JP4199312B2 - 植物の改良された形質転換法 - Google Patents
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Description
発明の背景
（ｉ）発明の分野
本発明は、植物細胞特に単子葉植物細胞（特に、トウモロコシ、イネ、コムギおよびオオムギ細胞）の組織培養、および遺伝的に形質転換された植物細胞および植物を得るための改良法に関する。
（ii）関連技術の説明
長年の間、植物の遺伝的形質転換のために多くの技術が開発されてきた。これらの方法の究極の目標は、すべての細胞が、ゲノム（特に、核ゲノム）内に安定に組み込まれた目的の遺伝子（いわゆるトランス遺伝子）を含む外来ＤＮＡを含有する、トランスジェニック植物を得ることである。
形質転換は、出発細胞を絶えずＤＮＡ（通常、目的の外来遺伝子を含むＤＮＡ）に接触させる複雑なプロセスである。ＤＮＡへの細胞の接触は、細胞によるＤＮＡの摂取およびＤＮＡの組み込み（細胞のゲノムへの目的の遺伝子の組み込みを含む）を促進する条件下で行われる。
形質転換の出発細胞は、通常インビトロでしばらく培養された細胞である。細胞をＤＮＡに接触させた後、形質転換された細胞は一般に、形質転換された細胞を形質転換されていない細胞から分離するために、および形質転換された細胞から形質転換された植物を再生するために、インビトロで一定期間培養する必要がある。
植物の異なる形質転換法が記載されており、直接ＤＮＡ移動法（例えば、電気穿孔法、ＰＥＧ−介在ＤＮＡ摂取、バイオリスティックス（biolistics））、またはアグロバクテリウム（Agrobacterium）−介在ＤＮＡ移動法に分類される。バシル（Vasil）（１９９４）とクリストウ（Christou）（１９９４）は、穀類について入手できる植物形質転換法を概説している。
アグロバクテリウム−介在ＤＮＡ移動法は、植物細胞へのＤＮＡ移動の最も効率的な方法の１つであり、必要とする技術的ハードウェアはおそらく、種々の形質転換法の中で最も少ないであろう。また定量的には、アグロバクテリウム−介在ＤＮＡ移動法により形質転換された植物は、染色体中の異なる位置に挿入されるトランス遺伝子の数が少ないこと、および異常なトランス遺伝子の発生頻度が低いことで、優れている。植物のアグロバクテリウム−介在ＤＮＡ形質転換は、あるアグロバクテリウム株が、そのＴｉ−プラスミドの一部（すなわち、Ｔ−ＤＮＡ）を植物細胞に導入する能力、および細胞の核ゲノム内にこのＴ−ＤＮＡを組み込む能力に基づく。移送され組み込まれるＴｉ−プラスミドの部分は、特異的なＤＮＡ配列（いわゆる、左および右のＴ−ＤＮＡボーダー配列）により区別され、これらのボーダー配列の間の天然のＴ−ＤＮＡ配列は、外来ＤＮＡで置換することができることがわかった（ヨーロッパ特許公報ＥＰ１１６７１８；デブラエレ（Deblaere）ら、１９８７）。
単子葉植物のアグロバクテリウム−介在形質転換は、数回報告されている（下記参照）。しかし、報告された方法の使用は、特定の種または遺伝子型に限定されているか、または特定の組織もしくは特殊なアグロバクテリウム株の使用が必要である。報告された方法の大部分では、形質転換効率はまだ改良の余地が大きい。
フーイカース−バンスログテレン（Hooykaas-Van Slogteren）ら（１９８４）は、発ガン性のアグロバクテリウム株で感染された２つの単子葉植物種（クロロフィツム・カペンセ（Chlorophytum capense）とスイセン属の栽培品種「ペーパーホワイト」（Narcissus cv ’Paperwhite’））における、Ｔｉ−プラスミド遺伝子発現の検出を記載している。
ヘルナルスティーンズ（Hernalsteens）ら（１９８４）とビテビアー（Bytebier）ら（１９８７）は、天然のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）単離株ならびに非発ガン性のＴ−ＤＮＡを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を使用する、アスパラガス・オフィシナリス（Asparagus officinalis）の形質転換を記載している。
米国特許第５，１６４，３１０号は、切り出し培養した植物の苗条の頂点にアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を接種する、植物（トウモロコシとコムギを含む）の形質転換法を記載している。
米国特許第５，１８７，０７３号と第５，１７７，０１０号は、急速に分裂している細胞を含む苗の部分で苗に傷をつけ、この傷にｖｉｒ＋アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を接種することを含んでなる、形質転換されたイネ科植物（トウモロコシ）の産生方法を記載している。
ＰＣＴ特許公報ＷＯ９２／０９６９６は、形質転換法の出発物質として、単子葉植物（例えば、トウモロコシおよびイネ）の緻密な胚発生カルス（すなわち、トウモロコシのＩ型カルス）および未成熟胚（機械的または酵素的に傷をつけた）の使用を記載している。
ＥＰ０６０４６６２Ａ１は、目的の遺伝子を含有するアグロバクテリウム属の細菌による脱分化中または脱分化後に、単子葉植物の培養組織を形質転換する方法を記載している。ＥＰ０６７２７５２Ａ１は、単子葉植物の未分化未成熟胚の胚盤をアグロバクテリウムで形質転換する方法を記載している。いずれの特許出願も、Ｔｉ−プラスミドまたはＲｉプラスミド以外に、Ｔｉ−プラスミドｐＴｉＢｏ５４２の毒性の強い領域に由来するＤＮＡ断片を含有するプラスミドを有するアグロバクテリウム株の使用を記載している。
ライネリ（Raineri）ら（１９９０）は、胚盤部分を傷つけたイネの２つの品種の胚由来の培養物の、アグロバクテリウム介在遺伝子移動システムを使用する形質転換を記載している。
チャン（Chan）ら（１９９３）は、ジャガイモ懸濁培養細胞を含有する培地上でアグロバクテリウム株を接種して、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（「２，４−Ｄ」）の存在下で２日間培養したイネの未成熟胚を形質転換する方法を記載している。
ムーネイ（Mooney）ら（１９９１）は、コムギの酵素処理した胚へのカナマイシン耐性遺伝子の、アグロバクテリム−介在導入法を記載している。
形質転換を増強するための同時培養の前の、アセトシリンゴン（acetosyringone）とのアグロバクテリウム株のインキュベート、およびこの細菌との植物細胞の同時培養の間のアセトシリンゴンの添加による、アグロバクテリウム株のＴｉ−プラスミドまたはヘルパープラスミドのｖｉｒ遺伝子の誘導が、報告されている（バン・ウォルドラゲンとドンス（Van Wordragen and Dons）、１９９２；ジャック（Jacq）ら、１９９３；ジェームス（James）ら、１９９３）。
グイバルチ（Guivarc’h）ら（１９９３）は、ニンジンの根の円盤状組織をアセトシリンゴンで１０分間という短時間だけ前処理する、この組織の一過性アグロバクテリウム−介在形質転換の改良を記載している。
発明の要約と目的
単子葉植物細胞（特に、トウモロコシ、イネ、コムギまたはオオムギ細胞）のゲノムへのＤＮＡ断片の組み込み法であって、
１）ＤＮＡ断片との接触の前に、植物性フェノール性化合物（特に、アセトシリンゴン、α−ヒドロキシ−アセトシリンゴン、シナピン酸、シリンジ酸（syringic acid）、フェルリ酸（ferulic acid）、カテコール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、β−レソルシル酸（β-resorcylic acid）、プロトカテク酸、ピロガロール酸、没食子酸、およびバニリンから選択される植物性フェノール性化合物）を含む培地上で、非形質転換単子葉植物細胞の培養物を、細胞分裂を刺激し外来ＤＮＡの組み込み能を増強するのに充分な時間、好ましくは約１〜１０日間、特に約４〜５日間、インキュベートする工程；および
２）ＤＮＡ断片が非形質転換細胞により摂取され、非形質転換細胞のゲノムに安定に組み込まれる条件下で、非形質転換細胞にＤＮＡ断片を接触させて、特に電気穿孔法、ポリエチレングリコールを使用する直接遺伝子移動、ＤＮＡコーティングしたマイクロプロジェクタイルによる衝撃、またはＤＮＡ断片を含むアグロバクテリウム株との同時培養法により、形質転換細胞を産生する工程、
を含んでなる、上記方法が提供される。
場合により、形質転換した細胞は再生して、トランスジェニック単子葉植物にすることができる。
さらに、トウモロコシ植物の細胞のゲノム内にＤＮＡ断片を組み込むための方法であって、
ＤＮＡ断片と接触させる前に、Ｉ型カルス、特に断片（特に、最大０．５〜５mmの長さの断片）に切断したＩ型カルスを、植物性フェノール性化合物（アセトシリンゴン、α−ヒドロキシ−アセトシリンゴン、シナピン酸、シリンジ酸（syringic acid）、フェルリ酸（ferulic acid）、カテコール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、β−レソルシル酸（β-resorcylic acid）、プロトカテク酸、ピロガロール酸、没食子酸、およびバニリンから選択される植物性フェノール性化合物）と、細胞分裂を刺激し外来ＤＮＡの組み込み能を増強するのに充分な時間、好ましくは約１〜１０日間、特に約４〜５日間、インキュベートする工程；または
ＤＮＡ断片と接触させる前に、Ｉ型カルスを、植物性フェノール性化合物を含む培地上で、細胞分裂を刺激し外来ＤＮＡの組み込み能を増強するのに充分な時間インキュベートした後、Ｉ型カルスを断片（特に、最大０．５〜５mmの長さの断片）に切断する工程；および
２）ＤＮＡ断片が非形質転換細胞により摂取され、非形質転換細胞のゲノムに安定に組み込まれる条件下で、非形質転換細胞にＤＮＡ断片を接触させて、特に電気穿孔法、ポリエチレングリコールを使用する直接遺伝子移動、ＤＮＡコーティングしたマイクロプロジェクタイルによる衝撃、またはＤＮＡ断片を含むアグロバクテリウム株との同時培養法により、形質転換細胞を産生する工程、
を含んでなる、上記方法が提供される。
また、植物性フェノール性化合物の存在下で単子葉植物中の安定な形質転換の頻度を増加させる方法が提供され、ここで植物性フェノール性化合物は、培養組織に外来ＤＮＡを接触させる前に植物細胞が培養される培地中に含有される。
さらに、少なくとも２つの植物性フェノール性化合物を含む植物培地組成物が提供される。
好適な実施態様の詳細な説明
本発明は、植物のカルス、特にトウモロコシのカルス（特に、トウモロコシの細かく切断したＩ型カルス）を、植物性フェノール性化合物（例えば、アセトシリンゴン）を含む培地上で約５日間培養すると、細胞分裂が大きく刺激され、アグロバクテリウム−介在形質転換により細胞内に移送された外来ＤＮＡのゲノム中への組み込み能が増強されたカルスを再現性良く産生する（これは標準的条件下で回収された形質転換細胞および植物の数に反映される）という観察に基づく。
本明細書において使用される「非形質転換細胞」とは、本発明の方法を応用する時使用されるであろう特定のＤＮＡ断片に接触していない細胞を意味する。このような細胞はまた、異なるかまたは同じＤＮＡ断片であらかじめ形質転換したトランスジェニック植物または植物組織から得られることは言うまでもない。
本明細書において使用される「形質転換の効率」または「形質転換の頻度」とは、標準的実験条件下（すなわち、外来ＤＮＡと接触した細胞の量、送達されたＤＮＡの量、ＤＮＡ送達のタイプと条件、および一般的培養条件など）で回収される形質転換細胞（または、個々の形質転換細胞から増殖させたトランスジェニック生物）の数により測定することができる。例えば、カルス断片が形質転換の出発物質として使用される時、形質転換の頻度は、形質転換された１００個のカルスについて得られるトランスジェニック植物株の数で表現することができる。本発明の方法を使用して、約１％またはそれ以上の形質転換頻度が得られた。
本明細書において使用されるトランスジェニック「植物株」は、再生プロセスの間に得られたある単位の培養細胞（例えば、１つの形質転換されたカルス片）由来の、トランスジェニック植物の群から構成される。一般に、１つの植物株からの植物は遺伝的に同一であり、１つの形質転換事象に由来し、従って同じゲノム位置に組み込まれた同じトランス遺伝子を含む。しかし、本明細書で定義された１つの植物株からの個々の植物は、特にアグロバクテリウム−介在ＤＮＡ移動法を使用する時、独立した形質転換に由来することができ、従って互いに異なることもある。形質転換頻度を１００個の最初のカルス片当たりの植物株の数で表すと、実際の形質転換頻度（形質転換の頻度／１００個の最初のカルス片）はさらに高くなる。
本発明に適した「植物性フェノール性化合物」または「植物のフェノール性物質」とは、陽性の走化性応答を誘導することができる、単離され置換されたフェノール性分子、特にアグロバクテリウム種を含有するＴｉ−プラスミド（特に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を含有するＴｉ−プラスミド）中でｖｉｒ遺伝子発現の増加を誘導することができるものである。植物性フェノール性化合物に対する走化性応答を測定する方法は、アシュビ（Ashby）ら（１９８８）により記載され、ｖｉｒ遺伝子発現の誘導を測定する方法も公知である（スタチェル（Stachel）ら、１９８５；ボルトン（Bolton）ら、１９８６）。
植物性フェノール性化合物を含有する培地上の植物組織のインキュベーションが形質転換効率に及ぼす有効な作用は、主に細胞分裂の誘導および植物細胞のゲノム内への外来ＤＮＡの取り込み能の増強が原因であると考えられている。多くの単子葉植物（特に、穀類植物）は傷がつくと、多くの双子葉植物で観察されたものと類似の方法では応答しない（ポトリクス（Potrykus）、１９９１）。植物性フェノール性化合物を外から供給すると、特に単子葉植物に適用した時に傷様の応答を引き起こすことがあることが知られている。前処理した植物組織に摂取される植物性フェノール性化合物の残存濃度によるｖｉｒ遺伝子の誘導はまた、形質転換効率に影響を及ぼすが、この作用はあまり重要ではないと考えられている。確かに、直接ＤＮＡ移動法を使用して、形質転換の同様の増強が観察された。
好適な植物性フェノール性化合物は、植物細胞の傷滲出液中に存在するものである。最もよく知られている植物性フェノール性化合物の１つは、アセトシリンゴンであり、これは濃度が異なるが、種々の多くの植物の傷ついた細胞および無傷の細胞中に存在する。しかし、アセトシリンゴン（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシアセトフェノン）は、ｖｉｒ遺伝子の発現を誘導することができる唯一の植物性フェノール性物質ではない。他の例には、α−ヒドロキシ−アセトシリンゴン、シナピン酸（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸）、シリンジ酸（syringic acid）（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸）、フェルリ酸（ferulic acid）（４−ヒドロキシ−３−メトキシケイ皮酸）、カテコール（１，２−ジヒドロキシベンゼン）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸（４−ヒドロキシ安息香酸）、β−レソルシル酸（β-resorcylic acid）（２，４−ジヒドロキシ安息香酸）、プロトカテク酸（３，４−ジヒドロキシ安息香酸）、ピロガロール酸（２，３，４−トリヒドロキシ安息香酸）、没食子酸（３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸）、およびバニリン（３−メトキシ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド）があり、これらの植物性フェノール性化合物は、培地中のアセトシリンゴンの代わりに使用しても同様の結果が得られることが知られているかまたは得られることが期待される。本明細書において使用される上記の分子は、植物性フェノール性化合物と呼ぶ。
植物性フェノール性化合物は、単独でまたは他の植物性フェノール性化合物と組合せて、植物の培地に加えることができる。植物性フェノール性化合物の特に好適な組合せは、少なくともアセトシリンゴンとｐ−ヒドロキシ安息香酸とを含有するが、２つまたはそれ以上の植物性フェノール性化合物の他の組合せも、相乗的に作用して形質転換効率を増強するであろう。
さらに、浸透圧保護物質（例えば、Ｌ−プロリン、好ましくは約７００mg/lの濃度、またはベタイン）、植物ホルモン（特に、ＮＡＡ）、オピネス（opines）、または糖などの化合物は、植物性フェノール性化合物と一緒に添加されると相乗作用を示すと予想される。
本発明は、植物細胞（特に、トウモロコシ細胞）への改良されたアグロバクテリウム−介在ＤＮＡ移動法に特に有用であるが、植物性フェノール性化合物で前処理した植物細胞（特に、単子葉植物）の培養物もまた、直接ＤＮＡ移動法（例えば、ＰＥＧ介在ＤＮＡ移動、粒子衝撃法または電気穿孔法）を使用して、形質転換の効率を改良するのに使用することができる。すなわち、基本的には本発明は、細胞が培養される培地中に、一定時間植物性フェノール性化合物（例えば、アセトシリンゴン）を含有させることにより、植物細胞（特に、単子葉植物細胞、特にトウモロコシ細胞）の遺伝的形質転換のための既存法の改良を提供する。特に植物細胞または植物組織は、アセトシリンゴン（１００〜２００μＭ）を含有する培地で５日間培養した後、細胞を外来ＤＮＡと接触させて、これを直接または電気穿孔法、ＰＥＧ介在ＤＮＡ移動または粒子衝撃法、または好ましくはアグロバクテリウム−介在ＤＮＡ移動法により、細胞に導入する。
好適な実施態様において本発明の方法は、植物細胞（特に、トウモロコシ細胞）へのアグロバクテリウム−介在ＤＮＡ移動の形質転換頻度を改良するために使用される。
植物細胞、特に単子葉植物細の遺伝的形質転換のための多くの従来法では、培養細胞、組織または外植体が出発物質として使用され、このような培養物中の細胞は、細胞のゲノム内への外来ＤＮＡの摂取を促進する条件下で、少なくとも１つの目的の遺伝子（すなわち、トランス遺伝子）を含む外来ＤＮＡと接触させられるであろう。植物細胞、組織、器官または外植体の培養に適した培地は、一般に当該分野で公知である。好適な植物培地は、化学的組成が公知の規定培地である。
本発明のある実施態様において、植物性フェノール性化合物特にアセトシリンゴンは、約４〜５または６日間（好ましくは、少なくとも５日間）培地に加えた後、細胞を外来ＤＮＡと接触させることが好ましい。培養細胞をアセトシリンゴンのような植物性フェノール性化合物を含有する培地中でインキュベートする正確な期間は、決定的に重要ではないと考えられているが、おそらく２週間を超えない方がよい。１〜１０日間（特に、３〜７日間）が最適な期間であるが、約４〜５または６日間インキュベートした後に接触させると最良の結果が得られるようである。一般に、接触時間の前に、約５日間植物性フェノール性化合物を培地に添加することが有用な期間であると考えられている。
培養組織は、植物性フェノール性化合物含有培地（特に培地に没食子酸を加えた時）でインキュベートすると褐色化または限定的壊死を示すことがあることに注意されたい。しかし、これらの培養細胞、組織または外植体を使用すると、形質転換効率が改良される。
培地中の植物性フェノール性化合物の濃度はまた、組み込み形質転換能の進展に影響を与えると考えられ、これは細胞の性質（種、組織外植体、一般的培養条件など）に依存して変化する。しかし、ある濃度範囲内では、特に培養細胞が７日を超えてインキュベートされない時は、その作用は小さい。培地中の植物性フェノール性化合物の最適濃度範囲は、その組織、細胞または細胞培養物が得られる種、または使用される組織のタイプにより変動するが、多くの目的（例えば、トウモロコシ由来の物質と使用する時）にとって約１００μＭ〜２００μＭが適当な濃度であると予測される。最適濃度はまた、使用する特定の植物性フェノール牲化合物の性質、特にその細胞分裂促進能に依存する。
例えば、アセトシリンゴンの最適濃度は、約２００μＭであることが見いだされたが、形質転換効率に対する良好な作用を得るのに、約２５μＭという低い濃度が使用できる。同様に、約４００μＭまでの高い濃度が同様の作用を示すと予測される。
他の植物性フェノール性化合物にも同様の濃度が適用され、本発明に従う実験により最適濃度は容易に確立することができる。
上記のように、植物形質転換法は一般に、培養組織に外来ＤＮＡを接触させる前に、細胞、細胞培養物、組織または外植体の培養を行う。形質転換法の出発物質としていくつかの組織が記載されており、例えば、乾燥種子、未成熟胚、未成熟の花、葯、花粒粉、胚盤、節、若い葉の基部、胚軸外植体、根（特に、根の先端）、緻密な胚カルス（例えば、トウモロコシのＩ型）、もろい胚カルス（例えば、トウモロコシのII型）、懸濁培養物、懸濁細胞凝集物の培養物、体細胞胚および苗条頂端があるが、これらに限定されない。外来ＤＮＡに接触させる前に、これらの組織、細胞、細胞培養物または外植体がインキュベートされる培地中に植物性フェノール性化合物（特に、アセトシリンゴン）を含有させると、特にアグロバクテリウム−介在形質転換を使用する時に、形質転換効率が改善されるであろう。
「（植物）培地上でインキュベートする」という用語を用いる時はいつも、培地は液体または個体であることは明白である。本発明の範囲において、植物培地は、少なくとも１つの植物性フェノール性化合物を含む。
形質転換法の究極的目標が、植物特に表現型が正常な植物を再生することである時、出発物質は、先行技術で広く記録されているような再生能があることは当然である。
特に好適な実施態様において、形質転換能のある植物細胞、好ましくはアグロバクテリウム形質転換能のある植物細胞は、植物性フェノール性化合物（好ましくはアセトシリンゴン）を含有する培地上に、緻密な再生可能なカルス（例えば、トウモロコシＩ型カルス）を含有させることにより産生できる。この目的のために、緻密なカルスは、小さい断片に切断することにより分割される。得られるカルスは、全体または少なくとも一部が、カルスの再生可能な（例えば、胚形成性）部分を含む。カルス断片はまた、好ましくは最大長が０．５〜５mm、特に１〜２mm、さらに詳しくは１．２５〜１．７５mmであり、好ましくは最小長が約０．１mmである。しかし、約１cmまでの大きなＩ型カルス断片を使用することが好ましい。植物性フェノール性化合物含有培地で培養した後、さらに傷つけたり酵素的前処理をすることなく、カルスを外来ＤＮＡ、好ましくは外来ＤＮＡを含有するアグロバクテリウムに接触させる。
あるいは、傷つける（すなわち、切断する）ことなく、植物性フェノール性化合物を含有する培地上で緻密なカルスをインキュベートし、次に傷をつけ、すなわち小さい断片（特に、上記サイズを有する断片）に切断してから、接触工程を行う。
別の実施態様において、形質転換能のある、特にアグロバクテリウム−形質転換能のある細胞を、植物性フェノール性化合物（好ましくはアセトシリンゴン）含有培地上で、未成熟胚（好ましくは、トウモロコシの未成熟胚）をインキュベートして作成する。この点でトウモロコシのような植物については、未成熟胚は、最大長が約０．５〜２mm、好ましくは０．５〜１．５mmであることが好ましいが、０．５〜１mmの長さの小さい胚も使用することができる。植物性フェノール性化合物含有培地で培養後、さらに傷害または酵素的前処理をすることなく、未成熟胚を外来ＤＮＡ（好ましくは、外来ＤＮＡを含むアグロバクテリウム）と接触させることができる。
本発明を使用して、異なる遺伝子型のトウモロコシ、特に、トウモロコシ、ＰＨＨ［（Ｐａ９１×Ｈ９９）×Ｈ９９］、Ｐａ９１ ＨＥ８９またはＰＨＰ［（Ｐａ９１×Ｈ９９）×Ｈ９１］に、アグロバクテリウム−介在ＤＮＡ移動を行うことができる。従って、本発明は遺伝子型に制限されることなく、特にトウモロコシの形質転換に使用することができると考えられる。
植物細胞特に本発明のトウモロコシ細胞を前培養とすると、アグロバクテリウム−介在ＤＮＡ移動の形質転換効率が上昇し、この作用は、アグロバクテリウム宿主の染色体バックグランド、使用されるＴｉ−プラスミド、ヘルパー−プラスミドまたはＴ−ＤＮＡベクターのタイプに依存しない。従って本発明の方法は、効率的に使用できるアグロバクテリウム株の範囲を拡大する。
特に好適な細菌の染色体バックグランドは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumefaciens）Ｃ５８Ｃ１（バン・ラレベケ（Van Larebeke）ら、１９７４）、Ａ１３６（ワトソン（Watson）ら、１９７５）、またはＬＢＡ４０１１（クラプウィジク（Klapwijk）ら、１９８０）により提供される。
好適な実施態様において、植物性フェノール性化合物とともに前培養される植物組織を形質転換するのに使用されるアグロバクテリウム株は、Ｌ，Ｌ−スクシンアモピン型Ｔｉ−プラスミド（好ましくは、武装していない（disarmed）もの、例えばｐＥＨＡ１０１）を含有する。
別の好適な実施態様において、植物性フェノール性化合物とともに前培養した植物組織を形質転換するのに使用されるアグロバクテリウム株は、オクトピン型Ｔｉ−プラスミド（好ましくは、武装していない（disarmed）もの、例えばｐＡＬ４４０４）を含有する。一般にオクトピン型Ｔｉ−プラスミドまたはヘルパープラスミドを使用する時は、ｖｉｒＦ遺伝子は削除されるかまたは不活性化されることが好ましい（ジャルスチョウ（Jarschow）ら、１９９１）。
本発明の方法はまた、特定のアグロバクテリウム株と組合せて使用して、さらに形質転換効率を上げることができ、例えば、ｖｉｒ遺伝子発現および／またはその誘導が、突然変異またはキメラｖｉｒＡもしくはｖｉｒＧ遺伝子の存在のために変化しているアグロバクテリウム株が使用できる（例えば、ハンセン（Hansen）ら、１９９４；チェンとウィナンス（Chen and Winans）、１９９１；シェーレン−グルート（Scheeren-Groot）ら、１９９４）。
別の実施態様において、追加のｖｉｒＧ遺伝子コピー（特に、ｐＴｉＢｏ５４２由来のいわゆるスーパーｖｉｒＧ遺伝子）（好ましくは、多重コピープラスミドに連結している）を含有するアグロバクテリウム株は、形質転換効率をさらに上げるために使用することができる。
本発明のさらに別の実施態様において、使用されるアグロバクテリウム株は、アグロバクテリウム中で発現される追加のｖｉｒＢ１１遺伝子コピー（特に、ｐＴｉＢｏ５４２由来のｖｉｒＢ１１遺伝子）を含有する。これは、ｖｉｒＢオペレーターの他の介在コード領域の無い、アグロバクテリウム中で発現可能なプロモーター（例えば、単離したｖｉｒＢプロモーター）に機能的に結合したｖｉｒＢ１１コード領域を含むキメラ遺伝子を提供することにより行われる。
植物細胞特にトウモロコシ細胞と同時培養されるアグロバクテリウム細胞は、当業者に公知の如く、アセトシリンゴンまたは他の植物性フェノール性化合物とともにプレインキュベートされるか、またはその培地から単離した後直接使用することができる。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の特に好適な誘導条件は、ベルナーデ（Vernade）ら（１９８８）により記載されている。
本発明の方法は原理的に、植物細胞特にトウモロコシ細胞を任意の外来ＤＮＡで形質転換するために使用することができる。一般に外来ＤＮＡは、１）形質転換される種である真核細胞（例えば、植物）中でＤＮＡからＲＮＡへの転写を指令することができるプロモーターを有するプロモーター領域と、２）ＲＮＡ（例えば、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイム）またはタンパク質をコードするコード領域とを含む、目的の少なくとも１つの遺伝子を含む。目的の遺伝子はまたしばしば、３）ポリアデニル化シグナルを含有する真核生物遺伝子の３’非翻訳領域を含む。プロモーターは、真核生物の選択された組織中で発現を指令するために選択することができる。例えば、植物のおしべ細胞中で選択的に発現を指令するプロモーター（例えば、タペツム（tapetum））が知られており、このようなプロモーターは、雄の不稔植物と、ハイブリッドを産生するのに有用な他の植物とを産生するのに使用されている（ＥＰ３４４０２９；ＥＰ４１２９１１；ＷＯ９２１３９５６；ＷＯ９２１３９５７；マリアニ（Mariani）ら、１９９０；マリアニ（Mariani）ら、１９９２）。
本発明の方法で使用される外来ＤＮＡはまた好ましくは、その発現が、非形質転換細胞（または生物）から形質転換細胞（または生物）を選択することを可能にする選択マーカー遺伝子を含有する。このような選択マーカー遺伝子は一般に、通常は細胞にとって毒性である抗生物質または他の化学的化合物に対して、細胞に耐性を与えるタンパク質をコードする。従って植物において選択マーカー遺伝子は、除草剤、例えば活性成分としてグルタミンシンターゼインヒビター（例えば、ホスヒノトリシン（phosphinothricin））を含有する除草剤に対して耐性を与えるタンパク質もコードする。このような遺伝子の例は、ｓｆｒ遺伝子またはｓｆｒｖ遺伝子のようなホスヒノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である（ＥＰ２４２２３６；ＥＰ２４２２４６；デブロック（De Block）ら、１９８７）。
従って本発明は、ＤＮＡ移動、特に植物細胞（特に、単子葉植物細胞、特にトウモロコシ細胞、しかしイネ、コムギまたはオオムギ細胞も含む）のアグロバクテリウム−介在ＤＮＡ移動の形質転換効率を上昇させるための、迅速かつ効率的で再現性のある方法を提供する。さらにアグロバクテリウム−介在形質転換法は、直接遺伝子移動法より、細胞のゲノムに組み込まれるトランス遺伝子コピー数の限定された（特に、１つのトランス遺伝子コピーを有する）、より多数のトランスジェニック植物（特に、トウモロコシ植物）を生成する。さらに、そのゲノム内に２つ以上のトランス遺伝子コピーが組み込まれている、アグロバクテリウム−介在形質転換により得られるトランスジェニック植物（特に、トランスジェニックトウモロコシ植物）は、異なるコピーが独立に遺伝される子孫植物をしばしば産生し、子孫植物中の異なるトランス遺伝子コピーの分離を可能にする。従って、直接遺伝子移動法で得られるトランスジェニック植物の集団より、本発明の形質転換法により低レベルトランスジェニック植物の集団中に、目的の特徴を有する高い比率の「エリート」トランス遺伝子植物が見いだされると予測される。本発明は単子葉植物に特に有用であるが、本発明の方法の出発物質として双子葉植物の培養細胞を使用しても、同様の結果が得られると予測される。
以下の例において本発明を詳細に説明する。以下の例において特に明記しなければ、すべての組換えＤＮＡ法は、サムブルーク（Sambrook）ら（１９８９）モレキュラークローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、ニューヨーク、およびアウスベル（Ausubel）ら（１９９４）、カレントプロトコールズインモレキュラーバイオロジー、カレントプロトコールズ（Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols）、アメリカ合衆国、に記載の標準的方法に従って行う。植物の分子学的作業の標準的材料や方法は、アール・ディー・ディー・クロイ（R.D.D. Croy）のプラントモレキュラーバイオロジーラボファックス（Plant Molecular Biology Labfax）（１９９３）［ビオスサイエンティフィック出版（BIOS Scientific Publications Ltd）（英国）とブラックウェルサイエンティフィック出版（Blackwell Scientific Publications）（英国）との共同出版］に記載されている。
本発明の例および説明において、配列リストの以下の配列が参照される：
配列番号１：ｐＧＶＳ７１のＴ−ＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号２：ａｄｈ１イントロンを含むｂａｒ遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列
配列番号３：ｐＧＶＳ８のＴ−ＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号４：オリゴヌクレオチドＶＧ４０のヌクレオチド配列
配列番号５：オリゴヌクレオチドＶＧ４１のヌクレオチド配列
実験：例で使用される培地、プラスミドおよび細菌株
１．１．培地
例を通して、植物組織の培養のために以下の培地を使用した：
− ＭａｈｉｌVII：Ｎ６培地（チュー（Chu）ら、１９７５）に、１００mg/lカゼイン加水分解物、６mM Ｌ−プロリン、０．５g/l ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、０．２Ｍマンニトール、２％ショ糖、１mg/l ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、２．５g/lゲルライト（Gelrite）を補足し、ｐＨ５．８に調整する。
− ＬＳＩＤｈｔ１．５VII：ＭＳ塩（ムラシゲとスクーグ（Murashige and Skoog）、１９６８）に、０．５mg/lニコチン酸、０．５mg/lピリドキシンＨＣｌ、１mg/lチアミンＨＣｌ、１００mg/lミオ−イノシトール、６mM Ｌ−プロリン、０．５g/l ＭＥＳ、２０g/lショ糖、１０g/lグルコース、１．５mg/l ２，４−Ｄ、２．５g/lゲルライト（Gelrite）を補足し、ｐＨ５．２に調整する。
− ＬＳＩ：ＭＳ塩に、ＬＳＩＤｈｙ１．５VIIのビタミン、１g/lのカザミノ酸、０．２Ｍショ糖、０．２Ｍグルコース、１．５mg/l ２，４−Ｄ、２．５g/lゲルライト（Gelrite）を補足し、ｐＨ５．２に調整する。
− Ａｈｘ１．５VII ｐ５００ｉｎｏ１０００ｐｐＴ１０：ＭＳ塩に、１０００mg/lミオ−イノシトール、０．５g/l ＭＥＳ、３０g/lショ糖、１０g/lグルコース、１．５mg/l ２，４−Ｄ、２．５g/lフィタゲル（Phytagel）、１０mg/lグルホシネート−アンモニウム、５００mg/lカルベニシリンを補足し、ｐＨ５．８に調整する。
− Ｍｈ１VII ｐ５００ｐｐＴ５：Ｎ６培地に、０．５g/l ＭＥＳ、２０g/lショ糖、１mg/l ２，４−Ｄ、５g/lグルホシネート−アンモニウム、５００mg/lカルベニシリンを補足し、ｐＨ５．８に調整する。
− Ａ３７VII ｐ５００ｐｐＴ２：ＭＳ塩に、０．５g/l ＭＥＳ、３０g/lショ糖、５mg/lゼアチン、２．５g/lフィタゲル（Phytagel）、２mg/lグルホシネート−アンモニウム、５００mg/lカルベニシリンを補足し、ｐＨ５．８に調整する。
− ＬＳIIＤｈｙ１．５XI：ＬＳＩＤｈｙ１．５VII培地と同様であるが、６mM Ｌ−プロリンの代わりに１g/lのカサイノ酸（casaino acids）、そして２．５g/lゲルライト（Gelrite）の代わりに０．５％アガロースＢＲＬウトルラピュア（BRL Utlra Pure）を使用した。
− Ａ６％VII ｐ５００ｐｐＴ２：ＭＳ塩に、０．５g/l ＭＥＳ、６０g/lショ糖、２．５g/lフィタゲル（Phytagel）、２mg/lグルホシネート−アンモニウム、５００mg/lカルベニシリンを補足し、ｐＨ５．８に調整する。
１．２． Ｔ−ＤＮＡベクター：
例を通して、以下のＴ−ＤＮＡベクターを使用した：
− ｐＧＳＶ７１：ｐＧＳＣ１７００（コルネリセンとバンデビーレ（Cornelissen and Vandewiele）、１９８９）由来のＴ−ＤＮＡベクターであるが、β−ラクタマーゼ遺伝子が欠如していることと、Ｔ−ＤＮＡが存在することで異なり、配列番号１の配列を特徴とする。ｐＧＶＳ７１は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターに機能的に結合した選択性キメラｂａｒマーカー遺伝子と、ノパリンシンターゼ遺伝子の３’末端を有する。
− ｐＴＣＯ１１４：ｐＧＶＳ７１に類似のＴ−ＤＮＡベクターであるが、ｂａｒ遺伝子のコード配列（ヌクレオチド１４３７位からヌクレオチド１９８８位までの配列番号１のヌクレオチド配列）が、トウモロコシのａｄｈ１遺伝子のイントロンを含むｂａｒ遺伝子の配列（配列番号２のヌクレオチド配列）により置換されている。
− ｐＴＣＯ１２１：約１．３kbのＢｇｌII−ＳｐｈＩ断片上にｐＴｉＢｏ５４２由来の追加のｖｉｒＧ遺伝子を有するＴ−ＤＮＡベクター。Ｔ−ＤＮＡは基本的にｐＴＣＯ１１４と同じである。このベクターは以下の方法で作製された：
約１．３kbのＢｇｌII−ＳｐｈＩ断片を、ｐＣＮＬ２（リウ（Liu）ら、１９９２）から精製した。この断片は、ｖｉｒＢオペロンの３’末端、完全なｖｉｒＧ遺伝子、およびｐＴｉＢｏ５４２からのｖｉｒＣオペロンの３’末端を有する。この断片をＴ４ポリメラーゼで処理して平滑末端とし、ＸｂａＩで線状化しクレノウで処理したｐＧＳＶ８に連結し、ｐＧＳＶ１５を得た。ｐＧＳＶ８は、ｐＧＳＣ１７００（コルネリセンとバンデビーレ（Cornelissen and Vandewiele）、１９８９）由来のＴ−ＤＮＡベクターであるが、β−ラクタマーゼ遺伝子が欠如していることと、Ｔ−ＤＮＡが存在することで異なり、配列番号３の配列を特徴とする。次の工程で、キメラ選択性ｂａｒマーカーを有するＴ−ＤＮＡをｐＧＳＶ１５に導入した。このために、ｐＧＳＶ１５の約１．２kbのＥｃｏＲＩ−ＢｓｔＥII断片（ｐＧＳＶ１５のＴ−ＤＮＡ内のＥｃｏＲＩ部位）を、Ｔ−ＤＮＡを含むｐＴＣＯ１１４（右の境界を除く）からの約４kbのＥｃｏＲＩ−ＢｓｔＥII断片で置換し、ｐＴＣＯ１２１を得た。
− ｐＶＥ２００：ｐＴＣＯ１２１として同じＴ−ＤＮＡを有するＴ−ＤＮＡベクターであり、ｖｉｒＢオペロン（ｖｉｒＢ１１読みとり枠を含む）の３’末端、完全なｖｉｒＧ遺伝子、およびｖｉｒＣオペロンの３’末端を含む、類似のｐＴｉＢｏ５４２断片を有するが、ｖｉｒＢオペロンの３’末端は、ＰＣＲ増幅したｖｉｒＢプロモーター断片により機能的に結合（すなわち、これに先行される）されている。このベクターは以下の方法で作製した：
− プライマーＶＧ４０（配列番号４）とＶＧ４１（配列番号５）および鋳型としてＡ３４８（ｐＳＭ３０）（スタチェルとネスター（Stachel and Nester）、１９８６）からの総ＤＮＡを使用して標準的ポリメラーゼチェイン反応により、ｖｉｒＢプロモーター断片を増幅した。ダス（Das）ら（１９８６）が記載したｖｉｒＢプロモーターを含む、約３９０塩基対の得られた断片（基本的に、ＥＭＢＬ受け入れ番号Ｊ０３２１６のヌクレオチド４７５〜ヌクレオチド７６４の配列に対応する）を、ＸｂａＩとＮｈｅＩで消化し、ＸｂａＩで線状化したｐＣＮＬ２（リウ（Liu）ら、１９９２）に連結して、ｐＶＥ１９４を得た。ｐＶＥ１９４では、ｖｉｒＢオペロンの３’末端は、ｖｉｒＢプロモーターの転写制御下にある。
− 次に、ｖｉｒＢプロモーターの制御下にあるｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＢオペロンの３’末端とｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＧ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ｐＶＥ１９４の約１．６kbのＸｂａＩ−ＢｇｌII断片、ｐＶＥ１９４の約１．３kbのＢｇｌII−ＳｐｈＩ断片、およびｐＧＳＶ８からの約７．２kbのＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片の間で、３者連結を行い、Ｔ−ＤＮＡを有するＴ−ＤＮＡベクターに導入した。得られたプラスミドを、ｐＴＶＥ１９７と命名した。
− ｐＴＣＯ１１４の選択マーカー遺伝子を、以下の３つの断片の連結により、ｐＴＶＥ１９７に導入し：
ｉ）ｖｉｒＢの３’末端とｖｉｒＧ遺伝子を含む、ｐＴＶＥ１９７の約５．３kbのＢａｎII−ＢｓｔＥII断片；
ii）右のＴ−ＤＮＡ境界を有する、ｐＴＶＥ１９７の約３．７kbのＢａｎII−ＥｃｏＲＩ断片；
iii）キメラ選択ｂａｒ遺伝子と左のＴ−ＤＮＡ境界を有する、ｐＴＣＯ１１４の約４kbのＥｃｏＲＩ−ＢｓｔＥII断片、
そして、Ｔ−ＤＮＡベクターｐＶＥ２００を得た。
１．３． アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株
Ｔ−ＤＮＡベクターであるｐＧＳＶ７１、ｐＴＣＯ１１４、ｐＴＣＯ１２１、およびｐＶＥ２００を、３親（triparental）接合プロトコール（ディッタ（Ditta）ら、１９８０）を使用して、ストレプトマイシン（３００μg/ml）とスペクチノマイシン（１００μg/ml）に対する耐性について選択して、ヘルパープラスミドｐＥＨＡ１０１を有するヘルパーＴｉ−プラスミドｐＡＬ４４０４またはＥＨＡ１０１を含むアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４に導入した。
例を通して、以下の株を使用した：
Ａ３５９３株：ｐＧＳＶ７１を含むＬＢＡ４４０４
Ａ３５３２株：ｐＴＣＯ１２１を含むＬＢＡ４４０４
Ａ３６３８株：ｐＶＥ２００を含むＬＢＡ４４０４
Ａ３４６０株：ＰＴＣＯ１１４を含むＥＨＡ１０１
Ａ３５３３株：ＰＴＣＯ１２１を含むＥＨＡ１０１
Ａ３６３７株：ｐＶＥ２００を含むＥＨＡ１０１
例
例１．トウモロコシからのアセトシリンゴン前処理したＩ型カルスのアグロバクテリウム−介在形質転換
Ｉ型カルス断片は、基本的にＷＯ９２／０９６９６に記載のように得た。受粉の９〜１２日後に、トウモロコシ株（Ｐａ９１×Ｈ９９）×Ｈ９９（ＰＨＨ−株）からの未成熟胚を穀粒から切り出し、表面を滅菌し、Ｉ型カルスの誘導のためにＭａｈｉ１VII上に広げた。Ｉ型カルスを、１ヶ月間隔で約２〜６ヶ月間、同じ培地で継代した。次に、Ｉ型カルスを、平均長さ約１．５mmの断片に細かく切断し、得られた断片を、１００〜２００μＭアセトシリンゴンを補足したＬＳＩＤｈｙ１．５VII基質上で５日間インキュベートした。あらかじめ誘導したカルス片を集め、さらに傷害することなく、適当なアグロバクテリウム株の懸濁液に約３〜約２０分間浸漬した。細菌懸濁液を以下の方法で得た：ＭＡＧ培地［２g/lグルコースを補足した最小Ａ培地（ジェフリー・ミラー（Jeffrey Miller）、１９７２）］、またはＡＢ培地（チルトン（Chilton）ら、１９７４）で、細菌を３〜６日間増殖させた。細菌を採取し、１００〜２００μＭアセトシリンゴンを補足した液体ＬＳＩ基質に、約５×１０9細胞/mlの濃度で再懸濁した。
細菌懸濁液中に浸漬後、カルス断片を、１００〜２００μＭアセトシリンゴンを補足したＬＳIIＤｈｙ１．５XI培地上で、約２５℃で３〜６日間同時培養した（ＬＢＡ−型株については３日間、ＥＨＡ−型株については６日間）。
同時培養後、組織をＡｈｘ１．５VII ｐ５００ｉｎｏ１０００ｐｐＴ１０に移し、３〜４日間培養した。増殖しているホスフィノトリシン（ＰＰＴ）−耐性カルスを切り出し、Ｍｈ１VII ｐ５００ｐｐＴ５上で３週間の継代間隔で少なくとも２回継代した。胚形成性ＰＰＴ−耐性カルスを、再生培地（Ａ３７VII ｐ５００ｐｐＴ２．）上に広げ、同じ培地上で１０〜１４日間の間隔で胚形成性組織を２回継代した。小さい植物を、Ａ６％VII ｐ５００Ｔ２基質を含有するガラス容器に移してさらに増殖させ、次に、成長してくる苗条を１．５％ショ糖を補足した半強度のＭＳ培地に移して、さらに苗条の伸長と根の成長をさせた。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）活性について植物を試験し、ＰＡＴ陽性植物を温室に移した。ＰＡＴ陽性植物を、サザンハイブリダイゼーションによりトランス遺伝子の存在について試験した。
Ｉ型カルス断片がアセトシリンゴン含有培地でのインキュベーション（実験欄で記載したアグロバクテリウム株による同時培養）により前処理されなかった対照実験では、平均形質転換頻度は０．１％を超えなかった（表１を参照）が、ＰＡＴ陽性植物が各ケースで得られた。
アセトシリンゴンを用いる前処理により、アグロバクテリウム株との同時培養によるＩ型カルスの形質転換効率が少なくとも３倍上昇した。アセトシリンゴンで前処理した約１７００のカルス断片をＡ３４６０株と同時培養すると、５つのＰＡＴ陽性株が得られた（平均形質転換頻度は約０．３％；表１を参照）。
（各シリーズの実験について）約４０００の前処理カルス断片をアグロバクテリウム株Ａ３６３８、Ａ３５３３およびＡ３６３７と同時培養すると、それぞれ３７、３０および３３のＰＡＴ陽性植物株が得られた（平均形質転換頻度は約１％）。従ってこれらの実験において、形質転換効率は少なくとも約７〜１０倍改良された。
アセトシリンゴンとの前処理によりトウモロコシ植物株（Ｐａ９１×Ｈ９９）×Ｐａ９１（ＰＨＰ）から得られたＩ型カルスとＰａ９１の同時培養について、形質転換頻度が増強された。
例２．追加のキメラｖｉｒＢ１１遺伝子の存在は、アグロバクテリウム−介在形質転換頻度を改良する
Ｉ型カルス断片は、例１に記載のように得られ、１００μＭのアセトシリンゴンを補足したＬＳＩＤｈｙ１．５VII基質で５日間インキュベートし、次にアグロバクテリウム株Ａ３５３２とＡ３６３８とともに同時培養した。Ａ３５３２株についてはアセトシリンゴン前処理を行ってもＰＡＴ陽性株が１つのみしか得られなかった（形質転換頻度＜０．１％）。しかし、Ｔ−ＤＮＡベクターのｖｉｒＢ１１読みとり枠に先行する機能性ｖｉｒＢプロモーターの存在は、形質転換効率を少なくともほとんど１０倍改良した（表１を参照）。
例３．異なる植物性フェノール性化合物で前処理したトウモロコシからのＩ型カルスのアグロバクテリウム−介在形質転換
Ｉ型カルス断片は、例１に記載のように得られ、表IIに記載の１００μＭの植物性フェノール性化合物を補足したＬＳＩＤｈｙ１．５VII基質で５日間インキュベートした。約２００のあらかじめ誘導したカルス断片を、アグロバクテリウム株Ａ３６３７（またはＡ３６３８）で同時培養した。得られたＰＡＴ陽性株の数と形質転換頻度を、表IIに要約する。
例４．アセトシリンゴンによるトウモロコシのＩ型カルスの前処理は電気穿孔法による形質転換頻度を改良する
例１に記載のように、Ｉ型カルスから得られ、１００μＭアセトシリンゴン含有培地で５日間プレインキュベートした、細かく切断したカルスを、さらに傷害することなく、ＷＯ９２／０９６９６に記載の電気穿孔法に付した。簡単に説明すると、約５０のカルス片を、１００μｌのＥＰＭ−ＫＣｌ緩衝液に再懸濁し、室温で３時間あらかじめ原形質分離した。次にカルス片をＥＰＭ＋ＫＣｌ緩衝液で洗浄し、エレクトロキュベットのＥＰＭ＋ＫＣｌ緩衝液に移した。プラスミドＤＮＡ（１０μｇのｐＤＥ１１０）を加え、ＤＮＡをカルス断片で室温で約１時間インキュベートした。標準的条件（９００μＦコンデンサーからの初期電界強度３７５Ｖ／cmで１パルス）で電気穿孔法を行った。カルスは決して氷上には置かなかった。ホスフィノトリシン耐性カルスを選択し、既に記載されている（ＷＯ９２／０９６９６）ように植物を再生した。既に記載されている（ＷＯ９２／０９６９６）ように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性を検出した。
アセトシリンゴン（約０．２３％）で前処理しなかった約５６４０のカルス片の対照電気穿孔法により１３のＰＡＴ陽性植物が得られたが、アセトシリンゴン（約０．７５％）で前処理した約５３０のカルス片の電気穿孔法により４つのＰＡＴ陽性植物が得られた。すなわち、細かく切断したＩ型カルスを１００μＭアセトシリンゴン含有培地で５日間インキュベートして前処理した時、形質転換頻度は約３倍高かった。
例５．植物性フェノール性化合物の組合せは形質転換頻度をさらに上げる
Ｉ型カルス断片を例１に記載のように得て、２００μＭアセトシリンゴン、又は１００μＭアセトシリンゴンと１００μＭ ｐ−ヒドロキシ安息香酸の組合せで補足したＬＳＫＤｈｙ１．５VII基質で５日間インキュベートした。約２５０のカルス片をアグロバクテリウムＡ株３５３３と同時培養した。アセトシリンゴンでプレ誘導後ＰＰＴ含有培地で２つの苗条再生株（１つのＰＡＴ陽性株を含む）が得られ（頻度約１％）、アセトシリンゴン＋ｐ−ヒドロキシ安息香酸でプレ誘導後ＰＰＴ含有培地で７つの苗条再生株（５つのＰＡＴ陽性株を含む）が得られた（頻度約３％）。
例６．例１〜５のアグロバクテリウム−介在形質転換により得られたトランスジェニックトウモロコシ植物の解析
前述の例のトランスジェニックトウモロコシ植物を、サザン解析により解析した。
第１の例において、単一のトランスジェニックカルス株から再生されたすべてのトランスジェニック植物が同一であるか、またはこれらは独立の形質転換に由来するかを証明した。２４の独立したトランスジェニックカルス株から得られたすべての再生植物をサザンで解析し、３７の異なるタイプのＴ−ＤＮＡ組み込みを同定した。すなわち、２４の植物株（説明の欄に記載した）が、少なくとも３７の独立した形質転換を示した。従って、形質転換した１００のカルス片について得られたトランスジェニック植物株の数として表した形質転換頻度は、実際の形質転換頻度より小さい。
次に、異なるトウモロコシ株中のトランス遺伝子のコピー数を、サザンハイブリダイゼーションにより解析した。解析した形質転換株（Ｔ０）のほとんどは、比較的単純なＴ−ＤＮＡ組み込みパターン（４コピー未満）を示した。解析したトランス遺伝子株の約１／３（５６／１４８）は、単一コピーＴ−ＤＮＡ組み込みを有した。ほんのわずかの株のみ（＜１０％）が、より複雑なＴ−ＤＮＡ組み込みパターン（＞４コピー）を示した。
前述の例のトランス遺伝子トウモロコシ植物を、子孫のトランス遺伝子の分離パターンについても解析した。バスタ（Basta）除草剤スプレーを使用して、５７の独立したトランス遺伝子カルス株から再生された１１３植物中のＰＡＴ活性の分離を追跡した。３２の独立したトランス遺伝子カルス株から再生した７４の植物の子孫では、ＰＡＴ活性の１：１分離が観察され、Ｔ０植物では、１つのコピーまたはいくつかの密接に結合したコピーで除草剤耐性トランス遺伝子が存在することを示していた。１８の独立したトランス遺伝子カルス株から再生した３１の植物の子孫では、すべての植物がバスタ（Basta）除草剤スプレーに対して耐性があるか、または有意に多くの植物が感受性ではなく耐性であり、Ｔ０植物中に２つまたはそれ以上のトランス遺伝子の結合していないコピーが存在することを示していた。最後に、７つの独立したトランス遺伝子カルス株から再生した１４の植物の子孫では、耐性のある植物はまったく無いかまたは有意に多くの植物が耐性ではなく感受性であった。これらの後者の植物は、これ以上解析しなかった。
５３の独立に形質転換したトウモロコシ植物（Ｔ０）についてバスタ（Basta）除草剤に対して耐性のＴ１子孫の２つの植物のサザン解析は、約７０％の解析したケース（３５／５３）で、両方の子孫の植物はＴ０親植物株と同じＴ−ＤＮＡ組み込みパターンを有することを証明した。約１８％（１０／５３）のケースで分離が観察された。
文献
配列表
（１）一般情報：
（i）出願人：
（Ａ）名称：プラント・ジェネティック・システムズ・エヌ・ブイ（Plant Genetic Systems N.V.）
（Ｂ）通り：ジョゼフ・プラトーストラート２２（Jozef Plateaustraat 22）
（Ｃ）市：ゲント（Gent）
（Ｅ）国：ベルギー
（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：Ｂ−９０００
（Ｇ）電話：３２ ９ ２３５ ８４ ５４
（Ｈ）ファックス：３２ ９ ２２３ １９ ２３
（ii）発明の名称：植物の形質転換改良法
（iii）配列の数：５
（iv）コンピューターで読める形式：
（Ａ）媒体の型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣコンパチブル
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース＃１．０、バージョン＃１．３０（PatentIn Release #1.0, Version #1.30）（ヨーロッパ特許庁（EPO））
（２）配列番号：１の情報：
（i）配列の特色：
（Ａ）長さ：２３４５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（Ａ）説明：/desc=「ｐＧＳＶ７１のＴ−ＤＮＡ」
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：−
（Ｂ）位置：１．．２５
（Ｄ）他の情報：/label=RB
/note=「Ｔ−ＤＮＡ右の境界」
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：−
（Ｂ）位置：５３．．１４３６
（Ｄ）他の情報：/note=「ＣａＭＶ３５Ｓ Ｐ３プロモーター」
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）位置：１４３７．．１９８８
（Ｄ）他の情報：/product=「ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ」
/label=bar
/note=「ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする領域」
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：−
（Ｂ）位置：２００７．．２２６６
（Ｄ）他の情報：/label=３’nos
/note=「アグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔ−ＤＮＡのノパリンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化シグナルを含有する３’非翻訳領域」
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：−
（Ｂ）位置：２３２１．．２３４５
（Ｄ）他の情報：/label=LB
/note=「Ｔ−ＤＮＡ左の境界」
（xi）配列：配列番号：１：
（２）配列番号：２の情報：
（i）配列の特色：
（Ａ）長さ：１０８６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（Ａ）説明：/desc=「ａｄｈ１イントロンを含むｂａｒ遺伝子のコード領域」
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）位置：１．．２３３
（Ｄ）他の情報：/product=「ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（Ｎ末端の半分）」
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：intron
（Ｂ）位置：２３４．．７６９
（Ｄ）他の情報：/standard_name=「ａｄｈ１イントロン」
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）位置：７７０．．１０８６
（Ｄ）他の情報：/product=「ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ末端の半分）」
（xi）配列：配列番号：２：
（２）配列番号：３の情報：
（i）配列の特色：
（Ａ）長さ：１０８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（Ａ）説明：/desc=「ｐＧＳＶ８のＴ−ＤＮＡ」
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：−
（Ｂ）位置：１．．２５
（Ｄ）他の情報：/label=RB
/note=「ｐＧＳＶ８のＴ−ＤＮＡからの右の境界の配列」
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：−
（Ｂ）位置：２６．．８３
（Ｄ）他の情報：/label=MCS
/note=「多重クローニング部位」
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：−
（Ｂ）位置：８４．．１０８
（Ｄ）他の情報：/label=LB
/note=「ｐＧＳＶ８のＴ−ＤＮＡからの左の境界の配列」
（xi）配列：配列番号：３：
（２）配列番号：４の情報：
（i）配列の特色：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（Ａ）説明：/desc=「オリゴヌクレオチドＶＧ４０」
（xi）配列：配列番号：４：
（２）配列番号：５の情報：
（i）配列の特色：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（Ａ）説明：/desc=「オリゴヌクレオチドＶＧ４１」
（xi）配列：配列番号：５：
（ｉ）発明の分野
本発明は、植物細胞特に単子葉植物細胞（特に、トウモロコシ、イネ、コムギおよびオオムギ細胞）の組織培養、および遺伝的に形質転換された植物細胞および植物を得るための改良法に関する。
（ii）関連技術の説明
長年の間、植物の遺伝的形質転換のために多くの技術が開発されてきた。これらの方法の究極の目標は、すべての細胞が、ゲノム（特に、核ゲノム）内に安定に組み込まれた目的の遺伝子（いわゆるトランス遺伝子）を含む外来ＤＮＡを含有する、トランスジェニック植物を得ることである。
形質転換は、出発細胞を絶えずＤＮＡ（通常、目的の外来遺伝子を含むＤＮＡ）に接触させる複雑なプロセスである。ＤＮＡへの細胞の接触は、細胞によるＤＮＡの摂取およびＤＮＡの組み込み（細胞のゲノムへの目的の遺伝子の組み込みを含む）を促進する条件下で行われる。
形質転換の出発細胞は、通常インビトロでしばらく培養された細胞である。細胞をＤＮＡに接触させた後、形質転換された細胞は一般に、形質転換された細胞を形質転換されていない細胞から分離するために、および形質転換された細胞から形質転換された植物を再生するために、インビトロで一定期間培養する必要がある。
植物の異なる形質転換法が記載されており、直接ＤＮＡ移動法（例えば、電気穿孔法、ＰＥＧ−介在ＤＮＡ摂取、バイオリスティックス（biolistics））、またはアグロバクテリウム（Agrobacterium）−介在ＤＮＡ移動法に分類される。バシル（Vasil）（１９９４）とクリストウ（Christou）（１９９４）は、穀類について入手できる植物形質転換法を概説している。
アグロバクテリウム−介在ＤＮＡ移動法は、植物細胞へのＤＮＡ移動の最も効率的な方法の１つであり、必要とする技術的ハードウェアはおそらく、種々の形質転換法の中で最も少ないであろう。また定量的には、アグロバクテリウム−介在ＤＮＡ移動法により形質転換された植物は、染色体中の異なる位置に挿入されるトランス遺伝子の数が少ないこと、および異常なトランス遺伝子の発生頻度が低いことで、優れている。植物のアグロバクテリウム−介在ＤＮＡ形質転換は、あるアグロバクテリウム株が、そのＴｉ−プラスミドの一部（すなわち、Ｔ−ＤＮＡ）を植物細胞に導入する能力、および細胞の核ゲノム内にこのＴ−ＤＮＡを組み込む能力に基づく。移送され組み込まれるＴｉ−プラスミドの部分は、特異的なＤＮＡ配列（いわゆる、左および右のＴ−ＤＮＡボーダー配列）により区別され、これらのボーダー配列の間の天然のＴ−ＤＮＡ配列は、外来ＤＮＡで置換することができることがわかった（ヨーロッパ特許公報ＥＰ１１６７１８；デブラエレ（Deblaere）ら、１９８７）。
単子葉植物のアグロバクテリウム−介在形質転換は、数回報告されている（下記参照）。しかし、報告された方法の使用は、特定の種または遺伝子型に限定されているか、または特定の組織もしくは特殊なアグロバクテリウム株の使用が必要である。報告された方法の大部分では、形質転換効率はまだ改良の余地が大きい。
フーイカース−バンスログテレン（Hooykaas-Van Slogteren）ら（１９８４）は、発ガン性のアグロバクテリウム株で感染された２つの単子葉植物種（クロロフィツム・カペンセ（Chlorophytum capense）とスイセン属の栽培品種「ペーパーホワイト」（Narcissus cv ’Paperwhite’））における、Ｔｉ−プラスミド遺伝子発現の検出を記載している。
ヘルナルスティーンズ（Hernalsteens）ら（１９８４）とビテビアー（Bytebier）ら（１９８７）は、天然のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）単離株ならびに非発ガン性のＴ−ＤＮＡを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を使用する、アスパラガス・オフィシナリス（Asparagus officinalis）の形質転換を記載している。
米国特許第５，１６４，３１０号は、切り出し培養した植物の苗条の頂点にアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を接種する、植物（トウモロコシとコムギを含む）の形質転換法を記載している。
米国特許第５，１８７，０７３号と第５，１７７，０１０号は、急速に分裂している細胞を含む苗の部分で苗に傷をつけ、この傷にｖｉｒ＋アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を接種することを含んでなる、形質転換されたイネ科植物（トウモロコシ）の産生方法を記載している。
ＰＣＴ特許公報ＷＯ９２／０９６９６は、形質転換法の出発物質として、単子葉植物（例えば、トウモロコシおよびイネ）の緻密な胚発生カルス（すなわち、トウモロコシのＩ型カルス）および未成熟胚（機械的または酵素的に傷をつけた）の使用を記載している。
ＥＰ０６０４６６２Ａ１は、目的の遺伝子を含有するアグロバクテリウム属の細菌による脱分化中または脱分化後に、単子葉植物の培養組織を形質転換する方法を記載している。ＥＰ０６７２７５２Ａ１は、単子葉植物の未分化未成熟胚の胚盤をアグロバクテリウムで形質転換する方法を記載している。いずれの特許出願も、Ｔｉ−プラスミドまたはＲｉプラスミド以外に、Ｔｉ−プラスミドｐＴｉＢｏ５４２の毒性の強い領域に由来するＤＮＡ断片を含有するプラスミドを有するアグロバクテリウム株の使用を記載している。
ライネリ（Raineri）ら（１９９０）は、胚盤部分を傷つけたイネの２つの品種の胚由来の培養物の、アグロバクテリウム介在遺伝子移動システムを使用する形質転換を記載している。
チャン（Chan）ら（１９９３）は、ジャガイモ懸濁培養細胞を含有する培地上でアグロバクテリウム株を接種して、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（「２，４−Ｄ」）の存在下で２日間培養したイネの未成熟胚を形質転換する方法を記載している。
ムーネイ（Mooney）ら（１９９１）は、コムギの酵素処理した胚へのカナマイシン耐性遺伝子の、アグロバクテリム−介在導入法を記載している。
形質転換を増強するための同時培養の前の、アセトシリンゴン（acetosyringone）とのアグロバクテリウム株のインキュベート、およびこの細菌との植物細胞の同時培養の間のアセトシリンゴンの添加による、アグロバクテリウム株のＴｉ−プラスミドまたはヘルパープラスミドのｖｉｒ遺伝子の誘導が、報告されている（バン・ウォルドラゲンとドンス（Van Wordragen and Dons）、１９９２；ジャック（Jacq）ら、１９９３；ジェームス（James）ら、１９９３）。
グイバルチ（Guivarc’h）ら（１９９３）は、ニンジンの根の円盤状組織をアセトシリンゴンで１０分間という短時間だけ前処理する、この組織の一過性アグロバクテリウム−介在形質転換の改良を記載している。
発明の要約と目的
単子葉植物細胞（特に、トウモロコシ、イネ、コムギまたはオオムギ細胞）のゲノムへのＤＮＡ断片の組み込み法であって、
１）ＤＮＡ断片との接触の前に、植物性フェノール性化合物（特に、アセトシリンゴン、α−ヒドロキシ−アセトシリンゴン、シナピン酸、シリンジ酸（syringic acid）、フェルリ酸（ferulic acid）、カテコール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、β−レソルシル酸（β-resorcylic acid）、プロトカテク酸、ピロガロール酸、没食子酸、およびバニリンから選択される植物性フェノール性化合物）を含む培地上で、非形質転換単子葉植物細胞の培養物を、細胞分裂を刺激し外来ＤＮＡの組み込み能を増強するのに充分な時間、好ましくは約１〜１０日間、特に約４〜５日間、インキュベートする工程；および
２）ＤＮＡ断片が非形質転換細胞により摂取され、非形質転換細胞のゲノムに安定に組み込まれる条件下で、非形質転換細胞にＤＮＡ断片を接触させて、特に電気穿孔法、ポリエチレングリコールを使用する直接遺伝子移動、ＤＮＡコーティングしたマイクロプロジェクタイルによる衝撃、またはＤＮＡ断片を含むアグロバクテリウム株との同時培養法により、形質転換細胞を産生する工程、
を含んでなる、上記方法が提供される。
場合により、形質転換した細胞は再生して、トランスジェニック単子葉植物にすることができる。
さらに、トウモロコシ植物の細胞のゲノム内にＤＮＡ断片を組み込むための方法であって、
ＤＮＡ断片と接触させる前に、Ｉ型カルス、特に断片（特に、最大０．５〜５mmの長さの断片）に切断したＩ型カルスを、植物性フェノール性化合物（アセトシリンゴン、α−ヒドロキシ−アセトシリンゴン、シナピン酸、シリンジ酸（syringic acid）、フェルリ酸（ferulic acid）、カテコール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、β−レソルシル酸（β-resorcylic acid）、プロトカテク酸、ピロガロール酸、没食子酸、およびバニリンから選択される植物性フェノール性化合物）と、細胞分裂を刺激し外来ＤＮＡの組み込み能を増強するのに充分な時間、好ましくは約１〜１０日間、特に約４〜５日間、インキュベートする工程；または
ＤＮＡ断片と接触させる前に、Ｉ型カルスを、植物性フェノール性化合物を含む培地上で、細胞分裂を刺激し外来ＤＮＡの組み込み能を増強するのに充分な時間インキュベートした後、Ｉ型カルスを断片（特に、最大０．５〜５mmの長さの断片）に切断する工程；および
２）ＤＮＡ断片が非形質転換細胞により摂取され、非形質転換細胞のゲノムに安定に組み込まれる条件下で、非形質転換細胞にＤＮＡ断片を接触させて、特に電気穿孔法、ポリエチレングリコールを使用する直接遺伝子移動、ＤＮＡコーティングしたマイクロプロジェクタイルによる衝撃、またはＤＮＡ断片を含むアグロバクテリウム株との同時培養法により、形質転換細胞を産生する工程、
を含んでなる、上記方法が提供される。
また、植物性フェノール性化合物の存在下で単子葉植物中の安定な形質転換の頻度を増加させる方法が提供され、ここで植物性フェノール性化合物は、培養組織に外来ＤＮＡを接触させる前に植物細胞が培養される培地中に含有される。
さらに、少なくとも２つの植物性フェノール性化合物を含む植物培地組成物が提供される。
好適な実施態様の詳細な説明
本発明は、植物のカルス、特にトウモロコシのカルス（特に、トウモロコシの細かく切断したＩ型カルス）を、植物性フェノール性化合物（例えば、アセトシリンゴン）を含む培地上で約５日間培養すると、細胞分裂が大きく刺激され、アグロバクテリウム−介在形質転換により細胞内に移送された外来ＤＮＡのゲノム中への組み込み能が増強されたカルスを再現性良く産生する（これは標準的条件下で回収された形質転換細胞および植物の数に反映される）という観察に基づく。
本明細書において使用される「非形質転換細胞」とは、本発明の方法を応用する時使用されるであろう特定のＤＮＡ断片に接触していない細胞を意味する。このような細胞はまた、異なるかまたは同じＤＮＡ断片であらかじめ形質転換したトランスジェニック植物または植物組織から得られることは言うまでもない。
本明細書において使用される「形質転換の効率」または「形質転換の頻度」とは、標準的実験条件下（すなわち、外来ＤＮＡと接触した細胞の量、送達されたＤＮＡの量、ＤＮＡ送達のタイプと条件、および一般的培養条件など）で回収される形質転換細胞（または、個々の形質転換細胞から増殖させたトランスジェニック生物）の数により測定することができる。例えば、カルス断片が形質転換の出発物質として使用される時、形質転換の頻度は、形質転換された１００個のカルスについて得られるトランスジェニック植物株の数で表現することができる。本発明の方法を使用して、約１％またはそれ以上の形質転換頻度が得られた。
本明細書において使用されるトランスジェニック「植物株」は、再生プロセスの間に得られたある単位の培養細胞（例えば、１つの形質転換されたカルス片）由来の、トランスジェニック植物の群から構成される。一般に、１つの植物株からの植物は遺伝的に同一であり、１つの形質転換事象に由来し、従って同じゲノム位置に組み込まれた同じトランス遺伝子を含む。しかし、本明細書で定義された１つの植物株からの個々の植物は、特にアグロバクテリウム−介在ＤＮＡ移動法を使用する時、独立した形質転換に由来することができ、従って互いに異なることもある。形質転換頻度を１００個の最初のカルス片当たりの植物株の数で表すと、実際の形質転換頻度（形質転換の頻度／１００個の最初のカルス片）はさらに高くなる。
本発明に適した「植物性フェノール性化合物」または「植物のフェノール性物質」とは、陽性の走化性応答を誘導することができる、単離され置換されたフェノール性分子、特にアグロバクテリウム種を含有するＴｉ−プラスミド（特に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を含有するＴｉ−プラスミド）中でｖｉｒ遺伝子発現の増加を誘導することができるものである。植物性フェノール性化合物に対する走化性応答を測定する方法は、アシュビ（Ashby）ら（１９８８）により記載され、ｖｉｒ遺伝子発現の誘導を測定する方法も公知である（スタチェル（Stachel）ら、１９８５；ボルトン（Bolton）ら、１９８６）。
植物性フェノール性化合物を含有する培地上の植物組織のインキュベーションが形質転換効率に及ぼす有効な作用は、主に細胞分裂の誘導および植物細胞のゲノム内への外来ＤＮＡの取り込み能の増強が原因であると考えられている。多くの単子葉植物（特に、穀類植物）は傷がつくと、多くの双子葉植物で観察されたものと類似の方法では応答しない（ポトリクス（Potrykus）、１９９１）。植物性フェノール性化合物を外から供給すると、特に単子葉植物に適用した時に傷様の応答を引き起こすことがあることが知られている。前処理した植物組織に摂取される植物性フェノール性化合物の残存濃度によるｖｉｒ遺伝子の誘導はまた、形質転換効率に影響を及ぼすが、この作用はあまり重要ではないと考えられている。確かに、直接ＤＮＡ移動法を使用して、形質転換の同様の増強が観察された。
好適な植物性フェノール性化合物は、植物細胞の傷滲出液中に存在するものである。最もよく知られている植物性フェノール性化合物の１つは、アセトシリンゴンであり、これは濃度が異なるが、種々の多くの植物の傷ついた細胞および無傷の細胞中に存在する。しかし、アセトシリンゴン（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシアセトフェノン）は、ｖｉｒ遺伝子の発現を誘導することができる唯一の植物性フェノール性物質ではない。他の例には、α−ヒドロキシ−アセトシリンゴン、シナピン酸（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸）、シリンジ酸（syringic acid）（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸）、フェルリ酸（ferulic acid）（４−ヒドロキシ−３−メトキシケイ皮酸）、カテコール（１，２−ジヒドロキシベンゼン）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸（４−ヒドロキシ安息香酸）、β−レソルシル酸（β-resorcylic acid）（２，４−ジヒドロキシ安息香酸）、プロトカテク酸（３，４−ジヒドロキシ安息香酸）、ピロガロール酸（２，３，４−トリヒドロキシ安息香酸）、没食子酸（３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸）、およびバニリン（３−メトキシ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド）があり、これらの植物性フェノール性化合物は、培地中のアセトシリンゴンの代わりに使用しても同様の結果が得られることが知られているかまたは得られることが期待される。本明細書において使用される上記の分子は、植物性フェノール性化合物と呼ぶ。
植物性フェノール性化合物は、単独でまたは他の植物性フェノール性化合物と組合せて、植物の培地に加えることができる。植物性フェノール性化合物の特に好適な組合せは、少なくともアセトシリンゴンとｐ−ヒドロキシ安息香酸とを含有するが、２つまたはそれ以上の植物性フェノール性化合物の他の組合せも、相乗的に作用して形質転換効率を増強するであろう。
さらに、浸透圧保護物質（例えば、Ｌ−プロリン、好ましくは約７００mg/lの濃度、またはベタイン）、植物ホルモン（特に、ＮＡＡ）、オピネス（opines）、または糖などの化合物は、植物性フェノール性化合物と一緒に添加されると相乗作用を示すと予想される。
本発明は、植物細胞（特に、トウモロコシ細胞）への改良されたアグロバクテリウム−介在ＤＮＡ移動法に特に有用であるが、植物性フェノール性化合物で前処理した植物細胞（特に、単子葉植物）の培養物もまた、直接ＤＮＡ移動法（例えば、ＰＥＧ介在ＤＮＡ移動、粒子衝撃法または電気穿孔法）を使用して、形質転換の効率を改良するのに使用することができる。すなわち、基本的には本発明は、細胞が培養される培地中に、一定時間植物性フェノール性化合物（例えば、アセトシリンゴン）を含有させることにより、植物細胞（特に、単子葉植物細胞、特にトウモロコシ細胞）の遺伝的形質転換のための既存法の改良を提供する。特に植物細胞または植物組織は、アセトシリンゴン（１００〜２００μＭ）を含有する培地で５日間培養した後、細胞を外来ＤＮＡと接触させて、これを直接または電気穿孔法、ＰＥＧ介在ＤＮＡ移動または粒子衝撃法、または好ましくはアグロバクテリウム−介在ＤＮＡ移動法により、細胞に導入する。
好適な実施態様において本発明の方法は、植物細胞（特に、トウモロコシ細胞）へのアグロバクテリウム−介在ＤＮＡ移動の形質転換頻度を改良するために使用される。
植物細胞、特に単子葉植物細の遺伝的形質転換のための多くの従来法では、培養細胞、組織または外植体が出発物質として使用され、このような培養物中の細胞は、細胞のゲノム内への外来ＤＮＡの摂取を促進する条件下で、少なくとも１つの目的の遺伝子（すなわち、トランス遺伝子）を含む外来ＤＮＡと接触させられるであろう。植物細胞、組織、器官または外植体の培養に適した培地は、一般に当該分野で公知である。好適な植物培地は、化学的組成が公知の規定培地である。
本発明のある実施態様において、植物性フェノール性化合物特にアセトシリンゴンは、約４〜５または６日間（好ましくは、少なくとも５日間）培地に加えた後、細胞を外来ＤＮＡと接触させることが好ましい。培養細胞をアセトシリンゴンのような植物性フェノール性化合物を含有する培地中でインキュベートする正確な期間は、決定的に重要ではないと考えられているが、おそらく２週間を超えない方がよい。１〜１０日間（特に、３〜７日間）が最適な期間であるが、約４〜５または６日間インキュベートした後に接触させると最良の結果が得られるようである。一般に、接触時間の前に、約５日間植物性フェノール性化合物を培地に添加することが有用な期間であると考えられている。
培養組織は、植物性フェノール性化合物含有培地（特に培地に没食子酸を加えた時）でインキュベートすると褐色化または限定的壊死を示すことがあることに注意されたい。しかし、これらの培養細胞、組織または外植体を使用すると、形質転換効率が改良される。
培地中の植物性フェノール性化合物の濃度はまた、組み込み形質転換能の進展に影響を与えると考えられ、これは細胞の性質（種、組織外植体、一般的培養条件など）に依存して変化する。しかし、ある濃度範囲内では、特に培養細胞が７日を超えてインキュベートされない時は、その作用は小さい。培地中の植物性フェノール性化合物の最適濃度範囲は、その組織、細胞または細胞培養物が得られる種、または使用される組織のタイプにより変動するが、多くの目的（例えば、トウモロコシ由来の物質と使用する時）にとって約１００μＭ〜２００μＭが適当な濃度であると予測される。最適濃度はまた、使用する特定の植物性フェノール牲化合物の性質、特にその細胞分裂促進能に依存する。
例えば、アセトシリンゴンの最適濃度は、約２００μＭであることが見いだされたが、形質転換効率に対する良好な作用を得るのに、約２５μＭという低い濃度が使用できる。同様に、約４００μＭまでの高い濃度が同様の作用を示すと予測される。
他の植物性フェノール性化合物にも同様の濃度が適用され、本発明に従う実験により最適濃度は容易に確立することができる。
上記のように、植物形質転換法は一般に、培養組織に外来ＤＮＡを接触させる前に、細胞、細胞培養物、組織または外植体の培養を行う。形質転換法の出発物質としていくつかの組織が記載されており、例えば、乾燥種子、未成熟胚、未成熟の花、葯、花粒粉、胚盤、節、若い葉の基部、胚軸外植体、根（特に、根の先端）、緻密な胚カルス（例えば、トウモロコシのＩ型）、もろい胚カルス（例えば、トウモロコシのII型）、懸濁培養物、懸濁細胞凝集物の培養物、体細胞胚および苗条頂端があるが、これらに限定されない。外来ＤＮＡに接触させる前に、これらの組織、細胞、細胞培養物または外植体がインキュベートされる培地中に植物性フェノール性化合物（特に、アセトシリンゴン）を含有させると、特にアグロバクテリウム−介在形質転換を使用する時に、形質転換効率が改善されるであろう。
「（植物）培地上でインキュベートする」という用語を用いる時はいつも、培地は液体または個体であることは明白である。本発明の範囲において、植物培地は、少なくとも１つの植物性フェノール性化合物を含む。
形質転換法の究極的目標が、植物特に表現型が正常な植物を再生することである時、出発物質は、先行技術で広く記録されているような再生能があることは当然である。
特に好適な実施態様において、形質転換能のある植物細胞、好ましくはアグロバクテリウム形質転換能のある植物細胞は、植物性フェノール性化合物（好ましくはアセトシリンゴン）を含有する培地上に、緻密な再生可能なカルス（例えば、トウモロコシＩ型カルス）を含有させることにより産生できる。この目的のために、緻密なカルスは、小さい断片に切断することにより分割される。得られるカルスは、全体または少なくとも一部が、カルスの再生可能な（例えば、胚形成性）部分を含む。カルス断片はまた、好ましくは最大長が０．５〜５mm、特に１〜２mm、さらに詳しくは１．２５〜１．７５mmであり、好ましくは最小長が約０．１mmである。しかし、約１cmまでの大きなＩ型カルス断片を使用することが好ましい。植物性フェノール性化合物含有培地で培養した後、さらに傷つけたり酵素的前処理をすることなく、カルスを外来ＤＮＡ、好ましくは外来ＤＮＡを含有するアグロバクテリウムに接触させる。
あるいは、傷つける（すなわち、切断する）ことなく、植物性フェノール性化合物を含有する培地上で緻密なカルスをインキュベートし、次に傷をつけ、すなわち小さい断片（特に、上記サイズを有する断片）に切断してから、接触工程を行う。
別の実施態様において、形質転換能のある、特にアグロバクテリウム−形質転換能のある細胞を、植物性フェノール性化合物（好ましくはアセトシリンゴン）含有培地上で、未成熟胚（好ましくは、トウモロコシの未成熟胚）をインキュベートして作成する。この点でトウモロコシのような植物については、未成熟胚は、最大長が約０．５〜２mm、好ましくは０．５〜１．５mmであることが好ましいが、０．５〜１mmの長さの小さい胚も使用することができる。植物性フェノール性化合物含有培地で培養後、さらに傷害または酵素的前処理をすることなく、未成熟胚を外来ＤＮＡ（好ましくは、外来ＤＮＡを含むアグロバクテリウム）と接触させることができる。
本発明を使用して、異なる遺伝子型のトウモロコシ、特に、トウモロコシ、ＰＨＨ［（Ｐａ９１×Ｈ９９）×Ｈ９９］、Ｐａ９１ ＨＥ８９またはＰＨＰ［（Ｐａ９１×Ｈ９９）×Ｈ９１］に、アグロバクテリウム−介在ＤＮＡ移動を行うことができる。従って、本発明は遺伝子型に制限されることなく、特にトウモロコシの形質転換に使用することができると考えられる。
植物細胞特に本発明のトウモロコシ細胞を前培養とすると、アグロバクテリウム−介在ＤＮＡ移動の形質転換効率が上昇し、この作用は、アグロバクテリウム宿主の染色体バックグランド、使用されるＴｉ−プラスミド、ヘルパー−プラスミドまたはＴ−ＤＮＡベクターのタイプに依存しない。従って本発明の方法は、効率的に使用できるアグロバクテリウム株の範囲を拡大する。
特に好適な細菌の染色体バックグランドは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumefaciens）Ｃ５８Ｃ１（バン・ラレベケ（Van Larebeke）ら、１９７４）、Ａ１３６（ワトソン（Watson）ら、１９７５）、またはＬＢＡ４０１１（クラプウィジク（Klapwijk）ら、１９８０）により提供される。
好適な実施態様において、植物性フェノール性化合物とともに前培養される植物組織を形質転換するのに使用されるアグロバクテリウム株は、Ｌ，Ｌ−スクシンアモピン型Ｔｉ−プラスミド（好ましくは、武装していない（disarmed）もの、例えばｐＥＨＡ１０１）を含有する。
別の好適な実施態様において、植物性フェノール性化合物とともに前培養した植物組織を形質転換するのに使用されるアグロバクテリウム株は、オクトピン型Ｔｉ−プラスミド（好ましくは、武装していない（disarmed）もの、例えばｐＡＬ４４０４）を含有する。一般にオクトピン型Ｔｉ−プラスミドまたはヘルパープラスミドを使用する時は、ｖｉｒＦ遺伝子は削除されるかまたは不活性化されることが好ましい（ジャルスチョウ（Jarschow）ら、１９９１）。
本発明の方法はまた、特定のアグロバクテリウム株と組合せて使用して、さらに形質転換効率を上げることができ、例えば、ｖｉｒ遺伝子発現および／またはその誘導が、突然変異またはキメラｖｉｒＡもしくはｖｉｒＧ遺伝子の存在のために変化しているアグロバクテリウム株が使用できる（例えば、ハンセン（Hansen）ら、１９９４；チェンとウィナンス（Chen and Winans）、１９９１；シェーレン−グルート（Scheeren-Groot）ら、１９９４）。
別の実施態様において、追加のｖｉｒＧ遺伝子コピー（特に、ｐＴｉＢｏ５４２由来のいわゆるスーパーｖｉｒＧ遺伝子）（好ましくは、多重コピープラスミドに連結している）を含有するアグロバクテリウム株は、形質転換効率をさらに上げるために使用することができる。
本発明のさらに別の実施態様において、使用されるアグロバクテリウム株は、アグロバクテリウム中で発現される追加のｖｉｒＢ１１遺伝子コピー（特に、ｐＴｉＢｏ５４２由来のｖｉｒＢ１１遺伝子）を含有する。これは、ｖｉｒＢオペレーターの他の介在コード領域の無い、アグロバクテリウム中で発現可能なプロモーター（例えば、単離したｖｉｒＢプロモーター）に機能的に結合したｖｉｒＢ１１コード領域を含むキメラ遺伝子を提供することにより行われる。
植物細胞特にトウモロコシ細胞と同時培養されるアグロバクテリウム細胞は、当業者に公知の如く、アセトシリンゴンまたは他の植物性フェノール性化合物とともにプレインキュベートされるか、またはその培地から単離した後直接使用することができる。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の特に好適な誘導条件は、ベルナーデ（Vernade）ら（１９８８）により記載されている。
本発明の方法は原理的に、植物細胞特にトウモロコシ細胞を任意の外来ＤＮＡで形質転換するために使用することができる。一般に外来ＤＮＡは、１）形質転換される種である真核細胞（例えば、植物）中でＤＮＡからＲＮＡへの転写を指令することができるプロモーターを有するプロモーター領域と、２）ＲＮＡ（例えば、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイム）またはタンパク質をコードするコード領域とを含む、目的の少なくとも１つの遺伝子を含む。目的の遺伝子はまたしばしば、３）ポリアデニル化シグナルを含有する真核生物遺伝子の３’非翻訳領域を含む。プロモーターは、真核生物の選択された組織中で発現を指令するために選択することができる。例えば、植物のおしべ細胞中で選択的に発現を指令するプロモーター（例えば、タペツム（tapetum））が知られており、このようなプロモーターは、雄の不稔植物と、ハイブリッドを産生するのに有用な他の植物とを産生するのに使用されている（ＥＰ３４４０２９；ＥＰ４１２９１１；ＷＯ９２１３９５６；ＷＯ９２１３９５７；マリアニ（Mariani）ら、１９９０；マリアニ（Mariani）ら、１９９２）。
本発明の方法で使用される外来ＤＮＡはまた好ましくは、その発現が、非形質転換細胞（または生物）から形質転換細胞（または生物）を選択することを可能にする選択マーカー遺伝子を含有する。このような選択マーカー遺伝子は一般に、通常は細胞にとって毒性である抗生物質または他の化学的化合物に対して、細胞に耐性を与えるタンパク質をコードする。従って植物において選択マーカー遺伝子は、除草剤、例えば活性成分としてグルタミンシンターゼインヒビター（例えば、ホスヒノトリシン（phosphinothricin））を含有する除草剤に対して耐性を与えるタンパク質もコードする。このような遺伝子の例は、ｓｆｒ遺伝子またはｓｆｒｖ遺伝子のようなホスヒノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である（ＥＰ２４２２３６；ＥＰ２４２２４６；デブロック（De Block）ら、１９８７）。
従って本発明は、ＤＮＡ移動、特に植物細胞（特に、単子葉植物細胞、特にトウモロコシ細胞、しかしイネ、コムギまたはオオムギ細胞も含む）のアグロバクテリウム−介在ＤＮＡ移動の形質転換効率を上昇させるための、迅速かつ効率的で再現性のある方法を提供する。さらにアグロバクテリウム−介在形質転換法は、直接遺伝子移動法より、細胞のゲノムに組み込まれるトランス遺伝子コピー数の限定された（特に、１つのトランス遺伝子コピーを有する）、より多数のトランスジェニック植物（特に、トウモロコシ植物）を生成する。さらに、そのゲノム内に２つ以上のトランス遺伝子コピーが組み込まれている、アグロバクテリウム−介在形質転換により得られるトランスジェニック植物（特に、トランスジェニックトウモロコシ植物）は、異なるコピーが独立に遺伝される子孫植物をしばしば産生し、子孫植物中の異なるトランス遺伝子コピーの分離を可能にする。従って、直接遺伝子移動法で得られるトランスジェニック植物の集団より、本発明の形質転換法により低レベルトランスジェニック植物の集団中に、目的の特徴を有する高い比率の「エリート」トランス遺伝子植物が見いだされると予測される。本発明は単子葉植物に特に有用であるが、本発明の方法の出発物質として双子葉植物の培養細胞を使用しても、同様の結果が得られると予測される。
以下の例において本発明を詳細に説明する。以下の例において特に明記しなければ、すべての組換えＤＮＡ法は、サムブルーク（Sambrook）ら（１９８９）モレキュラークローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、ニューヨーク、およびアウスベル（Ausubel）ら（１９９４）、カレントプロトコールズインモレキュラーバイオロジー、カレントプロトコールズ（Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols）、アメリカ合衆国、に記載の標準的方法に従って行う。植物の分子学的作業の標準的材料や方法は、アール・ディー・ディー・クロイ（R.D.D. Croy）のプラントモレキュラーバイオロジーラボファックス（Plant Molecular Biology Labfax）（１９９３）［ビオスサイエンティフィック出版（BIOS Scientific Publications Ltd）（英国）とブラックウェルサイエンティフィック出版（Blackwell Scientific Publications）（英国）との共同出版］に記載されている。
本発明の例および説明において、配列リストの以下の配列が参照される：
配列番号１：ｐＧＶＳ７１のＴ−ＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号２：ａｄｈ１イントロンを含むｂａｒ遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列
配列番号３：ｐＧＶＳ８のＴ−ＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号４：オリゴヌクレオチドＶＧ４０のヌクレオチド配列
配列番号５：オリゴヌクレオチドＶＧ４１のヌクレオチド配列
実験：例で使用される培地、プラスミドおよび細菌株
１．１．培地
例を通して、植物組織の培養のために以下の培地を使用した：
− ＭａｈｉｌVII：Ｎ６培地（チュー（Chu）ら、１９７５）に、１００mg/lカゼイン加水分解物、６mM Ｌ−プロリン、０．５g/l ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、０．２Ｍマンニトール、２％ショ糖、１mg/l ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、２．５g/lゲルライト（Gelrite）を補足し、ｐＨ５．８に調整する。
− ＬＳＩＤｈｔ１．５VII：ＭＳ塩（ムラシゲとスクーグ（Murashige and Skoog）、１９６８）に、０．５mg/lニコチン酸、０．５mg/lピリドキシンＨＣｌ、１mg/lチアミンＨＣｌ、１００mg/lミオ−イノシトール、６mM Ｌ−プロリン、０．５g/l ＭＥＳ、２０g/lショ糖、１０g/lグルコース、１．５mg/l ２，４−Ｄ、２．５g/lゲルライト（Gelrite）を補足し、ｐＨ５．２に調整する。
− ＬＳＩ：ＭＳ塩に、ＬＳＩＤｈｙ１．５VIIのビタミン、１g/lのカザミノ酸、０．２Ｍショ糖、０．２Ｍグルコース、１．５mg/l ２，４−Ｄ、２．５g/lゲルライト（Gelrite）を補足し、ｐＨ５．２に調整する。
− Ａｈｘ１．５VII ｐ５００ｉｎｏ１０００ｐｐＴ１０：ＭＳ塩に、１０００mg/lミオ−イノシトール、０．５g/l ＭＥＳ、３０g/lショ糖、１０g/lグルコース、１．５mg/l ２，４−Ｄ、２．５g/lフィタゲル（Phytagel）、１０mg/lグルホシネート−アンモニウム、５００mg/lカルベニシリンを補足し、ｐＨ５．８に調整する。
− Ｍｈ１VII ｐ５００ｐｐＴ５：Ｎ６培地に、０．５g/l ＭＥＳ、２０g/lショ糖、１mg/l ２，４−Ｄ、５g/lグルホシネート−アンモニウム、５００mg/lカルベニシリンを補足し、ｐＨ５．８に調整する。
− Ａ３７VII ｐ５００ｐｐＴ２：ＭＳ塩に、０．５g/l ＭＥＳ、３０g/lショ糖、５mg/lゼアチン、２．５g/lフィタゲル（Phytagel）、２mg/lグルホシネート−アンモニウム、５００mg/lカルベニシリンを補足し、ｐＨ５．８に調整する。
− ＬＳIIＤｈｙ１．５XI：ＬＳＩＤｈｙ１．５VII培地と同様であるが、６mM Ｌ−プロリンの代わりに１g/lのカサイノ酸（casaino acids）、そして２．５g/lゲルライト（Gelrite）の代わりに０．５％アガロースＢＲＬウトルラピュア（BRL Utlra Pure）を使用した。
− Ａ６％VII ｐ５００ｐｐＴ２：ＭＳ塩に、０．５g/l ＭＥＳ、６０g/lショ糖、２．５g/lフィタゲル（Phytagel）、２mg/lグルホシネート−アンモニウム、５００mg/lカルベニシリンを補足し、ｐＨ５．８に調整する。
１．２． Ｔ−ＤＮＡベクター：
例を通して、以下のＴ−ＤＮＡベクターを使用した：
− ｐＧＳＶ７１：ｐＧＳＣ１７００（コルネリセンとバンデビーレ（Cornelissen and Vandewiele）、１９８９）由来のＴ−ＤＮＡベクターであるが、β−ラクタマーゼ遺伝子が欠如していることと、Ｔ−ＤＮＡが存在することで異なり、配列番号１の配列を特徴とする。ｐＧＶＳ７１は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターに機能的に結合した選択性キメラｂａｒマーカー遺伝子と、ノパリンシンターゼ遺伝子の３’末端を有する。
− ｐＴＣＯ１１４：ｐＧＶＳ７１に類似のＴ−ＤＮＡベクターであるが、ｂａｒ遺伝子のコード配列（ヌクレオチド１４３７位からヌクレオチド１９８８位までの配列番号１のヌクレオチド配列）が、トウモロコシのａｄｈ１遺伝子のイントロンを含むｂａｒ遺伝子の配列（配列番号２のヌクレオチド配列）により置換されている。
− ｐＴＣＯ１２１：約１．３kbのＢｇｌII−ＳｐｈＩ断片上にｐＴｉＢｏ５４２由来の追加のｖｉｒＧ遺伝子を有するＴ−ＤＮＡベクター。Ｔ−ＤＮＡは基本的にｐＴＣＯ１１４と同じである。このベクターは以下の方法で作製された：
約１．３kbのＢｇｌII−ＳｐｈＩ断片を、ｐＣＮＬ２（リウ（Liu）ら、１９９２）から精製した。この断片は、ｖｉｒＢオペロンの３’末端、完全なｖｉｒＧ遺伝子、およびｐＴｉＢｏ５４２からのｖｉｒＣオペロンの３’末端を有する。この断片をＴ４ポリメラーゼで処理して平滑末端とし、ＸｂａＩで線状化しクレノウで処理したｐＧＳＶ８に連結し、ｐＧＳＶ１５を得た。ｐＧＳＶ８は、ｐＧＳＣ１７００（コルネリセンとバンデビーレ（Cornelissen and Vandewiele）、１９８９）由来のＴ−ＤＮＡベクターであるが、β−ラクタマーゼ遺伝子が欠如していることと、Ｔ−ＤＮＡが存在することで異なり、配列番号３の配列を特徴とする。次の工程で、キメラ選択性ｂａｒマーカーを有するＴ−ＤＮＡをｐＧＳＶ１５に導入した。このために、ｐＧＳＶ１５の約１．２kbのＥｃｏＲＩ−ＢｓｔＥII断片（ｐＧＳＶ１５のＴ−ＤＮＡ内のＥｃｏＲＩ部位）を、Ｔ−ＤＮＡを含むｐＴＣＯ１１４（右の境界を除く）からの約４kbのＥｃｏＲＩ−ＢｓｔＥII断片で置換し、ｐＴＣＯ１２１を得た。
− ｐＶＥ２００：ｐＴＣＯ１２１として同じＴ−ＤＮＡを有するＴ−ＤＮＡベクターであり、ｖｉｒＢオペロン（ｖｉｒＢ１１読みとり枠を含む）の３’末端、完全なｖｉｒＧ遺伝子、およびｖｉｒＣオペロンの３’末端を含む、類似のｐＴｉＢｏ５４２断片を有するが、ｖｉｒＢオペロンの３’末端は、ＰＣＲ増幅したｖｉｒＢプロモーター断片により機能的に結合（すなわち、これに先行される）されている。このベクターは以下の方法で作製した：
− プライマーＶＧ４０（配列番号４）とＶＧ４１（配列番号５）および鋳型としてＡ３４８（ｐＳＭ３０）（スタチェルとネスター（Stachel and Nester）、１９８６）からの総ＤＮＡを使用して標準的ポリメラーゼチェイン反応により、ｖｉｒＢプロモーター断片を増幅した。ダス（Das）ら（１９８６）が記載したｖｉｒＢプロモーターを含む、約３９０塩基対の得られた断片（基本的に、ＥＭＢＬ受け入れ番号Ｊ０３２１６のヌクレオチド４７５〜ヌクレオチド７６４の配列に対応する）を、ＸｂａＩとＮｈｅＩで消化し、ＸｂａＩで線状化したｐＣＮＬ２（リウ（Liu）ら、１９９２）に連結して、ｐＶＥ１９４を得た。ｐＶＥ１９４では、ｖｉｒＢオペロンの３’末端は、ｖｉｒＢプロモーターの転写制御下にある。
− 次に、ｖｉｒＢプロモーターの制御下にあるｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＢオペロンの３’末端とｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＧ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ｐＶＥ１９４の約１．６kbのＸｂａＩ−ＢｇｌII断片、ｐＶＥ１９４の約１．３kbのＢｇｌII−ＳｐｈＩ断片、およびｐＧＳＶ８からの約７．２kbのＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片の間で、３者連結を行い、Ｔ−ＤＮＡを有するＴ−ＤＮＡベクターに導入した。得られたプラスミドを、ｐＴＶＥ１９７と命名した。
− ｐＴＣＯ１１４の選択マーカー遺伝子を、以下の３つの断片の連結により、ｐＴＶＥ１９７に導入し：
ｉ）ｖｉｒＢの３’末端とｖｉｒＧ遺伝子を含む、ｐＴＶＥ１９７の約５．３kbのＢａｎII−ＢｓｔＥII断片；
ii）右のＴ−ＤＮＡ境界を有する、ｐＴＶＥ１９７の約３．７kbのＢａｎII−ＥｃｏＲＩ断片；
iii）キメラ選択ｂａｒ遺伝子と左のＴ−ＤＮＡ境界を有する、ｐＴＣＯ１１４の約４kbのＥｃｏＲＩ−ＢｓｔＥII断片、
そして、Ｔ−ＤＮＡベクターｐＶＥ２００を得た。
１．３． アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株
Ｔ−ＤＮＡベクターであるｐＧＳＶ７１、ｐＴＣＯ１１４、ｐＴＣＯ１２１、およびｐＶＥ２００を、３親（triparental）接合プロトコール（ディッタ（Ditta）ら、１９８０）を使用して、ストレプトマイシン（３００μg/ml）とスペクチノマイシン（１００μg/ml）に対する耐性について選択して、ヘルパープラスミドｐＥＨＡ１０１を有するヘルパーＴｉ−プラスミドｐＡＬ４４０４またはＥＨＡ１０１を含むアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４に導入した。
例を通して、以下の株を使用した：
Ａ３５９３株：ｐＧＳＶ７１を含むＬＢＡ４４０４
Ａ３５３２株：ｐＴＣＯ１２１を含むＬＢＡ４４０４
Ａ３６３８株：ｐＶＥ２００を含むＬＢＡ４４０４
Ａ３４６０株：ＰＴＣＯ１１４を含むＥＨＡ１０１
Ａ３５３３株：ＰＴＣＯ１２１を含むＥＨＡ１０１
Ａ３６３７株：ｐＶＥ２００を含むＥＨＡ１０１
例
例１．トウモロコシからのアセトシリンゴン前処理したＩ型カルスのアグロバクテリウム−介在形質転換
Ｉ型カルス断片は、基本的にＷＯ９２／０９６９６に記載のように得た。受粉の９〜１２日後に、トウモロコシ株（Ｐａ９１×Ｈ９９）×Ｈ９９（ＰＨＨ−株）からの未成熟胚を穀粒から切り出し、表面を滅菌し、Ｉ型カルスの誘導のためにＭａｈｉ１VII上に広げた。Ｉ型カルスを、１ヶ月間隔で約２〜６ヶ月間、同じ培地で継代した。次に、Ｉ型カルスを、平均長さ約１．５mmの断片に細かく切断し、得られた断片を、１００〜２００μＭアセトシリンゴンを補足したＬＳＩＤｈｙ１．５VII基質上で５日間インキュベートした。あらかじめ誘導したカルス片を集め、さらに傷害することなく、適当なアグロバクテリウム株の懸濁液に約３〜約２０分間浸漬した。細菌懸濁液を以下の方法で得た：ＭＡＧ培地［２g/lグルコースを補足した最小Ａ培地（ジェフリー・ミラー（Jeffrey Miller）、１９７２）］、またはＡＢ培地（チルトン（Chilton）ら、１９７４）で、細菌を３〜６日間増殖させた。細菌を採取し、１００〜２００μＭアセトシリンゴンを補足した液体ＬＳＩ基質に、約５×１０9細胞/mlの濃度で再懸濁した。
細菌懸濁液中に浸漬後、カルス断片を、１００〜２００μＭアセトシリンゴンを補足したＬＳIIＤｈｙ１．５XI培地上で、約２５℃で３〜６日間同時培養した（ＬＢＡ−型株については３日間、ＥＨＡ−型株については６日間）。
同時培養後、組織をＡｈｘ１．５VII ｐ５００ｉｎｏ１０００ｐｐＴ１０に移し、３〜４日間培養した。増殖しているホスフィノトリシン（ＰＰＴ）−耐性カルスを切り出し、Ｍｈ１VII ｐ５００ｐｐＴ５上で３週間の継代間隔で少なくとも２回継代した。胚形成性ＰＰＴ−耐性カルスを、再生培地（Ａ３７VII ｐ５００ｐｐＴ２．）上に広げ、同じ培地上で１０〜１４日間の間隔で胚形成性組織を２回継代した。小さい植物を、Ａ６％VII ｐ５００Ｔ２基質を含有するガラス容器に移してさらに増殖させ、次に、成長してくる苗条を１．５％ショ糖を補足した半強度のＭＳ培地に移して、さらに苗条の伸長と根の成長をさせた。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）活性について植物を試験し、ＰＡＴ陽性植物を温室に移した。ＰＡＴ陽性植物を、サザンハイブリダイゼーションによりトランス遺伝子の存在について試験した。
アセトシリンゴンを用いる前処理により、アグロバクテリウム株との同時培養によるＩ型カルスの形質転換効率が少なくとも３倍上昇した。アセトシリンゴンで前処理した約１７００のカルス断片をＡ３４６０株と同時培養すると、５つのＰＡＴ陽性株が得られた（平均形質転換頻度は約０．３％；表１を参照）。
（各シリーズの実験について）約４０００の前処理カルス断片をアグロバクテリウム株Ａ３６３８、Ａ３５３３およびＡ３６３７と同時培養すると、それぞれ３７、３０および３３のＰＡＴ陽性植物株が得られた（平均形質転換頻度は約１％）。従ってこれらの実験において、形質転換効率は少なくとも約７〜１０倍改良された。
アセトシリンゴンとの前処理によりトウモロコシ植物株（Ｐａ９１×Ｈ９９）×Ｐａ９１（ＰＨＰ）から得られたＩ型カルスとＰａ９１の同時培養について、形質転換頻度が増強された。
例２．追加のキメラｖｉｒＢ１１遺伝子の存在は、アグロバクテリウム−介在形質転換頻度を改良する
Ｉ型カルス断片は、例１に記載のように得られ、１００μＭのアセトシリンゴンを補足したＬＳＩＤｈｙ１．５VII基質で５日間インキュベートし、次にアグロバクテリウム株Ａ３５３２とＡ３６３８とともに同時培養した。Ａ３５３２株についてはアセトシリンゴン前処理を行ってもＰＡＴ陽性株が１つのみしか得られなかった（形質転換頻度＜０．１％）。しかし、Ｔ−ＤＮＡベクターのｖｉｒＢ１１読みとり枠に先行する機能性ｖｉｒＢプロモーターの存在は、形質転換効率を少なくともほとんど１０倍改良した（表１を参照）。
例３．異なる植物性フェノール性化合物で前処理したトウモロコシからのＩ型カルスのアグロバクテリウム−介在形質転換
Ｉ型カルス断片は、例１に記載のように得られ、表IIに記載の１００μＭの植物性フェノール性化合物を補足したＬＳＩＤｈｙ１．５VII基質で５日間インキュベートした。約２００のあらかじめ誘導したカルス断片を、アグロバクテリウム株Ａ３６３７（またはＡ３６３８）で同時培養した。得られたＰＡＴ陽性株の数と形質転換頻度を、表IIに要約する。
例１に記載のように、Ｉ型カルスから得られ、１００μＭアセトシリンゴン含有培地で５日間プレインキュベートした、細かく切断したカルスを、さらに傷害することなく、ＷＯ９２／０９６９６に記載の電気穿孔法に付した。簡単に説明すると、約５０のカルス片を、１００μｌのＥＰＭ−ＫＣｌ緩衝液に再懸濁し、室温で３時間あらかじめ原形質分離した。次にカルス片をＥＰＭ＋ＫＣｌ緩衝液で洗浄し、エレクトロキュベットのＥＰＭ＋ＫＣｌ緩衝液に移した。プラスミドＤＮＡ（１０μｇのｐＤＥ１１０）を加え、ＤＮＡをカルス断片で室温で約１時間インキュベートした。標準的条件（９００μＦコンデンサーからの初期電界強度３７５Ｖ／cmで１パルス）で電気穿孔法を行った。カルスは決して氷上には置かなかった。ホスフィノトリシン耐性カルスを選択し、既に記載されている（ＷＯ９２／０９６９６）ように植物を再生した。既に記載されている（ＷＯ９２／０９６９６）ように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性を検出した。
アセトシリンゴン（約０．２３％）で前処理しなかった約５６４０のカルス片の対照電気穿孔法により１３のＰＡＴ陽性植物が得られたが、アセトシリンゴン（約０．７５％）で前処理した約５３０のカルス片の電気穿孔法により４つのＰＡＴ陽性植物が得られた。すなわち、細かく切断したＩ型カルスを１００μＭアセトシリンゴン含有培地で５日間インキュベートして前処理した時、形質転換頻度は約３倍高かった。
例５．植物性フェノール性化合物の組合せは形質転換頻度をさらに上げる
Ｉ型カルス断片を例１に記載のように得て、２００μＭアセトシリンゴン、又は１００μＭアセトシリンゴンと１００μＭ ｐ−ヒドロキシ安息香酸の組合せで補足したＬＳＫＤｈｙ１．５VII基質で５日間インキュベートした。約２５０のカルス片をアグロバクテリウムＡ株３５３３と同時培養した。アセトシリンゴンでプレ誘導後ＰＰＴ含有培地で２つの苗条再生株（１つのＰＡＴ陽性株を含む）が得られ（頻度約１％）、アセトシリンゴン＋ｐ−ヒドロキシ安息香酸でプレ誘導後ＰＰＴ含有培地で７つの苗条再生株（５つのＰＡＴ陽性株を含む）が得られた（頻度約３％）。
例６．例１〜５のアグロバクテリウム−介在形質転換により得られたトランスジェニックトウモロコシ植物の解析
前述の例のトランスジェニックトウモロコシ植物を、サザン解析により解析した。
第１の例において、単一のトランスジェニックカルス株から再生されたすべてのトランスジェニック植物が同一であるか、またはこれらは独立の形質転換に由来するかを証明した。２４の独立したトランスジェニックカルス株から得られたすべての再生植物をサザンで解析し、３７の異なるタイプのＴ−ＤＮＡ組み込みを同定した。すなわち、２４の植物株（説明の欄に記載した）が、少なくとも３７の独立した形質転換を示した。従って、形質転換した１００のカルス片について得られたトランスジェニック植物株の数として表した形質転換頻度は、実際の形質転換頻度より小さい。
次に、異なるトウモロコシ株中のトランス遺伝子のコピー数を、サザンハイブリダイゼーションにより解析した。解析した形質転換株（Ｔ０）のほとんどは、比較的単純なＴ−ＤＮＡ組み込みパターン（４コピー未満）を示した。解析したトランス遺伝子株の約１／３（５６／１４８）は、単一コピーＴ−ＤＮＡ組み込みを有した。ほんのわずかの株のみ（＜１０％）が、より複雑なＴ−ＤＮＡ組み込みパターン（＞４コピー）を示した。
前述の例のトランス遺伝子トウモロコシ植物を、子孫のトランス遺伝子の分離パターンについても解析した。バスタ（Basta）除草剤スプレーを使用して、５７の独立したトランス遺伝子カルス株から再生された１１３植物中のＰＡＴ活性の分離を追跡した。３２の独立したトランス遺伝子カルス株から再生した７４の植物の子孫では、ＰＡＴ活性の１：１分離が観察され、Ｔ０植物では、１つのコピーまたはいくつかの密接に結合したコピーで除草剤耐性トランス遺伝子が存在することを示していた。１８の独立したトランス遺伝子カルス株から再生した３１の植物の子孫では、すべての植物がバスタ（Basta）除草剤スプレーに対して耐性があるか、または有意に多くの植物が感受性ではなく耐性であり、Ｔ０植物中に２つまたはそれ以上のトランス遺伝子の結合していないコピーが存在することを示していた。最後に、７つの独立したトランス遺伝子カルス株から再生した１４の植物の子孫では、耐性のある植物はまったく無いかまたは有意に多くの植物が耐性ではなく感受性であった。これらの後者の植物は、これ以上解析しなかった。
５３の独立に形質転換したトウモロコシ植物（Ｔ０）についてバスタ（Basta）除草剤に対して耐性のＴ１子孫の２つの植物のサザン解析は、約７０％の解析したケース（３５／５３）で、両方の子孫の植物はＴ０親植物株と同じＴ−ＤＮＡ組み込みパターンを有することを証明した。約１８％（１０／５３）のケースで分離が観察された。
文献
（１）一般情報：
（i）出願人：
（Ａ）名称：プラント・ジェネティック・システムズ・エヌ・ブイ（Plant Genetic Systems N.V.）
（Ｂ）通り：ジョゼフ・プラトーストラート２２（Jozef Plateaustraat 22）
（Ｃ）市：ゲント（Gent）
（Ｅ）国：ベルギー
（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：Ｂ−９０００
（Ｇ）電話：３２ ９ ２３５ ８４ ５４
（Ｈ）ファックス：３２ ９ ２２３ １９ ２３
（ii）発明の名称：植物の形質転換改良法
（iii）配列の数：５
（iv）コンピューターで読める形式：
（Ａ）媒体の型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣコンパチブル
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース＃１．０、バージョン＃１．３０（PatentIn Release #1.0, Version #1.30）（ヨーロッパ特許庁（EPO））
（２）配列番号：１の情報：
（i）配列の特色：
（Ａ）長さ：２３４５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（Ａ）説明：/desc=「ｐＧＳＶ７１のＴ−ＤＮＡ」
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：−
（Ｂ）位置：１．．２５
（Ｄ）他の情報：/label=RB
/note=「Ｔ−ＤＮＡ右の境界」
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：−
（Ｂ）位置：５３．．１４３６
（Ｄ）他の情報：/note=「ＣａＭＶ３５Ｓ Ｐ３プロモーター」
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）位置：１４３７．．１９８８
（Ｄ）他の情報：/product=「ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ」
/label=bar
/note=「ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする領域」
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：−
（Ｂ）位置：２００７．．２２６６
（Ｄ）他の情報：/label=３’nos
/note=「アグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔ−ＤＮＡのノパリンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化シグナルを含有する３’非翻訳領域」
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：−
（Ｂ）位置：２３２１．．２３４５
（Ｄ）他の情報：/label=LB
/note=「Ｔ−ＤＮＡ左の境界」
（xi）配列：配列番号：１：
（i）配列の特色：
（Ａ）長さ：１０８６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（Ａ）説明：/desc=「ａｄｈ１イントロンを含むｂａｒ遺伝子のコード領域」
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）位置：１．．２３３
（Ｄ）他の情報：/product=「ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（Ｎ末端の半分）」
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：intron
（Ｂ）位置：２３４．．７６９
（Ｄ）他の情報：/standard_name=「ａｄｈ１イントロン」
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）位置：７７０．．１０８６
（Ｄ）他の情報：/product=「ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ末端の半分）」
（xi）配列：配列番号：２：
（i）配列の特色：
（Ａ）長さ：１０８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（Ａ）説明：/desc=「ｐＧＳＶ８のＴ−ＤＮＡ」
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：−
（Ｂ）位置：１．．２５
（Ｄ）他の情報：/label=RB
/note=「ｐＧＳＶ８のＴ−ＤＮＡからの右の境界の配列」
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：−
（Ｂ）位置：２６．．８３
（Ｄ）他の情報：/label=MCS
/note=「多重クローニング部位」
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：−
（Ｂ）位置：８４．．１０８
（Ｄ）他の情報：/label=LB
/note=「ｐＧＳＶ８のＴ−ＤＮＡからの左の境界の配列」
（xi）配列：配列番号：３：
（i）配列の特色：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（Ａ）説明：/desc=「オリゴヌクレオチドＶＧ４０」
（xi）配列：配列番号：４：
（i）配列の特色：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（Ａ）説明：/desc=「オリゴヌクレオチドＶＧ４１」
（xi）配列：配列番号：５：
Claims (19)
- 単子葉植物細胞のゲノムへのＤＮＡ断片の組み込み法であって、
１）ＤＮＡ断片との接触の前に、植物性フェノール性化合物を含む培地上で、非形質転換単子葉植物細胞の培養物を、１〜１０日間インキュベートする工程；および
２）ＤＮＡ断片が非形質転換細胞により摂取され、非形質転換細胞のゲノムに安定に組み込まれる条件下で、非形質転換細胞にＤＮＡ断片を接触させて形質転換細胞を産生する工程、および
３）形質転換細胞からトランスジェニック単子葉植物を再生する工程
を含んでなる、上記方法。 - 植物性フェノール性化合物は、アセトシリンゴン、α−ヒドロキシ−アセトシリンゴン、シナピン酸、シリンジ酸（syringic acid）、フェルリ酸（ferulic acid）、カテコール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、β−レソルシル酸（β−resorcylic acid）、プロトカテク酸、ピロガロール酸、没食子酸、またはバニリンである、請求項１に記載の方法。
- 植物性フェノール性化合物はアセトシリンゴンである、請求項２に記載の方法。
- 植物性フェノール性化合物は、アセトシリンゴン、α−ヒドロキシ−アセトシリンゴン、シナピン酸、シリンジ酸（syringic acid）、フェルリ酸（ferulic acid）、カテコール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、β−レソルシル酸（β−resorcylic acid）、プロトカテク酸、ピロガロール酸、没食子酸、およびバニリンよりなる群から選択される、少なくとも２つの植物性フェノール性化合物を含む混合物である、請求項２に記載の方法。
- 混合物は、少なくともアセトシリンゴンとｐ−ヒドロキシ安息香酸を含む、請求項４に記載の方法。
- 単子葉植物はトウモロコシ、イネ、コムビまたはオオムギである、請求項１に記載の方法。
- 単子葉植物はトウモロコンである、請求項１〜５までのいずれか１項に記載の方法。
- 非形質転換単子葉植物細胞の培養物はＩ型カルスである、請求項７に記載の方法。
- Ｉ型カルスは、接触工程の前に断片に切断されている、請求項８に記載の方法。
- Ｉ型カルスは、インキュベーション工程の前又は後に断片に切断されている、請求項９に記載の方法。
- Ｉ型カルス断片は０．５〜５mmの長さを有する、請求項９に記載の方法。
- 非形質転換細胞は、ＤＮＡ断片との接触の前に、４〜５日間、植物性フェノール性化合物を含む培地上でインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
- 非形質転換細胞は、ＤＮＡ断片との接触の前に、４〜５日間、植物性フェノール性化合物を含む培地上でインキュベートされる、請求項１１に記載の方法。
- 非形質転換細胞は、電気穿孔法、ポリエチレングリコールを使用する直接遺伝子移動、またはＤＮＡコーティングしたマイクロプロジェクタイルによる衝撃により、ＤＮＡ断片と接触される、請求項１に記載の方法。
- 非形質転換細胞は、ＤＮＡ断片を含むアグロバクテリウム株との同時培養法により、ＤＮＡ断片と接触される、請求項１に記載の方法。
- 非形質転換細胞は、ＤＮＡ断片を含むアグロバクテリウム株との同時培養法により、ＤＮＡ断片と接触される、請求項１１に記載の方法。
- アグロバクテリウム株は追加のｖｉｒＧ遺伝子コピーをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
- ｖｉｒＧ遺伝子はｐＴｉＢｏ５４２から得られる、請求項１７に記載の方法。
- アグロバクテリウム株は、ｖｉｒＢプロモーターに機能的に結合したｖｉｒＢ１１コード領域を含むキメラ遺伝子の追加のコピーをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
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