CN110343732A

CN110343732A - 一种泰斯巴汀类似物的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN110343732A
Application number: CN201810284249.8A
Authority: CN
Inventors: 张琪
Original assignee: Nanjing Kemobir Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Sichuan Futong Technology Co ltd
Priority date: 2018-04-02
Filing date: 2018-04-02
Publication date: 2019-10-18
Anticipated expiration: 2038-04-02
Also published as: CN110343732B

Abstract

本发明公开了一种泰斯巴汀类似物的制备方法，其包含以下步骤(1).如下式(式I)所示前体肽1或前体肽2在硫酯酶催化下，所述前体肽第8位的D‑Thr或D‑Ser与第11位的氨基酸发生缩合反应即得。还公开了一种用于制备泰斯巴汀类似物的试剂盒，所述的试剂盒含如式I所示的前体肽1或前体肽2。本发明公开了一种前体肽，所述前体肽如式I所示的前体肽1或前体肽2。还公开了所述前体肽在制备合成泰斯巴汀类似物的试剂盒中的应用。本发明泰斯巴汀类似物的制备方法快速、高效，可用于大规模构建抗菌活性化合物，并建立泰斯巴汀类似物库，以筛选更有药物价值的化合物。

Description

一种泰斯巴汀类似物的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于化学与生物技术工程领域，涉及一种泰斯巴汀类似物的制备方法及其应用。

背景技术

天然产物，尤其是微生物来源的天然化合物，一直是抗生素类药物发现或发展的源泉，如抗感染药物青霉素的发现就是一个非常好的例子。但随着抗生素使用的不规范，以及细菌抗性基因进化等原因，细菌耐药性已经越来越成为一个危害公众健康的巨大隐患，目前市场上的商业化抗生素多来源于上世纪中期——抗生素发现的黄金年代，但它们在应对细菌耐药性问题上已越来越无能为力，急需发现新型的抗生素药物。

泰斯巴汀(Teixobactin)是近30年来发现的第一种新型抗生素，它具有新型的骨架，是一类含有十一个氨基酸残基的非核糖体多肽，具有非常好的抗菌活性(图1)。研究表明，它可以杀死一些臭名昭著的耐药性革兰氏阳性致病菌，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)等，且效果非常显著。实验室研究结果表明，目前使用多种手段，仍未培养出抗泰斯巴汀的耐药致病菌，这表明其具有独特的抗菌机制，可以用来对抗日益严峻的细菌耐药性问题。同时泰斯巴汀未表现出明显的细胞毒性，这些优点都使得其受到广泛关注，并具有开发成临床使用药物的巨大潜力。

由于泰斯巴汀巨大的药物开发潜力，很多化学、生物、医药界的工作者都将目光聚焦到它的研究上。很多有机合成化学家，进行了巨大的努力，对其进行了全合成工作，并得到了各种类似物。然而，由于泰斯巴汀复杂的化学结构，使得通过化学合成的方法生产泰斯巴汀及其类似物的前景有限。例如，CN106632604A公开了一种泰斯巴汀类似物及其制备方法，其包括在固相合成树脂上制备直链肽，用CH₂Cl₂洗涤树脂进行环化，抽除CH₂Cl₂，加入无水DMF、吡啶、醋酸铜，过夜震荡，然后用半制备型HPLC纯化，收集产物，冷冻干燥，得到环化产物。其方法非常复杂，操作步骤繁琐，制备时间长，且不利于一次性快速大量制备多个不同的化合物。另外，其制备中使用大量化学试剂造成环境污染，不利于工业推广。

发明内容

本发明解决的技术问题是为了克服现有技术中缺乏一种快速、简单、高效且大量制备泰斯巴汀(Teixobactin)类似物的制备方法的缺陷，提供一种泰斯巴汀类似物的制备方法及其应用。所述制备方法可用于建立泰斯巴汀类似物库，以筛选更有药物价值的化合物。

为解决这一技术问题，本发明的技术方案之一为，一种泰斯巴汀类似物的制备方法，其包含以下步骤：(1).如下式(式I)所示前体肽1或前体肽2在硫酯酶催化下，所述前体肽第8位的D-Thr或D-Ser与第11位的氨基酸发生缩合反应即得。在式I的前体肽硫酯酶缩合反应中，第8位的D-Ser/Thr的羟基通过进攻11位的L-Ile的酯基成环。

优选地，还包括步骤(2).使所述硫酯酶失活，离心并收集上清。更优选地，还包括步骤(3).将步骤(2)所得的产物冻干，获得干粉。

硫酯酶(thioseterase,TE)是属于酯酶家族的酶，在巯基上表现出酯酶活性，可催化脂肪酸链的终止作用，水解脂酰基-S-酰基载体蛋白的硫酯键，释放自由脂肪酸的酶。

优选地，所述硫酯酶(thioseterase,TE)的终浓度为2～20μM，缩合反应的温度为25～35℃，且pH为7.5～8.0。

更优选地，所述硫酯酶的终浓度为2μM；所述的温度为30℃；所述的pH为8.0。所述缩合反应的反应时间优选为30min，反应体系为50mM的MOPS溶液。

进一步更优选地，所述离心的速度为11,000×g，时间为10min。

优选地，所述硫酯酶失活是通过加入2倍反应体积的甲醇，或在55～65℃中水浴10～30min实现的。

更优选地，所述硫酯酶为含硫酯酶模块的非核糖体聚肽合酶(nonribosomalpeptide synthetase,NRPS)。非核糖体肽合成酶是一类多功能蛋白质复合体，其独立于信使RNA，能识别、激活、转运氨基酸底物并按特定顺序合成非核糖体肽。NRPS构成天然生物活性产物的一大类，是细菌和霉菌等的次级代谢产物，具有结构多样性和重要的药用价值。目前发现的NRPS在微生物体内可能作为抗生素、铁载体、毒素、含氮物质的储存场所及调节生长等的信号分子等发挥各种功能。

最优选地，所述硫酯酶模块为TE1-TE2；所述TE1-TE2其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明中的硫酯酶模块，首先采用在线的NRPS合成模块预测工具——PKS/NRPSAnalysis，对来源于β-变形杆菌Eleftheria terrae的泰斯巴汀生物合成基因进行分析，得到其生物合成途径中编码的两个连续的硫酯酶模块(TE1-TE2，图2)，并按照氨基酸序列进行大肠杆菌表达密码子优化，设计出编码基因，所述的硫酯酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

上述核苷酸序列交金唯智公司进行合成，并克隆到大肠杆菌表达载体pET28a上。最后将这一编码了合成泰斯巴汀所使用的硫酯酶模块的质粒导入到大肠杆菌表达菌株BL21中，进行异源表达并纯化。使用pET28a表达载体，可以得到N端带有六个连续组氨酸标签的蛋白，这使得后续蛋白质的纯化只需使用商业化可得的镍柱，就可以得到足够反应使用的硫酯酶模块。同样地，其它常规带标签的载体也可用于本发明。

为解决这一技术问题，本发明的技术方案之一为，一种用于制备泰斯巴汀类似物的试剂盒，所述的试剂盒含如式I所示的前体肽1或前体肽2。优选地，所述试剂盒还包括氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的硫酯酶TE1-TE2。

为解决这一技术问题，本发明的技术方案之一为，一种前体肽，所述的前体肽如下式(式I)所示的前体肽1或前体肽2。

泰斯巴汀的前体肽合成，采用传统的固相合成技术，从羧基端(C端)倒数第二个氨基酸开始，将其与活化好的树脂连接，随后使用Fmoc保护的氨基酸作为原料，经过脱保护、缩合两个步骤，逐步延伸肽链至氨基端(N端)第一个氨基酸，在酸性条件下，水解释放合成好的多肽，并在水相中将其与C端的最后一个被甲酯化的氨基酸缩合连接，经高效液相色谱(HPLC)分离纯化，得到前体肽。

为解决这一技术问题，本发明的技术方案之一为，所述前体肽在制备合成泰斯巴汀类似物的试剂盒中的应用。

为解决这一技术问题，本发明的技术方案之一为，一种泰斯巴汀类似物，所述泰斯巴汀类似物如下式(式II)所示的泰斯巴汀类似物1或泰斯巴汀类似物2。

本发明在前体肽的合成及硫酯酶模块的表达中，使用的策略均是常规、成熟的方法，便于重复操作及应用。本发明中得到的泰斯巴汀类似物，其具体实施方式将在下文详细说明，其结构经高分辨串级质谱(HR-MS-MS)进行鉴定确认。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明提供了快速、高效、大规模构建抗菌活性化合物泰斯巴汀类似物的制备方法，其可用于建立泰斯巴汀类似物库，以筛选更有药物价值的化合物。

附图说明

图1为泰斯巴汀的化学结构，其是一个含有11个氨基酸残基的缩酯环肽，第10位的氨基酸(L-allo-enduracididine)是一个独特的非蛋白质氨基酸；

图2为泰斯巴汀生物合成基因簇中的两个非核糖体多肽合成酶及其包含的各功能域，通过软件预测，其中每个包含的功能域与泰斯巴汀的化学结构相匹配，值得注意的是，txo2的末端含有两个连续的硫酯酶模块(TE1-TE2)；

图3为前体肽1和前体肽2的固相合成制备路线；

图4为前体肽1的LC-MS图谱，前体肽1的第八位是一个D型的苏氨酸，C端被甲酯化保护。前体肽1的计算的[M+2H]2+为631.8770，LC-MS检测得到的分子量为631.8753；

图5为前体肽1的MS-MS串联图谱，前体肽1的碎裂片段，与高分辨串联质谱检测到的分子量相互匹配，确定前体肽1的结构；

图6为前体肽2的LC-MS图谱，前体肽2的第八位是一个D型的丝氨酸，C端被甲酯化保护。前体肽1的计算的[M+2H]2+为624.8692，LC-MS检测得到的分子量为624.8695；

图7为前体肽2的MS-MS串联图谱，前体肽2的碎裂片段，与高分辨串联质谱检测到的分子量相互匹配，确定前体肽2的结构；

图8为泰斯巴汀类似物1的LC-MS图谱，泰斯巴汀类似物1的末端羧基与第八位的苏氨酸形成分子内酯键，得到环状的泰斯巴汀类似物。泰斯巴汀类似物1的计算的[M+2H]2+为615.8645，LC-MS检测得到的分子量为615.8634；

图9为泰斯巴汀类似物1的MS-MS串联图谱，泰斯巴汀类似物1中8-11个氨基酸成环后的特征碎片分子量为442.2767，高分辨串联质谱检测到的分子量为442.2725；

图10为泰斯巴汀类似物2的LC-MS图谱，泰斯巴汀类似物2的末端羧基与第八位的丝氨酸形成分子内酯键，得到环状的泰斯巴汀类似物。泰斯巴汀类似物2的计算的[M+2H]2+为608.8565，LC-MS检测得到的分子量为608.8565；

图11为泰斯巴汀类似物2的MS-MS串联图谱，泰斯巴汀类似物1中8-11个氨基酸成环后的特征碎片分子量为428.2610，高分辨串联质谱检测到的分子量为428.2609。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。其他任何与以下实例阐述所使用的相似或者均等的方法或者材料均可用于本发明，本文所载方法仅做示范，并不做任何限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1前体肽1的合成制备和鉴定

合成起始于将L-Arg(Pbf)与树脂偶联。2-氯代三苯甲基氯树脂(1.1mmol/g,0.1mmol)加入反应容器，使用5ml干燥的二氯甲烷(dichloro-methane,DCM)清洗三次，再加入5ml的干燥DCM溶胀活化30min。称量Fmoc-L-Arg(Pbf)0.3mmol溶于DCM:DMF(N,N-dimethylformamide,二甲基甲酰胺)(50Wt％:50Wt％)和二异丙基乙胺(0.6mmol,diisopropyl-ethylamine,DIEA)的混合溶液中，在氮气保护下，加入活化好的树脂中，并震荡反应3h。随后分别使用5ml的DCM和5ml的DMF各清洗三次，真空干燥，称重用于下一步反应。

将上一步制备的树脂继续使用5ml的干燥DCM溶胀30min，随后加入10ml含20％哌啶的DMF处理30min，脱掉氨基酸的保护基Fmoc。脱Fmoc保护完成，用5ml DMF溶解Fmoc-Ala-OH 0.3mmol和HBTU(2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate即苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐)/HOBt(1-Hydroxybenzotriazole即1-羟基苯并三唑)/DIEA(1:2:2)，并加入反应容器中，震荡反应3h。完成氨基酸偶联，再使用5ml含20％哌啶的DMF做脱Fmoc处理，随后按照要合成的多肽顺序，加入Fmoc-D-Ser(OtBu)，并逐个加入Fmoc-D/L-Ser(OtBu)、Fmoc-D/L-Ile、Fmoc-D/L-Ile，Fmoc-D/L-Gln(Trt)、Fmoc-D/L-Ser(OtBu)、Fmoc-D/L-Ile和(Boc)-D/L-Phe，重复偶联、脱Fmoc保护，最终完成多肽连的延伸。随后加入2ml的含2％的三氟乙酸的DCM，室温震荡10min，过滤并收集滤液，重复此步骤5次，将收集到的滤液合并、旋干，得到粗品多肽，并使用LC-MS确认。

使用5ml的DCM:DMF(1:1)溶液将上一步得到的线性多肽(1eq.)溶解，加入L-Ile-OMe(1eq.)，HBTU(3eq.)，HOBt(6eq.)，DIEA(6eq.)，在室温下搅拌反应3h，液相检测，待偶联完成，加水析出多肽，过滤收集滤饼，并烘干称重，得到粗品多肽。将此粗品多肽用10ml的三氟乙酸:三异丙基硅烷:水(5:5:95)混合液溶解，在氮气保护下搅拌1h，进行氨基酸侧链保护基脱保护。所得溶液旋干，得到油状脱保护基后的多肽，用10ml含20％乙腈的水溶液溶解，离心5min，取上清，进行HPLC纯化制备，目标组分经LC-MS分析确认后，收集合并、冻干，得到纯度大于85％的多肽前体。

HPLC纯化条件：使用C18半制备柱(Kromasil C18,10×250mm,5μm)，流速为2ml/min，流动相A使用水(含0.1％三氟乙酸)，流动相B使用乙腈(含0.1％三氟乙酸)：0-15min，流动相B由20％提高到90％；15-18min，维持流动相比例不变；18-20min，流动相B由90％下降到20％。纯化所得的目标组分收集混合，由LC-MS确认后，冻干可以得到产品。

图4为前体肽1的LC-MS图谱，前体肽1的第八位是一个D型的苏氨酸，C端被甲酯化保护。前体肽1的计算的[M+2H]2+为631.8770，LC-MS检测得到的分子量为631.8753。图5为前体肽1的MS-MS串联图谱，前体肽1的碎裂片段，与高分辨串联质谱检测到的分子量相互匹配，确定前体肽1的结构为设计的结构。

实施例2前体肽2的合成制备和鉴定

前体肽2的合成制备方法中，除将加入Fmoc-D-Ser(OtBu)的步骤改为加入Fmoc-D-Thr(OtBu)外，基本同实施例1，HPLC纯化条件也同实施例1。图6为前体肽2的LC-MS图谱，前体肽2的第8位是一个D型的丝氨酸，C端被甲酯化保护。前体肽1的计算的[M+2H]2+为624.8692，LC-MS检测得到的分子量为624.8695。图7为前体肽2的MS-MS串联图谱，前体肽2的碎裂片段，与高分辨串联质谱检测到的分子量相互匹配，确定前体肽2的结构为设计的结构。

实施例3硫酯酶TE1-TE2的表达纯化

构建带有TE1-TE2编码基因(所述基因序列如SEQ ID NO：1所示)的表达载体pET28a(金唯智)，将其电转化导入大肠杆菌表达菌株BL21中，在相应抗性的平板涂布培养过夜，挑选单克隆转化子，加入到5ml的LB培养基中，并添加终浓度为50μg/ml卡那霉素，37℃生长12h。随后转接到含有50μg/ml卡那霉素的1L液体LB培养基中，180转每分钟，37℃摇床中生长到OD600值到0.6-0.8，加入终浓度为0.2mM的诱导剂IPTG，在150转每分钟，20℃摇床中继续表达12h。5000转每分钟，离心10min收集菌体，收集得到的菌体可直接用于纯化或者-80℃冻存。

将收集的菌体溶于20ml裂解溶液I(50mM MOPS,200mM NaCl,10％Glycerol,pH8.0)中，在冰水浴中超声破碎30min(80w,3s/17s,45min)。破碎后的菌体裂解液，使用超速离心机，13000转每分钟，在4℃下离心30min，小心收集上清，弃掉菌体残渣。将收集的上清与3ml裂解溶液I预先平衡过的含镍树脂填料混合，随后装载到纯化柱上，依次使用50mM咪唑洗脱10ml、100mM咪唑洗脱5ml、500mM咪唑洗脱5ml，并收集合并目标组分，使用超滤管(Millipore,10KD)超滤浓缩。浓缩后的蛋白溶液经过GE公司的PD-10脱盐柱,按照产品的标准说明书操作脱盐，并收集目标组分，经SDS-PAGE分析确认，所得蛋白可直接用于体外活性实验，或者冻存于-80℃冰箱以便今后使用。

实施例4酶催化产物制备反应

本实施例为典型的酶催化制备反应，使用200μmol的前体肽1，加入20μmol的硫酯酶TE1-TE2，在50mM的MOPS溶液(pH 8.0，不含有甘油)中30℃反应约30min，随后加入两倍体积的甲醇，使酶失活，12000转每分钟离心10min，弃掉沉淀，上清收集冻干，产品进行LC-MS分析。

图8为前体肽1环化产物，即泰斯巴汀类似物1的LC-MS图谱。泰斯巴汀类似物1的末端羧基与第八位的苏氨酸形成分子内酯键，得到环状的泰斯巴汀类似物。泰斯巴汀类似物1的计算的[M+2H]2+为615.8645，LC-MS检测得到的分子量为615.8634。图9为泰斯巴汀类似物1的MS-MS串联图谱，泰斯巴汀类似物1中8-11个氨基酸成环后的特征碎片分子量为442.2767，高分辨串联质谱检测到的分子量为442.2725。

实施例5酶催化产物制备反应

本实施例为典型的酶催化制备反应，使用100μmol的前体肽1，加入10μmol的硫酯酶TE1-TE2，在50mM的HEPES溶液(pH 7.5，不含有甘油)中35℃反应约20min，随后60℃水浴10min，使酶失活，11000转每分钟离心10min，弃掉沉淀，上清收集冻干，产品进行LC-MS分析。

其LC-MS图谱和MS-MS串联图谱均说明产生了泰斯巴汀类似物1。

实施例6酶催化产物制备反应

本实施例为典型的酶催化制备反应，使用50μmol的前体肽2，加入5μmol的硫酯酶TE1-TE2，在25mM的MOPS溶液(pH 7.8，不含有甘油)中25℃反应约30min，随后加入两倍体积的甲醇，使酶失活，11000转每分钟离心10min，弃掉沉淀，上清收集冻干，产品进行LC-MS分析。

图10为泰斯巴汀类似物2的LC-MS图谱，泰斯巴汀类似物2的末端羧基与第八位的丝氨酸形成分子内酯键，得到环状的泰斯巴汀类似物。泰斯巴汀类似物2的计算的[M+2H]2+为608.8565，LC-MS检测得到的分子量为608.8565。

实施例7酶催化产物制备反应

本实施例为典型的酶催化制备反应，使用100μmol的前体肽2，加入2μmol的硫酯酶TE1-TE2，在50mM的MOPS溶液(pH 8.0，不含有甘油)中35℃反应约20min，随后加入两倍体积的甲醇，使酶失活，11000转每分钟离心10min，弃掉沉淀，上清收集冻干，产品进行LC-MS分析。

其LC-MS图谱和MS-MS串联图谱均说明产生了泰斯巴汀类似物2。

序列表

<110> 南京凯沫比尔生物科技有限公司;

<120> 一种泰斯巴汀类似物的合成方法

<130> P1711355C

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1674

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 硫酯酶TE1-TE2基因

<400> 1

atgcgcgcag gtagtcgtgc aggcccgggt ccgtatccgt tagtgccgct gcgtagtgcc 60

ggcacagccc gcccgctgtt cttttttcac gagggctttg gtggcctgca ggtgtatgaa 120

cgcttcgccc gctgcattgc cgacgatatc ccgatctatg gcgtggaggc agcaggcctg 180

cagcagagtg aaccggccta cctgaccgtg gaagcaatgg cagccctgta tgttgaacgc 240

atccgcagcg tgcaacctca cggtccgtac cgtctggcag gttggagcgg tggtggtgtg 300

ctggcctatg aagtggcata tcagctgctg ggccgtgatg agcgcgtgga ctacgttggc 360

ctgatcgaca gttacaacct gaccgccgaa cctcaggcac cggaagttgc agcacctgag 420

ccgttcctgg cacgtattct ggaatatacc cgccctgacc tggatgaagc agaactgcgc 480

gccctgctgg cattaggcag cctggatgcc atggttgcac atgcacatcg ccagggctgg 540

ttacctgccg cactggatag cgaggagatt cgtcgtcgct gccgcctggc caaccatatt 600

acccaggcct gcatgagtta cttcccgccg agtttaccgg ttcctgttca gctgttcagc 660

gccagcttac ctgcccgtga agacccggca aatggctgga gcgcagtgct gggtcctcag 720

ctgcaacgca ttccggtgcg cggtacccat ctgagcattg tgcaggagcc ggcagcaatg 780

agcgaggtgg cagcagccat gaatcaggca ctgcgcgaag accgtgcagc agcagcaagt 840

acaagcggcg ccccgagcct gcctttagat agccgtgtgc tgcctctgca acgtggtaca 900

ccgggcgcac cgccggtttt ttgcattccg ggcgcaggca tgagcgttgc cgcctttgtt 960

ggcctgaccc agacactgcc tccgcagctg ccgctgtacg gtttacaacc gcgtggtctg 1020

gatggtaagc aggttccgca tgtgagcgtg gaagcagcag cagccagtca tgtgcaggca 1080

attgcagagt tcctgccgga aggcccggtt cgtttactgg gccatagctt tggtggttgg 1140

gtggcactgg aggttggccg tcgtctgcgt gccttaggtc gtcaggtgga accggtggtg 1200

gtggtggata cacgcccgcc tagtagtcag cctggccatc cggcccatag ccgtgcagaa 1260

gtgtatgatc gcctgattgg cgtgctggag caagaagctg gtcgtagcct ggatctgtgt 1320

ggtacagccc tggcactgct gcctgaaccg gcacagcgcc aacgtctgcg cgatgcaatg 1380

gttgcagcag gcttactgcc tccgccggtt ggcccggaag cattacgcgg catgctggcc 1440

gtgtttgccg ccaatgtgaa taccgcctat gcaccggccg caccgttcga aggtgaagtg 1500

gttctgattc aggccggcca tgcccctgat cctgcagcac gtgccctgcg tgcagaagac 1560

tggcgcaccc gtagtcgtgg ttttcgcgca cataccgccc cgggcaatca tgtgaccgtg 1620

ctgaaacctc cgcatgttgc aagcgtggca gccctgctgg cagacgtttg gtaa 1674

<210> 2

<211> 557

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TE1-TE2蛋白

<400> 2

Met Arg Ala Gly Ser Arg Ala Gly Pro Gly Pro Tyr Pro Leu Val Pro

1 5 10 15

Leu Arg Ser Ala Gly Thr Ala Arg Pro Leu Phe Phe Phe His Glu Gly

20 25 30

Phe Gly Gly Leu Gln Val Tyr Glu Arg Phe Ala Arg Cys Ile Ala Asp

35 40 45

Asp Ile Pro Ile Tyr Gly Val Glu Ala Ala Gly Leu Gln Gln Ser Glu

50 55 60

Pro Ala Tyr Leu Thr Val Glu Ala Met Ala Ala Leu Tyr Val Glu Arg

65 70 75 80

Ile Arg Ser Val Gln Pro His Gly Pro Tyr Arg Leu Ala Gly Trp Ser

85 90 95

Gly Gly Gly Val Leu Ala Tyr Glu Val Ala Tyr Gln Leu Leu Gly Arg

100 105 110

Asp Glu Arg Val Asp Tyr Val Gly Leu Ile Asp Ser Tyr Asn Leu Thr

115 120 125

Ala Glu Pro Gln Ala Pro Glu Val Ala Ala Pro Glu Pro Phe Leu Ala

130 135 140

Arg Ile Leu Glu Tyr Thr Arg Pro Asp Leu Asp Glu Ala Glu Leu Arg

145 150 155 160

Ala Leu Leu Ala Leu Gly Ser Leu Asp Ala Met Val Ala His Ala His

165 170 175

Arg Gln Gly Trp Leu Pro Ala Ala Leu Asp Ser Glu Glu Ile Arg Arg

180 185 190

Arg Cys Arg Leu Ala Asn His Ile Thr Gln Ala Cys Met Ser Tyr Phe

195 200 205

Pro Pro Ser Leu Pro Val Pro Val Gln Leu Phe Ser Ala Ser Leu Pro

210 215 220

Ala Arg Glu Asp Pro Ala Asn Gly Trp Ser Ala Val Leu Gly Pro Gln

225 230 235 240

Leu Gln Arg Ile Pro Val Arg Gly Thr His Leu Ser Ile Val Gln Glu

245 250 255

Pro Ala Ala Met Ser Glu Val Ala Ala Ala Met Asn Gln Ala Leu Arg

260 265 270

Glu Asp Arg Ala Ala Ala Ala Ser Thr Ser Gly Ala Pro Ser Leu Pro

275 280 285

Leu Asp Ser Arg Val Leu Pro Leu Gln Arg Gly Thr Pro Gly Ala Pro

290 295 300

Pro Val Phe Cys Ile Pro Gly Ala Gly Met Ser Val Ala Ala Phe Val

305 310 315 320

Gly Leu Thr Gln Thr Leu Pro Pro Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Leu Gln

325 330 335

Pro Arg Gly Leu Asp Gly Lys Gln Val Pro His Val Ser Val Glu Ala

340 345 350

Ala Ala Ala Ser His Val Gln Ala Ile Ala Glu Phe Leu Pro Glu Gly

355 360 365

Pro Val Arg Leu Leu Gly His Ser Phe Gly Gly Trp Val Ala Leu Glu

370 375 380

Val Gly Arg Arg Leu Arg Ala Leu Gly Arg Gln Val Glu Pro Val Val

385 390 395 400

Val Val Asp Thr Arg Pro Pro Ser Ser Gln Pro Gly His Pro Ala His

405 410 415

Ser Arg Ala Glu Val Tyr Asp Arg Leu Ile Gly Val Leu Glu Gln Glu

420 425 430

Ala Gly Arg Ser Leu Asp Leu Cys Gly Thr Ala Leu Ala Leu Leu Pro

435 440 445

Glu Pro Ala Gln Arg Gln Arg Leu Arg Asp Ala Met Val Ala Ala Gly

450 455 460

Leu Leu Pro Pro Pro Val Gly Pro Glu Ala Leu Arg Gly Met Leu Ala

465 470 475 480

Val Phe Ala Ala Asn Val Asn Thr Ala Tyr Ala Pro Ala Ala Pro Phe

485 490 495

Glu Gly Glu Val Val Leu Ile Gln Ala Gly His Ala Pro Asp Pro Ala

500 505 510

Ala Arg Ala Leu Arg Ala Glu Asp Trp Arg Thr Arg Ser Arg Gly Phe

515 520 525

Arg Ala His Thr Ala Pro Gly Asn His Val Thr Val Leu Lys Pro Pro

530 535 540

His Val Ala Ser Val Ala Ala Leu Leu Ala Asp Val Trp

545 550 555

Claims

1.一种泰斯巴汀(Teixobactin)类似物的制备方法，其特征在于，其包含以下步骤：(1).如下式(式I)所示前体肽1或前体肽2在硫酯酶催化下，所述前体肽第8位的D-Thr或D-Ser与第11位的氨基酸发生缩合反应即得。

2.如权利要求1所述的制备方法，其还包括步骤(2).使所述硫酯酶失活，离心并收集上清；优选地，还包括步骤(3).将步骤(2)所得的产物冻干，获得干粉。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述硫酯酶的终浓度为2～20μM，缩合反应的温度为25～35℃，且pH为7.5～8.0；优选地，所述硫酯酶的终浓度为10μM，所述的温度为30℃，且所述的pH为8.0。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述离心的速度为11,000×g，时间为10min。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，使所述的硫酯酶失活是通过加入2倍反应体积的甲醇，或在55～65℃中水浴10～30min实现的。

6.如权利要求1～5任一项所述的制备方法，所述硫酯酶为含硫酯酶模块的非核糖体聚肽合酶；优选地，所述硫酯酶模块为TE1-TE2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

7.一种用于制备泰斯巴汀类似物的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含如下式(式I)所示的前体肽1或前体肽2；优选地，所述试剂盒还包括硫酯酶TE1-TE2，所述TE1-TE2其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

8.一种前体肽，其特征在于，所述前体肽如下式(式I)所示的前体肽1或前体肽2。

9.如权利要求9所述的前体肽在制备合成泰斯巴汀类似物的试剂盒中的应用。

10.一种泰斯巴汀类似物，其特征在于，所述泰斯巴汀类似物如下式(式II)所示的泰斯巴汀类似物1或泰斯巴汀类似物2。