CN104311633B - 一组hrp5类似物 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，具体而言涉及一组HRP5类似物。本发明所涉及的HRP5类似物的氨基酸序列通式如SEQ ID NO:2所示：Xaa1‑Xaa2‑Xaa3‑Xaa4‑Xaa5‑Xaa6‑Xaa7‑Xaa8‑Xaa9‑Leu‑Xaa11‑Lys‑Tyr‑Leu‑Arg‑Xaa16‑Xaa17‑Xaa18。体外活性测定表明，本发明提供的多肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌均具有显著的杀菌效果，对临床上分离的耐药性革兰氏阳性菌、耐药性革兰氏阴性菌及耐药性真菌同样具有显著的杀菌效果，具有广谱、高效的特点。

Description

一组HRP5类似物

本申请是申请号为201110116643.9，申请日为2011年5月6日，发明名称为“一组新型的HRP5类似物及其制备方法”的分案申请。

技术领域

本发明属于医药领域，具体而言涉及一组新型的具有广谱抗菌活性的HRP5类似物及其制备方法。

背景技术

自从青霉素发现以来，抗生素一直是人类治疗病原微生物感染的有力武器，但随着传统抗生素的滥用，越来越多的病原菌开始对传统抗生素产生耐药性，所以急需寻找一类全新的抗菌药物来替代抗生素进行使用。

阳离子抗菌肽(cationic antimicrobial peptides)是植物和动物产生的一般由12-50个氨基酸残基组成的阳离子型(富含精氨酸及赖氨酸)多肽，能够保护宿主不受外界病原微生物感染。阳离子抗菌肽的抗菌谱比传统抗生素宽，来自昆虫、猪、蛙以及人的阳离子抗菌肽不仅对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌有抗菌作用，而且还具有抗真菌及抗病毒活性。传统抗生素通过消除微生物生长或生存必不可少的条件，如使酶变性，来达到杀菌的目的，但细菌只要一种基因突变后就可以抵抗此类抗生素的攻击。而阳离子抗菌肽则通过中和电荷的方法与细菌细胞膜相互作用，以此穿透杀死细菌，极大地减少了细菌产生耐药性的可能。但天然的阳离子抗菌肽并非完美无缺，部分抗菌肽对真核生物有一定的毒性，对病原物高杀灭活性的同时往往伴随着对真核生物的溶血作用。因此如何提高其活性并最大程度降低其毒性是目前抗菌肽药物开发的难点和希望所在。目前的研究主要将α-螺旋的两性抗菌肽作为研究对象，围绕阳离子氨基酸以及疏水性氨基酸数量及位置，对抗菌肽进行结构改造，如残基替换、截取天然抗菌肽的部分序列以及增加肽链的正电荷含量等，取得了较大进展。

富组蛋白(histidine rich protein,HRPs或histatins)是一类存在于灵长类动物腮腺和颌下腺分泌物中富含组氨酸的阳离子多肽。现已分离出至少12种人HRPs(HRP1-12)，其中HRP1、HRP3及HRP5是主要富组蛋白，占总HRPs的85％-90％，分别由38，32，24个氨基酸组成。HRP1和HRP3由不同的基因编码，HRP5是HRP3经蛋白酶水解的产物，包含在HRP3的N末端24个残基中。编码HRP1，3的基因已被测序且定位于人类第4号染色体q13上。现有研究表明：HRPs具有多种活跃的生物学功能，其抗微生物作用尤为重要，如抑制、杀灭变形链球菌和白色念珠菌等。

HRP5含有24个氨基酸残基，分子量为3037D。其氨基酸序列为Asp-Ser-His-Ala-Lys-Arg-His-His-Gly-Tyr-Lys-Arg-Lys-Phe-His-Glu-Lys-His-His-Ser-His-Arg-Gly-Tyr(SEQ ID NO:1)。Raj等学者认为HRP5抗白色念珠菌的特性与其氨基酸序列有关，他们分别将HRP5及其残基片段N16(1-16位氨基酸)、C16(9-24位氨基酸)、C14(11-24位氨基酸)、C12(13-24位氨基酸)、C10(15-24位氨基酸)和M10(7-16位氨基酸)分别与不同浓度的白色念球菌作用，检测其抗白色念球菌的能力。试验结果表明C16和C14有较强的抑制白色念珠菌生长的能力，而且HRP5与C16的抗白色念球菌的活性基本一致，而同样含有16个氨基酸的N16抗白色念珠菌的活性远远低于C16。这一结果提示HRP5的抗白色念珠菌的功能区位于羧基端。为了进一步研究HRP5的结构和功能的关系，许多学者通过残基替换得到了一系列的变异体，其中较重要的是dhvar1、dhvar2、dhvar4、dhvar5。它们是HRP5活性区(11-24位氨基酸)变异体。

发明内容

多肽或其药用盐，所述多肽具有如下氨基酸序列：

Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Leu-Xaa11-Lys-Tyr-Leu-Arg-Xaa16-Xaa17-Xaa18(SEQ ID NO:2)

其中Xaa1为Cys或缺失；

Xaa2为Lys、D-Lys、Arg、D-Arg、HoR或缺失；

Xaa3为Leu、Ile、Nle、Val、Trp、Phe、D-Phe、Thi或缺失；

Xaa4为Lys、D-Lys、Arg、D-Arg、Aib或HoR；

Xaa5为Lys、D-Lys、Arg、D-Arg或HoR；

Xaa6为Leu、Ile、Nle、Val、Trp、Phe、D-Phe或Thi；

Xaa7为Leu、Ile、Nle、Val、Trp、Phe、D-Phe或Thi；

Xaa8为Lys、D-Lys、Arg、D-Arg或HoR；

Xaa9为Lys、D-Lys、Arg、D-Arg或HoR；

Xaa11为Leu、Ile、Nle、Val、Trp、Phe、D-Phe或Thi；

Xaa16为Lys、D-Lys、Arg、D-Arg或HoR；

Xaa17为Leu、Ile、Nle、Val、Trp、Phe、D-Phe或Thi；

Xaa18为Cys或缺失，当Xaa1与Xaa18同为Cys时，该多肽可以形成环肽。

作为本发明的一种优选方案Xaa1与Xaa18同为Cys或同时缺失；Xaa2优选Arg、D-Arg或缺失；Xaa3优选Phe、D-Phe或缺失；Xaa4优选Lys、D-Lys、Arg、Aib或HoR；Xaa5优选Lys、Arg或D-Arg；Xaa6优选Leu、Ile或Nle；Xaa7优选Trp、Phe、D-Phe或Thi；Xaa8优选Lys、D-Lys或Arg；Xaa9优选Lys、D-Lys或Arg；Xaa11优选Leu、D-Phe或Phe；Xaa16优选Lys、D-Lys或Arg；Xaa17优选Trp、Phe、D-Phe或Thi。

本发明所涉及的氨基酸残基既包括天然氨基酸，也包括非天然氨基酸。本发明所涉及的天然氨基酸所对应的三字母代码表如表1所示，本发明所涉及的非天然氨基酸所对应的三字母代码表及结构如表2所示。

本发明所涉及的所有氨基酸残基若不特别限定其构型，代表L型氨基酸。

本发明所涉及的多肽，既可以是线性肽，也可以是环肽。当Xaa1与Xaa18同为Cys时，可以通过加入氧化剂使得Xaa1与Xaa18之间形成二硫键，此时该肽由线性肽变成环肽。

本发明所涉及的多肽为线性肽时，其C末端既可以是羧酸的形式，也可以是酰胺的形式，优选以酰胺的形式存在。

表1：天然氨基酸三字母代码表

表2：非天然氨基酸三字母代码表及结构

本发明优选的一个实施方式中公开了一种线性的多肽(AMP-1)，其氨基酸序列为：

Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH₂(SEQ IDNO:3)

本发明另一个优选的实施方式中公开了一组线性的多肽(AMP-2，AMP-3，AMP-4，AMP-5，AMP-6，AMP-7，AMP-8，AMP-9，AMP-10，AMP-11，AMP-12)，其氨基酸序列分别为：

Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-D-Lys-D-Phe-NH₂(SEQID NO:4)

D-Lys-D-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-D-Lys-D-Phe-NH₂(SEQ ID NO:5)

D-Lys-D-Arg-Leu-Phe-D-Lys-D-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-D-Lys-D-Phe-NH₂(SEQ ID NO:6)

Phe-Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH₂(SEQID NO:7)

Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Tyr-Leu-Arg-Arg-Phe-NH₂(SEQ IDNO:8)

Arg-Arg-Ile-Phe-Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Tyr-Leu-Arg-Arg-Phe-NH₂(SEQ IDNO:9)

Arg-Leu-Arg-Arg-Ile-Phe-Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Tyr-Leu-Arg-Arg-Phe-NH₂(SEQ ID NO:10)

Lys-Arg-Leu-Thi-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Thi-NH₂(SEQ IDNO:11)

Lys-Arg-Nle-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Thi-NH₂(SEQ IDNO:12)

Aib-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Thi-NH₂(SEQ IDNO:13)

HoR-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Thi-NH₂(SEQ IDNO:14)

本发明的又一个优选的实施方式公开了一种环状的多肽(AMP-13)，其氨基酸序列为：

(SEQ ID NO:15)

本发明还有个目的就是提供上述线性及环状多肽的制备方法，可以采用本领域技术人员熟悉的固相化学合成技术制备线性肽以及通过双氧水氧化法在线性肽的基础上制备环肽。

固相化学合成技术的制备步骤如下：

(1)在树脂上固相合成多肽；

(2)将步骤(1)的产物在三氟乙酸或氢氟酸中进行裂解，优选三氟乙酸，并加入侧链保护基清除剂，然后用5-20倍体积的冰乙醚沉淀多肽，离心，弃上清，再用冰乙醚反复洗涤沉淀4-5次，真空干燥，得到粗肽；

若本发明所涉及的多肽C末端为羧酸形式则步骤(1)采用Wang树脂进行合成；若本发明所涉及的多肽C末端为酰胺形式则步骤(1)采用Rink Amide MBHA树脂进行合成。

步骤(1)是在液相环境中进行，具体包括：浸泡树脂—脱除氨基保护基—洗涤—偶联氨基酸—监测—洗涤—脱除氨基保护基(顺序偶联剩余氨基酸)—干燥树脂。

其中氨基保护基是指为保护参与缩合反应的氨基而引入的化学基团。所述的氨基保护基选自：叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Z)和9-芴基-甲基羰基(Fmoc)，优选9-芴基-甲基羰基(Fmoc)。

作为固相多肽合成技术的一个优势，对部分氨基酸的侧链可以通过引入化学基团进行保护，例如Arg及HoR可以采用五甲基苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)；Cys可以采用三苯甲基(Trt)；Lys及Trp可以采用叔丁氧羰基(Boc)；Tyr可以采用叔丁基(tBu)。所述的保护基团不限于此，可以根据本领域常规方案进行合理选择。

步骤(1)的液相环境所用溶剂选自：二甲基甲酰胺(DMF)或二氯甲烷(DCM)，优选DMF。

步骤(1)中脱除氨基保护基需要加入氨基保护基的脱除剂，氨基保护基的脱除剂选用哌啶(PIP)溶液，浓度10-40％(PIP/DMF)，脱除时间为20-50min。优选浓度为20-25％(PIP/DMF)，脱除时间25-35min。

步骤(1)中氨基酸的偶联需要加入偶联试剂，偶联试剂由：碳二亚胺型试剂或者苯并三氮唑鎓盐型试剂与1-羟基苯并三唑(HOBt)组成。

碳二亚胺型试剂包括二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)及N-二氨基丙基-N-乙基碳二亚胺(EDC)。

苯并三氮唑鎓盐型试剂包括2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、O-苯并三唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(BOP)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)等。

偶联试剂优选二异丙基碳二亚胺(DIC)与1-羟基苯并三唑(HOBt)、2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)与1-羟基苯并三唑(HOBt)，最优选DIC(二异丙基碳二亚胺)与1-羟基苯并三唑(HOBt)。

步骤(1)中的“监测”采用茚三酮检测法监测多肽的缩合反应。

步骤(1)中的顺序连接氨基酸是指根据多肽氨基酸序列从C端向N端逐个连接氨基酸。

步骤(2)所述的侧链保护基清除剂是选自如茴香硫醚、三异丙基硅烷、苯酚、水、1,2-乙二硫醇、间甲酚等两个或者两个以上的组合并与三氟乙酸或氢氟酸按5-20％(V/V)进行配制得到。优选三氟乙酸(TFA):茴香硫醚:1,2-乙二硫醇:75％苯酚:水＝85:5:5:4:1。

特别有益的是为满足医药用途的质量要求，本发明所提供的多肽制备方法还包括采用常规手段进行纯化。所采用的纯化方法可以为反相色谱法或离子交换色谱法，优选反相色谱法。

本发明所涉及的多肽的体外抗菌活性可以通过测定其最低抑菌浓度(MIC)来鉴定。美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐采用常量肉汤稀释法来测定各抗菌肽的最低抑菌浓度(MIC)，培养基采用Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基。以两性霉素B、多粘菌素E及万古霉素作为阳性对照。体外活性测定表明，本发明提供的多肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌均具有显著的杀菌效果，对临床上分离的耐药性革兰氏阳性菌、耐药性革兰氏阴性菌及耐药性真菌同样具有显著的杀菌效果，具有广谱、高效的特点。因此本发明所涉及的多肽可以在临床上作为活性成分替代传统抗生素进行治疗。

以下实施例仅代表本发明阐述的一个方面，不是本发明主题的局限。

具体实施方式

实施例1：AMP-1的制备及纯化

序列：Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH₂(SEQID NO:3)

(1)材料及试剂

Rink Amide MBHA树脂，取代值0.41mmol/g。

所需带保护的氨基酸为Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Phe-OH及Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH。

试剂：HOBt、DIC、DMF、哌啶。

(2)仪器

PSI300型多肽合成仪、Waters600半制备型高效液相色谱仪、磁力搅拌器。

(3)操作步骤(以0.25mmol为例)

a.固相化学合成多肽

称取Rink Amide MBHA树脂0.61g，置于多肽合成仪的反应器中，加入10mLDMF，浸泡2h，然后加入20％PIP/DMF溶液15mL，混合30min来脱除氨基保护剂，用DMF洗涤树脂7次，然后向反应器中加入387.4mg Fmoc-L-Phe-OH、等摩尔的偶联试剂DIC(0.33mol/L)与HOBt(0.33mol/L)进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应监测反应进程，确保氨基酸偶联到树脂上，用DMF洗涤树脂7次。当第一个氨基酸偶联到树脂上后，即可按照上述方法继续进行下一个氨基酸的偶联反应，如此循环，直至全部氨基酸偶联完成。

b.裂解及沉淀

肽合成结束后，真空干燥树脂，称重。按照1g树脂10mL裂解试剂的比例加入裂解试剂，试剂配比为TFA:茴香硫醚:1,2-乙二硫醇:75％苯酚:水＝85:5:5:4:1，室温搅拌反应3小时，抽滤。接着向裂解抽滤液中加入10倍体积的冰乙醚沉淀多肽，离心，弃上清，再用冰乙醚反复洗涤沉淀4～5次，真空干燥，称重粗肽。

c.反相色谱纯化

用制备型HPLC，采用反相色谱法，纯化上述粗肽。

HPLC条件如下：

色谱柱：XBridgeTM PrepC185μm OBDTM19×150mm

流速：10mL/min

检测波长：210nm

流动相：A：含0.1％TFA水溶液

B：含0.1％TFA的乙腈

梯度洗脱程序如表3:

表3 梯度洗脱表

收集目标肽纯度大于99％的部分，然后50℃减压浓缩至干。经ESI-MS测定，该肽的分子量为1880.28，理论值为1880.43。

实施例2：表4中HRP5类似物的制备及纯化

(1)材料及试剂

Rink Amide MBHA树脂，取代值0.41mmol/g。

所需带保护的氨基酸Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-HoR(Pbf)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Nle-OH、Fmoc-L-Thi-OH及Fmoc-L-Aib-OH。

试剂：HOBt、DIC、DMF、哌啶。

(2)仪器

PSI300型多肽合成仪、Waters600半制备型高效液相色谱仪、磁力搅拌器。

(3)操作步骤(以0.25mmol为例)

以类似实施例1中操作步骤a-c的方法制备及纯化表4中的多肽，收集纯度大于99％的部分，然后50℃减压浓缩至干。ESI-MS测定值如表4所示。

表4 HRP5类似物

实施例3：环肽AMP-13的制备及纯化

序列：(SEQ ID NO:15)

(1)材料及试剂

Rink Amide MBHA树脂，取代值0.41mmol/g。

所需带保护的氨基酸为Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH及Fmoc-L-Cys(Trt)-OH。

试剂：HOBt、DIC、DMF、哌啶、30％H₂O₂。

(2)仪器

PSI300型多肽合成仪、Waters600半制备型高效液相色谱仪、磁力搅拌器。

(3)操作步骤

a.以类似实施例1中操作步骤a-c的方法制备及纯化具有如下序列(Cys-Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-Cys-NH₂)的多肽，收集纯度大于99％的部分，然后50℃减压浓缩至干。经ESI-MS测定，该肽的分子量为2086.24，理论值为2086.72。

b.分子内二硫键的形成

称取本实施例操作步骤a中多肽100.0mg，溶于200ml水，配制成浓度为0.5mg/ml的溶液，加入3.33ml浓度为30％的过氧化氢，室温下搅拌反应，用HPLC监测反应的进行，直至完全转化为氧化型。

c.反向色谱纯化

以类似实施例1中操作步骤c的方法纯化，收集环肽AMP-13纯度大于99％的部分，然后50℃减压浓缩至干。经ESI-MS测定，该肽的分子量为2084.25，理论值为2084.72。

实施例4：体外抗菌活性测定

根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的常量肉汤稀释法测定各抗菌肽的最低抑菌浓度(MIC)，培养基采用Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基。

具体步骤为：

(1)抗菌药物贮存液制备：

精确配制浓度为1280μg/mL的上述HRP5类似物AMP 1～13和阳性对照品两性霉素B、多粘菌素E及万古霉素。配制好的各贮存液置于－20℃环境中保存备用。

(2)培养基的配制：

称取MH肉汤培养基21g，溶于蒸馏水中并定容至1L，121℃高温灭菌30min。

(3)接种物的制备：

用接种环挑取形态相似待检菌落3～5个，接种于4～5mL的MH肉汤中，35℃孵育2～6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1～2×10⁸CFU/mL。用MH肉汤将上述菌悬液进行1：100稀释后备用。

(4)稀释抗菌药物的制备及菌液接种：

取无菌试管(13×100mm)13支，排成一排，第1管中加入1.6mL MH肉汤，第2-13管中各加入1mL MH肉汤，然后向第1管加入抗菌药物原液(1280μg/mL)0.4mL，混匀，接着吸取1mL至第2管，混匀后再从第2管中吸取1mL至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1mL弃去，，然后向第1-11管及第13管中加入上述制备好的接种物各1mL，使每管最终菌液浓度约为5×10⁵CFU/mL。第1-11管药物浓度分别为128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL，第12管为不含抗菌药物及接种物的空白对照，第13管为不含抗菌药物的阴性对照。(5)孵育：将接种好的稀释管塞好塞子，置35℃普通空气孵箱中孵育16～20h。

(6)结果：以肉眼观察，无细菌生长的最低药物浓度即为该样品的最低抑菌浓度(MIC)。各抗菌肽的MIC测定结果如表5所示。

表5 HRP5类似物的MIC测定结果

Claims (9)

1.多肽或其药用盐，其氨基酸序列为：

Lys-Arg-Leu-Thi-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Thi-NH₂，

Lys-Arg-Nle-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Thi-NH₂，

Aib-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Thi-NH₂或

HoR-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Thi-NH₂。

2.权利要求1的多肽的制备方法，其包括以下步骤：

(1)在树脂上固相合成多肽；

(2)将步骤(1)的产物在三氟乙酸或氢氟酸中进行裂解，加入侧链保护基清除剂，并与5-20倍体积比的冰乙醚混合，沉淀多肽，离心，干燥得到粗肽。

3.权利要求2的制备方法，其中步骤(1)是在液相环境中进行，具体包括：浸泡树脂—脱除氨基保护基—洗涤—偶联氨基酸—监测—洗涤—脱除氨基保护基—顺序连接其余氨基酸—干燥树脂。

4.权利要求3的制备方法，其中所述氨基保护基选自叔丁氧羰基、苄氧羰基或9-芴基-甲基羰基。

5.权利要求3的制备方法，其中所述液相环境所使用的溶剂选自二甲基甲酰胺或二氯甲烷。

6.权利要求3的制备方法，其中偶联氨基酸所使用的偶联试剂选自碳二亚胺型试剂与1-羟基苯并三唑的组合，或者苯并三氮唑鎓盐型试剂与1-羟基苯并三唑的组合。

7.权利要求6的制备方法，其中所述偶联试剂选自二异丙基碳二亚胺与1-羟基苯并三唑的组合，或者2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯与1-羟基苯并三唑的组合。

8.权利要求2的制备方法，其进一步包括将粗肽纯化的步骤，其中纯化方法选自反相色谱法或离子交换色谱法。

9.权利要求1的多肽在制备抗白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、耐氟康唑白色念珠菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐氨苄青霉素肠球菌、耐亚胺培南绿脓杆菌和耐亚胺培南鲍曼不动杆菌的药物中的应用。