-
GEBIET DER ERFINDUNG
-
Die vorliegende Anmeldung beansprucht das Prioritätsrecht der am 23. März 2009 eingereichten provisorischen US-Patentanmeldung mit der Reihennummer 61/162,427, die hiermit voll inhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen ist.
-
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
In den letzten Jahren haben Bevölkerungszunahme und Klimawandel die Möglichkeit einer weltweiten Nahrungsmittel-, Futter- und Brennstoffknappheit drastisch vor Augen geführt. Zu einem Zeitpunkt, wo die Niederschlagsmenge in vielen Teilen der Erde rückgängig ist, entfällt auf die Landwirtschaft 70% des von Menschen verbrauchten Wassers. Außerdem werden weniger Hektar Ackerland für den Anbau von Feldfrüchten verfügbar, da sich die Flächennutzung von landwirtschaftlichen Betrieben auf Städte und Vorstädte verlagert. In der Agrarbiotechnologie hat man versucht, den zunehmenden Bedarf der Menschheit durch genetische Modifikationen von Pflanzen zu decken, wodurch der Kulturpflanzenertrag erhöht werden könnte, zum Beispiel dadurch, dass eine bessere Toleranz gegenüber abiotischen Stressreaktionen vermittelt wird oder dass die Biomasse erhöht wird.
-
Im vorliegenden Zusammenhang wird der Kulturpflanzenertrag als Anzahl Bushel des entsprechenden Agrarprodukts (wie Körner, Futterpflanzen oder Samen), die pro Acre geerntet werden, definiert. Der Kulturpflanzenertrag wird durch abiotische Stressfaktoren wie Trockenheit, Hitze, Salinität und Kältestress sowie durch die Größe (Biomasse) der Pflanze beeinflusst. Traditionelle Pflanzenzüchtungsstrategien sind relativ langsam und waren im Allgemeinen nicht erfolgreich, um eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischen Stressfaktoren zu vermitteln. Die durch die traditionelle Züchtung erzielten Verbesserungen beim Kornertrag haben beim Mais beinahe ein Plateau erreicht. Der Harvest Index, d. h. das Verhältnis zwischen Ertragsbiomasse zu der gesamten kumulativen Biomasse zum Erntezeitpunkt ist beim Mais während der selektiven Züchtung auf Kornertrag über die letzten hundert Jahre im Wesentlichen unverändert geblieben. Dementsprechend ergeben sich die jüngsten Ertragsverbesserungen, die beim Mais erzielt werden, aus einer erhöhten Gesamtbiomasseproduktion pro Kulturflächeneinheit. Diese erhöhte Gesamtbiomasse wurde durch Erhöhung der Saatstärke erzielt, was zu adaptiven phänotypischen Veränderungen, wie Verkleinerung des Blattwinkels, was die Beschattung der unteren Blätter verringern kann, und der Fahnengröße, was den Harvest Index erhöhen kann, geführt hat.
-
Wenn das Bodenwasser zurückgeht oder wenn Wasser während Trockenperioden nicht verfügbar ist, sind die Kulturpflanzenerträge eingeschränkt. Ein Pflanzenwasserdefizit entsteht dann, wenn die Transpiration von den Blättern größer ist als die Versorgung mit Wasser von den Wurzeln. Die Menge an Wasser, die verfügbar ist, steht in Relation zu der Menge an Wasser, die im Boden vorhanden ist, und der Fähigkeit der Pflanze, dieses Wasser mit ihrem Wurzelsystem zu erreichen. Die Transpiration von Wasser von den Blättern steht mit der Fixierung von Kohlenstoffdioxid durch die Photosynthese über die Stomata in Verbindung. Die beiden Vorgänge sind positiv korreliert, so dass ein hoher Kohlendioxid-Influx über die Photosynthese eng mit Wasserverlust durch Transpiration in Verbindung steht. Wenn Wasser vom Blatt durch Transpiration abgegeben wird, so ist das Blattwasserpotential erniedrigt und die Stomata neigen dazu, sich hydraulisch zu schließen, und schränken so die Photosyntheserate ein. Da der Kulturpflanzenertrag von der Fixierung von Kohlendioxid in der Photosynthese abhängig ist, sind die Wasseraufnahme und die Transpiration Faktoren, die zum Kulturpflanzenertrag beitragen. Pflanzen, die fähig sind, weniger Wasser zu verbrauchen, um dieselbe Menge an Kohlendioxid zu fixieren, oder die fähig sind, bei einem niedrigeren Wasserpotential normal zu funktionieren, weisen das Potential für eine höhere Photosyntheserate und daher für die Produktion von mehr Biomasse und Marktwert in vielen Agrarsystemen auf.
-
Beim Versuch, transgene Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, entweder durch erhöhte abiotische Stresstoleranz oder durch erhöhte Biomasse, zu entwickeln, haben die Agrarbiotechnologen Tests an Modellpflanzensystemen, Gewächshausstudien von Kulturpflanzen und Feldversuche durchgeführt. So ist zum Beispiel die Wassernutzungseffizienz (Water Use Efficiency, WUE) ein Parameter, der häufig mit Trockenheitstoleranz korreliert ist. Untersuchungen der Reaktion einer Pflanze auf Austrocknung, osmotischen Schock und Temperaturextreme werden auch dazu verwendet, um die Toleranz oder Resistenz der Pflanze gegen abiotische Stressfaktoren zu bestimmen.
-
Eine Erhöhung der Biomasse bei niedriger Wasserverfügbarkeit kann auf einer relativ verbesserten Wachstumseffizienz oder einem erniedrigten Wasserverbrauch beruhen. Beim Selektieren von Merkmalen für die Verbesserung von Kulturpflanzen wäre eine verringerte Wassernutzung ohne damit einhergehende Wachstumsveränderung in einem Agrarsystem mit Bewässerung, wo die Betriebsmittelkosten für das Wasser hoch sind, besonders günstig. Eine Wachstumserhöhung ohne damit einhergehendes starkes Ansteigen bei der Wassernutzung wäre auf alle Agrarsysteme anwendbar. In vielen Agrarsystemen, in denen die Wasserversorgung nicht limitierend ist, erhöht eine Wachstumserhöhung ebenfalls den Ertrag, selbst wenn dies auf Kosten einer erhöhten Wassernutzung ginge.
-
Die Agrarbiotechnologen verwenden auch Messungen von anderen Parametern, die die mögliche Auswirkung eines Transgens auf den Kulturpflanzenertrag angeben. Bei Futterkulturen wie Luzerne, Silomais und Heu korreliert die Pflanzenbiomasse mit dem Gesamtertrag. Bei Kornfrüchten wurden jedoch andere Parameter eingesetzt, um den Ertrag zu schätzen, wie zum Beispiel die Pflanzengröße, die über Gesamtpflanzentrockengewicht, Trockengewicht der oberirdischen Pflanzenteile, Frischgewicht der oberirdischen Pflanzenteile, Blattfläche, Stangelvolumen, Pflanzenhöhe, Rosettendurchmesser, Blattlänge, Wurzellänge, Wurzelmasse, Anzahl der Bestockungstriebe und Anzahl Blätter bestimmt wird. Die Pflanzengröße in einem frühen Entwicklungsstadium wird typischerweise mit der Pflanzengröße in einem späteren Entwicklungsstadium korrelieren. Eine größere Pfanne mit einer größeren Blattfläche kann typischerweise mehr Licht und Kohlendioxid als eine kleinere Pflanze absorbieren, und es ist daher wahrscheinlich, dass sie über denselben Zeitraum mehr an Gewicht zunimmt. Bei der Pflanzengröße und der Wachstumsrate besteht eine starke genetische Komponente, und die Pflanzengröße unter ein und derselben Umweltbedingung wird für eine Reihe von verschiedenen Genotypen vermutlich mit der Größe unter einer anderen Umweltbedingung korrelieren. Auf diese Weise verwendet man eine Standardumwelt, um die verschiedenen und dynamischen Umwelten, die von den Kulturpflanzen im Feld an verschiedenen Standorten und zu verschiedenen Zeiten angetroffen werden, ungefähr wiederzugeben.
-
Der Harvest Index ist unter vielen Umweltbedingungen relativ stabil und ermöglicht so eine robuste Korrelation zwischen Pflanzengröße und Kornertrag. Pflanzengröße und Kornertrag sind intrinsisch miteinander verbunden, da der Großteil der Kornbiomasse von der gegenwärtigen oder gespeicherten Photosyntheseproduktivität der Blätter und des Stängels der Pflanze abhängt. Wie bei der abiotischen Stresstoleranz sind Messungen der Pflanzengröße während der frühen Entwicklung unter standardisierten Bedingungen in einer Wachstumskammer oder im Gewächshaus Standardmethoden, um mögliche Ertragsvorteile, die durch das Vorhandensein eines Transgens vermittelt werden, zu messen.
-
Pflanzen sind nicht dazu in der Lage, ihren Standort zu verändern, um Energiequellen zu finden oder Fressfeinde oder Stress zu meiden. Pflanzen haben daher als Reaktion auf ihre Umwelt verschiedene biochemische Pfade und Vernetzungen entwickelt, durch die die Energieversorgung der sich entwicklenden Pflanze unter verschiedenen Umweltbedingungen aufrecht erhalten wird. Eine der Herausforderungen, die Pflanzen unter diesen widrigen Bedingungen wie Trockenheit, extremen Temperaturen und der Einwirkung von Schwermetallen bewältigen müsse, ist die hohe Toxizität einiger Stoffwechselprodukte. Bei oxidativem Stress schließen diese Toxine hochreaktive Sauerstoffspezies (highly Reactive Oxygen Species, ROS) der Superoxid-, Peroxid- und Hydroxylradikale und organischer Derivate davon ein. ROS zeigen eine hohe Reaktivität gegenüber organischen Molekülen wie ungesättigten Fetten, Nukleinsäuren und Proteinen. ROS abstrahieren von diesen organischen Molekülen Wasserstoff, was die Bildung von reduziertem Sauerstoff (Wasser oder einem reduzierten organischen Produkt) und einem zweiten organischen ROS zur Folge hat, wodurch eine Kettenreaktion propagiert wird, die zur kontinuierlichen Zerstörung zellulärer Komponenten führt, bis das ROS abgefangen wird. Das Abfangen von ROS beinhaltet die Bildung eines unreaktiven Endprodukts, bei dem es sich nicht um eine ROS-Spezies handelt. Es ist bekannt, dass eine Reihe von Wasserstoffspendern, die als ROS-Radikalfänger agieren, einschließlich Tocopherol, Ascorbat, Gluthion und Thioredoxin in Pflanzen wirken. Diese verschiedenen ROS-Radikalfänger haben zwei gemeinsame Charakteristika: ihre oxidierte Form reagiert nicht mit anderen organischen Verbindungen, und die oxidierte Form kann durch Stoffwechselreaktionen in der Zelle reduziert werden, wodurch die reduzierte Form des Radikalfängers in einer Kreislaufreaktion unter direkter oder indirekter Nutzung von Reduktionsäquivalenten aus NAD(P)H regeneriert wird.
-
In Pflanzen kommt es unter widrigen Umweltbedingungen zu oxidativem Stress, wenn die Produktion von als Stoffwechselnebenprodukte gebildeten ROS die Fähigkeit der Radikalfängersysteme der Pflanze zum Unschädlichmachen der ROS in Form von stabilen Endprodukten übersteigt. Um den oxidativen Stress zu bewältigen, muss die Pflanzenzelle ausreichende Mengen an Radikalfängern oder Enzymen, die dazu in der Lage sind, die ROS zu deaktivieren, enthalten. Darüber hinaus benötigt die Zelle auch eine ausreichende Versorgung mit Reduktionsäquivalenten in Form von NAD(P)H zum Regenerieren der aktiven Form des Radikalfängers. Ist eines von beiden unzureichend, so steigt der ROS-Titer und die Zelle erleidet einen oxidativen Schaden an Lipiden, Nukleinsäuren oder Proteinen. In schweren Fällen kann dieser Schaden Zelltod, Nekrose und einen Produktivitätsverlust zur Folge haben.
-
Glutathion wurde in fast allen Pflanzenzellenkompartments wie dem Zytosol, Chloroplasten, dem endoplasmatischen Retikulum, Vakuolen und Mitochondrien nachgewiesen. Glutathion ist die Hauptquelle von nicht aus Proteinen stammenden Thiolen in Pflanzen; aufgrund der chemischen Reaktivität der Thiolgruppe ist Glutathion an vielen biochemischen Funktionen beteiligt. Glutathion ist wasserlöslich, stabil und zusätzlich zum Entgiften von ROS schützt es auch gegen andere Stressfaktoren wie Schwermetalle, organische Chemikalien und Pathogene. Das lösliche Enzym „klassische” Glutathionperoxidase wandelt reduziertes monomeres Glutathion (GSH) mit H2O2 in seine oxidierte Form Disulfidglutathion (GSSG) und H2O um. Das zelluläre Redoxgleichgewicht einer Zelle ist indikativ für das GSH/GSSG-Verhältnis, und es wurde nahegelegt, dass es an ROS-Wahrnehmung und -Signalvermittlung beteiligt ist. Eine zweite Form von Glutathionperoxidase, die Phospholipidhydroperoxid-Glutathionperoxidase (PHGPx), kann membranständig sein. PHGPx ist mit diversen Funktionen wie der Signalvermittlung und der Zelldifferenzierung assoziiert und kann mit dem Thioredoxinpfad in Verbindung stehen. PHGPx reduziert außerdem mit Membranen veresterte Lipidhydroperoxide. PHGPx wurde somit mit der Reparatur von Membranlipidperoxidation in Verbindung gebracht.
-
Glutathion ist darüber hinaus an der Glutathionylierung beteiligt, die Proteine durch das Schützen bestimmter Cysteinreste gegen irreversible Oxidation modifiziert, wodurch die Aktivität bestimmter Proteine reguliert wird. Das Enzym Isocitratlyase wird durch eine Glutathionylierung deaktiviert. Die Isocitratlyase katalysiert die Bildung von Succinat und Glyoxylat aus Isocitrat, Teil des Glyoxylat-Cyclus, in dem zwei Moleküle Acetyl-CoA in ein Succinatmolekül umgewandelt werden.
-
Glutathion kann durch durch die Einwirkung von gamma-Glutamyltranspeptidase, die den Transfer der gamma-Glutamyleinheit von Glutathion zu einem Akzeptor, bei dem es sich um eine Aminosäure, ein Peptid oder Wasser handeln kann, abgebaut werden. Auf Basis der Homologie zu Tier-GGTs wurden vier Gene in Arabidopsis gefunden: GGT1, GGT2, GGT3 und GGT4. GGT1 macht 80–99% der Aktivität aus, mit der Ausnahme von Samen, in denen GGT2 50% der Aktivität ausmacht. GGT2- und GGT4-Knockouts zeigen keinen offensichtlichen Phänotyp, aber GGT1-Knockouts zeigten ein vorzeitiges Altern von Rosetten kurz nach dem Blühen. Knockouts von GGT3 zeigen eine verminderte Anzahl an Schoten und einen verminderten Samenertrag.
-
Reduktion-Oxidation-(Redox-)Reaktionen finden statt, wenn sich bei Atomen die Oxidationszahl durch eine Elektronentransferreaktion ändert. Eine Oxidation ist eine Erhöhung der Oxidationszahl durch die Abgabe von Wasserstoff oder die Aufnahme von Sauerstoff. Eine Reduktion ist eine Erniedrigung der Oxidationszahl durch die Aufnahme von Wasserstoff oder die Abgabe von Sauerstoff. In der Biologie sind an vielen Pfaden der Energiespeicherung oder -freisetzung Redoxreaktionen beteiligt. Bei der zellulären Atmung wird Glucose zu CO2 oxidiert und O2 zu Wasser reduziert. Bei der Photosynthese wird im Photosystem II CO2 zu Zuckern reduziert und H2O zu O2 oxidiert. Im Photosystem I reduziert der Elektronengradient den Cofaktor NAD+ zu NADH. Es kommt zur Bildung eines Protonengradienten, der die ATP-Synthese antreibt, wie dies bei der Atmungskette stattfindet, wobei H+ herausgepumpt wird; die H+-transportierende ATP-Synthese koppelt die H+-Aufnahme mit der ATP-Synthese. Bei nicht-photosynthetischen Organismen wie E. coli können durch Redoxreaktionen Elektronen ausgetauscht und Wasserstoff als Energiequelle genutzt werden, um anaerobes Wachstum zu ermöglichen, was die Einwirkung von Hydrogenasen erfordert.
-
Der Redox-Zustand einer Zelle spiegelt hauptsächlich das Verhältnis von NAD+/NADH oder NADP+/NADPH wider. Dieses Gleichgewicht wird in der Menge an Stoffwechselprodukten wie Pyruvat und Lactat reflektiert. Für das Wachstum von Pflanzen wird ein ständiger Nachschub an Kohlenstoff, ATP, NADH und NADPH benötigt. Diese Erfordernisse werden durch die Glycolyse und den Pentosephosphatpfad befriedigt, welche eine oxidative Route zur Regenerierung von NADPH sowie eine nichtoxidative Route zur Produktion von Ribose und anderen Pentosen aus den im Stoffwechsel anzutreffenden Hexosen zur Verfügung stellen. Transaldolase ist ein Enzym des nichtoxidativen Pentosephosphatpfades, das den reversiblen Transfer einer 3-Kohlenstoff-Ketoleinheit von Sedoheptulose-7-phosphat zu Glyceraldehyd-3-phosphat unter Bildung von Erythrose-4-phosphat und Fructose-6-phosphat katalysiert. Transaldolase stellt zusammen mit Transketolase eine Verbindung zwischen dem glycolytischen Pfad und dem Pentosephosphatpfad her.
-
Der Galactosemetabolismus spielt im zellulären Stoffwechsel eine Rolle, indem er Glucose für den Fructose- und Mannosemetabolismus, den Nukleotidzuckermetabolismus und die Glycolyse bereitstellt. Die Umwandlung von Galactose in Glucose-1-phosphat erfordert die Einwirkung von drei Enzymen des Leloir-Pfades: Galactokinase, Galactose-1-phosphaturidylyltransferase und UDP-Galactose-4-epimerase. Beim ersten Schritt des Pfades phosphoryliert Galactokinase Galactose spezifisch mit ATP unter Bildung von Galactose-1-phosphat.
-
Es sind einige Gene, die an Stressreaktionen, am Wasserverbrauch und/oder an der Biomasse in Pflanzen beteiligt sind, charakterisiert worden, ein Erfolg bei der Entwicklung von transgenen Kulturpflanzen mit verbessertem Ertrag ist jedoch bis jetzt mäßig gewesen, und es wurden keine solchen Pflanzen in den Handel gebracht. Es besteht daher ein Bedarf daran, zusätzliche Gene zu identifizieren, die fähig sind, den Ertrag von Kulturpflanzen zu erhöhen.
-
KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
-
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, dass Veränderungen bei der Expression von mit dem ROS-abfangenden System in Pflanzen zu einer Verbesserung des pflanzlichen Ertrags führen kann. Bei einem wie im vorliegenden Text beschriebenen Targeting sind die Polynukleotide und Polypeptide gemäß Tabelle 1 fähig, den Ertrag von transgenen Pflanzen zu verbessern. Tabelle 1
Bezeichnung des Gens | Organismus | Polynukleotid SEQ ID NR. | Aminosäure SEQ ID NR. |
b0757 | Escherichia coli | 1 | 2 |
GM59594085 | Glycine max | 3 | 4 |
GM59708137 | G. max | 5 | 6 |
ZMBFb0152K10 | Zea mays | 7 | 8 |
b2464 | E. coli | 9 | 10 |
BN43182918 | Brassica napus | 11 | 12 |
GM48926546 | G. max | 13 | 14 |
b2990 | E. coli | 15 | 16 |
YER065C | Saccaromyces cerevisiae | 17 | 18 |
YIR037W | S. cerevisiae | 19 | 20 |
BN42261838 | B. napus | 21 | 22 |
BN43722096 | B. napus | 23 | 24 |
BN51407729 | B. napus | 25 | 26 |
GM50585691 | G. max | 27 | 28 |
GMsa56c07 | G. max | 29 | 30 |
GMsp82f11 | G. max | 31 | 32 |
GMss66f03 | G. max | 33 | 34 |
HA03MC1446 | Helianthus anuus | 35 | 36 |
HV03MC9784 | Hordeum vulgare | 37 | 38 |
OS34914218 | Oryza sativa | 39 | 40 |
ZM61990487 | Z. mays | 41 | 42 |
ZM68466470.r01 | Z. mays | 43 | 44 |
slr1269 | Synechocystis sp. | 45 | 46 |
SLL1323 | Synechocystis sp. | 47 | 48 |
Gmsb38b04 | G. max | 49 | 50 |
YMR015C | S. cerevisiae | 51 | 52 |
GMso65h07 | G. max | 53 | 54 |
-
Gemäß einer Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in funktioneller Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promotor codiert; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Chloroplastentransitpeptid codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Galactokinasepolypeptid codiert, transformiert ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
-
Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in funktioneller Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promotor codiert, und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Transaldolase-A-Polypeptid codiert, transformiert ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
-
Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in funktioneller Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promotor codiert und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Hydrogenase-2-Accessory-Polypeptid codiert, transformiert ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
-
Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in funktioneller Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promotor, der dazu in der Lage ist, die Genexpression in Blättern zu verstärken, codiert; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein mitochondriales Transitpeptid codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für Volllängen-Isocitratlyasepolypeptid codiert, transformiert ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
-
Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in funktioneller Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promotor codiert; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Chloroplastentransitpeptid codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Phospholipidhydroperoxidglutathionperoxidasepolypeptid codiert, transformiert ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
-
Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in funktioneller Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promotor codiert, und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-gamma-Glutamyltranspeptidasepolypeptid codiert, transformiert ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
-
Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in funktioneller Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promotor codiert; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein mitochondriales Transitpeptid codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-ATP-Synthase-Untereinheit-B'-Polypeptid codiert, transformiert ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
-
Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in funktioneller Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promotor codiert; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Chloroplastentransitpeptid codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-C-22-Steroldesaturasepolypeptid codiert, transformiert ist, wobei die transgene Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, einen erhöhten Ertrag aufweist.
-
Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung einen Semen, der von der transgenen Pflanze der Erfindung erzeugt worden ist, bereit, wobei der Semen für ein Transgen umfassend die oben beschriebenen Expressionsvektoren reinerbig ist. Pflanzen, die von den Samen der Erfindung hervorgehen, weisen unter normalen Bedingungen oder unter Stressbedingungen verglichen mit einer Wildtypsorte der Pflanze eine erhöhte Toleranz gegen einen Umweltstress und/oder ein erhöhtes Pflanzenwachstum und/oder einen erhöhten Ertrag auf.
-
Gemäß noch einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung Produkte, die von oder aus den transgenen Pflanzen der Erfindung, ihren Pflanzenteilen oder ihren Semen erzeugt worden sind, wie ein Nahrungsmittel, Futtermittel, einen Nahrungsmittelzusatzstoff, einen Futtermittelzusatzstoff, eine Faser, ein Kosmetikum oder ein Pharmazeutikum.
-
Die Erfindung stellt weiterhin gewisse isolierte Polynukleotide, die in Tabelle 1 identifiziert sind, und gewisse isolierte Polypeptide, die in Tabelle 1 identifiziert sind, bereit. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein rekombinanter Vektor, umfassend ein isoliertes Polynukleotid der Erfindung.
-
Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der oben genannten transgenen Pflanze, wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor umfassend ein isoliertes Polynukleotid der Erfindung transformiert und aus der Pflanzenzelle eine transgene Pflanze erzeugt, die das von dem Polynukleotid codierte Polypeptid exprimiert. Die Expression des Polypeptids in der Pflanze führt im Vergleich zu einer Wildtypsorte der Pflanze zu einer erhöhten Toleranz gegenüber einem Umweltstress und/oder einem erhöhten Wachstum und/oder einem erhöhten Ertrag unter normalen Bedingungen und/oder Stressbedingungen.
-
Gemäß noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen der Toleranz einer Pflanze gegenüber einem Umweltstress und/oder zum Erhöhen des Wachstums einer Pflanze und/oder zum Erhöhen des Ertrags einer Pflanze bereit. Das Verfahren umfasst die Schritte des Transformierens einer Pflanzenzelle mit einer Expressionskassette umfassend ein isoliertes Polynukleotid der Erfindung und das Erzeugen einer transgenen Pflanze aus der Pflanzenzelle, wobei die transgene Pflanze das Polynukleotid umfasst.
-
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
-
1 zeigt ein Alignment der Aminosäuresequenzen der Galactokinasen mit den Bezeichnungen b0757 (SEQ ID NR.: 2), GM59594085 (SEQ ID NR.: 4), GM59708137 (SEQ ID NR.: 6) und ZMBFb0152K10 (SEQ ID NR.: 8). Das Alignment wurde unter Verwendung von Align X von Vector NTI erstellt.
-
2 zeigt ein Alignment der Aminosäuresequenzen der Transaldolase-A-Proteine mit den Bezeichnungen b2464 (SEQ ID NR.: 10), BN43182918 (SEQ ID NR.: 12) und GM48926546 (SEQ ID NR.: 14). Das Alignment wurde unter Verwendung von Align X von Vector NTI erstellt.
-
3 zeigt ein Alignment der Aminosäuresequenzen der Phospholipidhydroperoxidglutathionperoxidasen mit den Bezeichnungen YIR037W (SEQ ID NR.: 20), BN42261838 (SEQ ID NR.: 22), BN43722096 (SEQ ID NR.: 24), BN51407729 (SEQ ID NR.: 26), GM50585691 (SEQ ID NR.: 28), GMsa56c07 (SEQ ID NR.: 30), GMsp82f11 (SEQ ID NR.: 32), GMss66f03 (SEQ ID NR.: 34), HA03MC1446 (SEQ ID NR.: 36), HV03MC9784 (SEQ ID NR.: 38), OS34914218 (SEQ ID NR.: 40), ZM61990487 (SEQ ID NR.: 42) und ZM68466470.r01 (SEQ ID NR.: 44). Das Alignment wurde unter Verwendung von Align X von Vector NTI erstellt.
-
4 zeigt ein Alignment der Aminosäuresequenzen der ATP-Synthase-Untereinheit-B'-Proteine mit den Bezeichnungen SLL1323 (SEQ ID NR.: 48) und Gmsb38b04 (SEQ ID NR.: 50). Das Alignment wurde unter Verwendung von Align X von Vector NTI erstellt.
-
5 zeigt ein Alignment der Aminosäuresequenzen der C-22-Steroldesaturasen mit den Bezeichnungen YMR015C (SEQ ID NR.: 52) und GMso65h07 (SEQ ID NR.: 54). Das Alignment wurde unter Verwendung von Align X von Vector NTI erstellt.
-
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
In der gesamten vorliegenden Anmeldung wird auf verschiedene Veröffentlichungen Bezug genommen. Die Offenbarungen von all diesen Veröffentlichungen und die Literaturangaben, die innerhalb dieser Veröffentlichungen zitiert werden, werden hiermit vollständig durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen, um den Stand der Technik, auf den sich die vorliegende Erfindung bezieht, vollständiger zu beschreiben. Die im vorliegenden Zusammenhang verwendete Terminologie dient lediglich der Beschreibung Von bestimmten Ausführungsformen und ist nicht als einschränkend zu verstehen. Im vorliegenden Zusammenhang kann „ein/e” ein/e oder mehr bedeuten, je nach dem Zusammenhang, in dem dieses Wort verwendet wird. So kann zum Beispiel, wenn „eine Zelle” erwähnt wird, dies bedeuten, dass mindestens eine Zelle verwendet werden kann.
-
Gemäß einer Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze, die ein in Tabelle 1 identifiziertes isoliertes Polynukleotid in dem subzellulären Kompartiment und Gewebe, das darin angegeben ist, überexprimiert, bereit. Die erfindungsgemäße transgene Pflanze weist im Vergleich zu einer Wildtypsorte der Pflanze einen verbesserten Ertrag auf. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff „verbesserter Ertrag” jegliche Verbesserung bezüglich des Ertrags von irgendeinem gemessenen Pflanzenprodukt, wie Korn, Frucht oder Faser. Erfindungsgemäß können Veränderungen bei unterschiedlichen phänotypischen Merkmalen den Ertrag verbessern. So sind zum Beispiel geeignete Maße für einen verbesserten Ertrag Parameter wie die Blütenorganentwicklung, die Anlage von Wurzeln, die Wurzelbiomasse, die Anzahl Samen, das Samengewicht, der Harvest Index, Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, Blattbildung, Phototropismus, Apikaldominanz und Fruchtentwicklung, was keine Einschränkung darstellen soll. Jegliche Ertragserhöhung ist erfindungsgemäß ein verbesserter Ertrag. So kann die Ertragsverbesserung zum Beispiel eine Erhöhung von 0,1%, 0,5%, 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% oder mehr bei einem der gemessenen Parameter umfassen. So ist zum Beispiel eine Erhöhung des in Bushel/Acre angegebenen Ertrags von Sojabohnen oder Mais, die von einer Kultur umfassend Pflanzen, die für die Nukleotide und Polypeptide gemäß Tabelle 1 transgen sind, verglichen mit dem in Bushel/Acre ausgedrückten Ertrag von unbehandelten Sojabohnen oder unbehandeltem Mais, die/der unter denselben Bedingungen herangezogen wird, ein erfindungsgemäß verbesserter Ertrag.
-
Wie im vorliegenden Text definiert versteht man unter einer „transgenen Pflanze” eine Pflanze, die unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechnik dahingehend verändert wurde, dass sie eine isolierte Nukleinsäure enthält, die sonst in der Pflanze nicht vorliegen würde. Im vorliegenden Zusammenhang beinhaltet der Ausdruck „Pflanze” eine ganze Pflanze, Pflanzenzellen und Pflanzenteile. Zu Pflanzenteilen zählen, sind jedoch nicht einschränkend: Stängel, Wurzeln, Ovula, Staubblätter, Blätter, Embryonen, meristematische Regionen, Kallusgewebe, Gametophyten, Sporophyten, Pollen, Mikrosporen und dergleichen. Die erfindungsgemäße transgene Pflanze kann pollensteril oder pollenfertil sein und kann weiterhin Transgene beinhalten, bei denen es sich nicht um diejenigen, die die im vorliegenden Text beschriebenen isolierten Polynukleotide beinhalten, handelt.
-
Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Sorte” auf eine Gruppe von Pflanzen innerhalb einer Art, denen konstante Charakteristika gemeinsam sind, die sie von der typischen Form und von anderen möglichen Sorten innerhalb dieser Art unterscheiden. Eine Sorte weist nicht nur mindestens ein unterscheidbares Merkrmal auf, sondern ist auch durch ein gewisses Ausmaß an Variation zwischen den Einzelorganismen innerhalb der Sorte gekennzeichnet, und zwar in erster Linie auf Grundlage der Mendelschen Aufspaltung der Merkmale unter der Nachkommenschaft von aufeinanderfolgenden Generationen. Eine Sorte gilt als „reinerbig” für ein bestimmtes Merkmal, wenn sie genetisch für dieses Merkmal so stark homozygot ist, dass, wenn die reinerbige Sorte selbstbestäubt wird, kein wesentliches Ausmaß an unabhängiger Aufspaltung dieses Merkmals innerhalb der Nachkommenschaft beobachtet wird. Bei der vorliegenden Erfindung entsteht das Merkmal aufgrund der transgenen Expression von einem oder mehreren isolierten Polynukleotiden, die in eine Pflanzensorte eingeführt werden. Ebenso im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff „Wildtypsorte” eine Gruppe von Pflanzen, die aus Vergleichszwecken als Kontrollpflanze analysiert werden, wobei die Pflanze der Wildtypsorte mit der transgenen Pflanze (einer Pflanze, die mit einem erfindungsgemäßen isolierten Polynukleotid transformiert wurde) mit der Ausnahme, dass die Pflanze der Wildtypsorte nicht mit einem erfindungsgemäßen isolierten Polynukleotid transformiert wurde, identisch ist. Der Begriff „Wildtyp” bezieht sich im vorliegenden Zusammenhang auf eine Pflanzenzelle, einen Samen, einen Pflanzenbestandteil, ein Pflanzengewebe, ein Pflanzenorgan oder eine ganze Pflanze, die/der/das nicht mit einem erfindungsgemäßen isolierten Polynukleotid genetisch modifiziert worden ist.
-
Der Begriff „Kontrollpflanze” bezieht sich im vorliegenden Zusammenhang auf eine Pflanzenzelle, ein Explantat, einen Samen, einen Pflanzenbestandteil, ein Pflanzengewebe, ein Pflanzenorgan oder eine ganze Pflanze, die/der/das verwendet wird, um einen Vergleich gegen eine transgene oder genetisch modifizierte Pflanze anzustellen, um einen verbesserten Phänotyp oder ein wünschenswertes Merkmal in der transgenen Pflanze oder der genetisch modifizierten Pflanze zu identifizieren. Bei einer „Kontrollpflanze” kann es sich in manchen Fällen um eine transgene Pflanzenlinie handeln, die einen Blankvektor oder ein Markergen umfasst, jedoch das interessierende rekombinante Polynukleotid, das in der transgenen Pflanze oder der genetisch modifizierten Pflanze, die ausgewertet wird, vorhanden ist, nicht enthält. Eine Kontrollpflanze kann eine Pflanze derselben Linie oder Sorte wie die transgene Pflanze oder die genetisch modifizierte Pflanze, die geprüft wird, sein oder eine andere Linie oder Sorte, wie eine Pflanze, von der bekannt ist, dass sie einen spezifischen Phänotyp, ein spezifisches Charakteristikum oder einen bekannten Genotyp aufweist. Eine geeignete Kontrollpflanze würde eine genetisch nichtmodifizierte bzw. nichttransgene Pflanze der Elternlinie, die eingesetzt wurde, um eine transgene Pflanze im vorliegenden Zusammenhang zu erzeugen, beinhalten.
-
Wie im vorliegenden Zusammenhang definiert sind die Begriffe „Nukleinsäure” und „Polynukleotid” austauschbar und beziehen sich auf RNA oder DNA, die geradkettig oder verzweigt, einzel- oder doppelsträngig oder ein Hybrid davon ist. Der Begriff umfasst auch RNA/DNA-Hybride. Ein „isoliertes” Nukleinsäuremolekül ist eines, das von den anderen Nukleinsäuremolekülen, die in dem natürlichen Ausgangsmaterial der Nukleinsäure vorliegen (d. h. Sequenzen, die für andere Polypeptide codieren), im Wesentlichen getrennt ist. So zum Beispiel wird eine klonierte Nukleinsäure als isoliert betrachtet. Eine Nukleinsäure wird auch dann als isoliert betrachtet, wenn sie durch das Eingreifen des Menschen verändert wurde oder an einem Lokus oder einer Stelle platziert wurde, bei dem/der es sich nicht um ihren natürlichen Ort handelt, oder wenn sie durch Transformation in eine Zelle eingeführt wurde. Weiterhin kann ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, wie ein cDNA-Molekül, frei von einem Teil des sonstigen Zellmaterials, mit dem es auf natürliche Weise assoziiert ist, bzw. von dem Kulturmedium, wenn es mittels Rekombinationstechniken hergestellt wurde, oder chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wurde, sein. Obwohl es gegebenenfalls eine untranslatierte Sequenz, die sowohl am 3'- als auch am 5'-Ende der Codierregion eines Gens vorliegen kann, umfassen kann, kann es bevorzugt sein, die Sequenzen, die die Codierregion in ihrem natürlich vorkommenden Replikon auf natürliche Weise flankieren, zu entfernen.
-
Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Umweltstress” auf eine suboptimale Bedingung, die mit Salinitätsstress, Trockenheitsstress, Stickstoffstress, Temperaturstress, Metallstress, chemischem Stress, pathogen bedingtem Stress oder oxidativem Stress oder einer beliebigen Kombination davon einhergeht. Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Trockenheit” auf eine Umweltbedingung, wo die Wassermenge, die verfügbar ist, um das pflanzliche Wachstum bzw. die pflanzliche Entwicklung zu unterstützen, suboptimal ist. Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Frischgewicht” auf alles in der Pflanze inklusive Wasser. Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Trockengewicht” auf alles in der Pflanze außer Wasser, und er beinhaltet zum Beispiel Kohlenhydrate, Proteine, die und mineralische Nährstoffe.
-
Zur Erzeugung einer erfindungsgemäßen transgenen Pflanze kann jede beliebige Pflanzenart transformiert werden. Bei der erfindungsgemäßen transgenen Pflanze kann es sich um eine dikotyle Pflanze oder eine monokotyle Pflanze handeln. Beispielhaft und nicht einschränkend können erfindungsgemäße transgene Pflanzen von jeder beliebigen der folgenden dikotylen Pflanzenfamilien abstammen: Leguminosae, darunter Pflanzen wie Erbse, Luzerne und Sojabohne; Umbelliferae, darunter Pflanzen wie Karotte und Sellerie; Solanaceae, darunter Pflanzen wie Tomate, Kartoffel, Aubergine, Tabak und Paprika; Cruciferae, insbesondere die Gattung Brassica, die Pflanzen wie Raps, Rübe, Kohl, Blumenkohl und Brokkoli beinhaltet; und A. thaliana; Compositae, darunter Pflanzen wie Salat; Malvaceae, darunter Baumwolle; Fabaceae, darunter Pflanzen wie Erdnuss und dergleichen. Erfindungsgemäße transgene Pflanzen können von monokotylen Pflanzen abstammen, wie zum Beispiel Weizen, Gerste, Sorghumhirse, Millethirse, Roggen, Triticale, Mais, Reis, Hafer und Zuckerrohr. Erfindungsgemäße transgene Pflanzen können auch Bäume wie Apfel, Birne, Quitte, Pflaume, Kirsche, Pfirsich, Nektarine, Aprikose, Papaya, Mango und andere Gehölzarten, darunter Koniferen und laubabwerfende Bäume wie Pappel, Kiefer, Sequoia, Zeder, Eiche und dergleichen sein. Besonders bevorzugt sind Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Reis, Raps, Canola, Sojabohne, Mais, Baumwolle und Weizen.
-
Gemäß einer Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in funktioneller Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promotor codiert; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Chloroplastentransitpeptid codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Galactokinasepolypeptid codiert; transformiert ist, wobei die transgene Pflanze einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer Wildtyppflanze der gleichen Sorte ohne die Expressionskassette zeigt. Wie aus Beispiel 2 unten hervorgeht, zeigen transgene Arabidopsis-Pflanzen, die das E. coli-Gen b0757 (SEQ ID NR.: 1), das auf Chloroplasten zielt, enthalten, einen im Vergleich mit Arabidopsis-Kontrollpflanzen höheren Ertrag. Das b0757-Gen codiert für Galactokinase und ist zum Teil durch das Vorhandensein der Signatursequenzen GHMP_kinases_C (Pfam: PF08544) und GHMP_kinases_N (PF00288) gekennzeichnet. Beispiele für solche Signatursequenzen finden sich in den in 1 gezeigten Galactokinaseproteinen.
-
Die transgene Pflanze dieser Ausführungsform kann ein beliebiges Polynukleotid umfassen, das für ein Galactokinasepolypeptid codiert. Vorzugsweise umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid mit Galactokinaseaktivität codiert, wobei das Polypeptid wenigstens eine Signatursequenz ausgewählt aus einer GHMP_kinases_C- und einer GHMP_kinases_N-Signatursequenz enthält, wobei die GHMP_kinases_C-Signatursequenz aus der aus den Aminosäuren 278 bis 362 von SEQ ID NR.: 2; den Aminosäuren 378 bis 426 von SEQ ID NR.: 4; den Aminosäuren 326 bis 404 von SEQ ID NR.: 6 und den Aminosäuren 391 bis 473 von SEQ ID NR.: 8 bestehenden Gruppe ausgewählt ist und wobei die GHMP_kinases_N-Signatursequenz aus der aus den Aminosäuren 114 bis 182 von SEQ ID NR.: 2; den Aminosäuren 152 bis 219 von SEQ ID NR.: 4; den Aminosäuren 138 bis 205 von SEQ ID NR.: 6 und den Aminosäuren 159 bis 226 von SEQ ID NR.: 8 bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Vorzugsweise umfasst das Polypeptid sowohl eine GHMP_kinases_C-Signatursequenz als auch eine GHMP_kinases_N-Signatursequenz. Am meisten bevorzugt umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Galactokinasepolypeptid mit einer Sequenz ausgewählt aus der aus den Aminosäuren 1 bis 382 von SEQ ID NR.: 2; den Aminosäuren 1 bis 460 von SEQ ID NR.: 4; den Aminosäuren 1 bis 431 von SEQ ID NR.: 6 und den Aminosäuren 1 bis 504 von SEQ ID NR.: 8 bestehenden Gruppe codiert.
-
Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in funktioneller Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promotor; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Transaldolase-A-Polypeptid codiert; transformiert ist, wobei die transgene Pflanze einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer Wildtyppflanze der gleichen Sorte ohne die Expressionskassette zeigt. Wie aus Beispiel 2 unten hervorgeht, zeigen transgene Arabidopsis-Pflanzen, die das E. coli-Gen b2464 (SEQ ID NR.: 9), das für ein Transadolase-A-Polypeptid codiert, enthalten, und die transgenen Pflanzen dieser Ausführungsform einen im Vergleich mit Arabidopsis-Kontrollpflanzen höheren Ertrag. Transaldolase-A-Polypeptide sind zum Teil durch das Vorhandensein einer Transaldolase-(PF00923-)Signatursequenz gekennzeichnet. Beispiele für solche Signatursequenzen finden sich in den in 2 gezeigten Transaldolase-A-Proteinen.
-
Die transgene Pflanze dieser Ausführungsform kann ein beliebiges Polynukleotid umfassen, das für ein Transaldolase-A-Protein codiert. Vorzugsweise umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid mit Transaldolase-A-Aktivität codiert, wobei das Polypeptid eine Transaldolase-Signatursequenz ausgewählt aus der aus den Aminosäuren 12 bis 312 von SEQ ID NR.: 10; den Aminosäuren 1 bis 275 von SEQ ID NR.: 12 und den Aminosäuren 1 bis 277 von SEQ ID NR.: 14 bestehenden Gruppe umfasst. Am meisten bevorzugt umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Transaldolase-A-Polypeptid mit einer Sequenz ausgewählt aus der aus den Aminosäuren 1 bis 316 von SEQ ID NR.: 10; den Aminosäuren 1 bis 284 von SEQ ID NR.: 12 und den Aminosäuren 1 bis 283 von SEQ ID NR.: 14 bestehenden Gruppe codiert.
-
Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in funktioneller Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promotor codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Hydrogenase-2-Accessory-Polypeptid codiert; transformiert ist, wobei die transgene Pflanze einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer Wildtyppflanze der gleichen Sorte ohne die Expressionskassette zeigt. Wie aus Beispiel 2 unten hervorgeht, zeigen transgene Arabidopsis-Pflanzen, die das E. coli-Gen b2990 (SEQ ID NR.: 15) enthalten, einen im Vergleich mit Arabidopsis-Kontrollpflanzen höheren Ertrag. Das b2990-Gen codiert für ein Hydrogenase-2-Accessory-Protein. In E. coli ist dieses Protein unter anaeroben Bedingungen ein chaperonähnliches Protein, welches für die Erzeugung von aktiver Hydrogenase 2, bei der es sich um eine Aufnahmehydrogenase [NiFe-Hydrogenase] handelt, die zusammen mit Hydrogenase 1 die H2-Oxidation mit der Fumaratreduktion koppelt, erforderlich ist. Hydrogenase-2-Accessory-Proteine sind zum Teil durch das Vorhandensein einer HupF_HypC-(PF01455-)Signatursequenz gekennzeichnet.
-
Die transgene Pflanze dieser Ausführungsform kann ein beliebiges Polynukleotid umfassen, das für ein Hydrogenase-2-Accessory-Protein codiert. Vorzugsweise umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid mit Hydrogenase-Assembly-Chaperonaktivität codiert, wobei das Polypeptid eine HupF_HypC Signatursequenz mit den Aminosäuren 1 bis 79 von SEQ ID NR.: 16 umfasst. Am meisten bevorzugt umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Hydrogenase-2-Accessory-Protein mit einer die Aminosäuren 1 bis 82 von SEQ ID NR.: 16 umfassenden Sequenz codiert.
-
Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in funktioneller Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promotor, der dazu in der Lage ist, die Genexpression in Blättern zu verstärken, codiert; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein mitochondriales Transitpeptid codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Isocitratlyasepolypeptid codiert; transformiert ist, wobei die transgene Pflanze einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer Wildtyppflanze der gleichen Sorte ohne die Expressionskassette zeigt. Wie aus Beispiel 2 unten hervorgeht, zeigen transgene Arabidopsis-Pflanzen, die das S. cerevisiae-Gen YER065C (SEQ ID NR.: 17), das für Isocitratlyase codiert und auf Mitochondrien zielt, enthalten, einen im Vergleich mit Arabidopsis-Kontrollpflanzen höheren Ertrag. Isocitratlyasen sind zum Teil durch das Vorhandensein einer ICL-(PF00463-)Signatursequenz gekennzeichnet.
-
Die transgene Pflanze dieser Ausführungsform kann ein beliebiges Polynukleotid umfassen, das für eine Isocitratlyase codiert. Vorzugsweise umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid mit Isocitratlyaseaktivität codiert, wobei das Polypeptid eine ICL-Signatursequenz mit den Aminosäuren 22 bis 550 von SEQ ID NR.: 18 umfasst. Am meisten bevorzugt umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für eine Isocitratlyase mit einer die Aminosäuren 1 bis 557 von SEQ ID NR.: 18 umfassenden Sequenz codiert.
-
Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in funktioneller Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promotor codiert; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Chloroplastentransitpeptid codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Phospholipidhydroperoxideglutathionperoxidaspolypeptid codiert; transformiert ist, wobei die transgene Pflanze einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer Wildtyppflanze der gleichen Sorte ohne die Expressionskassette zeigt. Wie aus Beispiel 2 unten hervorgeht, zeigen transgene Arabidopsis-Pflanzen, die das S. cerevisiae-Gen YIR037W (SEQ ID NR.: 19), das auf Chloroplasten zielt, enthalten, einen im Vergleich mit Arabidopsis-Kontrollpflanzen höheren Ertrag. Das YIR037W-Gen codiert codiert für ein Phospholipidhydroperoxidglutathionperoxidaseprotein, welches als ein Sensor für intrazelluläre Hyperoxidkonzentrationen fungiert, und für einen Transducer des Redoxsignals zum Transkriptionsfaktor Yap1, welcher die Hyperoxidkonzentrationen in S. cerevisiae reguliert. Phospholipidhydroperoxidglutathionperoxidasen sind zum Teil durch das Vorhandensein einer für die Gluthathionperoxidase-Genfamilie repräsentativen GSHPx-(PF00255-)Signatursequenz gekennzeichnet. Beispiele für solche Signatursequenzen finden sich in den in 3 gezeigten Phospholipidhydroperoxidglutathionperoxidasen.
-
Die transgene Pflanze dieser Ausführungsform kann ein beliebiges Polynukleotid umfassen, das für eine Phospholipidhydroperoxidglutathionperoxidase codiert. Vorzugsweise umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid mit Phospholipidhydroperoxidglutathionperoxidaseaktivität codiert, wobei das Polypeptid eine GSHPx Signatursequenz ausgewählt aus der aus den Aminosäuren 4 bis 111 von SEQ ID NR.: 20; Aminosäuren 10 bis 118 von SEQ ID NR.: 22; Aminosäuren 37 bis 145 von SEQ ID NR.: 24; Aminosäuren 9 bis 117 von SEQ ID NR.: 26; Aminosäuren 9 bis 117 von SEQ ID NR.: 28; Aminosäuren 9 bis 117 von SEQ ID NR.: 30; Aminosäuren 12 bis 120 von SEQ ID NR.: 32; Aminosäuren 12 bis 120 von SEQ ID NR.: 34; Aminosäuren 11 bis 119 von SEQ ID NR.: 36; Aminosäuren 12 bis 120 von SEQ ID NR.: 38; Aminosäuren 9 bis 117 von SEQ ID NR.: 40; Aminosäuren 12 bis 120 von SEQ ID NR.: 42 und Aminosäuren 24 bis 132 von SEQ ID NR.: 44 bestehenden Gruppe umfasst. Am meisten bevorzugt umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für eine Phospholipidhydroperoxidglutathionperoxidase mit einer aus der aus den Aminosäuren 1 bis 163 von SEQ ID NR.: 20; den Aminosäuren 1 bis 169 von SEQ ID NR.: 22; den Aminosäuren 1 bis 201 von SEQ ID NR.: 24; den Aminosäuren 1 bis 169 von SEQ ID NR.: 26; den Aminosäuren 1 bis 166 von SEQ ID NR.: 28; den Aminosäuren 1 bis 166 von SEQ ID NR.: 30; den Aminosäuren 1 bis 170 von SEQ ID NR.: 32; den Aminosäuren 1 bis 170 von SEQ ID NR.: 34; den Aminosäuren 1 bis 185 von SEQ ID NR.: 36; den Aminosäuren 1 bis 176 von SEQ ID NR.: 38; den Aminosäuren 1 bis 166 von SEQ ID NR.: 40; den Aminosäuren 1 bis 170 von SEQ ID NR.: 42 und Aminosäuren 1 bis 182 von SEQ ID NR.: 44 bestehenden Gruppe ausgewählten Sequenz codiert.
-
Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in funktioneller Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promotor codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-gamma-Glutamyltranspeptidasepolypeptid codiert; transformiert ist, wobei die transgene Pflanze einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer Wildtyppflanze der gleichen Sorte ohne die Expressionskassette zeigt. Gegebenenfalls umfasst die Expressionskassette weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, das für Chloroplastentransitpeptide codiert, in funktioneller Verknüpfung mit dem isolierten Polynukleotid, das für einen Promotor codiert, und dem isolierten Poynukleotid, das für ein Volllängen-gamma-Glutamyltranspeptidasepolypeptid codiert. Wie aus Beispiel 2 unten hervorgeht, zeigen transgene Arabidopsis-Pflanzen, die das Synechocystis sp.-Gen slr1269 (SEQ ID NR.: 45), welches für ein gamma-Glutamyltranspeptidasepolypeptid codiert, enthalten, einen im Vergleich mit Arabidopsis-Kontrollpflanzen höheren Ertrag. Gamma-glutamyltranspeptidasen sind zum Teil durch das Vorhandensein einer G_glu_transpept-(PF01019-)Signatursequenz gekennzeichnet.
-
Die transgene Pflanze dieser Ausführungsform kann ein beliebiges Polynukleotid umfassen, das für eine gamma-Glutamyltranspeptidase codiert. Vorzugsweise umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid mit gamma-Glutamyltranspeptidaseaktivität codiert, wobei das Polypeptid eine G_glu_transpept-Signatursequenz mit den Aminosäuren 21 bis 511 von SEQ ID NR.: 46 umfasst. Am meisten bevorzugt umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für eine gamma-Glutamyltranspeptidase mit einer die Aminosäuren 1 bis 518 von SEQ ID NR.: 46 umfassenden Sequenz codiert.
-
Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in funktioneller Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promotor codiert; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein mitochondriales Transitpeptid codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-ATP-Synthase-Untereinheit-B'-Polypeptid codiert; transformiert ist, wobei die transgene Pflanze einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer Wildtyppflanze der gleichen Sorte ohne die Expressionskassette zeigt. Wie aus Beispiel 2 unten hervorgeht, zeigen transgene Arabidopsis-Pflanzen, die das Synechocystis sp.-Gen SLL1323 (SEQ ID NR.: 47), das auf Mitochondrien zielt, enthalten, einen im Vergleich mit Arabidopsis-Kontrollpflanzen höheren Ertrag. Das SLL1323-Gen codiert für ein ATP-Synthase-Untereinheit-B'-Protein. Die Untereinheiten B und B' stammen aus dem F0-Komplex in F-ATPasen, die sich in Chloroplastenplasmamembranen und in bakteriellen Plasmamembranen finden und die Teil der peripheren Verbindungsachsen sind, die die F1- und die F0-Komplexe miteinander verbinden. ATP-Synthase-Untereinheit-B'-Proteine sind zum Teil durch das Vorhandensein einer für die ATP-Synthase-B/B'-CF(0)-Genfamilie repräsentativen ATP-synt_B-(PF00430-)Signatursequenz gekennzeichnet. Beispiele für solche Signatursequenzen finden sich in den in 4 gezeigten ATP-Synthase-Untereinheit-B'-Proteinen.
-
Die transgene Pflanze dieser Ausführungsform kann ein beliebiges Polynukleotid umfassen, das für ein ATP-Synthase-Untereinheit-B'-Protein codiert. Vorzugsweise umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid mit ATP-Synthase-Untereinheit-B'-Aktivität codiert, wobei das Polypeptid eine aus der aus den Aminosäuren 7 bis 138 von SEQ ID NR.: 48 und den Aminosäuren 82 bis 213 von SEQ ID NR.: 50 bestehenden Gruppe ausgewählte ATP-synt_B Signatursequenz umfasst. Am meisten bevorzugt umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein ATP-Synthase-Untereinheit-B'-Protein mit einer die Aminosäuren 1 bis 143 von SEQ ID NR.: 48 und Aminosäuren 1 bis 215 von SEQ ID NR.: 50 umfassenden Sequenz codiert.
-
Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette umfassend, in funktioneller Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promotor; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Chloroplastentransitpeptid codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-C-22 Steroldesaturasepolypeptid codiert; transformiert ist, wobei die transgene Pflanze einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer Wildtyppflanze der gleichen Sorte ohne die Expressionskassette zeigt. Gen YMR015C (SEQ ID NR.: 51) codiert für C-22-Steroldesaturase, bei der es sich um ein Cytochrom-P450-Enzym (ERG5) handelt, das in Hefe die Bildung der C-22(23)-Doppelbindung in der Sterolseitenkette in der Ergosterolbiosynthese katalysiert. C-22-Steroldesaturaseenzyme sind zum Teil durch das Vorhandensein eines K-Helix-Motivs (xExxR), eine PERF-Konsensussequenz (PxRx) und ein den Protoporphyrin-IX-Häm-Cysteinliganden umgebenedes FGRCG-Motiv neben dem C-Terminus gekennzeichnet. Beispiele für solche konservierten Motive finden sich in den in 5 gezeigten C-22-Steroldesaturasepolypeptiden.
-
Die transgene Pflanze dieser Ausführungsform kann ein beliebiges Polynukleotid umfassen, das für eine C-22-Steroldesaturase codiert. Vorzugsweise umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid mit C-22-Steroldesaturaseaktivität codiert, wobei das Polypeptid eine Domäne mit einem K-Helix-Motiv, einem PERF-Motiv und einem FGRCG-Motiv umfasst, wobei das K-Helix-Motiv eine aus der aus den Aminosäuren 395 bis 398 von SEQ ID NR.: 52 und den Aminosäuren 365 bis 368 von SEQ ID NR.: 54 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; das PERF-Motiv eine aus der aus den Aminosäuren 450 bis 453 von SEQ ID NR.: 52 und den Aminosäuren 418 bis 421 von SEQ ID NR.: 54 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz aufweist; und das FGRCG-Motiv eine aus der aus den Aminosäuren 469 bis 478 von SEQ ID NR.: 52 und den Aminosäuren 438 bis 447 von SEQ ID NR.: 54 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz umfasst. Besonders bevorzugt codiert das Polynukleotid für ein Volllängenpolypeptid mit C-22-Steroldesaturaseaktivität, wobei das Polypeptid eine aus der aus den Aminosäuren 61 bis 529 von SEQ ID NR.: 52 und den Aminosäuren 27 bis 498 von SEQ ID NR.: 54 bestehenden Gruppe ausgewählte Domäne umfasst. Am meisten bevorzugt umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für eine C-22-Steroldesaturase mit einer die Aminosäuren 1 bis 538 von SEQ ID NR.: 52 und die Aminosäuren 1 bis 513 von SEQ ID NR.: 54 umfassenden Sequenz codiert.
-
Die Erfindung stellt weiterhin einen Samen bereit, der für die im vorliegenden Text beschriebenen Expressionskassetten (im vorliegenden Text auch als „Transgene” bezeichnet) reinerbig ist, wobei transgene Pflanzen, die aus diesem Samen herangezogen werden, im Vergleich zu einer Wildtypsorte der Pflanze einen erhöhten Ertrag aufweisen. Die Erfindung stellt auch ein Produkt bereit, das von oder aus den transgenen Pflanzen, die das Polynukleotid exprimieren, ihren Pflanzenteilen oder ihren Samen erzeugt wird. Das Produkt kann unter Verwendung von verschiedenen, in der Fachwelt gut bekannten Verfahren erhalten werden. Im vorliegenden Zusammenhang beinhaltet das Wort „Produkt” ein Nahrungsmittel, Futtermittel, einen Nahrungsmittelzusatzstoff, einen Futterzusatzstoff, eine Faser, ein Kosmetikum oder ein Pharmazeutikum, ist jedoch nicht hierauf beschränkt. Nahrungsmittel gelten als Zusammensetzungen, die für die Ernährung oder als Ergänzung der Ernährung eingesetzt werden. Tierfuttermittel und Tierfutterzusatzstoffe insbesondere gelten als Nahrungsmittel. Die Erfindung stellt weiterhin ein Agrarprodukt bereit, das von einer der transgenen Pflanzen, einem der transgenen Pflanzenteile oder einem der transgenen Pflanzensamen gebildet wird. Zu den Agrarprodukten zählen Pflanzenextrakte, Proteine, Aminosäuren, Kohlenhydrate, Fette, Öle, Polymere, Vitamine und dergleichen, was jedoch keine Einschränkung darstellen soll.
-
Die Erfindung stellt außerdem ein isoliertes Polynukleotid mit einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR.: 3; SEQ ID NR.: 5; SEQ ID NR.: 7; SEQ ID NR.: 11; SEQ ID NR.: 13; SEQ ID NR.: 21; SEQ ID NR.: 23; SEQ ID NR.: 25; SEQ ID NR.: 27; SEQ ID NR.: 29; SEQ ID NR.: 31; SEQ ID NR.: 33; SEQ ID NR.: 35; SEQ ID NR.: 37; SEQ ID NR.: 39; SEQ ID NR.: 41; SEQ ID NR.: 43; SEQ ID NR.: 49; und SEQ ID NR.: 53 bereit. Das isolierte Polynukleotid der Erfindung umfasst auch ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR.: 4; SEQ ID NR.: 6; SEQ ID NR.: 8; SEQ ID NR.: 12; SEQ ID NR.: 14; SEQ ID NR.: 22; SEQ ID NR.: 24; SEQ ID NR.: 26; SEQ ID NR.: 28; SEQ ID NR.: 30; SEQ ID NR.: 32; SEQ ID NR.: 34; SEQ ID NR.: 36; SEQ ID NR.: 38; SEQ ID NR.: 40; SEQ ID NR.: 42; SEQ ID NR.: 44; SEQ ID NR.: 50; und SEQ ID NR.: 54 codiert. Ein Polynukleotid der Erfindung kann mit standardmäßigen molekularbiologischen Techniken und der im vorliegenden Text bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden, zum Beispiel unter Verwendung eines DNA-Syntheseautomaten.
-
Die erfindungsgemäßen isolierten Polynukleotide beinhalten Homologe der Polynukleotide gemäß Tabelle 1. „Homologe” werden im vorliegenden Text als zwei Nukleinsäuren oder Polypeptide mit ähnlichen oder im Wesentlichen identischen Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenzen definiert. Homologe beinhalten Allelvarianten, Analoge und Orthologe, wie sie im Folgenden definiert sind. Im folgenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Analoge” auf zwei Nukleinsäuren, die dieselbe oder eine ähnliche Funktion ausüben, die jedoch getrennt in nichtverwandten Organismen im Lauf der Evolution entstanden sind. Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „ Orthologe” auf zwei Nukleinsäuren aus unterschiedlichen Arten, die jedoch im Lauf der Evolution aus einem gemeinsamen Vorfahrengen durch Artbildung entstanden sind. Der Begriff Homolog umfasst weiterhin Nukleinsäuremoleküle, die sich von einer der in Tabelle 1 gezeigten Nukleotidsequenzen aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheiden und die so für dasselbe Polypeptid codieren.
-
Zur Bestimmung des Prozentsatzes der Sequenzidentität von zwei Aminosäuresequenzen (z. B. einer der Polypeptidsequenzen aus Tabelle 1 und einem Homolog davon) werden die Sequenzen für optimale Vergleichszwecke als Alignment untereinander geschrieben (z. B. können für ein optimales Alignment mit dem anderen Polypeptid bzw. der anderen Nukleinsäure „Gaps” in die Sequenz eines Polypeptids eingeführt werden). Die Aminosäurereste an entsprechenden Aminosäurepositionen werden dann miteinander verglichen. Wird eine Position in einer Sequenz von demselben Aminosäurerest wie die entsprechende Position in der anderen Sequenz eingenommen, dann sind die Moleküle an dieser Position identisch. Dieselbe Art von Vergleich kann zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen angestellt werden.
-
Vorzugsweise sind die isolierten Aminosäurehomologe, -analoge und -orthologe der Polypeptide der vorliegenden Erfindung mindestens ungefähr 50–60%, vorzugsweise mindestens ungefähr 60–70% und stärker bevorzugt mindestens ungefähr 70–75%, 75–80%, 80–85%, 85–90% oder 90–95% und am stärksten bevorzugt mindestens ungefähr 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr zu einer gesamten in Tabelle 1 identifizierten Aminosäuresequenz identisch. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nukleinsäurehomolog der Erfindung eine Nukleotidsequenz, die mindestens ungefähr 40–60%, vorzugsweise mindestens ungefähr 60–70%, stärker bevorzugt mindestens ungefähr 70–75%, 75–80%, 80–85%, 85–90% oder 90–95% und noch stärker bevorzugt mindestens ungefähr 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr zu einer in Tabelle 1 gezeigten Nukleotidsequenz identisch ist.
-
Für die Zwecke der Erfindung wird der Prozentsatz der Identität zwischen zwei Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen unter Verwendung von Align 2.0 (Myers and Miller, CABIOS (1989) 4: 11–17), wobei alle Parameter in der Default-Einstellung vorgegeben werden, oder Software-Paket Vector NTI 9.0 (PC) (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA92008) bestimmt. Für die mit Vector NTI berechnete Bestimmung des Prozentsatzes der Identität von zwei Nukleinsäuren werden eine „gap opening penalty” von 15 und eine „gap extension penalty” von 6,66 verwendet. Für die Bestimmung des Prozentsatzes der Identität von zwei Polypeptiden werden eine „gap opening penalty” von 10 und eine „gap extension penalty” von 0,1 verwendet. Alle anderen Parameter werden in der Default-Einstellung vorgegeben. Für ein multiples Alignment (Clustal W-Algorithmus) beträgt mit der blosum62-Matrix die „gap opening penalty” 10 und die „gap extension penalty” 0,05. Es versteht sich, dass beim Vergleich einer DNA-Sequenz mit einer RNA-Sequenz zwecks Bestimmung der Sequenzidentität ein Thymidinnukleotid einem Uracilnukleotid entspricht.
-
Nukleinsäuremoleküle, die Homologen, Analogen und Orthologen der in Tabelle 1 angeführten Polypeptide entsprechen, können aufgrund ihrer Identität zu diesen Polypeptiden isoliert werden, und zwar unter Verwendung der Polynukleotide, die für die entsprechenden Polypeptide codieren, oder hierauf beruhenden Primern als Hybridisierungssonden gemäß Standard-Hybridisierungstechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff „stringente Bedingungen” in Bezug auf die Hybridisierung für DNA an einem DNA-Blot eine Hybridisierung über Nacht bei 60°C in 10 × Denhart-Lösung, 6 × SSC, 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA. Die Blots werden der Reihe nach bei 62°C jeweils 30 Minuten mit 3 × SSC/0,1% SDS und anschließend 1 × SSC/0,1% SDS, und abschließend 0,1 × SSC/0,1% SDS gewaschen. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet die Wendung „stringente Bedingungen” ebenfalls im vorliegenden Zusammenhang eine Hybridisierung in einer 6 × SSC-Lösung bei 65°C. In einer anderen Ausführungsform bezieht sich „hochstringente Bedingungen” auf eine Hybridisierung über Nacht bei 65°C in 10 × Denhart-Lösung, 6 × SSC, 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA. Die Blots werden der Reihe nach bei 65°C jeweils 30 Minuten mit 3 × SSC/0,1% SDS und anschießend 1 × SSC/0,1% SDS und abschließend 0,1 × SSC/0,1% SDS gewaschen. Verfahren für Nukleinsäurehybridisierungen sind im Stand der Technik gut bekannt.
-
Die in der Erfindung verwendeten isolierten Polynukleotide können optimiert werden, also genetisch dahingehend verändert werden, dass ihre Expression in einer bestimmten Pflanze oder einem bestimmten Tier erhöht wird. Zur Bereitstellung von für Pflanzen optimierten Nukleinsäuren kann die DNA-Sequenz des Gens dahingehend modifiziert werden, dass: 1) sie von stark exprimierten Pflanzengenen bevorzugte Codons umfasst; 2) sie einen A + T-Gehalt der Nukleotidbasenzusammensetzung umfasst, der im Wesentlichen in Pflanzen angetroffen wird; 3) sie eine Pflanzeninitiationssequenz bildet; 4) sie Sequenzen, die Destabilisierung, unerwünschte Polyadenylierung, Abbau und Termination der RNA verursachen oder die Sekundärstruktur-„Hairpins” oder RNA-Spleißstellen bilden, eliminiert; oder 5) Antisense-orientierte Leseraster eliminiert werden. Die erhöhte Expression von Nukleinsäuren in Pflanzen kann dadurch erzielt werden, dass man die Verteilungshäufigkeit des Codon Usage bei Pflanzen im Allgemeinen oder in einer bestimmten Pflanze verwendet. Verfahren für die Optimierung der Nukleinsäureexpression in Pflanzen finden sich in
EPA 0359472 ;
EPA 0385962 ; PCT-Anmeldung Nr.
WO 91/16432 ;
US-Patent Nr. 5,380,831 ;
US-Patent Nr. 5,436,391 ;
Perlack et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324–3328; und
Murray et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17: 477–498.
-
Die Erfindung stellt weiterhin einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der eine Expressionskassette enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) einer Expressionskassette umfassend, in funktioneller Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promotor codiert; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Chloroplastentransitpeptid codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Galactokinasepolypeptid codiert; b) einer Expressionskassette umfassend, in funktioneller Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promotor codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Transaldolase-A-Polypeptid codiert; c) einer Expressionskassette umfassend, in funktioneller Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promotor codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Hydrogenase-2-Accessory-Polypeptid codiert; d) einer Expressionskassette umfassend, in funktioneller Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promotor codiert; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein mitochondriales Transitpeptid codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Isocitratlyasepolypeptid codiert; e) einer Expressionskassette umfassend, in funktioneller Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promotor codiert; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Chloroplastentransitpeptid codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-Phospholipidhydroperoxidglutathionperoxidasepolypeptid codiert; f) einer Expressionskassette umfassend, in funktioneller Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promotor codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-gamma-Glutamyltranspeptidasepolypeptid codiert; g) einer Expressionskassette umfassend, in funktioneller Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promotor codiert; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein mitochondriales Transitpeptid codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-ATP-Synthase-Untereinheit-B'-Polypeptid codiert; und h) einer Expressionskassette umfassend, in funktioneller Verknüpfung, ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promotor codiert; ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Chloroplastentransitpeptid codiert; und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängen-C-22 Steroldesaturasepolypeptid codiert.
-
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der rekombinante Expressionsvektor der Erfindung ein isoliertes Polynukleotid mit einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR.: 3; SEQ ID NR.: 5; SEQ ID NR.: 7; SEQ ID NR.: 11; SEQ ID NR.: 13; SEQ ID NR.: 21; SEQ ID NR.: 23; SEQ ID NR.: 25; SEQ ID NR.: 27; SEQ ID NR.: 29; SEQ ID NR.: 31; SEQ ID NR.: 33; SEQ ID NR.: 35; SEQ ID NR.: 37; SEQ ID NR.: 39; SEQ ID NR.: 41; SEQ ID NR.: 43; SEQ ID NR.: 49 und SEQ ID NR.: 53. Weiterhin umfasst der rekombinante Expressionsvektor der Erfindung ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR.: 4; SEQ ID NR.: 6; SEQ ID NR.: 8; SEQ ID NR.: 12; SEQ ID NR.: 14; SEQ ID NR.: 22; SEQ ID NR.: 24; SEQ ID NR.: 26; SEQ ID NR.: 28; SEQ ID NR.: 30; SEQ ID NR.: 32; SEQ ID NR.: 34; SEQ ID NR.: 36; SEQ ID NR.: 38; SEQ ID NR.: 40; SEQ ID NR.: 42; SEQ ID NR.: 44; SEQ ID NR.: 50 und SEQ ID NR.: 54 codiert.
-
Der rekombinante Expressionsvektor der Erfindung beinhaltet auch eine oder mehrere Regulationssequenzen, die je nach den für die Expression verwendeten Wirtszellen ausgewählt ist/sind und die mit dem zu exprimierenden isolierten Polynukleotid funktionell verknüpft ist/sind. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet „funktionell assoziiert” oder „funktionell verknüpft” in Bezug auf einen kombinanten Expressionsvektor, dass das interessierende Polynukleotid mit der/den Regulationssequenz(en) so verknüpft ist, dass, wenn der Vektor in die Wirtszelle (z. B. in eine bakterielle oder pflanzliche Wirtszelle) eingeführt wird, das Polynukleotid exprimiert werden kann. Der Begriff „Regulationssequenz” soll Promoter, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (z. B. Polyadenylierungssignale) beinhalten.
-
Wie oben ausgeführt, werden in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung Promotoren eingesetzt, die fähig sind, die Genexpression in Blättern zu verbessern. In einigen Ausführungsformen handelt es sich bei dem Promotor um einen blattspezifischen Promotor. In diesen Ausführungsformen der Erfindung kann jeder beliebige blattspezifische Promotor eingesetzt werden. Viele solche Promotoren sind bekannt, zum Beispiel der USP-Promotor aus Vicie faba (Baeumlein et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 225, 459–67), Promotoren von lichtinduzierbaren Genen, wie von der Ribulose-1.5-bisphosphatcarboxylase (rbcS-Promotor), Promotoren von Genen, die für Chlorophyll-a/b-Bindungsproteine (Cab) codieren, die Rubisco-Activase, die B-Untereinheit der Chloroplasten-Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase aus A. thaliana (Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105, 357–67) und sonstige blattspezifische Promotoren, wie diejenigen, die bei Aleman, I. (2001) Isolation and characterization of leafspecific promoters from alfalfa (Medicago sativa), Masters Thesis, New Mexico State University, Los Cruces, NM, identifiziert sind.
-
Gemäß anderen Ausführungsformen der Erfindung wird ein wurzel- oder sprossspezifischer Promotor eingesetzt. So führt zum Beispiel der Super-Promotor zu einem hohen Expressionsniveau sowohl in Wurzel als auch in Sprossen (Ni et al. (1995) Plant J. 7: 661–676). Weitere wurzelspezifische Promotoren schließen, ohne dass dies als Einschränkung gelten soll, den TobRB7-Promotor (Yamamoto et al. (1991) Plant Cell 3, 371–382), den rolD-Promotor (Leach et al. (1991) Plant Science 79, 69–76), die CaMV-35S-Domäne A (Benfey et al. (1989) Science 244, 174–181) und dergleichen ein.
-
Gemäß anderen Ausführungsformen wird ein konstitutiver Promotor eingesetzt. Konstitutive Promotoren sind unter den meisten Bedingungen aktiv. Beispiele für konstitutive Promotoren, die sich für die Verwendung in diesen Ausführungsformen eignen, schließen den Petersilie-Ubiquitinpromotor, der in
WO 2003/102198 beschrieben ist, den CaMV-19S- und -35S-Promotor, den sX-CaMV-35S-Promotor, den Sep1-Promotor, den Reis-Actin-Promotor, den Arabidopsis-Actin-Promotor, den Mais-Ubiquitinpromotor, pEmu, den Figwort Mosaic Virus 35S-Promotor, den Smas-Promotor, den „Super-Promotor” (
US-Patent Nr. 5,955,646 ), den GRP1-8-Promotor, den Cinnamylalkoholdehydrogenase-Promotor (
US-Patent Nr. 5,683,439 ), Promotor der T-DNA von Agrobacterium, wie Mannopinsynthase-Promotor, Nopalinsynthase-Promotor und Octopinsynthase-Promotor, und den Promotor der kleinen Untereinheit der Ribulosebisphosphatcarboxylase (ssuRUBISCO) und dergleichen ein.
-
Gemäß der Erfindung bezieht sich eine Chloroplastentransitsequenz auf eine Nukleotidsequenz, die für ein Chloroplastentransitpeptid codiert. Beispiele für ein Chloroplastentransitpeptid schließen die aus dem Chlorophyll-a/b-Bindungsproteintransitpeptid, dem Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Ribulosebisphosphatcarboxylase, dem EPSPS-Transitpeptid und dem Dihydrodipocolinsäuresynthasetransitpeptid bestehende Gruppe ein. Wie im vorliegenden Text definiert bezieht sich eine Mitochondrientransitsequenz auf eine Nukleotidsequenz, die für eine mitochondriale Präsequenz codiert und das Protein zu den Mitochondrien lenkt. Beispiele für mitochondriale Präsequenzen schließen Gruppen bestehend aus ATPase-Untereinheiten, ATP-Synthase-Untereinheiten, Rieske-FeS-Protein, Hsp60, Malatdehydrogenase, Citratsynthase, Aconitase, Isocitratdehydrogenase, Pyruvatdehydrogenase, Malik-Enzym, Glycindecarboxylase, Serinhydroxymethyltransferase und Superoxiddismutase ein.
-
Solche Transitpeptide sind im Stand der Technik bekannt, siehe zum Beispiel Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104–126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544–17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965–968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414–1421 und Shah et al. (1986) Science 233: 478–481. Auf Chloroplasten zielende Sequenzen sind im Stand der Technik bekannt; dazu zählen die chloroplastidäre kleine Untereinheit der Ribulose-1,5-bisphosphetcarboxylase (Rubisco) (de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30: 769–780; Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266 (5): 3335–3342); 5-(Enolpyruvyl)shikimat-3-phosphatsynthase (EPSPS) (Archer et al. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22 (6): 789–810); Tryptophansynthase (Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270 (11): 6081–6087); Plastocyanin (Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272 (33): 20357–20363); Chorismatsynthase (Schmidt et al. (1993) J. Biol. Chem. 268 (36): 27447–27457) und das Light Harvesting Chlorophyll-a/b-Bindungsprotein (LHBP) (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 14996–14999). Siehe auch Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104–126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544–17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965–968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414–1421 und Shah et al. (1986) Science 233: 478–481.
-
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die in Tabelle 1 angeführten Polynukleotide in Pflanzenzellen von höheren Pflanzen (z. B. den Spermatophyten, wie Kulturpflanzen) exprimiert. Ein Polynukleotid kann auf unterschiedliche Art und Weise in eine Pflanze „eingeführt” werden, darunter Transfektion, Transformation oder Transduktion, Elektroporation, Beschuss mit der Genkanone, Agroinfektion und dergleichen. Geeignete Verfahren für die Transformation oder Transfektion von Pflanzenzellen sind zum Beispiel unter der Verwendung der Genkanone gemäß
US-Patent Nr. 4,945,050 ;
5,036,006 ;
5,100,792 ;
5,302,523 ;
5,464,765 ;
5,120,657 ;
6,084,154 und dergleichen beschrieben. Stärker bevorzugt kann der erfindungsgemäße transgene Maissamen unter Verwendung der Agrobacterium-Transformation wie in
US-Pat. Nr. 5,591,616 ;
5,731,179 ;
5,981,840 ;
5,990,387 ;
6,162,965 ;
6,420,630 , der US-Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 2002/0104132 und dergleichen beschrieben erzeugt werden. Die Transformation von Sojabohnen kann zum Beispiel unter Verwendung einer der Techniken durchgeführt werden, die in dem europäischen Patent Nr.
EP 0424047 , dem
US-Patent Nr. 5,322,783 , dem europäischen Patent Nr.
EP 0397 687 , dem
US-Patent Nr. 5,376,543 oder dem
US-Patent Nr. 5,169,770 beschrieben werden. Ein spezifisches Beispiel für die Weizentransformation findet sich in der PCT-Anmeldung Nr.
WO 93/07256 . Baumwolle kann unter Verwendung der in den
US-Patenten Nr. 5,004,863 ;
5,159,135 ;
5,846,797 und dergleichen beschriebenen Verfahren transformiert werden. Reis kann unter Verwendung der in den
US-Patenten Nr. 4,666,844 ;
5,350,688 ;
6,153,813 ;
6,333,449 ;
6,288,312 ;
6,365,807 ;
6,329,571 und dergleichen beschriebenen Verfahren transformiert werden. Canola kann zum Beispiel unter Verwendung von Methoden, wie sie in den
US-Patenten Nr. 5,188,958 ,
5,463,174 ;
5,750,871 ;
EP1566443 ;
WO02/00900 und dergleichen beschrieben werden, transformiert werden. Andere Verfahren für die Transformation von Pflanzen werden zum Beispiel in den
US-Patenten Nr. 5,932,782 ;
6,153,811 ;
6,140,553 ;
5,969,213 ;
6,020,539 und dergleichen beschrieben. Für die Insertion eines Transgens in eine bestimmte Pflanze kann erfindungsgemäß jegliches geeignete Verfahren für die Transformation von Pflanzen verwendet werden.
-
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das eingeführte Polynukleotid in der Pflanzenzelle stabil aufrechterhalten werden, wenn es in ein nichtchromosomales autonomes Replikon eingebaut wird oder wenn es in die pflanzlichen Chromosomen integriert wird. Alternativ dazu kann das eingeführte Polynukleotid auf einem extrachromosomalen nichtreplizierenden Vektor vorliegen und kann transient exprimiert werden oder transient aktiv sein.
-
Eine Ausführungsform der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze umfassend mindestens ein Polynukleotid gemäß Tabelle 1, wobei die Expression des Polynukleotids in der Pflanze zu einem erhöhten Wachstum und/oder Ertrag der Pflanze unter normalen Bedingungen oder wasserlimitierten Bedingungen und/oder einer erhöhten Toleranz gegenüber einem Umweltstress im Vergleich zu einer Wildtypsorte der Pflanze führt, umfassend die folgenden Schritte: (a) Einführen einer oben beschriebenen Expressionskassette in eine Pflanzenzelle, und (b) ausgehend von der transformierten Pflanzenzelle Erzeugen einer transgenen Pflanze; und Selektieren von Pflanzen mit höherem Ertrag aus den regenerierten Pflanzenzellen. Bei der Pflanzenzelle kann es sich um einen Protoplasten, eine gametenproduzierende Zelle bzw. eine Zelle, die sich zu einer ganzen Pflanze regeneriert, handeln, was jedoch keine Einschränkung darstellen soll. Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „transgen” auf eine beliebige Pflanze, eine beliebige Pflanzenzelle, einen beliebigen Kallus, ein beliebiges Pflanzengewebe oder einen beliebigen Pflanzenteil, der/die/das die oben beschriebene Expressionskassette enthält. Erfindungsgemäß ist die Expressionskassette stabil in ein Chromosom oder ein stabiles extrachromosomales Element eingebaut, so dass sie an Folgegenerationen vererbt wird.
-
Die Auswirkung der genetischen Modifikation auf das Wachstum und/oder den Ertrag und/oder die Stresstoleranz der Pflanze kann dadurch beurteilt werden, dass man die modifizierte Pflanze unter normalen und/oder suboptimalen Bedingungen heranzieht und dann die Wachstumseigenschaften und/oder den Stoffwechsel der Pflanze analysiert. Solche Analysetechniken sind dem Fachmann gut bekannt; dazu zählen Trockengewicht, Feuchtgewicht, Samengewicht, Samenanzahl, Polypeptidsynthese, Kohlenhydratsynthese, Lipidoynthese, Evapotranspirationsraten, allgemeiner Pflanzen- und/oder Kulturpflanzenertrag, Blüte, Reproduktion, Samenansatz, Wurzelwachstum, Respirationsraten, Photosyntheseraten, Stoffwechselproduktzusammensetzung und dergleichen.
-
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert, die nicht dahingehend anzusehen sind, dass sie den Erfindungsumfang auf irgendeine Weise einschränken.
-
BEISPIEL 1
-
Charakterisierung der Gene
-
Die Leitgene b0757 (SEQ ID NR.: 1), b2464 (SEQ ID NR.: 9), b2990 (SEQ ID NR.: 15), SLL1323 (SEQ ID NR.: 47), slr1269 (SEQ ID NR.: 45), YER065C (SEQ ID NR.: 17), YIR037W (SEQ ID NR.: 19) und YMR015C (SEQ ID NR.: 51) wurden unter Verwendung von standardmäßigen Rekombinationstechniken kloniert. Die Funktionalität von jedem Gen wurde dadurch vorhergesagt, dass man die Aminosäuresequenz des Gens mit anderen Genen mit bekannter Funktionalität verglich. Homologe cDNAs wurden unter Verwendung von bekannten Verfahren aus offiziellen Bibliotheken der jeweiligen Arten isoliert. Die Sequenzen wurden unter Verwendung von Bioinformatikanalysen verarbeitet und annotiert.
-
Das b0757-Gen (SEQ ID NR.: 1) aus E. coli codiert für eine Galactokinase. Mit der Volllängen-Aminosäuresequenz von b0757 (SEQ ID NR.: 2) wurde ein Blast-Vergleich mit einer nicht-öffentlichen cDNA-Datenbank mit einem e-Wert von e–10 durchgeführt (Altschul et al., supra). Es wurden zwei Homologe aus der Sojabohne und ein Homolog aus Mais identifiziert. Die AminosÄureverwandtschaft dieser Sequenzen ist in den in 1 gezeigten Alignments angegeben.
-
Das b2464-Gen (SEQ ID NR.: 9) aus E. coli codiert für Transaldolase A. Mit der Volllängen-Aminosäuresequenz von b2464 (SEQ ID NR.: 10) wurde ein Blast-Vergleich mit einer nicht-öffentlichen cDNA-Datenbank mit einem e-Wert von e–10 durchgeführt (Altschul et al., supra). Es wurden ein Homolog aus Canola und ein Homolog aus der Sojabohne identifiziert. Die Aminosäureverwandtschaft dieser Sequenzen ist in den in 2 gezeigten Alignments angegeben.
-
Das YIR037W-Gen (SEQ ID NR.: 19) aus S. cerevisiae codiert für Phospholipidhydroperoxidglutathionperoxidase. Mit der Volllängen-Aminosäuresequenz von YIR037W (SEQ ID NR.: 20) wurde ein Blast-Vergleich mit einer nicht-öffentlichen cDNA-Datenbank mit einem e-Wert von e–10 durchgeführt (Altschul et al., supra). Es wurden drei Homologe aus Canola, vier Homologe aus der Sojabohne, ein Homolog aus Sonnenblumen, ein Homolog aus Gerste, ein Homolog aus Reis und zwei Homologe aus Mais identifiziert. Die Aminosäureverwandtschaft dieser Sequenzen ist in den in 3 gezeigten Alignments angegeben.
-
Das SLL1323-Gen (SEQ ID NR.: 47) aus Synechocystis sp. codiert für die ATP-Synthase-Untereinheit B'. Mit der Volllängen-Aminosäuresequenz von SLL1323 (SEQ ID NR.: 48) wurde ein Blast-Vergleich mit einer nicht-öffentlichen cDNA-Datenbank mit einem e-Wert von e–10 durchgeführt (Altschul et al., supra). Es wurde ein Homolog aus der Sojabohne identifiziert. Die Aminosäureverwandtschaft dieser Sequenzen ist in den in 4 gezeigten Alignments angegeben.
-
Das YMR015C-Gen (SEQ ID NR.: 51) aus S. cerevisiae codiert für C-22-Steroldesaturase. Mit der Volllängen-Aminosäuresequenz von YMR015C SEQ ID NR.: 52) wurde ein Blast-Vergleich mit einer nicht-öffentlichen cDNA-Datenbank mit einem e-Wert von e–10 durchgeführt (Altschul et al., supra). Es wurde ein Homolog aus der Sojabohne identifiziert. Die Aminosäureverwandtschaft dieser Sequenzen ist in den in 5 gezeigten Alignments angegeben.
-
BEISPIEL 2
-
Überexpression von Leitgenen in Pflanzen
-
Die Polynukleotide von Tabelle 1 wurden unter Anwendung von bekannten Verfahren in eine Expressionskassette ligiert. Für die Kontrolle der Expression der Transgene in Arabidopsis wurden drei unterschiedliche Promotoren verwendet: der USP-Promotor („USP”) aus Vicia faba (SEQ ID NR.: 61 oder SEQ ID NR.: 62), der Superpromotor („Super”; SEQ ID NR.: 63) und der Petersilie-Ubiquitin-Promotor (”PCUbi”; SEQ ID NR.: 64). Für die gezielte Expression wurde ein mitochondriales Transitpeptid (SEQ ID NR.: 56 oder SEQ ID NR.: 58; in den Tabellen 2–9 als „Mito” bezeichnet) oder ein Chloroplastentransitpeptid (SEQ ID NR.: 60; in den Tabellen 2–10 als „Plastid” bezeichnet) verwendet.
-
Der Arabidopsis-Ökotyp C24 wurde mit Konstrukten, die die in Beispiel 1 beschriebenen Gene enthielten, unter Verwendung von bekannten Verfahren transformiert. Semen der transformierten T2-Pflanzen wurde dann entsprechend dem Promotor, der die Expression vorantreibt, der Art, die das Ausgangsmaterial für das Gen bildet, und der Art des Targeting (an die Chloroplasten, die Mitochondrien bzw. keines) geramscht. Die Samenramsche wurden im Primär-Screening auf Biomasse unter gut bewässerten Wachstumsbedingungen und unter wasserlimitierten Wachstumsbedingungen verwendet. Hits von Ramschen im Primär-Screening wurden selektiert, es wurde eine molekulare Analyse durchgeführt und die Semen wurden gewonnen. Die gewonnenen Samen wurden dann für die Analyse im Sekundär-Screening verwendet, wo eine größere Anzahl Individuen für jedes transgene Event analysiert wurde. Wenn Pflanzen von einem Konstrukt im Sekundär-Screening dahingehend identifiziert wurden, dass sie verglichen mit den Kontrollen eine erhöhte Biomasse aufwiesen, wurde es zum Tertiär-Screening weitergeleitet. Bei diesem Screening wurden über 100 Pflanzen von allen transgenen Events für dieses Konstrukt unter gut bewässerten Wachstumsbedingungen und unter Trockenheitswachstumsbedingungen vermessen. Die Daten von den transgenen Pflanzen wurden mit Wildtyp-Arabidopsis-Pflanzen oder mit Pflanzen, die von einem Ramsch zufällig ausgewählter transgener Arabidopsis-Samen herangezogen wurden, unter Verwendung von statistischen Standardmethoden verglichen.
-
Die Pflanzen, die unter guten Bewässerungsbedingungen herangezogen wurden, wurden zweimal pro Woche bis zur Sättigung des Bodens bewässert. Mit einem im Handel erhältlichen Imaging-System wurden am 17. und 21. Tag von den transgenen Pflanzen Bilder aufgenommen. Alternativ dazu wurden die Pflanzen unter wasserlimitierten Wachstumsbedingungen herangezogen, und zwar dadurch, dass man selten bis zur Sättigung des Bodens bewässerte, wodurch der Boden zwischen den Bewässerungsbehandlungen austrocknen konnte. In diesen Versuchen wurde am 0., 8. und 19. Tag nach dem Aussäen bewässert. Bilder der transgenen Pflanzen wurden am 20. und 27. Tag unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Imaging-Systems aufgenommen.
-
Zum Vergleichen der Bilder der transgenen Pflanzen und der Kontrollpflanzen, die in demselben Versuch herangezogen wurden, verwendete man eine Bildanalyse-Software. Mit den Bildern wurde die relative Größe oder Biomasse der Pflanzen als Pixel und die Farbe der Pflanzen als das Verhältnis von Dunkelgrün zu der Gesamtfläche bestimmt. Das letztgenannte Verhältnis, das als Gesundheitsindex bezeichnet wird, war ein Maß für die relative Chlorophyllmenge in den Blättern und daher das relative Ausmaß an Blattseneszenz oder Vergilbung und wurde nur am 27. Tag aufgenommen. Zwischen den transgenen Pflanzen, die die verschiedenen Gene enthalten, besteht aufgrund von unterschiedlichen Stellen der DNA-Insertion und anderen Faktoren, die einen Einfluss auf das Niveau oder das Muster der Genexpression ausüben, eine Variation. Zum Aufzeigen dieses Effekts zeigen die Datentabellen die Anzahl der für das Merkmal positiven und negativen Pflanzen.
-
Die Tabellen 2 bis 9 zeigen den Vergleich der Messungen der Arabidopsis-Pflanzen. „CD” bedeutet, dass die Pflanzen unter Bedingungen mit zyklischer Trockenheit („cyclic drought”) herangezogen wurden; „WW” bedeutet Bedingungen mit guter Bewässerung („well-watered”). Eine Zahl nach einer Abkürzung bedeutet, dass mehrere unabhängige Experimente unter den gleichen Bedingungen durchgeführt wurden. Die prozentuale Veränderung bezeichnet das Maß der transgenen Pflanzen im Vergleich zu den Kontrollpflanzen als Prozentsatz der Kontrolle nichttransgener Pflanzen; der p-Wert ist die statistische Signifikanz des Unterschieds zwischen den transgenen Pflanzen und den Kontrollpflanzen auf Grundlage eines T-Test-Vergleichs von allen unabhängigen Events, wobei NS nicht signifikant auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau bedeutet; Anz. Events bezeichnet die Gesamtzahl der unabhängigen transgenen Events, die in dem Versuch getestet wurden; Anz. positive Events bezeichnet die Gesamtzahl der unabhängigen transgenen Events, die in dem Versuch größer als die Kontrolle waren; Anz. negative Events bezeichnet die Gesamtzahl der unabhängigen transgenen Events, die in dem Versuch kleiner als die Kontrolle waren.
-
A. Galactokinase
-
Das Galactokinasegen b0757 (SEQ ID. NR.: 1) wurde in Arabidopsis unter der Kontrolle des Super-Promotors mit Targeting auf den Chloroplasten exprimiert. In Tabelle 2 sind die von den mit diesen Konstrukten transformierten und unter Bedingungen mit guter Bewässerung und Bedingungen mit zyklischer Trockenheit getesteten Arabidopsis-Pflanzen erhaltenen Biomasse- und Gesundheitsindexdaten angeführt. Tabelle 2
Assay-Typ | Gen | Promotor | Target | Merkmal | prozentuale Veränderung | p-Wert | Anz. gültige Events | Anz. positive Events | Anz. negative Events |
WW | b0757 | Super | Plastid | Biomasse an Tag 17 | –1,5 | NS | 7 | 3 | 4 |
WW | b0757 | Super | Plastid | Biomasse an Tag 21 | 0,1 | NS | 7 | 3 | 4 |
WW | b0757 | Super | Plastid | Gesundheitsindex | –2,0 | NS | 7 | 3 | 4 |
CD | b0757 | Super | Plastid | Biomasse an Tag 20 | 8,4 | 0,014 | 4 | 4 | 0 |
CD | b0757 | Super | Plastid | Biomasse an Tag 27 | 8,0 | 0,026 | 4 | 4 | 0 |
CD | b0757 | Super | Plastid | Gesundheitsindex | –0,9 | NS | 4 | 2 | 2 |
-
Tabelle 2 zeigt, dass die gezielte Expression des b0757-Gens im Chloroplasten von Arabidopsis-Pflanzen zu Pflanzen führt, die unter Bedingungen mit eingeschränkter Wasserversorgung größer waren, jedoch nicht unter Bedingungen mit guter Bewässerung. Bei diesen Experimenten waren alle unabhängigen transgenen Ereignisse, die das b0757-Gen exprimierten, größer als die Kontrollen, was auf eine bessere Anpassung an die Stressumgebung hindeutet.
-
B. Transaldolase A
-
Das Transaldolase A-Gen b2464 (SEQ ID NR.: 9) wurde in Arabidopsis unter der Kontrolle des USP- oder des Super-Promotors ohne subzelluläres Targeting exprimiert. In Tabelle 3 sind die von den mit diesen Konstrukten transformierten und unter Bedingungen mit guter Bewässerung und Bedingungen mit zyklischer Trockenheit getesteten Arabidopsis-Pflanzen erhaltenen Biomasse- und Gesundheitsindexdaten angeführt. Tabelle 3
Assay-Typ | Gen | Promotor | Target | Merkmal | prozentuale Veränderung | p-Wert | Anz. gültige Events | Anz. positive Events | Anz. negative Events |
WW | b2464 | USP | keins | Biomasse an Tag 17 | 27,4 | 0,000 | 6 | 6 | 0 |
WW | b2464 | USP | keins | Biomasse an Tag 21 | 14,2 | 0,000 | 6 | 6 | 0 |
WW | b2464 | USP | keins | Gesundheitsindex | 6,0 | NS | 6 | 4 | 2 |
CD | b2464 | Super | keins | Biomasse an Tag 20 | 18,8 | 0,000 | 5 | 4 | 1 |
CD | b2464 | Super | keins | Biomasse an Tag 27 | 11,2 | 0,000 | 5 | 4 | 1 |
CD | b2464 | Super | keins | Gesundheitsindex | 2,5 | NS | 5 | 2 | 3 |
-
Tabelle 3 zeigt, dass Arabidopsis-Pflanzen, die das b2464-Gen unter der Kontrolle des Super-Promotors exprimieren, unter Bedingungen mit eingeschränkter Wasserversorgung größer waren. Bei den transgenen Pflanzen, die das b2464-Gen enthalten, kommt es aufgrund der verschiedenen Stellen der DNA-Insertierung und anderen Faktoren, die auf das Ausmaß bzw. das Muster der Genexpression Einfluss haben, zu Variationen. Bei diesen Experimenten waren die meisten unabhängigen transgenen Ereignisse, die das b2464-Gen exprimierten, größer als die Kontrollen, was auf eine bessere Anpassung an die Stressumgebung hindeutet. Darüber hinaus führte die Expression des b2464-Gens unter der Kontrolle des USP-Promotors zu Pflanzen, die unter Bedingungen mit guter Bewässerung größer waren. Bei diesen Experimenten waren alle das b2464-Gen exprimierenden transgenen Ereignisse größer als die Kontrollen.
-
C. Hydrogenase-2-Accessory-Protein
-
Das Hydrogenase-2-Accessory-Proteingen b2990 (SEQ ID NR.: 15) wurde in Arabidopsis unter der Kontrolle des Super-Promotors ohne subzelluläres Targeting exprimiert. In Tabelle 4 sind die von den mit diesen Konstrukten transformierten und unter Bedingungen mit guter Bewässerung und Bedingungen mit zyklischer Trockenheit getesteten Arabidopsis-Pflanzen erhaltenen Biomasse- und Gesundheitsindexdaten angeführt. Tabelle 4
Assay-Typ | Gen | Promotor | Target | Merkmal | prozentuale Veränderung | p-Wert | Anz. gültige Events | Anz. positive Events | Anz. negative Events |
WW | b2990 | Super | keins | Biomasse an Tag 17 | 9,3 | 0,0084 | 6 | 5 | 1 |
WW | b2990 | Super | keins | Biomasse an Tag 21 | 11,1 | 0,0001 | 6 | 5 | 1 |
WW | b2990 | Super | keins | Gesundheitsindex | –7,4 | 0,0120 | 6 | 0 | 6 |
CD | b2990 | Super | keins | Biomasse an Tag 20 | 19,4 | 0,0000 | 6 | 6 | 0 |
CD | b2990 | Super | keins | Biomasse an Tag 27 | 21,9 | 0,0000 | 6 | 6 | 0 |
CD | b2990 | Super | keins | Gesundheitsindex | 1,9 | NS | 6 | 5 | 1 |
-
Tabelle 4 zeigt, dass Arabidopsis-Pflanzen, die das b2990-Gen exprimieren, sowohl unter Bedingungen mit guter Bewässerung als auch unter Bedingungen mit eingeschränkter Wasserversorgung größer waren. Bei den transgenen Pflanzen, die das b2990-Gen enthalten, kommt es aufgrund der verschiedenen Stellen der DNA-Insertierung und anderen Faktoren, die auf das Ausmaß bzw. das Muster der Genexpression Einfluss haben, zu Variationen. Bei diesen Experimenten waren die meisten unabhängigen transgenen Ereignisse, die das b2990-Gen exprimierten, größer als die Kontrollen, was auf eine bessere Anpassung an die Stressumgebung hindeutet. Unter Bedingungen mit guter Bewässerung führte die Expression des b2990-Gens zu Pflanzen mit einem niedrigeren Gesundheitsindex; dieser Effekt wurde unter Bedingungen mit eingeschränkter Wasserversorgung nicht beobachtet.
-
D. Isocitratlyase
-
Das Isocitratlyasegen YER065C (SEQ ID NR.: 17) wurde in Arabidopsis unter der Kontrolle des USP-Promotors mit Targeting auf die Mitochondrien exprimiert. In Tabelle 5 sind die von den mit diesen Konstrukten transformierten und unter Bedingungen mit guter Bewässerung getesteten Arabidopsis-Pflanzen erhaltenen Biomasse- und Gesundheitsindexdaten angeführt. Tabelle 5
AssayTyp | Gen | Promotor | Target | Merkmal | prozentuale Veränderung | p-Wert | Anz. gültige Events | Anz. positive Events | Anz. negative Events |
WW1 | YER065C | USP | Mito | Biomasse an Tag 17 | 7,5 | 0,0136 | 7 | 5 | 2 |
WW1 | YER065C | USP | Mito | Biomasse an Tag 21 | 0,9 | NS | 7 | 4 | 3 |
WW1 | YER065C | USP | Mito | Gesundheitsindex | 1,3 | NS | 7 | 3 | 4 |
WW2 | YER065C | USP | Mito | Biomasse an Tag 17 | 30,6 | 0,0000 | 8 | 8 | 0 |
WW2 | YER065C | USP | Mito | Biomasse an Tag 21 | 22,1 | 0,0000 | 8 | 8 | 0 |
WW2 | YER065C | USP | Mito | Gesundheitsindex | 14,6 | 0,0000 | 8 | 7 | 1 |
-
Tabelle 5 zeigt, dass Arabidopsis-Pflanzen, die das YER065C-Gen exprimieren, unter Bedingungen mit guter Bewässerung größer waren. Bei den transgenen Pflanzen, die das YER065C-Gen enthalten, kommt es aufgrund der verschiedenen Stellen der DNA-Insertierung und anderen Faktoren, die auf das Ausmaß bzw. das Muster der Genexpression Einfluss haben, zu Variationen. Bei diesen Experimenten waren die meisten der unabhängigen transgenen Ereignisse, die das YER065C-Gen exprimierten, größer als die Kontrollen.
-
E. Phospholipidhydroperoxidglutathionperoxidase
-
Das Phospholipidhydroperoxidglutathionperoxidasegen YIR037W (SEQ ID NR.: 19) wurde in Arabidopsis unter der Kontrolle des USP- oder des PCUbi-Promotors mit Targeting auf den Chloroplasten oder auf die Mitochondrien exprimiert. In Tabelle 6 sind die von den mit diesen Konstrukten transformierten und unter Bedingungen mit guter Bewässerung oder Bedingungen mit eingeschränkter Wasserversorgung getesteten Arabidopsis-Pflanzen erhaltenen Biomasse- und Gesundheitsindexdaten angeführt. Tabelle 6
Assay-Typ | Gen | Promotor | Target | Merkmal | prozentuale Veränderung | p-Wert | Anz. gültige Events | Anz. positive Events | Anz. negative Events |
WW | YIR037W | PCUbi | Plastid | Biomasse an Tag 17 | 4,9 | NS | 6 | 4 | 2 |
WW | YIR037W | PCUbi | Plastid | Biomasse an Tag 21 | –1,8 | NS | 6 | 3 | 3 |
WW | YIR037W | PCUbi | Plastid | Gesundheitsindex | 11,3 | 0,006 | 6 | 6 | 0 |
WW | YIR037W | USP | Plastid | Biomasse an Tag 17 | –12,1 | 0,003 | 6 | 1 | 5 |
WW | YIR037W | USP | Plastid | Biomasse an Tag 21 | –8,1 | 0,017 | 6 | 1 | 5 |
WW | YIR037W | USP | Plastid | Gesundheitsindex | –7,5 | 0,000 | 6 | 0 | 6 |
CD | YIR037W | PCUbi | Plastid | Biomasse an Tag 20 | 12,2 | 0,004 | 6 | 5 | 1 |
CD | YIR037W | PCUbi | Plastid | Biomasse an Tag 27 | 11,2 | 0,000 | 6 | 6 | 0 |
CD | YIR037W | PCUbi | Plastid | Gesundheitsindex | 10,2 | 0,011 | 6 | 5 | 1 |
CD | YIR037W | USP | Mito | Biomasse an Tag 20 | –6,1 | NS | 6 | 2 | 4 |
CD | YIR037W | USP | Mito | Biomasse an Tag 27 | –6,0 | NS | 6 | 1 | 5 |
CD | YIR037W | USP | Mito | Gesundheitsindex | 1,2 | NS | 6 | 4 | 2 |
CD | YIR037W | USP | Plastid | Biomasse an Tag 20 | –7,9 | 0,015 | 6 | 1 | 5 |
CD | YIR037W | USP | Plastid | Biomasse an Tag 27 | –8,9 | 0,007 | 6 | 0 | 6 |
CD | YIR037W | USP | Plastid | Gesundheitsindex | –1,0 | NS | 6 | 1 | 5 |
-
Tabelle 6 zeigt, dass Arabidopsis-Pflanzen, die das YIR037W-Gen unter der Kontrolle des PCUbi-Promotors exprimieren, beim Targeting auf den Chloroplasten unter Bedingungen mit eingeschränkter Wasserversorgung größer waren als die Kontrollen, was auf eine bessere Anpassung an die Stressumgebung hindeutet. Darüber hinaus zeigten die YIR037W exprimierenden transgenen Pflanzen sowohl unter Bedingungen mit guter Bewässerung als auch unter Bedingungen mit eingeschränkter Wasserversorgung eine intensivere dunkelgrüne Farbe als die Kontrollen, was sich in dem höheren Gesundheitsindex zeigt. Dies legt nahe, dass die transgenen YIR037W-Pflanzen im Vergleich zu den Kontrollpflanzen mehr Chlorophyll produzierten oder dass in ihnen weniger Chlorophyll abgebaut wurde.
-
Wurde die Expression des YIR037W-Gens durch den USP-Promotor gesteuert und zielte auf den Chloroplasten, so waren die trangenen YIR037W-Pflanzen sowohl unter Bedingungen mit guter Bewässerung als auch unter Bedingungen mit eingeschränkter Wasserversorgung kleiner als die Kontrollpflanze. Darüber hinaus waren die transgenen YIR037W-Pflanzen unter Bedingungen mit guter Bewässerung weniger grün als die Kontrollpflanzen, was sich in dem niedrigeren Gesundheitsindex zeigt. Dies legt nahe, dass die transgenen YIR037W-Pflanzen mit diesem speziellen Konstrukt im Vergleich zu den Kontrollpflanzen weniger Chlorophyll produzierten oder dass in ihnen mehr Chlorophyll abgebaut wurde. Zielte das YIR037W-Gen unter der Kontrolle des USP-Promotors auf die Mitochondrien, so wurde im Vergleich zu transgenen YIR037W-Pflanzen und Kontrollpflanzen kein signifikanter Unterschied bei der Biomasse oder dem Gesundheitsindex festgestellt.
-
H. gamma-Glutamyltranspeptidase
-
Das gamma-Glutamyltranspeptidasegen slr1269 (SEQ ID NR.: 45) wurde in Arabidopsis unter der Kontrolle des PCUbi-Promotors mit Targeting auf den Chloroplasten, auf die Mitochondrien oder ohne subzelluläres Targeting exprimiert. In Tabelle 7 sind die von den mit diesen Konstrukten transformierten und unter Bedingungen mit guter Bewässerung oder Bedingungen mit zyklischer Trockenheit getesteten Arabidopsis-Pflanzen erhaltenen Biomasse- und Gesundheitsindexdaten angeführt. Tabelle 7
Assay-Typ | Gen | Promotor | Target | Merkmal | prozentuale Veränderung | p-Wert | Anz. gültige Events | Anz. positive Events | Anz. negative Events |
WW | slr1269 | PCUbi | Mito | Biomasse an Tag 17 | 0,6 | NS | 6 | 3 | 3 |
WW | slr1269 | PCUbi | Mito | Biomasse an Tag 21 | 0,2 | NS | 6 | 2 | 4 |
WW | slr1269 | PCUbi | Mito | Gesundheitsindex | –10,6 | 0,002 | 6 | 2 | 4 |
WW | slr1269 | PCUbi | keins | Biomasse an Tag 17 | 6,1 | 0,060 | 7 | 4 | 3 |
WW | slr1269 | PCUbi | keins | Biomasse an Tag 21 | 0,1 | NS | 7 | 3 | 4 |
WW | slr1269 | PCUbi | keins | Gesundheitsindex | –3,1 | NS | 7 | 3 | 4 |
WW | slr1269 | PCUbi | Plastid | Biomasse an Tag 17 | 4,4 | 0,056 | 6 | 4 | 2 |
WW | slr1269 | PCUbi | Plastid | Biomasse an Tag 21 | 2,8 | NS | 6 | 5 | 1 |
WW | slr1269 | PCUbi | Plastid | Gesundheitsindex | –7,5 | 0,034 | 6 | 2 | 4 |
CD | slr1269 | PCUbi | Mito | Biomasse an Tag 20 | –14,5 | 0,000 | 6 | 1 | 5 |
CD | slr1269 | PCUbi | Mito | Biomasse an Tag 27 | –10,8 | 0,000 | 6 | 2 | 4 |
CD | slr1269 | PCUbi | Mito | Gesundheitsindex | –10,2 | 0,002 | 6 | 0 | 6 |
CD | slr1269 | PCUbi | keins | Biomasse an Tag 20 | 23,4 | 0,000 | 7 | 6 | 1 |
CD | slr1269 | PCUbi | keins | Biomasse an Tag 27 | 12,2 | 0,006 | 7 | 4 | 3 |
CD | slr1269 | PCUbi | keins | Gesundheitsindex | 19,4 | 0,000 | 7 | 7 | 0 |
CD | slr1269 | PCUbi | Plastid | Biomasse an Tag 20 | –4,3 | NS | 5 | 2 | 3 |
CD | slr1269 | PCUbi | Plastid | Biomasse an Tag 27 | –6,8 | 0,018 | 5 | 2 | 3 |
CD | slr1269 | PCUbi | Plastid | Gesundheitsindex | –1,9 | NS | 5 | 2 | 3 |
-
Tabelle 7 zeigt, dass Arabidopsis-Pflanzen, die das slr1269-Gen exprimieren, beim Targeting auf die Mitochondrien unter Bedingungen mit eingeschränkter Wasserversorgung kleiner waren als die Kontrollen. Darüber hinaus waren die transgenen slr1269-Pflanzen sowohl unter Bedingungen mit guter Bewässerung als auch unter Bedingungen mit eingeschränkter Wasserversorgung weniger grün als die Kontrollpflanzen, was sich in dem niedrigeren Gesundheitsindex zeigt. Dies legt nahe, dass die transgenen slr1269-Pflanzen beim Targeting auf die Mitochondrien im Vergleich zu den Kontrollpflanzen weniger Chlorophyll produzierten oder dass in ihnen mehr Chlorophyll abgebaut wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn die Expression des slr1269-Gens auf den Chloroplasten zielte. Unter Bedingungen mit eingeschränkter Wasserversorgung waren transgene slr1269-Pflanzen kleiner als die Kontrollen. Unter Bedingungen mit guter Bewässerung waren transgene slr1269-Pflanzen weniger grün als die Kontrollen, was sich in dem niedrigeren Gesundheitsindex zeigt.
-
Bei einer Expression des slr1269-Gens ohne subzelluläres Targeting waren transgene slr1269-Pflanzen unter Bedingungen mit eingeschränkter Wasserversorgung größer als die Kontrollpflanzen, was auf eine bessere Anpassung an die Stressumgebung hindeutet. Darüber hinaus zeigten die das slr1269-Gen exprimierenden transgenen Pflanzen unter Bedingungen mit eingeschränkter Wasserversorgung eine intensivere dunkelgrüne Farbe als die Kontrollen, was sich in dem höheren Gesundheitsindex zeigt. Dies legt nahe, dass die transgenen slr1269-Pflanzen im Vergleich zu den Kontrollpflanzen mehr Chlorophyll produzierten oder dass in ihnen weniger Chlorophyll abgebaut wurde.
-
G. ATP-Synthase-Untereinheit B'
-
Das ATP-Synthase-Untereinheit-B'-Gen SLL1323 (SEQ ID NR.: 47) wurde in Arabidopsis unter der Kontrolle des PCUbi-Promotors mit Targeting auf die Mitochondrien exprimiert. In Tabelle 8 sind die von den mit diesen Konstrukten transformierten und unter Bedingungen mit guter Bewässerung oder Bedingungen mit zyklischer Trockenheit getesteten Arabidopsis-Pflanzen erhaltenen Biomasse- und Gesundheitsindexdaten angeführt. Tabelle 8
Assay-Typ | Gen | Promotor | Target | Merkmal | prozentuale Veränderung | p-Wert | Anz. gültige Events | Anz. positive Events | Anz. negative Events |
WW | SLL1323 | PCUbi | Mito | Biomasse an Tag 17 | 14,1 | 0,0001 | 6 | 5 | 1 |
WW | SLL1323 | PCUbi | Mito | Biomasse an Tag 21 | 11,2 | 0,0000 | 6 | 5 | 1 |
WW | SLL1323 | PCUbi | Mito | Gesundheitsindex | 2,4 | NS | 6 | 3 | 3 |
CD | SLL1323 | PCUbi | Mito | Biomasse an Tag 20 | 27,2 | 0,0000 | 6 | 6 | 0 |
CD | SLL1323 | PCUbi | Mito | Biomasse an Tag 27 | 23,6 | 0,0000 | 6 | 6 | 0 |
CD | SLL1323 | PCUbi | Mito | Gesundheitsindex | 6,9 | 0,0061 | 6 | 5 | 1 |
-
Tabelle 8 zeigt, dass die Expression des SLL1323-Gens in Arabidopsis-Pflanzen zu Pflanzen führte, die sowohl unter Bedingungen mit guter Bewässerung als auch unter Bedingungen mit eingeschränkter Wasserversorgung größer waren. Bei den transgenen Pflanzen, die das SLL1323-Gen enthalten, kommt es aufgrund der verschiedenen Stellen der DNA-Insertierung und anderen Faktoren, die auf das Ausmaß bzw. das Muster der Genexpression Einfluss haben, zu Variationen. Bei diesen Experimenten waren die meisten unabhängigen transgenen Ereignisse, die das SLL1323-Gen exprimierten, größer als die Kontrollen, was auf eine bessere Anpassung an die Stressumgebung hindeutet. Darüber hinaus zeigten die SLL1323 exprimierenden transgenen Pflanzen unter Bedingungen mit eingeschränkter Wasserversorgung eine intensivere dunkelgrüne Farbe als die Kontrollen, was sich in dem höheren Gesundheitsindex zeigt. Dies legt nahe, dass die Pflanzen mehr Chlorophyll produzierten oder dass in ihnen weniger Chlorophyll abgebaut wurde als in den Kontrollpflanzen.
-
H. C-22-Steroldesaturase
-
Das YMR015C-Gen (SEQ ID NR.: 51), welches für C-22-Steroldesaturase codiert, wurde unter Einsatz von drei Konstrukten in Arabidopsis exprimiert und auf den Chloroplasten gelenkt. Bei dem einen wird die Transkription durch den PCUbi-Promotor gesteuert. Bei einem anderen wird die Transkription durch den Super-Promotor gesteuert. Die Transkription von YMR015C im dritten Konstrukt wird vom USP-Promotor gesteuert. In Tabelle sind die von den mit diesen Konstrukten transformierten und unter Bedingungen mit guter Bewässerung oder Bedingungen mit eingeschränkter Wasserversorgung getesteten Arabidopsis-Pflanzen erhaltenen Biomasse- und Gesundheitsindexdaten angeführt. Tabelle 9
Assay-Typ | Gen | Promotor | Target | Merkmal | prozentuale Veränderung | p-Wert | Anz. gültige Events | Anz. positive Events | Anz. negative Events |
CD | YMR015C | PCUbi | Plastid | Biomasse an Tag 20 | 9,5 | 0,0150 | 6 | 4 | 2 |
CD | YMR015C | PCUbi | Plastid | Biomasse an Tag 27 | 17,1 | 0,0019 | 6 | 5 | 1 |
CD | YMR015C | PCUbi | Plastid | Gesundheitsindex | 7,8 | 0,0416 | 6 | 4 | 2 |
CD | YMR015C | Super | Plastid | Biomasse an Tag 20 | 10,2 | 0,0013 | 6 | 4 | 2 |
CD | YMR015C | Super | Plastid | Biomasse an Tag 27 | –1,7 | NS | 6 | 2 | 4 |
CD | YMR015C | Super | Plastid | Gesundheitsindex | 9,4 | 0,0003 | 6 | 4 | 2 |
WW | YMR015C | PCUbi | Plastid | Biomasse an Tag 20 | –16,0 | 0,0000 | 8 | 0 | 8 |
WW | YMR015C | PCUbi | Plastid | Biomasse an Tag 27 | –10,7 | 0,0003 | 8 | 1 | 7 |
WW | YMR015C | PCUbi | Plastid | Gesundheitsindex | –8,7 | 0,0144 | 8 | 3 | 5 |
WW | YMR015C | Super | Plastid | Biomasse an Tag 20 | –30,8 | 0,0000 | 6 | 0 | 6 |
WW | YMR015C | Super | Plastid | Biomasse an Tag 27 | –20,1 | 0,0000 | 6 | 0 | 6 |
WW | YMR015C | Super | Plastid | Gesundheitsindex | –13,5 | 0,0045 | 6 | 1 | 5 |
WW | YMR015C | USP | Plastid | Biomasse an Tag 20 | –39,5 | 0,0000 | 4 | 0 | 4 |
WW | YMR015C | USP | Plastid | Biomasse an Tag 27 | –28,7 | 0,0000 | 4 | 0 | 4 |
WW | YMR015C | USP | Plastid | Gesundheitsindex | –16,8 | 0,0006 | 4 | 1 | 3 |
-
Tabelle 9 zeigt, dass Arabidopsis-Pflanzen, bei denen der PCUbi-Promotor die Expression von YMR015C steuerte, signifikant größer waren als die Kontrollpflanzen, wenn das Protein außerdem auf den Chloroplasten gerichtet war. Darüber hinaus hatten diese transgenen Pflanzen und die, bei denen der Super-Promotor die Expression von YMR015C steuerte, eine intensivere dunkelgrüne Farbe als die Kontrollen. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Pflanzen unter Stress im Vergleich zu den Kontrollpflanzen mehr Chlorophyll produzierten oder dass in ihnen weniger Chlorophyll abgebaut wurde. Tabelle 9 zeigt außerdem, dass die meisten unabhängigen transgenen Ereignisse größer waren als die Kontrollen.
-
Tabelle 9 zeigt, dass Arabidopsis-Pflanzen, die unter Bedingungen mit guter Bewässerung herangezogen worden waren, und bei denen entweder der PCUbi-Promotor oder der Super-Promotor die Expression von YMR015C steuerte, signifikant kleiner waren als die Kontrollpflanzen, wenn das Protein außerdem auf den Chloroplasten gerichtet war. Tabelle 9 zeigt außerdem, dass die meisten unabhängigen transgenen Ereignisse kleiner waren als die Kontrollen. Darüber hinaus reduzierten diese Konstrukte, wenn sie unter Bedingungen mit guter Bewässerung herangezogen wurden, beide in signifikanter Weise die Menge an grüner Farbe in den Pflanzen.
-
Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
-
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
- EP 0359472 [0068]
- EP 0385962 [0068]
- WO 91/16432 [0068]
- US 5380831 [0068]
- US 5436391 [0068]
- WO 2003/102198 [0074]
- US 5955646 [0074]
- US 5683439 [0074]
- US 4945050 [0077]
- US 5036006 [0077]
- US 5100792 [0077]
- US 5302523 [0077]
- US 5464765 [0077]
- US 5120657 [0077]
- US 6084154 [0077]
- US 5591616 [0077]
- US 5731179 [0077]
- US 5981840 [0077]
- US 5990387 [0077]
- us 6162965 [0077]
- us 6420630 [0077]
- EP 0424047 [0077]
- US 5322783 [0077]
- EP 0397687 [0077]
- US 5376543 [0077]
- US 5169770 [0077]
- WO 93/07256 [0077]
- US 5004863 [0077]
- US 5159135 [0077]
- US 5846797 [0077]
- US 4666844 [0077]
- US 5350688 [0077]
- US 6153813 [0077]
- US 6333449 [0077]
- US 6288312 [0077]
- US 6365807 [0077]
- US 6329571 [0077]
- US 5188958 [0077]
- US 5463174 [0077]
- US 5750871 [0077]
- EP 1566443 [0077]
- WO 02/00900 [0077]
- US 5932782 [0077]
- US 6153811 [0077]
- US 6140553 [0077]
- US 5969213 [0077]
- US 6020539 [0077]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- Myers and Miller, CABIOS (1989) 4: 11–17 [0066]
- Perlack et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324–3328 [0068]
- Murray et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17: 477–498 [0068]
- Baeumlein et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 225, 459–67 [0072]
- Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105, 357–67 [0072]
- Aleman, I. (2001) Isolation and characterization of leafspecific promoters from alfalfa (Medicago sativa), Masters Thesis, New Mexico State University, Los Cruces, NM [0072]
- Ni et al. (1995) Plant J. 7: 661–676 [0073]
- Yamamoto et al. (1991) Plant Cell 3, 371–382 [0073]
- Leach et al. (1991) Plant Science 79, 69–76 [0073]
- Benfey et al. (1989) Science 244, 174–181 [0073]
- Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104–126 [0076]
- Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544–17550 [0076]
- Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965–968 [0076]
- Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414–1421 [0076]
- Shah et al. (1986) Science 233: 478–481 [0076]
- de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30: 769–780 [0076]
- Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266 (5): 3335–3342 [0076]
- Archer et al. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22 (6): 789–810 [0076]
- Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270 (11): 6081–6087 [0076]
- Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272 (33): 20357–20363 [0076]
- Schmidt et al. (1993) J. Biol. Chem. 268 (36): 27447–27457 [0076]
- Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 14996–14999 [0076]
- Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104–126 [0076]
- Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544–17550 [0076]
- Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965–968 [0076]
- Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414–1421 [0076]
- Shah et al. (1986) Science 233: 478–481 [0076]
- Altschul et al., supra [0084]
- Altschul et al., supra [0085]
- Altschul et al., supra [0086]
- Altschul et al., supra [0087]