DE112009001976T5 - Transgene Pflanzen mit erhöhtem Ertrag - Google Patents

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Abstract

Transgene Pflanze, die mit einer Expressionskassette umfassend in operativer Verknüpfung a) ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Expression in Wurzeln und Sprossen zu verstärken; b) ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Plastidentransitpeptid codiert; und c) ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Phosphatidatcytidylyltransferasepolypeptid codiert, transformiert ist; wobei die tansgene Pflanze einen erhöhten Ertrag verglichen mit einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, aufweist.

Description

  • Die vorliegende Anmeldung genießt das Prioritätsvorrecht der vorläufigen US-Patentanmeldung mit der Reihennummer 61/090,308, eingereicht am 20. August 2008; der vorläufigen US-Patentanmeldung mit der Reihennummer 61/090,625, eingereicht am 21. August 2008; und der vorläufigen US-Patentanmeldung mit der Reihennummer 61/090,669, eingereicht am 21. August 2008. Diese Anmeldungen werden hiermit vollinhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen.
  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein transgene Pflanzen, die isolierte Polynukleotide überexprimieren, die für Polypeptide codieren, die am Fettsäuremetabolismus in bestimmten Pflanzengeweben und -organellen aktiv sind, wodurch der Ertrag dieser Pflanzen verbessert wird.
  • ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
  • In den letzten Jahren haben Bevölkerungszunahme und Klimawandel die Möglichkeit einer weltweiten Nahrungsmittel-, Futter- und Brennstoffknappheit drastisch vor Augen geführt. Zu einem Zeitpunkt, wo die Niederschlagsmenge in vielen Teilen der Erde rückgängig ist, entfällt auf die Landwirtschaft 70% des von Menschen verwendeten Wassers. Außerdem werden weniger Hektar Ackerland für den Anbau von Feldfrüchten verfügbar, da sich die Flächennutzung von landwirtschaftlichen Betrieben auf Städte und Vorstädte verlagert. In der Agrarbiotechnologie hat man versucht, den zunehmenden Bedarf der Menschheit durch genetische Modifikationen von Pflanzen zu decken, wodurch der Kulturpflanzenertrag erhöht werden könnte, zum Beispiel dadurch, dass eine bessere Toleranz gegenüber abiotischen Stressreaktionen vermittelt wird oder dass die Biomasse erhöht wird.
  • Im vorliegenden Zusammenhang wird der Kulturpflanzenertrag als Anzahl Bushel des entsprechenden Agrarprodukts (wie Körner, Futterpflanzen oder Samen), die pro Acre geerntet werden, definiert. Der Kulturpflanzenertrag wird durch abiotische Stressfaktoren wie Trockenheit, Hitze, Salinität und Kältestress sowie durch die Größe (Biomasse) der Pflanze beeinflusst. Traditionelle Pflanzenzüchtungsstrategien sind relativ langsam und waren im Allgemeinen nicht erfolgreich, um eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischen Stressfaktoren zu vermitteln. Die durch die traditionelle Züchtung erzielten Verbesserungen beim Kornertrag haben beim Mais beinahe ein Plateau erreicht. Der Harvest Index, d. h. das Verhältnis zwischen Ertragsbiomasse zu der gesamten kumulativen Biomasse zum Erntezeitpunkt ist beim Mais während der selektiven Züchtung auf Kornertrag über die letzten hundert Jahre im Wesentlichen unverändert geblieben. Dementsprechend ergeben sich die jüngsten Ertragsverbesserungen, die beim Mais erzielt werden, aus einer erhöhten Gesamtbiomasseproduktion pro Kulturflächeneinheit. Diese erhöhte Gesamtbiomasse wurde durch Erhöhung der Saatstärke erzielt, was zu adaptiven phänotypischen Veränderungen, wie Verkleinerung des Blattwinkels, was die Beschattung der unteren Blätter verringern kann, und der Fahnengröße, was den Harvest Index erhöhen kann, geführt hat.
  • Wenn das Bodenwasser zurückgeht oder wenn Wasser während Trockenperioden nicht verfügbar ist, sind die Kulturpflanzenerträge eingeschränkt. Ein Pflanzenwasserdefizit entsteht dann, wenn die Transpiration von den Blättern größer ist als die Versorgung mit Wasser von den Wurzeln. Die Menge an Wasser, die verfügbar ist, steht in Relation zu der Menge an Wasser, die im Boden vorhanden ist, und der Fähigkeit der Pflanze, dieses Wasser mit ihrem Wurzelsystem zu erreichen. Die Transpiration von Wasser von den Blättern steht mit der Fixierung von Kohlenstoffdioxid durch die Photosynthese über die Stomata in Verbindung. Die beiden Vorgänge sind positiv korreliert, so dass ein hoher Kohlendioxid-Influx über die Photosynthese eng mit Wasserverlust durch Transpiration in Verbindung steht. Wenn Wasser vom Blatt durch Transpiration abgegeben wird, so ist das Blattwasserpotential erniedrigt und die Stomata neigen dazu, sich hydraulisch zu schließen und schränken so die Photosyntheserate ein. Da der Kulturpflanzenertrag von der Fixierung von Kohlendioxid in der Photosynthese abhängig ist, sind die Wasseraufnahme und die Transpiration Faktoren, die zum Kulturpflanzenertrag beitragen. Pflanzen, die fähig sind, weniger Wasser zu verbrauchen, um dieselbe Menge an Kohlendioxid zu fixieren, oder die fähig sind, bei einem niedrigeren Wasserpotential normal zu funktionieren, weisen das Potential für eine höhere Photosyntheserate und daher für die Produktion von mehr Biomasse und Marktwert in vielen Agrarsystemen auf.
  • Beim Versuch, transgene Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, entweder durch erhöhte abiotische Stresstoleranz oder durch erhöhte Biomasse, zu entwickeln, haben die Agrarbiotechnologen Tests an Modellpflanzensystemen, Gewächshausstudien von Kulturpflanzen und Feldversuche durchgeführt. So ist zum Beispiel die Wassernutzungseffizienz (WUE) ein Parameter, der häufig mit Trockenheitstoleranz korreliert ist. Untersuchungen der Reaktion einer Pflanze auf Austrocknung, osmotischen Schock und Temperaturextreme werden auch dazu verwendet, um die Toleranz oder Resistenz der Pflanze gegen abiotische Stressfaktoren zu bestimmen.
  • Eine Erhöhung der Biomasse bei niedriger Wasserverfügbarkeit kann aufgrund einer relativ verbesserten Wachstumseffizienz oder einem erniedrigten Wasserverbrauch beruhen. Beim Selektieren von Merkmalen für die Verbesserung von Kulturpflanzen wäre eine verringerte Wassernutzung ohne damit einhergehende Wachstumsveränderung in einem Agrarsystem mit Bewässerung, wo die Betriebsmittelkosten für das Wasser hoch sind, besonders günstig. Eine Wachstumserhöhung ohne damit einhergehendes starkes Ansteigen bei der Wassernutzung wäre auf alle Agrarsysteme anwendbar. In vielen Agrarsystemen, in denen die Wasserversorgung nicht limitierend ist, erhöht eine Wachstumserhöhung ebenfalls den Ertrag, selbst wenn dies auf Kosten einer erhöhten Wassernutzung ginge.
  • Die Agrarbiotechnologen verwenden auch Messungen von anderen Parametern, die die mögliche Auswirkung eines Transgens auf den Kulturpflanzenertrag angeben. Bei Futterkulturen wie Luzerne, Silomais und Heu korreliert die Pflanzenbiomasse mit dem Gesamtertrag. Bei Kornfrüchten wurden jedoch andere Parameter eingesetzt, um den Ertrag zu schätzen, wie zum Beispiel die Pflanzengröße, die über Gesamtpflanzentrockengewicht, Trockengewicht der oberirdischen Pflanzenteile, Frischgewicht der oberirdischen Pflanzenteile, Blattfläche, Stängelvolumen, Pflanzenhöhe, Rosettendurchmesser, Blattlänge, Wurzellänge, Wurzelmasse, Anzahl der Bestockungstriebe und Anzahl Blätter bestimmt wird. Die Pflanzengröße in einem frühen Entwicklungsstadium wird typischerweise mit der Pflanzengröße in einem späteren Entwicklungsstadium korrelieren. Eine größere Pflanze mit einer größeren Blattfläche kann typischerweise mehr Licht und Kohlendioxid als eine kleinere Pflanze absorbieren, und es ist daher wahrscheinlich, dass sie über denselben Zeitraum mehr an Gewicht zunimmt. Bei der Pflanzengröße und der Wachstumsrate besteht eine starke genetische Komponente, und die Pflanzengröße unter ein und derselben Umweltbedingung wird für eine Reihe von verschiedenen Genotypen vermutlich mit der Größe unter einer anderen Umweltbedingung korrelieren. Auf diese Weise verwendet man eine Standardumwelt, um die verschiedenen und dynamischen Umwelten, die von den Kulturpflanzen im Feld an verschiedenen Standorten und zu verschiedenen Zeiten angetroffen werden, ungefähr wiederzugeben.
  • Der Harvest Index, das Verhältnis von Kornertrag zu dem Trockengewicht der oberirdischen Pflanzenteile, ist unter vielen Umweltbedingungen relativ stabil und ermöglicht so eine robuste Korrelation zwischen Pflanzengröße und Kornertrag. Pflanzengröße und Kornertrag sind intrinsisch miteinander verbunden, da der Großteil der Kornbiomasse von der gegenwärtigen oder gespeicherten Photosyntheseproduktivität der Blätter und des Stängels der Pflanze abhängt. Wie bei der abiotischen Stresstoleranz sind Messungen der Pflanzengröße während der frühen Entwicklung unter standardisierten Bedingungen in einer Wachstumskammer oder im Gewächshaus Standardmethoden, um mögliche Ertragsvorteile, die durch das Vorhandensein eines Transgens vermittelt werden, zu messen.
  • Pflanzenmembranen enthalten unterschiedliche molekulare Spezies, und die Zusammensetzung dieser Membranen verändert sich in Abhängigkeit von Umweltreizen während Akklimatisierungsvorgängen und als Auswirkung von umweltstressbedingten Zellschädigungen. Es gilt allgemein, dass Pflanzenmembranen ein primärer Ort von Schädigung nach der Einwirkung von Niedertemperaturstress und verschiedenen Formen von oxidativem Stress, wie sie während Wassermangel auftreten, sind. Dieser Abbau kann die Einwirkung von spezifischen hydrolytischen Enzymen beinhalten oder kann das Ergebnis von Oxidationsreaktionen, die von Radikalen vermittelt werden, sein. Bei radikalbedingten Oxidationsreaktionen kann ein Abbau an den ungesättigten Doppelbindungen der Fettsäureacylkette oder an der Esterbindung, die die Fettsäureacylkette an das Glyceringerüst des Phospholipids bindet, auftreten. Ist dieser Abbau ausreichend stark, so wird er den Zelltod fördern, unter gemäßigteren Umständen sind Abbauprodukte jedoch Bestandteile von zellulären Signalleitungsmechanismen, die eine Akklimatisierungsreaktion fördern. Während der Akklimatisierung adaptieren sich die Pflanzen und entwickeln eine größere Toleranz gegenüber Umweltstress. Zufällig verändern die Pflanzen im Allgemeinen sowohl die Menge der Membrankomponenten in jeder Zelle als auch die Zusammensetzung dieser Membranen. Diese Veränderungen bezüglich der Zusammensetzung fallen mit einer erhöhten Toleranz der ganzen Pflanze zusammen. Zu häufigen Veränderungen zählen Veränderungen bei der Fettsäureunsättigung und bei Phospholipidkopfgruppen. Zusätzlich tragen genetische Unterschiede zwischen den Pflanzen sowohl zu Unterschieden bezüglich der Membranzusammensetzung, zu Stresssignalleitungsmechanismen als auch zu der Fähigkeit der ganzen Pflanze, Stress zu tolerieren, bei. Pflanzenmembranen gelten daher als wesentlicher Ort für das Wahrnehmen, das Tolerieren von und das Reagieren auf Umweltstress.
  • Phospholipide sind die Hauptstrukturkomponenten von biologischen Membranen und dienen auch als wichtige Signalleitungsmoleküle. Die Phospholipide werden üblicherweise im endoplasmatischen Reticulum synthetisiert und zu anderen Membranen transportiert, die Phospholipide können jedoch auch in anderen Zellkompartimenten, darunter den Mitochondrien und Chloroplast, synthetisiert werden. Phospholipasen hydrolysieren Phospholipide, und bei Pflanzen wurde über drei Phospholipaseklassen berichtet, darunter Phospholipase A (PLA), Phospholipase C (PLC) und Phospholipase D (PLD). Die PLC hydrolysieren Phosphotidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) zu Inositol-1,4,5-triphosphat und Diacylglycerin, bei denen es sich um Komponenten des Inositolsignalleitungswegs handelt.
  • Wie oben ausgeführt können sich Pflanzen dadurch an Umweltstress anpassen, dass sich die Aktivität von Enzymen, die die Fettsäureoxidation verändern, mäßig erhöht. Die meisten eukaryontischen Zellen verfügen über zwei Fettsäure-beta-Oxidationssysteme, eines in Mitochondrien und das andere in Peroxisomen. Das Gen B2341 aus Escherichia coli codiert für ein bifunktionelles Protein des anaeroben Fettsäureoxidationskomplexes, das sowohl mit Enoyl-CoA-Hydratase- als auch 3-Hydroxyacyl-CoA-Epimeraseaktivität assoziiert ist. WO 2006/069610 und WO 2007/087815 beschreiben metabolisch Veränderungen in Pflanzen, die mit dem E. coli-Gen B2341 (SEQ ID NO: 21) transformiert worden sind.
  • Viele Enzyme kommen als Proenzyme oder Zymogene vor, die, um ihre volle Wirksamkeit zu entfalten, von einem Nichtproteinmolekül oder einem Cofaktor aktiviert werden müssen. Cofaktoren können grob in Coenzyme, prosthetische Gruppe oder Metallaktivatoren eingeteilt werden. Ein Coenyzm ist ein kleines hitzestabiles organisches Molekül, das leicht von einem Proenzym, das als Träger von chemischen Gruppen zwischen Enzymen agiert, abgespalten wird. Prosthetische Gruppen sind fest an das Proenzym gebunden und bilden einen permanenten Teil der Proteinstruktur.
  • Das Vitamin Riboflavin ist ein Bestandteil der Coenzyme Flavinadenindinukleotid (FAD) und Flavinmononukleotid (FMN), die bei der enzymatischen Oxidation von Kohlenhydraten und anderen Elektronentransportreaktionen, die für die Pflanzen bei ihrer Reaktion auf Umweltstressbedingungen kritisch sind, benötigt werden. Bei der Biosynthese von Riboflavin sind GTP und Ribulose-5-Phosphat (R5P) als Vorstufen erforderlich. Die mikrobiellen Riboflavinbiosynthesegene RibA-RibF sind kloniert und biochemisch charakterisiert worden.
  • Homologe von RibA, RibB und RibE sind aus Pflanzen kloniert worden und die subzelluläre Lokalisierung der pflanzlichen Proteine wurde auf Grundlage von Sequenzanalyse abgeleitet. Proteine, die im Plastiden funktionsfähig sind, weisen am N-terminalen Ende des Proteins eine typische Aminosäuredomäne auf, die als Targeting-Sequenz dient, um das Protein in den Plastiden zu dirigieren. Die pflanzlichen Enzyme, die an der Riboflavinsynthese beteiligt sind, enthalten diese Plastiden-Targeting-Sequenz, während diejenigen, die für Proteine, die an der Biosynthese von FAD aus Riboflavin beteiligt sind, codieren, sie nicht enthalten Man nimmt daher an, dass die Synthese der Coenzyme FMN und FAD in Pflanzen nacheinander in den Plastiden- und den Cytosolkompartimenten stattfindet. In Wildtyppflanzen findet die Umwandlung von GTP in 5-Amino-6-ribitylamino-2,4-(1H,3H)-pyrimidindion (ARP) in mehreren Enzymreaktionen statt, die in Plastiden lokalisiert sind. Das Plastidenkompartiment enthält einen Pentosephosphatweg, der R5P bildet. Innerhalb des Plastiden wird R5P zu 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat (DBP) metabolisiert, das durch die enzymatische Einwirkung der 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthase (RibH) zu 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin (DR) kombiniert wird. Das DR wird von dem Enzym Riboflavinsynthase in dem Plastiden in Riboflavin umgewandelt und dann über einen unbekannten Mechanismus in das Cytosol transportiert. Im Cytosol wird das Riboflavin zu FMN phosphoryliert und in FAD umgewandelt. 9 zeigt den kompartimentalisierten Riboflavin- und FAD-Biosyntheseweg in Wildtyppflanzen.
  • Bei dem Enzym I von 9 handelt es sich um GTP-Cyclohydrolase II (EC 3.4.5.25) oder RibA, die den ersten Schritt in der Riboflavinsynthese katalysiert. Die RibA liegt manchmal als bifunktionelles Enzym mit 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthase (DHBP_synthase)-Aktivität zusätzlich zu der GTP-Cyclohydrolase-II-Aktivität vor.
  • Bei dem Enzym VIII von 9 handelt es sich um RibH (auch bekannt als RibE, Riboflavinsynthase-beta-Untereinheit, und Lumazinsynthase). Die US-Patente Nr. 6,146,866 und 6,323,013 beschreiben die Klonierung der Lumazinsynthase aus Spinat, Tabak, Arabidopsis und Magnaporthe grisea. Die Chloroplasten-Targeting-Sequenz der Polypeptide RibH aus Spinat, Tabak und Arabidopsis sind in den US-Patenten Nr. 6,146,866 und 6,323,013 beschrieben.
  • Eine zweite Klasse von Cofaktoren ist die als Vitamin B6 bekannte Vitamingruppe. Zu dieser Vitamingruppe zählen drei Verbindungen: Pyridoxal, Pyridoxin und Pyridoxamin, die alle in Tieren und in Pflanzen weit verbreitet sind, insbesondere in Getreidekörnern. Pyridoxal und Pyridoxamin kommen in der Natur auch in Form ihrer Phosphatderivate Pyridoxal-5'-phosphat (PLP) und Pyridoxamin-5'-Phosphat (PMP) vor, bei denen es sich um die Coenzymformen des Vitamins handelt. PLP nimmt an der Katalyse von mehreren wichtigen Reaktionen des Aminosäuremetabolismus wie Transaminierung, Decarboxylierung und Razemisierung teil.
  • Die de-novo-Synthese des PLP findet nur in Bakterien, Pilzen und Pflanzen statt. In Escherichia coli findet die de-novo-Synthese durch Kondensation von 4-Phosphohydroxy-L-Threonin und Desoxyxylulose-5-phosphat unter Bildung von Pyridoxin-5'-phosphat (PNP) statt. Die Kondensation wird durch die gemeinsame Einwirkung der Enzyme PdxA und PdxJ katalysiert. In dem de-novo-Syntheseweg bei E. coli wird PNP dann von der PdxH-Oxidase zu PLP oxidiert. In jüngster Zeit wurde ein unterschiedlicher de-novo-PLP-Biosyntheseweg identifiziert, der von Desoxyxylulose-5-Phosphat unabhängig ist. In diesem Syntheseweg wird PLP ausgehend von Ribose-5-phosphat oder R5P und entweder Glyceraldehyd-3-phosphat oder Dihydroxyacetonphosphat synthetisiert, und zwar über die Produkte von zwei Genen mit der Bezeichnung PDX1 und PDX2, die keine Homologie mit irgendeinem der PLP-Synthesegene aus E. coli zeigen. Von den PDX1- und PDX2-Genprodukten wird vorhergesagt, dass sie mit PDX2 als Glutaminasedomäne und PDX1 als Akzeptor-Synthasedomäne als Glutaminamidotransferase agieren. Das pdx1-Genprodukt des Fadenpilzes Cercospora nicotianae weist eine starke Homologie mit einer konservierten Genfamilie mit der Bezeichnung SOR1 auf, die in Archaebakterien, Eubakterien, Pflanzen und Pilzen weit verbreitet ist. Die beiden de-novo-PLP-Synthesewege sind autoexklusiv, das heißt, dass Organismen die Gene für den einen oder den anderen Syntheseweg, jedoch nicht beide, aufweisen.
  • PLP kann auch über einen zweiten Syntheseweg, der als Salvage-Syntheseweg bezeichnet wird, synthetisiert werden, bei dem Pyridoxal (PL), Pyridoxin (PN) und Pyridoxamin (PM) von dem Wachstumsmedium der Zelle aufgenommen werden. Der Salvage-Syntheseweg liegt bei E. coli zusätzlich zu dem de-novo-Syntheseweg vor und ist die einzige Möglichkeit für Säugetierzellen, PLP zu synthetisieren. Beim Salvage-Syntheseweg in E. coli werden PL, PN und PM zuerst von Kinasen unter Bildung von PLP, Pyridoxin-5'-phosphat (PNP) bzw. PMP phosphoryliert. PNP und PMP werden von der oben genannten PdxH-Oxidase oxidiert. Das pdxK-Gen codiert für eine PN/PL/PM-Kinase und das pdxY-Gen codiert für eine PL-Kinase, und den Produkten von beiden Genen sind eine Vielzahl von konservierten Motiven mit der PfkB-Superfamilie der Kohlenhydratkinasen gemeinsam. Homologe der PdxK-Kinase und der PdxY-Kinase sind beim Menschen, bei Trypanosoma brucei, Haemophilus influenzae, Caenorhabditis elegans, Rattus norvegicus, Saccharomyces cerevisiae und Salmonella typhimurium identifiziert worden.
  • Obwohl manche Gene, die an der Stressreaktion, der Wassernutzung und/oder der Biomasse in Pflanzen bereits charakterisiert worden sind, war der Erfolg bei der Entwicklung von transgenen Kulturpflanzen mit verbessertem Ertrag beschränkt, und keine solchen Pflanzen sind in den Handel gebracht worden. Es besteht daher ein Bedarf, zusätzliche Gene zu identifizieren, die die Fähigkeit, den Ertrag von Kulturpflanzen zu erhöhen, aufweisen.
  • DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben entdeckt, dass es drei kritische Komponenten gibt, die optimiert werden müssen, um eine Verbesserung des pflanzlichen Ertrags durch die transgene Expression von gewissen Polypeptiden zu erzielen. Bei einem Targeting unter den Regulationselementen wie im vorliegenden Text beschrieben sind die Polynukleotide und Polypeptide gemäß Tabelle 1 fähig, den Ertrag von transgenen Pflanzen zu verbessern. Tabelle 1
    Bezeichnung des Gens Organismus Polynukleotid SEQ ID NO: Aminosäure SEQ ID NO:
    YBR029C S. cerevisiae 1 2
    BN04MC30805 Brassica napus 3 4
    ZM06MC30283 Zea mays 5 6
    YKL192C S. cerevisiae 7 8
    BN1004MS43616414 B. napus 9 10
    GM06MC07589 G. max 11 12
    HA1004MS66693619 Helianthus annuus 13 14
    YDR018C S. cerevisiae 15 16
    GM06MC27072 G. max 17 18
    ZM06MC04863 Z. mays 19 20
    B2341 E. coli 21 22
    ZM06MC04303 Z. mays 23 24
    ZM06MC15742 Zmays 25 26
    B0452 E. coli 27 28
    BN42634969 B. napus 29 30
    BNP5302_30 B. napus 31 32
    GMsae90f11 G. max 33 34
    YNL202W S. cerevisiae 35 36
    HA66688442 Helianthus annuus 37 38
    YKL140W S. cerevisiae 39 40
    SLL1023 Synechocystis sp. PCC 6803 41 42
    SLR0252 Synechocystis sp. 43 44
    b3803 E. coli 45 46
    BN51286476 B. napus 47 48
    GM59791864 G. max 49 50
    ZMBFb0243J04 Z. mays 51 52
    b3209 E. coli 53 54
    GMss34d01 G. max 55 56
    HA03MC1392 H. annuus 57 58
    b2578 E. coli 59 60
    b2682 E. coli 61 62
    b3285 E. coli 63 64
    b1938 E. coli 65 66
    SLL1894 S. sp. PCC 6803 67 68
    GM08000037 G. max 69 70
    SLL1282 S. sp. PCC 6803 71 72
    GM06MC29296 G. max 73 74
    ZM07MC00430 Z. mays 75 76
    ZM07MC23187 Z. mays 77 78
    b1636 E. coli 79 80
    pdxH E. coli 81 82
    ECpdxK E. coli 83 84
    TBpdxK Trypanosoma brucei 85 86
    CEpdxK Caenorhabditis elegans 87 88
    STyfei Salmonella typhimurium 89 90
    Hlyfei Haemophilus. influenzae 91 92
    Yn8fp S. cerevisiae 93 94
    SLR1779 S. sp. PCC 6803 95 96
    pdxJ E. coli 97 98
    pdx1.1 A. thaliana 99 100
    pdx1.3 A. thaliana 101 102
    CNpdx1 Cercospora nicotianae 103 104
    SCpdx1 S. cerevisiae 105 106
    BSpdx1 Bacillus subtilis 107 108
    OSpdx1 Oryza sativa 109 110
    HBpdx1 Hevea brasiliensis 111 112
    SLpdx1 Stellaria longipes 113 114
    BNpdx1 B. napus 115 116
    PPpdx1 Physcomitrella patens 117 118
    SPpdx1 Schizosaccharomyces pombe 119 120
  • In einer Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Genexpression in Wurzeln und Sprossen zu verstärken; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein subzelluläres Targeting-Peptid codiert; sowie ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Phosphatidatcytidylyltransferasepolypeptid codiert, wobei die transgene Pflanze einen erhöhten Ertrag verglichen mit einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, aufweist, transformiert ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Genexpression in Blättern zu verstärken; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Mitochondrien-Transitpeptid codiert; sowie ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Acyl-Carrier-Protein codiert, wobei die transgene Pflanze einen erhöhten Ertrag verglichen mit einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, aufweist, transformiert ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein subzelluläres Targeting-Peptid codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Acyltransferasepolypeptid codiert, transformiert ist, wobei die transgene Pflanze einen erhöhten Ertrag verglichen mit einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, aufweist.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags einer Pflanze bereit, und zwar dadurch, dass man eine Wildtyppflanze mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Genexpression in Blättern zu verstärken; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Mitochondrien-Transitpeptid codiert und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Polypeptid des bifunktionellen anaeroben Fettsäureoxidationskomplexes codiert, transformiert, aus der transformierten Pflanzenzelle transgene Pflanzen regeneriert und aus den transgenen Pflanzen Pflanzen mit höheren Ertrag selektiert.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags einer Pflanze bereit, und zwar dadurch, dass man eine Wildtyppflanze mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Genexpression in Blättern zu verstärken; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein subzelluläres TargetingPeptid codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Acyl-CoA-Thioesterasepolypeptid codiert; transformiert, wobei die transgene Pflanze einen erhöhten Ertrag verglichen mit einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, aufweist.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags einer Pflanze bereit, und zwar dadurch, dass man eine Wildtyppflanze mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein subzelluläres Targeting-Peptid codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Sterolesterasepolypeptid codiert, transformiert, wobei die transgene Pflanze einen erhöhten Ertrag verglichen mit einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, aufweist.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags einer Pflanze bereit, und zwar dadurch, dass man eine Wildtyppflanze mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Genexpression in Blättern zu verstärken; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Mitochondrien-Targeting-Peptid; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-2,4-Dienoyl-CoA-Reduktasepolypeptid codiert, transformiert; wobei die transgene Pflanze einen erhöhten Ertrag verglichen mit einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, aufweist.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags einer Pflanze bereit, und zwar dadurch, dass man eine Wildtyppflanze mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Plastiden-Transit-Peptid codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Succinat-CoA-Ligasepolypeptid codiert, transformiert, wobei die transgene Pflanze einen erhöhten Ertrag verglichen mit einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, aufweist.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags einer Pflanze bereit, und zwar dadurch, dass man eine Wildtyppflanze mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Cobalt-precorrin-6A-Reduktasepolypeptid codiert, transformiert, wobei die transgene Pflanze einen erhöhten Ertrag verglichen mit einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, aufweist.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid mit Uroporphyrin-III-C-Methyltransferaseaktivität codiert, und eine HemX-Signatursequenz, transformiert ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Genexpression in Wurzeln und Sprossen zu verstärken, und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid mit Isoprenoidbiosyntheseaktivität codiert, und eine DJ-1_Pfp1-Signatursequenz transformiert worden ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Genexpression in Wurzeln und Sprossen zu verstärken, und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid mit Translokatoraktivität des LysE-Typs codiert, und eine LysE-Signatursequenz umfassend die Aminosäuren 14 bis 195 von SEQ ID NO: 60 transformiert worden ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Genexpression in Wurzeln und Sprossen zu verstärken, und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid mit Transportaktivität für verzweigtkettigte Aminosäure der LIV-E-Familie und eine AzlC-Signatursequenz transformiert worden ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Genexpression in Wurzeln und Sprossen zu verstärken, und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein verkürztes DNA-Bindungspolypeptid mit einer Sequenz umfassend die Aminosäuren 1 bis 102 von SEQ ID NO: 64 codiert, transformiert worden ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Genexpression in Wurzeln und Sprossen zu verstärken, und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid mit einer ersten YscJ_FliF-Signatursequenz und einer zweiten YscJ_FliF-Signatursequenz codiert, transformiert worden ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-GTP-Cyclohydrolase-II-Polypeptid, das kein subzelluläres Targeting-Peptid umfasst, codiert, transformiert worden ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Lumazinsynthasepolypeptid, das kein subzelluläres Targeting-Peptid umfasst, codiert, transformiert worden ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Polypeptid, das fähig ist, die Pyridoxal-5'-Phosphatsynthese zu verstärken, codiert, transformiert worden ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist. In dieser Ausführungsform kann die Expressionskassette weiterhin ein Polynukleotid, das für ein Mitochondrien- oder Plastidentransitpeptid codiert, umfassen.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung einen Samen bereit, der von den oben beschriebenen transgenen Pflanzen produziert worden ist, wobei der Samen für ein Transgen, umfassend die oben beschriebenen Expressionsvektoren, reinerbig ist. Pflanzen, die von dem erfindungsgemäßen Samen abstammen, weisen unter normalen Bedingungen oder unter Stressbedingungen im Vergleich zu einer Wildtypsorte der Pflanze eine erhöhte Toleranz gegen einen Umweltstress und/oder ein erhöhtes Pflanzenwachstum und/oder einen erhöhten Ertrag auf.
  • In einem weiteren Aspekt wiederum betrifft die Erfindung Produkte, die durch die bzw. von den erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen, ihren Pflanzenteilen oder ihren Samen produziert worden sind, wie ein Nahrungsmittel, ein Futtermittel, ein Nahrungsergänzungsmittel, ein Futterergänzungsmittel, eine Faser, ein Kosmetikum oder ein Pharmazeutikum.
  • Die Erfindung stellt weiterhin gewisse isolierte Polynukleotide, die in Tabelle 1 angegeben sind, und gewisse isolierte Polypeptide, die in Tabelle 1 angegeben sind, bereit. Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein rekombinanter Vektor, umfassend ein erfindungsgemäßes isoliertes Polynukleotid.
  • In einer weiteren Ausführungsform wiederum betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der oben genannten transgenen Pflanze, wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor, umfassend ein erfindungsgemäßes isoliertes Polynukleotid, transformiert und aus der Pflanzenzelle eine transgene Pflanze erzeugt, die das von dem Polynukleotid codierte Polypeptid exprimiert. Die Expression des Polypeptids in der Pflanze führt unter normalen Bedingungen und/oder unter Stressbedingungen im Verglich zu einer Wildtypsorte der Pflanze zu einer erhöhten Toleranz gegenüber einem Umweltstress und/oder Wachstum und/oder Ertrag.
  • In einer weiteren Ausführungsform wiederum stellt die Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen der Toleranz einer Pflanze gegenüber einem Umweltstress und/oder ihres Wachstums und/oder ihres Ertrags bereit. Das Verfahren umfasst, dass man eine Pflanzenzelle mit einer Expressionskassette, umfassend ein isoliertes Polynukleotid gemäß Tabelle 1, transformiert und aus der Pflanzenzelle eine transgene Pflanze erzeugt, wobei die transgene Pflanze das Polynukleotid umfasst
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt ein Alignment der Aminosäuresequenzen des Volllängen-Phosphatidatcytidylyltransferasepolypeptids mit der Bezeichnung YBR029C (SEQ ID NO: 2), BN04MC30805 (SEQ ID NO: 4) und ZM06MC30283 (SEQ ID NO: 6). Das Alignment wurde unter Verwendung von Align X von Vector NTI Advance 10.3.0 erzeugt.
  • 2 zeigt ein Alignment der Aminosäuresequenzen der Acyl-Carrier-Proteine mit der Bezeichnung YKL192C (SEQ ID NO: 8), BN1004MS43616414 (SEQ ID NO: 10), GM06MC07589 (SEQ ID NO: 12) und HA1004MS66693619 (SEQ ID NO: 14). Das Alignment wurde unter Verwendung von Align X von Vector NTI Advance 10.3.0 erzeugt.
  • 3 zeigt ein Alignment der Aminosäuresequenzen der Acyltransferasen mit der Bezeichnung: YDR018C (SEQ ID NO: 16), GM06MC27072 (SEQ ID NO: 18) und ZM06MC04863 (SEQ ID NO: 20). Das Alignment wurde unter Verwendung von Align X von Vector NTI Advance 10.3.0 erzeugt.
  • 4 zeigt ein Alignment der Aminosäuresequenzen, die für bifunktionelle Polypeptide des anaeroben Fettsäureoxidationskomplexes mit der Bezeichnung b2341 (SEQ ID NO: 22), ZM06MC04303 (SEQ ID NO: 24) und ZM06MC15742 (SEQ ID NO: 26) codieren. Das Alignment wurde unter Verwendung von Align X von Vector NTI Advance 10.3.0 erzeugt.
  • 5 zeigt ein Alignment der Aminosäuresequenzen, die für Acyl-CoA-Thioesterasepolypeptide mit der Bezeichnung B0452 (SEQ ID NO: 28), BN42634969 (SEQ ID NO: 30), BNP5302_30 (SEQ ID NO: 32) und GMsae90f11 (SEQ ID NO: 34) codieren. Das Alignment wurde unter Verwendung von Align X von Vector NTI Advance 10.3.0 erzeugt.
  • 6 zeigt ein Alignment der Aminosäuresequenzen, die für 2,4-Dienoyl-COA-Reduktasepolypeptide mit der Bezeichnung YNL202W (SEQ ID NO: 36) und HA66688442 (SEQ ID NO: 38) codieren. Das Alignment wurde unter Verwendung von Align X von Vector NTI Advance 10.3.0 erzeugt.
  • 7 zeigt ein Alignment der Aminosäuresequenzen von Uroporphyrin-III-C-Methyltransferasen mit der Bezeichnung b3803 (SEQ ID NO: 46), BN51286476 (SEQ ID NO: 48), GM59791864 (SEQ ID NO: 50) und ZMBFb0243J04 (SEQ ID NO: 52). Das Alignment wurde unter Verwendung von Align X von Vector NTI Advance 10.3.0 erzeugt.
  • 8 zeigt ein Alignment der Aminosäuresequenzen der Isoprenoidbiosyntheseproteine mit der Bezeichnung b3209 (SEQ ID NO: 54), GMss34d01 (SEQ ID NO: 56) und HA03MC1392 (SEQ ID NO: 58). Das Alignment wurde unter Verwendung von Align X von Vector NTI Advance 10.3.0 erzeugt.
  • 9 zeigt ein Flussdiagramm des Riboflavin/FAD-Biosynthesewegs in Wildtyppflanzen. Die Enzymbezeichnungen lauten: Enzym I ist die GTP-Cyclohydrolase (II) (RibA); Enzym II ist die 2,5-Diamino-o-ribosylamino-4-(3H)-pyrimidinon-50-phosphatdesaminase; Enzym III ist die 5-Amino-6-ribosylamino-2,4-(1H,3H)-pyrimidindion-50-phosphatreduktase; Enzym IV ist die 2,5-Diamino-6-ribosylamino-4-(3H)-pyrimidindion-50-phosphatreduktase; Enzym V ist die 2,5-Diamino-6-ribitylamino-4-(3H)-pyrimidindion-50-phosphatdeaminase; Enzym VI ist eine hypothetische Phosphatase; Enzym VII ist die 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthase; Enzym VIII ist die 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinsynthase (RibH), Enzym IX ist die Riboflavinsynthase Enzym X ist die Riboflavinkinase; und Enzym XI ist die FAD-Synthetase. Zwischenprodukte in der Biosynthese von Riboflavin und FAD sind GTP; DAPP (2,5-Diamino-6-ribosylamino-4-(3H)-pyrimidindion-50-phosphat), AAPP (5-Amino-6-ribosylamino-2,4-(1H,3H)-pyrimidindion-50-phosphat); DRPP (2,5-Diamino-6-ribitylamino-4-(3H)-pyrimidindion-50-phosphat); ARPP (5-Amino-6-ribitylamino-2,4-(1H,3H)-pyrimidindion-50-phosphat); ARP; G6P (Glucose-6-phosphat); Riboflavin; wobei R5P, DBP, DR, FMN und FAD wie oben erwähnt sind.
  • 10A zeigt ein Flussdiagramm des vorgeschlagenen Riboflavin/FAD-Biosynthesewegs in den erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen. Die Abkürzungen sind wie in 9 angegeben. 10A zeigt den Syntheseweg mit Targeting von RibH an das Cytosol. 10B zeigt den Syntheseweg mit Targeting von RibA an das Cytosol. 10C zeigt den Syntheseweg mit Targeting von sowohl RibH als auch RibA an das Cytosol.
  • 11 zeigt ein Flussdiagramm der Vitamin-B6-Synthese in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung. Abkürzungen: DAP: Dihydroxyaceton-P; G3P: Glyceraldehyd-3P; wobei PL, PLP, PM, PN, PNP und R5P wie oben erwähnt sind.
  • 12 zeigt ein Alignment der Aminosäuresequenzen der GTP-Cyclohydrolase II mit der Bezeichnung SLL1894 (SEQ ID NO: 68) und Gm018000037 (SEQ ID NO: 70). Das Alignment wurde unter Verwendung von Align X von Vector NTI Advance 10.3.0 erzeugt. Die Aminosäuren 1 bis 49 gemäß SEQ ID NO: 17 entsprechen der subzellulären Targeting-Sequenz.
  • 13 zeigt ein Alignment der Aminosäuresequenzen der Lumazinsynthasepolypeptide mit der Bezeichnung 5111282 (SEQ ID NO: 72), GM06MC29296 (SEQ ID NO: 74), ZM07M000430 (SEQ ID NO: 76) und ZM07MC23187 (SEQ ID NO: 78). Das Alignment wurde unter Verwendung von Align X von Vector NTI Advance 10.3.0 erzeugt. Die subzellulären Targeting-Sequenzen entsprechen den Aminosäuren 1 bis 53 gemäß SEQ ID NO: 74, den Aminosäuren 1 bis 56 gemäß SEQ ID NO: 76; und den Aminosäuren 1 bis 80 gemäß SEQ ID NO: 78.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • In der gesamten vorliegenden Anmeldung wird auf verschiedene Veröffentlichungen Bezug genommen. Die Offenbarungen von all diesen Veröffentlichungen und den Literaturangaben, die innerhalb dieser Veröffentlichungen zitiert werden, werden hiermit vollständig durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen, um den Stand der Technik, auf den sich die vorliegende Erfindung bezieht, vollständiger zu beschreiben. Die im vorliegenden Zusammenhang verwendete Terminologie dient lediglich der Beschreibung von bestimmten Ausführungsformen und ist nicht als einschränkend zu verstehen. Im vorliegenden Zusammenhang kann „ein/e” ein/e oder mehr bedeuten, je nach dem Zusammenhang, in dem dieses Wort verwendet wird. So kann zum Beispiel, wenn „eine Zelle” erwähnt wird, dies bedeuten, dass mindestens eine Zelle verwendet werden kann.
  • In einer Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze, die ein in Tabelle 1 identifiziertes isoliertes Polynukleotid in dem subzellulären Kompartiment und Gewebe, das darin angegeben ist, überexprimiert, bereit. Die erfindungsgemäße transgene Pflanze weist im Vergleich zu einer Wildtypsorte der Pflanze einen verbesserten Ertrag auf. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff „verbesserter Ertrag” jegliche Verbesserung bezüglich des Ertrags von irgendeinem gemessenen Pflanzenprodukts, wie Korn, Frucht oder Faser. Erfindungsgemäß können Veränderungen bei unterschiedlichen phänotypischen Merkmalen den Ertrag verbessern. So sind zum Beispiel geeignete Maße für einen verbesserten Ertrag Parameter wie die Blütenorganentwicklung, die Anlage von Wurzeln, die Wurzelbiomasse, die Anzahl Samen, das Samengewicht, der Harvest Index, Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, Verringerung eines Nährstoffs, z. B. Stickstoff oder Phosphor, Betriebsmittelbedarf, Blattbildung, Phototropismus, Apikaldominanz und Fruchtentwicklung, was keine Einschränkung darstellen soll. Jegliche Ertragserhöhung ist erfindungsgemäß ein verbesserter Ertrag. So kann die Ertragsverbesserung zum Beispiel eine Erhöhung von 0,1%, 0,5%, 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% oder mehr bei einem der gemessenen Parameter umfassen. So ist zum Beispiel eine Erhöhung des in Bushel/Acre angegebenen Ertrags von Sojabohnen oder Mais, die von einer Kultur umfassenden Pflanzen, die für die Nukleotide und Polypeptide gemäß Tabelle 1 transgen sind, verglichen mit dem in Bushel/Acre ausgedrückten Ertrag von unbehandelten Sojabohnen oder unbehandeltem Mais, die/der unter denselben Bedingungen herangezogen wird, ein erfindungsgemäß verbesserter Ertrag.
  • Wie im vorliegenden Text definiert versteht man unter einer „transgenen Pflanze” eine Pflanze, die unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechnik dahingehend verändert wurde, dass sie eine isolierte Nukleinsäure enthält, die sonst in der Pflanze nicht vorliegen würde. Im vorliegenden Zusammenhang beinhaltet der Ausdruck „Pflanze” eine ganze Pflanze, Pflanzenzellen und Pflanzenteile. Zu Pflanzenteilen zählen, sind jedoch nicht einschränkend: Stängel, Wurzeln, Ovula, Staubblätter, Blätter, Embryonen, meristematische Regionen, Kallusgewebe, Gametophyten, Sporophyten, Pollen, Mikrosporen und dergleichen. Die erfindungsgemäße transgene Pflanze kann pollensteril oder pollenfertil sein und kann weiterhin Transgene beinhalten, bei denen es sich nicht um diejenigen, die die im vorliegenden Text beschriebenen isolierten Polynukleotide beinhalten, handelt.
  • Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Sorte” auf eine Gruppe von Pflanzen innerhalb einer Art, denen konstante Charakteristika gemeinsam sind, die sie von der typischen Form und von anderen möglichen Sorten innerhalb dieser Art unterscheiden. Eine Sorte weist nicht nur mindestens ein unterscheidbares Merkmal auf, sondern ist auch durch ein gewisses Ausmaß an Variation zwischen den Einzelorganismen innerhalb der Sorte gekennzeichnet, und zwar in erster Linie auf Grundlage der Mendelschen Aufspaltung der Merkmale unter der Nachkommenschaft von aufeinanderfolgenden Generationen. Eine Sorte gilt als „reinerbig” für ein bestimmtes Merkmal, wenn sie genetisch für dieses Merkmal so stark homozygot ist, dass, wenn die reinerbige Sorte selbstbestäubt wird, kein wesentliches Ausmaß an unabhängiger Aufspaltung dieses Merkmals innerhalb der Nachkommenschaft beobachtet wird. Bei der vorliegenden Erfindung entsteht das Merkmal aufgrund der transgenen Expression von einem oder mehreren isolierten Polynukleotiden, die in eine Pflanzensorte eingeführt werden. Ebenso im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff „Wildtypsorte” eine Gruppe von Pflanzen, die aus Vergleichszwecken als Kontrollpflanze analysiert werden, wobei die Pflanze der Wildtypsorte mit der transgenen Pflanze (Pflanze, die mit einem erfindungsgemäßen isolierten Polynukleotid transformiert wurde) mit der Ausnahme, dass die Pflanze der Wildtypsorte nicht dahingehend transformiert wurde, dass sie ein erfindungsgemäßes isoliertes Polynukleotid enthält, identisch ist. Der Begriff „Wildtyp” bezieht sich im vorliegenden Zusammenhang auf eine Pflanzenzelle, einen Samen, einen Pflanzenbestandteil, ein Pflanzengewebe, ein Pflanzenorgan oder eine ganze Pflanze, die/der/das nicht mit einem erfindungsgemäßen isolierten Polynukleotid genetisch modifiziert worden ist.
  • Der Begriff „Kontrollpflanze” bezieht sich im vorliegenden Zusammenhang auf eine Pflanzenzelle, ein Explantat, einen Samen, einen Pflanzenbestandteil, ein Pflanzengewebe, ein Pflanzenorgan oder eine ganze Pflanze, die/der/das verwendet wird, um einen Vergleich gegen eine transgene oder genetisch modifizierte Pflanze anzustellen, um einen verbesserten Phänotyp oder ein wünschenswertes Merkmal in der transgenen Pflanze oder der genetisch modifizierten Pflanze zu identifizieren. Bei einer „Kontrollpflanze” kann es sich in manchen Fällen um eine transgene Pflanzenlinie handeln, die einen Blankvektor oder ein Markergen umfasst, jedoch das interessierende rekombinante Polynukleotid, das in der transgenen Pflanze oder der genetisch modifizierten Pflanze, die ausgewertet wird, vorhanden ist, nicht enthält. Eine Kontrollpflanze kann eine Pflanze derselben Linie oder Sorte wie die transgene Pflanze oder die genetisch modifizierte Pflanze, die geprüft wird, sein oder eine andere Linie oder Sorte, wie eine Pflanze, von der bekannt ist, dass sie einen spezifischen Phänotyp, ein spezifisches Charakteristikum oder einen bekannten Genotyp aufweist. Eine geeignete Kontrollpflanze würde eine genetisch nichtmodifizierte bzw. nichttransgene Pflanze der Elternlinie, die eingesetzt wurde, um eine transgene Pflanze im vorliegenden Zusammenhang zu erzeugen, beinhalten.
  • Wie im vorliegenden Zusammenhang definiert sind die Begriffe „Nukleinsäure” und „Polynukleotid” austauschbar und beziehen sich auf RNA oder DNA, die geradkettig oder verzweigt, einzel- oder doppelsträngig oder ein Hybrid davon ist. Der Begriff umfasst auch RNA/DNA-Hybride. Ein „isoliertes” Nukleinsäuremolekül ist eines, das von den anderen Nukleinsäuremolekülen, die in dem natürlichen Ausgangsmaterial der Nukleinsäure vorliegen (d. h. Sequenzen, die für andere Polypeptide codieren), im Wesentlichen getrennt ist. So zum Beispiel wird eine klonierte Nukleinsäure als isoliert betrachtet. Eine Nukleinsäure wird auch dann als isoliert betrachtet, wenn sie durch das Eingreifen des Menschen verändert wurde oder an einem Lokus oder einer Stelle platziert wurde, bei dem/der es sich nicht um ihren natürlichen Ort handelt, oder wenn sie durch Transformation in eine Zelle eingeführt wurde. Weiterhin kann ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, wie ein cDNA-Molekül, frei von einem Teil des sonstigen Zellmaterials, mit dem es auf natürliche Weise assoziiert ist, bzw. von dem Kulturmedium, wenn es mittels Rekombinationstechniken hergestellt wurde, oder chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wurde, sein. Obwohl es gegebenenfalls eine untranslatierte Sequenz, die sowohl am 3'- als auch am 5'-Ende der Codierregion eines Gens vorliegen kann, umfassen kann, kann es bevorzugt sein, die Sequenzen, die die Codierregion in ihrem natürlich vorkommenden Replikon auf natürliche Weise flankieren, zu entfernen.
  • Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Umweltstress” auf eine suboptimale Bedingung, die mit Salinitätsstress, Trockenheitsstress, Stickstoffstress, Temperaturstress, Metallstress, chemischem Stress, pathogen bedingtem Stress oder oxidativem Stress oder einer beliebigen Kombination davon einhergeht. Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Trockenheit” auf eine Umweltbedingung, wo die Wassermenge, die verfügbar ist, um das pflanzliche Wachstum bzw. die pflanzliche Entwicklung zu unterstützen, suboptimal ist. Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Frischgewicht” auf alles in der Pflanze inklusive Wasser. Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Trockengewicht” auf alles in der Pflanze außer Wasser, und er beinhaltet zum Beispiel Kohlenhydrate, Proteine, Öle und mineralische Nährstoffe.
  • Zur Erzeugung einer erfindungsgemäßen transgenen Pflanze kann jede beliebige Pflanzenart transformiert werden. Bei der erfindungsgemäßen transgenen Pflanze kann es sich um eine dikotyle Pflanze oder eine monokotyle Pflanze handeln. Beispielhaft und nicht einschränkend können erfindungsgemäße transgene Pflanzen von jeder beliebigen der folgenden dikotylen Pflanzenfamilien abstammen: Leguminosae, darunter Pflanzen wie Erbse, Luzerne und Sojabohne; Umbelliferae, darunter Pflanzen wie Karotte und Sellerie; Solanaceae, darunter Pflanzen wie Tomate, Kartoffel, Aubergine, Tabak und Paprika; Cruciferae, insbesondere die Gattung Brassica, die Pflanzen wie Raps, Rübe, Kohl, Blumenkohl und Brokkoli beinhaltet; und A. thaliana; Compositae, darunter Pflanzen wie Salat; Malvaceae, darunter Baumwolle; Fabaceae, darunter Pflanzen wie Erdnuss und dergleichen. Erfindungsgemäße transgene Pflanzen können von monokotylen Pflanzen abstammen, wie zum Beispiel Weizen, Gerste, Sorghumhirse, Millethirse, Roggen, Triticale, Mais, Reis, Hafer und Zuckerrohr. Erfindungsgemäße transgene Pflanzen können auch Bäume wie Apfel, Birne, Quitte, Pflaume, Kirsche, Pfirsich, Nektarine, Aprikose, Papaya, Mango und andere Gehölzarten, darunter Koniferen und laubabwerfende Bäume wie Pappel, Kiefer, Sequoia, Zeder, Eiche und dergleichen sein. Besonders bevorzugt sind A. thaliana, Nicotiana tabacum, Reis, Raps, Canola, Sojabohne, Mais, Baumwolle und Weizen.
  • A. Phosphatidatcytidylyltransferase
  • In einer Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Genexpression in Wurzeln und Sprossen zu verstärken; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein subzelluläres Targeting-Peptid codiert; sowie ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Vollfängen-Phosphatidatcytidylyltransferasepolypeptid codiert, transformiert ist, wobei die transgene Pflanze einen erhöhten Ertrag verglichen mit einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, aufweist. Erfindungsgemäß ist, wenn der Promoter fähig ist, die Expression in Wurzeln oder Sprossen zu verstärken, das subzelluläre Targeting-Peptid ein Plastidentransitpeptid.
  • Wie in Tabelle 2 unten angegeben zeigen, wenn mit dem S. cerevisiae-Genprodukt YBR029C (SEQ ID NO: 2) ein Targeting an den Chloroplasten erfolgt und die transkriptionelle Expression des Gens von dem Super-Promoter vorangetrieben wird, transgene Pflanzen eine verbesserte Reaktion auf wasserlimitierende Bedingungen. Weiterhin geht aus Tabelle 3 hervor, dass Pflanzen, die YBR029C, bei dem ein Targeting an den Plastiden oder an die Mitochondrien erfolgt, exprimieren, unter guten Bewässerungsbedingungen größer als die Kontrollpflanzen waren. Das Gen YBR029C codiert für eine Phosphatidatcytidylyltransferase (EC 2.7.7.41), die auch unter der Bezeichnung CDP-Diacylglycerolsynthase (CDS) bekannt ist und die die Synthese von CDP-Diacylglycerol aus CTP und Phosphatidat katalysiert. Bei CDS handelt es sich um ein membrangebundenes Protein mit acht vorhergesagten membrandurchspannenden Regionen in der Kartoffel und in Arabidopsis. Phosphatidatcytidylyltransferasen sind teilweise durch eine charakteristische Signatursequenz „S – x – [LIVMF] – K – R – x(4) – K – D – x – [GSA] – x(2) – [LIF] – [PGS]x – H – G – G – [LIVMF] – x – D – R [LIVMFT]D” gekennzeichnet, wobei Aminosäurepositionen innerhalb eckiger Klammern beliebige der genannten Reste sein können und Aminosäurepositionen, die nicht in Klammern stehen, nur dieser bestimmte Aminosäurerest sein können. Solche konservierten Signatursequenzen sind beispielhaft in den Phosphatidatcytidylyltransferaseproteinen gemäß 1 dargestellt.
  • Die transgene Pflanze dieser Ausführungsform kann ein beliebiges Polynukleotid, das für Phosphatidatcytidylyltransferase codiert, umfassen. Vorzugsweise umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid mit Phosphatidatcytidylyltransferaseaktivität codiert, wobei das Polypeptid eine Phosphatidatcytidylyltransferase-Signatursequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 351 bis 377 gemäß SEQ ID NO: 2, den Aminosäuren 341 bis 367 gemäß SEQ ID NO: 4 oder den Aminosäuren 340 bis 366 gemäß SEQ ID NO: 6 umfasst. Stärker bevorzugt umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für eine Phosphatidatcytidylyltransferasedomäne mit einer Sequenz umfassend die Aminosäuren 65 bis 377 gemäß SEQ ID NO: 4, die Aminosäuren 54 bis 367 gemäß SEQ ID NO: 4 oder die Aminosäuren 53 bis 366 gemäß SEQ ID NO: 6, codiert. Am stärksten bevorzugt umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Phosphatidatcytidylyltransferasepolypeptid umfassend die Aminosäuren 1 bis 457 gemäß SEQ ID NO: 2, die Aminosäuren 1 bis 367 gemäß SEQ ID NO: 4 oder die Aminosäuren 1 bis 425 gemäß SEQ ID NO: 6 codiert.
  • B. Acyl-Carrier-Protein
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Expression in Blättern zu verstärken; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Mitochondrien-Transitpeptid codiert; sowie ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Acyl-Carrier-Protein codiert, transformiert ist, wobei die transgene Pflanze einen erhöhten Ertrag verglichen mit einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, aufweist.
  • Wie in Tabelle 4 unten angegeben zeigen, wenn mit dem S. cerevisiae-Genprodukt YKL192C (SEQ ID NO: 8) ein Targeting an die Mitochondrien unter der Kontrolle des USP-Promoters (SEQ ID NO: 123) erfolgt, transgene Pflanzen eine verbesserte Reaktion auf wasserlimitierende Bedingungen. Das Gen YKL192C codiert für ein Acyl-Carrier-Protein (ACP), das eine Phosphopantethein-Bindungsdomäne (PF00550) enthält. Acyl-Carrier-Proteine katalysieren eine Kondensationsreaktion unter Bildung von Peptidbrücken in der nichtribosomalen Proteinbiosynthese. Das Acyl-Carrier-Protein ist ein universeller und hochkonservierter Träger von Acylgruppen in der Fettsäurebiosynthese. Die aminoterminale Region der ACP-Proteine ist gut definiert und besteht aus alpha-vier-Helices, die in einem rechsläufigem Bündel, das durch interhelikale hydrophobe Wechselwirkungen zusammengehalten wird, angeordnet sind.
  • Phosphopantethein (oder Pantethein-4'-phosphat) ist die prosthetische Gruppe von ACP in manchen Multienzymkomplexen, wo es als „schwingender Arm” für das Anheften von aktivierten Fettsäure- und Aminosäuregruppen dient. Die Phosphopantethein-Bindungsdomänen sind teilweise durch das Vorhandensein der charakteristischen Phosphopantethein-Attachment-Site-Signatursequenz „[DEQGSTALMKRH] – [LIVMFYSTAC] – [GNQ] – [LIVMFYAG] – [DNEKHS] – S – [LIVMST] – {PCFY} – [STAGCPQLIVMF] – [LIVMATN] – [DENQGTAKRHLM] – [LIVMWSTA] – [LIVGSTACR] – {LPIY} – {VY} – [LIVMFA]” gekennzeichnet, wobei die Aminosäurepositionen innerhalb der eckigen Klammern beliebige der angegebenen Reste sein können, Aminosäurepositionen innerhalb der geschwungenen Klammern ein beliebiger Aminosäurerest mit Ausnahme des/der angegebenen sein können und Aminosäurepositionen ohne Klammern nur derjenige bestimmte Aminosäurerest sein können. Der Phosphopantetheinrest ist an den in der obigen Signatursequenz fett und kursiv gedruckten Serinrest gebunden. Dieser Serinrest ist am aminoterminalen Ende der Helix II vorhanden, einer Domäne des Proteins, die als die Erkennungshelix bezeichnet wird und die für die Wechselwirkung von ACP mit den Enzymen der Typ-II-Fettsäuresynthese verantwortlich ist.
  • Vorzugsweise umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Pölynukleotid, das für ein Volllängen-ACP umfassend eine Phosphopantethein-Bindungsstellen-Signatursequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 77 bis 92 gemäß SEQ ID NO: 8, den Aminosäuren 73 bis 88 gemäß SEQ ID NO: 10, den Aminosäuren 75 bis 90 gemäß SEQ ID NO: 12 oder den Aminosäuren 84 bis 99 gemäß SEQ ID NO: 14 codiert. Stärker bevorzugt umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Acyl-Carrier-Protein umfassend eine Acyl-Carrier-Proteindomäne ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 49 bis 106 gemäß SEQ ID NO: 8, den Aminosäuren 49 bis 102 gemäß SEQ ID NO: 10, den Aminosäuren 51 bis 104 gemäß SEQ ID NO: 12, den Aminosäuren 60 bis 113 gemäß SEQ ID NO: 14 codiert. Am stärksten bevorzugt umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Acyl-Carrier-Protein umfassend die Aminosäuren 1 bis 125 gemäß SEQ ID NO: 8, die Aminosäuren 1 bis 117 gemäß SEQ ID NO: 10, die Aminosäuren 1 bis 128 gemäß SEQ ID NO: 12 oder die Aminosäuren 1 bis 119 gemäß SEQ ID NO: 14 codiert.
  • C. Acyltransferase
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein subzelluläres Targeting-Peptid codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Acyltransferasepolypeptid codiert, transformiert ist, wobei die transgene Pflanze einen erhöhten Ertrag verglichen mit einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, aufweist.
  • Wie in Tabelle 5 unten angegeben zeigen, wenn mit dem S. cerevisiae-Acyltransferasegenprodukt YDR018C (SEQ ID NO: 16) ein Targeting an den Chloroplasten oder die Mitochondrien unter der Kontrolle des Super-Promoters oder des USP-Promoters (SEQ ID NO: 123) erfolgt, die transgenen Pflanzen eine verbesserte Reaktion auf wasserlimitierende Bedingungen. Weiterhin zeigt die Tabelle 6, dass unter guten Bewässerungsbedingungen die Pflanzen, die YDR018C unter Kontrolle des USP-Promoters (SEQ ID NO: 123) exprimieren und bei denen ein Targeting an die Mitochondrien erfolgt, größer als Kontrollpflanzen waren.
  • Die transgene Pflanze dieser Ausführungsform kann jedes beliebige. Polynukleotid, das für ein Acyltransferasepolypeptid codiert, umfassen. Vorzugweise umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Acyltransferasepolypeptid umfassend eine Acyltransferasedomäne ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 108 bis 272 gemäß SEQ ID NO: 16, den Aminosäuren 80 bis 222 gemäß SEQ ID NO: 18 oder den Aminosäuren 116 bis 258 gemäß SEQ ID NO: 20 codiert. Stärker bevorzugt umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für eine Acyltransferase mit einer Sequenz umfassend die Aminosäuren 1 bis 396 gemäß SEQ ID NO: 16, die Aminosäuren 1 bis 384 gemäß SEQ ID NO: 18 oder die Aminosäuren 1 bis 332 gemäß SEQ ID NO: 20 codiert.
  • D. Bifunktionelles Polypeptid des anaeroben Fettsäureoxidationskomplexes
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags einer Pflanzenart bereit, und zwar dadurch, dass man eine Wildtypzelle der Art mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Expression in Blättern zu verstärken; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Mitochondrien-Transitpeptid codiert und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Polypeptid des bifunktionellen anaeroben Fettsäureoxidationskomplexes transformiert. In einem zweiten Schritt werden aus der transformierten Pflanzenzelle transgene Pflänzchen regeneriert. In einem dritten Schritt wird mit den transgenen Pflänzchen ein ertragsbezogener Assay durchgeführt, und aus den regenierten transgenen Pflanzen werden Pflanzen mit höherem Ertrag selektiert.
  • Wie in den Tabellen 7 und 8 unten dargestellt sind, wenn die Transkription des E coli-Gens B2341 (SEQ ID NO: 21) unter der Kontrolle des USP-Promoters (SEQ ID NO: 123) steht und bei dem Genprodukt (SEQ ID NO: 22) ein Targeting an die Mitochondrien erfolgt, die transgenen Pflanzen tendenziell größer und weisen eine dunklere grüne Farbe auf als die Kontrollpflanzen. Das Gen B2341 codiert für ein Protein, das drei Domänen umfasst: eine Domäne, die für die ECH- oder Enoyl-CoA-Hydratase/Isomerase-Familie (PF00378) charakteristisch ist; eine C-terminale Domäne, die für 3HCDH oder 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase (PF00725) charakteristisch ist; und eine 3HCDH_N-3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase, NAD-Bindungsdomäne (PF02737). Die 3HCDH-Domäne ist teilweise durch das Vorliegen der Signatursequenz „[DNES] – x(2) – [GA] – F – [LIVMFYA] – x – [NT] – R – x(3) – [PA] – [LIVMFY] – [LIVMFYST] – x(5,6) – [LIVMFYCT] – [LIVMFYEAH] – x(2) – [GVE]” gekennzeichnet, wobei die Aminosäurepositionen innerhalb der eckigen Klammern ein beliebiger der angegebenen Reste sein können und Aminosäurepositionen ohne Klammern nur dieser bestimmte Aminosäurerest sein können. Alle in 4 dargestellten Sequenzen weisen diese charakteristische Signatursequenz auf, wobei die einzige Abweichung innerhalb dieser Gruppe das Vorhandensein eines Leucinrests in Position 498 in ZM06MC15742 (SEQ ID NO: 26) statt des kanonischen Argininrests ist.
  • Bei dem Verfahren dieser Ausführungsform kann ein beliebiges Polynukleotid verwendet werden, das für ein bifunktionelles Polypeptid des anaeroben Fettsäureoxidationskomplexes codiert und das eine ECH-Domäne, eine terminale 3HCDH-C-terminale Domäne und eine 3HCHD-NAD-Bindungsdomäne umfasst. Vorzugsweise wird bei dem Verfahren dieser Ausführungsform ein Polynukleotid verwendet, das für ein bifunktionelles Polypeptid des anaeroben Fettsäureoxidationskomplexes codiert und das drei Domänen umfasst: a) eine ECH-Domäne ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 17 bis 190 gemäß SEQ ID NO: 22, den Aminosäuren 17 bis 187 gemäß SEQ ID NO: 24 und den Aminosäuren 18 bis 187 gemäß SEQ ID NO: 26; b) eine 3HCDH-Domäne ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 489 bis 513 gemäß SEQ ID NO: 22, den Aminosäuren 490 bis 514 gemäß SEQ ID NO: 24, den Aminosäuren 490 bis 514 gemäß SEQ ID NO: 26; und c) eine 3HCDH-N-Domäne ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 310 bis 490 gemäß SEQ ID NO: 22, den Aminosäuren 312 bis 491 gemäß SEQ ID NO: 24 und den Aminosäuren 312 bis 491 gemäß SEQ ID NO: 26. Stärker bevorzugt wird bei dem Verfahren dieser Ausführungsform ein Polynukleotid verwendet, das für ein bifunktionelles Polypeptid des anaeroben Fettsäureoxidationskomplexes mit einer Sequenz umfassend die Aminosäuren 1 bis 714 gemäß SEQ ID NO: 22, die Aminosäuren 1 bis 723 gemäß SEQ ID NO: 24 oder die Aminosäuren 1 bis 727 gemäß SEQ ID NO: 26 codiert.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist eine transgene Pflanze, umfassend ein Polynukleotid, das für ein bifunktionelles Polypeptid des anaeroben Fettsäureoxidationskomplexes umfassend a) eine ECH-Domäne ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 17 bis 190 gemäß SEQ ID NO: 22, den Aminosäuren 17 bis 187 gemäß SEQ ID NO: 24 und den Aminosäuren 18 bis 187 gemäß SEQ ID NO: 26; b) eine 3HCDH-Domäne ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 489 bis 513 gemäß SEQ ID NO: 22, den Aminosäuren 490 bis 514 gemäß SEQ ID NO: 24, den Aminosäuren 490 bis 514 gemäß SEQ ID NO: 26; und c) eine 3HCDH-N-Domäne ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 310 bis 490 gemäß SEQ ID NO: 22, den Aminosäuren 312 bis 491 gemäß SEQ ID NO: 24 und den Aminosäuren 312 bis 491 gemäß SEQ ID NO: 26 codiert. Stärker bevorzugt umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein bifunktionelles Polypeptid des anaeroben Fettsäureoxidationskomplexes mit einer Sequenz umfassend die Aminosäuren 1 bis 714 gemäß SEQ ID NO: 22, die Aminosäuren 1 bis 723 gemäß SEQ ID NO: 24 oder die Aminosäuren 1 bis 727 gemäß SEQ ID NO: 26 codiert.
  • E. Acyl-CoA-Thioesterase
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Genexpression in Blättern zu verstärken; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Mitochondrien-Transitpeptid codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Acyl-CoA-Thioesterasepolypeptid codiert; transformiert ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
  • Wie in Tabelle 9 unten dargestellt waren, wenn bei der Transkription des E. coli-Gens b0452 ein Targeting an die Mitochondrien unter der Kontrolle des USP-Promoters erfolgt, die transgenen Pflanzen größer als die Kontrollpflanzen und zwar sowohl unter guten Bewässerungsbedingungen als auch unter Trockenheitsbedingungen. Das Gen B0452 (SEQ ID NO: 27) codiert für eine Acyl-CoA-Thioesterase (EC 3.1.2.2). Bei den Acyl-CoA-Thioesterasen (ACH) handelt es sich um eine Gruppe von Enzymen, die die Hydrolyse von Acyl-CoAs in die freie Fettsäure und Coenzym A (CoASH) katalysieren und so die Möglichkeit, die intrazellulären Gehalte an Acyl-CoAs, freien Fettsäuren und CoASH zu regulieren, bereitstellen. Dieses Enzym weist starke Aktivitäten auf mittel- und langkettige Acyl-CoAs auf. In A. thaliana wurden zwei Familien von ACHs identifiziert. Eine Familie, die aus AtACH1 und AtACH2 besteht, scheint in den Peroxisomen vorzuliegen, da sie über Peroxisomen-Targeting-Sequenzen des Typs 1 verfügen. Die andere Familie, die aus AtACH4 und AtACH5 besteht, kommt im endoplasmatischen Reticulum vor.
  • Die transgene Pflanze dieser Ausführungsform kann ein beliebiges Polynukleotid, das für eine Acyl-CoA-Thioesterase codiert, umfassen. Vorzugsweise umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid mit Acyl-CoA-Thioesteraseaktivität codiert, wobei das Polypeptid eine Domäne ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 107 bis 184 gemäß SEQ ID NO: 28, den Aminosäuren 54 bis 138 gemäß SEQ ID NO: 30, den Aminosäuren 127 bis 211 gemäß SEQ ID NO: 32 und den Aminosäuren 3 bis 87 gemäß SEQ ID NO: 34 umfasst. Stärker bevorzugt umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für eine Acyl-CoA-Thioesterase mit einer Sequenz umfassend die Aminosäuren 1 bis 286 gemäß SEQ ID NO: 28, die Aminosäuren 1 bis 248 gemäß SEQ ID NO: 30, die Aminosäuren 1 bis 212 gemäß SEQ ID NO: 32 oder die Aminosäuren 1 bis 197 gemäß SEQ ID NO: 34 codiert.
  • F. 2,4-Dienoyl-CoA-Reduktase
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine. transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Expression in Blättern zu verstärken; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Mitochondrien-Targeting-Peptid codiert, und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-2,4-Dienoyl-CoA-Reduktasepolypeptid codiert; transformiert ist, wobei die transgene Pflanze einen erhöhten Ertrag verglichen mit einer Wildtyppfianze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, aufweist.
  • Wie in Tabelle 10 unten dargestellt waren, wenn bei der Transkription des S. cerevisiae-Gens YNL202W (SEQ ID NO: 35) ein Targeting an die Mitochondrien unter der Kontrolle des USP-Promoters erfolgt, die transgenen Pflanzen unter cyclischen Trockenheitsbedingungen größer als die Kontrollpflanzen. Bei YNL202W handelt es sich um eine 2,4-Dienoyl-CoA-Reduktase (EC 1.3.1.34, DECR), ein Hilfsenzym der beta-Oxidation. Die DECR nimmt am Abbau von ungesättigten Fettsäure-Enoyl-CoA-Estern mit Doppelbindungen sowohl in geradzahligen als auch in ungeradzahligen Positionen im Peroxisomen teil. Sie katalysiert die NADP-abhängige Reduktion von 2,4-Dienoyl-CoA zu trans-3-Enoyl-CoA.
  • Die transgene Pflanze dieser Ausführungsform kann ein beliebiges Polynukleotid, das für eine 2,4-Dienoyl-CoA-Reduktase codiert, umfassen. Vorzugsweise umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid mit 2,4-Dienoyl-CoA-Reduktaseaktivität codiert, wobei das Polypeptid eine Domäne ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 107 bis 270 gemäß SEQ ID NO: 36 und den Aminosäuren 54 bis 227 gemäß SEQ ID NO: 38 umfasst. Stärker bevorzugt umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für eine 2,4-Dienoyl-CoA-Reduktase mit einer Sequenz umfassend die Aminosäuren 1 bis 296 gemäß SEQ ID NO: 36 oder die Aminosäuren 1 bis 264 gemäß SEQ ID NO: 38 codiert.
  • G. Sterolesterase
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein subzelluläres Transpeptid codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für eine Volllängen-Sterolesterase codiert; transformiert ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppfianze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
  • Wie in Tabelle 11 unten dargestellt waren, wenn bei der Transkription des S. cerevisiae-Gens YKL140W (SEQ ID NO: 39) ein Targeting an die Plastiden unter der Kontrolle des PcUbi-Promoters erfolgt, die transgenen Pflanzen unter guten Bewässerungsbedingungen größer als die Kontrollpflanzen. Die Tabelle 11 zeigt auch, dass, wenn bei der YKL140W-Transkription ein Targeting an die Mitochondrienunter der Kontrolle des USP-Promoters erfolgt, die transgenen Pflanzen unter cyclisehen Trockenheitsbedingungen größer als die Kontrollpflanzen waren. YKL140W codiert für eine Sterolesterase (EC 3.1.1.13). In der Hefe vermittelt die Sterolesterase die Hydrolyse von Stearylestern und ist für die Mobilisierung von Stearylester erforderlich, wodurch ihr eine zentrale Rolle im Lipidmetabolismus zukommt. Dieses Enzym kann unter gewissen Bedingungen eine schwache Lipaseaktivität gegenüber Triglyceriden aufweisen.
  • Die transgene Pflanze dieser Ausführungsform kann ein beliebiges Polynukleotid, das für eine Sterolesterase codiert, umfassen. Vorzugsweise umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid mit Sterolesteraseaktivität codiert, wobei das Polypeptid eine Sequenz umfassend die Aminosäuren 1 bis 548 gemäß SEQ ID NO: 40 aufweist.
  • H. Succinat-CoA-Ligase
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Chloroplastentransitpeptid codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Succinat-CoA-Ligasepolypeptid codiert; transformiert ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
  • Wie in Tabelle 12 unten dargestellt sind, wenn bei der Transkription des Synechocystis-Gens SLL1023 (SEQ ID NO: 41) ein Targeting an die Plastiden unter der Kontrolle des PcUbi-Promoters stattfindet, die transgenen Pflanzen größer als die Kontrollpflanzen, sowohl unter cyclischen Trockenheitsbedingungen als auch unter guten Bewässerungsbedingungen. Bei der SLL1023 handelt es sich um eine Succinat-CoA-Ligase (EC 6.2.1.5). Die Succinat-CoA-Ligase katalysiert die Reaktion GTP + Succinat + CoA = GDP + Phosphat + Succinyl-CoA. Diese Reaktion ist ein Bestandteil des TCA-Cyclus für den Zuckermetabolismus.
  • Die transgene Pflanze dieser Ausführungsform kann ein beliebiges Polynukleotid umfassen, das für eine Succinat-CoA-Ligase codiert. Vorzugsweise umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für eine Succinat-CoA-Ligase mit einer Sequenz umfassend die Aminosäuren 1 bis 401 gemäß SEQ ID NO: 42 codiert.
  • I. Cobalt-Precorrin-6A-Reduktase
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Cobalt-Precorrin-6A-Reduktasepolypeptid codiert; transformiert ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
  • Wie in Tabelle 13 unten dargestellt waren, wenn das Synechocystis-Gen SLR0252 (SEQ ID NO: 43) unter der Kontrolle des PcUbi-Promoters exprimiert wird, die transgenen Pflanzen unter cyclischen Trockenheitsbedingungen größer als die Kontrollpflanzen. Bei SLR0252 handelt es sich um eine Cobalt-Precorrin-6A-Reduktase (EC 1.3.1.54). Die Cobalt-Precorrin-6A-Reduktase katalysiert die Reduktion des Makrocyclus von Cobalt-Precorrin-6X zu Cobalt-Precorrin-6Y. Cobalt-Precorrin-6Y ist ein Cofaktor von vielen Enzymen.
  • Die transgene Pflanze dieser Ausführungsform kann ein beliebiges Polynukleotid umfassen, das für eine Cobalt-Precorrin-6A-Reduktase codiert. Vorzugsweise umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Volllängen-Peptid codiert, das für eine Cobalt-Precorrin-6A-Reduktase mit einer Sequenz umfassend die Aminosäuren 1 bis 261 gemäß SEQ ID NO: 44 codiert.
  • J. Uroporphyrin-III-C-Methyltransferase
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Expression in Blättern zu verstärken, und ein isoliertes Polynukleotid, das für eine Volllängen-Uroporphyrin-III-C-Methyltransferase codiert; transformiert ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist. In Tabelle 14 unten wird gezeigt, dass, wenn das E. coli-Gen b3803 (SEQ ID NO: 45) unter der Kontrolle des USP-Promoters exprimiert wird, die transgenen Pflanzen unter Wachstumsbedingungen mit guter Bewässerung größer als die Kontrollpflanzen waren. Das b3803-Gen codiert für eine Uroporphyrin-III-C-Methyltransferase, die auch als S-adenosyl-L-methioninabhängige Uroporphyrinogen-III-C-Methyltransferase (SUMT) bekannt ist, ein Enzym, das an der Biosynthese von Sirohem und Cobalamin (Vitamin B12) beteiligt ist. SUMT (EC 2.1.1.107) ist ein Verzweigungspunktenzym, das eine Schlüsselrolle in der Biosynthese von modifizierten Tetrapyrrolen spielt. Dadurch, dass die SUMT die Transformation von Uroporphyrinogen III zu Precorrin-2 katalysiert, kontrolliert sie den Fluss zu Verbindungen wie Vitamin B12 und Sirohem, einem wichtigen Cofaktor der Enzyme Nitratreduktase und Sulfitreduktase. In Pflanzen tritt Uroporphyrinogen III in den Syntheseweg ein, der zur Chlorophyllsynthese führt.
  • Die transgene Pflanze dieser Ausführungsform kann vorzugsweise ein beliebiges Polynukleotid umfassen, das für eine Uroporphyrin-III-C-Methyltransferase codiert. Stärker bevorzugt umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid mit Uroporphyrin-III-C-Methyltransferaseaktivität codiert, wobei das Polypeptid eine Domäne umfassend die Aminosäuren 101 bis 356 gemäß SEQ ID NO: 46; die Aminosäuren 97 bis 353 gemäß SEQ ID NO: 48; die Aminosäuren 91 bis 346 gemäß SEQ ID NO: 50 oder die Aminosäuren 100 bis 355 gemäß SEQ ID NO: 52 umfasst. Am stärksten bevorzugt umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für eine Uroporphyrin-III-C-Methyltransferase mit einer Sequenz umfassend die Aminosäuren 1 bis 393 gemäß SEQ ID NO: 46; die Aminosäuren 1 bis 368 gemäß SEQ ID NO: 48; die Aminosäuren 1 bis 363 gemäß SEQ ID NO: 50 oder die Aminosäuren 1 bis 379 gemäß SEQ ID NO: 52 codiert.
  • K. Isoprenoid-Biosyntheseprotein
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Genexpression in Wurzeln und Sprossen zu verstärken; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid mit Isoprenoidbiosyntheseaktivität codiert, transformiert worden ist; wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
  • Die Tabelle 15 unten zeigt, dass, wenn das E. coli-Gen b3209 (SEQ ID NO: 53) unter der Kontrolle des Super-Promoters exprimiert wird, die transgenen Pflanzen unter Wachstumsbedingungen mit guter Bewässerung größer als die Kontrollpflanzen sind. Obwohl die spezifische Funktion des b3209-Proteins nicht bekannt ist, wurde gezeigt, dass es, wenn es überexprimiert wird, die Lycopenproduktion in E. coli erhöht. Lycopen ist ein wichtiger Bestandteil des Photosystems und ein starkes Antioxidationsmittel, das Zellen gegen oxidative Schädigung schützt. In Pflanzenzellen wird es auch in andere Carotinoide und Vorstufen für Pflanzenhormone umgewandelt. Die Isoprenoidbiosyntheseproteine sind teilweise durch das Vorhandensein einer DJ-1_Pfp1-Signatursequenz gekennzeichnet. Solche Signatursequenzen sind beispielhaft in den Isoprenoidbiosyntheseproteinen gemäß 8 dargestellt.
  • Die transgene Pflanze dieser Ausführungsform kann ein beliebiges Polynukleotid umfassen, das für ein Isoprenoidbiosyntheseprotein codiert. Vorzugsweise umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid mit Isoprenoidbiosyntheseaktivität codiert, wobei das Polypeptid eine DJ-1_Pfp1-Signatursequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 46 bis 208 gemäß SEQ ID NO: 54; den Aminosäuren 32 bis 189 gemäß SEQ ID NO: 56; und den Aminosäuren 25 bis 151 gemäß SEQ ID NO: 58 umfasst. Am stärksten bevorzugt umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Isoprenoidbiosyntheseprotein mit einer Sequenz umfassend die Aminosäuren 1 bis 220 gemäß SEQ ID NO: 54, die Aminosäuren 1 bis 231 gemäß SEQ ID NO: 56 oder die Aminosäuren 1 bis 161 gemäß SEQ ID NO: 58 codiert.
  • L. Translokator des LysE-Typs
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Nukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Genexpression in Wurzeln und Sprossen zu verstärken, und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid mit Translokatoraktivität des LysE-Typs codiert, transformiert worden ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
  • Wie in Tabelle 16 unten dargestellt waren, wenn das E. coli-Gen b2578 (SEQ ID NO: 59) unter der Kontrolle des Super-Promoters exprimiert wird, die transgenen Pflanzen unter guten Bewässerungsbedingungen größer als die Kontrollpflanzen. Das b2578-Gen codiert für ein Translokatorprotein des LysE-Typs, ein Membranprotein mit sechs vorhergesagten Transmembrandomänen, das an der Aufrechterhaltung der intrazellulären L-Lysinspiegel durch Ausschleusen von überschüssigem L-Lysin aus der Zelle beteiligt ist. Diese Proteine sind teilweise durch das Vorhandensein einer LysE-Signatursequenz gekennzeichnet.
  • Die transgene Pflanze dieser Ausführungsform kann ein beliebiges Polynukleotid, das für einen Translokator des LysE-Typs codiert, umfassen. Vorzugsweise umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid mit Translokatoraktivität des LysE-Typs codiert, wobei das Polypeptid eine LysE-Signatursequenz umfassend die Aminosäuren 14 bis 195 gemäß SEQ ID NO: 60 umfasst. Am stärksten bevorzugt umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für einen Translokator des Lys-E-Typs mit einer Sequenz umfassend die Aminosäuren 1 bis 195 gemäß SEQ ID NO: 60 codiert.
  • M. Transporter für verzweigtkettige Aminosäuren
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Genexpression in Wurzeln und Sprossen zu verstärken; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid der LIV-E-Familie mit Transportaktivität für verzweigtkettige Aminosäuren codiert, transformiert ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
  • Wie in Tabelle 17 unten gezeigt waren, wenn das E. coli-Gen b2682 (SEQ ID NO: 61) unter der Kontrolle des Super-Promoters exprimiert wird, die transgenen Pflanzen unter Wachstumsbedingungen mit guter Bewässerung größer als die Kontrollpflanzen. Das b2682-Gen codiert für ein Protein der LIV-E-Familie für den Transport von verzweigtkettigen Aminosäuren, ein Membranprotein mit fünf vorhergesagten Transmembrandomänen, das an der Ausschleusung von L-Valin beteiligt ist. Diese Proteine sind teilweise durch das Vorhandensein einer AzlC-Signatursequenz gekennzeichnet.
  • Die transgene Pflanze dieser Ausführungsform kann ein beliebiges Polynukleotid, das für einen Transporter für verzweigtkettige Aminosäuren codiert, umfassen. Vorzugsweise umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid mit Transportaktivität für verzweigtkettige Aminosäuren der LIV-E-Familie codiert, wobei das Polypeptid eine AzlC-Signatursequenz umfassend die Aminosäuren 23 bis 167 gemäß SEQ ID NO: 62 umfasst. Am stärksten bevorzugt umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für einen Transporter für verzweigtkettige Aminosäuren mit einer Sequenz umfassend die Aminosäuren 1 bis 245 gemäß SEQ ID NO: 62 codiert.
  • N. DNA-Bindungsprotein
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Nukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Genexpression in Wurzeln und Sprossen zu verstärken, und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein verkürztes DNA-Bindungspolypeptid codiert, transformiert worden ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
  • Wie in Tabelle 18 unten dargestellt sind, wenn das E. coli-Gen b3285 (SEQ ID NO: 63) unter der Kontrolle des Super-Promoters exprimiert wird, die transgenen Pflanzen unter Wachstumsbedingungen mit guter Bewässerung größer als die Kontrollpflanzen. Das b3285-Gen codiert für ein verkürztes DNA-Bindungsprotein umfassend den C-terminalen Abschnitt des E. coli-SMF-Proteins (Eintragsnummer in der öffentlichen Datenbank YP_026211) und kann den Zutritt von DNA-modifizierten Proteinen zu genomischer DNA erleichtern. Solche DNA-Bindungsproteine sind teilweise durch das Vorhandensein einer SMF-Signatursequenz gekennzeichnet.
  • Die transgene Pflanze dieser Ausführungsform kann ein beliebiges Polynukleotid mit Homologie zu dem Polynukleotid, das für das verkürzte DNA-Bindungsprotein gemäß SEQ ID NO: 64 codiert, umfassen. Vorzugsweise umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein DNA-Bindungsprotein mit einer Sequenz umfassend die Aminosäuren 1 bis 102 gemäß SEQ ID NO: 64 codiert.
  • O. YscJ/FliF-Protein
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Genexpression in Wurzeln und Sprossen zu verstärken, und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid der YscJ/FliF-Familie codiert, transformiert worden ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
  • Wie in Tabelle 19 unten dargestellt sind, wenn das E. coli-Gen b1938 (SEQ ID NO: 65), ein Protein der YscJ/FliF-Familie unter der Kontrolle des Superpromoters, exprimiert wird, die transgenen Pflanzen größer als die Kontrollpflanzen. Die Proteine der YscJ/FliF-Familie stabilisieren Membranproteine und Komplexe wie Transporter, die Zellen wichtige Verbindungen für das Zellwachstum bereitstellen. Die Proteine der YscJ/FliF-Familie sind teilweise durch das Vorhandensein einer YscJ_FliF-Signatursequenz gekennzeichnet.
  • Die transgene Pflanze dieser Ausführungsform kann ein beliebiges Polynukleotid umfassen, das für ein Protein der YscJ/FliF-Familie codiert. Vorzugsweise umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid mit YscJ/FliF-Aktivität codiert, wobei das Polypeptid eine erste YscJ/FliF-Signatursequenz umfassend die Aminosäuren 17 bis 225 gemäß SEQ ID NO: 66 und eine zweite YscJ/FliF-Signatursequenz umfassend die Aminosäuren 250 bis 429 gemäß SEQ ID NO: 66 umfasst. Am stärksten bevorzugt umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Protein der YscJ/FliF-Familie mit einer Sequenz umfassend die Aminosäuren 1 bis 552 gemäß SEQ ID NO: 66 codiert.
  • P. Riboflavinbiosynthese-Gene
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, einen Promoter und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-GTP-Cyclohydrolase-II-Polypeptid, das keine subzelluläre Targetingsequenz umfasst, codiert, transformiert ist; wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
  • Wie in Tabelle 20 unten dargestellt waren, wenn das Synechocystis-Gen SLL1894 (SEQ ID NO: 67), eine GTP-Cyclohydrolase II, unter der Kontrolle des PcUbi-Promoters ohne subzelluläres Targeting exprimiert wurde, die transgenen Pflanzen unter Wasserlimitierungsbedingungen größer als die Kontrollpflanzen. GTP-Cyclohydrolase-II-Enzyme sind teilweise durch das Vorhandensein einer DHBP_synthase-Signatursequenz am N-terminalen Ende und eine GTP-Cyclohydrolase-II-Signatursequenz am C-terminalen Ende gekennzeichnet. Solche Signatursequenzen sind beispielhaft in den GTP-Cyclohydrolase-II-Proteinen gemäß 12 dargestellt.
  • Die in der transgenen Pflanze dieser Ausführungsform verwendete Expressionskassette kann ein beliebiges Polynukleotid umfassen, das für ein Volllängenpolypeptid mit GTP-Cyclohydrolase-II-Aktivität, das kein subzelluläres Targetingpeptid umfasst, codiert. Vorzugsweise umfasst das GTP-Cyclohydrolase-II-Polypeptid eine DHBP-Synthasedomäne ausgewählt aus den Gruppen bestehend aus den Aminosäuren 5 bis 202 gemäß SEQ ID NO: 68 und den Aminosäuren 120 bis 317 gemäß SEQ ID NO: 70 und eine GTP-Cyclohydrolase-II-Domäne ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 207 bis 377 gemäß SEQ ID NO: 68 und den Aminosäuren 322 bis 491 gemäß SEQ ID NO: 70. Erfindungsgemäß ist, wenn die G. max-GTP-Cyclohydrolase-II gemäß SEQ ID NO: 70 in der Expressionskassette verwendet wird, die Polynukleotidsequenz, die für das subzelluläre Targeting-Peptid codiert (Aminosäuren 1 bis 49 gemäß SEQ ID NO: 70), deletiert. Stärker bevorzugt umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein GTP-Cyclohydrolase-II-Polypeptid mit einer Sequenz umfassend die Aminosäuren 1 bis 556 gemäß SEQ ID NO: 68 oder die Aminosäuren 50 bis 544 gemäß SEQ ID NO: 70 codiert.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Nukleotid, das für einen Promoter codiert, und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Lumazinsynthasepolypeptid, das keine plastidäre Targeting-Sequenz umfasst, codiert, transformiert worden ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
  • Wie in den Tabellen 21 und 22 unten dargestellt weisen, wenn das Synechocystis-Gen SLL1282 (SEQ ID NO: 71), eine Lumazinsynthase, unter der Kontrolle des PcUbi-Promoters exprimiert wird, die transgenen Pflanzen im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die das SLL1282-Gen nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag auf. Lumazinsynthaseenzyme sind teilweise durch das Vorhandensein einer DMRL_synthase-Signatursequenz gekennzeichnet. Solche Signatursequenzen sind beispielhaft in den Lumazinsynthaseproteinen gemäß 13 dargestellt.
  • Die bei der transgenen Pflanze dieser Ausführungsform verwendete Expressionskassette kann ein beliebiges Polynukleotid umfassen, das für ein Lumazinsynthasepolypeptid, das kein subzelluläres Targeting-Peptid umfasst, codiert. Vorzugsweise umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid mit Lumazinsynthaseaktivität codiert, wobei das Polypeptid eine DMRL_synthase-Signatursequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 12 bis 158 gemäß SEQ ID NO: 72, den Aminosäuren 83 bis 226 gemäß SEQ ID NO: 74; den Aminosäuren 70 bis 213 gemäß SEQ ID NO: 76; den Aminosäuren 70 bis 215 gemäß SEQ ID NO: 78 umfasst. Erfindungsgemäß sind, wenn eine beliebige der pflanzlichen Lumazinsynthasen gemäß SEQ ID NO: 100, 76 oder 78 in der Expressionskassette verwendet wird, die Polynukleotidsequenzen, die für das subzelluläre Targeting-Peptid codieren (Aminosäuren 1 bis 53 gemäß SEQ ID NO: 74; Aminosäuren 1 bis 56 gemäß SEQ ID NO: 76 und Aminosäuren 1 bis 80 gemäß SEQ ID NO: 78) deletiert. Stärker bevorzugt umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für eine Lumazinsynthase umfassend die Aminosäuren 1 bis 164 gemäß SEQ ID NO: 72, die Aminosäuren 54 bis 228 gemäß SEQ ID NO: 74; die Aminosäuren 57 bis 217 gemäß SEQ ID NO: 76 oder die Aminosäuren 81 bis 217 gemäß SEQ ID NO: 78 codiert.
  • Q. Vitamin-B6-Biosynthesegene
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Genexpression in Wurzeln und Sprossen zu verstärken und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid codiert, das fähig ist, die PLP-Synthese zu verstärken, transformiert ist. In dieser Ausführungsform kann die Expressionskassette gegebenenfalls weiterhin ein isoliertes Polynukleotid umfassen, das für ein Mitochondrien- oder Plastidentransitpeptid codiert. Für die Verwendung in dieser Ausführungsform der Erfindung eignen sich Polynukleotide umfassend ein beliebiges Gen des Vitamin-B6-Synthesewegs. So zum Beispiel kann es sich bei dem Vitamin-B6-Synthesegen um pdxY (z. B. SEQ ID NO: 79), pdxH (z. B. SEQ ID NO: 81), pdxK (z. B. SEQ ID NO: 83, 85 und 87), yfei (z. B. SEQ ID NO: 89 und 91), Yn8fp (SEQ ID NO: 93); pdxJ (z. B. SEQ ID NO: 95 und 97), pdx1/sor 1 (z. B. SEQ ID NO: 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117 oder 119) handeln.
  • Umfasst die transgene Pflanze das Vitamin-B6-Biosynthesegen PdxY, so handelt es sich bei dem Promoter vorzugsweise um einen Wurzel- oder sprossspezifischen Promoter und die Expressionskassette umfasst weiterhin ein Polynukleotid, das für ein Plastidentransitpeptid codiert. Wie in den Tabellen 23 und 24 unten dargestellt waren, wenn mit dem E. coli-Gen b1636 (SEQ ID NO: 79), mit der Bezeichnung PdxY, ein Targeting an den Plastiden unter der Kontrolle des Super-Promoters erfolgt, die transgenen Pflanzen unter guten Bewässerungsbedingungen und unter wasserlimitierten Bedingungen größer als die Kontrollpflanzen.
  • Das PdxY-Gen codiert für eine PL-Kinase, die eine Phosphomethylpyrimidinkinasedomäne umfasst. Die transgene Pflanze dieser Ausführungsform kann ein beliebiges Polynukleotid, das für eine PL-Kinase codiert, umfassen. Vorzugsweise umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid mit PL-Kinaseaktivität codiert, wobei das Polypeptid eine Phosphomethylpyrimidinkinase-Signatursequenz wie die Aminosäuren 61 bis 259 gemäß SEQ ID NO: 80 umfasst. Stärker bevorzugt umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für eine PL-Kinase mit einer Sequenz umfassend die Aminosäuren 1 bis 287 gemäß SEQ ID NO: 80 codiert, umfasst.
  • Wie in Tabelle 25 unten dargestellt sind, wenn das Synechocystis-Gen SLL1779 (SEQ ID NO: 95), mit der Bezeichnung pdxJ, unter der Kontrolle des PcUbi-Promoters mit oder ohne subzelluläres Targeting exprimiert wird, die transgenen Pflanzen unter guten Bewässerungsbedingungen größer als die Kontrollpflanzen. Tabelle 26 zeigt, dass, wenn bei SLL1779 (SEQ ID NO: 95) ein Targeting an die Mitochondrien unter der Kontrolle des PcUbi-Promoters erfolgt, die transgenen Pflanzen größer als die Kontrollpflanzen sind, wenn sie unter wasserlimitierten Bedingungen geprüft werden. Demgemäß kann, wenn die transgene Pflanze das PdxJ-Gen umfasst, die Expressionskassette gegebenenfalls weiterhin ein Polynukleotid umfassen, das für ein Mitochondrien- oder Plastidentransitpeptid codiert. Wie oben dargestellt wirkt das Enzym PdxJ gemeinsam mit dem Enzym PdxA zusammen, wobei PNP gebildet wird. Die Aminosäuren 2 bis 218 gemäß SEQ ID NO: 96 stellen eine Signatursequenz des PdxJ-Gens aus Synechocystis sp PCC6803 dar. Vorzugsweise codiert das in der Expressionskassette dieser Ausführungsform verwendete PdxJ-Gen für ein Polypeptid mit den Aminosäuren 1 bis 221 gemäß SEQ ID NO: 96 oder den Aminosäuren 1 bis 243 gemäß SEQ ID NO: 98.
  • Die Erfindung stellt weiterhin einen Samen bereit, der für die im vorliegenden Text beschriebenen Expressionskassetten (im vorliegenden Text auch als „Transgene” bezeichnet) reinerbig ist, wobei transgene Pflanzen, die aus diesem Samen herangezogen werden, im Vergleich zu einer Wildtypsorte der Pflanze einen erhöhten Ertrag aufweisen. Die Erfindung stellt auch ein Produkt bereit, das von oder aus den transgenen Pflanzen, die das Polynukleotid exprimieren, ihren Pflanzenteilen oder ihren Samen erzeugt wird. Das Produkt kann unter Verwendung von verschiedenen, in der Fachwelt gut bekannten Verfahren erhalten werden. Im vorliegenden Zusammenhang beinhaltet das Wort „Produkt” ein Nahrungsmittel, Futtermittel, einen Nahrungsmittelzusatzstoff, einen Futterzusatzstoff, eine Faser, ein Kosmetikum oder ein Pharmazeutikum, ist jedoch nicht hierauf beschränkt. Nahrungsmittel gelten als Zusammensetzungen, die für die Ernährung oder als Ergänzung der Ernährung eingesetzt werden. Tierfuttermittel und Tierfutterzusatzstoffe insbesondere gelten als Nahrungsmittel. Die Erfindung stellt weiterhin ein Agrarprodukt bereit, das von einer der transgenen Pflanzen, einem der transgenen Pflanzenteile oder einem der transgenen Pflanzensamen gebildet wird. Zu den Agrarprodukten zählen Pflanzenextrakte, Proteine, Aminosäuren, Kohlenhydrate, Fette, Öle, Polymere, Vitamine und dergleichen, was jedoch keine Einschränkung darstellen soll.
  • Die Erfindung stellt auch ein isoliertes Polynukleotid bereit, das über eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 69; SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 75 und SEQ ID NO: 77 verfügt. Ebenfalls umfasst von dem erfindungsgemäßen Polynukleotid ist ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 70; SEQ ID NO: 74; SEQ ID NO: 76 und SEQ ID NO: 78 codiert. Ein erfindungsgemäßes Polynukleotid kann unter Verwendung von standardmäßigen molekularbiologischen Techniken und der im vorliegenden Text bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden, zum Beispiel unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesegeräts.
  • Die erfindungsgemäßen isolierten Polynukleotide beinhalten Homologe der Polynukleotide gemäß Tabelle 1. „Homologe” werden im vorliegenden Text als zwei Nukleinsäuren oder Polypeptide mit ähnlichen oder im Wesentlichen identischen Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenzen definiert. Homologe beinhalten Allelvarianten, Analoge und Orthologe, wie sie im Folgenden definiert sind. Im folgenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Analoge” auf zwei Nukleinsäuren, die dieselbe oder eine ähnliche Funktion ausüben, die jedoch getrennt in nichtverwandten Organismen im Lauf der Evolution entstanden sind. Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Orthologe” auf zwei Nukleinsäuren aus unterschiedlichen Arten, die jedoch im Lauf der Evolution aus einem gemeinsamen Vorfahrengen durch Artbildung entstanden sind. Der Begriff Homolog umfasst weiterhin Nukleinsäuremoleküle, die sich von einer der in Tabelle 1 gezeigten Nukleotidsequenzen aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheiden und die so für dasselbe Polypeptid codieren.
  • Zur Bestimmung des Prozentsatzes der Sequenzidentität von zwei Aminosäuresequenzen (z. B. einer der Polypeptidsequenzen aus Tabelle 1 und ein Homolog davon) werden die Sequenzen für optimale Vergleichszwecke als Alignment untereinander geschrieben (z. B. können. für ein optimales Alignment mit dem anderen Polypeptid bzw. der anderen Nukleinsäure „Gays” in die Sequenz eines Polypeptids eingeführt werden). Die Aminosäurereste an entsprechenden Aminosäurepositionen werden dann miteinander verglichen. Wird eine Position in einer Sequenz von demselben Aminosäurerest wie die entsprechende Position in der anderen Sequenz eingenommen, dann sind die Moleküle an dieser Position identisch. Dieselbe Art von Vergleich kann zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen angestellt werden.
  • Vorzugsweise sind die isolierten Aminosäurehomologe, -analoge und -orthologe der Polypeptide der vorliegenden Erfindung mindestens ungefähr 50–60%, vorzugsweise mindestens ungefähr 60–70% und stärker bevorzugt mindestens ungefähr 70–75%, 75–80%, 80–85%, 85–90% oder 90–95% und am stärksten bevorzugt mindestens ungefähr 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr zu einer gesamten in Tabelle 1 identifizierten Aminosäuresequenz identisch. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nukleinsäurehomolog der Erfindung eine Nukleotidsequenz, die mindestens ungefähr 40–60%, vorzugsweise mindestens ungefähr 60–70%, stärker bevorzugt mindestens ungefähr 70–75%, 75–80%, 80–85%, 85–90% oder 90–95% und noch stärker bevorzugt mindestens ungefähr 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr zu einer in Tabelle 1 gezeigten Nukleotidsequenz identisch ist.
  • Für die Zwecke der Erfindung wird der Prozentsatz der Identität zwischen zwei Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen unter Verwendung von Align 2.0 (Myers and Miller, CABIOS (1989) 4: 11–17), wobei alle Parameter in der Default-Einstellung vorgegeben werden, oder Software-Paket Vector NTI 9.0 (PC) (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA92008) bestimmt. Für die mit Vector NTI berechnete Bestimmung des Prozentsatzes der Identität von zwei Nukleinsäuren werden eine „gap opening penalty” von 15 und eine „gap extension penalty” von 6,66 verwendet. Für die Bestimmung des Prozentsatzes der Identität von zwei Polypeptiden werden eine „gap opening penalty” von 10 und eine „gap extension penalty” von 0,1 verwendet. Alle anderen Parameter werden in der Default-Einstellung vorgegeben. Für ein multiples Alignment (Clustal W algorithm) beträgt mit der blosumo2-Matrix die „gap opening penalty” 10 und die „gap extension penalty” 0,05. Es ist klar, dass beim Vergleich einer DNA-Sequenz mit einer RNA-Sequenz zwecks Bestimmung der Sequenzidentität ein Thymidinnukleotid einem Uracilnukleotid entspricht.
  • Nukleinsäuremoleküle, die Homologen, Analogen und Orthologen der in Tabelle 1 angeführten Polypeptiden entsprechen, können aufgrund ihrer Identität zu diesen Polypeptiden isoliert werden, und zwar unter Verwendung der Polynukleotide, die für die entsprechenden Polypeptide codieren, oder hierauf beruhenden Primern als Hybridisierungssonden gemäß Standard-Hybridisierungstechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff „stringente Bedingungen” in Bezug auf die Hybridisierung für DNA an einem DNA-Blot eine Hybridisierung über Nacht bei 60°C in 10X Denhart-Lösung, 6X SSC, 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA. Die Blots werden der Reihe nach bei 62°C jeweils 30 Minuten mit 3X SSC/0,1% SDS und anschließend 1X SSC/0,1% SDS, und abschließend 0,1X SSC/0,1% SDS gewaschen. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet die Wendung „stringente Bedingungen” ebenfalls im vorliegenden Zusammenhang eine Hybridisierung in einer 6X SSC-Lösung bei 65°C. In einer anderen Ausführungsform bezieht sich „hochstringente Bedingungen auf eine Hybridisierung über Nacht bei 65°C in 10X Denhart-Lösung, 6X SSC, 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA. Die Blots werden der Reihe nach bei 65°C jeweils 30 Minuten mit 3X SSC/0,1% SDS und anschließend 1X SSC/O,1% SDS und abschließend 0,1X SSC/0,1% SDS gewaschen. Verfahren für Nukleinsäurehybridisierungen sind gut fachbekannt.
  • Die in der Erfindung verwendeten isolierten Polynukleotide können optimiert werden, also genetisch dahingehend verändert werden, dass ihre Expression in einer bestimmten Pflanze oder einem bestimmten Tier erhöht wird. Zur Bereitstellung von für Pflanzen optimierten Nukleinsäuren kann die DNA-Sequenz des Gens dahingehend modifiziert werden, dass: 1) sie von stark exprimierten Pflanzengenen bevorzugte Codons umfasst; 2) sie einen A + T-Gehalt der Nukleotidbasenzusammensetzung umfasst, der im Wesentlichen in Pflanzen angetroffen wird; 3) sie eine Pflanzeninitiationssequenz bildet; 4) sie Sequenzen, die Destabilisierung, unerwünschte Polyadenylierung, Abbau und Termination der RNA verursachen, oder die Sekundärstruktur-„Hairpins” oder RNA-Spleißstellen bilden, eliminiert; oder 5) Antisense-orientierte Leseraster eliminiert werden. Die erhöhte Expression von Nukleinsäuren in Pflanzen kann dadurch erzielt werden, dass man die Verteilungshäufigkeit des Codon Usage bei Pflanzen im Allgemeinen oder in einer bestimmten Pflanze verwendet. Verfahren für die Optimierung der Nukleinsäureexpression in Pflanzen finden sich in EPA 0359472 ; EPA 0385962 ; PCT-Anmeldung Nr. WO 91/16432; US-Patent Nr. 5,380,831 ; US-Patent Nr. 5,436,391 ; Perlack et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324–3328; und Murray et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17: 477–498.
  • Die Erfindung stellt weiterhin einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der eine Expressionskassette ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, ein isoliertes Polynukleotid, das für ein subzelluläres Targeting-Peptid codiert und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Phosphatidatcytidylyltransferasepolypeptid codiert; b) einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Expression in Blättern zu verstärken, ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Mitochondrien-Transitpeptid codiert, und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Acyl-Carrier-Protein codiert; und c) einer Expressionskassette umfassend, in operativer Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, ein isoliertes Polynukleotid, das für ein subzelluläres Targeting-Peptid codiert, und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Acyltransferasepolypeptid codiert, umfasst.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst der erfindungsgemäße rekombinante Expressionsvektor ein isoliertes Polynukleotid mit einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 70; SEQ ID NO: 74; SEQ ID NO: 76 und SEQ ID NO: 78. Zusätzlich umfasst der erfindungsgemäße rekombinante Expressionsvektor ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 70; SEQ ID NO: 74; SEQ ID NO: 76 und SEQ ID NO: 78 codiert.
  • Der erfindungsgemäße rekombinante Expressionsvektor kann auch eine oder mehrere Regulationssequenzen umfassen, die je nach den Wirtszellen, die für die Expression verwendet werden sollen, ausgewählt wird/werden und die in operativer Verknüpfung mit dem zu exprimierenden isolierten Polypeptid ist. Im Zusammenhang bedeutet ”in operativer Verknüpfung” oder ”operativ verknüpft” in Bezug auf einen rekombinanten Expressionsvektor, dass das interessierende Polynukleotid mit der Regulationssequenz bzw. den Regulationssequenzen so verknüpft ist, dass eine Expression des Polynukleotids ermöglicht wird, wenn der Vektor in die Wirtszelle (z. B. in eine bakterielle oder pflanzliche Wirtszelle) eingeführt wird. Der Begriff „Regulationssequenz” soll Promoter, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (z. B. Polyadenylierungssignale) beinhalten.
  • Wie oben ausgeführt, werden in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung Promoter eingesetzt, die fähig sind, die Genexpression in Blättern zu verbessern. In einigen Ausführungsformen handelt es sich bei dem Promoter um einen blattspezifischen Promoter. In diesen Ausführungsformen der Erfindung kann jeder beliebige blattspezifische Promoter eingesetzt werden. Viele solche Promoter sind bekannt, zum Beispiel der USP-Promoter aus Vicia faba (SEQ ID NO: 123 oder SEQ ID NO: 124, Baeumlein et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 225, 459–67), Promoter von lichtinduzierbaren Genen, wie von der Ribulose-1.5-bisphosphatcarboxylase (rbcS-Promoter), Promoter von Genen, die für Chlorophyll-a/b-Bindungsproteine (Cab) codieren, die Rubisco-Activase, die B-Untereinheit der Chloroplasten-Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase aus A. thaliana (Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105, 357–67) und sonstige blattspezifische Promoter, wie diejenigen, die bei Aleman, I. (2001) Isolation and characterization of leaf-specific promoters from alfalfa (Medicago sativa), Masters Thesis, New Mexico State University, Los Cruces, NM, identifiziert sind, und dergleichen ein konstitutiver Promoter. Konstitutive Promoter sind unter den meisten Bedingungen aktiv. Zu Beispielen von konstitutiven Promotern, die sich für die Verwendung in diesen Ausführungsformen eignen, zählen der Petersilie-Ubiquitinpromoter aus Petroselium crispum, der in WO 2003/102198 (SEQ ID NO: 121) beschrieben ist, der CaMV-19S- und -35S-Promoter, der sX-CaMV-35S-Promoter, der Sep1-Promoter, der Reis-Actin-Promoter, der Arabidopsis-Actin-Promoter, der Mais-Ubiquitinpromoter, pEmu, der Figwort Mosaic Virus 35S-Promoter, der Smas-Promoter, der „Super-Promoter” ( US-Patent Nr. 5,955,646 ), der GRP1-8-Promoter, der Cinnamylalkoholdehydrogenase-Promoter ( US-Patent Nr. 5,683,439 ), Promoter der T-DNA von Agrobacterium, wie Mannopinsynthase-Promoter, Nopalinsynthase-Promoter und Octopinsynthase-Promoter, und der Promoter der kleinen Untereinheit der Ribulosebisphosphatcarboxylase (ssuRUBISCO) und dergleichen.
  • In anderen Ausführungsformen der Erfindung wird ein Wurzel- oder sprossspezifischer Promoter eingesetzt. So führt zum Beispiel der Super-Promoter (SEQ ID NO: 122) zu einem hohen Expressionsniveau in sowohl Wurzel als auch Sprossen (Ni et al. (1995) Plant J. 7: 661–676). Zu weiteren wurzelspezifischen Promotern zählen, jedoch ohne Einschränkung, der TobRB7-Promoter (Yamamoto et al. (1991) Plant Cell 3, 371–382), der roID-Promoter (Lesch et al. (1991) Plant Science 79, 69–76); die CaMV-35S-Domäne A (Benfey et al. (1989) Science 244, 174–181) und dergleichen.
  • Gemäß der Erfindung bezieht sich eine Chloroplastentransitsequenz auf eine Nukleotidsequenz, die für ein Chloroplastentransitpeptid codiert. Chloroplasten-Targeting-Sequenzen sind fachbekannt; dazu zählen die chloroplastidäre kleine Untereinheit der Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase (Rubisco) (de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30: 769–780; Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(5): 3335–3342); die 5-(Enolpyruvyl)shikimate-3-phosphatsynthase (EPSPS)(Archer et al. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6): 789–810); die Tryptophansynthase (Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(11): 6081–6087); Plastocyanin (Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(33): 20357–20363); die Chorismatsynthase (Schmidt et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(36): 27447–27457); Ferredoxin-NADP+Oxidoreduktase (Jansen et al. (1988) Curr. Genetics 13: 517–522) (SEQ ID NO: 13); die Nitritreduktase (Back et al. (1988) MGG 212: 20–26) und das Light Harvesting Chlorophyll a/b Bindungsprotein (LHBP) (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 14996–14999). Siehe auch Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104–126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544–17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965–968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414–1421; und Shah et al. (1986) Science 233: 478–481.
  • Wie im vorliegenden Text definiert bezieht sich eine Mitochondrientransitsequenz auf eine Nukleotidsequenz, die für eine mitochondriale Präsequenz codiert und das Protein zu den Mitochondrien dirigiert. Zu Beispielen für mitochondriale Präsequenzen zählen Gruppen bestehend aus ATPase-Untereinheiten, ATP-Synthase-Untereinheiten, Rieske-FeS-Protein, Hsp60, Malatdehydrogenase, Citratsynthase, Aconitase, Isocitratdehydrogenase, Pyruvatdehydrogenase, Malik-Enzym, Glycindecarboxylase, Serinhydroxymethyltransferase, Isovaleryl-CoA-dehydrogenase und Superoxiddismutase. Solche Transitpeptide sind fachbekannt. Siehe zum Beispiel Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104–126; Clark et al. (1989)J. Biol. Chem. 264: 17544–17550; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414–1421; Faivre-Nitschke et al. (2001) Eur. J. Biochem. 268 1332–1339 und Shah et al. (1986) Science 233: 478–481.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die in Tabelle 1 angeführten Polynukleotide in Pflanzenzellen von höheren Pflanzen (z. B. den Spermatophyten, wie Kulturpflanzen) exprimiert. Ein Polynukleotid kann auf unterschiedliche Art und Weise in eine Pflanze „eingeführt” werden, darunter Transfektion, Transformation oder Transduktion, Elektroporation, Beschuss mit der Genkanone, Agroinfektion und dergleichen. Geeignete Verfahren für die Transformation oder Transfektion von Pflanzenzellen sind zum Beispiel unter der Verwendung der Genkanone gemäß US-Patent Nr. 4,945,050 ; 5,036,006 ; 5,100,792 ; 5,302,523 ; 5,464,765 ; 5,120,657 ; 6,084,154 und dergleichen beschrieben. Stärker bevorzugt kann der erfindungsgemäße transgene Maissamen unter Verwendung der Agrobacterium-Transformation wie in US-Pat. Nr. 5,591,616 ; 5,731,179 ; 5,981,840 ; 5,990,387 ; 6,162,965 ; 6,420,630 , der US-Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 2002/0104132 und dergleichen beschrieben erzeugt werden. Die Transformation von Sojabohnen kann zum Beispiel unter Verwendung einer der Techniken durchgeführt werden, die in dem europäischen Patent Nr. EP 0424047 , dem US-Patent Nr. 5,322,783 , dem europäischen Patent Nr. EP 0397 687 , dem US-Patent Nr. 5,376,543 oder dem US-Patent Nr. 5,169,770 beschrieben werden. Ein spezifisches Beispiel für die Weizentransformation findet sich in der PCT-Anmeldung Nr. WO 93/07256. Baumwolle kann unter Verwendung der in den US-Patenten Nr. 5,004,863 ; 5,159,135 ; 5,846,797 und dergleichen beschriebenen Verfahren transformiert werden. Reis kann unter Verwendung der in den US-Patenten Nr. 4,666,844 ; 5,350,688 ; 6,153,813 ; 6,333,449 ; 6,288,312 ; 6,365,807 ; 6,329,571 und dergleichen beschriebenen Verfahren transformiert werden. Canola kann zum Beispiel unter Verwendung von Methoden, wie sie in den US-Patenten Nr. 5,188,958 , 5,463,174 ; 5,750,871 ; EP 1566443 ; WO 02/00900 und dergleichen beschrieben werden, transformiert werden. Andere Verfahren für die Transformation von Pflanzen werden zum Beispiel in den US-Patenten Nr. 5,932,782 ; 6,153,811 ; 6,140,553 ; 5,969,213 ; 6,020,539 und dergleichen beschrieben. Für die Insertion eines Transgens in eine bestimmte Pflanze kann erfindungsgemäß jegliches geeignetes Verfahren für die Transformation von Pflanzen verwendet werden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das eingeführte Polynukleotid in der Pflanzenzelle stabil aufrechterhalten werden, wenn es in ein nichtchromosomales autonomes Replikon eingebaut wird oder wenn es in die pflanzlichen Chromosomen integriert wird. Alternativ dazu kann das eingeführte Polynukleotid auf einem extrachromosomalen nichtreplizierenden Vektor vorliegen und kann transient exprimiert werden oder transient aktiv sein.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze umfassend mindestens ein Polynukleotid gemäß Tabelle 1, wobei die Expression des Polynukleotids in der Pflanze zu einem erhöhten Wachstum und/oder Ertrag der Pflanze unter normalen Bedingungen oder wasserlimitierten Bedingungen und/oder einer erhöhten Toleranz gegenüber einem Umweltstress im Vergleich zu einer Wildtypsorte der Pflanze führt, umfassend die folgenden Schritte: (a) Einführen einer oben beschriebenen Expressionskassette in eine Pflanzenzelle, und (b) ausgehend von der transformierten Pflanzenzelle Erzeugen einer transgenen Pflanze; und Selektieren von Pflanzen mit höherem Ertrag aus den regenerierten Pflanzenzellen. Bei der Pflanzenzelle kann es sich um einen Protoplasten, eine gametenproduzierende Zelle bzw. eine Zelle, die sich zu einer ganzen Pflanze regeneriert, handeln, was jedoch keine Einschränkung darstellen soll. Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „transgen” auf eine beliebige Pflanze, eine beliebige Pflanzenzelle, einen beliebigen Kallus, ein beliebiges Pflanzengewebe oder einen beliebigen Pflanzenteil, der/die/das die oben beschriebene Expressionskassette enthält. Erfindungsgemäß ist die Expressionskassette stabil in ein Chromosom oder ein stabiles extrachromosomales Element eingebaut, so dass sie an Folgegenerationen vererbt wird.
  • Die Auswirkung der genetischen Modifikation auf das Wachstum und/oder den Ertrag und/oder die Stresstoleranz der Pflanze kann dadurch beurteilt werden, dass man die modifizierte Pflanze unter normalen und/oder suboptimalen Bedingungen heranzieht und dann die Wachstumseigenschaften und/oder den Stoffwechsel der Pflanze analysiert. Solche Analysetechniken sind dem Fachmann gut bekannt; dazu zählen Trockengewicht, Feuchtgewicht, Samengewicht, Samenanzahl, Polypeptidsynthese, Kohlenhydratsynthese, Synthese, Evapotranspirationsraten, allgemeiner Pflanzen- und/oder Kulturpflanzenertrag, Blüte, Reproduktion, Samenansatz, Wurzelwachstum, Respirationsraten, Photosyntheseraten, Stoffwechselproduktzusammensetzung usw.
  • Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert, die nicht dahingehend anzusehen sind, dass sie den Erfindungsumfang auf irgendeine Weise einschränken.
  • BEISPIEL 1
  • Charakterisierung der Gene
  • YBR029C (SEQ ID NO: 1), YKL192C (SEQ ID NO: 7), YDR018C (SEQ ID NO: 15), B2341 (SEQ ID NO: 21), B0452 (SEQ ID NO: 27), YNL202W (SEQ ID NO: 35), YKL140W (SEQ ID NO: 39), SLL1023 (SEQ ID NO: 41), SLR0252 (SEQ ID NO: 43), b3803 (SEQ ID NO: 45), b3209 (SEQ ID NO: 53), b2578 (SEQ ID NO: 59), b2682 (SEQ ID NO: 61), b3285 (SEQ ID NO: 63), b1938 (SEQ ID NO: 65), SLL1894 (SEQ ID NO: 67), SLL1282 (SEQ ID NO: 5), b1636 (SEQ ID NO: 79) und SLR1779 (SEQ ID NO: 95) wurden unter Verwendung von standardmäßigen Rekombinationstechniken kloniert. Die Funktionalität von jedem Leitgen wurde dadurch vorhergesagt, dass man die Aminosäuresequenz des Gens mit anderen Genen mit bekannter Funktionalität verglich. Homologe cDNAs wurden unter Verwendung von bekannten Verfahren aus offiziellen Bibliotheken der jeweiligen Arten isoliert. Die Sequenzen wurden unter Verwendung von Bioinformatikanalysen verarbeitet und annotiert.
  • YBR029C (SEQ ID NO: 2) aus S. cerevisiae codiert für eine Phosphatidatcytidylyltransferase. Mit der DNA-Sequenz dieses Gens wurde ein Blast-Vergleich mit offiziellen Datenbanken von Canola- und Mais-cDNAs bei einem e-Wert von e-10 durchgeführt (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402). Es wurden ein Homolog aus Canola und ein Homolog aus Mais identifiziert. Die Aminosäureverwandtschaft dieser Sequenzen ist in den in 1 gezeigten Alignments angegeben.
  • YKL192C (SEQ ID NO: 8) aus S. cerevisiae codiert für ein Acyl-Carrier-Protein. Mit der DNA-Sequenz dieses Gens wurde ein Blast-Vergleich mit offiziellen Datenbanken von Pflanzen-cDNAs bei einem e-Wert von e-10 durchgeführt (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402). Es wurden jeweils ein Homolog aus Canola, Sojabohne und Sonnenblume identifiziert. Die Aminosäureverwandtschaft dieser Sequenzen ist in den in 2 gezeigten Alignments angegeben.
  • YDR018C (SEQ ID NO: 16) aus S. cerevisiae codiert für ein Acyltransferaseprotein. Mit der DNA-Sequenz dieses Gens wurde ein Blast-Vergleich mit offiziellen Datenbanken von Sojabohne- und Mais-cDNAs bei einem e-Wert von e-10 durchgeführt (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402). Es wurden ein Homolog aus Sojabohne und ein Homolog aus Mais identifiziert. Die Aminosäureverwandtschaft dieser Sequenzen ist in 3 angegeben.
  • Das B2341-Gen (SEQ ID NO: 21) aus E. coli-codiert für ein bifunktionelles Polypeptid des anaeroben Fettsäureoxidationskomplexes. Mit der DNA-Sequenz dieses Gens wurde ein Blast-Vergleich mit offiziellen Datenbanken von Mais-cDNAs bei einem e-Wert von e-10 durchgeführt (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402). Es wurden zwei Homologe aus dem Mais identifiziert. Die Aminosäureverwandtschaft dieser Sequenzen ist in 4 angegeben.
  • B0452 (SEQ ID NO: 28) aus E. coli codiert für ein Acyl-CoA-Thioesteraseprotein. Mit der DNA-Sequenz dieses Gens wurde ein Blast-Vergleich mit offiziellen Datenbanken von Pflanzen-cDNAs bei einem e-Wert von e-10 durchgeführt (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402). Es wurden zwei Homologe aus Canola und eines aus der Sojabohne identifiziert. Die Aminosäureverwandtschaft dieser Sequenzen ist in 5 angegeben.
  • YNL202W (SEQ ID NO: 36) aus S. cerevisiae codiert für ein 2,4-Dienoyl-CoA-Reduktaseprotein. Mit der DNA-Sequenz dieses Gens wurde ein Blast-Vergleich mit offiziellen Datenbanken von Pflanzen-cDNAs bei einem e-Wert von e-10 durchgeführt (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402). Es wurde ein Homolog aus der Sonnenblume identifziert. Die Aminosäureverwandtschaft dieser Sequenzen ist in 6 angegeben.
  • Das b3803-Gen aus E. coli codiert für eine Uroporphyrin-III C-Methyltransferase. Mit der Volllängenaminosäuresequenz der funktionellen Homologe von b3803 aus Tabelle 11 wurde eine Blast-Analyse gegen offizielle Datenbanken von cDNAs bei einem e-Wert von e-10 durchgeführt (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402). Es wurden ein Homolog aus Brassica napus, ein Homolog aus Glycine maxund ein Homolog aus Zea mays identifziert. Homologe cDNAs wurden unter Verwendung von bekannten Verfahren aus offiziellen Bibliotheken der jeweiligen Arten isoliert. Die Sequenzen wurden unter Verwendung von Bioinformatikanalysen verarbeitet und annotiert. Die Aminosäureverwandtschaft dieser Sequenzen ist in 7 dargestellt.
  • Das b3209-Gen aus E. coli codiert für ein Isoprenoidbiosyntheseprotein. Mit der Volllängenaminosäuresequenz der funktionellen Homologe von b3209 aus Tabelle 15 wurde eine Blast-Analyse gegen offizielle Datenbanken von cDNAs bei einem e-Wert von e-10 durchgeführt (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402). Es wurden ein Homolog aus Glycine max und ein Homolog aus Helianthus annuus identifiziert. Die Aminosäureverwandtschaft dieser Sequenzen ist in 8 dargestellt.
  • Das SLL1894-Gen (SEQ ID NO: 67) aus Synechocystis sp. PCC 6803 codiert für eine GTP-Cyclohydrase II. Mit der Volllängen-DNA-Sequenz von SLL1894 wurde eine Blast-Analyse gegen eine offizielle Datenbanken von Sojabohnen-cDNAs bei einem e-Wert von e-10 durchgeführt (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402) und es wurde ein Homolog aus der Sojabohne identifiziert. Die Aminosäureverwandtschaft dieser Sequenzen ist in 12 dargestellt.
  • Das SLL1282-Gen (SEQ ID NO: 71) aus Synechocystis sp. PCC 6803 codiert für eine Lumazinsynthase. Mit der Volllängen-DNA-Sequenz dieses Gens wurde ein Blast-Vergleich mit offiziellen Datenbanken von Sojabohnen- und Mais-cDNAs bei einem e-Wert von e-10 durchgeführt (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402). Es wurden ein Homolog aus der Sojabohne und zwei Homologe aus dem Mais identifiziert. Die Aminosäureverwandtschaft dieser Sequenzen ist in 13 dargestellt.
  • BEISPIEL 2
  • Überexpression von Leitgenen in Pflanzen
  • Jedes der in Beispiel 1 beschriebenen Gene wurde unter Verwendung von bekannten Verfahren in eine Expressionskassette hineinligiert. Für die Kontrolle der Expression der Transgene in Arabidopsis wurden vier unterschiedliche Promoter verwendet: der Petersilie-Ubiquitin-Promoter (SEQ ID NO: 121) mit der Bezeichnung „PCUbi” in den Tabellen 2 bis 26; der Super-Promoter (SEQ ID NO: 122) mit der Bezeichnung „Super” in den Tabellen 2 bis 26; der USP-Promoter aus Vicia faba (SEQ ID NO: 124) mit der Bezeichnung „USP” in den Tabellen 2 bis 26 wurde für die Expression von Genen aus Prokaryonten verwendet oder SEQ ID NO: 123 wurde für die Expression von Genen aus S. cerevisiae verwendet. Für das selektive Targeting der Polypeptide wurde das Mitochondrientransitpeptid aus einem A. thalana-Gen, das für die mitochondrielle Isovaleryl-CoA-Dehydrogenase mit der Bezeichnung „Mit” in den Tabellen 2 bis 26 codiert, SEQ ID NO: 126, wurde für die Expression von Genen aus Prokaryonten verwendet oder SEQ ID NO: 128 wurde für die Expression von Genen aus S. cerevisiae verwendet. Weiterhin wurde für das selektive Targeting von Polypeptiden an den Chloroplasten das Transitpeptid eines Spinacia oleracea-Gens, das für die Ferredoxinnitritreduktase codiert, mit der Bezeichnung „Chlor” in den Tabellen 2 bis 26; SEQ ID NO: 130, verwendet.
  • Der Arabidopsis-Ökotyp C24 wurde mit Konstrukten, die die in Beispiel 1 beschriebenen Leitgene enthielten, unter Verwendung von bekannten Verfahren transformiert. Samen der transformierten T2-Pflanzen wurde dann entsprechend dem Promoter, der die Expression vorantreibt, der Art, die das Ausgangsmaterial für das Gen bildet, und der Art des Targeting (an die Chloroplasten, die Mitochondrien und das Zytoplasma) geramscht. Die Samenramsche wurden im Primär-Screening auf Biomasse unter gut bewässerten Wachstumsbedingungen und unter wasserlimitierten Wachstumsbedingungen verwendet. Hits von Ramschen im Primär-Screening wurden selektiert, es wurde eine molekulare Analyse durchgeführt und die Samen wurden gewonnen. Die gewonnenen Samen wurden dann für die Analyse im Sekundär-Screening verwendet, wo eine größere Anzahl Individuen für jedes transgene Event analysiert wurde. Wenn Pflanzen von einem Konstrukt im Sekundär-Screening dahingehend identifiziert wurden, dass sie verglichen mit den Kontrollen eine erhöhte Biomasse aufwiesen, wurde es zum Tertiär-Screening weitergeleitet. Bei diesem Screening wurden über 100 Pflanzen von allen transgenen Events für dieses Konstrukt unter gut bewässerten Wachstumsbedingungen und unter Trockenheitswachstumsbedingungen vermessen. Die Daten von den transgenen Pflanzen wurden mit Wildtyp-Arabidopsis-Pflanzen oder mit Pflanzen, die von einem Ramsch zufällig ausgewählten transgenen Arabidopsis-Samen herangezogen wurden, unter Verwendung von statistischen Standardmethoden verglichen.
  • Pflanzen, die unter guten Bewässerungsbedingungen herangezogen wurden, wurden zweimal pro Woche bis zur Sättigung des Bodens bewässert. Mit einem im Handel erhältlichen Imaging-System wurden am 17. und 21. Tag von den transgenen Pflanzen Bilder aufgenommen. Alternativ dazu wurden Pflanzen unter wasserlimitierten Wachstumsbedingungen herangezogen, und zwar dadurch, dass man selten bis zur Sättigung des Bodens bewässerte, wodurch der Boden zwischen den Bewässerungsbehandlungen austrocknen konnte. In diesen Versuchen wurde am 0., 8. und 19. Tag nach dem Aussäen bewässert. Bilder der transgenen Pflanzen wurden am 20. und 27. Tag unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Imaging-Systems aufgenommen.
  • Zum Vergleichen der Bilder der transgenen Pflanzen und der Kontrollpflanzen, die in demselben Versuch herangezogen wurden, verwendete man eine Image-Analyse-Software. Mit den Bildern wurde die relative Größe oder Biomasse der Pflanzen als Pixel und die Farbe der Pflanzen als das Verhältnis von Dunkelgrün zu der Gesamtfläche bestimmt. Das letztgenannte Verhältnis, das als Gesundheitsindex bezeichnet wird, war ein Maß für die relative Chlorophyllmenge in den Blättern und daher das relative Ausmaß an Blattseneszenz oder Vergilbung und wurde nur am 27. Tag aufgenommen. Zwischen den transgenen Pflanzen, die die verschiedenen Leitgene enthalten, besteht aufgrund von unterschiedlichen Stellen der DNA-Insertion und anderen Faktoren, die einen Einfluss auf das Niveau oder das Muster der Genexpression ausüben, eine Variation.
  • Die Tabellen 2 bis 26 zeigen den Vergleich der Messungen der Arabidopsis-Pflanzen. Die prozentuale Veränderung bezeichnet das Maß der transgenen Pflanzen im Vergleich zu den Kontrollpflanzen als Prozentsatz der Kontrolle nichttransgener Pflanzen; der p-Wert ist die statistische Signifikanz des Unterschieds zwischen den transgenen Pflanzen und den Kontrollpflanzen auf Grundlage eines T-Test-Vergleichs von allen unabhängigen Events, wobei NS nicht signifikant auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau bedeutet. „Anz. Events” bezeichnet die Gesamtzahl der unabhängigen transgenen Events, die in dem Versuch getestet wurden; „Anz. positive Events” bezeichnet die Gesamtzahl der unabhängigen transgenen Events, die in dem Versuch größer als die Kontrolle waren; „Anz. negative Events” bezeichnet die Gesamtzahl der unabhängigen transgenen Events, die in dem Versuch kleiner als die Kontrolle waren. NS bedeutet nicht signifikant auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau.
  • A. Phosphatidatcytidylyltransferase
  • Die Phosphatidatcytidylyltransferase mit der Bezeichnung YBR029C (SEQ ID NO: 2) wurde in Arabidopsis unter Verwendung von drei Konstrukten exprimiert: in einem Konstrukt war die YBR029C-Expression von dem PCUbi-Promoter (SEQ ID NO: 121) kontrolliert und es erfolgte ein Targeting an die Chloroplasten; in einem anderen Konstrukt war die YBR029C-Expression von dem Super-Promoter (SEQ ID 25 NO: 122) kontrolliert und es erfolgte ein Targeting an die Chloroplasten; und in dem dritten Konstrukt war die YBR029C-Expression von dem USP-Promoter (SEQ ID NO: 123) kontrolliert und es erfolgte ein Targeting an die Mitochondrien. In Tabelle 2 sind die Biomassen- und Gesundheitsindexdaten dargestellt, die von den mit diesen Konstrukten transformierten und unter wasserlimitierenden Bedingungen getesteten Arabidopsis-Pflanzen erhalten wurden. Tabelle 2
    Gen Promoter Targeting Messung % Veränderung p-Wert Anz. Events Anz. positive Events Anz. negative Events
    YBRO 29C PCUbi Chlor Biomasse am 20. Tag –16,7 0,0000 6 1 5
    YBRO 29C PCUbi Chlor Biomasse am 27. Tag –17,2 0,0000 6 0 6
    YBRO 29C PCUbi Chlor Gesundheitsindex –9,5 0,0056 6 1 5
    YBRO 29C Super Chlor Biomasse am 20. Tag 8,2 0,0340 6 4 2
    YBRO 29C Super Chlor Biomasse am 27. Tag 19,4 0,0000 6 5 1
    YBRO 29C Super Chlor Gesundheitsindex 0,6 NS 6 4 2
    YBRO 29C USP Mit Biomasse am 20. Tag –10,1 0,0040 8 2 6
    YBRO 29C USP Mit Biomasse am 27. Tag –9,5 0,0034 8 2 6
    YBRO 29C USP Mit Gesundheitsindex –1,8 NS 8 2 6
  • Tabelle 2 zeigt, dass unter wasserlimitierenden Bedingungen Arabidopsis-Pflanzen, die das YBR029C (SEQ ID NO: 1)-Gen unter der Kontrolle des Super-Promoters mit Targeting des Proteinprodukts an den Chloroplasten exprimieren und herangezogen werden, signifikant größer als die Kontrollpflanzen waren. Tabelle 2 zeigt auch, dass der Großteil der unabhängigen transgenen Events mit Super-Promoter/Chloroplasten-Targeting größer als die Kontrollen waren. Tabelle 2 zeigt auch, dass Arabidopsis-Pflanzen, die unter wasserlimitierenden Bedingungen herangezogen wurden und das YBR029C-Gen unter der Kontrolle entweder des USP-Promoters mit Targeting des Proteinprodukts an die Mitochondrien oder unter der Kontrolle des PCUbi-Promoters mit Targeting des Proteinprodukts an den Chloroplasten signifikant kleiner waren als die Kontrollpflanzen, die YBR029C nicht exprimieren. Tabelle 2 zeigt auch, dass der Großteil der unabhängigen transgenen Events kleiner als die Kontrollen waren.
  • In Tabelle 3 sind die Biomasse- und Gesundheitsindexdaten angegeben, die bei den mit diesen Konstrukten transformierten und unter guten Bewässerungsbedingungen getesteten Arabidopsis-Pflanzen erhalten wurden. Tabelle 3
    Gen Promoter Targeting Messung % Veränderung p-Wert Anz. Events Anz. positive Events Anz. negative Events
    YBRO2 9C PCUbi Chlor Biomasse am 17. Tag 9,5 0,0001 6 5 1
    YBR02 9C PCUbi Chlor Biomasse am 21. Tag 5,5 0,0066 6 5 1
    YBR02 9C PCUbi Chlor Gesundheitsindex –9,6 0,0052 6 0 6
    YBRO2 9C Super Chlor Biomasse am 17. Tag 5,2 0,050 6 4 2
    YBR02 9C Super Chlor Biomasse am 21. Tag 6,7 0,0035 6 4 2
    YBR02 9C Super Chlor Gesundheitsindex –10,7 0,0012 6 0 6
    YBRO2 9C USP Chlor Biomasse am 17. Tag 6,2 0,0378 6 5 1
    YBRO2 9C USP Chlor Biomasse am 21. Tag 6,2 0,0174 6 5 1
    YBRO2 9C USP Chlor Gesundheitsindex –2,7 NS 6 2 4
    YBRO2 9C USP Mit Biomasse am 17. Tag 14,7 0,0000 8 7 1
    YBRO2 9C USP Mit Biomasse am 21. Tag 9,6 0,0000 8 8 0
    YBRO2 9C USP Mit Gesundheitsindex 1,2 NS 8 4 4
  • Tabelle 3 zeigt, dass, wenn sie unter guten Bewässerungsbedingungen herangezogen werden, Arabidopsis-Pflanzen, die YBR029C exprimieren, größer waren als die Kontrollpflanzen, die nicht YBR029C exprimieren. Der Biomasseanstieg trat mit den Promotern PCUbi, Super und Ubi auf, und die Auswirkung des Transgens wurde in den Konstrukten beobachtet, in denen bei dem YBR029C-Proteinprodukt (SEQ ID NO: 2) ein Targeting an die Mitochondrien oder den Chloroplasten erfolgte.
  • B. Acyl-Carrier-Protein
  • Das Acyl-Carrier-Protein mit der Bezeichnung YKL192C (SEQ ID NO: 8) wurde in Arabidopsis unter Verwendung eines Konstrukts, in dem die Acyl-Carrier-Proteinexpression von dem USP-Promoter (SEQ ID NO: 123) kontrolliert war und ein Targeting an die Mitochondrien erfolgte, exprimiert. In Tabelle 4 sind die Biomassen- und Gesundheitsindexdaten dargestellt, die von den mit diesen Konstrukten transformierten und unter wasserlimitierenden Bedingungen getesteten Arabidopsis-Pflanzen erhalten wurden. Tabelle 4
    Gen Promoter Targeting Messung % Veränderung p-Wert Anz. Events Anz. positive Events Anz. negative Events
    YKL19 2C USP Mit Biomasse am 20. Tag 29,8 0,0000 5 5 0
    YKL19 2C USP Mit Biomasse am 27. Tag 16,6 0,0000 5 4 1
    YKL19 2C USP Mit Gesundheitsindex 14,2 0,0000 5 4 1
  • Tabelle 4 zeigt, dass Arabidopsis-Pflanzen, die das YKL192C (SEQ ID NO: 7)-Gen unter der Kontrolle des USP-Promoters mit Targeting an die Mitochondrien exprimieren und die unterwasserlimitierenden Bedingungen herangezogen wurden, signifikant größer als die Kontrollpflanzen, die YKL192C nicht exprimierten, waren. Tabelle 4 zeigt auch, dass der Großteil der unabhängigen transgenen Events größer und gesünder als die Kontrollen war.
  • C. Acyltransferase
  • Die Acyltransferase mit der Bezeichnung YDR018C (SEQ ID NO: 16) wurde in Arabidopsis unter Verwendung von zwei verschiedenen Konstrukten exprimiert: in einem Konstrukt war die YDR018C (SEQ ID NO: 15)-Genexpression von dem Super-Promoter (SEQ ID NO: 122) kontrolliert und mit dem YDR018C-Protein erfolgte ein Targeting an den Chloroplasten, und in dem zweiten Konstrukt war die YDR018C-Expression von dem USP-Promoter kontrolliert (SEQ ID NO: 123) und es erfolgte ein Targeting an die Mitochondrien. In Tabelle 5 sind die Biomasse- und Gesundheitsindexdaten beschrieben, die von den mit diesen Konstrukten transformierten und unter wasserlimitierenden Bedingungen getesteten Arabidopsis-Pflanzen erhalten wurden. Tabelle 5
    Gen Promoter Targeting Messung % Veränderung p-Wert Anz. Events Anz. positive Events Anz. negative Events
    YDR01 8C Super Chlor Biomasse am 20. Tag 6,8 0,0486 6 5 1
    YDR01 8C Super Chlor Biomasse am 27. Tag 21,1 0,0000 6 5 1
    YDR01 8C Super Chlor Gesundheitsindex 3,0 NS 6 4 2
    YDR01 8C USP Mit Biomasse am 20. Tag 11,5 0,0240 6 4 2
    YDR01 8C USP Mit Biomasse am 27. Tag 7,1 NS 6 4 2
    YDR01 8C USP Mit Gesundheitsindex 1,7 NS 6 4 2
  • Tabelle 5 zeigt, dass Arabidopsis-Pflanzen, die YDR018C exprimieren, tendentiell signifikant größer waren, wenn sie unter wasserlimitierenden Bedingungen herangezogen wurden als die Kontrollpflanzen, die YDR018C nicht exprimierten. Tabelle zeigt auch, dass der Großteil der unabhängigen transgenen Events größer als die Kontrollen waren.
  • In Tabelle 6 sind die Biomasse- und Gesundheitsindexdaten angegeben, die bei den mit diesen Konstrukten transformierten und unter guten Bewässerungsbedingungen getesteten Arabidopsis-Pflanzen erhalten wurden. Tabelle 6
    Gen Promoter Targeting Messung % Veränderung p-Wert Anz. Events Anz. positive Events Anz. negative Events
    YDR01 8C Super Chlor Biomasse am 17. Tag –0,2 NS 6 3 3
    YDR01 8C Super Chlor Biomasse am 21. Tag 1,7 NS 6 3 3
    YDR01 8C Super Chlor Gesundheitsindex –7,2 2 0,037 5 6 0 6
    YDR01 8C USP Mit Biomasse am 17. Tag 20,9 0,0000 6 6 0
    YDR01 8C USP Mit Biomasse am 21.Tag 20,3 0,0000 6 5 1
    YDR01 8C USP Mit Gesundheitsindex 2,4 NS 6 3 3
  • Tabelle 6 zeigt, dass Arabidopsis-Pflanzen, die YDR018C unter der Kontrolle des USP-Promoters mit Targeting an die Mitochondrien exprimieren, wenn sie unter guten Bewässerungsbedingungen herangezogen wurden, größer waren als die Kontrollpflanzen, die YDR018C nicht exprimierten. Wurde jedoch das YDR018C-Gen unter der Kontrolle des Super-Promoters exprimiert und erfolgte bei dem Proteinprodukt ein Targeting an den Chloroplasten, waren die Pflanzen, wenn sie unter guten Bewässerungsbedingungen herangezogen wurden, nicht signifikant größer als Kontrollpflanzen, die YDR018C nicht exprimierten.
  • D. Bifunktionelles Polypeptid des anaeroben Fettsäureoxidationskomplexes
  • Das bifunktionelle Polypeptid des anaeroben Fettsäureoxidationskomplexes mit der Bezeichnung B2341 (SEQ ID NO: 22) wurde in Arabidopsis unter Verwendung eines Konstrukts exprimiert, in dem die B2341-Expression von dem USP-Promoter (SEQ ID NO: 124) kontrolliert wurde und mit dem Proteinprodukt ein Targeting an die Mitochondrien erfolgte. In Tabelle 7 sind die Biomassen- und Gesundheitsindexdaten dargestellt, die von den mit diesen Konstrukten transformierten und unter wasserlimitierenden Bedingungen getesteten Arabidopsis-Pflanzen erhalten wurden. Tabelle 7
    Gen Promoter Targeting Messung % Veränderung p-Wert Anz. Events Anz. positive Events Anz. negative Events
    b234 1 USP Mit Biomasse am 20. Tag 24,2 0,0000 6 5 1
    b234 1 USP Mit Biomasse am 27. Tag 15,9 0,0009 6 5 1
    b234 1 USP Mit Gesundheitsindex 10,6 0,0007 6 5 1
  • Tabelle 7 zeigt, dass Arabidopsis-Pflanzen, die das B2341-Gen (SEQ ID NO: 21) exprimierten, wenn sie unterwasserlimitierenden Bedingungen herangezogen wurden, signifikant größer waren als die Kontrollpflanzen, die B2341 nicht exprimierten. Tabelle 7 zeigt auch, dass der Großteil der unabhängigen transgenen Events größer als die Kontrollen waren.
  • In Tabelle 8 sind die Biomasse- und Gesundheitsindexdaten angegeben, die bei den mit diesen Konstrukten transformierten und unter guten Bewässerungsbedingungen getesteten Arabidopsis-Pflanzen erhalten wurden. Tabelle 8
    Gen Promoter Targeting Messung % Veränderung p-Wert Anz. Events Anz. positive Events Anz. negative Events
    b234 1 USP Mit Biomasse am 20. Tag 8,5 0,0067 6 6 0
    b234 1 USP Mit Biomasse am 27. Tag 1,6 NS 6 5 1
    b234 1 USP Mit Gesundheitsindex 14,2 0,0100 6 5 1
  • Tabelle 8 zeigt, dass der Großteil der unabhängigen transgenen Events, die B2341 exprimierten, wenn sie unter guten Bewässerungsbedingungen herangezogen wurden, größer waren als die Kontrollpflanzen, die B2341 nicht exprimierten. Tabelle 8 zeigt auch, dass die Pflanzen, die B2341 exprimierten, eine signifikant dunklere grüne Farbe als die Kontrolle aufwiesen.
  • E. Acyl-CoA-Thioesterase
  • B0452 (SEQ ID NO: 27) wurde in Arabidopsis unter der Kontrolle des USP-Promoters (SEQ ID NO: 124) exprimiert und mit dem Proteinprodukt (SEQ ID NO: 28) erfolgte ein Targeting an die Mitochondrien. In Tabelle 9 sind die Biomasse- und Gesundheitsindexdaten angegeben, die von den mit diesem Konstrukt transformierten und unter zyklischen Trockenheitsbedingungen (ZT) oder guten Bewässerungsbedingungen (GBW) getesteten Arabidopsi-Pflanzen erhalten wurden. Tabelle 9
    Art des Assays Gen Promoter Targeting Messung % Veränderung p-Wert Anz. Events positive Events negative Events
    ZT B045 2 USP Mit 20. Tag 36,56 0,0000 4 4 0
    ZT B045 2 USP Mit 27. Tag 21,03 0,0000 4 4 0
    ZT B045 2 USP Mit Gesundheitsindex 15,14 0,0002 4 4 0
    GBW B045 2 USP Mit 17. Tag 30,57 0,0000 5 5 0
    GBW 6045 2 USP Mit 21. Tag 15,39 0,0000 5 5 0
    GBW B045 2 USP Mit Gesundheitsindex 2,59 NS 5 3 2
  • Tabelle 9 zeigt, dass transgene Pflanzen, die das B0452-Gen unter der Kontrolle des USP-Promoters mit Targeting an die Mitochondrien exprimierten, sowohl unter guten Bewässerungsbedingungen als auch unter Trockenheitsbedingungen signifikant größer waren als die Kontrollpflanzen, die das B0452-Gen nicht exprimierten. Der Unterschied war in den frühen Stadien sogar noch deutlicher, was eine positive Auswirkung auf die Keimpflanzenwüchsigkeit anzeigt. In diesen Versuchen waren alle unabhängigen transgenen Events sowohl in der zyklischen Trockenheitsumwelt als auch in der gut bewässerten Umwelt größer als die Kontrollen. Der Wachstumsvorsprung der transgenen Pflanzen war unter zyklischen Trockenheitsbedingungen sogar noch stärker ausgeprägt. Die transgenen Pflanzen, die das 60452-Gen exprimierten, blieben unter zyklischen Trockenheitsbedingungen signifikant gesünder als die Wildtypkontrolle. F. 2,4-Dienoyl-CoA-Reduktase
  • YNL202W (SEQ ID NO: 35) wurde in Arabidopsis unter Verwendung von zwei Konstrukten exprimiert, wobei bei dem einen die Transkription unter der Kontrolle des USP-Promoters (SEQ ID NO: 123) stand und mit dem Proteinprodukt YNL202W 20 (SEQ ID NO: 36) ein Targeting an die Mitochondrien erfolgte, während das andere Konstrukt, in dem die transkriptionelle Expression unter der Kontrolle des PCUbi-Promoters (SEQ ID NO: 121) stand und das mit dem Proteinprodukt ein Targeting an die Plastiden erfolgte. In Tabelle 10 sind die Biomasse- und Gesundheitsindexdaten angegeben, die von den mit diesen Konstrukten transformierten und unter zyklischen Trockenheitsbedingungen (ZT) oder guten Bewässerungsbedingungen (GBW) getesteten Arabidopsis-Pflanzen erhalten wurden. Tabelle 10
    Art des Assays Gen Promoter Targeting Messung % Veränderung p-Wert Anz. Events positive Events negative Events
    ZT YNL2 02W PCUb i Chlor 20. Tag –0,77 0,8773 6 3 3
    ZT YNL2 02W PCUb i Chlor 27. Tag –13,24 0,0646 6 0 6
    ZT YNL2 02W PCUb i Chlor Gesundheitsindex –0,78 0,8045 6 3 3
    ZT YNL2 02W USP Mit 20. Tag 58,29 0,0000 6 6 0
    ZT YNL2 02W USP Mit 27. Tag 27,33 0,0000 6 6 0
    ZT YNL2 02W USP Mit Gesundheitsindex 0,36 0,9046 6 2 4
    GBW1 YNL2 02W USP Mit 17. Tag 33,64 0,0000 8 8 0
    GBW1 YNL2 02W USP Mit 21. Tag 25,52 0,0000 8 8 0
    GBW1 YNL2 02W USP Mit Gesundheitsindex 0,16 0,9592 8 5 3
    GBW2 YNL2 02W USP Mit 17. Tag 31,51 0,0000 6 6 0
    GBW2 YNL2 02W USP Mit 21. Tag 21,82 0,0000 6 6 0
    GBW2 YNL2 02W USP Mit Gesundheitsindex 12,62 0,0002 6 5 1
  • Tabelle 10 zeigt, dass transgene Pflanzen, die das YNL202W-Gen unter der Kontrolle des USP-Promoters mit Targeting an die Mitochondrien exprimierten, unter zyklischen Trockenheitsbedingungen und in zwei Versuchen (GBW1 und GBW2) unter guten. Bewässerungsbedingungen signifikant größer waren als die Kontrollpflanzen, die das YNL202W-Gen nicht exprimierten. In diesen Versuchen waren sowohl in der zyklischen Trockenheitsumwelt als auch in der gut bewässerten Umwelt alle unabhängigen transgenen Events mit Targeting an die Mitochondrien größer als die Kontrollen. Die transgenen Pflanzen, die das YNL202W-Gen unter der Kontrolle des USP-Promoters mit Targeting an die Mitochondrien exprimierten, waren in einem Versuch unter guten Bewässerungsbedingungen auch signifikant gesünder als die Kontrollpflanzen, die das YNL202W-Gen nicht exprimierten.
  • Tabelle 10 zeigt, dass die transgenen Pflanzen, die das YNL202W-Gen unter der Kontrolle des PCUbi-Promoters mit Targeting an die Plastiden exprimierten, unter zyklischen Trockenheitsbedingungen verglichen mit den Kontrollpflanzen, die das YNL202W-Gen nicht exprimierten, kleiner, jedoch nicht signifikant verschieden waren.
  • G. Sterolesterase
  • YKL140W (SEQ ID NO: 39) wurde in Arabidopsis unter Verwendung von drei verschiedenen Konstrukten exprimiert: in einem Konstrukt war die Expression unter der Kontrolle des PCUbi-Promoters (SEQ ID NO: 121) und mit dem Proteinprodukt (SEQ ID NO: 40) erfolgt ein Targeting an die Mitochondrien, die Expression in dem zweiten Konstrukt war ebenfalls unter der Kontrolle des PCUbi-Promoters, mit dem Proteinprodukt erfolgte jedoch ein Targeting an die Plastiden, und die Expression in dem dritten Konstrukt war unter der Kontrolle des USP-Promoters (SEQ ID NO: 123), wobei mit dem Proteinprodukt ein Targeting an die Plastiden erfolgte. In Tabelle 11 sind die Biomasse- und Gesundheitsindexdaten angegeben, die von den mit diesen Konstrukten transformierten und unter zyklischen Trockenheitsbedingungen oder guten Bewässerungsbedingungen getesteten Arabidopsis-Pflanzen erhalten wurden. Table 11
    Art des Assays Gen Promoter Targeting Messung % Veränderung p-Wert Anz. Events positive Events negative Events
    ZT YKL14 OW USP Mit 20. Tag 13,86 0,0003 6 6 0
    ZT YKL14 OW USP Mit 27. Tag –2,03 0,5931 6 3 3
    ZT YKL14 OW USP Mit Gesundheitsindex 5,65 0,0969 6 5 1
    ZT YKL14 OW USP Chlor 20. Tag –37,76 0,0000 5 0 5
    ZT YKL14 OW USP Chlor 27. Tag –21,06 0,0000 5 0 5
    ZT YKL14 OW USP Chlor Gesundheitsindex –10,81 0,0001 5 0 5
    GBW YKL14 OW PCUb i Chlor 17. Tag 42,97 0,0000 5 5 0
    GBW YKL14 OW PCUb i Chlor 21. Tag 26,82 0,0000 5 5 0
    GBW YKL14 OW PCUb i Chlor Gesundheitsindex –1,09 0,7119 5 2 3
  • Tabelle 11 zeigt, dass die transgenen Pflanzen, die das YKL140W-Gen unter der Kontrolle des PCUbi-Promoters mit Targeting an die Plastiden exprimierten, unter guten Bewässerungsbedingungen signifikant größer waren als die Kontrollpflanzen, die das YKL140W-Gen nicht exprimierten. In diesen Versuchen waren alle unabhängigen transgenen Events mit Targeting an die Plastiden in der zyklischen Trockenheitsumwelt größer als die Kontrollen. Die transgenen Pflanzen, die das YKL140W-Gen unter der Kontrolle des USP-Promoters mit Targeting an die Mitochondrien exprimierten, waren unter cyclischen Trockenheitsbedingungen ebenfalls signifikant größer als die Wildtypkontrollpflanzen. Tabelle 11 zeigt, dass die transgenen Pflanzen, die das YKL140W-Gen unter der Kontrolle des USP-Promoters mit Targeting an den Plastiden unter Trockenheitsbedingungen signifikant kleiner waren als die Kontrollpflanzen, die das YKL140W-Gen nicht exprimierten. Zusätzlich wiesen diese transgenen Pflanzen im Vergleich zu den Kontrollen unter wasserlimitierten Bedingungen niedrigere Gesundheitsindexwerte auf.
  • H. Succinat-CoA-Ligase
  • Das Synechocystis-Gen SLL1023 (SEQ ID NO: 41) wude in Arabidopsis unter der Kontrolle des PCUbi-Promoters (SEQ ID NO: 121) exprimiert und es erfolgte ein Targeting an die Plastiden. In Tabelle 12 sind die Biomasse- und Gesundheitsindexdaten angegeben, die von den mit diesem Konstrukt transformierten und unter zyklischen Trockenheitsbedingungen und guten Bewässerungsbedingungen getesteten Arabidopsis-Pflanzen, erhalten wurden. Tabelle 12
    Art des Assays Gen Promoter Targeting Messung % Veränderung p-Wert Anz. Events positive Events negative Events
    ZT SLL1 023 PCUbi Chlor 20. Tag 43,02 0,000 0 6 6 0
    ZT SLL1 023 PCUbi Chlor 27. Tag 37,78 0,000 0 6 6 0
    ZT SLL1 023 PCUbi Chlor Gesundheitsindex 0,61 0,835 7 6 3 3
    GBW SLL1 023 PCUbi Chlor 17. Tag 24,08 0,000 0 6 6 0
    GBW SLL1 023 PCUbi Chlor 21. Tag 16,79 0,000 0 6 6 0
    GBW SLL1 023 PCUbi Chlor Gesundheitsindex 9,33 0,003 8 6 5 1
  • Tabelle 12 zeigt, dass die transgenen Pflanzen, die das SLL1023-Gen unter der Kontrolle des PCUbi-Promoters mit Targeting an die Plastiden exprimierten, unter zyklischen Trockenheitsbedingungen und unter guten Bewässerungsbedingungen signifikant größer waren als die Kontrollpflanzen, die das SLL1023-Gen nicht exprimierten. In diesen Versuchen waren alle unabhängigen transgenen Events mit Targeting an die Plastiden sowohl unter zyklischen Trockenheitsbedingungen als auch unter guten Bewässerungsbedingungen größer als die Kontrollen Die transgenen Pflanzen, die das SLL1023-Gen unter der Kontrolle des PCUbi-Promoters mit Targeting an die Plastiden exprimierten, waren unter guten Bewässerungsbedingungen auch signifikant gesünder als die Kontrollpflanzen. Das Vorhandensein des SLL1023-Proteins in den Plastiden förderte das Pflanzenwachstum sowohl unter guten Bewässerungsbedingungen als auch unter Trockenheitsbedingungen.
  • I. Cobalt-Precorrin-6A-Reduktase
  • Das Synechocystis-Gen SLR0252 (SEQ ID NO: 43) wurde in Arabiclopsis unter der Kontrolle des PCUbi-Promoters (SEQ ID NO: 121) exprimiert. In Tabelle 13 sind die Biomasse- und Gesundheitsindexwerte angegeben, die bei den mit diesem Konstrukt transformierten und unter zyklischen Trockenheitsbedingungen getesteten Arabidopsis-Pflanzen erhalten wurden. Tabelle 13
    Art des Assays Gen Promoter Targeting Messung % Veränderung p-Wert Anz. Events positive Events negative Events
    ZT SLRO 252 PCUb i Kein Targeting 20. Tag 20,20 0,000 0 5 5 0
    ZT SLRO 252 PCUb i Kein Targeting 27. Tag 16,30 0,000 1 5 5 0
    ZT SLRO 252 PCUb i Kein Targeting Gesundheitsindex –4,07 0,007 6 5 0 5
  • Tabelle 13 zeigt, dass die transgene Pflanzen, die das SLR0252-Gen unter der Kontrolle des PCUbi-Promoters exprimierten, unter zyklischen Trockenheitsbedingungen signifikant größer waren als die Kontrollpflanzen, die das SLR0252-Gen nicht exprimierten. In diesen Versuchen waren alle unabhängigen transgenen Events in der zyklischen Trockenheitsumwelt größer als die Kontrollen. Die Beobachtung, dass die transgenen Pflanzen unter zyklischen Trockenheitsbedingungen größer als die Kontrollen waren, ist ein Beweis dafür, dass es das Vorhandensein des SLR0252-Proteins im Zytoplasma den transgenen Pflanzen ermöglichte, unter wasserlimitierten Bedingungen besser zu wachsen.
  • J. Uroporphyrin-III-C-Methyltransferase
  • Das E, coli-Gen mit der Bezeichnung b3803 (SEQ ID NO: 45), das für eine Uroporphyrin-III-C-Methyltransferase codiert, wurde in Arabidopsis unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Konstrukten exprimiert: Konstrukten, die von dem USP-Promoter (SEQ ID NO: 124) kontrolliert wurden, und Konstrukten, die von dem Super-Promoter (SEQ ID NO: 122) kontrolliert wurden. In Tabelle 14 sind die Biomassewerte angegeben, die bei Arabidopsis-Pflanzen, die mit diesen Konstrukten transformiert wurden und unter guten Bewässerungsbedingungen getestet wurden, erhalten wurden. Tabelle 14
    Gen Promoter Messung Kontrolltyp % Veränderung p-Wert Anz. Events Anz. positive Events Anz. negative Events
    b3803 USP Biomasse am 20. Tag WT 15,31 0,0000 6 6 0
    b3803 Super Biomasse am 20. Tag WT –1,87 0,5346 6 3 3
    b3803 Super Biomasse am 27. Tag WT –1,25 0,6151 6 3 3
    b3803 USP Biomasse am 27. Tag WT 14,86 0,0000 6 6 0
    b3803 Super Biomasse am 20. Tag Super-Ramsch 8,89 0,0139 6 5 1
    b3803 Super Biomasse am 27. Tag Super-Ramsch 2,22 0,4364 6 3 3
  • Tabelle 14 zeigt, dass Arabidopsis-Pflanzen, die b3803 unter der Kontrolle des USP-Promoters exprimieren und die unter guten Bewässerungsbedingungen herangezogen wurden, signifikant größer als die Kontrollpflanzen waren, die b3803 nicht exprimierten. Aus Tabelle 14 geht weiterhin hervor, dass die meisten transgenen Ereignisse größer waren als die Kontrollen.
  • K. Isoprenoidbiosyntheseprotein
  • Das Gen mit der Bezeichnung b3209 (SEQ ID NO: 53), das für ein Isoprenoidbiosyntheseprotein codiert, wurde in Arabidopsis unter Verwendung eines Konstrukts, das von dem Super-Promoter (SEQ ID NO: 122) kontrolliert wird, exprimiert.
  • In Tabelle 15 sind die Biomassewerte angegeben, die bei Arabidopsis-Pflanzen, die mit diesen Konstrukten transformiert wurden und unter guten Bewässerungsbedingungen getestet wurden, erhalten wurden. Tabelle 15
    Gen Promoter Messung Kontrolltyp % Veränderung p-Wert Anz. Events Anz. positive Events Anz. negative Events
    b320 9 Super Biomasse am 20. Tag WT 17,71 0,0000 7 7 0
    b320 9 Super Biomasse am 27. Tag WT 14,47 0,0000 7 7 0
    b320 9 Super Biomasse am 20. Tag Super-Ramsch 29,46 0,0000 7 7 0
    b320 9 Super Biomasse am 27. Tag Super-Ramsch 22,10 0,0000 7 7 0
  • Tabelle 15 zeigt, dass Arabidopsis Pflanzen, die b3209 unter der Kontrolle des Super-Promoters exprimieren und die unter guten Bewässerungsbedingungen herangezogen wurden, wesentlich größer als die Kontrollpflanzen, die b3209 nicht exprimierten, waren. Tabelle 15 zeigt auch, dass der Großteil der unabhängigen transgenen Events größer als die Kontrollen war.
  • L. Translokator des LysE-Typs
  • Das E. coli-Gen mit der Bezeichnung b2578 (SEQ ID NO: 59), das für einen Translokator des LysE-Typs codiert, wurde in Arabidopsis unter Verwendung eines Konstrukts, das von dem Super-Promoter (SEQ ID NO: 122) kontrolliert wird, exprimiert. In Tabelle 16 sind Biomasse- und Gesundheitsindexdaten angegeben, die bei Arabidopsis-Pflanzen, die mit diesen Konstrukten transformiert wurden und unter guten Bewässerungsbedingungen getestet wurden, erhalten wurden. Tabelle 16
    Gen Promoter Messung Kontrolltyp % Veränderung p-Wert Anz. Events Anz. positive Events Anz. negative Events
    b2578 Super Gesundheitsindex WT –6,74 0,0221 7 1 6
    b2578 Super Biomasse am 20. Tag WT 7,66 0,0352 7 5 2
    b2578 Super Biomasse am 27. Tag WT 8,22 0,0061 7 6 1
    b2578 Super Gesundheitsindex Super-Ramsch 8,17 0,0200 7 6 1
    b2578 Super Biomasse am 20. Tag Super-Ramsch 18,41 0,0000 7 6 1
    b2578 Super Biomasse am 27. Tag Super-Ramsch 15,44 0,0000 7 6 1
  • Tabelle 16 zeigt, dass Arabidopsis-Pflanzen, die b2578 exprimieren und die unter guten Bewässerungsbedingungen herangezogen wurden, signifikant größer waren als die Kontrollpflanzen, die b2578 nicht exprimierten. Tabelle 16 zeigt auch, dass der Großteil der unabhängigen transgenen Events größer als die Kontrollen war.
  • M. Verzweigtkettige-Aminosäure-Transporter
  • Das Gen mit der Bezeichnung b2682 (SEQ ID NO: 61), das für einen verzweigtkettige-Aminosäure-Transporter codiert, wurde in Arabidopsis unter Verwendung eines Konstrukts, das von dem Super-Promoter (SEQ ID NO: 122) kontrolliert wird, exprimiert. In Tabelle 17 sind Biomasse- und Gesundheitsindexdaten angegeben, die bei Arabidopsis-Pflanzen, die mit diesen Konstrukten transformiert wurden und unter guten Bewässerungsbedingungen getestet wurden, erhalten wurden. Tabelle 17
    Gen Promoter Messung Kontrolltyp % Veränderung p-Wert Anz. Events Anz. positive Events Anz. negative Events
    b2682 Super Gesundheitsindex WT –0,95 0,7523 7 3 4
    b2682 Super Biomasse am 20. Tag WT 16,28 0,0000 7 7 0
    b2682 Super Biomasse am 27. Tag WT 7,49 0,0073 7 7 0
    b2682 Super Gesundheitsindex Super-Ramsch 14,89 0,0000 7 6 1
    b2682 Super Biomasse am 20. Tag Super-Ramsch 27,89 0,0000 7 7 0
    b2682 Super Biomasse am 27. Tag Super-Ramsch 14,66 0,0000 7 7 0
  • Tabelle 17 zeigt, dass Arabidopsis-Pflanzen, die b2682 unter der Kontrolle des Super-Promoters exprimieren und die unter guten Bewässerungsbedingungen herangezogen wurden, wesentlich größer als die Kontrollpflanzen, die b2682 nicht exprimierten, waren. Tabelle 17 zeigt auch, dass der Großteil der unabhängigen transgenen Events größer als die Kontrollen war.
  • N. DNA-Bindungsprotein
  • Das Gen mit der Bezeichnung b3285 (SEQ ID NO: 63), das für ein DNA-Bindungsprotein codiert, wurde in Arabidopsis unter Verwendung eines Konstrukts, das von dem Super-Promoter (SEQ ID NO: 122) kontrolliert wird, exprimiert. In Tabelle 18 sind Biomasse- und Gesundheitsindexdaten angegeben, die bei Arabidopsis-Pflanzen, die mit diesen Konstrukten transformiert wurden und unter guten Bewässerungsbedingungen getestet wurden, erhalten wurden. Tabelle 18
    Gen Promoter Messung Kontrolltyp % Veränderung p-Wert Anz. Events Anz. positive Events Anz. negative Events
    b3285 Super Gesundheitsindex WT –6,46 0,0351 7 2 5
    b3285 Super Biomasse am 20. Tag WT 16,84 0,0000 7 6 1
    b3285 Super Biomasse am 27. Tag WT 14,14 0,0000 7 7 0
    b3285 Super Gesundheitsindex Super-Ramsch 8,49 0,0200 7 5 2
    b3285 Super Biomasse am 20. Tag Super-Ramsch 28,51 0,0000 7 7 0
    b3285 Super Biomasse am 27. Tag Super-Ramsch 21,75 0,0000 7 7 0
  • Tabelle 18 zeigt, dass Arabidopsis-Pflanzen, die b3285 unter der Kontrolle des Super-Promoters exprimieren und die unter guten Bewässerungsbedingungen herangezogen wurden, signifikant größer waren als die Kontrollpflanzen, die b3285 nicht exprimierten. Tabelle 18 zeigt auch, dass der Großteil der unabhängigen transgenen Events größer als die Kontrollen war.
  • O. YscJ/FliF-Protein
  • Das Gen mit der Bezeichnung b1938 (SEQ ID NO: 65), das für ein YscJ/FliF-Protein codiert, wurde in Arabidopsis unter Verwendung eines Konstrukts, das von dem Super-Promoter (SEQ ID NO: 122) kontrolliert war, exprimiert. In Tabelle 19 sind Biomasse- und Gesundheitsindexdaten angegeben, die bei Arabidopsis-Pflanzen, die mit diesen Konstrukten transformiert wurden und unter guten Bewässerungsbedingungen getestet wurden, erhalten wurden. Tabelle 19
    Gen Promoter Messung Kontrolltyp % Veränderung p-Wert Anz. Events Anz. positive Events Anz. negative Events
    b1938 Super Biomasse am 20. Tag WT 5,64 0,1074 7 5 2
    b1938 Super Biomasse am 27. Tag WT 7,41 0,0123 7 5 2
    b1938 Super Biomasse am 20. Tag Super-Ramsch 16,18 0,0000 7 6 1
    b1938 Super Biomasse am 27. Tag Super-Ramsch 14,57 0,0000 7 5 2
  • Tabelle 19 zeigt, dass Arabidopsis-Pflanzen, die b1938 unter der Kontrolle des Super-Promoters exprimieren und die unter guten Bewässerungsbedingungen herangezogen wurden, wesentlich größer als die Kontrollpflanzen, die b1938 nicht exprimierten, waren. Tabelle 19 zeigt auch, dass der Großteil der unabhängigen transgenen Events größer als die Kontrollen war.
  • P. Riboflavinbiosynthesegene
  • Das Synechocystis-Gen mit der Bezeichnung SLL1894 (SEQ ID NO: 67), das für die GTP-Cyclohydrolase II codiert, wurde in Arabidopsis unter Verwendung von drei unterschiedlichen Konstrukten, die von dem Petersilie-Ubiquitin-Promoter (SEQ ID NO: 121) kontrolliert waren, exprimiert: Konstrukte ohne subzelluläres Targeting, Konstrukte mit Targeting an den Chloroplasten und Konstrukte mit Targeting an die Mitochondrien. In Tabelle 20 sind Biomasse- und Gesundheitsindexdaten angegeben, die von Arabidopsis-Pflanzen, die mit SLL1894 unter der Kontrolle des Petersilie-Ubiquitin-Promoters mit bzw. ohne subzelluläres Targeting transformiert worden waren und unter wasserlimitierten Bedingungen getestet worden waren, erhalten wurden. Tabelle 20
    Gen Promoter Targeting Messung % Veränderung p-Wert Anz. Events Anz. positive Events Anz. negative Events
    sll189 4 PCUbi Kein Targeting Biomasse am 20. Tag 12,2 0,0016 7 6 1
    sll189 4 PCUbi Kein Targeting Biomasse am 27. Tag 7,8 0,0499 7 5 2
    sll189 4 PCUbi Kein Targeting Gesundheitsindex 9,4 0,0092 7 5 2
    sll189 4 PCUbi Mito Biomasse am 20. Tag –2,1 NS 6 3 3
    sll189 4 PCUbi Mito Biomasse am 27. Tag –21,8 0,0002 6 0 6
    sll189 4 PCUbi Mito Gesundheitsindex 2,5 NS 6 5 1
    sll189 4 PCUbi Chlor Biomasse am 20. Tag –1,3 NS 6 3 3
    sll189 4 PCUbi Chlor Biomasse am 27. Tag –0,9 NS 6 4 2
    sll189 4 PCUbi Chlor Gesundheitsindex 7,1 0,0327 6 5 1
  • Transgene Pflanzen, die das SLL1894-Gen ohne subzelluläres Targeting exprimierten, waren unter wasserlimitierten Bedingungen signifikant größer als die Kontrollpflanzen, die das SLL1894-Gen nicht exprimierten. Zusätzlich wiesen die trangenen Pflanzen, wie aus dem gesteigerten Gesundheitsindex hervorgeht, unter wasserlimitierten Bedingungen eine dunklere grüne Farbe als die Kontrollen auf. In diesen Versuchen war der Großteil der unabhängigen transgenen Events in der wasserlimitierten Umwelt größer als die Kontrollen.
  • Die transgenen Pflanzen, die das SLL1894-Gen ohne subzelluläres Targeting an die Mitochondrien exprimierten, waren unter wasserlimitierten Bedingungen wesentlich kleiner als die Kontrollpflanzen, die das SLL1894-Gen nicht exprimierten. Die transgenen Pflanzen, die das SLL1894-Gen mit subzellulärem Targeting an den Plastiden exprimierten, wiesen unter wasserlimitierten Bedingungen eine ähnliche Größe auf wie die Kontrollpflanzen, die das SLL1894-Gen nicht exprimierten, wiesen jedoch einen höheren Gesundheitsindex auf.
  • Das Synechocystis-Gen mit der Bezeichnung Gen SLL1282 (SEQ ID NO: 71), das für die Lumazinsynthase codiert, wurde in Arabidopsis unter Verwendung eines Konstrukts, das von dem Petersilie-Ubiquitin-Promoter (SEQ ID NO: 121) ohne subzelluläres Targeting kontrolliert wurde, exprimiert. In Tabelle 21 sind Biomasse- und Gesundheitsindexdaten angegeben, die bei Arabidopsis-Pflanzen, die mit diesem Konstrukt transformiert wurden und unter guten Bewässerungsbedingungen getestet wurden, erhalten wurden. Tabelle 21
    Gen Promoter Targeting Messung % Veränderung p-Wert Anz. Events Anz. positive Events Anz. negative Events
    sll128 2 PCUbi Kein Targeting Biomasse am 17. Tag 2,2 NS 6 3 3
    sll128 2 PCUbi Kein Targeting Biomasse am 21. Tag –0,6 NS 6 2 4
    sll128 2 PCUbi Kein Targeting Gesundheitsindex –1,5 NS 6 3 3
  • Das Wachstum der Arabidopsis-Pflanzen, die das SLL1282-Gen unter der Kontrolle des PcUbi-Promoters ohne subzelluläres Targeting exprimierten, war ähnlich wie bei den Kontrollpflanzen unter guten Bewässerungsbedingungen.
  • In Tabelle 22 sind die Biomasse- und Gesundheitsindexdaten angegeben, die von Arabidopsis-Pflanzen, die mit SLL1282 unter der Kontrolle des Petersilie-Ubiquitin-Promoters mit bzw. ohne subzelluläres Targeting transformiert worden waren und unter wasserlimitierten Bedingungen getestet worden waren, erhalten wurden. Tabelle 22
    Gen Promoter Targeting Messung % Veränderung p-Wert Anz. Events Anz. positive Events Anz. negative Events
    sll128 2 PCUbi Kein Targeting Biomasse am 20. Tag 27,5 0,0000 6 6 0
    sll128 2 PCUbi Kein Targeting Biomasse am 27. Tag 34,5 0,0000 6 6 0
    sll128 2 PCUbi Kein Targeting Gesundheitsindex 9,5 0,0003 6 6 0
    sll128 2 PCUbi Mito Biomasse am 20. Tag 8,7 0,0166 7 4 3
    sll128 2 PCUbi Mito Biomasse am 27. Tag 10,7 0,0029 7 5 2
    sll128 2 PCUbi Mito Gesundheitsindex –3,1 NS 7 3 4
    sll128 2 PCUbi Chlor Biomasse am 20. Tag –16,9 0,0000 6 1 5
    sll128 2 PCUbi Chlor Biomasse am 27. Tag –4,6 NS 6 1 5
    sll128 2 PCUbi Chlor Gesundheitsindex –6,8 0,0044 6 1 5
  • Arabidopsis-Pflanzen, die unter wasserlimitierten Bedingungen herangezogen wurden, waren, wenn das Protein keine subzelluläre Targetingsequenz enthielt, zu zwei Messzeitpunkten signifikant größer als die Kontrollpflanzen, die das SLL1282-Gen nicht exprimierten. War eine Mitochondrien-Targeting-Sequenz vorhanden, so war das Gen weniger wirksam, stellte jedoch verglichen mit der Kontrolle eine gewisse Verbesserung dar. Das Targeting des Proteins an den Plastiden führte zu reduziertem Wachstum. In diesen Versuchen waren alle unabhängigen transgenen Events ohne subzelluläres Targeting in der wasserlimitierten Umweltgrößer als die Kontrollen.
  • Q. Vitamin-B6-Biosynthesegene
  • Das E. coli-Gen mit der Bezeichnung b1636 (SEQ ID NO: 79), das für die Pyridoxalkinase PdxY codiert, wurde in Arabidopsis unter Verwendung eines Konstrukts, das von dem Super-Promoter (SEQ ID NO: 122) mit Targeting an den Chloroplasten kontrolliert wurde, exprimiert. In Tabelle 23 sind Biomasse- und Gesundheitsindexdaten angegeben, die bei Arabidopsis-Pflanzen, die mit diesen Konstrukten transformiert wurden und unter guten Bewässerungsbedingungen getestet wurden, erhalten wurden. Tabelle 23
    Gen Promoter Targeting Messung % Veränderung p-Wert Anz. Events Anz. positive Events Anz. negative Events
    b1636 Super Chlor Biomasse am 17. Tag 10,7 0,0001 6 5 1
    b1636 Super Chlor Biomasse am 21. Tag 10,0 0,0000 6 5 1
    b1636 Super Chlor Gesundheitsindex –10,7 0,0009 6 1 5
  • Arabidopsis-Pflanzen, die unter guten Bewässerungsbedingungen herangezogen wurden, waren zu zwei Messzeitpunkten signifikant größer als die Kontrollpflanzen, die das b1636-Gen nicht exprimierten. In diesen Versuchen war der Großteil der unabhängigen transgenen Events in der Umwelt mit guter Bewässerung größer als die Kontrollen.
  • In Tabelle 24 sind Biomasse- und Gesundheitsindexdaten angegeben, die bei Arabidopsis-Pflanzen, die mit b1636 unter der Kontrolle des Super-Promoters mit Targeting an den Chloroplasten transformiert wurden und unter wasserlimitierten Bedingungen getestet wurden, erhalten wurden. Tabelle 24
    Gen Promoter Targeting Messung % Veränderung p-Wert Anz. Events Anz. positive Events Anz. negative Events
    b1636 Super Chlor Biomasse am 20. Tag 8,9 0,0243 6 4 2
    b1636 Super Chlor Biomasse am 27. Tag 21,9 0,0000 6 3 3
    b1636 Super Chlor Gesundheitsindex 1,6 NS 6 4 2
  • Arabidopsis-Pflanzen, die unter wasserlimitierten Bedingungen herangezogen wurden, waren zu zwei Messzeitpunkten signifikant größer als die Kontrollpflanzen, die das b1636-Gen nicht exprimierten. In diesen Versuchen waren drei oder vier der sechs unabhängigen transgenen Events in der wasserlimitierten Umwelt größer als die Kontrollen.
  • Das Synechocystis-Gen mit der Bezeichnung SLR1779 (SEQ ID NO: 95), das für das Pyridoxalphosphatbiosyntheseprotein PdxJ codiert, wurde in Arabidopsis unter Verwendung von drei verschiedenen Konstrukten, die von dem Petersilie-Ubiquitin-Promoter (SEQ ID NO: 121) kontrolliert waren, exprimiert: Konstrukte ohne subzelluläres Targeting, Konstrukte mit Targeting an den Chloropiasten und Konstrukte mit Targeting an die Mitochondrien. In Tabelle 25 sind Biomasse- und Gesundheitsindexdaten angegeben, die bei Arabidopsis-Pflanzen, die mit diesen Konstrukten transformiert wurden und unter guten Bewässerungsbedingungen getestet wurden, erhalten wurden. Tabelle 25
    Gen Promoter Targeting Messung % Veränderung p-Wert Anz. Events Anz. positive Events Anz. negative Events
    slr17 79 PCUbi Kein Targeting Biomasse am 17. Tag 23,8 0,0000 8 8 0
    slr17 79 PCUbi Kein Targeting Biomasse am 21. Tag 20,6 0,0000 8 8 0
    slr17 79 PCUbi Kein Targeting Gesundheitsindex –1,1 NS 8 4 4
    slr17 79 PCUbi Mito Biomasse am 17. Tag 18,8 0,0000 6 6 0
    slr17 79 PCUbi Mito Biomasse am 21. Tag 7,6 0,0008 6 6 0
    slr17 79 PCUbi Mito Gesundheitsindex 8,7 0,0104 6 6 0
    slr17 79 PCUbi Chlor Biomasse am 17. Tag 27,6 0,0000 6 6 0
    slr17 79 PCUbi Chlor Biomasse am 21. Tag 15,1 0,0000 6 6 0
    slr17 79 PCUbi Chlor Gesundheitsindex –1,0 NS 6 3 3
  • In Tabelle 26 sind die Biomasse- und Gesundheitsindexdaten der Arabidopsis-Pflanzen, die mit dem SLR1779-Gen unter der Kontrolle des Petersilie-Ubiquitin-Promoters mit subzellulärem Targeting transformiert worden waren und die unter wasserlimitierten Bedingungen geprüft wurden, angegeben. Tabelle 26
    Gen Promoter Targeting Messung % Veränderung p-Wert Anz. Events Anz. positive Events Anz. negative Events
    slr177 9 PCUbi Mito Biomasse am 20. Tag –6,5 0,0058 6 4 2
    slr177 9 PCUbi Mito Biomasse am 27. Tag –4,7 0,0302 6 3 3
    slr177 9 PCUbi Mito Gesundheitsindex –0,4 NS 6 3 3
    slr177 9 PCUbi Chlor Biomasse am 20. Tag 16,6 0,0000 6 5 1
    slr177 9 PCUbi Chlor Biomasse am 27. Tag 8,5 0,0002 6 4 2
    slr177 9 PCUbi Chlor Gesundheitsindex 13,2 0,0000 6 5 1
  • Die transgenen Pflanzen, die das SLR1779-Gen exprimierten, waren unter guten Bewässerungsbedingungen größer als die Kontrollpflanzen, die das SLR1779-Gen nicht exprimierten. Dieser Effekt wurde bei allen drei Konstrukten ohne subzelluläres Targeting bzw. mit subzellulärem Targeting entweder an die Mitochondrien oder an den Plastiden beobachtet.
  • Die transgenen Pflanzen, die das SLR1779-Gen mit subzellulärem Targeting an den Plastiden exprimierten, waren unter wasserlimitierten Bedingungen signifikant größer als die Kontrollpflanzen, die das SLR1779-Gen nicht exprimierten.
  • Weiterhin wiesen die transgenen Pflanzen, wie aus dem erhöhten Gesundheitsindex hervorgeht, unter wasserlimitierten Bedingungen eine dunklere grüne Farbe auf als die Kontrollen. In diesen Versuchen war der Großteil der unabhängigen transgenen Events in der wasserlimitierten Umwelt größer als die Kontrollen.
  • Die transgenen Pflanzen, die das SLR1779-Gen mit subzellulärem Targeting an die Mitochondrien exprimierten, waren unter wasserlimitierten Bedingungen signifikant kleiner als die Kontrollpflanzen, die das SLR1779-Gen nicht exprimierten.
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • Es werden Polynukleotide beschrieben, die fähig sind, den Ertrag einer Pflanze, die dahingehend transformiert wurde, dass sie solche Polynukleotide enthält, zu erhöhen. Ebenfalls bereitgestellt werden Verfahren für die Verwendung von solchen Polynukleotiden sowie transgene Pflanzen und Agrarprodukte, darunter Samen, die solche Polynukleotide als Transgene enthalten.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Claims (12)

  1. Transgene Pflanze, die mit einer Expressionskassette umfassend in operativer Verknüpfung a) ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Expression in Wurzeln und Sprossen zu verstärken; b) ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Plastidentransitpeptid codiert; und c) ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Phosphatidatcytidylyltransferasepolypeptid codiert, transformiert ist; wobei die tansgene Pflanze einen erhöhten Ertrag verglichen mit einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, aufweist.
  2. Transgene Pflanze nach Anspruch 1, wobei das Phosphatidatcytidylyltransferasepolypeptid eine CTP_transf_1-Signatursequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 63 bis 393 gemäß SEQ ID NO.: 2, den Aminosäuren 58 bis 373 gemäß SEQ ID NO.: 4 und den Aminosäuren 116 bis 447 gemäß SEQ ID NO.: 6 umfasst.
  3. Transgene Pflanze nach Anspruch 2, wobei das Phosphatidatcytidylyltransferasepolypeptid die Aminosäuren 1 bis 457 gemäß SEQ ID NO.: 2, die Aminosäuren 1 bis 373 gemäß SEQ ID NO.: 4 oder die Aminosäuren 1 bis 490 gemäß SEQ ID NO.: 6 umfasst.
  4. Transgene Pflanze nach Anspruch 1, die weiterhin als eine Art ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mais, Weizen, Reis, Sojabohne, Baumwolle, Raps und Canola definiert ist.
  5. Samen, der für ein Transgen umfassend in operativer Verknüpfung a) ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Expression in Wurzeln und Sprossen zu verstärken; b) ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Plastidentransitpeptid codiert; und c) ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Phosphatidatcytidylyltransferasepolypeptid codiert, reinerbig ist, wobei eine transgene Pflanze, die aus diesem Samen herangezogen wird, einen erhöhten Ertrag verglichen mit einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, aufweist.
  6. Samen nach Anspruch 5, wobei das Phosphatidatcytidylyltransferasepolypeptid eine CTP_transf_1-Signatursequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 63 bis 393 gemäß SEQ ID NO.: 2, den Aminosäuren 58 bis 373 gemäß SEQ ID NO.: 4 und den Aminosäuren 116 bis 447 gemäß SEQ ID NO.: 6 umfasst.
  7. Samen nach Anspruch 6, wobei das Phosphatidatcytidylyltransferasepolypeptid die Aminosäuren 1 bis 457 gemäß SEQ ID NO.: 2, die Aminosäuren 1 bis 373 gemäß SEQ ID NO.: 4 oder die Aminosäuren 1 bis 490 gemäß SEQ ID NO.: 6 umfasst.
  8. Samen nach Anspruch 5, der weiterhin als eine Art ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mais, Weizen, Reis, Sojabohne, Baumwolle, Raps und Canola definiert ist.
  9. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einem erhöhten Ertrag verglichen mit einer Wildtyppflanze derselben Sorte, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor umfassend in operativer Verknüpfung i) ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert, der fähig ist, die Expression in Wurzeln und Sprossen zu verstärken; ii) ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Plastidentransitpeptid codiert; und iii) ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Phosphatidatcytidylyltransferasepolypeptid codiert, b) Regenerieren von transgenen Pflanzen aus der transformierten Pflanzenzelle; und c) Selektieren von Pflanzen mit höherem Ertrag aus den regenerierten transgenen Pflanzen.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Phosphatidatcytidylyltransferasepolypeptid eine CTP_transf_1-Signatursequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 63 bis 393 gemäß SEQ ID NO.: 2, den Aminosäuren 58 bis 373 gemäß SEQ ID NO.: 4 und den Aminosäuren 116 bis 447 gemäß SEQ ID NO.: 6 umfasst.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Phosphatidatcytidylyltransferasepolypeptid die Aminosäuren 1 bis 457 gemäß SEQ ID NO.: 2, die Aminosäuren 1 bis 373 gemäß SEQ ID NO.: 4 oder die Aminosäuren 1 bis 490 gemäß SEQ ID NO.: 6 umfasst.
  12. Verwendung eines Polynukleotids, das für ein Volllängen-Phosphatidatcytidylyltransferasepolypeptid codiert, oder einer Expressionskassette oder eines Expressionsvektors, umfassend das Polynukleotid, oder einer Wirtszelle, die mit dem Vektor umfassend die Expressionskassette transformiert ist, oder einer Wirtszelle umfassend das Polynukleotid zum Erhöhen des Ertrags einer Pflanze verglichen mit einer Wildtyppflanze derselben Sorte oder für die Herstellung einer Pflanze mit einem erhöhten Ertrag verglichen mit einer Wildtyppflanze derselben Sorte.
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