CN102656184A

CN102656184A - 抗菌肽Pexiganan类似物及其制备方法

Info

Publication number: CN102656184A
Application number: CN2009801620719A
Authority: CN
Inventors: 吴晓琰; 孙玉琨; 龚铁军
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-12-11
Filing date: 2009-12-11
Publication date: 2012-09-05
Also published as: WO2011069280A1

Abstract

本发明提供了抗微生物的Pexiganan类似物，其氨基酸序列为GIGKFLKKAKKFGKAFVKILKKR。另外，本发明还提供了该类似物的制备方法。

Description

说明书 . 抗微生物的 PEXIGANAN类似物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种 Pexiganan类似物（1-23 ) ，该 Pexiganan类似物（1-23 ) 具有抗菌作用，可用作为抗菌多肽药物。本发明还提供了通过化学合成或基因工程生产该 Pexiganan类似物（1-23 ) 的方法。

背景技术

生物体（动物、植物、昆虫……）对外界微生物的入侵本能的反应产生抗菌肽，通过天然免疫从而保护机体不受病菌的侵害。迄今 20余年来已从各种生物体内分离出 800多种抗菌多肽，仅从各种蛙皮中就分离出 200多种抗菌肽。这种多肽，分子量比较小（20- 60个氨基酸），却能杀死细菌、真菌、原虫和某些病毒，对一些耐药型微生物有效，是一种新型广谱抗菌药物，又被称为 "新型抗生素" 。抗菌肽本身没有毒性，代谢后为氨基酸，受到国内外广泛注意和研究。随着各种细菌对抗生素的耐药性增加，对抗菌肽的研究愈来愈多，因为抗菌肽对那些抗药性的菌类也能遏制。化学合成品 Pexiganan由 22个氨基酸组成，临床试验局部用药获得很好的治疗效果。

化学合成品的高价制约了其广泛应用。基因工程技术制备抗菌肽的困难在于发酵表达的抗菌肽会将工程菌杀死，发酵很难进行。用 Pichia Pastori s酵母发酵，分泌到发酵液中的小肽，分子量小，量少，回收困难。目前多以融合蛋白方式表达，形成不溶性包涵体，避免了对工程菌的伤害，但要求融合蛋白载体分子量要小，表达水平要高，以增加目的多肽产量。参考文献：

US patene ： 7332800

Pexiganan: Antimicrob Agents Chemither(1999)43,782-788

Diagn. Microbiol Infect. Dis.(1999)35,45-53

Drugs.(1998)56, 1047-1052

Rev. in Medical Microbiology(2004) 15, 17-25

Drug Communication.(2008) 确认本 Pexiganan基因工程制备：

Biotechnology and applied Biochemistry(2004)39,339-345.

Protein Expression and purification( 1998) 12,53-60.

Biochemical and Biophysical. Res.comm(2000)277,575-579.

US patent(2001)6183992

生物工程学报（2008 ) 24, 21-26. 发明内容

本发明的目的在于克服已有技术的缺陷，利用基因工程技术成功的生产

Pexiganan类似物（1-23 ) ，每立升发酵液可达 500mg，能降低成本。

本发明的 Pexiganan 类似物（1-23)，其特征在于： Pexiganan 类似物（1-23) 的氨基酸序列由 23个氨基酸组成， Pexiganan 类似物（1-23) 其结构式为：

Gly-I le-Gly-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Lys

-I le-Leu-Lys-Lys-Arg

其中， 22个氨基酸序列为 Pexiganan, C末端为 Arg， C末端 Arg为 -OH或 NH2。根据 Pexiganan类似物氨基酸序列及相应 DNA序列，合成 DNA片段

BamH I X Gly l ie Gly Lys Phe Leu Lys Lys Ala Lys Lys Phe < > GGC ATC GGC AAA TTC CTG AAA AAA GCG AAA AAA TTC

CCG TAG CCG TTT AAG GAC TTT TTT CGC TTT TTT AAG

Gly Lys Ala Phe Val Lys lie Leu Lys Lys Arg

GGC AAA GCG TTC GTT AAA ATC CTG AAA AAA CGT TAG

<==>

CCG TTT CGC AAG CAA TTT TAG GAC TTT TTT GCA ATC

Sal I

其中 X=Met ¾=Asp或 =Trp或 Arg。

另一方面，本发明还提供了该 Pexiganan 类似物（1-23 )利用基因工程或化学合成法生产的方法。

本发明的 Pexiganan 类似物（1-23 ) 是抗菌肽 Magainin的类似物，具有很强的抗菌作用，能直接杀死细菌、真菌、原虫和某些病毒，不产生抗药性。本发明的 Pexiganan 类似物（1-23 ) 的用途可作为抗菌多肽药物。

迄今所用的 Pexiganan等抗菌肽都是化学合成品，价格昂贵，阻碍了其广泛的应用。基因工程利用 Pichia Pastoris酵母以甲醇诱导表达的抗菌肽分泌到发酵液中，由于分子量小，表达量也低，从发酵液中回收十分困难。本发明将抗菌肽

Pexigarmn类似物（1-23) 以融合蛋白形式表达，制备，工艺简单，具有工业量产意义。附图说明

图 1是 Pexiganan 类似物 (1-23) 的 HPLC检测图谱；

图 2是 Pexiganan类似物（1-23) 杀菌效果图；

图 3是固相合成法合成 Pexiganan类似物（1-23) 合成过程图。具体实施方式

实施例一：

固相合成法合成 Pexiganan类似物（1-23) 。

(1) 化学结构

Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Lys-Ile- Leu-Lys-Lys-Arg

(2) 固相树脂是王树脂（Wang Resin) ，进行固相合成，合成结束后将得到的带侧链保护基的多肽树脂进行裂解，即切断多肽与树脂的联结同时脱保护基一步完成， C端为自由羧基。

(3) 合成步骤

8种带保护基 Fmoc氨基酸 ~~► 固相合成一"► 切断树脂，同时脱保护基一 HPLC纯化——►冷冻干燥，得到 Pexiganan类似物（1-23) 。

带保护基 Fmoc的氨基酸- Fmoc-L- Ala-OH； Fmoc-L-Lys(Trt)-OH；

Fmoc-L-Arg(pmc)-OH； Fmoc-L-Val-OH；

Fmoc-L-Ile-OH; Fmoc-Gly-OH;

Fmoc-L-Phe-OH; Fmoc-L-Leu-OH

(4) 合成过程参见图 3，从 C端幵始将第一个氨基酸 Arg联在树脂（R) 上，然后从 C端一步完成一个氨基酸的联结，向 N端延伸直至最后完成，共进行 24步。 ( 5 ) 固相多肽合成仪（Applied Biosystem433A型）

所用试剂皆系分析纯或多肽合成级： N-甲基吡咯烷酮，二氯甲垸，六氢 B比啶， 2.0M DIEA NMP, DMAP/DMF, HBTU100mmole/0.5M HOBT in F等。

( 6) 操作

以 0.25mmole规模，称树脂 0.5g置入多肽合成仪的反应器中，将 8种带保护基 Fmoc的氨基酸各秤 lmmole装瓶按 Pexiganan类似物（ 1-23 ) 的氨基酸序列从 C端向 N端排列在合成仪中，于 25'C室温条件下由电脑程序（Synth Assiat) 控制自动进行，脱 Fmoc保护基，活化，联结完成后进入下一个循环步骤。

( 7) 裂解与脱保护基

将带保护基的 Pexiganan类似物（1-23 ) - 放入带塞的三角瓶中，放入裂解试剂如下：

试剂体积（ml)

水 0.50

苯甲醚 0.50

苯酚 0.75

巯基乙酸 0.20

三氟乙酸 10.0

恒温 30°C条件下，电磁搅拌 6小时，过滤除去树脂，收集清液，再用少量三氟乙酸将树脂洗涤一次，合并收集液，加入乙醚（约 20-30ml) 产生沉淀，过滤，用乙醚将沉淀洗一次，立即放入干燥器中。

用 0.5%乙酸将上述 Pexiganan类似物（ 1-23 )粗品溶解，浓度为 5mg/ml，进行 HPLC，以大连依列特制备型 HPLC纯化分离 Pexiganan类似物 ( 1-23 )主峰，分离纯化条件： 0.1%三氟乙酸及含 0.1%三氟乙酸的 80% 的乙腈进行梯度分离，将分离所得的 Pexiganan类似物（1-23 ) 减压浓缩除去乙腈后进行冷冻干燥得到产品。

Pexiganan 类似物（1-23 ) 的 HPLC检测参见图 1。实施例二：

融合蛋白的 Clostripain切断。

BamH I Arg Gly lie Gly Lys Phe Leu Lys Lys Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val ^ ^ CGT GGC ATC GGC AAA TTC CTG AAA AAA GCG AAA AAA TTC GGC AAA GCG TTC GTT

GCA CCG TAG CCG TTT AAG GAC TTT TTT CGC TTT TTT AAG CCG TTT CGC AAG CAA

Lys lie Leu Lys Lys Arg

AAA ATC CTG AAA AAA CGT TAG ^ ►

TTT TAG GAC TTT TTT GCA ATC

Sal I

基因合成及克隆：

根据 Pexiganan类似物 (1-23)氨基酸序列及相应 DNA序列，合成 DNA片段

1 BamH I CGTGGCATCGGCAAATTCCTGAAAAAAGCGAAAAAATT 2

4 Sal I^ CTAGGATCCACGTTTTTTCA

5 TGCCGATGCCACG ^amH

以常规 PCR方法扩增联接构成含 Arg的密码子，克隆到含 Lac启动子质粒中，形成融合蛋白基因，构建表达质粒，转染大肠杆菌 JM109。

发酵：

Pexiganan类似物（1-23 ) 基因工程菌接种于 300ml X 2瓶 LB培养基中，加氨苄西林（Ampici l l in ) 使其最后浓度为 50 μ g/ml， 37 °C , 摇床培养过夜（150rpm) 。第二日转至 20L New Brunswik 发酵罐培养，培养液组成为 M9培养液，加葡萄糖浓度 1%，氨苄西林（Ampici l l in )浓度为 50 μ g/ml , 通气量为 20L/min, 溶氧维持在 20%以上，防泡剂为国产泡敌， pH维持在 7〜8，用氨水调节。当菌体浓度达 log曲线中线，加 IPTG, 浓度为 0. 5mM，继续发酵 4〜6小时，离心收集菌体为湿重 30〜 50g/L_o

下游工艺：

收集的菌体用 pH 7. 0 Tri s 缓冲液 20mM匀浆，之后加溶菌酶 lg/L ， 37°C保温 1 小时，冷冻一 20°C 过夜，超声破碎 3次，每次 1分钟左右，离心收集沉淀， 2M Urea 打碎洗涤 1次，再打碎水洗 1次。分离、纯化包涵体：沉淀溶于 8M尿素， Sephadex G- 100层析 A280nm检测，将收集液透析过夜，用 Clostripain蛋白酶裂解， HPLC追踪。完成酶解反应后以 30000分子量超滤，再经 HPLC纯化，得到 Pexiganan 类似物（1-23 ) 。制备型 HPLC纯化（参见图 1 ) 。冷冻干燥获得产品。实施例三：

融合蛋白的 BrCN切断。

BamH I Met Gly lie Gly Lys Phe Leu Lys Lys Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val ►ATG GGC ATC GGC AAA TTC CTG AAA AAA GCG AAA AAA TTC GGC AAA GCG TTC GTT

TAC CCG TAG CCG TTT AAG GAC TTT TTT CGC TTT TTT AAG CCG TTT CGC AAG CAA

Lys He Leu Lys Lys Arg

AAA ATC CTG AAA AAA CGT TAG ~►

TTT TAG GAC TTT TTT GCA ATC

Sal I

基因合成及克隆- 根据 Pexiganan类似物（1-23)氨基酸序列及相应 DNA序列，合成 DNA片段

1 BamH I ATGGGCATCGGCAAATTCCTGAAAAAAGCGAAAAAATT 2

CGGCAAAGCGTTCGTTAAAATCCTGAAAAAACGTGGATCCTAGSal l

►

4 Sal CTAGGATCCACGTTTTTTCA

5 TGCCGATGCCCAT gamH

以常规 PCR方法扩增联接构成含 Met的密码子，克隆到含 Lac启动子质粒中，形成融合蛋白基因，构建表达质粒，转染大肠杆菌 JM109。

发酵：

Pexiganan类似物（1-23 ) 基因工程菌接种于 300ml X 2瓶 LB培养基中，加氨苄西林（Ampici l l in) 使其最后浓度为 50 μ g/ml， 37 °C , 摇床培养过夜（150rpm) 。第二日转至 20L New Brunswik 发酵罐培养，培养液组成为 M9培养液，加葡萄糖浓度 1%，氨苄西林（Ampici l l in )浓度为 50 μ g/ml，通气量为 20L/min，溶氧维持在 20%以上，防泡剂为国产泡敌， pH维持在 7〜8，用氨水调节。当菌体浓度达 log曲线中线，加 IPTG, 浓度为 0. 5mM，继续发酵 4〜6小时，离心收集菌体为湿重 30〜 50g/L。下游工艺- 收集的菌体用 pH 7. 0 Tri s 缓冲液 20mM匀浆，之后加溶菌酶 lg/L , 37°C保温 1 小时，冷冻一 20°C 过夜，超声破碎 3次，每次 1分钟左右，离心收集沉淀， 2M Urea 打碎洗涤 1次，再打碎水洗 1次。分离、纯化包涵体：沉淀溶于 8M尿素， Sephadex G-100层析 A280nm检测，将收集液透析过夜，在 70%HC02H条件下经 CNBr切断，加 Na2S03, 停止反应，稀释后 1000分子量超滤，再经 HPLC纯化，得到 Pexiganan类似物（1-23 ) 。制备型 HPLC纯化。冷冻干燥获得产品。实施例四：

融合蛋白的羟胺裂解。

BamH 】 Asn Gly lie Gly Lys Phe Leu Lys Lys Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val i ► AAC GGC ATC GGC AAA TTC CTG AAA AAA GCG AAA AAA TTC GGC AAA GCG TTC GTT

TTG CCG TAG CCG TTT AAG GAC TTT TTT CGC TTT TTT AAG CCG TTT CGC AAG CAA

Lys lie Leu Lys Lys Arg

AAA ATC CTG AAA AAA CGT TAG ^ ~►

TTT TAG GAC TTT TTT GCA ATC

Sal I

基因合成及克隆：

1 BamH I AACGGCATCGGCAAATTCCTGAAAAAAGCGAAAAAATT 2

CGGCAAAGCGTTCGTTAAAATCCTGAAAAAACGTGGATCCTAGSal I

4 ^Sal CTAGGATCCACGTTTTTTC A

5 TGCCGATGCCGTT ^amH I

以常规 PCR方法扩增联接构成含 Asn-Gly的密码子，克隆到含 Lac启动子质粒中，形成融合蛋白基因，构建表达质粒，转染大肠杆菌 JM109。

发酵：

Pexiganan类似物（1-23 )基因工程菌接种于 300ml X 2瓶 LB培养基中，加氨苄西林（Ampici l l in ) 使其最后浓度为 50 μ g/ml， 37 摇床培养过夜（150rpm) 。第二日转至 20L New Brunswik 发酵罐培养，培养液组成为 M9培养液，加葡萄糖浓度 1%，氨苄西林（Ampici l lin)浓度为 50 μ g/ml，通气量为 20L/min，溶氧维持在 20%以上，防泡剂为国产泡敌， pH维持在 7〜8, 用氨水调节。当菌体浓度达 log曲线中线，加 IPTG，浓度为 0. 5mM，继续发酵 4〜6小时，离心收集菌体为湿重 30〜 50g/L。

下游工艺- 收集的菌体用 pH 7. 0 Tri s 缓冲液 20mM匀浆，之后加溶菌酶 lg/L , 37°C保温 1 小时，冷冻一 20°C 过夜，超声破碎 3次，每次 1分钟左右，离心收集沉淀， 2M Urea 打碎洗漆 1次，再打碎水洗 1次。分离、纯化包涵体：沉淀溶于 8M尿素， Sephadex G-100层析 A280nm检测，将收集液透析过夜。 Pexiganan类似物（ 1-23 ) 的融合蛋白以 2M的 NH20H/6M的盐酸胍 Guanidin · HC1在 pH9. 0， 45 °C , 裂解 8小时，过程中以 HPLC追踪，裂解后以分子量 1000超滤去盐， HPLC纯化，得 Pexiganan 类似物（1-23 ) 产品。制备型 HPLC纯化。冷冻干燥获得产品。实施例五：

融合蛋白色氨酸残基的裂解。

BamH I Trp Gly lie Gly Lys Phe Leu Lys Lys Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val ⁴ ^ TGG GGC ATC GGC AAA TTC CTG AAA AAA GCG AAA AAA TTC GGC AAA GCG TTC GTT

ACC CCG TAG CCG TTT AAG GAC TTT TTT CGC TTT TTT AAG CCG TTT CGC AAG CAA

Lys lie Leu Lys Lys Arg

AAA ATC CTG AAA AAA CGT TAG ~►

TTT TAG GAC TTT TTT GCA ATC

Sal I

基因合成及克隆- 根据 Pexiganan类似物 (1-23)氨基酸序列及相应 DNA序列，合成 DNA片段

1 BamH I TGGGGCATCGGCAAATTCCTGAAAAAAGCGAAAAAATT

3

CGGCAAAGCGTTCGTTAAAATCCTGAAAAAACGTGGATCCTAGSal I

4 Sal I CTAGGATCCACGTTTTTTCA

5 TGCCGATGCCCCA gamH^I 以常规 PCR方法扩增联接构成含 Trp的密码子，克隆到含 Lac启动子质粒中，形成融合蛋白基因，构建表达质粒，转染大肠杆菌 JM109。

发酵：

Pexiganan类似物（1-23 ) 基因工程菌接种于 300ml X 2瓶 LB培养基中，加氨苄西林（Ampici l l in ) 使其最后浓度为 50 μ g/ml , 37°C，摇床培养过夜（150rpm) 。第二日转至 20L New Brunswik 发酵罐培养，培养液组成为 M9培养液，加葡萄糖浓度 1%，氨苄西林（Ampici l l in )浓度为 50 μ g/ml，通气量为 20L/min，溶氧维持在 20%以上，防泡剂为国产泡敌， pH维持在 7〜8，用氨水调节。当菌体浓度达 log曲线中线，加 IPTG，浓度为 0. 5mM，继续发酵 4〜6小时，离心收集菌体为湿重 30〜 50g/L o

下游工艺- 收集的菌体用 pH 7. 0 Tri s 缓冲液 20mM匀浆，之后加溶菌酶 lg/L , 37°C保温 1 小时，冷冻一 20°C 过夜，超声破碎 3次，每次 1分钟左右，离心收集沉淀， 2M Urea 打碎洗涤 1次，再打碎水洗 1次。分离、纯化包涵体：沉淀溶于 8M尿素， Sephadex G- 100层析 A280nm检测，将收集液透析过夜，取 BNPS- Skatole溶于 70%醋酸（含 0. 1%酚），加入融合蛋白，室温反应 48小时（或 37°C反应 5小时），暗处氮气条件下加 10倍量还原剂（如巯基乙醇）停止反应。反应液经乙酸乙酯抽提除去 BNPS- Skatole，水相冻干保存，溶解后 HPLC制备，得 Pexiganan类似物（ 1-23 ) 产品。实施例六：

本发明的 Pexiganan类似物（1-23 ) 作为抗菌多肽药物，具有很强的抗菌作用，能直接杀死细菌、真菌、原虫和某些病毒，不产生抗药性。

参见图 2，图中：左碟为 Pexiganan 类似物（1-23 ) 与 E.Coli耐药菌预混生理盐水液体中保温半小时后涂板，右碟为 E.Coli耐药菌预混生理盐水液体中保温半小时后涂板。 37°C保温过夜后摄片。

Claims

1. 一种 Pexiganan 类似物（1-23)，其特征在于： Pexiganan 类似物 (1-23) 的氨基酸序列由 23个氨基酸组成， Pexiganan 类似物（1-23) 其结构式为：

Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Phe-Qly-Lys-Ala-Phe-Val-Lys -Ile-Leu-Lys-Lys-Argo
2. 如权利要求 1所述的 Pexiganan 类似物（1-23) ，其中， 1-22个氨基酸序列为 Pexiganan, C末端为 Arg。
3. 如权利要求 1或 2所述的 Pexiganan类似物（1-23) , 其中， C末端 Arg为 -OH 或 NH2。
4. 如权利要求 1所述的 Pexiganan类似物（1-23)的生产方法，为化学合成法生产，包括如下步骤：将 8种带保护基 Fmoc氨基酸经固相合成、切断树脂，同时脱保护基、 HPLC纯化、冷冻干燥，得到 Pexiganan类似物（1-23)
5. 如权利要求 1所述的 Pexiganan类似物（1-23)的生产方法，为基因工程法生产。
6. 如权利要求 1所述的 Pexiganan类似物（1-23) ，其用途为作为抗菌多肽药物。