルス株から再生されたすべて のトランスジェニック植物が同一であるか、またはこれらは独立の形質転換に由 来するかを証明した。２４の独立したトランスジェニックカルス株から得られた すべての再生植物をサザンで解析し、３７の異なるタイプのＴ−ＤＮＡ組み込み を同定した。すなわち、２４の植物株（説明の欄に記載した）が、少なくとも３ ７の独立した形質転換を示した。従って、形質転換した１００のカルス片につい て得られたトランスジェニック植物株の数として表した形質転換頻度は、実際の 形質転換頻度より小さい。 次に、異なるトウモロコシ株中のトランス遺伝子のコピー数を、サザンハイブ リダイゼーションにより解析した。解析した形質転換株（Ｔ０）のほとんどは、 比較的単純なＴ−ＤＮＡ組み込みパターン（４コピー未満）を示した。解析した トランス遺伝子株の約１／３（５６／１４８）は、単一コビーＴ−ＤＮＡ組み込 みを有した。ほんのわずかの株のみ（＜１０％）が、より複雑なＴ−ＤＮＡ組み 込みパターン（＞４コピー）を示した。 前述の例のトランス遺伝子トウモロコシ植物を、子孫のトランス遺伝子の分離 パターンについても解析した。バスタ（Basta）除草剤スプレーを使用して、５ ７の独立したトランス遺伝子カルス株から再生された１１３植物中のＰＡＴ活性 の分離を追跡した。３２の独立したトランス遺伝子カルス株から再生した７４の 植物の子孫 では、ＰＡＴ活性の１：１分離が観察され、Ｔ０植物では、１つのコピーまたは いくつかの密接に結合したコピーで除草剤耐性トランス遺伝子が存在することを 示していた。１８の独立したトランス遺伝子カルス株から再生した３１の植物の 子孫では、すべての植物がバスタ（Basta）除草剤スプーに対して耐性があるか 、または有意に多くの植物が感受性ではなく耐性であり、Ｔ０植物中に２つまた はそれ以上のトランス遺伝子の結合していないコピーが存在することを示してい た。最後に、７つの独立したトランス遺伝子カルス株から再生した１４の植物の 子孫では、耐性のある植物はまったく無いかまたは有意に多くの植物が耐性では なく感受性であった。これらの後者の植物は、これ以上解析しなかった。 ５３の独立に形質転換したトウモロコシ植物（Ｔ０）についてバスタ（Basta ）除草剤に対して耐性のＴ１子孫の２つの植物のサザン解析は、約７０％の解析 したケース（３５／５３）で、両方の子孫の植物はＴ０親植物株と同じＴ−ＤＮ Ａ組み込みパターンを有することを証明した。約１８％（１０／５３）のケース で分離が観察された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．単子葉植物細胞のゲノムへのＤＮＡ断片の組み込み法であって、 １）ＤＮＡ断片との接触の前に、植物性フェノール性化合物を含む培地上で、 非形質転換単子葉植物細胞の培養物を、細胞分裂を刺激し外来ＤＮＡの組み込み 能を増強するのに充分な時間、インキュベートする工程；および ２）ＤＮＡ断片が非形質転換細胞により摂取され、非形質転換細胞のゲノムに 安定に組み込まれる条件下で、非形質転換細胞にＤＮＡ断片を接触させて形質転 換細胞を産生する工程、 を含んでなる、上記方法 ２．形質転換細胞からトランスジェニック単子葉植物を再生する工程をさらに含 む、請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．植物性フェノール性化合物は、アセトシリンゴン、α−ヒドロキシ−アセト シリンゴン、シナピン酸、シリンジ酸（syringic acid）、フェルリ酸（ferulic acid）、カテコール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、β−レソルシル酸（β-resorc ylic acid）、プロトカテク酸、ピロガロール酸、没食子酸、またはバニリンで ある、請求の範囲第１項に記載の方法。 ４．植物性フェノール性化合物はアセトシリンゴンである、請求の範囲第３項に 記載の方法。 ５．植物性フェノール性化合物は、アセトシリンゴン、α−ヒドロキシ−アセト シリンゴン、シナピン酸、シリンジ酸（syringi cacid）、フェルリ酸（ferulic acid）、カテコール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、β−レソルシル酸（β-resorc ylic acid）、プロトカテク酸、ピロガロール厳、没食子酸、およびバニリンよ りなる群から選択される、少なくとも２つの植物性フェノール性化合物を含む混 合物である、請求の範囲第３項に記載の方法。 ６．混合物は、少なくともアセトシリンゴンとｐ−ヒドロキシ安息香酸を含む、 請求の範囲第５項に記載の方法。 ７．単子葉植物はトウモロコシ、イネ、コムギまたはオオムギである、請求の範 囲第１項に記載の方法。 ８．単子葉植物はトウモロコシである、請求の範囲第１項〜６項までのいずれか １ 項に記載の方法。 ９．非形質転換単子葉植物細胞の培養物はＩ型カルスである、請求の範囲第８項 に記載の方法。 １０．Ｉ型カルスは、接触工程の前に断片に切断されている、請求の範囲第９項 に記載の方法。 １１．Ｉ型カルスは、インキュベーション工程の前に断片に切断されている、請 求の範囲第９項に記載の方法。 １２．Ｉ型カルス断片は最大０．５〜５mmの長さを有する、請求の範囲第１０項 に記載の方法。 １３．非形質転換細胞は、ＤＮＡ断片との接触の前に、約１〜１０日間、植物性 フェノール性化合物を含む培地上でインキュベートされる、請求の範囲第１項に 記載の方法。 １４．非形質転換細胞は、ＤＮＡ断片との接触の前に、約４〜５日間、植物性フ ェノール性化合物を含む培地上でインキュベートされる、鯖求の範囲第１項に記 載の方法。 １５．非形質転換細胞は、ＤＮＡ断片との接触の前に、約４〜５日間、植物性フ ェノール性化合物を含む培地上でインキュベートされる、請求の範囲第１２項に 記載の方法。 １６．非形質転換細胞は、電気穿孔法、ポリエチレングリコールを使用する直接 遺伝子移動、またはＤＮＡコーティングしたマイクロプロジェクタイルによる衝 撃により、ＤＮＡ断片と接触される、請求の範囲第１項に記載の方法。 １７．非形質転換細胞は、ＤＮＡ断片を含むアグロバクテリウム株との同時培養 法により、ＤＮＡ断片と接触される、請求の範囲第１項に記載の方法。 １８．非形質転換細胞は、ＤＮＡ断片を含むアグロバクテリウム株との同時培養 法により、ＤＮＡ断片と接触される、請求の範囲第１２項に記載の方法。 １９．アグロバクテリウム株は追加のｖｉｒＧ遺伝子コピーをさらに含む、請求 の範囲第１７項に記載の方法。 ２０．ｖｉｒＧ遺伝子はｐＴｉＢｏ５４２から得られる、請求の範囲第１９項に 記載の方法。 ２１．アグロバクテリウム株は、ｖｉｒＢプロモーターに機能的に結合したｖｉ ｒＢ１１コード領域を含むキメラ遺伝子の追加のコピーをさらに含む、請求の範 囲第１７項に記載の方法。 ２２．単子葉植物細胞を外来ＤＮＡと接触させる前に、植物性フェノール性化合 物を含む培地上で該細胞を培養することを含んでなる、単子葉植物細胞の安定な 形質転換の頻度を上げる方法。 ２３．植物性フェノール性化合物は、アセトシリンゴン、α−ヒドロキシ−アセ トシリンゴン、シナピン酸、シリンジ酸（syringic acid）、フェルリ酸（ferul ic acid）、カテコール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、β−レソルシル酸（β-reso rcylic acid）、プロトカテク酸、ピロガロール厳、没食子酸、またはバニリン である、請求の範囲第２０項に記載の方法。 ２４．アセトシリンゴン、α−ヒドロキシ−アセトシリンゴン、シナピン酸、シ リンジ酸（syringic acid）、フェルリ酸（ferulic acid）、カテコール、ｐ− ヒドロキシ安息香酸、β−レソルシル酸（β-resorcylic acid）、プロトカテク 酸、ピロガロール酸、没食子酸、およびバニリンよりなる群から選択される、少 なくとも２つの植物性フェノール性化合物を含む、植物増殖培地用の組成物。 ２５．植物性フェノール性化合物はアセトシリンゴンおよびｐ−ヒドロキシ安息 香酸である、請求の範囲第２４項に記載の方法。