CN109021068B - 一种线性假多肽及其制备方法以及在抗菌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种线性假多肽及其制备方法以及在抗菌药物中的应用。该线性假多肽包含了Loloatin C药核序列结构的生物等电体，即包含了Tyr、Pro、Trp和Phe的生物等电体，四个氨基酸残基为L‑构型或D‑构型，其结构更为稳定，在血浆中的稳定性更高。本发明所述线性假多肽采用固相合成法制备得到的，总收率为25～35％。本发明线性假多肽的制备方法具有反应条件温和、容易自动化、操作简便安全、产品纯度高、总收率高的优点，制备的线性多肽可以用于制备抗菌药物，特别是治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染的药物，具有高效、广谱、不易产生耐药性的优点。

Description

一种线性假多肽及其制备方法以及在抗菌药物中的应用

技术领域

本发明属于抗菌肽领域，特别涉及一种线性假多肽及其制备方法以及在抗菌药物中的应用。

背景技术

抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是由机体特定基因编码且在外界诱导下产生的，大量存在于动物、植物及微生物中，是自然界生物体内极其重要的防御体系。它们是一类具有生物学活性的小分子多肽，一般由10～100个氨基酸残基组成。抗菌肽大多具有两亲性并且带有一定量的正电荷(通常为+2～+9)，属于阳离子多肽(Theis,T.,Stahl,U.Cellular and Molecular Life Sciences:CMLS 2004,61,437-455)。世界上第一个被发现的抗菌肽是天蚕素，是Boman等在1980年从诱导的惜古比天蚕蛹淋巴液中分离出的，随后人们从各种动植物以及微生物中发现并分离了多种具有抗菌活性的多肽，他们普遍具有抗菌谱广、抗菌效率高等特点，因此这类多肽物质被命名为“Antimicrobial peptides”，中文名为“抗菌肽”。

Loloatins抗菌肽家族包含4个成员，即Loloatin A、B、C和D，它们是在实验室条件下由采集于巴布亚新几内亚南部海滩沿岸大堡礁上的海洋微生物的发酵液中分离出来的一类环十肽抗菌素。研究发现，该家族中的Loloatin C[结构式为cyclo-(-L-Val-L-Orn-L-Leu-D-Tyr-L-Pro-L-Trp-D-Phe-L-Asn-L-Asp-L-Trp)]不仅对革兰氏阳性菌(G⁺)表现出和tyrocidine C一致甚至更好的抗菌活性，还对革兰氏阴性菌(G^-)Escherichia coli表现出明显的抗菌活性(Gerard,J.M.,et al.J.Nat.Prod.1999,62,80-85)。Chen随后的研究发现Loloatin C的药核结构为-D-Tyr-Pro-Trp-D-Phe-，即该四肽序列结构对Loloatin C抑菌活性的发挥起着关键的作用(Chen H.Preparation and Evaluation of the Loloatinsand Their Analogues.Ann Arbor,Mich:UMI,2003)。

研究结果表明，抗菌肽是通过破坏细菌细胞膜的完整性从而使得膜的穿透性增加而杀死细菌(Ghadiri,M.R.et al.,Nature,2001,412:452-455；Zasloff,M.,Nature,2002,415:389-395)。因此，利用计算机辅助药物设计技术，以Loloatin C的药核结构作为模板，设计具有更多正电性和α-螺旋结构的多肽，将是寻找具有更强抗菌活性的抗菌肽的有效途径。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种线性假多肽。

本发明的另一目的在于提供所述线性假多肽的制备方法。

本发明还又一目的在于提供所述线性假多肽在制备抗菌药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种线性假多肽，所述的线性假多肽为包含Loloatin C的药核序列结构-A1-A2-A3-A4-的生物等电体；

所述的A1为L-Phe(4-NH₂)或D-Phe(4-NH₂)；其中，L-Phe(4-NH₂)、D-Phe(4-NH₂)表示L-Phe或D-Phe的侧链苯环上的4位被-NH₂取代；

所述的A2为L-Pro或D-Pro；

所述的A3为L-Ala(4-Py)或D-Ala(4-Py)；其中，Py表示吡啶基(pyridyl)，L-Ala(4-Py)、D-Ala(4-Py)表示丙氨酸(L-Ala或D-Ala)侧链甲基上连接一个吡啶基，连接的位置是在吡啶的4位(吡啶中以N为第1位)；

所述的A4为L-Phe或D-Phe。

所述的线性假多肽分别在N-端和C-端进一步延伸，结构式为H-A1′-A1-A2-A3-A4-A4′-OH或H-A1′-A1-A2-A3-A4-A4′–NH₂；

所述的A1′为L-Asn或L-Asp；

所述的A4′为L-Asn或L-Asp。

所述的线性假多肽优选为选自如下任一序列：

(1)H-Asp-D-Phe(4-NH₂)-Pro-Ala(4-Py)-D-Phe-Asn-OH；

(2)H-Asp-D-Phe(4-NH₂)-Pro-Ala(4-Py)-D-Phe-Asn–NH₂；

(3)H-Asn-D-Phe(4-NH₂)-Pro-Ala(4-Py)-D-Phe-Asn-OH；

(4)H-Asn-D-Phe(4-NH₂)-Pro-Ala(4-Py)-D-Phe-Asn–NH₂；

(5)H-Asn-D-Phe(4-NH₂)-Pro-Ala(4-Py)-D-Phe-Asp-OH。

所述的线性假多肽的制备方法为采用固相多肽合成法，可以采用手工操作制备，也可以采用多肽合成仪制备，比如利用美国应用系统生物公司生产的Pioneer多肽合成仪制备；所述线性假多肽的合成为氨基酸的装配从C端到N端逐个进行，由人工控制或自动合成仪设定控制，具体合成步骤为：首先称取0.1mmol结合了第一个氨基酸Asp-OtBu侧链羧基的Rink amide树脂，装柱，用20％体积比的二氯甲烷(DCM)二甲基甲酰胺(DMF)溶液溶胀30min，然后用30％体积比的哌啶二甲基甲酰胺溶液脱保护基(Fmoc)，DMF清洗3次。将9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸溶于三吡咯基膦氧苯骈三唑六氟合磷盐(PyBOP)，羟基苯骈三唑(HOBt)和二异丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的溶液上柱循环偶合反应30～60min，DMF清洗3次；重复以上脱保护、偶合反应、清洗等步骤直到制备结束；制备完成后，抗菌肽经如下步骤从树脂上剪切：取下反应后的树脂肽，加入切肽试剂(一般为95％(v/v)三氟醋酸，2.5％(v/v)二氯甲烷，2.5％(v/v)三乙基硅烷)，室温反应2h，过滤，滤液在室温下用旋转蒸发仪蒸除易挥发溶剂，加少量水，冷冻干燥得线性假多肽。

所述的线性假多肽的制备方法还包括将上述获得的线性假多肽进行纯化的步骤：采用反相高效液相法(RP-HPLC)进行纯化，洗脱液为甲醇-0.1％三氟醋酸水溶液，收集洗脱峰，冷冻干燥，得到纯化后的线性假多肽。

所述的线性假多肽在制备抗菌药物中的应用。

所述的抗菌药物包括治疗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌感染的药物。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明克服了现有的抗生素类药物中存在的抗菌谱较窄，统称只对细菌有效、对真菌和病毒等病原体无效且易产生耐药性的缺点，提供一种线性假多肽，可用于制备抗菌药物，特别是治疗革兰氏阳性菌药物时，具有高效、广谱、不易产生耐药性的优点。

(2)本发明利用96孔板法检测抗菌肽的抗菌活性，并以预先合成的天然抗菌肽Loloatin C为对照，进行抗菌活性检测。结果表明，本发明所设计合成的线性假多肽CHR-L1-05保留了Loloatin C的抗菌活性，线性抗菌肽CHR-L1-03和CHR-L1-01保留了一定程度的抗菌活性。此外，本发明还检测了合成的线性假多肽对人体红细胞的溶血活性，实验表明，线性假多肽溶血率值很低，证实本发明所合成的线性假多肽的溶血毒性很小，即对人体的毒副作用较小。

(3)本发明线性假多肽的制备方法具有反应条件温和、容易自动化、操作简便安全、产品纯度高、总收率高(总收率为25～35％)的优点，制备的线性多肽可以用于制备抗菌药物，特别是治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染的药物。

(4)本发明所使用的原料廉价易得、工艺简单，容易实现工业化。预示该项目具有非常好的产业化前景。

(5)本发明的线性假多肽为首次合成的新化合物，结构更为稳定，在血浆中的稳定性更高。

附图说明

图1为线性假多肽CHR-L1-03的质谱图。

图2为线性假多肽CHR-L1-03的二级质谱图。

图3为线性假多肽CHR-L1-01和CHR-L1-03的溶血率统计结果图。

图4为线性假多肽CHR-L1-05和HR-01的在小鼠血清中的稳定性结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所使用的各原料以及试剂，除特别指出的以外，均可由市售获得。

本发明中涉及线性假多肽是在对来自海洋微生物代谢物Loloatin C抗菌药核序列结构研究的基础上，以计算机辅助药物设计技术为工具设计，由固相多肽合成法合成的。其中，-A1-A2-A3-A4-为线性假多肽的核心结构，也即是Loloatin C药核结构的生物等电体，四个氨基酸残基为L-构型或D-构型；

A1为L-Phe(4-NH₂)或D-Phe(4-NH₂)；其中，括号内“4-NH₂”表示L-Phe或D-Phe的侧链苯环上的4位被氨基取代；

A2为L-Pro或D-Pro；

A3为L-Ala(4-Py)或D-Ala(4-Py)；其中，括号内“4-Py”表示L-Ala或D-Ala的侧链甲基上连接一个吡啶基(pyridyl)，连接的位置是在吡啶的4位(吡啶中以N为第1位)；

A4为L-Phe或D-Phe。

本发明的线性假多肽可以分别在N-端和C-端进一步延伸，结构式为H-A1′-A1-A2-A3-A4-A4′-OH或H-A1′-A1-A2-A3-A4-A4′–NH₂。其中，A1′为L-Asn和L-Asp中的一种；A4′为L-Asn和L-Asp中的一种。

本发明线性假多肽的制备方法采用固相多肽合成法，可以采用手工操作制备，也可以采用多肽合成仪制备，比如利用美国应用系统生物公司生产的Pioneer多肽合成仪制备。线性假多肽的序列结构及产率见表1。

表1线性假多肽的序列结构及产率

*注：Py代表pyridyl，即吡啶基。

实施例1线性假多肽的制备及分离纯化

1、线性假多肽CHR-L1-01的氨基酸序列见表1。

(1)本实施例采用固相多肽合成法。具体步骤如下：氨基酸的装配从C端到N端逐个进行，由人工控制。首先称取0.1mmol结合了第一个氨基酸Asp-OtBu侧链羧基的Rink amide树脂(购自吉尔生化(上海)有限公司)，装柱，用20％体积比的二氯甲烷(DCM)二甲基甲酰胺(DMF)溶液溶胀30min，然后用30％体积比的哌啶二甲基甲酰胺溶液脱保护基(Fmoc)，DMF清洗3次。将9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸即Fmoc-D-Phe-OH溶于三吡咯基膦氧苯骈三氮唑六氟合磷(PyBOP)，羟基苯骈三唑(HOBt)和二异丙基乙基胺(DIPEA)中，溶解后的溶液上柱循环偶合反应30～60分钟，DMF清洗3次；重复以上脱保护、偶合反应、清洗等步骤，依次偶合Ala(4-Py)，Pro，D-Phe(4-NH₂)和Asp，制备结束。

(2)制备完成后，线性假多肽CHR-L1-01经如下步骤从树脂上剪切：取下反应后的树脂肽，加入切肽试剂(其成分为95％(v/v)三氟醋酸，2.5％(v/v)二氯甲烷，2.5％(v/v)三乙基硅烷)，室温反应2h，过滤，滤液在室温下用旋转蒸发仪蒸除易挥发溶剂，加少量水，冷冻干燥得线性假多肽CHR-L1-01粗品。

(3)线性假多肽CHR-L1-01粗品的纯化采用反相高效液相法(RP-HPLC)，洗脱液为甲醇-0.1％(v/v)三氟醋酸水溶液，采用梯度洗脱，收集各洗脱峰馏分，室温下旋转蒸发除去甲醇，水溶液经冷冻干燥，得28.2mg假多肽CHR-L1-01纯品，收率为25.3％。产品经质谱分析鉴定：线性假多肽CHR-L1-01的理论分子量C₃₉H₄₇N₉O₁₀+H([M+H]⁺)为802.3524,实验值802.3513；ESI-MS/MS：碎片峰m/z 525.2473为{Pro-Ala[3-(4-pyridyl)]-D-Phe-Asn+H}⁺。

2、参考上述线性假多肽CHR-L1-01的合成方法合成CHR-L1-02，CHR-L1-03，CHR-L1-04和CHR-L1-05(氨基酸序列见表1)。其中，线性假多肽CHR-L1-03的质谱图如图1所示，CHR-L1-03的二级质谱图如图2所示。

上述合成过程中涉及到的L-Phe(4-NH₂)、D-Phe(4-NH₂)、L-Ala(4-Py)、D-Ala(4-Py)均是N端由Fmoc保护的氨基酸，购自上海吉尔生化科技有限公司。

实施例2线性假多肽的抗菌活性检测

以下实施例中所使用的各种菌株购于中国生物制品鉴定所。

采用96孔板法对合成的线性假多肽的抗菌活性进行检测，具体步骤是：将菌种复苏，接种斜面37℃培养过夜，挑菌体于MH培养基中，37℃培养过夜，稀释菌液使其浓度为10⁴～10⁵CFU/ml，按每孔100μl菌液接种于96孔板中，随后将多肽按一定比例稀释后，每孔中加入10μl，将96孔板置于37℃培养过夜，酶标仪检测OD₅₇₀值。检测结果列于表2。

含有线性假多肽的细菌的生长浓度(OD₅₇₀)与不加线性假多肽的细菌的生长浓度(OD₅₇₀)的差值相比于后者的比值若大于90％时，其线性假多肽浓度即近似等同于最小抑制浓度(MIC)。MIC被定义为显著抑制细菌生长的最低浓度。

表2线性假多肽对不同细菌的最小抑菌浓度(MIC)

*注：表2中LoC代表阳性药Loloatin C；01，02，03，04，05分别代表线性假多肽CHR-L1-01，CHR-L1-02，CHR-L1-03，CHR-L1-04，CHR-L1-05。

表2中，MIC值越小，表示线性抗菌肽的抗菌能力越强。

实施例3线性假多肽的体外溶血活性检测

本实施例用于检测合成的线性假多肽对兔血红细胞(购自郑州九龙生物制品有限公司)的溶血活性，使用的血样取于正常兔血。

具体的检测步骤是：兔血红细胞经PBS缓冲溶液(35mM磷酸缓冲液/0.15mol/LNaCl,pH 7.0)洗涤，取100μl的8％(v/v)兔血红细胞悬液于96孔板中，每孔中加入100μl抗菌肽溶液，37℃摇荡1h后，1500rpm离心5min，转移100μl上清液于新的96孔板中，通过酶标仪检测414nm波长下的吸收。阳性对照采用0.1％Triton X-100，阴性对照采用PBS。检测结果列于表3。

表3五种抗菌肽的溶血活性

*注：表3中LoC代表阳性药Loloatin C；01，02，03，04，05分别代表线性假多肽CHR-L1-01，CHR-L1-02，CHR-L1-03，CHR-L1-04，CHR-L1-05。

表3中抗菌肽的溶血率值越小，表示其溶血毒性越小。

线性假多肽CHR-L1-01和CHR-L1-03的溶血率如图3所示。

实施例4 CHR-L1-05和HR-01在小鼠血清中的稳定性

本实施例用于检测本发明中的CHR-L1-05和HR-01(中国发明专利CN201010226536.7)在小鼠血清中的稳定性。实验所用小鼠血清购自郑州九龙生物制品有限公司。

实验步骤：待测多肽样品溶解于PBS缓冲液中，配制成10μM/L的样品溶液。取1ml样品溶液与4ml小鼠血清混合，悬浮1min，将悬浮液置于37℃温浴锅中，搅拌温浴，每隔30min或60min，取样10μl，用甲醇和质量分数为20％高氯酸处理除去蛋白，重新溶解于50μl甲醇/水(50:50,V/V)，取10μl进行HPLC分析，通过峰面积定量，计算半衰期t_1/2，结果见图4。

从图4可见，线性假多肽CHR-L1-05在小鼠血清中的稳定性比HR-01高，其半衰期为25.2h；而HR-01在小鼠血清中的半衰期为6.6h。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种线性假多肽，其特征在于：所述的线性假多肽选自如下任一序列：

（1）H-Asp-D-Phe(4-NH₂)-Pro-Ala(4-Py)-D-Phe-Asn-OH；

（2）H-Asp-D-Phe(4-NH₂)-Pro-Ala(4-Py)-D-Phe-Asn–NH₂；

（3）H-Asn-D-Phe(4-NH₂)-Pro-Ala(4-Py)-D-Phe-Asn-OH；

（4）H-Asn-D-Phe(4-NH₂)-Pro-Ala(4-Py)-D-Phe-Asn–NH₂；

（5）H-Asn-D-Phe(4-NH₂)-Pro-Ala(4-Py)-D-Phe-Asp-OH；

其中，D-Phe(4-NH₂)表示D-Phe的侧链苯环上的4位被-NH₂取代；

Py表示吡啶基；Ala(4-Py)表示丙氨酸侧链甲基上连接一个吡啶基，连接的位置是在吡啶的4位，吡啶中以N为第1位。

2.线性假多肽在制备抗菌药物中的应用，其特征在于：

所述的抗菌药物为治疗革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌感染的药物；

所述的线性假多肽的序列如下所示：

H-Asn-D-Phe(4-NH₂)-Pro-Ala(4-Py)-D-Phe-Asp-OH；其中，D-Phe(4-NH₂)表示D-Phe的侧链苯环上的4位被-NH₂取代；

Py表示吡啶基；Ala(4-Py)表示丙氨酸侧链甲基上连接一个吡啶基，连接的位置是在吡啶的4位，吡啶中以N为第1位。

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