EP1038012A2 - Verfahren zur herstellung transgener pflanzen mit veränderter 5-aminolävulinsäure-biosynthese und verfahren zur identifizierung von effektoren der 5-aminolävulinsäure-synthese - Google Patents

Verfahren zur herstellung transgener pflanzen mit veränderter 5-aminolävulinsäure-biosynthese und verfahren zur identifizierung von effektoren der 5-aminolävulinsäure-synthese

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EP1038012A2
EP1038012A2 EP98964495A EP98964495A EP1038012A2 EP 1038012 A2 EP1038012 A2 EP 1038012A2 EP 98964495 A EP98964495 A EP 98964495A EP 98964495 A EP98964495 A EP 98964495A EP 1038012 A2 EP1038012 A2 EP 1038012A2
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EP
European Patent Office
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alas
plant
transgenic
plants
protein
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP98964495A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Frank Schmidt
Günter Donn
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Bayer CropScience AG
Original Assignee
Aventis CropScience GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Aventis CropScience GmbH filed Critical Aventis CropScience GmbH
Publication of EP1038012A2 publication Critical patent/EP1038012A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
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    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)

Definitions

  • the invention relates to processes for the production of transgenic plant cells and plants with modified 5-aminolevulinic acid biosynthesis, the use of nucleic acid molecules coding for a protein with the function of a 5-aminolevulinic acid synthase (ALAS) for the production of transgenic plant cells and plants, and processes for identifying effectors of the and the use of effectors of 5-aminolevulinic acid biosynthesis, in particular the use of herbicidally active inhibitors of plant 5-aminolevulinic acid biosynthesis in plant crops, preferably in transgenic plant crops.
  • UAS 5-aminolevulinic acid synthase
  • herbicides to control undesirable plant growth on agricultural crop areas is widespread in modern agriculture. Despite the use of herbicides, it is not always possible to control weeds and harmful plants efficiently, since highly effective herbicides with a broad spectrum of activity often have an intolerance to useful plants or the emergence of resistance phenomena can also be observed.
  • Herbicide tolerance can be created by modifying the plant enzyme which is inhibited by the selected herbicide so that it is less sensitive to the herbicidal active ingredient.
  • WO 95/3459 describes plants which express the genes of variants of the protoporphyrinogen oxidase and thereby an increased tolerance to herbicidal diphenyl ether and other plant inhibitors Have protoporphyrinogen oxidase.
  • Herbicide tolerance was also achieved by introducing enzymes by genetic engineering into the metabolism of crop plants which can deactivate the applied herbicidal active ingredient (e.g. EP-A-0 242 236; EP-A-0 343 100).
  • enzymes by genetic engineering into the metabolism of crop plants which can deactivate the applied herbicidal active ingredient (e.g. EP-A-0 242 236; EP-A-0 343 100).
  • ALA 5-aminolevulinic acid
  • the C5 metabolic pathway (C5 pathway) consists of three reaction steps, catalyzed by the enzymes glutamyl-tRNA synthetase (EC 6.1.1.17), glutamyl-tRNA reductase (EC 1.2.1.-.) And glutamate-1-semialdehyde aminotransferase ( GSAAT, EC 5.4.3.8.) And is localized in plants in the plastids.
  • the GSAAT was isolated from various organisms and the structural genes of the enzyme were cloned, e.g. B. from the plants Arabidopsis thaliana, tobacco, barley and soybean.
  • the vegetable GSAAT can be produced recombinantly by heterologous expression of its cDNA (Berry-Lowe et al. (1992) Plant Physiol. 99: 1597-1603).
  • GSAAT is inhibited by 3-amino-2,3-dihydrobenzoic acid.
  • the treated plants can no longer synthesize ALA and therefore no longer the porphyrin compounds chlorophyll, heme and siroheme (Beale (1990) Plant Physiology 93: 1273-1279).
  • Such plants develop strong chlorotic tissue, which is destroyed in the light.
  • An alternative biosynthetic pathway for the production of ALA exists in animals, fungi, yeasts and the purple bacteria of the alpha group, e.g. B. Rhodobacter sphaeroides or Rhodobacter capsulatus.
  • the ALAS has been isolated from a variety of organisms.
  • the structural gene of the ALAS has also been isolated from, among others, Saccharomyces cerevisiae, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, humans and mice.
  • the task was to provide a practicable resistance principle against inhibitors of plant 5-amino acid levulinic acid synthesis and a rational, practicable method for finding such inhibitors.
  • the rate of synthesis of ALA in the plant must be sufficient to meet the need for ALA for the physiologically necessary porphyrin biosynthesis ensure.
  • the production of ALA must not be so high that there is direct or indirect damage to the plant. Therefore the C5 biosynthetic pathway for ALA in plants is regulated.
  • plants can be produced which are resistant to herbicidally active inhibitors of the C5 pathway, e.g. against inhibitors of GSAAT, if one expresses certain or complementary heterologous ALAS genes in useful plants, so that non-selective inhibitors of the C5 pathway can be used as herbicides in said transgenic useful plant cultures.
  • the present invention therefore provides a method for producing transgenic plants with modified 5-aminolevulinic acid biosynthesis, in which the metabolic pathway specifically inhibited by a herbicide is circumvented by a heterologous gene expression which complements or substitutes the inhibition.
  • the plants are equipped with one or more heterologous nucleic acid molecules with one or more additional or alternative biosynthetic steps which lead to the end product of the inhibited metabolic pathway, so that the transgenic plant is resistant to the herbicidally active inhibitor of the C5 metabolic pathway results.
  • This alternative pathway gives the transgenic plants that have ALAS activity the desired resistance to non-selective herbicides that inhibit the formation of aminolevulinic acid within the C5 pathway, e.g. by inhibiting the GSAAT enzyme by bypassing the metabolic step blocked by the herbicidal active ingredient. Resistance to heterologous ALAS activity can also be obtained in the transgenic plants against inhibitors of glutamyl-tRNA reductase.
  • the subject of the invention is therefore a process for the production of transgenic plants, transgenic plant cells, transgenic plant parts, transgenic plant seeds, transgenic propagation material with modified 5-aminolevulinic acid biosynthesis, comprising one or more functionally active nucleic acid molecules coding for a protein with the function of an ALAS selected from the group of feedback-regulated ALAS, animal ALAS and bacterial ALAS, preferably a feedback-regulated ALAS, particularly preferably ALAS from purple bacteria, active fragments thereof or an antisense or complementary sequence thereof, which are prepared by a process known per se for the production of transgenic plant cells or plants, Plant parts, plant seeds or propagation material are stably integrated into the plant genome.
  • genome includes the entire genetic material of a plant, i.e. In addition to the core DNA, the genetic material of all organelles of the plant cells.
  • monocot plants in particular maize plants, can be produced which are resistant to herbicidally active inhibitors of the C5 pathway, for example to GSAAT inhibitors, if heterologous ALAS genes are substitutive in these crop plants or expressed in a complementary manner so that non-selectively active inhibitors of the C5 metabolic pathway can be used as herbicides in the said transgenic crops.
  • the invention therefore also relates to a process for producing transgenic plants, transgenic plant cells, transgenic plant seeds, transgenic propagation material with modified 5-aminolevulinic acid biosynthesis, comprising one or more functionally active nucleic acid molecules coding for a protein with the function of an ALAS, preferably a feedback regulated ALAS, particularly preferably of ALAS from purple bacteria, of active fragments thereof or an antisense or complementary sequence thereof, which are stably integrated into the plant genome by a process known per se for the production of transgenic plant cells or plants, plant parts, plant seeds or propagation material, characterized in that the transgenic plant is a monocot plant, preferably a maize plant.
  • Another object of the invention is the use of at least one nucleic acid molecule (NS) coding for a protein with the function of an ALAS, selected from the group of feedback-regulated ALAS, animal ALAS and bacterial ALAS, preferably a feedback-regulated ALAS, particularly preferably an ALAS Purple bacteria, an active fragment thereof or an antisense or complementary sequence thereof for the production of transgenic plant cells or plants with modified 5-aminolevulinic acid biosynthesis, preferably for the expression of a protein with the function of an ALAS according to the invention or an active fragment thereof in transgenic plant cells or plants or also preferred for the production of transgenic Plant cells or plants whose expression of a protein with the function of a GSAAT or an active fragment thereof is suppressed or inhibited.
  • NS nucleic acid molecule
  • Another object of the invention is the use of at least one nucleic acid molecule (NS) coding for a protein with the function of an ALAS, preferably a feedback-regulated ALAS, particularly preferably an ALAS from purple bacteria, an active fragment thereof or an antisense or complementary sequence thereof for the production of transgenic plant cells or plants with modified 5-aminolevulinic acid biosynthesis, preferably for the expression of a protein with the function of an ALAS according to the invention or an active fragment thereof in transgenic plant cells or plants or also preferably for the production of transgenic plant cells or plants whose expression of a protein with the Function of a GSAAT or an active fragment is suppressed or inhibited therefrom, characterized in that the transgenic plant is a monocotyledonous plant, preferably a maize plant.
  • NS nucleic acid molecule
  • genes coding for proteins with ALAS activity can be used for the production of transgenic plants which are able to produce ALA by means of the Shemin metabolic pathway.
  • Nucleic acid sequences coding for proteins with ALAS activity are derived from amino acid sequences of proteins with ALAS activity or their genes from, for example, animals and bacteria, or generally from feedback-regulated ALAS from prokaryotic or eukaryotic organisms or their active fragments, for example the ALAS from the purple bacteria of the alpha group such as Rhodobacter sphaeroides, Seq. ID No. 1 or Seq. ID No. 2, (Neidle & Kaplan (1993) Journal of Bacteriology 175: 2292-2303) or Rhodobacter capsulatus, Seq. ID No. 3 (Hornberger et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 221: 371-378).
  • a balanced synthesis of ALA can be ensured, for example, in the following way, so that the term feedback-regulated in connection with the biological activity of ALAS is to be understood as explained below:
  • nucleic acids (NS) coding for proteins with ALAS activity which have a pronounced feedback regulation by heme
  • heme is an essential product made from ALA.
  • the synthesis rate of heme is linked to the provision of ALA and thus reflects the synthesis capacity for the intermediate ALA and thus indirectly also the possible substrate flow into the chlorophyll biosynthesis.
  • ALAS-coding NS from Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus and other purple bacteria of the alpha group are suitable.
  • the feedback regulation of the enzymatic activity of a heterologous ALAS can take place in the plant cell, for example in plastids and in the mitochondria, since the regulatory active compounds, for example heme, are formed in these organelles starting from 5-aminolevulinate (ALA). It is therefore particularly advantageous to express a heterologous NS coding for a feedback-regulated protein with ALAS activity in such a way that the functionally intact expression products (ALAS) are present in the plastids or mitochondria.
  • ALAS functionally intact expression products
  • ALA synthesized in mitochondria can be exported to the plastids, where the enzymes of the subsequent tetrapyrrole biosynthesis are located, through the transport systems present in the plant.
  • the localization of an ALAS in plastids can be achieved, for example, by an NS coding for a protein with ALAS activity under the control of an in Plastid active promoter is inserted into the piastome of a plant by methods known to those skilled in the art. All promoters constitutively active in plastids are available as promoters, preferably, for example, the expression signal sequences of the psM cassette (Staub & Maliga (1993) EMBO Journal 12: 601-606; Zoubenko et al. (1994) Nucleic Acids Research 22: 3819-3824) and the Prrn promoter (Svab & Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917).
  • the promoters can e.g. according to known methods, together with the heterologous NS coding for a protein with the function of an ALAS, are inserted into the piastom or the heterologous NS is inserted into the piastom in such a way that it is under the control of an already existing promoter (Staub & Maliga (1995) Plant Journal 7: 845-848).
  • plastid localization of an ALAS can also be achieved by first synthesizing the ALAS in the cytoplasm with a suitable plastid targeting sequence (transit peptide) and importing it into the plastids during or after its synthesis.
  • a suitable plastid targeting sequence transit peptide
  • numerous promoters, plastid targeting sequences and fusion strategies for NS coding for a targeting sequence and NS coding for a protein with ALAS activity are available to the person skilled in the art.
  • promoters which are able to bring about the transcription of DNA sequences in plants.
  • Such promoters are preferably derived from the genome of plants or phytopathogenic viruses, for example the CaMV35S promoter and its derivatives, preferably from the piastome, likewise preferably from core DNA, particularly preferably from the piastom of plants.
  • the promoter used must allow an expression level of the ALAS gene which is sufficient to impart resistance to the transgenic plant to inhibitors of the C5 biosynthetic pathway for ALA.
  • the NS coding for a protein with ALAS activity is preferably cloned under the control of a promoter as a fusion with a DNA sequence coding for a plastid transit peptide, so that the primary translation product is provided at the N-terminal with a plastid transit peptide and is imported into plastids.
  • plastid transit peptides preference is given to using peptide sequences which, as an N-terminal fusion, bring about the translocation of polypeptide chains from the cytoplasm into plastids and are cleaved off during or after this process.
  • Particularly preferred as the transit peptide for proteins with ALAS activity is the transit peptide of the small subunit of ribulose bisphosphate carboxylase.
  • the localization of an ALAS according to the invention in mitochondria can be achieved by first synthesizing the protein in the cytoplasm with a suitable mitochondrial targeting sequence and importing it into the mitochondrion during or after its synthesis.
  • a suitable mitochondrial targeting sequence and importing it into the mitochondrion during or after its synthesis.
  • Numerous promoters, mitochondrial targeting sequences and fusion strategies for sequences coding for a targeting sequence and sequences coding for a protein with ALAS activity are also available to the person skilled in the art.
  • the same promoters can be used which have been described for the localization of the expression products in the plastid.
  • the NS coding for a protein with ALAS activity is preferably cloned under the control of a promoter as a fusion with a DNA sequence coding for a mitochondrial transit peptide, so that the primary translation product is provided with a mitochondrial transit peptide and is imported into mitochondria.
  • peptide sequences which, as an N-terminal fusion, are the translocation of polypeptide chains effect from the cytoplasm in mitochondria and be split off during or after this process.
  • a further subject of the invention is therefore a process for the production of transgenic plants, transgenic plant cells, transgenic plant parts, transgenic plant seeds, transgenic propagation material with modified 5-aminolevulinic acid biosynthesis containing one or more functionally active nucleic acid molecules coding for a protein with the function of an ALAS, selected from the Group of feedback-regulated ALAS, animal ALAS and bacterial ALAS, preferably a feedback-regulated ALAS, particularly preferably ALAS from purple bacteria, active fragments thereof or an antisense or complementary sequence thereof, in which said nucleic acid molecules are under the control of a feedback-regulated Promoters and the use of a feedback-regulated promoter, preferably a promoter of a plant GSAAT or glutamyl-tRNA reductase in a method according to the invention for the production of transgenic plant cells or plants Modified 5-aminolevulinic acid biosynthesis.
  • an ALAS selected from the Group of feedback-regulated ALAS, animal ALAS and bacterial ALAS, preferably a feedback-regulated
  • the invention also relates to a process for producing transgenic plants, transgenic plant cells, transgenic plant parts, transgenic plant seeds, transgenic propagation material with modified 5-aminolevulinic acid biosynthesis containing one or more functional active nucleic acid molecules coding for a protein with the function of an ALAS, preferably a feedback -regulated ALAS, particularly preferably of ALAS from purple bacteria, of active fragments thereof or an antisense or complementary sequence thereof, in which said nucleic acid molecules are under the control of a feedback-regulated promoter and the use of a feedback-regulated promoter, preferably a promoter of a vegetable GSAAT or Glutamyl-tRNA reductase in a method according to the invention for the production of transgenic plant cells or plants with modified 5-aminolevulinic acid Biosynthesis, characterized in that the transgenic plant is a monocot plant, preferably a maize plant.
  • the ALAS gene according to the invention under the control of a promoter specifically regulated in plants in order to achieve a targeted, feedback-regulated expression.
  • a promoter specifically regulated in plants e.g., the promoters of the enzymes of plant porphyrin biosynthesis, preferably the promoters of the genes coding for glutamyl-tRNA reductase and GSAAT, e.g. by using promoter sequences which are in the region of approximately 2 kb (kilobase) long, upstream (in the 3 'direction) nucleic acid segments of the coding regions of said genes.
  • NS coding for a heterologous protein with ALAS activity as well as the plant genes coding for glutamyl-tRNA reductase and GSAAT is only expressed when there is a physiological need for ALA.
  • an NS coding for an ALAS feedback-regulated at the protein and gene expression level is also particularly advantageous, i.e. to both express an ALAS protein which has a feedback-regulated enzymatic activity and to place the gene expression of the feedback-regulated ALAS under the control of a feedback-regulated promoter.
  • NS coding for proteins with ALAS activity can be isolated or synthetically produced from animal, fungal or suitable bacterial organisms.
  • the nucleic acid molecules will preferably be cloned using DNA or RNA from the respective donor organism by means of common molecular biological methods (Ausubel et al. In “Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc., ISBN 0-471-50338-X).
  • the sequence of the NS can also be changed, shortened or expanded in many ways using common molecular biological methods, so that devatization, for example by mutation, deletion, substitution or insertion.
  • the invention also relates to non-naturally occurring chimeric genes, at least comprising a promoter suitable for the expression of an ALAS according to the invention in plants, which is functionally coding for a DNA molecule for a protein with the function of an ALAS or an active fragment thereof or an antisense or complementary sequence thereof is fused.
  • the invention also relates to recombinant vectors, in particular plasmids, cosmids, viruses and other vectors common in genetic engineering, containing at least one non-naturally occurring chimeric gene according to the invention.
  • nucleic acid molecules contained in the vectors are linked to regulatory elements which ensure the transcription and synthesis of a translatable RNA in plant cells.
  • the invention also relates to transgenic plant cells which have been transformed and / or genetically modified with a DNA molecule coding for a protein having the function of an ALAS according to the invention or an active fragment thereof or an antisense or complementary sequence thereof or a chimeric gene or vector according to the invention , and cells which are derived from cells transformed and / or modified in this way and which contain a nucleic acid molecule to be used according to the invention or a gene or vector according to the invention.
  • the invention also relates to transgenic plant cells which transform with a DANN molecule coding for a protein with the function of an ALAS or an active fragment thereof or an antisense or complementary sequence thereof or a chimeric gene or vector according to the invention and / or are genetically modified, and cells derived from such transformed and / or modified cells, which contain a nucleic acid molecule to be used according to the invention or a gene or vector according to the invention, characterized in that the transgenic plant is a monocotyledonous plant, preferably a maize plant .
  • the invention also relates to the production of transgenic plants, transgenic plant cells, transgenic plant parts, transgenic plant seeds, transgenic propagation material, i.e. obtainable, preferably obtained, by a method according to the invention, containing a DNA molecule coding for a protein with the function of an ALAS selected from the group of feedback-regulated ALAS, animal ALAS and bacterial ALAS, or an active fragment thereof or an antisense or complementary Sequence thereof, especially crops or ornamental plants.
  • the invention also relates to the production of transgenic plants, transgenic plant cells, transgenic plant parts, transgenic plant seeds, transgenic propagation material, i.e. obtainable, preferably obtained, by a method according to the invention, containing a DNA molecule coding for a protein with the function of an ALAS, or an active fragment thereof or an antisense or complementary sequence thereof, in particular useful or ornamental plants, characterized in that the transgenic Plant is a monocot plant, preferably a corn plant.
  • Plant cells of this type contain one or more nucleic acid molecules (s) to be used according to the invention, these (s) preferably being linked to regulatory DNA elements which ensure transcription in plant cells, in particular a promoter.
  • Such cells can be distinguished from naturally occurring plant cells in that they have at least one chimeric gene according to the invention contain, which does not naturally occur in these cells, or in that such a molecule is integrated at a location in the genome of the cell where it does not naturally occur, ie in a different genomic environment.
  • Suitable NS constructs are produced for the transformation of plants, which contain a translatable sequence coding for a protein with ALAS activity.
  • DNA constructs for the expression of a heterologous gene in plants and to transform plants with this DNA construct.
  • DNA constructs are preferably produced by cloning a DNA sequence coding for ALAS under the control of a plant promoter in a plant transformation vector.
  • Binary plant transformation vectors such as e.g. B. pBIB or pPCV801 and their derivatives are suitable.
  • the gene coding for a protein with ALAS activity can also be inserted into the plant genome without a DNA sequence coding for an N-terminal plastid or mitochondrial targeting peptide under the control of a promoter active in plants, so that the primary translation product is directly in the cytoplasm active protein is expressed.
  • Plant cells or plastids are transformed with one of the DNA constructs described above, which is suitable for the functional expression of a gene coding for a protein with ALAS activity in plants.
  • one of the common genetic engineering methods for transforming plants for example Potrykus & Spangenberg (Eds.) "Gene Transfer to Plants” (1995) Springer-Verlag ISBN 3-540 58406-4
  • plastids for example Zoubenko et al. ( 1994) Nucleic Acids Research 22: 3819-1824).
  • Another subject of the invention is therefore a process for the production of transgenic plants, transgenic plant cells, transgenic plant parts, transgenic plant seeds, transgenic propagation material with modified 5-aminolevulinic acid biosynthesis containing one or more functionally active nucleic acid molecules coding for a protein with the function of an ALAS, selected from the Group of feedback-regulated ALAS, animal ALAS and bacterial ALAS, preferably a feedback-regulated ALAS, particularly preferably of ALAS from purple bacteria, of active fragments thereof or of an antisense or complementary sequence thereof, in which said nucleic acid molecules are stable into the plant piastom by plastid transformation to get integrated.
  • an ALAS selected from the Group of feedback-regulated ALAS, animal ALAS and bacterial ALAS, preferably a feedback-regulated ALAS, particularly preferably of ALAS from purple bacteria, of active fragments thereof or of an antisense or complementary sequence thereof, in which said nucleic acid molecules are stable into the plant piastom by plastid transformation to get integrated.
  • Another subject of the invention is therefore a process for the production of transgenic plants, transgenic plant cells, transgenic plant parts, transgenic plant seeds, transgenic propagation material with modified 5-aminolevulinic acid biosynthesis containing one or more functionally active nucleic acid molecules coding for a protein with the function of an ALAS, particularly preferably from ALAS from purple bacteria, from active fragments thereof or from an antisense or complementary sequence thereof, in which said nucleic acid molecules are stably integrated into the plant piastome by plastid transformation, characterized in that the transgenic plant is a monocot plant, preferably a maize plant.
  • Suitable recipient plants for a heterologous gene coding for a protein with ALAS activity are all agriculturally important monocotyledonous and dicotyledonous, preferably monocotyledonous, crop plants in which herbicidal inhibitors of the C5 pathway can be used to control undesirable accompanying vegetation, preferably maize and others Cereals such as wheat, rye, barley, millet and rice as well as cotton, tobacco, sugar beet, sugar cane, potatoes, rapeseed, sunflowers, soybeans, vegetables and fruit.
  • Cereals such as wheat, rye, barley, millet and rice as well as cotton, tobacco, sugar beet, sugar cane, potatoes, rapeseed, sunflowers, soybeans, vegetables and fruit.
  • the coding region can optionally be linked to DNA sequences which ensure localization in the respective compartment.
  • DNA sequences are known (see for example Braun et al., EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald et al ., Plant J. 1 (1991), 95-106).
  • the transgenic plant cells can be regenerated into whole plants using techniques known to those skilled in the art.
  • the plants obtainable by regeneration of the transgenic plant cells according to the invention are also the subject of the present invention.
  • the invention furthermore relates to plants which contain the transgenic plant cells described above.
  • the transgenic plants can in principle be plants of any plant species, i.e. both monocot and dicot plants. It is preferably useful or ornamental plants such as Cereals (rye, barley, oats, wheat, rice, corn), fruits and vegetables, cassava, potatoes, soy, sugar beet etc.
  • the invention also relates to propagation material of the plants according to the invention, for example fruits, seeds, tubers, rhizomes, seedlings and cuttings.
  • nucleic acid molecules to be used according to the invention are linked to regulatory DNA elements which ensure transcription in plant cells.
  • regulatory DNA elements which ensure transcription in plant cells.
  • These include promoters in particular.
  • any promoter active in plant cells can be used for the expression.
  • the promoter can be selected so that the expression is constitutive or only in a certain tissue, at a certain time in plant development or at a time determined by external influences.
  • the promoter can be homologous or heterologous with respect to the plant. Suitable promoters are, for example, the 35S RNA promoter of the Cauliflower Mosaic Virus and the ubiquitin promoter from maize for constitutive expression, the patatin gene promoter B33 (Rocha-Sosa et al., EMBO J.
  • a sink-specific expression e.g. potato tubers, beets, tomato fruit
  • a promoter which ensures expression only in photosynthetically active tissues for example the ST-LS1 promoter (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451), all promoters constitutively active in plastids, for example the expression signal sequences of the psM cassette (Staub & Maliga (1993) EMBO Journal 12: 601-606; Zoubenko et al.
  • cloning vectors which contain a replication signal for E. coli and a marker gene for the selection of transformed bacterial cells.
  • examples of such vectors are pBR322, pUC series, M13mp series and pACYC184.
  • the desired sequence can be introduced into the vector at a suitable restriction site.
  • the plasmid obtained is used for the transformation of E. coli cells.
  • Transformed E. coli Cells are grown in a suitable medium, then harvested and lysed.
  • the plasmid is recovered. Restriction analyzes, gel electrophoresis and other biochemical-molecular biological methods are generally used as the analysis method for characterizing the plasmid DNA obtained.
  • the plasmid DNA can be cleaved and DNA fragments obtained can be linked to other DNA sequences.
  • Each plasmid DNA sequence can be cloned into the same or different plasmids.
  • a variety of techniques are available for introducing DNA into a plant host cell. These techniques include the transformation of plant cells with T-DNA using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as a transformation agent, the fusion of protoplasts, the injection, the electroporation of DNA, the introduction of DNA using the biolistic method etc.
  • plasmids When injecting and electroporation of DNA into plant cells, there are no special requirements for the plasmids used. Simple plasmids such as e.g. PUC derivatives can be used. However, if whole plants are to be regenerated from such transformed cells, the presence of a selectable marker gene is necessary.
  • the Ti or Ri plasmid is used for the transformation of the plant cell, at least the right boundary, but often the right and left boundary of the Ti and Ri plasmid T-DNA as the flank region, must be connected to the genes to be introduced.
  • the DNA to be introduced must be cloned into special plasmids, either in an intermediate vector or in a binary vector.
  • the intermediate vectors can be integrated into the Ti or Ri plasmid of the agrobacteria by means of sequences which are homologous to sequences in the T-DNA by homologous recombination. This also contains the vir region necessary for the transfer of the T-DNA. Intermediate vectors cannot replicate in agrobacteria. Using a helper plasmid, the intermediate vector can be transferred to Agrobacterium tumefaciens (conjugation). Binary vectors can replicate in E. coli as well as in Agrobacteria.
  • the agrobacterium serving as the host cell is said to contain a plasmid which carries a vir region.
  • the vir region is necessary for the transfer of the T-DNA into the plant cell; additional T-DNA may be present.
  • the agrobacterium transformed in this way is used to transform plant cells.
  • T-DNA for the transformation of plant cells is described in detail in EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 and An et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287.
  • plant explants can expediently be cultivated with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • Whole plants can then be regenerated from the infected plant material (for example leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension-cultivated plant cells) in a suitable medium, which can contain antibiotics or biocides for the selection of transformed cells.
  • the plants thus obtained can then be examined for the presence of the introduced DNA.
  • Other ways of introducing foreign DNA using the biolistic method or by protoplast transformation are known (cf. for example Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (HJ Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds., Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim).
  • Transformed cells inherently contain a marker against inhibitors of GSAAT.
  • the transformed cells grow within the plant in the usual way (see also McCormick et al. Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84).
  • the resulting plants can be grown normally and crossed with plants that have the same transformed genetic makeup or other genetic makeup.
  • the resulting hybrid individuals have the corresponding phenotypic properties. Seeds can be obtained from the plant cells.
  • Two or more generations should be grown to ensure that the phenotypic trait is stably maintained and inherited. Seeds should also be harvested to ensure that the appropriate phenotype or other characteristics have been preserved.
  • transgenic plants according to the invention can be used in practice in conjunction with a herbicide whose mechanism of action is based, at least in part, on an inhibition of the GSAAT and thus the C5 pathway.
  • the invention therefore also relates to a method for controlling unwanted vegetation in crops, characterized in that a crop is used which comprises one or more crops Has nucleic acid molecules coding for a protein of an ALAS according to the invention and applies a herbicidal agent to the location of this plant, the plant itself or its propagation material, the mechanism of action of which is based at least in part on a, preferably specific, inhibition of GSAAT.
  • herbicidal inhibitors of the plant C5 pathway can be found if the influence of a chemical compound on the activity of the plant GSAAT is determined and chemically diverse compounds are screened in individual or series tests. By automating a suitable GSAAT activity test, a large number of compounds can be examined in this way and the process can thus be made practical.
  • the subject of the invention is therefore also a, preferably automated, method for determining the effector effect of a test substance with regard to the activity of a GSAAT, in which a) the enzymatic activity of the GSAAT is determined in the absence of a test substance; b) the enzymatic activity of the GSAAT is determined in the presence of a test substance; and c) compares the enzymatic activities determined under a) and b).
  • the method is suitable for finding specific inhibitors or activators (ie effectors) of the enzymatic activity of the GSAAT, so that substances can be identified which have a potential herbicidal or growth-inhibiting but also growth-promoting effect.
  • the chemical compound to be examined is preferably used in concentrations between 10 "9 M and 10 " 3 M, and particularly preferably in concentrations between 10 "7 M and 10 " 4 M used.
  • the enzyme inhibition or enzyme activation (i.e. the effector effect) can be quantified by a simple comparison of the catalytic activity of the GSAAT in the absence and in the presence of the test substance to be investigated under otherwise identical test conditions in a manner known to the person skilled in the art.
  • Various biochemical measurement methods can be used to determine the activity of the GSAAT, by means of which either the formation of the reaction products of the reaction catalyzed by the GSAAT, eg. B. ALA, or a decrease in the concentration of the enzyme substrates such as glutamate semialdehyde can be measured, e.g. by an end point determination or after enzymatic conversion of the substrates, which may or may not have been radioactively labeled or provided with other common markers or can be detected by subsequent reactions, e.g. through coupled enzymatic reactions.
  • the enzyme substrates such as glutamate semialdehyde
  • the methods according to the invention for determining the effector effect of test substances can be carried out with purified GSAAT, but also with whole cells of a recombinant organism which expresses the GSAAT recombinantly, with GSAAT-containing extracts from this organism or enriched GSAAT-containing fractions from this organism.
  • Bacterial, insect and yeast cells may be mentioned as the preferred recombinant host organism.
  • a GSAAT isolated from plant tissue or plant cell cultures can be used.
  • the subject of the invention is therefore also the use of a method according to the invention and the use of a, preferably recombinantly produced, protein with the function of a GSAAT for identifying effectors of the GSAAT, preferably in an automated method, for example in a so-called high-speed screening, the implementation of which makes it possible to automate the Procedure for determining the activity of the enzyme is required.
  • Effectors according to the invention or identified according to the invention influence (inhibit) the activity of the enzyme, preferably under the test conditions described, preferably by at least 30%, particularly preferably by at least 50%.
  • effectors that can be identified by means of the method according to the invention, i.e. Activators or inhibitors of the enzymatic activity of the GSAAT, in particular pesticidal or herbicidally active effectors of the vegetable GSAAT, especially structural analogs of glutamate semialdehyde, glutamate or 5-aminolevulinate and their use as pesticides or herbicides.
  • GSAAT glutamate 1 semialdehyde
  • the GSAAT from plants is preferably used to identify effective enzyme inhibitors, particularly preferably the GSAAT from Arabidopsis thaliana (Seq. ID No. 5) or Hordeum vulgare (Seq. ID No. 6).
  • the GSAAT can either be isolated from the corresponding plants in a manner known to the person skilled in the art or can also be produced recombinantly in transgenic host cells on the basis of cDNA known from the literature.
  • glutamate-1-semialdehyde instead of glutamate-1-semialdehyde, other compounds, such as. B. 4,5-diaminovaleric acid, 4,5-dioxovaleric acid and in particular mixtures of these compounds can be used.
  • the enzymatic reaction can be influenced by adding pyridoxal phosphate or pyridoxamine phosphate.
  • GSAAT activity test A particularly suitable, exemplary embodiment of the GSAAT activity test is shown below, which is also particularly advantageous for an automated execution of the GSAAT test:
  • Glutamate-1-semialdehyde can be converted to 5-aminolevulinic acid in a reaction buffer in the pH range from pH 6 to pH 8 by an enzyme with GSAAT activity.
  • the 5-aminolevulinic acid can then be detected using two derivatization steps.
  • the solution is a compound of the general formula R-CO-CH 2 -CO-R ', such as acetylacetone, acetoacetic acid, amides and salts of acetoacetic acid, acetoacetic acid esters (methyl ester, ethyl ester, isopropyl ester, etc.) or derivatives of these compounds, in added at least a ten-fold molar excess to the expected amount of 5-aminolevulinic acid.
  • the mixture is then heated, for example, for a few minutes (80 ° C to the boiling point of the mixture) or incubated at 12 ° C to 80 ° C for 15 minutes or longer.
  • a condensation reaction takes place between the aminolevulinic acid and the added compound to form a pyrrole derivative.
  • the concentration of the pyrrole derivative is then determined, for example, by adding Ehrlichs Reagent (for example 1 volume) determined.
  • Ehrlichs Reagent for example 1 volume
  • the pyrrole de vat forms a colored complex with the 4-diaminobenzaldehyde in Ehrlich's reagent, the concentration of which can be determined photometrically by means of an absorption measurement.
  • a suitable wavelength for determining absorption is, for. B. between 530 and 550 nm.
  • the enzymatically formed amount of 5-aminolevulinic acid can be calculated using a calibration series with 5-aminolevulinic acid solutions of known concentrations, which are derivatized in the same way.
  • compositions of the reagents or the concentrations of salts, substrates and proteins, the pH values, the temperatures, the batch volumes and the wavelengths for measurement or detection can vary widely.
  • a person skilled in the art can determine the effector, ie activatorial or inhibitory properties of chemical compounds on the activity of the GSAAT in a variety of known ways.
  • a variety of methods are available to the person skilled in the art for checking the effect of a GSAAT inhibitor on plants in vivo.
  • the substances to be investigated for example defined chemical compounds, but also heterogeneous substance mixtures
  • auxiliaries such as wetting agents or solvents, can be used.
  • the plants are rated. Substances that damage a plant through selective inhibition of the GSAAT or the C5 pathway cause at least one characteristic symptom.
  • Chlorosis often develops after application, which can be particularly pronounced in the newly formed tissue and which can, for example, pass into necrosis due to the action of light.
  • Other symptoms can be a depression of growth or a very rapid death of the plant.
  • the symptoms vary depending on the plant species, depending on their different sensitivity and depending on the properties of the inhibitor.
  • a simple and practical possibility for an in vivo test is the Lemna test described in Example 8.
  • the concentration range of the test substance preferably being in the range from 10 "6 to 10 * 4 represents a rational method for the development of herbicides, the effect of which is based on an inhibition of plant GSAAT.
  • the invention therefore also relates to a method for finding herbicidal active compounds, characterized in that the test substance to be examined is tested for an effector effect against GSAAT as described above and preferably also subjected to a Lemna test.
  • the invention relates to the use of a compound which, in the test methods described, has an at least 30%, preferably at least 50%, inhibitory activity on effector properties compared to GSAAT and is preferably active in the Lemna test as a herbicide.
  • Active means preferably the appearance of chlorotic tissue, particularly preferably the appearance before chlorotic tissue and a growth depression of the plant, preferably within ten, particularly preferably within seven days.
  • the invention also relates to a process for combating undesirable plant growth in crops, characterized in that a herbicidal composition is applied to the site of the crop, the crop or its propagation material, comprising a compound which, in the test method described above, has a concentration range of 10 '7 to 10 "4 molar an at least 30%, preferably at least 50%, inhibitory effect compared to GSAAT and, preferably, is active in the Lemna test.
  • the useful plants are preferably transgenic plants according to the invention with modified 5-levulinic acid biosynthesis.
  • ALAS1 has the sequence 5'-gactgtgcatgcaggactacaatctggcactc-3 ', carries a Sphl restriction site at the 5' end and is derived in the 3 'region from positions 1950 to 1967 of gene bank entry L07490 (SEQ ID No. 1).
  • ALAS2 has the sequence 5'-ctgactctgcagtcaggcaacgacctcggc-3 ', carries a PstI restriction site at the 5' end and is derived in the 3 'region from positions 3170 to 3153 of gene bank entry L07490.
  • PCR polymerase chain reaction
  • 5 ⁇ l of a stationary culture of Rhodobacter sphaeroides strain ATCC # 35054 were cultured in a total volume of 50 ⁇ l given in the catalog of the American Type Culture Collection, Manassas, Virginia 20110-2209, USA), 10 nmol dATP, dCTP, dGTP and dTTP as well as 25 pmol each of primers ALAS1 and ALAS2 mixed.
  • the reaction mixture was 1/10 volume 10x Taq buffer (100 mM Tris / HCl pH 9.0, 500 mM KCI, 15 mM MgCl 2 ,
  • the vector pGEM3Zf- Promega was cleaved with Sphl and Pstl and the approximately 3100 bp vector fragment was isolated.
  • the Sphl / Pstl vector fragment was ligated to the 1235 b long Sphl / Pstl fragment of the hemA-PCR product.
  • Escherichia coli XL-1 Blue (Stratagene) was transformed with the ligation product.
  • the 1235 b long Sphl / Pstl fragment from pALASI was ligated with the 222 bp Pstl (2335) / Hindlll (2557) fragment from p35StpASN and the 3438 bp long Hindlll (2557) / Sphl (1199) fragment from p35StpASN.
  • the sequence of the vector p35StpANS is given in sequence ID NO. 8, the plasmid map in FIG. 1.
  • the ligation product of the three fragments was named pALAS2.
  • the sequence coding for ALAS from Rhodobacter sphaeroides at the 5 'end via the Sphl cleavage site in the reading frame is fused with a sequence coding for a modified chloroplastic targeting sequence.
  • This sequence is derived from the chloroplastic targeting sequence of the small subunit of pea ribulose bisphosphate carboxylase and contains an internal sequence duplication corresponding to positions 985 to 1041 in p35StpASN, which are repeated as positions 1045 to 1101 in p35StpASN (cf. Seq. ID No. 8).
  • the transcription of the fusion gene is regulated via the CaMV35S promoter.
  • the approximately 2.2 kb cassette containing the 35S promoter, targeting sequence, ALAS gene and 35S terminator was cut out of pALAS2 using EcoRI and the overhanging DNA ends of this fragment were filled in using T4 DNA polymerase.
  • the vector pcva13 (Seq. ID. No. 9, plasmid map in FIG. 2) was linearized with SnaBI, dephosphorilized with alkaline phosphatase and ligated with the approx. 2.2 kb long, filled-in fragment from pALAS2.
  • pALAS3f a plasmid in which the reading direction of the hemA gene and the PAT gene are in the same direction was designated as pALAS3f (cf. FIG. 3).
  • transgenic maize plants which contain an expression cassette for the hemA gene from Rhodobacter sphaeroides
  • a transformation was carried out as described in EP-A 0 469 273, with pALAS3f being used differently as the DNA to be transferred.
  • 41 independent maize Get transformants Plants were regenerated as described from these lines designated as M23T1, M25T1 to M25T13 and M27T1 to M27T27.
  • the presence of the complete hemA gene was detected in all transgenic plants by means of PCR using the oligodeoxynucleotides ALAS1 and ALAS2 (see Example 1) as PCR primers.
  • the tolerance threshold of the non-transformed maize line against the GSAAT inhibitor 3-amino-2,3-dihydrobenzoic acid was determined.
  • the maize seeds were surface-sterilized by washing them under sterile conditions first in 70% ethanol for 1 min, then in 5% sodium hypochlorite, 0.1% Tween 20 for 20 min and then briefly in sterile water for six times.
  • the seeds were then sterile on Murashige & Skoog medium (micro and macronutrients, Sigma GmbH # M5524) containing 90 g / l sucrose and 8 g / l agar and put for six days at room temperature under daylight fluorescent tubes in 12 h light / Dressed darkly for 12 h until the second leaf became visible.
  • the plantlets were placed on fresh medium with various concentrations of 3-amino-2,3-dihydrobenzoic acid.
  • transgenic lines to 3-amino-2,3-dihydrobenzoic acid is determined in comparison with the non-transgenic starting line.
  • five regenerated plants per line which visually correspond in size and rooting to the seedlings described above after six days of germination, on media without 3-amino-2,3-dihydrobenzoic acid (one plant) and with 100 ⁇ M 3-amino-2, 3-dihydrobenzoic acid (four plants) implemented and cultivated further. All regenerated plants of the non-transgenic line show, as before, under the action of 3-amino-2,3-dihydrobenzoic acid marked chlorosis and reduced biomass production compared to the untreated control.
  • the transgenic lines show a phenotype comparable to the non-transgenic plants under these conditions.
  • the ALAS gene according to the invention none of the regenerated plants in the presence of 100 ⁇ M 3-amino-2,3-dihydrobenzoic acid shows chlorosis or reduced growth compared to their respective untreated control on medium without 3-amino-2,3- dihydrobenzoic acid.
  • the mature GSAAT from Hordeum vulgare was genetically engineered in Escherichia coli using Sequence ID No. 6.
  • Escherichia coli strain TG1 (Gibson (1984) PhD Thesis, Cambridge, UK) was used simultaneously with the expression plasmid pATE19 (Berry-Lowe et al. (1992) Plant Physiology 99: 1597-1603) and the plasmid pGroESL (Goloubinoff et al (1989) Nature 337: 44-47).
  • Transformed clones were always cultivated in LB medium (10 g / l tryptone, 5 g / IHefe extract, 5 g / l NaCl) with 100 mg / l ampicillin and 30 mg / l chloramphenicol.
  • 100 ml of medium were inoculated with a TG1 / pATE19 / pGroESL clone and incubated for 14 h at 37 ° C. with shaking in a culture flask.
  • isopropyl-bD-thio-galactopyranoside was immediately added to a final concentration of 0.5 mM.
  • the incubation temperature was reduced to 28 ° C.
  • the cells were harvested by centrifugation (4200 g, 20 min, 4 ° C.).
  • the cell sediment was resuspended in 150 ml buffer A (50 mM tricin / NaOH pH 7.9, 25 mM MgCl 2 ).
  • the cells were then disrupted by three passages through the French Press homogenizer (French Pressure Cell Press and 35 ml digestion cell from SLM Instruments, Inc., Rochester NY 14625 USA) at 16000 psi and 4 ° C. The homogenate was then centrifuged for 30 min at 25000 g and 4 ° C. The clear supernatant was subjected to anion exchange chromatography.
  • French Press homogenizer Frnch Pressure Cell Press and 35 ml digestion cell from SLM Instruments, Inc., Rochester NY 14625 USA
  • a DEAE-Sepharose Fast Flow column (Pharmacia GmbH, Freiburg) with a bed volume of 500 ml was equilibrated with buffer A. The clear supernatant of the digested cells was applied to this column. The column was then rinsed first with 250 ml of buffer A and then with 1500 ml of buffer B (50 mM tricin / NaOH pH 7.9, 25 mM MgCl 2 , 20 mM NaCl). The elution of the recombinant GSAAT took place with 750 ml buffer C (50 mM tricin / NaOH pH 7.9, 25 mM MgCl 2 , 100 mM NaCl). The eluate was collected in fractions of 25 ml and the fractions containing functional GSAAT were determined by means of a GSAAT activity test on samples from the fractions. 25 nkat GSAAT were obtained from 5 l expression culture.
  • the activity of the GSAAT was demonstrated by photometric detection of the derivatized reaction product 5-aminolevulinic acid.
  • the activity test was carried out in a 96-well flat-bottom microtiter plate (F-form) made of polystyrene.
  • F-form microtiter plate
  • the desired number of individual measurements could be carried out in parallel in the wells of the microtiter plate (wells).
  • MTP microtiter plate
  • the mixture was incubated at 20 ° C. for 30 min. 25 ⁇ l of ethyl acetoacetate were then added immediately, the mixture was thoroughly mixed and incubated at 40 ° C. for 30 min. Immediately afterwards, 100 ⁇ l Ehrlich's reagent (see below) was added and the mixture was incubated at 20 ° C. for 30 min. After the incubation had ended, the absorption of the solution at a wavelength of 540 nm was determined immediately with the aid of a microtiter plate photometer.
  • the blank value (see below) was first subtracted from the absorption of the batch to be determined.
  • the concentration of 5-aminolevulinic acid in the reaction mixture at the time immediately before the addition of the acetoacetic acid ethyl ester was calculated from the difference between the measured value and the blank value using a calibration series.
  • the calibration series was generated by first incubating 100 ⁇ l of differently concentrated 5-aminolevulinate solutions in 250 mM BisTris / HCl pH 6.5 for 30 min at 20 ° C., then mixing with 25 ⁇ l ethyl acetoacetate and 30 min at 40 ° C.
  • the concentration of 5-aminolevulinic acid in the 100 ⁇ l 250 mM BisTris / HCl pH 6.5 is varied in parallel between 0 ⁇ M and 150 ⁇ M (0 ⁇ M, 5 ⁇ M, 10 ⁇ M, 20 ⁇ M, 50 ⁇ M, 100 ⁇ M, 150 ⁇ M).
  • a parallel GSAAT activity test was used to determine a blank value (see above) as a reference to the measured absorption value of a GSAAT reaction carried out, in which 1.) the enzymatic activity of the GSAAT was blocked and the 2.) was otherwise carried out under exactly the same conditions as the approach to be compared.
  • 10 ⁇ l of a solution of 10 mM aminooxyacetic acid in 25% (v / v) dimethyl sulfoxide / water is initially introduced together with the enzyme solution instead of 10 ⁇ l 25% (v / v) dimethyl sulfoxide / water (see above) .
  • Composition of Ehrlich's reagent is initially introduced together with the enzyme solution instead of 10 ⁇ l 25% (v / v) dimethyl sulfoxide / water (see above) .
  • the solutions in the wells of the MTPs were then mixed with 100 ⁇ l enzyme solution (25 pkat / ml recombinant GSAAT from Hordeum vulgar, 250 mM BisTris / HCl pH 6.5).
  • the enzymatic reaction was started in all wells of an MTP at the same time by adding 5 ⁇ l of 1.8 mM glutamate-1-semialdehyde dissolved in 100 mM HCl.
  • the further steps were identical to the procedure described in Example 2 after the start of the enzymatic reaction.
  • the activity of the non-inhibited GSAAT could then be determined for each MTP from the mean of the measurement results for the wells with the control reactions and the mean of the wells with the blank values. Likewise, the GSAAT activity was determined for each well of this MTP in which a substance to be examined was used by subtracting the mean value of the blank values. By comparing the activity of the activity of the GSAAT in the presence of a substance to be investigated and the activity in the absence of the substance to be investigated (control reactions), it was determined whether the substance is effector, i.e. inhibits or activates the GSAAT activity test. Compounds that cause a relative reduction in GSAAT activity by more than 30% compared to the control reactions have been investigated more closely as potential effectors.
  • the potency of an effector of the GSAAT was determined by carrying out the GSAAT test (cf. Example 2) in the presence of different concentrations of the effector in the reaction solution. Concentrations of 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 ⁇ M, 3 ⁇ M, 10 ⁇ M, 30 ⁇ M, 100 ⁇ M and 300 ⁇ M of the effector were used.
  • the inhibitor constants were calculated on the basis of the activities derived from the measured values using the methods described in detail by Bergmeyer (basics of enzymatic analysis; ed. By Hans Ulrich Bergmeyer, Verlag Chemie Weinheim, New York, 1977, ISBN 3- 527-25677-6), the constants for activators could be determined in an analogous manner.
  • the phytotoxic effects of GSAAT inhibitors could also be determined in vivo by treating Lemna cultures.
  • Lemna gibba was added to this in sterile culture solution (0.4 g / l KNO 3 , 0.8 g / l CaCl 2 * 2 H 2 O, 0.366 g / l MgSO 4 * 7 H 2 O, 0.2 g / l KH 2 PO 4 , 2 ml / 1 solution I (2.23 g / l MnSO 4 * 4 H 2 O, 83 mg / l KJ, 2.5 mg / l CoCI 2 * 6 H 2 O, 0.86 g / I ZnS0 4 * 7H 2 O, 2.5 mg / l CuSO 4 * 5 H 2 O, 0.62 g / l H 3 BO 3 , 25 mg / l Na 2 MoO 4 * 2 H 2 O) and 2 ml / 1 solution II (14.92 g / l Na-EDTA, 10.92 g / l FeSO 4 * 7 H 2 O)).

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Abstract

Ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit veränderter 5-Aminolävulinsäure-Biosynthese, transgener Pflanzenzellen, transgener Pflanzenteile, transgener Pflanzensamen, transgenen Vermehrungsguts, ist dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle kodierend für ein Protein mit der Funktion einer 5-Aminolävulinsäure-Synthase (ALAS), ausgewählt aus der Gruppe der feedback-regulierten ALAS, tierischen ALAS und bakteriellen ALAS, eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon stabil in das pflanzliche Genom integriert werden. Effektoren der natürlichen 5-Aminolävulinsäure-Biosynthese in Pflanzen werden gefunden mit einem Verfahren zur Bestimmung der effektorischen Wirkung einer Testsubstanz bezüglich der Aktivität einer GSAAT, worin man (a) die enzymatische Aktivität der GSAAT in Abwesenheit einer Testsubstanz bestimmt; (b) die enzymatische Aktivität der GSAAT in Anwesenheit einer Testsubstanz bestimmt; und (c) die unter (a) und (b) ermittelten enzymatischen Aktivitäten vergleicht.

Description

Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit veränderter 5-Aminolävulinsäure-Biosynthese und Verfahren zur Identifizierung von Effektoren der 5-Aminolävulinsäure Synthese
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen und Pflanzen mit veränderter 5-Aminolävulinsäure-Biosynthese, die Verwendung von Nukleinsäuremolekülen kodierend für ein Protein mit der Funktion einer 5- Aminolävulinsäure Synthase (ALAS) zur Herstellung transgener Pflanzenzellen und Pflanzen, Verfahren zur Identifizierung von Effektoren der und die Verwendung von Effektoren der 5-Aminolävulinsäure-Biosynthese, insbesondere die Verwendung von herbizid wirksamen Inhibitoren der pflanzlichen 5-Aminolävulinsäure-Biosynthese in Pflanzenkulturen, vorzugsweise in transgenen Pflanzenkulturen.
Der Einsatz von Herbiziden zur Kontrolle von unerwünschtem Pflanzenwuchs auf landwirtschaftlichen Kulturflächen ist in der modernen Landwirtschaft weit verbreitet. Trotz des Einsatzes von Herbiziden ist eine effiziente Kontolle von Unkräutern und Schadpflanzen nicht immer zufriedenstellend möglich, da hochwirksame Herbizide mit einem breiten Wirkungsspektum oft eine Unverträglichkeit bei Nutzpflanzen aufweisen oder auch die Enstehung von Resistenzphänomenen beobachtet werden kann.
Diese Nachteile versuchte man bisher durch Nutzpflanzen zu umgehen, die gegenüber nicht selektiv wirksamen Herbiziden tolerant sind. Die Herbizidtoleranz kann erzeugt werden, indem das pflanzliche Enzym, welches durch das ausgewählte Herbizid inhibiert wird, derart verändert wird, daß es weniger empfindlich gegenüber dem herbiziden Wirkstoff ist. Beispielsweise sind in der WO 95/3459 Pflanzen beschrieben, die Gene von Varianten der Protoporphyrinogen Oxidase exprimieren und dadurch eine erhöhte Toleranz gegenüber herbiziden Diphenylethem und anderen Inhibitoren der pflanzlichen Protoporphyrinogen Oxidase besitzen.
Herbizidtoleranz wurde ebenfalls durch die Einführung von Enzymen auf gentechnologischem Wege in den Stoffwechsel von Kulturpflanzen erreicht, welche den applizierten herbiziden Wirkstoff deaktivieren können (z. B. EP-A-0 242 236; EP-A-0 343 100).
Es ist bekannt, daß die Biosynthese von 5-Aminolävulinsäure (ALA) ein geschwindigkeitsbestimmender und regulierender Stoffwechselschritt für die Synthese von Porphyrinen in Pflanzen, Tieren, Pilzen und Bakterien ist. Bei Pflanzen und den meisten Prokaryonten, mit Ausnahme der alpha-Gruppe der Purpurbakterien, wird ALA über den sogenannten C5-Stoffwechselweg aus Glutamat hergestellt. Der C5-Stoffwechselweg (C5-Weg) besteht aus drei Reaktionsschritten, katalysiert durch die Enzyme Glutamyl-tRNA Synthetase (EC 6.1.1.17), Glutamyl-tRNA Reduktase (EC 1.2.1.-.) und Glutamat-1-semialdehyd Aminotransferase (GSAAT, EC 5.4.3.8.) und ist bei Pflanzen in den Piastiden lokalisiert.
Die GSAAT wurde aus verschiedenen Organismen isoliert und die Strukturgene des Enzyms kloniert, z. B. aus den Pflanzen Arabidopsis thaliana, Tabak, Gerste und Sojabohne.
Die pflanzliche GSAAT kann durch heterologe Expression ihrer cDNA rekombinant produziert werden (Berry-Lowe et al. (1992) Plant Physiol. 99:1597-1603).
Die GSAAT wird durch 3-Amino-2,3-dihydrobenzoesäure inhibiert. Nach Applikation von 3-Amino-2,3-dihydrobenzoesäure können die behandelten Pflanzen keine ALA und somit auch nicht mehr die Porphyrinverbindungen Chlorophyll, Häm und Sirohäm synthetisieren (Beale (1990) Plant Physiology 93:1273-1279). Solche Pflanzen entwickeln stark chlorotisches Gewebe, welches im Licht zerstört wird. Ein alternativer Biosyntheseweg zur Herstellung von ALA existiert in Tieren, Pilzen, Hefen und den Purpurbakterien der alpha-Gruppe, z. B. Rhodobacter sphaeroides oder Rhodobacter capsulatus. Bei diesem als Shemin-Stoffwechselweg bezeichneten Syntheseweg werden Succinyl-CoA und Glycin in einem einzigen Reaktionsschritt, katalysiert durch das Enzym 5-Aminolävulinsäure Synthase (ALAS, EC 2.3.1.37.), zu ALA kondensiert (Kikuchi et al. (1958) Journal of Biological Chemistry 233:1214-1219). Bei Eukaryonten laufen die Reaktionsschritte des Shemin-Stoffwechselweges in den Mitochondrien ab.
Die ALAS wurde aus einer Vielzahl von Organismen isoliert. Das Strukturgen der ALAS wurde unter anderem auch aus Saccharomyces cerevisiae, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, dem Menschen und der Maus isoliert.
Als erstes Enzym des Shemin Tetrapyrrol-Biosyntheseweges wurde die ALAS schon früh bezüglich ihrer Regulation auf Transkriptions- und auf Enzymaktivitäts-Ebene untersucht (Lascelles (1968) Biochem. Soc. Symp. 28:49-59, Garnick et al. (1975) Journal of Biological Chemistry 250:9215-9225). Insbesondere bei prokaryontischen 5-Aminolävulinat Synthasen wurde festgestellt, daß Häm ein wichtiger direkter feedback-Regulator der enzymatischen Aktivität ist.
Aufgabe war es, ein praxistaugliches Resistenzprinzip gegen Inhibitoren der pflanzlichen 5-Aminosäurelävulinsäure-Synthese und eine rationale, praxistaugliche Methode zum Auffinden solcher Inhibitoren bereitzustellen.
Die Einführung einer heterologen ALAS-Aktivität in Tabakpflanzen unter Verwendung der cDNA der ALAS aus Saccharomyces cerevisiae (Seq. ID Nr. 4) wurde bereits von Zavgorodnyaya et al. beschrieben (1997, Plant Journal 12.169- 178).
Die Syntheserate von ALA in der Pflanze muß jedoch ausreichend sein, um den Bedarf an ALA für die phyiologisch notwendige Porphyrinbiosynthese sicherzustellen. Die Produktion von ALA darf jedoch andererseits nicht so hoch liegen, daß eine direkte oder indirekte Schädigung der Pflanze erfolgt. Deshalb wird der C5-Biosyntheseweg für ALA in Pflanzen reguliert.
In ähnlicher Weise muß in den transgenen Pflanzen, welche eine heterologe ALAS- Aktivität enthalten, gewährleistet sein, daß die Synthese von ALA keine schädlichen Folgen für die Pflanzen bewirkt.
Es wurde nun überraschend gefunden, daß man Pflanzen herstellen kann, die resistent gegenüber herbizid wirksamen Inhibitoren des C5-Stoffwechselweges sind, z.B. gegen Inhibitoren der GSAAT, wenn man bestimmte heterologe ALAS-Gene in Nutzpflanzen substitutiv oder komplementierend exprimiert, so daß man nicht selektiv wirksame Inhibitoren des C5-Stoffwechselweges als Herbizide in besagten transgenen Nutzpflanzenkulturen einsetzen kann.
Mit der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit veränderter 5-Aminolävulinsäure-Biosynthese bereitgestellt, in welchen der durch ein Herbizid spezifisch inhibierte Stoffwechselweg durch eine die Hemmung komplementierende oder substituierende, heterologe Genexpression umgangen wird. Für eine geeignete Komplementierung oder Substitution werden die Pflanzen mittels eines oder mehrerer heterologer Nukleinsäuremoleküle mit einem oder mehreren zusätzlichen oder alternativen Biosyntheseschritten ausgestattet, die zu dem Endprodukt des inhibierten Stoffwechselweges führen, so daß eine Resistenz der transgenen Pflanze gegenüber dem herbizid wirksamen Inhibitor des C5-Stoffwechselweges resultiert.
In Pflanzen verläuft die Biosynthese von ALA ausschließlich über den im Chloroplasten lokalisierten C5-Weg. Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß transgene Pflanzen, welche eine heterologe ALAS-Aktivität enthalten, unabhängig von der Aktivität des C5-Weges Aminolävulinsäure für die Chlorophyll- und Hämbiosynthese produzieren können.
Dieser alternative Stoffwechselweg verleiht den transgenen Pflanzen, die über eine ALAS-Aktivität verfügen, die erwünschte Resistenz gegenüber nichtselektiven Herbiziden, welche die Bildung der Aminolävulinsäure innerhalb des C5-Wegs inhibieren, z.B. durch Hemmung des Enzyms GSAAT, indem der durch den herbiziden Wirkstoff blockierte Stoffwechselschritt umgangen wird. Eine Resistenz mittels der heterologen ALAS-Aktivität ist in den transgenen Pflanzen ebenfalls gegenüber Inhibitoren der Glutamyl-tRNA Reduktase zu erhalten.
Erfindungsgegenstand ist daher ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, transgener Pflanzenzellen, transgener Pflanzenteile, transgener Pflanzensamen, transgenen Vermehrungsguts mit veränderter 5-Aminolävulinsäure-Biosynthese, enthaltend ein oder mehrere funktioneil aktive Nukleinsäuremoleküle kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS ausgewählt aus der Gruppe der feedbackregulierten ALAS, tierischen ALAS und bakteriellen ALAS, vorzugsweise einer feedback-regulierten ALAS , besonders bevorzugt von ALAS aus Purpurbakterien, von aktiven Fragmenten daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon, die nach einem an sich bekannten Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzenzellen oder Pflanzen, Pflanzenteile, Pflanzensamen oder Vermehrungsguts stabil in das pflanzliche Genom integriert sind.
Genom im Sinne dieser Erfindung beinhaltet das gesamte Erbmaterial einer Pflanze, d.h. neben der Kern-DNA auch das genetische Material aller Organellen der pflanzlichen Zellen.
Ebenso überraschend wurde gefunden, daß man monokotyle Pflanzen, insbesondere Maispfianzen, herstellen kann, die resistent gegenüber herbizid wirksamen Inhibitoren des C5-Stoffwechselweges sind, z.B. gegen Inhibitoren der GSAAT, wenn man heterologe ALAS-Gene in diesen Nutzpflanzen substitutiv oder komplementierend exprimiert, so daß man nicht selektiv wirksame Inhibitoren des C5-Stoffwechselweges als Herbizide in den besagten transgenen Nutzpflanzenkulturen einsetzen kann.
Dies war umso überraschender, als dem Fachmann bekannt ist, daß auf Grund der großen Unterschiede zwischen monokotylen und dikotylen Pflanzen sich Effekte, die in dikotylen Pflanzen beobachtet werden, im allgemeinen nicht ohne weiteres auf monokotyle Pflanzen in gleichem Maße übertragen lassen.
Ebenso Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, transgener Pflanzenzellen, transgener Pflanzensamen, transgenen Vermehrungsguts mit veränderter 5-Aminolävulinsäure-Biosynthese, enthaltend ein oder mehrere funktionell aktive Nukleinsäuremoleküle kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS, vorzugsweise einer feedback-regulierten ALAS, besonders bevorzugt von ALAS aus Purpurbakterien, von aktiven Fragmenten daraus oder eine antisense oder komplementären Sequenz davon, die nach einem an sich bekannten Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzenzellen oder Pflanzen, Pflanzenteile, Pflanzensamen oder Vermehrungsguts stabil in das pflanzliche Genom integriert sind, dadurch gekennzeichnet, daß die transgene Pflanze eine monokotyle Pflanze, vorzugsweise eine Maispflanze ist.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist die Verwendung mindestens eines Nukleinsäuremoleküls (NS) kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS, ausgewählt aus der Gruppe der feedback-regulierten ALAS, tierischen ALAS und bakteriellen ALAS, vorzugsweise einer feedback-regulierten ALAS, besonders bevorzugt einer ALAS aus Purpurbakterien, eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon zur Herstellung von transgenen Pflanzenzellen oder Pflanzen mit veränderter 5-Aminolävulinsäure- Biosynthese, vorzugsweise zur Expression eines Proteins mit der Funktion einer erfindungsgemäßen ALAS oder eines aktiven Fragments daraus in transgenen Pflanzenzellen oder Pflanzen oder auch bevorzugt zur Herstellung von transgenen Pflanzenzellen oder Pflanzen, deren Expression eines Proteins mit der Funktion einer GSAAT oder eines aktiven Fragments daraus supp miert oder inhibiert ist.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist die Verwendung mindestens eines Nukleinsäuremoleküls (NS) kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS, vorzugsweise einer feedback-regulierten ALAS, besonders bevorzugt einer ALAS aus Purpurbakterien, eines aktiven Fragments daraus oder eine antisense oder komplementären Sequenz davon zur Herstellung von transgenen Pflanzenzellen oder Pflanzen mit veränderter 5-Aminolävulinsäure-Biosynthese, vorzugsweise zur Expression eines Proteins mit der Funktion einer erfindungsgemäßen ALAS oder eines aktiven Fragments daraus in transgenen Pflanzenzellen oder Pflanzen oder auch bevorzugt zur Herstellung von transgenen Pflanzenzellen oder Pflanzen, deren Expression eines Proteins mit der Funktion einer GSAAT oder eines aktiven Fragments daraus supphmiert oder inhibiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß die transgene Pflanze eine monokotyle Pflanze, vorzugsweise eine Maispflanze ist.
Für die Herstellung von transgenen Pflanzen, die in der Lage sind, mittels des Shemin-Stoffwechselweges ALA herzustellen, können verschiedene, literaturbekannte Gene kodierend für Proteine mit ALAS-Aktivität eingesetzt werden.
So sind Nukleinsäuresequenzen kodierend für Proteine mit ALAS-Aktivität geeignet, die abgeleitet sind aus Aminosäuresequenzen von Proteinen mit ALAS-Aktivität oder deren Genen aus z.B. Tieren und Bakterien, oder allgemein von feedbackregulierten ALAS aus prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen oder deren aktiver Fragmente, z.B. die ALAS aus den Purpurbakterien der alpha-Gruppe wie Rhodobacter sphaeroides, Seq. ID Nr. 1 oder Seq. ID Nr. 2, (Neidle & Kaplan (1993) Journal of Bacteriology 175: 2292-2303) oder Rhodobacter capsulatus, Seq. ID Nr. 3 (Hornberger et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 221 : 371-378). Eine balancierte Synthese von ALA kann z.B. auf folgende Weise gewährleistet werden, so daß der Begriff feedback-reguliert im Zusammenhang mit der biologischen Aktivität der ALAS wie nachstehend erläutert zu verstehen ist:
Zum einen können bevorzugt Nukleinsäuren (NS) kodierend für Proteine mit ALAS- Aktivität , die eine ausgeprägte Feedback-Regulation durch Häm aufweisen, zur Transformation von Pflanzen eingesetzt werden. Häm ist neben Chlorophyll ein wesentliches aus ALA gebildetes Produkt. Die Syntheserate von Häm ist wie die Synthese aller anderen Tetrapyrrole an die Bereitstellung von ALA gekoppelt und spiegelt somit die Synthesekapazität für das Intermediat ALA und damit indirekt auch den möglichen Substratfluß in die Chiorophyllbiosynthese wider. Zur heterologen Expression feedback-regulierter Enzyme mit ALAS-Aktivität in Pflanzen sind daher beispielsweise, aber nicht ausschließlich, ALAS-kodierende NS aus Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus und anderen Purpurbakterien der alpha-Gruppe geeignet.
Die Feedback-Regulation der enzymatischen Aktivität einer heterologen ALAS kann in der pflanzlichen Zelle beispielsweise in Piastiden und in den Mitochondrien erfolgen, da in diesen Organellen ausgehend von 5-Aminolävulinat (ALA) die regulatorisch aktiven Verbindungen, beispielsweise Häm, gebildet werden. Deshalb ist es besonders vorteilhaft, eine heterologe NS kodierend für ein Feedbackreguliertes Protein mit ALAS-Aktivität derart zu exprimieren, daß die funktionell intakten Expressionsprodukte (ALAS) in den Piastiden oder Mitochondrien vorliegen.
In Mitochondrien synthetisierte ALA kann durch die in der Pflanze vorhandenen Transportsysteme in die Piastiden exportiert werden, in denen die Enzyme der sich anschließenden Tetrapyrrolbiosynthese lokalisiert sind.
Die Lokalisierung einer ALAS in Piastiden kann z.B. dadurch erreicht werden, daß eine NS kodierend für ein Protein mit ALAS-Aktivität unter Kontrolle eines in Plastiden aktiven Promotors nach den dem Fachmann bekannten Methoden in das Piastom einer Pflanze eingefügt wird. Als Promotoren stehen dabei alle in Plastiden konstitutiv aktiven Promotoren zur Verfügung, vorzugsweise z.B. die Expressions- Signalsequenzen der psM-Kassette (Staub & Maliga (1993) EMBO Journal 12: 601 -606; Zoubenko et al. (1994) Nucleic Acids Research 22:3819-3824) und der Prrn Promotor (Svab & Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 913-917).
Die Promotoren können z.B. nach bekannten Methoden zusammen mit der heterologen NS kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS in das Piastom insertiert werden oder die heterologe NS wird derart in das Piastom inseriert, daß es unter Kontrolle eines bereits vorhanden Promotors steht (Staub & Maliga (1995) Plant Journal 7: 845-848).
Des weiteren kann eine plastidäre Lokalisierung einer ALAS auch erreicht werden, indem die ALAS zunächst im Cytoplasma mit einer geeigneten plastidären Targetingsequenz (Transitpeptid) synthetisiert und während oder nach ihrer Synthese in den Plastiden importiert wird. Hierfür stehen dem Fachmann zahlreiche Promotoren, plastidäre Targetingsequenzen und Fusionsstrategien für NS kodierend für eine Targetingsequenz und NS kodierend für ein Protein mit ALAS- Aktivität zur Verfügung.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung können alle Promotoren eingesetzt werden, die in der Lage sind, in Pflanzen die Transkription von DNA-Sequenzen zu bewirken. Solche Promotoren sind vorzugsweise abgeleitet aus dem Genom von Pflanzen oder pflanzenpathogenen Viren, z.B. der CaMV35S Promotor sowie dessen Derivate, vorzugsweise aus dem Piastom, ebenso bevorzugt aus Kern-DNA, besonders bevorzugt aus dem Piastom von Pflanzen. Der eingesetzte Promotor muß ein Expressionsniveau des ALAS-Gens ermöglichen, welches ausreicht, um der transgenen Pflanze eine Resistenz gegenüber Inhibitoren des C5- Biosyntheseweges für ALA zu vermitteln. Die NS kodierend für ein Protein mit ALAS-Aktivität wird bevorzugt unter Kontolle eines Promotors als Fusion mit einer DNA-Sequenz kodierend für ein plastidäres Transitpeptid kloniert, so daß das primäre Translationsprodukt N-terminal mit einem plastidären Transitpeptid versehen ist und in Plastiden importiert wird. Als plastidäre Transitpeptide werden dabei bevorzugt solche Peptidsequenzen verwendet, welche als N-terminale Fusion die Translokation von Polypeptidketten aus dem Cytoplasma in Plastiden bewirken und während oder nach diesem Prozeß abgespalten werden. Besonders bevorzugt sei als Transitpeptid für Proteine mit ALAS-Aktivität das Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Ribulosebisphosphat Carboxylase genannt.
Die Lokalisierung einer erfindungsgemäßen ALAS in Mitochondrien kann erreicht werden, indem das Protein zunächst im Cytoplasma mit einer geeigneten mitochondrialen Targetingsequenz synthetisiert und während oder nach seiner Synthese in das Mitochondrium importiert wird. Hierfür stehen dem Fachmann ebenfalls zahlreiche Promotoren, mitochondriale Targetingsequenzen und Fusionsstrategien für Sequenzen kodierend für eine Targetingsequenz und Sequenzen kodierend für ein Protein mit ALAS-Aktivität zur Verfügung.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung können die gleichen Promotoren eingesetzt werden, die für die Lokalisierung der Expressionsprodukte im Plastiden beschrieben wurden.
Die NS kodierend für ein Protein mit ALAS-Aktivität wird bevorzugt unter Kontolle eines Promotors als Fusion mit einer DNA-Sequenz kodierend für ein mitochondriales Transitpeptid kloniert, so daß das primäre Translationsprodukt N- terminal mit einem mitochondrialen Transitpeptid versehen ist und in Mitochondrien importiert wird.
Als mitochondriale Transitpeptide werden dabei bevorzugt solche Peptidsequenzen verwendet, welche als N-terminale Fusion die Translokation von Polypeptidketten aus dem Cytoplasma in Mitochondrien bewirken und während oder nach diesem Prozeß abgespalten werden.
Daher ist ein weiterer Erfindungsgegenstand ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, transgener Pflanzenzellen, transgener Pflanzenteile, transgener Pflanzensamen, transgenen Vermehrungsguts mit veränderter 5-Aminolävulinsäure-Biosynthese enthaltend ein oder mehrere funktionell aktive Nukleinsäuremoleküle kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS, ausgewählt aus der Gruppe der feedback-regulierten ALAS, tierischen ALAS und bakteriellen ALAS, vorzugsweise einer feedback-regulierten ALAS, besonders bevorzugt von ALAS aus Purpurbakterien, von aktiven Fragmenten daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon, in dem besagte Nukleinsäuremoleküle unter der Kontrolle eines feedback-regulierten Promotors stehen sowie die Verwendung eines feedback-regulierten Promotors, vorzugsweise eines Promotors einer pflanzlichen GSAAT oder Glutamyl-tRNA Reduktase in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen oder Pflanzen mit veränderter 5-Aminolävulinsäure-Biosynthese.
Ebenso Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, transgener Pflanzenzellen, transgener Pflanzenteile, transgener Pflanzensamen, transgenen Vermehrungsguts mit veränderter 5-Aminolävulinsäure- Biosynthese enthaltend ein oder mehrere funktioneile aktive Nukleinsäuremoleküle kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS, vorzugsweise einer feedback-regulierten ALAS, besonders bevorzugt von ALAS aus Purpurbakterien, von aktiven Fragmenten daraus oder eine antisense oder komplementären Sequenz davon, in dem besagte Nukleinsäuremoleküle unter der Kontrolle eines feedbackregulierten Promotors stehen sowie die Verwendung eines feedback-regulierten Promotors, vorzugsweise eines Promotors einer pflanzlichen GSAAT oder Glutamyl- tRNA Reduktase in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen oder Pflanzen mit veränderter 5-Aminolävulinsäure- Biosynthese, dadurch gekennzeichnet, daß die transgene Pflanze eine monokotyle Pflanze, vorzugsweise eine Maispflanze ist.
Zum anderen ist es besonders vorteilhaft, das erfindungsgemäße ALAS-Gen unter Kontrolle eines in Pflanzen spezifisch regulierten Promotors zu klonieren, um eine gezielte, feedback-regulierte Expression zu erreichen. Dazu eignen sich beispielsweise die Promotoren der Enzyme der pflanzlichen Porphyrinbiosynthese, vorzugsweise die Promotoren der Gene kodierend für Glutamyl-tRNA Reduktase und GSAAT, z.B. durch Verwendung von Promotorsequenzen die im Bereich von ca. 2 kb (kilobasen) langen, strangaufwärts gelegenen (in 3'-Richtung) Nukleinsäureabschnitten der kodierenden Bereiche besagter Gene liegen. Unter der Kontrolle eines dieser Promotoren kann erreicht werden, daß die NS kodierend für ein heterologes Protein mit ALAS-Aktivität ebenso wie die pflanzlichen Gene kodierend für Glutamyl-tRNA Reduktase und GSAAT nur bei einem physiologischen Bedarf an ALA exprimiert wird.
Darüber hinaus ist auch die kombinierte Verwendung einer NS kodierend für eine auf Protein- und Genexpressionsebene feedback-regulierte ALAS besonders vorteilhaft, d.h. sowohl ein ALAS-Protein zu exprimieren, das eine feedbackregulierte enzymatische Aktivität aufweist, als auch die Genexpression der feedback-regulierten ALAS unter die Kontrolle eines feedback-regulierten Promotors zu stellen.
NS kodierend für Proteine mit ALAS-Aktivität können aus tierischen, pilzlichen oder geeigneten bakteriellen Organismen isoliert oder synthetisch hergestellt werden. Die Nukleinsäuremoleküle werden vorzugsweise mittels gängiger molekularbiologischer Methoden (Ausubel et al. in "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc., ISBN 0-471 -50338-X) ausgehend von DNA oder RNA aus dem jeweiligen Spenderorganismus kloniert werden. Die NS können mittels gängiger molekularbiologischer Methoden auch in vielfältiger Weise in ihrer Sequenz abgeändert, verkürzt oder erweitert werden, so daß eine De vatisierung, z.B. durch Mutation, Deletion, Substitution oder Insertion erfolgen kann.
Gegenstand der Erfindung sind auch nicht-natürlich vorkommende Chimäre Gene, mindestens enthaltend einen für die Expression einer erfindungsgemäßen ALAS in Pflanzen geeigneten Promotor, der funktionell mit einem DNA-Molekül kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS oder eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon fusioniert ist.
Gegenstand der Erfindung sind auch rekombinante Vektoren, insbesondere Plasmide, Cosmide, Viren und andere in der Gentechnik gängige Vektoren, enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes nicht-natürlich vorkommendes chimäres Gen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in den Vektoren enthaltenen Nukleinsäuremoleküle verknüpft mit regulatorischen Elementen, die die Transkription und Synthese einer translatierbaren RNA in pflanzlichen Zellen gewährleisten.
Gegenstand der Erfindung sind auch transgene Pflanzenzellen, die mit einem DNA- Molekül kodierend für ein Protein mit der Funktion einer erfindungsgemäßen ALAS oder eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon oder einem erfindungsgemäßen Chimären Gen oder Vektor transformiert und/oder genetisch modifiziert sind, sowie Zellen, die von derart transformierten und/oder modifizierten Zellen abstammen, die ein erfindungsgemäß zu verwendendes Nukleinsäuremolekül oder einen erfindungsgemäßes Gen oder Vektor enthalten.
Ebenso Gegenstand der Erfindung sind transgene Pflanzenzellen, die mit einem DANN-Moleküle kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS oder eines aktiven Fragments daraus oder eine antisense oder komplementären Sequenz davon oder einem erfindungsgemäßen Chimären Gen oder Vektor transformiert und/oder genetisch modifiziert sind, sowie Zellen, die von derart transformierten und/oder modifizierten Zellen abstammen, die ein erfinduπgsgemäß zu verwendendes Nukleinsäuremolekül oder einen erfindungsgemäßes Gen oder Vektor enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß die transgene Pflanze einen monokotylen Pflanze, vorzugsweise eine Maispflanze ist.
Gegenstand der Erfindung sind auch transgene Pflanzen, transgene Pflanzenzellen, transgene Pflanzenteile, transgene Pflanzensamen, transgenes Vermehrungsgut, herstellbar, d.h. erhältlich, vorzugsweise erhalten, nach einem erfindungsgemäßen Verfahren, enthaltend ein DNA-Molekül kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS ausgewählt aus der Gruppe der feedback-regulierten ALAS, tierischen ALAS und bakteriellen ALAS, oder eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon, insbesondere Nutz- oder Zierpflanzen.
Gegenstand der Erfindung sind auch transgene Pflanzen, transgene Pflanzenzellen, transgene Pflanzenteile, transgene Pflanzensamen, transgenes Vermehrungsgut, herstellbar, d.h. erhältlich, vorzugsweise erhalten, nach einem erfindungsgemäßen Verfahren, enthaltend ein DNA-Molekül kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS , oder eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon, insbesondere Nutz- oder Zierpflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß die transgene Pflanze eine monokotyle Pflanze, vorzugsweise einer Maispflanze ist.
Derartige Pflanzenzellen enthalten ein oder mehrere erfindungsgemäß zu verwendende(s) Nukleinsäuremolekül(e), wobei diese(s) vorzugsweise mit regulatorischen DNA-Elementen verknüpft ist/sind, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten, insbesondere mit einem Promotor.
Derartige Zellen lassen sich von natürlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen dadurch unterscheiden, daß sie mindestens ein erfindungsgemäßes chimäres Gen enthalten, das natürlicherweise in diesen Zellen nicht vorkommt, oder dadurch, daß ein solches Molekül an einem Ort im Genom der Zelle integriert vorliegt, an dem es natürlicherweise nicht vorkommt, d.h. in einer anderen genomischen Umgebung.
Zur Transformation von Pflanzen werden geeignete NS-Konstrukte hergestellt, die eine translatierbare Sequenz kodierend für ein Protein mit ALAS-Aktivität enthalten.
Dem in der Pflanzenbiotechnologie erfahrenen Fachmann stehen vielfältige Techniken zur Verfügung, um geeignete DNA-Konstrukte zur Expression eines heterologen Gens in Pflanzen herzustellen und Pflanzen mit diesem DNA-Konstrukt zu transformieren. Derartige DNA-Konstrukte werden bevorzugt durch Klonierung einer DNA-Sequenz kodierend für ALAS unter Kontrolle eines pflanzlichen Promotors in einem Pflanzen-Transformationsvektor hergestellt. Besonders bevorzugt sind hierfür binäre Pflanzen-Transformationsvektoren wie z. B. pBIB oder pPCV801 und deren Derivate geeignet.
Das Gen kodierend für ein Protein mit ALAS-Aktivität kann auch ohne eine DNA- Sequenz kodierend für ein N-terminales plastidäres oder mitochondriales Targetingpeptid unter Kontrolle eines in Pflanzen aktiven Promotors in das pflanzliche Genom insertiert werden, so daß das primäre Translationsprodukt direkt im Cytoplasma zum aktiven Protein exprimiert wird.
Mit einem der oben beschriebenen DNA-Konstrukte, welches zur funktioneilen Expression eines Gens kodierend für ein Protein mit ALAS-Aktivität in Pflanzen geeignet ist, werden Pflanzenzellen oder Plastiden transformiert. Bevorzugt wird dazu eine der gängigen gentechnologischen Methoden zur Transformation von Pflanzen (beispielsweise Potrykus & Spangenberg (Eds.) "Gene Transfer to Plants" (1995) Springer-Verlag ISBN 3-540 58406-4) oder Plastiden (beispielsweise Zoubenko et al. (1994) Nucleic Acids Research 22:3819-1824) eingesetzt. Ebenfalls ein Erfindungsgegenstand ist daher ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, transgener Pflanzenzellen, transgener Pflanzenteile, transgener Pflanzensamen, transgenen Vermehrungsguts mit veränderter 5- Aminolävulinsäure-Biosynthese enthaltend ein oder mehrere funktionell aktive Nukleinsäuremoleküle kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS, ausgewählt aus der Gruppe der feedback-regulierten ALAS, tierischen ALAS und bakteriellen ALAS, vorzugsweise einer feedback-regulierten ALAS, besonders bevorzugt von ALAS aus Purpurbakterien, von aktiven Fragmenten daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon, in dem besagte Nukleinsäuremoleküle durch Piastidentransformation stabil in das pflanzliche Piastom integriert werden.
Ebenfalls ein Erfindungsgegenstand ist daher ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, transgener Pflanzenzellen, transgener Pflanzenteile, transgener Pflanzensamen, transgenen Vermehrungsguts mit veränderter 5- Aminolävulinsäure-Biosynthese enthaltend ein oder mehrere funktionell aktive Nukleinsäuremoleküle kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS, besonders bevorzugt von ALAS aus Purpurbakterien, von aktiven Fragmenten daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon, in dem besagte Nukleinsäuremoleküle durch Piastidentransformation stabil in das pflanzliche Piastom integriert werden, dadurch gekennzeichnet, daß die transgene Pflanze eine monokotyle Pflanze, vorzugsweise eine Maispflanze ist.
Als Empfänger-Pflanzen für ein heterologes Gen kodierend für ein Protein mit ALAS-Aktivität kommen alle landwirtschaftlich wichtigen monokotylen und dikotylen, vorzugsweise monokotylen Kulturpflanzen in Betracht, in denen herbizide Inhibitoren des C5-Stoffwechselweges zur Kontrolle unerwünschter Begleitvegetation eingesetzt werden können, vorzugsweise Mais und andere Getreide, wie beispielsweise Weizen, Roggen, Gerste, Hirse und Reis sowie Baumwolle, Tabak, Zuckerrüben, Zuckerrohr, Kartoffeln, Raps, Sonnenblumen, Sojabohnen, Gemüse und Obst. Bei der Expression der erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremoleküle in Pflanzen besteht grundsätzlich die Möglichkeit, daß das synthetisierte Protein in jedem beliebigen Kompartiment der pflanzlichen Zelle lokalisiert sein kann. Um die Lokalisation in einem bestimmten Kompartiment zu erreichen, kann die kodierende Region gegebenenfalls mit DNA-Sequenzen verknüpft werden, die die Lokalisierung in dem jeweiligen Kompartiment gewährleisten. Derartige Sequenzen sind bekannt (siehe beispielsweise Braun et al., EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald et al., Plant J. 1 (1991 ), 95-106).
Die transgenen Pflanzenzellen können nach dem Fachmann bekannten Techniken zu ganzen Pflanzen regeneriert werden. Die durch Regeneration der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen erhältlichen Pflanzen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ferner sind Gegenstand der Erfindung Pflanzen, die die oben beschriebenen transgenen Pflanzenzellen enthalten. Bei den transgenen Pflanzen kann es sich prinzipiell um Pflanzen jeder beliebigen Pflanzenspezies handeln, d.h. sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen. Bevorzugt handelt es sich um Nutz- oder Zierpflanzen wie z.B. Getreidearten (Roggen, Gerste, Hafer, Weizen, Reis, Mais), Obst- und Gemüsearten, Maniok, Kartoffel, Soja, Zuckerrübe etc..
Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial der erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge und Stecklinge.
Zur Expression der erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuremoleküle in sense-Orientierung in pflanzlichen Zellen werden diese mit regulatorischen DNA- Elementen verknüpft, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Hierzu zählen insbesondere Promotoren. Generell kommt für die Expression jeder in pflanzlichen Zellen aktive Promotor in Frage. Der Promotor kann dabei so gewählt sein, daß die Expression konstitutiv erfolgt oder nur in einem bestimmten Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung oder zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt. In bezug auf die Pflanze kann der Promotor homolog oder heterolog sein. Geeignete Promotoren sind z.B. der Promotor der 35S RNA des Cauliflower Mosaic Virus und der Ubiquitin-Promotor aus Mais für eine konstitutive Expression, der Patatingen-Promotor B33 (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) für eine sink-spezifische Expression (z.B. Kartoffelknollen, Rüben, Tomatenfrucht) oder ein Promotor, der eine Expression lediglich in photosynthetisch aktiven Geweben sicherstellt, z.B. der ST-LS1 -Promotor (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451 ), alle in Plastiden konstitutiv aktiven Promotoren, z.B. die Expressions-Signalsequenzen der psM-Kassette (Staub & Maliga (1993) EMBO Journal 12: 601-606; Zoubenko et al. (1994) Nucleic Acids Research 22:3819-3824) und der Prrn Promotor (Svab & Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 913-917), oder für eine endosperm- spezifische Expression der HMG-Promotor aus Weizen, der USP-Promotor, der Phaseolinpromotor oder Promotoren von Zein-Genen aus Mais. Ferner kann eine Terminationssequenz vorhanden sein, die der korrekten Beendigung der Transkription dient sowie der Addition eines Poly-A-Schwanzes an das Transkript, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (vgl. Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) und sind im allgemeinen beliebig austauschbar.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien und pACYC184. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E. coli-Zellen verwendet. Transformierte E. coli- Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch- molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA- Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, das Einbringen von DNA mittels der biolistischen Methode etc..
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z.B. PUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z.B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.
Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid enthalten, das eine vir-Region trägt. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig; zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.
Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist ausführlich in EP 120 516 beschrieben; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sei., 4, 1-46 und An et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z.B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA unter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch Protoplastentransformation sind bekannt (vgl. z.B. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim).
Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes, die elektrisch oder chemisch induzierte DNA-Aufnahme in Protoplasten, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen, die Makroinjektion von DNA in Blütenstände, die Mikroinjektion von DNA in Mikrosporen und Pro-Embryonen, die DNA-Aufnahme durch keimenden Pollen und die DNA-Aufnahme in Embryonen durch Quellung (zur Übersicht: Potrykus, Physiol. Plant (1990), 269 - 273).
Während die Transformation dikotyler Pflanzen über Ti-Plasmid-Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, daß auch monokotyle Pflanzen der Transformation mittels Agrobacterium basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491 -506; Hiei et al., Plant J. 6 (1994), 271-282; Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987), 5345 - 5349; Raineri et al., Bio/Technology 8 (1990), 33 - 38; Gould et al., Plant Physiol. 95 (1991 ), 426 - 434; Mooney et al. Plant Cell Tiss. & Org. Cult. 25 (1991 ), 209 - 218; Li et al., Plant Mol. Biol. 20 (1992), 1037 - 1048).
Drei der oben genannten Transformationssysteme konnten in der Vergangenheit für verschiedene Getreide etabliert werden: die Elektroporation von Gewebe, die Transformation von Protoplasten und der DNA-Transfer durch Partikel-Beschluß in regenerierbare Gewebe und Zellen (Jahne et al, Euphytica 85 (1995), 35 - 44).
Die Transformation von Weizen wird in der Literatur verschiedentlich beschrieben (zur Übersicht: Maheshwari et al, Critical Reviews in Plant Science 14 (2) (1995), 149 - 178), vgl. auch Hess et al. (Plant Sei. 72 (1990), 233), Vasil et al. (Bio/Technology 10 (1992), 667 - 674), Weeks et al. (Plant Physiol. 102 (1993), 1077 - 1084) sowie Becker et al. (Plant J. 5(2) (1994), 299 - 307). Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzelleπ Resistenz gegenüber einem Biozid, wie Phosphinothricin, oder einem Antibiotikum, wie Kanamycin, G 418, Bleomycin oder Hygromycin u.a. vermittelt. Der individuelle gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten. Erfindungsgemäße transformierte Zellen enthalten inhärent einen Marker gegenüber Inhibitoren der GSAAT.
Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al. Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften. Von den Pflanzenzellen können Samen gewonnen werden.
Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.
Eine praktische Nutzung der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen kann in Verbindung mit einem Herbizid erfolgen, dessen Wirkmechanismus, zumindest teilweise, auf einer Inhibition der GSAAT und damit des C5-Weges beruht.
Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zum Bekämpfen von unerwünschtem Pflanzenwuchs in Nutzpflanzenkulturen, dadurch gekennzeichnet.daß man eine Nutzpflanze einsetzt, die ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle, kodierend für ein Protein einer erfindungsgemäßen ALAS, aufweist und auf den Ort dieser Pflanze, die Pflanze selbst oder deren Vermehrungsgut ein herbizides Mittel aufbringt, dessen Wirkmechanismus zumindest teilweise auf einer, vorzugsweise spezifischen, Inhibition der GSAAT beruht.
Die rationale Entwicklung solcher Herbizide ist ebenso Gegenstand der Erfindung.
Es wurde gefunden, daß man herbizide Inhibitoren des pflanzlichen C5-Weges finden kann, wenn man den Einfluß einer chemischen Verbindungen auf die Aktivität der pflanzlichen GSAAT bestimmt und in Einzel- oder Reihenuntersuchungen chemisch diverse Verbindungen durchmustert. Durch Automatisierung eines geeigneten GSAAT-Aktivitätstests läßt sich auf diese Weise eine große Anzahl von Verbindungen untersuchen und das Verfahren damit praxistauglich gestalten.
Erfindungsgegenstand ist daher auch ein, vorzugsweise automatisiertes, Verfahren zur Bestimmung der effektorischen Wirkung einer Testsubstanz bezüglich der Aktivität einer GSAAT, worin man a) die enzymatische Aktivität der GSAAT in Abwesenheit einer Testsubstanz bestimmt; b) die enzymatische Aktivität der GSAAT in Anwesenheit einer Testsubstanz bestimmt; und c) die unter a) und b) ermittelten enzymatischen Aktivitäten vergleicht.
Das Verfahren ist geeignet, spezifische Inhibitoren oder Aktivatoren (d.h. Effektoren) der enzymatischen Aktivität der GSAAT aufzufinden, so daß u.a. Stoffe identifiziert werden können, welche eine potentielle herbizide bzw. wachstumshemmende, aber auch wachstumsfördernde Wirkung besitzen. Die zu untersuchende chemische Verbindung wird dabei bevorzugt in Konzentrationen zwischen 10"9 M und 10"3 M, und besonders bevorzugt in Konzentrationen zwischen 10"7 M und 10"4 M eingesetzt.
Die Quantifizierung der Enzyminhibition oder Enzymaktivierung (d.h. der effektorischen Wirkung) kann durch einen einfachen Vergleich der katalytischen Aktivität der GSAAT in Abwesenheit und in Anwesenheit der zu untersuchenden Testsubstanz unter ansonsten identischen Testbedingungen in einer dem Fachmann bekannten Weise geschehen.
Zur Bestimmung der Aktivität der GSAAT können verschiedene biochemische Meß- Methoden eingesetzt werden, durch die entweder die Entstehung der Reaktionsprodukte der von der GSAAT katalysierten Reaktion, z. B. ALA, oder aber eine Abnahme der Konzentration der Enzymsubstrate wie Glutamatsemialdehyd gemessen werden, z.B. durch eine Endpunktsbestimmung oder nach enzymatischer Umsetzung der Substrate, die gegebenenfalls radioaktiv markiert oder mit anderen gängigen Markern versehen waren oder durch nachgeschaltete Reaktionen nachgewiesen werden können, z.B. durch gekoppelte enzymatische Reaktionen.
Dem in der Durchführung von Enzymtests erfahrenen Fachmann stehen hierfür viele Standardmethoden zur Bestimmung von Enzymaktivitäten zur Verfügung (s. z. B. Bergmeyer, H.U, Methoden der enzymatischen Analyse, Band 1 und 2, Verlag Chemie, Weinheim (1974), Suelter, C.H, Experimentelle Enzymologie: Grundlagen für die Laborpraxis, Fischer Stuttgart (1990)).
Die erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der effektorischen Wirkung von Testsubstanzen können mit gereinigter GSAAT durchgeführt werden, aber auch mit ganzen Zellen eines rekombinanten Organismus, welcher die GSAAT rekombinant exprimiert, mit GSAAT-haltigen Extrakten aus diesem Organismus oder angereicherten GSAAT-haltigen Fraktionen aus diesem Organismus. Als bevorzugter rekombinanter Wirtsorganismus seien Bakterien-, Insekten- und Hefezellen genannt. Alternativ kann auch eine aus Pflanzengewebe oder Pflanzenzellkulturen isolierte GSAAT verwendet werden. Erfindungsgegenstand ist daher auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens sowie die Verwendung eines, vorzugsweise rekombinant hergestellten, Proteins mit der Funktion einer GSAAT zur Identifizierung von Effektoren der GSAAT, vorzugsweise in einem automatisierten Verfahren, z.B. in einem sog. Highthrouput screening, dessen Durchführung die Automatisierbarkeit des Verfahrens zur Aktivitätsbestimmung des Enzyms zur Voraussetzung hat.
Erfindungsgemäße bzw. erfindungsgemäß identifizierte Effektoren, vorzugsweise Inhibitoren, beeinflussen (inhibieren) die Aktivität des Enzyms, vorzugsweise unter den beschriebenen Testbedingungen, vorzugsweise um mindestens 30 %, besonders bevorzugt um mindestens 50 %.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand sind daher mittels der erfindungsgemäßen Verfahren identifizierbare Effektoren, d.h. Aktivatoren oder Inhibitoren der enzymatischen Aktivität der GSAAT, insbesondere pestizid oder herbizid wirksame Effektoren der pflanzlichen GSAAT, speziell Strukturanaloge des Glutamatsemialdehyds, Glutamats oder des 5-Aminolävulinats sowie deren Verwendung als Pestizide oder Herbizide.
Bislang waren neben 3-Amino-2,3-dihydrobenzoesäure nur extrem unselektive Inhibitoren der GSAAT bekannt, wie beispielsweise Aminooxyessigsäure. Die bekannten Inhibitoren sind nicht als Herbizide einsetzbar, da sie eine nicht nur für Pflanzen hohe Toxizität aufweisen. Erst die Entwicklung von spezifischen Inhibitoren des pflanzlichen C5-Stoffwechselweges für 5-Aminolevulinsäure, welche als Herbizide in der Landwirtschaft eingestzt werden können, läßt die Herstellung transgener Kulturpflanzen mit Resistenz gegenüber Inhibitoren des C5-Weges vorteilhaft und ökonomisch sinnvoll erscheinen.
Für die Bestimmung der enzymatischen Aktivität der GSAAT stehen eine Reihe von geeigneten Verfahren zur Verfügung, bei denen man eine GSAAT in einem geeigneten Reaktionspuffer unter geeigneten Reaktionsbedingungen bezüglich Reaktionstemperatur und pH-Wert mit einem geeigneten Substrat, wie z. B. Glutamat-1 -Semialdehyd (GSA), inkubiert. Bevorzugt wird zur Identifikation wirksamer Enzyminhibitoren dabei die GSAAT aus Pflanzen verwendet, besonders bevorzugt die GSAAT aus Arabidopsis thaliana (Seq. ID Nr. 5) oder Hordeum vulgäre (Seq. ID Nr. 6). Die GSAAT kann in einer dem Fachmann bekannten Weise entweder aus den entsprechenden Pflanzen isoliert werden oder auch ausgehend von literaturbekannter cDNA rekombinant in transgenen Wirtszellen produziert werden.
Anstelle von Glutamat-1 -Semialdehyd können als Substrate auch andere Verbindungen, wie z. B. 4,5-Diaminovaleriansäure, 4,5-Dioxovaleriansäure und insbesondere Mischungen dieser Verbindungen, verwendet werden. Die enzymatische Reaktion kann dabei durch Zusatz von Pyridoxalphosphat oder Pyridoxaminphosphat beeinflußt werden.
Eine besonders geeignete, beispielhafte Ausführungsform des GSAAT- Aktivitätstests ist im folgenden dargestellt, die insbesondere auch für eine automatisierte Ausführung des GSAAT-Tests vorteilhaft ist:
Glutamat-1 -Semialdehyd kann in einem Reaktionspuffer im pH-Bereich von pH 6 bis pH 8 von einem Enzym mit GSAAT-Aktivität zu 5-Aminolevulinsäure umgesetzt werden. Die 5-Aminolevulinsäure kann dann mittels zweier Derivatisierungsschritte nachgewiesen werden. Zunächst wird dazu der Lösung eine Verbindung der allgemeinen Formel R-CO-CH2-CO-R', wie beispielsweise Acetylaceton, Acetessigsäure, Amide und Salze der Acetessigsäure, Acetessigsäureester (Methylester, Ethylester, Isopropylester, u.a.) oder Derivate dieser Verbindungen, in mindestens zehnfachem molarem Überschuß zu der erwarteten Menge an 5- Aminolevulinsäure zugesetzt. Die Mischung wird dann beispielsweise für einige Minuten erhitzt (80 °C bis Siedepunkt der Mischung) oder für 15 min oder länger bei 12 °C bis 80 °C inkubiert. Während dieser Inkubationszeit findet eine Kondensationsreaktion zwischen der Aminolevulinsäure und der zugesetzten Verbindung unter Ausbildung eines Pyrrolderivates statt. Anschließend wird die Konzentration des Pyrrolderivates beispielsweise durch Zugabe von Ehrlichs Reagenz (beispielsweise 1 Volumen) bestimmt. Bei dieser Detektionsmethode bildet das Pyrrolde vat mit dem 4-Diaminobenzaldehyd in Ehrlichs Reagenz einen farbigen Komplex, dessen Konzentration photometrisch durch eine Absorptionsmessung bestimmt werden kann. Eine geeignete Wellenlänge zur Absorptionsbestimmung liegt z. B. zwischen 530 und 550 nm. Die enzymatisch gebildete Menge an 5-Aminolevulinsäure kann anhand einer Eichreihe mit 5- Aminolevulinsäure-Lösungen bekannter Konzentrationen, welche in gleicher Weise derivatisiert werden, errechnet werden.
Die geeigneten Zusammensetzungen der Reagenzien oder die Konzentrationen von Salzen, Substraten und Proteinen, die pH-Werte, die Temperaturen, die Ansatzvolumina und die Wellenlängen zur Messung oder bei der Detektion können dabei in weiten Bereichen variieren.
Mittels eines GSAAT-Aktivitätstests kann ein Fachmann auf vielfältige, bekannte Weise die effektorischen, d.h. aktivatorischen oder inhibitorischen Eigenschaften chemischer Verbindungen auf die Aktivität der GSAAT bestimmen. Zur Überprüfung der Wirkung eines GSAAT Inhibitors auf Pflanzen in vivo stehen dem Fachmann vielfätige Methoden zur Verfügung. Die zu untersuchenden Substanzen (z.B. definierte chemische Verbindungen, aber auch heterogene Stoffgemische) werden Pflanzen appliziert, wobei verschiedenste Hilfsstoffe, wie beispielsweise Netzmittel oder Lösungsmittel, verwendet werden können. Nach der Applikation der zu untersuchenden Substanzen werden die Pflanzen bonitiert. Substanzen, welche eine Pflanze durch selektive Inhibition der GSAAT oder des C5-Stoffwechselweges schädigen, rufen mindestens ein charakteristisches Symptom hervor. Häufig entstehen nach Applikation Chlorosen, die bei dem neugebildeten Gewebe besonders ausgeprägt sein können, und die beispielsweise durch Lichteinwirkung in Nekrosen übergehen können. Weitere Symtome können eine Depression des Wachstums oder auch ein sehr rasches Absterben der Pflanze sein. Die Symptome variieren je nach Pflanzenspezies in Abhängigkeit von deren unterschiedlicher Empfindlichkeit und in Abhängigkeit der Eigenschaften des Inhibitors. Eine einfachen und praxistaugliche Möglichkeit für einen in-vivo Test stellt der in Beispiel 8 beschriebene Lemna-Test dar.
Die Kombination des erfindungsgemäßen in-vitro Enzymtests mit einem in-vivo- Test, vorzugsweise einer Lemna-Test, besonders bevorzugt im wesentlichen unter den in Beispiele 8 genannten Bedingungen, wobei der Konzentrationsbereich der Testsubstanz vorzugsweise im Bereich von 10"6 bis 10*4 stellt eine rationale Methode zur Entwicklung von Herbiziden, deren Wirkung auf einer Inhibierung der pflanzliche GSAAT beruht, dar.
Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zum Auffinden herbizider Wirkstoffe, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchende Testsubstanz wie oben beschrieben auf eine effektorische Wirkung gegenüber GSAAT testet und vorzugsweise ebenfalls einem Lemna-Test unterzieht.
Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer Verbindung, die in den beschriebenen Testverfahren auf Effektoreigenschaften gegenüber GSAAT, eine mindestens 30-%ige, bevorzugt mindestens 50-%ige, Inhibitorwirkung aufweist und, vorzugsweise im Lemna-Test aktiv ist, als Herbizid.
Aktiv bedeutet vorzugsweise des Auftretens von chlorotischen Gewebe, besonders bevorzugt das Auftreten vor chlorotischen Gewebe und einer Wachstumsdepression der Pflanze, vorzugsweise innerhalb von zehn, besonders bevorzugt innerhalb von sieben Tagen.
Ebenso Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bekämpfung von unerwünschten Pflanzenwuchs in Nutzpflanzenkulturen, dadurch gekennzeichnet, daß man auf den Ort der Nutzpflanze, die Nutzpflanze oder deren Vermehrungsgut ein herbizides Mittel aufbringt, enthaltend eine Verbindung, die in der oben beschriebenen Testverfahren in einem Konzentrationsbereich von 10'7 bis 10"4 molar eine mindestens 30-%ige, bevorzugt mindestens 50-%ige, Inhibitorwirkung gegenüber GSAAT aufweist und, vorzugsweise, im Lemna-Test aktiv ist.
Die Nutzpflanzen sind vorzugsweise erfindungsgemäße transgene Pflanzen mit veränderten 5-Lävulinsäure Biosynthese.
Auf den Inhalt der deutschen Patentanmeldung 197 54 929.2, deren Priorität diese Anmeldung beansprucht, sowie auf die Zusammenfassung dieser Anmeldung wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen, sie gelten durch Zitat als Bestandteil dieser Beschreibung.
Die nachfolgenden Beispiele sollen der näheren Erläuterung der Erfindung dienen und bedeuten in keiner Weise eine Einschränkung.
Beispiel 1 :
Konstruktion eines Transformationsvektors zur Übertragung eines ALAS-Gens auf
Pflanzen
Zur Expression in Pflanzen wurde das hemA Gen aus Rhodobacter sphaeroides kodierend für eine ALAS isoliert. Dazu wurden die Oligodesoxynukleotide ALAS1 und ALAS2 konstruiert. ALAS1 hat die Sequenz 5'- gactgtgcatgcaggactacaatctggcactc-3', trägt am 5'-Ende eine Sphl- Restriktionsschnittstelle und leitet sich im 3'-Bereich ab aus den Positionen 1950 bis 1967 des Genbankeintrags L07490 (SEQ ID Nr. 1). ALAS2 hat die Sequenz 5'-ctgactctgcagtcaggcaacgacctcggc-3', trägt am 5'-Ende eine Pstl-Restriktionsschnittstelle und leitet sich im 3'-Bereich ab aus den Positionen 3170 bis 3153 des Genbankeintrags L07490.
Zur Amplifikation des Rhodobacter sphaeroides hemA Genfragmentes entsprechend den Positionen 1950 bis 3170 des Genbankeintrags L07490 wurde eine Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt. Für den PCR-Ansatz wurden in einem Gesamtvolumen von 50 μl 5 μl einer 1:10 in Wasser verdünnten stationären Kultur von Rhodobacter sphaeroides Stamm ATCC #35054 (kultiviert wie angegeben im Katalog der American Type Culture Collection, Manassas, Virginia 20110-2209, USA), jeweils 10 nmol dATP, dCTP, dGTP und dTTP sowie jeweils 25 pmol von Primer ALAS1 und ALAS2 gemischt. Dem Reaktionsansatz wurde 1/10 Volumen 10x Taq-Puffer (100 mM Tris/HCI pH 9,0, 500 mM KCI, 15 mM MgCI2,
0,1 % Gelatine und 1 % Triton X-100) zugesetzt. Die Ansätze wurden mit 3 Tropfen Paraffinöl überschichtet und anschließend im PCR-Gerät auf 94 °C erhitzt. Nach 2 min Inkubation wurden 2,5 u taq DNA-Polymerase zugegeben. Die PCR wurde in sukzessiven Thermo-Zyklen durchgeführt, die aus den drei folgenden Schritten bestanden: 1. Denaturierung der Doppelstrang-DNA bei 96 °C für 1 min; 2. Anlagerung der Primer an die Matrizen-DNA bei 50 °C für 1 min; 3. DNA-Synthese bei 72 °C für 3 min. Dieser Zyklus wurde 30mal hintereinander ausgeführt. Danach wurde der Ansatz für 5 min bei 60 °C inkubiert. Das 1247 bp große Reaktionsprodukt wurde durch präparative Agarose-Gelelektrophorese isoliert und anschließend mit den Restriktionsenzymen Sphl und Pstl für die spätere Klonierung gespalten.
Zur Klonierung wurde der Vektor pGEM3Zf- (Promega) mit Sphl und Pstl gespalten und das ca. 3100 bp Vektorfragment isoliert. Das Sphl/Pstl-Vektorfragment wurde mit dem 1235 b langen Sphl/Pstl-Fragment des hemA-PCR-Produktes ligiert. Mit dem Ligierungsprodukt wurde Escherichia coli XL-1 Blue (Stratagene) transformiert.
Die Sequenz des in pGEM3Zf- klonierten hemA-PCR-Produktes in dem erhaltenen Plasmid pALASI ist identisch mit dem Konsensus aus mehreren weiteren unabhängigen Plasmidklonen und ist in Seq ID Nr. 7 aufgeführt (ohne Klonierungsschnittstellen):
Das 1235 b lange Sphl/Pstl-Fragment aus pALASI wurde mit dem 222 bp Pstl(2335)/Hindlll(2557)-Fragment aus p35StpASN und dem 3438 bp langen Hindlll(2557)/Sphl(1199)-Fragment aus p35StpASN ligiert. Die Sequenz des Vektors p35StpANS ist angegeben in Sequenz ID NO. 8, die Plasmidkarte in Figur 1.
Legende Figur 1 : Der Vektor pStpASN ist abgeleitet aus pUC18 (amp = beta- Lactamase) und enthält eine Cassette mit folgenden Elementen: 35S Promoter = CaMV35S Promotor, tp'-'tp'-'tp' = modifiziertes chloroplastidäre Targetingsequenz der kleinen Untereinheit der Ribulosebisphosphatcarboxylase aus Erbse, 35S Terminator = CaMV35S-Transkriptionsterminator).
Das Ligierungsprodukt der drei Fragmente wurde bezeichnet als pALAS2. In diesem Konstrukt ist die Sequenz kodierend für ALAS aus Rhodobacter sphaeroides am 5'- Ende über die Sphl-Schnittstelle im Leserahmen fusioniert mit einer Sequenz kodierend für eine modifizierte chloroplastidäre Targetingsequenz. Diese Sequenz ist abgeleitet von der chloroplastidären Targetingsequenz der kleinen Untereinheit der Ribulosebisphosphatcarboxylase aus Erbse und enthält eine interne Sequenzduplikation entsprechend den Positionen 985 bis 1041 in p35StpASN, welche als Positionen 1045 bis 1101 in p35StpASN wiederholt sind (vgl. Seq. ID Nr. 8). Die Transkription des Fusionsgens ist reguliert über den CaMV35S-Promotor.
Die ca. 2,2 kb Cassette enthaltend 35S-Promotor, Targetingsequenz, ALAS-Gen und 35S-Terminator wurde mittels EcoRI aus pALAS2 herausgeschnitten und die überhängenden DNA-Enden dieses Fragments mittels T4-DNA-Polymerase aufgefüllt. Der Vektor pcva13 (Seq. ID. Nr. 9, Plasmidkarte in Figur 2) wurde mit SnaBI linearisiert, mittels alkalischer Phosphatase dephosphoriliert und mit dem ca. 2,2 kb langen, aufgefüllten Fragment aus pALAS2 ligiert. Von den erhaltenen Ligierungsprodukten wurde ein Plasmid, bei welchem die Leserichtung des hemA- Gens und des PAT-Gens gleichgerichtet sind, als pALAS3f bezeichnet (vgl. Figur 3).
Legende Figur 3: Der Vektor pcva13 (amp = beta-Lactamase) enthält eine Cassette mit folgenden Elementen: P-35S = CaMV35S Promotor, PAT = Phosphinothricin- Acetyltransferase, T-35S = CaMV35S-Transkriptionsterminator.
Beispiel 2: Herstellung von Pflanzen, welche das hemA-Gen exprimieren
Zur Herstellung transgener Mais-Pflanzen, welche eine Expressionscassette für das hemA-Gen aus Rhodobacter sphaeroides enthalten, wurde eine Transformation wie beschrieben in EP-A 0 469 273 durchgeführt, wobei abweichend als zu transferierende DNA pALAS3f eingesetzt wurde. Es wurden 41 unabhängige Mais- Transformanden erhalten. Aus diesen als M23T1 , M25T1 bis M25T13 und M27T1 bis M27T27 bezeichneten Linien wurden wie beschrieben Pflanzen regeneriert. Die Anwesenheit des vollständigen hemA-Gens wurde in allen transgenen Pflanzen mittels PCR unter Einsatz der Oligodesoxynukleotide ALAS1 und ALAS2 (siehe Beispiel 1 ) als PCR-Primer nachgewiesen.
Beispiel 3: Phänotypische Charakterisierung hemA-exprimierender Pflanzen
Zunächst wurde die Toleranzschwelle der nicht-transformierten Maislinie gegenüber dem GSAAT-Inhibitor 3-Amino-2,3-dihydrobenzoesäure bestimmt. Dazu wurden die Mais-Samen oberflächensterilisiert, indem sie unter sterilen Bedingungen erst für 1 min in 70 % Ethanol, dann für 20 min in 5 % Natriumhypochlorit, 0,1 % Tween 20 und abschließend sechsmal kurz in sterilem Wasser gewaschen wurden. Die Samen wurden dann steril auf Murashige & Skoog-Medium (Micro- und Makronährstoffe, Sigma GmbH #M5524) enthaltend 90 g/l Saccharose und 8 g/l Agar ausgelegt und für sechs Tage bei Raumtemperatur unter Tageslicht- Leuchtstoffröhren bei 12 h Licht/12 h dunkel angezogen bis das zweite Blatt sichtbar wurde. In diesem Stadium wurden die Pflänzchen auf frisches Medium mit verschiedenen Konzentrationen 3-Amino-2,3-dihydrobenzoesäure gesetzt.
Nach weiteren 10 Tagen Kultur der Pflanzen wurde der Einfluß des Inhibitors erfaßt. Bei einer 3-Amino-2,3-dihydrobenzoesäure Konzentration von unter 5 μM war die Biomasseproduktion im Rahmen der üblichen Schwankungen unverändert. Bei 100 μM 3-Amino-2,3-dihydrobenzoesäure war die Biomasseproduktion deutlich herabgesetzt und das unter Einwirkung von 3-Amino-2,3-dihydrobenzoesäure neu gebildete Gewebe war deutlich chlorotisch.
Folgende Feuchtgewichte wurden für die nicht-transgenen Pflanzen sechs Tage nach Medienwechsel festgestellt (jeweils Mittelwerte aus zehn Einzelpflanzen ohne Wurzel und Reste des Samenkorns):
0 μM 3-Amino-2,3-dihydrobenzoesäure: 3,89 g
1 μM 3-Amino-2,3-dihydrobenzoesäure: 4,15 g 5 μM 3-Amino-2,3-dihydrobenzoesäure: 3,82 g
10 μM 3-Amino-2,3-dihydrobenzoesäure: 3,12 g
100 μM 3-Amino-2,3-dihydrobenzoesäure: 1 ,53 g
Die Toleranz von transgenen Linien gegenüber 3-Amino-2,3-dihydrobenzoesäure wird im Vergleich mit der nicht-transgenen Ausgangslinie ermittelt. Dazu werden fünf Regeneratpflanzen je Linie, die in ihrer Größe und Bewurzelung optisch den oben beschriebenen Sämlingen nach sechs Tagen Keimung entsprechen, auf Medien ohne 3-Amino-2,3-dihydrobenzoesäure (eine Pflanze) und mit 100 μM 3- Amino-2,3-dihydrobenzoesäure (vier Pflanzen) umgesetzt und weiterkultiviert. Alle Regeneratpflanzen der nicht-transgenen Linie zeigen wie zuvor unter Einwirkung von 3-Amino-2,3-dihydrobenzoesäure deutliche Chlorose und verringerte Biomasseproduktion gegenüber der unbehanditen Kontrolle. Die transgenen Linien zeigen auf Medium ohne 3-Amino-2,3-dihydrobenzoesäure einen zu den nicht- transgenen Pflanzen unter dieser Bedingungen vergleichbaren Phänotyp. Bei den meisten transgenen Linien mit dem erfindungsgemäßen ALAS-Gen zeigt jedoch keine der Regeneratpflanzen in Anwesenheit von 100 μM 3-Amino-2,3- dihydrobenzoesäure Chlorosen oder reduziertes Wachstum gegenüber ihrer jeweiligen unbehandelten Kontrolle auf Medium ohne 3-Amino-2,3- dihydrobenzoesäure.
Beispiel 4: Gentechnische Produktion und Reinigung der GSAAT
Die mature GSAAT aus Hordeum vulgäre wurde mittels der Seqenz ID Nr. 6 gentechnisch in Escherichia coli hergestellt. Dazu wurde der Escherichia coli Stamm TG1 (Gibson (1984) PhD Thesis, Cambridge, UK) gleichzeitig mit dem Expressionsplasmid pATE19 (Berry-Lowe et al. (1992) Plant Physiology 99:1597- 1603) und dem Plasmid pGroESL (Goloubinoff et al. (1989) Nature 337:44-47) transformiert. Transformierte Klone wurden stets in LB-Medium (10 g/l Trypton, 5 g/IHefeextrakt, 5 g/l NaCI) mit 100 mg/l Ampicillin und 30 mg/l Chloramphenicol kultiviert. 100 ml Medium wurden mit einem TG1/pATE19/pGroESL Klon angeimpft und für 14 h bei 37 °C unter Schütteln in einem Kulturkolben inkubiert. Mit dieser Kultur wurden 5 I Medium angeimft und in Kuturkolben bei 37 °C unter Schütteln bis zu einer Optischen Dichte von OΩ550 = 0,5 herangezogen. Dann wurde sofort Isopropyl-b-D- thio-galactopyranosid zu einer Endkonzentration von 0,5 mM zugesetzt. Gleichzeitig wurde die Inkubationstemperatur auf 28 °C reduziert. Nach weiteren 16 h Inkubation wurden die Zellen durch Zentrifugation (4200 g, 20 min, 4 °C) geerntet. Das Zellsediment wurde in 150 ml Puffer A (50 mM Tricin/NaOH pH 7,9, 25 mM MgCI2) resuspendiert. Die Zellen wurden dann mittels drei Passagen durch den French Press-Homogenisator (French Pressure Cell Press und 35 ml Aufschlußzelle von SLM Instruments, Inc., Rochester NY 14625 USA) bei 16000 psi und 4 °C aufgeschlossen. Das Homogenisat wurde anschließend für 30 min bei 25000 g und 4 °C zentrifugiert. Der klare Überstand wurde einer Anionenaustasch- chromatographie unterzogen.
Zur Chromatographie wurde eine DEAE-Sepharose Fast Flow Säule (Pharmacia GmbH, Freiburg) mit einem Bettvolumen von 500 ml mit Puffer A äquilibriert. Der klare Überstand der aufgeschlossenen Zellen wurde auf diese Säule aufgetragen. Anschließend wurde die Säule zunächst mit 250 ml Puffer A und dann mit 1500 ml Puffer B (50 mM Tricin/NaOH pH 7,9, 25 mM MgCI2, 20 mM NaCI) gespült. Die Elution der rekombinanten GSAAT fand mit 750 ml Puffer C (50 mM Tricin/NaOH pH 7,9, 25 mM MgCI2, 100 mM NaCI) statt. Das Eluat wurde in Fraktionen ä 25 ml gesammelt und die Fraktionen, welche funktionelle GSAAT enthielt, wurde mittels eines GSAAT-Aktivitätstests an Proben aus den Fraktionen ermittelt. Aus 5 I Expressionskultur wurden 25 nkat GSAAT erhalten.
Beispiel 5: Bestimmung der enzymatischen Aktivität der GSAAT
Die Aktivität der GSAAT wurde durch einen photometrischen Nachweis des derivatisierten Reaktionsproduktes 5-Aminolevulinsäure nachgewiesen. Der Aktivitätstest wurde in einer 96-Well Flachboden-Microtiterplatte (F-Form) aus Polystyrol durchgeführt. In den Vertiefungen der Microtiterplatte (Wells) konnte die gewünschte Anzahl an Einzelmessungen parallel durchgeführt werden. Die folgenden Angaben beziehen sich jeweils auf eine Vertiefung der Microtiterplatte (MTP). Bei einer Temperatur von 20 °C wurden 100 μl Enzymlösung (25 pkat/ml rekombinante GSAAT aus Hordeum vulgäre, 250 mM BisTris/HCI pH 6,5) und 10 μl 25 % (v/v) Dimethylsulfoxyd in Wasser vorgelegt. Die enzymatische Reaktion wurde durch Zugabe von 5 μl 1 ,8 mM Glutamat-1 -Semialdehyd gelöst in 100 mM HCI gestartet.
Unmittelbar nach dem Start der enzymatischen Reaktion wurde der Ansatz für 30 min bei 20 °C inkubiert. Anschließend wurden sofort 25 μl Acetoessigsäureethylester zugesetzt, der Ansatz gut durchmischt und für 30 min bei 40°C inkubiert. Direkt im Anschluß wurde 100 μl Ehrlichs Reagenz (s. u.) zugesetzt und der Ansatz für 30 min bei 20 °C inkubiert. Nach Abschluß der Inkubation wurde sofort mit Hilfe eines Microtiterplattenphotometers die Absorption der Lösung bei einer Wellenlänge von 540 nm bestimmt.
Zur Bestimmung der enzymatisch gebildeten Menge an 5-Aminolevulinsäure wurde zunächst der Blindwert (s. u.) von der Absorption des zu bestimmenden Ansatzes abgezogen. Aus dem Differenz aus Meßwert und Blindwert wurde mit Hilfe einer Eichreihe die Konzentration an 5-Aminolevulinsäure im Reaktionsansatz zum Zeitpunkt unmittelbar vor Zugabe des Acetoessigsäureethylesters berechnet. Die Eichreihe wurde erzeugt, indem jeweils 100 μl verschieden konzentrierter 5- Aminolevulinat-Lösungen in 250 mM BisTris/HCI pH 6,5 zunächst für 30 min bei 20 °C inkubiert wurden, dann mit 25 μl Acetoessigsäureethylester gemischt und 30 min bei 40 °C inkubiert wurden, anschließend mit 100 μl Ehrlichs Reagenz versetzt und 30 min bei 20 °C inkubiert wurden und die Absorption der erhaltenen Lösung sofort mit Hilfe eines Microtiterplattenphotometers bei einer Wellenlänge von 540 nm bestimmt wurde. Die Konzentration an 5-Aminolevulinsäure in den 100 μl 250 mM BisTris/HCI pH 6,5 wird bei diesem Vorgang in parallelen Ansätzen zwischen 0 μM und 150 μM variiert (0 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM). Zur Bestimmung eines Blindwertes (s. o.) als Referenz zu dem gemessenen Absorptionswert einer GSAAT-Reaktion wurde ein paralleler GSAAT-Aktivitätstest durchgeführt, bei welchem 1.) die enzymatische Aktivität der GSAAT blockiert wurde und der 2.) ansonsten unter den exakt gleichen Bedingungen wie der zu vergleichende Ansatz durchgeführt wurde. Zur Blockierung der GSAAT-Aktivität wird vor Reaktionsstart anstelle von 10 μl 25 % (v/v) Dimethylsulfoxyd/Wasser (s. o.) 10 μl einer Lösung von 10 mM Aminooxyessigsäure in 25 % (v/v) Dimethylsulfoxyd/Wasser zusammen mit der Enzymlösung vorgelegt. Zusammensetzung von Ehrlichs Reagenz:
1 g 4-(Dimethylamino)-benzaldehyd in 30 ml Eisessig lösen und anschließend mit 8 ml 70 % Perchlorsäure mischen. Diese Lösung mit Eisessig auf ein Endvolumen von 50 ml bringen.
Beispiel 6: Identifikation von Effektoren der GSAAT
Zur Auffindung neuer Effektoren der GSAAT wurde eine Anzahl von unterschiedlichen chemischen Substanzen in bezug auf ihre Wirkung durchmustert. Substanzen oder Verbindungen, welche unter den Bedingungen des GSAAT- Aktivitätstests ungünstige chemisch reaktive Eigenschaften aufwiesen, z. B. Alkylierung, Halogenierung, Oxidation, Reduktion oder sonstige unspezifische kovalente Modifizierungen von Proteinen oder den eingesetzten Enzymsubstraten verursachen, sind nicht enthalten. Die Verbindungen wurden in einer Konzentration von 100 μM in 25 % (v/v) DMSO/Wasser gelöst.
Zur Bestimmung der Wirkung dieser Verbindungen auf die enzymatische Aktivität der GSAAT wurden von jeder Verbindung 10 μl der 100 μM Lösung in eine Vertiefung einer 96 Well MTP (s. o.) gegeben. 90 Vertiefungen einer MTP wurden auf diese Weise mit Lösungen der zu untersuchenden Verbindungen versehen. Zur Bestimmung der Aktivität der nicht inhibierten GSAAT (Kontrollreaktion) wurden 3 Vertiefungen der gleichen MTP mit jeweils 10 μl 25 % (v/v) DMSO/Wasser versehen und zur Bestimmung von Blindwerten wurden die restlichen 3 Vertiefungen mit jeweils 10 μl einer Lösung von 10 mM Aminooxyessigsäure in 25 % (v/v) Dimethylsulfoxyd/Wasser versehen. Die Lösungen in den Vertiefungen der MTPs wurden dann mit je 100 μl Enzymlösung (25 pkat/ml rekombinante GSAAT aus Hordeum vulgäre, 250 mM BisTris/HCI pH 6,5) gemischt. Die enzymatische Reaktion wurde in allen Vertiefungen einer MTP zeitgleich durch Zugabe von 5 μl 1 ,8 mM Glutamat-1 - Semialdehyd gelöst in 100 mM HCI gestartet. Die weiteren Schritte waren identisch mit der unter Beispiel 2 beschriebenen Vorgehensweise nach dem Start der enzymatischen Reaktion.
Für jede MTP konnte dann aus dem Mittelwert der Meßergebnisse für die Wells mit den Kontrollreaktionen und dem Mittelwert der Wells mit den Blindwerten die Aktivität der nicht inhibierten GSAAT bestimmt werden. Ebenso wurde für jedes Well dieser MTP, in welchem eine zu untersuchende Substanz eingesetzt wurde, durch Abzug des Mittelwertes der Blindwerte die GSAAT-Aktivität bestimmt. Durch Vergleich der Aktivität der Aktivität der GSAAT in Anwesenheit einer zu untersuchenden Substanz und der Aktivität in Abwesenheit der zu untersuchende Substanz (Kontrollreaktionen) wurde bestimmt, ob die Substanz effektorisch, d.h. hemmend oder aktivierend auf den GSAAT Aktivitätstest wirkt. Verbindungen, die eine relative Reduktion der GSAAT-Aktivität um mehr als 30 % gegenüber den Kontrollreaktionen bewirken, wurden als potentielle Effektoren genauer untersucht.
Beispiel 7: Bestimmung der Wirkstärke der GSAAT-Effektoren
Die Wirkstärke eines Effektors der GSAAT wurde bestimmt, indem der GSAAT-Test (vgl. Beispiel 2) in Gegenwart verschiedener Konzentrationen des Effektors in der Reaktionslösung durchgeführt wurde. Dabei wurden Konzentrationen von 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 μM, 3 μM, 10 μM, 30 μM, 100 μM und 300 μM des Effektors eingesetzt. Die Inhibitor-Konstanten wurden anhand der aus den gemessenen Werten abgeleiteten Aktivitäten nach den von Bergmeyer ausführlich beschriebenen Methoden berechnet (Grundlagen der enzymatischen Analyse; hrsg. von Hans Ulrich Bergmeyer, Verlag Chemie Weinheim, New York, 1977, ISBN 3- 527-25677-6), die Konstanten für Aktivatoren konnten in analoger Weise ermittelt werden.
Beispiel 8: Lemna-Test
Die phytotoxische Wirkung von GSAAT-Inhibitoren konnte auch in vivo durch Behandlung von Lemna Kulturen festgestellt werden.
Dazu wurde Lemna gibba in steriler Kulturlösung (0,4 g/l KNO3, 0,8 g/l CaCI2 * 2 H2O, 0,366 g/l MgSO4 * 7 H2O, 0,2 g/l KH2PO4, 2 ml/1 Lösung I (2,23 g/l MnSO4 * 4 H2O, 83 mg/l KJ, 2,5 mg/l CoCI2 * 6 H2O, 0,86 g/I ZnS04 * 7H2O, 2,5 mg/l CuSO4 * 5 H2O, 0,62 g/l H3BO3, 25 mg/l Na2MoO4 * 2 H2O) und 2 ml/1 Lösung II (14,92 g/l Na- EDTA, 10,92 g/l FeSO4 * 7 H2O)) kultiviert. Jeweils 3 Pflanzen wurden unter sterilen Bedingungen in die einen 100 ml Erlenmeyerkolben gesetzt, welcher mit 50 ml Kulturlösung enthaltend den GSAAT-Inhibitor in einer Konzentration von 20 μM gefüllt war. Die Kulturkolben wurden bei 25 °C im Abstand von 70 cm mit zwei 36 W Tageslicht-Leuchtstoffröhren beleuchtet (24 h Dauerlicht). Das Wachstum und das äußere Erscheinungsbild der Lemna-Pflanzen wurde über 7 Tage hinweg beobachtet und mit dem Wachstum und dem äußeren Erscheinungsbild von Lemna- Pflanzen verglichen, die in Kulturlösung ohne Inhibitor unter ansonsten identischen Bedingungen kultiviert wurden.
Charakteristisch für die phytotoxische Wirkung eines GSAAT-Inhibitors war eine Chlorose der neu gebildeten Gewebe. Bei hohen Lichtintensitäten konnte auch eine Nekrose des pflanzlichen Gewebes auftreten. Schnell wirkende Verbindungen führten oft schon nach einem Tag zum kompletten Absterben der Pflanzen während die langsamer wirkenden Verbindungen zunächst eine Wachstumsdepression zur Folge hatten. Beispiel 9: Inhibitoren der GSAAT
Mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens wurde die folgende herbizid wirksame Verbindung A (Hydrazinopropylsulfonsäure, Sulfopropylhydrazin) gefunden: Verbindung A:
Die Verbindung A führte bei einer Konzentration von 6 μM zu einer 50 %igen
Reduktion der GSAAT-Aktivität.
Im Lemnatest führte Verbindung A innerhalb von 48 h zu Chlorosen und einer
Wachstumsdepression der Pflanzen. Nach 72 h waren mehr als 60 % der Pflanzen abgestorben.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, transgener Pflanzenzellen, transgener Pflanzenteile, transgener Pflanzensamen, transgenen Vermehrungsguts, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle kodierend für ein Protein mit der Funktion einer 5- Aminolävulinsäure Synthase (ALAS), ausgewählt aus der Gruppe der feedback-regulierten ALAS, tierischen ALAS und bakteriellen ALAS, eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon stabil in das pflanzliche Genom integriert werden.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS, ausgewählt aus der Gruppe der feeback-regulierten ALAS, tierischen ALAS und bakteriellen ALAS eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon durch Piastidentransformation stabil in das pflanzliche Piastom integriert werden.
3. Verwendung mindestens eines Nukieinsäuremoleküls kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS ausgewählt aus der Gruppe der feedback-regulierten ALAS, tierischen ALAS, bakteriellen, eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon zur Herstellung von transgenen Pflanzenzellen oder Pflanzen.
4. Verwendung mindestens eines Nukieinsäuremoleküls kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS, ausgewählt aus der Gruppe der feedback-regulierten ALAS, tierischen ALAS und bakteriellen ALAS, oder eines aktiven Fragments daraus, zur Expression eines Proteins mit der Funktion einer ALAS oder eines aktiven Fragments daraus in transgenen Pflanzenzellen oder Pflanzen.
5. Verwendung mindestens eines Nukieinsäuremoleküls kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS, ausgewählt aus der Gruppe der feedback-regulierten ALAS, tierischen ALAS und bakteriellen ALAS, oder eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon zur Herstellung von transgenen Pflanzenzellen oder Pflanzen, deren Expression eines Proteins mit der Funktion einer GSAAT oder eines aktiven Fragments daraus supprimiert oder inhibiert ist.
6. Nicht-natürlich vorkommendes chimäres Gen, mindestens enthaltend einen für die Expression einer ALAS, ausgewählt aus der Gruppe der feeback- regulierten ALAS, tierischen ALAS und bakteriellen ALAS, in Pflanzen geeigneten Promotor, der funktionell verknüpft ist mit einem DNA-Molekül kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS oder eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon.
7. Transgene Pflanze, transgene Pflanzenzellen, transgene Pflanzenteile, transgene Pflanzensamen, transgenes Vermehrungsgut, enthaltend ein DNA- Molekül kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS, ausgewählt aus der Gruppe der feedback-regulierten ALAS, tierischen ALAS und bakteriellen ALAS, oder eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon.
8. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, transgener Pflanzenzellen, transgener Pflanzenteile, transgener Pflanzensamen, transgenen Vermehrungsguts, bei dem ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle kodierend für ein Protein mit der Funktion einer 5-Aminolävulinsäure Synthase (ALAS), eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon stabil in das pflanzliche Genom integriert werden, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze eine monokotyle Pflanze ist.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS, eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon durch Piastidentransformation stabil in das pflanzliche Piastom integriert werden
10. Verwendung mindestens eines Nukieinsäuremoleküls kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS, oder eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon zur Herstellung von transgenen Pflanzenzellen oder Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze eine monokotyle Pflanze ist.
11. Verwendung mindestens eines Nukieinsäuremoleküls kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS, oder eines aktiven Fragments daraus, zur Expression eines Proteins mit der Funktion einer ALAS oder eines aktiven Fragments daraus in transgenen Pflanzenzellen oder Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze eine monokotyle Pflanze ist.
12. Verwendung mindestens eines Nukieinsäuremoleküls kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS, oder eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon zur Herstellung von transgenen Pflanzenzellen oder Pflanzen, deren Expression eines Proteins mit der Funktion einer GSAAT oder eines aktiven Fragments daraus supprimiert oder inhibiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze eine monokotyle Pflanze ist.
13. Nicht-natürlich vorkommendes chimäres Gen, mindestens enthaltend einen für die Expression einer ALAS, in Pflanzen geeigneten Promotor, der funktionell verknüpft ist mit einem DNA-Molekül kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS oder eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze eine monokotyle Pflanze ist.
14. Transgene-Pflanze, transgene Pflanzenzellen, transgene Pflanzenteile, transgene Pflanzensamen, transgenen Vemehrungsgut, enthaltend ein DNA- Molekül kodierend für ein Protein mit der Funktion einer ALAS, oder eines aktiven Fragments daraus oder einer antisense oder komplementären Sequenz davon, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze eine monokotyle Pflanze ist.
15. Verfahren gemäß Anspruch 1 , 2, 8 und/oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Nukleinsäuremoleküle unter der Kontrolle eines feedback-regulierten Promotors stehen.
16. Verwendung eines feedback-regulierten Promotors in einem Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 , 2, 8, 9 und 15.
17. Rekombinanter Vektor, enthaltend ein chimäres Gen gemäß Anspruch 6 oder 13.
18. Transgene Pflanzenzelle, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanzenzelle, mit einem Chimären Gen gemäß Anspruch 6 oder 13 oder einem Vektor gemäß Anspruch 17 transformiert und/oder genetisch modifiziert ist.
19. Pflanze, Pflanzenzellen, Pflanzenteile, Pflanzensamen, Vermehrungsgut gemäß Anspruch 7, 14 oder 18 herstellbar nach einem Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 , 2, 8, 9 oder 15.
20. Pflanze gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Nutzoder Zierpflanze ist.
21. Pflanze gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Maispflanze ist.
22. Verfahren zur Bestimmung der effektorischen Wirkung einer Testsubstanz bezüglich der Aktivität einer GSAAT, worin man a) die enzymatische Aktivität der GSAAT in Abwesenheit einer Testsubstanz bestimmt; b) die enzymatische Aktivität der GSAAT in Anwesenheit einer Testsubstanz bestimmt; und c) die unter a) und b) ermittelten enzymatischen Aktivitäten vergleicht.
23. Verfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß in einem automatisierten Testsystem zum Prüfen der effektorischen Wirkung von Testsubstanzen angewendet wird.
24. Verfahren zur Auffindung herbizider Wirkstoffe, dadurch gekennzeichnet, daß die zu testende Substanz in einen Verfahren gemäß Anspruch 22 getestet wird.
25. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Testsubstanz zusätzlich einem Lemna-Test unterworfen wird.
26. Verwendung von Effektoren der GSAAT als Herbizid.
27. Verwendung einer Verbindung, die in einem Testverfahren auf Effektoreigenschaften gegenüber GSAAT gemäß Anspruch 22 mindestens einer molaren Konzentration im Bereich von 10"4 bis 10"7 eine mindestens 30 %ige Inhibitorwirkung aufweist, als Herbizid.
28. Verwendung gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung auch im Lemna-Test aktiv ist.
29. Verfahren zur Bekämpfung von unerwünschtem Pflanzenwuchs in Nutzpflanzenkulturen, dadurch gekennzeichnet, daß man auf den Ort der Nutzpflanze, die Nutzpflanze oder deren Vermehrungsgut ein herbizides Mittel aufbringt, enthaltend eine Verbindung, die in dem Testverfahren gemäß Anspruch 22 bei mindestens einer molaren Konzentration im Bereich von 10"4 bis 10'7 molar eine mindestens 30 %ige Inhibitorwirkung aufweist, als Herbizid eine mindestens 30 %ige Inhibitorwirkung gegenüber GSAAT aufweist.
30. Verfahren gemäß Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung auch im Lemna-Test aktiv ist.
31. Verfahren gemäß Anspruch 29 und/oder 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Nutzpflanze eine transgene Pflanze gemäß Anspruch 7 oder 14 ist.
32. Verfahren zum Bekämpfen von unerwünschten Pflanzenwuchs in Nutzpflanzenkulturen, dadurch gekennzeichnet.daß man eine Nutzpflanze gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 7, 14, 19, 20 und/oder 21 einsetzt, und auf den Ort dieser Pflanze, die Pflanze selbst oder derer Vermehrungsgut ein herbizides Mittel aufbringt, dessen Wirkmechanismus zumindest teilweise auf einer Inhibition der pflanzlichen GSAAT beruht.
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6916971B1 (en) 1999-07-30 2005-07-12 Rebecca E. Cahoon Polynucleotides encoding aminolevulinic acid biosynthetic enzymes
EP1198573A2 (de) * 1999-07-30 2002-04-24 E.I. Du Pont De Nemours And Company Polynukleotide kodierend für aminolevulinsäure biosyntheseenzyme
ATE478951T1 (de) * 2000-03-03 2010-09-15 Kirin Holdings Kk Verbesserte promotoren und deren verwendung
JP5256020B2 (ja) * 2005-04-08 2013-08-07 バイエル・クロップサイエンス・エヌ・ヴェー エリートイベントａ２７０４−１２、ならびに生物サンプル中の該イベントを同定するための方法およびキット
CN1322132C (zh) * 2005-04-19 2007-06-20 浙江大学 生产5－氨基乙酰丙酸的工程菌及其构建方法
CA2625371C (en) * 2005-08-24 2012-06-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions providing tolerance to multiple herbicides and methods of use thereof
CN103468736A (zh) * 2013-09-27 2013-12-25 浙江大学 一种荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达方法
CN103911317B (zh) * 2014-03-07 2016-01-20 中国农业科学院生物技术研究所 一种具有耐草甘膦功能的细菌及其应用
WO2017158514A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 National Research Council Of Canada Modulating plant abiotic stress responses using the kanghan gene family
US11859196B2 (en) 2016-03-15 2024-01-02 National Research Council Of Canada Modulating drought tolerance in Brassicaceae using the Kanghan gene family
CN111454988B (zh) * 2020-05-11 2022-02-15 湖南省植物保护研究所 一种提高植物抗虫能力的方法及其植物表达载体

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997020209A2 (en) * 1995-12-01 1997-06-05 E.I. Du Pont De Nemours And Company Agricultural product microscreen method and apparatus
DE19650216A1 (de) * 1996-12-04 1998-06-10 Inst Pflanzengenetik & Kultur Verfahren zur Beeinflussung der Chlorophyllbiosynthese in Pflanzen

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
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WO1999029880A3 (de) 1999-10-07
WO1999029880A2 (de) 1999-06-17
JP2001526041A (ja) 2001-12-18
DE19754929A1 (de) 1999-06-17
CA2313706A1 (en) 1999-06-17
US20030204873A1 (en) 2003-10-30
US6603062B1 (en) 2003-08-05
AU1966999A (en) 1999-06-28

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