CN109354604B

CN109354604B - 一种线性假多肽及其制备方法与用途

Info

Publication number: CN109354604B
Application number: CN201811028247.9A
Authority: CN
Inventors: 陈河如; 王怀玲; 周帆; 刘杰; 刘志军
Original assignee: Guangzhou Yaoben Junan Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Yaoben Junan Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2018-09-04
Filing date: 2018-09-04
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2038-09-04
Also published as: CN109354604A

Abstract

本发明公开了一种线性假多肽及其制备方法与应用。本发明线型假多肽包含了Loloatin C药核序列结构的生物等电体结构，即包含了Tyr、Pro、Trp和Phe的生物等电体结构，四个氨基酸残基为L‑构型或D‑构型。本发明所述线性假多肽采用固相合成法制备得到的，总收率为18～40％。本发明线性假多肽的制备方法具有反应条件温和、容易自动化、操作简便安全、产品纯度高、总收率高的优点，所制备的线性假多肽可以用于制备抗氧化及抗衰老药物，特别是用于制备抗衰老药物。

Description

一种线性假多肽及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及抗衰老多肽领域，具体涉及一种线性假多肽及其制备方法与其在抗氧化抗衰老药物中的应用。

背景技术

抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是由机体特定基因编码且在外界诱导下产生的，大量存在于动物、植物及微生物中，是自然界生物体内极其重要的防御体系。它们是一类具有生物学活性的小分子多肽，一般由10～100个氨基酸残基组成。抗菌肽大多具有两亲性并且带有一定量的正电荷(通常为+2～+9)，属于阳离子多肽(Theis,T.,Stahl,U.Cellular and Molecular Life Sciences:CMLS 2004,61,437-455)。世界上第一个被发现的抗菌肽是天蚕素，是Boman等在1980年从诱导的惜古比天蚕蛹淋巴液中分离出的，随后人们从各种动植物以及微生物中发现并分离了多种具有抗菌活性的多肽，他们普遍具有抗菌谱广、抗菌效率高等特点，因此这类多肽物质被命名为“Antimicrobial peptides”，中文名为“抗菌肽”。

研究揭示，抗氧化作用是抗菌肽表现出来的重要生物活性之一。很多天然抗菌肽都具有抗氧化能力，如Lfcin、Magainins、Apidecin、Melittin以及Cecropi ns。目前对于抗菌肽的抗氧化作用机制尚未完全明确，一般而言，它与传统的抗氧化剂具有相似的作用机理，主要包括对自由基的清除、鳌合金属离子以及抑制脂质过氧化(Yang,H.,Wang,X,,Liu,X.,Wu,J.,Liu,C.,Gong,W.Mole cular&Cellular Proteomics Mcp 2009,8(3):571-583)。

机体内发生氧化反应会导致自由基的产生，自由基是指含有一个或多个不成对电子的原子团，如羟基自由基、超氧阴离子等。自由基具有极强的氧化性，病理状态下或者伴随着年龄增长，自由基在机体内大量产生却不能被及时地清除，就会导致其在细胞内堆积，并与机体内的生物大分子，如蛋白质、核酸、脂质等相互作用，生成过多的氧化物与过氧化物，最终就会对机体的新陈代谢造成严重影响。衰老以及很多疾病如肿瘤、肺气肿、心血管疾病、关节炎等都与自由基的损伤有关(Kullisaar,T.,Songisepp,E.,Mikelsaar,M.,Zilmer,K.,Vihalemm,T.,Zilmer,M.British Journal of Nutrition 2003,90(2):449-456)^[62]。

Loloatins抗菌肽家族包含4个成员，即Loloatin A、B、C和D，它们是在实验室条件下由采集于巴布亚新几内亚南部海滩沿岸大堡礁上的海洋微生物的发酵液中分离出来的一类环十肽抗菌素。研究发现，该家族中的Loloatin C[结构式为cyclo-(-L-Val-L-Orn-L-Leu-D-Tyr-L-Pro-L-Trp-D-Phe-L-Asn-L-Asp-L-Trp)]不仅对革兰氏阳性菌(G⁺)表现出和tyrocidine C一致甚至更好的抗菌活性，还对革兰氏阴性菌(G^-)Escherichia coli表现出明显的抗菌活性(Gerard,J.M.,et al.J.Nat.Prod.1999,62,80-85)。Chen随后的研究发现Loloatin C的药核结构为-D-Tyr-Pro-Trp-D-Phe-，即该四肽序列结构对Loloatin C抑菌活性的发挥起着关键的作用(Chen H.Preparation and Evaluation of the Loloatinsand Their Analogues.Ann Arbor,Mich:UMI,2003)。

研究结果表明，抗菌肽是通过破坏细菌细胞膜的完整性从而使得膜的穿透性增加而杀死细菌(Ghadiri,M.R.et al.,Nature,2001,412:452-455；Zasloff,M.,Nature,2002,415:389-395)。因此，利用计算机辅助药物设计技术，以Loloatin C的药核结构作为模板，设计具有更多正电性和α-螺旋结构的多肽，由于序列中包含芳香氨基酸，可能具有较好的抗氧化作用，将是寻找具有抗衰老多肽的有效途径。

发明内容

本发明的所解决的技术问题在于一种具有抗衰老作用的线性假多肽，该线性假多肽为包含Loloatin C的药核序列结构-A1-A2-A3-A4-的生物等电体结构。根据loloatin C药核结构的生物等电体，设计合成具有抗衰老作用的多肽。

本发明所解决的技术问题还在于提供上述线性假多肽的制备方法。

本发明所解决的技术问题还在于提供上述线性假多肽在抗氧化及抗衰老药物中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下方案：

本发明线性假多肽是在对来自海洋微生物代谢物Loloatin C抗菌药核序列结构研究的基础上，以计算机辅助药物设计技术为工具设计，由固相多肽合成法合成的。其中，-A1-A2-A3-A4-为线性假多肽的核心结构，也即是Loloatin C药核结构的生物等电体。

作为一种优选方案，所述A1为L-Phe(4-NH₂)或D-Phe(4-NH₂)或L-Tyr(3-Cl)或D-Tyr(3-Cl)；所述A2为L-Pro或D-Pro；所述A3为L-Ala(4-Py)或D-Ala(4-Py)或L-Ala(2-Py)或D-Ala(2-Py)或L-Trp或D-Trp；所述A4为L-Phe或D-Phe或L-Phg或D-Phg或L-Phe(4-F)或D-Phe(4-F)。

本发明线性假多肽可以分别在N-端和C-端进一步延伸，结构式为H-A1′-A1-A2-A3-A4-A4′-OH。其中，所述A1′为L-Asn或L-Asp中的一种；所述A4′为L-Asn或L-Asp中的一种。

本发明线性假多肽的制备方法采用固相多肽合成法，可以采用手工操作制备，也可以采用多肽合成仪制备，比如利用美国应用系统生物公司生产的Pioneer多肽合成仪制备。

作为一种优选方案，所述线性假多肽的具体合成步骤为：氨基酸的装配从C端到N端逐个进行，由人工控制或自动合成仪设定控制。首先称取0.1mmol结合了第一个氨基酸Asp-OtBu侧链羧基的Rink amide树脂(购自吉尔生化(上海)有限公司)，装柱，用20％体积比的二氯甲烷(DCM)二甲基甲酰胺(DMF)溶液溶胀30min，然后用30％体积比的哌啶二甲基甲酰胺溶液脱保护基(Fmoc)，DMF清洗3次。将9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸溶于三吡咯基膦氧苯骈三唑六氟合磷盐(PyBOP)，羟基苯骈三唑(HOBt)和二异丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的溶液上柱循环偶合反应30～60min，DMF清洗3次；重复以上脱保护、偶合反应、清洗等步骤直到制备结束。制备完成后，抗菌肽经如下步骤从树脂上剪切：取下反应后的树脂肽，加入切肽试剂，一般为95％三氟醋酸，2.5％二氯甲烷，2.5％三乙基硅烷，室温反应2h，过滤，滤液在室温下用旋转蒸发仪蒸除易挥发溶剂，加少量水，冷冻干燥得线性假多肽粗品。

线性假多肽的纯化一般采用反相高效液相法(RP-HPLC)，洗脱液为甲醇-0.1％三氟醋酸水溶液，收集洗脱峰，冷冻干燥，产品经质谱分析鉴定。线性假多肽的序列结构及产率见表1。

表1线性假多肽的序列结构及总收率

本发明的线性假多肽可以用于制备抗氧化和抗衰老药物。利用CAA法检测了系列线性假多肽对HepG2细胞的抗氧化活性。结果表明，本发明所设计合成的线性假多肽均对HepG2细胞具有优良的抗氧化活性，其中，以HR-AL1-03对HepG2细胞的抗氧化作用最好，其值为5.65±0.64μmol QE/g。本发明还建立秀丽隐杆线虫衰老模型评价了HR-AL1-04抗衰老作用，实验表明，HR-AL1-04可延长线虫的正常自然寿命，能够延缓线虫的正常衰老，具有抗衰老的作用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明线性假多肽用于制备抗氧化和抗衰老药物，具有广谱、不易产生耐药性的优点；

(2)本发明线性假多肽的制备方法反应条件温和、容易自动化、操作简便安全、产品纯度高、总收率高。

附图说明

图1为线性假多肽HR-AL1-04的质谱图。

图2为线性假多肽HR-AL1-04的二级质谱图。

图3为线性假多肽HR-AL1-04对秀丽隐杆线虫寿命的影响。

图4为线性假多肽HR-AL1-04对秀丽隐杆线虫百草枯损伤的保护。

图5为线性假多肽HR-AL1-04对线虫体内ROS的影响。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1线性假多肽HR-AL1-01的制备及分离纯化

线性假多肽HR-AL1-01的氨基酸序列见表1。

本实施例采用固相多肽合成法。具体步骤如下：氨基酸的装配从C端到N端逐个进行，由人工控制。首先称取0.1mmol结合了第一个氨基酸Asp-OtBu侧链羧基的Rink amide树脂(购自吉尔生化(上海)有限公司)，装柱，用20％体积比的二氯甲烷(DCM)二甲基甲酰胺(DMF)溶液溶胀30min，然后用30％体积比的哌啶二甲基甲酰胺溶液脱保护基(Fmoc)，DMF清洗3次。将9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸即Fmoc-D-Phg-OH、三吡咯基膦氧苯骈三氮唑六氟合磷(PyBOP)，羟基苯骈三唑(HOBt)和二异丙基乙基胺(DIPEA)溶解于DMF，溶液上柱循环偶合反应30～60分钟，DMF清洗3次；重复以上脱保护、偶合反应、清洗等步骤，依次偶合Ala(4-Py)，Pro，D-Phe(4-NH₂)和Asp，制备结束。

制备完成后，线性假多肽HR-AL1-01经如下步骤从树脂上剪切：取下反应后的树脂肽，加入切肽试剂(其成分为95％三氟醋酸，2.5％二氯甲烷，2.5％三乙基硅烷)，室温反应2h，过滤，滤液在室温下用旋转蒸发仪蒸除易挥发溶剂，加少量水，冷冻干燥得线性假多肽HR-AL1-01粗品。

线性假多肽HR-AL1-01粗品的纯化采用反相高效液相法(RP-HPLC)，洗脱液为甲醇-0.1％三氟醋酸水溶液，采用梯度洗脱，收集各洗脱峰馏分，室温下旋转蒸发除去甲醇，水溶液经冷冻干燥，得28.0克假多肽HR-AL1-01纯品，总收率为25.6％。产品经质谱分析鉴定：线性假多肽HR-AL1-01的理论分子量C₃₈H₄₅N₉O₁₀+H([M+H]⁺)为788.3368,实验值788.3324；ESI-MS/MS：碎片峰m/z 511.2282为{Pro-Ala[3-(4-pyridyl)]-D-Phg-Asn+H}⁺；碎片峰m/z 673.3080为{D-Phe(4-NH₂)-Pro-Ala[3-(4-pyridyl)]-D-Phg-Asn+H}⁺；碎片峰m/z 278.1141为{M-{Pro-Ala[3-(4-pyridyl)]-D-Phg-Asn}+H}⁺；碎片峰m/z 523.2300为[M-(D-Phg-Asn)+H]⁺；碎片峰m/z 656.2830为[M-Asn+H]⁺。

实施例2线性假多肽的抗氧化活性检测

以下实施例中所使用的人肝癌细胞HepG2购于中国科学院上海细胞所。

采用CAA法检测待测线性假多肽对HepG2细胞的抗氧化活性。首先取对数生长期的HepG2的细胞，用胰酶消化下来，离心后将细胞浓度调整为6×10⁵个/mL，最后接种到96孔黑板中100μL/孔。培养24h。贴壁24h后，先将L1-12用CAA抗氧化培养基稀释成一系浓度(终浓度的两倍)，并设定正常对照组，采用槲皮素作为标准品。孵育结束后移弃完全培养基，用PBS冲洗细胞一遍，随后按照实验设计先加入50μL的标准品或样品和50μL含有DCFH-DA的CAA抗氧化培养基。最后置于37℃孵育1h。弃去含有DCFH-DA的培养基，随后进行以下两种不同操作：①PBS wash：先用PBS冲洗96孔黑板一次，然后加入ABAP 100μL/孔(空白组除外，空白组加入不含ABAP的CAA氧化培养基)。②No PBS wash：直接弃掉含DCFH-DA的培养基，不用PBS冲洗96孔黑板，直接加ABAP 100μL/孔(空白组除外，空白组加入不含ABAP的CAA氧化培养基)。最后立即将96孔黑板放在多功能酶标仪中开始检测荧光信号变化，条件为：激发波长(485nm)，发射波长(538nm)，37℃，每5min测定一次荧光强度值，时长为60min。以时间为横坐标，以荧光度值为纵坐标绘制不同样品浓度下荧光值与时间的变化曲线。

CAA unit＝100-(∫SA/∫CA)×100

公式中∫SA为标准品或是样品的荧光积累量，∫CA为空白对照组的荧光积累量。通过样品或是标准品的各浓度曲线计算EC₅₀值，最终通过EC₅₀值计算CAA值。结果表示为：每克样品的QE当量(μmol QE/100g FW.)。检测结果列于表2。

表2线性假多肽对HepG-2细胞的抗氧化活性

表2中，CAA值越大，表示线性假多肽的抗氧化能力越强。

实施例3 HR-AL1-04对秀丽隐杆线虫衰老模型的作用

本实施例用于检测HR-AL1-04对秀丽隐杆线虫抗衰老模型，使用的秀丽隐杆线虫购自Caenorhabditis Genetics Center(CGC，University of Minnesota,Minneapolis,MN)。

具体的检测步骤是：将不同浓度的HR-AL1-04加在含有E.coil OP50 NGM琼脂板表面，培养板含有五氟尿嘧啶(150μM)可抑制线虫繁殖。挑取同期化后L4期线虫至NGM琼脂板上，每组3板，每板40条。给药时间记为day 0，每天定点计数1次，剔除异常的线虫后，记录正常死亡的线虫。直至全部线虫死亡，停止计数，重复3次，绘制寿命曲线。实验结果见表3及图3.

表3 HR-AL1-04对秀丽隐杆线虫寿命的影响

注：所有数值均以Mean±SD的形式表示，n＝3,同栏中的数值带有不同的字母表示：这两组数值之间具有显著性差异(p<0.05)。从同期化开始，记为Day 1。

从表3及图可见，线虫的平均寿命为：21.00±1.00days，最高寿命为：24days。表明线虫的抗衰老模型构建成功。加入HR-AL1-04后，高浓度下线虫的平均寿命分别为：25.34±1.23days，最长寿命分别为：30days，与对照组相比，平均寿命延长了24.7％，并且具有浓度依赖性。结果表明，HR-AL1-04可延长线虫的正常自然寿命，能够延缓线虫的正常衰老，具有抗衰老的作用。

实施例4 HR-AL1-04对百草枯氧化损伤线虫的保护作用

本实施例用于检测HR-AL1-04对百草枯氧化损伤线虫的保护作用，使用的秀丽隐杆线虫购自Caenorhabditis Genetics Center(CGC，University of Minnesota,Minneapolis,MN)。

具体的检测步骤是：准备NGM琼脂板和线虫，设对照组和给药组。20℃培养5天后，收集线虫并配制百草枯溶液(5mM)，将收集的线虫浸泡在百草枯溶液中，4h后收集虫子，将虫子转移到准备好的NGM培养板中，每板40条，每组3板。放置在20℃培养，并每隔4h进行观察线虫是否存活，并计数。实验结果见表4和图4。

表4.HR-AL1-04对秀丽隐杆线虫百草枯损伤的保护

从同期化开始，记为Day 1。

由表4和图4可见，与对照组相比，高浓度的HR-AL1-04处理组中线虫的存活时间延长27.0％，低浓度和中浓度时存活时间分别延长11.5％和19.8％。

实施例5 HR-AL1-04对线虫体内ROS的影响

本实施例用于检测HR-AL1-04对线虫体内ROS的影响，使用的秀丽隐杆线虫购自Caenorhabditis Genetics Center(CGC，University of Minnesota,Minneapolis,MN)。

具体的检测步骤是：准备NGM琼脂板和线虫，设对照组和给药组。20℃培养5天后，用M9缓冲液收集线虫，每管大约收集500条线虫，3000g离心1min，弃上清。装有线虫的Ep管加入的生理盐水(400μL)，反复颠倒均匀，超声仪功率200W，15min。随后，3000g离心1min，取上清加入96孔黑板中(50μL/孔)，随后向每孔中加入DCFH-DA溶液(50μL，100μM)，确保96孔中工作液中DCFH-DA的终浓度为50μM。随后立即检测荧光强度，检测条件为：37℃，检测波长：激发波长：485nm，发射波长：538nm，每5min进行一次荧光强度测定，测定时长为2h。最后选取最大吸收值的时间点进行计算，计算HR-AL1-04对线虫体内ROS的抑制率。实验设置空白组：不加虫子和DCFH-DA溶液和对照物：只加虫子不加DCFH-DA溶液。实验结果见图5。

由图5可知，对照组中线虫体内的ROS含量最高，加入HR-AL1-04处理，随着HR-AL1-04浓度增加，线虫体内ROS的含量逐渐下降。显然，HR-AL1-04可降低线虫体内的ROS的含量，降低ROS对线虫造成的氧化损伤，延缓线虫衰老。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种线性假多肽，其特征在于：所述的线性假多肽选自如下任一序列：

(1)H-Asp-D-Phe(4-NH₂)-Pro-Ala(4-Py)-D-Phg-Asn-OH

(2)H-Asp-D-Phe(4-NH₂)-Pro-Ala(4-Py)-D-Phe(4-F)-Asn-OH

(3)H-Asp-D-Phe(4-NH₂)-Pro-Ala(2-Py)-D-Phe(4-F)-Asn-OH

(4)H-Asp-D-Phe(4-NH₂)-Pro-Trp-D-Phe(4-F)-Asn-OH

(5)H-Asp-D-Phe(4-NH₂)-Pro-Trp-D-Phg-Asp-OH

(6)H-Asp-D-Tyr(3-Cl)-Pro-Ala(4-Py)-D-Phe(4-F)-Asn-OH

D-Phe(4-NH₂)表示D构型苯丙氨酸侧链苯环上连接一个氨基，连结的位置在苯环的4位，以苯环跟氨基酸侧链相连的位置为第1位；D-Phe(4-F)表示D构型苯丙氨酸侧链苯环上连接一个氟代基，连结的位置在苯环的4位，以苯环跟氨基酸侧链相连的位置为第1位；D-Tyr(3-Cl)表示D构型酪氨酸侧链苯环上连接一个氯代基，连结的位置在苯环的3位，以苯环跟氨基酸侧链相连的位置为第1位；

Py表示吡啶基；Ala(4-Py)表示丙氨酸侧链甲基上连接一个吡啶基，连接的位置是在吡啶的4位，吡啶中以N为第1位。

2.如权利要求1中所述的线性假多肽在制备抗氧化药物中的应用。

3.如权利要求1中所述的线性假多肽在制备抗衰老药物中的应用。