CN102925432A

CN102925432A - 重组抗菌肽buforin IIb的生产方法

Info

Publication number: CN102925432A
Application number: CN2011102310117A
Authority: CN
Inventors: 殷志敏; 王期; 周军
Original assignee: NANJING BAAODE BIO-TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: NANJING BAAODE BIO-TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2011-08-12
Filing date: 2011-08-12
Publication date: 2013-02-13
Anticipated expiration: 2031-08-12
Also published as: CN102925432B

Abstract

本发明公开了重组抗菌肽buforin IIb的生产方法，应用重组DNA技术，构建pSUMO/buforin IIb原核表达载体，再转化大肠杆菌，构建表达工程菌；工程菌以乳糖为诱导剂诱导表达SUMO-buforin IIb融合蛋白；然后经细胞破碎后释放出融合蛋白，使用镍离子亲和层析纯化，纯化后的融合蛋白经SUMO酶切反应，释放出buforin IIb，经镍离子亲和层析分离得到含有His₆标签的SUMO蛋白和不含His₆的buforin IIb蛋白。本发明方法在原核宿主细胞中高效表达了重组抗菌肽buforin IIb，分离纯化简单，重组蛋白纯度高，易操作，易放大，表达产物稳定性好，适于大规模工业化生产。

Description

重组抗菌肽buforin IIb的生产方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及重组抗菌肽buforin IIb的生产方法。

背景技术

抗菌肽是先天性免疫的分子受动器，通常它们含有15-45个氨基酸残基，净电荷为正。Cecropins类型的不含半胱氨酸线性肽是最早发现的，来源于昆虫。现已发现抗菌肽、蛋白有800个以上，来源于动物、植物领域。抗菌肽主要作用的靶点是细菌的膜，而且杀伤过程必须比细菌生长的速度快。人们发现许多传统的抗生素，特别是青霉素，能够诱导耐药菌株的产生。为了解决抗生素耐药性的问题，研制新的抗生素或抗菌肽就显得特别重要。抗菌肽具有良好的抗菌选择性和独特的抗菌模式，而且不会诱导产生耐药菌株，容易被降解，不易在微生物体内富集，因此，被认为能够成为替代抗生素的首选药物。

1996年Park首次在亚洲蟾蜍Bufo bufo gargarizans胃组织中发现了buforin I，buforin II是由buforin I在胞内蛋白酶Lys-C的作用下裂解而来，是buforin I从Thr到Lys共21个氨基酸残基的烈性抗菌肽。两者在体外都有很强的抗菌活性，其中buforin II的抗菌活性较buforin I更强。buforin IIb(RAGLQFPVG[RLLR]3)是在研究buforin II的结构-活性关系时发现的一种人工合成多肽，其核苷酸序列见SEQ ID No.1所示，氨基酸序列见SEQ ID No.2所示，其表现出比buforin II更强的抗菌活性。

目前，许多抗菌肽正在开发成药，但是，抗菌肽天然产量非常低，合成肽成本又太高，这成为开发成药的一个瓶颈，通过基因工程技术生产抗菌肽具有广阔的应用前景。

国内外对于buforin IIb的基因工程生产方法很少有报道，查到仅有的报道曾采用大肠杆菌表达系统以PruF融合蛋白的形式表达buforin IIb，结果不是十分理想，表达的buforin IIb产物绝大部份以包涵体形式存在，给后续的分离纯化带来不便，设计羟氨切割融合产物对buforin IIb活性也有影响。

近年来，SUMO(small ubiquitin-related modifier，一种小分子泛素样修饰蛋白)融合表达技术日益受到人们的重视。与传统的融合蛋白表达系统相比，SUMO融合表达系统有两个明显的优势：(1)SUMO不仅能够提高蛋白质在大肠杆菌的表达量，尤其是一些毒性或者小肽，而且能够大大增加蛋白的可溶性；SUMO被发现可用作分子伴侣来增加外源蛋白的稳定性和可溶性，其作用机理可能是SUMO蛋白作为一个高度疏水的核心为目的蛋白的折叠提供成核位点，促进蛋白间的相互作用并使其正确折叠，最终增强了融合蛋白的可溶性。有人对各种不同的融合标签在对蛋白总量及可溶蛋白含量的作用进行了实验比较，他们将三个蛋白模型融合到MBP，GST，TRX，NusA，Ub和SUMO标签的C端，结果表明，在增加蛋白总表达量上为：TRX＞SUMO＞NusA＞Ub＞MBP＞GST；在可溶蛋白含量上为：SUMO＞NusA＞Ub＞GST＞MBP＞TRX。总体来说，SUMO和NusA在提高蛋白表达量和可溶含量上是等同的。但是，SUMO在一定程度上比NusA更有优势：SUMO分子量小；SUMO可以精确的被切除而不留下氨基酸残基。(2)SUMO蛋白酶具有高比活性和高度特异性，1U的SUMO蛋白酶可以切割100μg SUMO融合蛋白。与其它酶切割原理不同的是SUMO蛋白酶识别SUMO的空间结构，而不是一级结构，这就避免了靶蛋白的非特异切割。由于SUMO蛋白酶的N-端添加了6xHis标签，大大简化该酶的去除以及目标产物的进一步纯化。而且经过切割的目标产物N-端不会携带多余的氨基酸。另外，IPTG是非常高效的乳糖启动子诱导剂，但其只适用于实验室规模的小量样品制备，应用于大规模发酵生产基因工程重组药物则有一定的局限性：一方面IPTG对于人体具有潜在的毒性，从安全角度而言并不合适；另一方面，IPTG较为昂贵。乳糖具备无毒和价廉的优点，使得其在重组蛋白的大规模发酵生产中，具有优于IPTG的潜在价值和优势。我们用乳糖作为诱导剂来启动T7RNA聚合酶基因和bufroin IIb目的蛋白基因的转录，从而短时间大量表达目的蛋白。

发明内容

本发明所要解决的技术问题，是提供一种表达效率高、蛋白纯度高、适于大规模工业化生产的重组抗菌肽buforin IIb的生产方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

重组抗菌肽buforin IIb的生产方法，包括如下步骤：

(1)应用重组DNA技术，将buforin IIb基因插入pSUMO载体中，构建pSUMO/buforin IIb原核表达载体；

(2)pSUMO/buforin IIb原核表达载体转化大肠杆菌，构建表达工程菌；

(3)将步骤(2)得到的工程菌以廉价无毒的乳糖为诱导剂诱导表达SUMO-buforin IIb融合蛋白；

(4)收集步骤(3)诱导表达后的菌体，经细胞破碎后释放出SUMO-buforin IIb融合蛋白，使用镍离子亲和层析纯化，得到纯化后的SUMO-buforin IIb融合蛋白；

(5)将纯化后的SUMO-buforin IIb融合蛋白经酶切反应，释放出buforin IIb，经镍离子亲和层析分离得到含有His₆标签的SUMO蛋白和不含His₆的buforin IIb蛋白。

步骤(2)中，所述的大肠杆菌为E.coli Rosetta(DE3)。

步骤(3)中，诱导表达方法为：将步骤(2)得到的工程菌接种于含卡那霉素50～60mg/L的LB液体培养基，37℃振荡培养16h，然后取10mL接种到1L LB液体培养基，37℃振荡培养2～4h，OD600达到0.8～1时，加乳糖至终浓度为0.8～1g/L，32℃～37℃继续振荡培养8～10h，离心收集菌体。

步骤(4)中，所述的细胞破碎方法为超声破碎。

步骤(4)或(5)中，所述的镍离子亲和层析使用的是Ni²⁺-NTA树脂。

有益效果：本发明应用基因工程技术在原核宿主细胞中高效表达了重组抗菌肽buforin IIb，经实验验证该重组抗菌肽buforin IIb对多种细菌和真菌具有杀菌作用，且本发明表达效率高，分离纯化简单，重组蛋白纯度高，易操作，易放大，表达产物稳定性好，适于大规模工业化生产，对研制新型高效的buforin IIb抗菌药物具有重要价值。

附图说明

图1为pSUMO-buforin IIb表达载体图谱。

图2为重组SUMO-buforin IIb融合蛋白表达SDS-PAGE分析及鉴定。其中，1为未诱导的全菌蛋白；2，3，4分别为挑取三个克隆诱导后的全菌蛋白；5为Western Blotting鉴定的诱导表达产物。

图3为0.5mMIPTG诱导和1g/L乳糖诱导的重组buforin IIb表达产物SDS-PAGE分析。其中，1为未诱导的菌体蛋白；2，5分别为经1g/L乳糖诱导和0.5mMIPTG诱导的全菌蛋白；3，6分别为经1g/L乳糖诱导和0.5mMIPTG诱导破碎后的上清蛋白；4，7分别为经1g/L乳糖诱导和0.5mMIPTG诱导破碎后的沉淀蛋白。

图4为重组buforin IIb的纯化。其中，a为LPDataView监控下的融合蛋白Ni-NTA亲和纯化；b为SDS-PAGE分析乳糖诱导下重组可溶性buforin IIb融合蛋白的纯化；1为诱导破碎后上清蛋白；2为上样流出液；3为洗涤液；4为洗脱液。

图5为Tricine/SDS-PAGE分析SUMO-buforin IIb融合蛋白的酶切及进一步纯化。其中，a为Tricine/SDS-PAGE分析SUMO蛋白酶对SUMO-buforin IIb融合蛋白的切割；1为纯化后的SUMO-buforin IIb融合蛋白；2为SUMO蛋白酶对融合蛋白切割后的混合物。b 为Tricine/SDS-PAGE分析重组buforin IIb的再纯化；1为切割后再纯化的重组buforin IIb。图6为重组buforin IIb蛋白的质谱图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

(1)构建表达载体：

根据大肠杆菌偏爱的密码子和抗菌肽buforin IIb的氨基酸序列，以及pSUMO的多克隆位点，设计合成如下四条引物进行ovrelap PCR，其中Buforin IIb-F2和Buforin IIb-R2做为模板。

Buforin IIh-F1：5′-TTAC GGT CTC CGT GCT GGT CTG CAG TTT CCA GTT G-3′

Bsa I

Buforin IIb-F1：5′-ATCC AAG CTT TTAGCG CAG CAG ACG GCG CA-3′

Hind III

Buforin IIb-F2：5′-CGT GCT GGT CTG CAG TTT CCA GTT GGC CGT CTG-3′

Buforin IIb-F2：5′-GCG CAG CAG ACG GCG CAG CAG GCG ACG CAG CAG ACGGCC AAC TGG AA-3′

在50μl PCR反应管中建立如下反应体系：

补H₂O至50μl，

反应条件如下：

冷却至4℃，

反应结束后，取10μl进行2.0％Agarose电泳鉴定。

随后PCR产物和pSUMO载体分别进行Bsa I和Hind III双酶切，回收酶切产物进行连接，常规CaCl₂法转化大肠杆菌DH5α进行重组克隆的鉴定，从而获得重组表达质粒pSUMO-buforin IIb。载体构建见图1。

(2)构建基因工程菌：

1.将甘油冻存保存的Rosetta(DE3)接种划平板，37℃倒置培养过夜；

2.挑取单克隆至装有4mL LB的试管中，37℃ 220rpm振摇12h；

3.吸取1mL菌液至1.5mL离心管中，4℃ 12000g离心3min，弃上清；

4.用400μL预冷的CaCl₂重悬菌体沉淀，12000g离心3min，弃上清；

5.用200μL预冷的CaCl₂再次重悬菌体沉淀，置冰上过夜；

6.将1μl上述重组表达质粒pSUMO-buforin IIb全部加入200μL感受态细菌中，置冰上1h；

7.42℃热激90sec，迅速置冰中5min；加入600μL 37℃预热的LB培养液；

8.37℃，220rpm振摇1h，离心后全部涂布于含50mg/L Kan的LB平板，37℃倒置培养过夜。

(3)诱导表达及表达产物鉴定：

小规模诱导鉴定实验：平板上挑取3个克隆，各接种于4mL含卡那霉素50mg/L的LB液体培养基(含胰蛋白胨0.04g，酵母提取物0.02g，NaCl 0.04g)，37℃振荡培养4h使OD600达到0.8～1，加IPTG至终浓度为1mM，继续振荡培养6h，12500g离心10min收集菌体并留样进行SDS-PAGE结合考马斯亮蓝G-250染色分析。同时取样进行12％SDS-PAGE电泳，然后以半干法电转移至硝酸纤维素膜上，取下硝酸纤维素膜TBS短暂漂洗后经5％光明脱脂奶粉室温封闭1h，TBST漂洗3次后，与His-Tag单抗孵育过夜，次日TBST漂洗3次后，与IRDye800标记的羊抗鼠IgG孵育1h，最后TBST 3次洗膜经Odyssey红外激光成像系统扫描实验结果，进一步鉴定诱导表达产物。如图2所示，与未诱导相比，基因工程菌都能很好的诱导出buforin IIb融合蛋白表达(22kDa左右)，western blotting结果进一步证实了带His标签的buforin IIb融合蛋白的表达。

放大培养和优化实验：将上述鉴定正确pSUMO-buforin IIb-rosetta(DE3)冻存菌株接种于4mL含卡那霉素50mg/L的LB液体培养基(含胰蛋白胨0.04g，酵母提取物0.02g，NaCl 0.04g)，37℃振荡培养16h，然后取1mL接种到100mL LB液体培养基，37℃振摇培养2～4h，OD600达到0.8～1时，加乳糖至终浓度为1g/L或IPTG至终浓度0.5mM，均继续振荡培养8h，12500g离心10min收集菌体并留样，按每g菌体沉淀加5mLPBS缓冲液重悬诱导表达后的菌体沉淀，经超声破碎后，12500g，4℃离心15min后取上清和沉淀留样，进行SDS-PAGE结合考马斯亮蓝G-250染色分析。如图3，由于IPTG有毒，乳糖作为一种廉价无毒的诱导剂，其buforin IIb诱导表达量要明显高于IPTG诱导的buforin IIb表达量。

(4)大规模纯化：

将pSUMO-buforin IIb-rosetta(DE3)冻存菌株接种于4mL含卡那霉素50-60mg/L的LB液体培养基(含胰蛋白胨0.04g，酵母提取物0.02g，NaCl 0.04g)，37℃振荡培养16h，然后取10mL接种到1L LB液体培养基，37℃振摇培养2～4h，OD600达到0.8～1时，加乳糖至终浓度为0.8-1g/L，32℃-37℃继续振荡培养8-10h，12500g离心10min收集菌体。按每g菌体沉淀加5mL 0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，20mM咪唑，pH7.9的结合缓冲液重悬诱导表达后收集的菌体沉淀，经超声破碎后，12500g，4℃离心15min后取上清，上清与经结合缓冲液预平衡过的Ni²⁺-NTA树脂在4℃结合120min，利用Biologic LP层析系统，将上述结合缓冲液以0.5mL/min流速冲洗，至流出液OD₂₈₀值到达基线，再用0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，50mM咪唑，pH7.9的洗涤缓冲液以0.5mL/min流速冲洗，至流出液OD₂₈₀值到达基线，用0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，250mM咪唑，pH7.9的洗脱缓冲液以0.5mL/min流速冲洗，至流出液OD₂₈₀值到达基线，分步收样；洗脱液上清用140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄的PBS缓冲液透析，BCA法测定蛋白浓度。如图4，纯化的SUMO-buforin IIb融合蛋白纯度至少在90％以上，含量达188mg。

(5)融合蛋白的酶切及进一步纯化：

根据SUMO酶酶切手册对融合蛋白进行酶切，具体条件如下：按50μg融合蛋白加入 1U SUMO酶，30℃酶切30min。由于SUMO标签和SUMO蛋白酶的N-端均含有6个组氨酸蛋白标签，所以继续利用Ni²⁺-NTA亲和层析来分离SUMO标签、SUMO蛋白酶及目的蛋白，得到目的蛋白。酶切后的蛋白混合液以0.5mL/min流速上样至Ni-NTA结合缓冲液预平衡的Ni-NTA亲和层析柱，收集流出液；用Ni-NTA洗脱缓冲液以0.5mL/min流速冲洗，至流出液OD₂₈₀值到达基线，收集洗脱液。随后制备15％浓度的分离胶(尿素)，10％浓度的中间胶及4％浓度的浓缩胶；最终样品浓缩十倍，与2×上样缓冲液(4％SDS，12％甘油，50mMTris，2％巯基乙醇，0.01％溴酚蓝)混合，沸水浴5min后上样电泳，固定液(50％甲醇，10％醋酸)固定30min，考马斯亮蓝G-250染色1h，后脱色液脱色，如图5所示，SUMO酶切及进一步分离纯化后的样品经Tricine/SDS-PAGE分析，每升培养液可得到纯度大于95％的样品55mg。如图6所示纯化得到的buforin IIb的质谱分子量为2560.566道尔顿，与天然buforin IIb蛋白的理论分子量一致，说明SUMO酶酶切位点的特异性及准确性。

实施例2：

将实施例1得到的纯化产物buforin IIb进行活性检测。

最小抑菌浓度(MIC)用来测定抗菌肽对部分大肠杆菌革兰氏阴性菌(Escherichia coli K₁₂D₃₁)、革兰氏阳性菌(Bacillus subtilis)和真菌(Saccharomyces cerevisiae)的抑菌活性。接种冻存大肠杆菌于普通LB中培养过夜，次日按1∶100的比例重新接种于新鲜LB中，培养至OD600约为0.6左右(大约2.5小时)。同时将5天前用马铃薯斜面培养基(PDA)30℃培养的真菌，用无菌水冲洗斜面，获得孢子悬浮液(10⁶/ml)。分别取100μl菌液或孢子悬浮液加入96孔无菌板，向每孔中加入10μl不同稀释浓度的合成的抗菌肽buforin IIb以及重组的buforin IIb，将96孔板置于37℃培养过夜，酶标仪检测OD₆₂₀，计算细菌的存活率和抑菌率。存活率％＝加入抗菌肽的吸收值/不加抗菌肽的孔的吸收值，抑菌率％＝1-存活率％，最小抑菌浓度定义为抑菌率％＞80％的抗菌肽浓度。结果见表1。

表1重组抗菌肽buforin IIb对部分革兰氏阳性、阴性菌和真菌的最小抑菌浓度(MIC)

Claims

1.重组抗菌肽buforin IIb的生产方法，其特征在于，它包括如下步骤：

(3)将步骤(2)得到的工程菌以乳糖为诱导剂诱导表达SUMO-buforin IIb融合蛋白；

2.根据权利要求1所述的重组抗菌肽buforin IIb的生产方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的大肠杆菌为E.coli rosetta(DE3)。

3.根据权利要求1所述的重组抗菌肽buforin IIb的生产方法，其特征在于，步骤(3)中，诱导表达方法为：将步骤(2)得到的工程菌接种于含卡那霉素50～60mg/L的LB液体培养基，37℃振荡培养16h，然后取10mL接种到1L LB液体培养基，37℃振荡培养2～4h，OD600达到0.8～1时，加乳糖至终浓度为0.8～1g/L，32℃～37℃继续振荡培养8～10h，离心收集菌体。

4.根据权利要求1所述的重组抗菌肽buforin IIb的生产方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的细胞破碎方法为超声破碎。

5.根据权利要求1所述的重组抗菌肽buforin IIb的生产方法，其特征在于，步骤(4)或(5)中，所述的镍离子亲和层析使用的是Ni²⁺-NTA树脂。