CN109096379A - 一种枯草芽孢杆菌amep412蛋白的新功能及其抗菌肽的鉴定 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌amep412蛋白的新功能及其抗菌肽的鉴定 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还涉及了上述枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白在抗疮痂链霉菌中的应用。本发明还从枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白中鉴定出了3条抗菌肽。本发明发现了一种枯草芽孢杆菌的AMEP412蛋白的抗菌活性，并进一步从枯草芽孢杆菌的AMEP412蛋白中鉴定出了3条抗菌肽序列，为生物防治工作积累了新的材料。

Description

一种枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白的新功能及其抗菌肽的鉴定
技术领域
本发明属于植物保护与生物防治领域，涉及一种枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白的新功能及其抗菌肽的鉴定。
背景技术
马铃薯疮痂病是由链霉菌引起的一种危害马铃薯块茎的病害，主要通过土壤进行病菌的传播，从皮孔或伤口侵入后发病，症状一般为薯块表面上产生凸起或凹陷的病斑。马铃薯疮痂病不仅降低马铃薯的品质，严重时还会导致马铃薯产量的下降，造成大量的经济损失。在我国，马铃薯疮痂病在甘肃、黑龙江、四川和云南等马铃薯产区分布十分广泛，因此马铃薯疮痂病的防治变得十分迫切，但是化学防治会造成农药的残留并对环境造成污染，所以对马铃薯疮痂病进行高效的生物防治尤为重要。
芽孢杆菌是一种理想的生防微生物，对高温、紫外线和酸碱环境均具有一定的耐受性，能够有效抑制多种病原菌，对病害起到良好的防治效果。目前，已出现多种芽孢杆菌与生物防治相关的报道，包括蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌 (Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)等。此外，芽孢杆菌产生的抗菌物质如多肽、多糖、次生代谢物、抗菌蛋白等，是其拮抗病原菌的主要物质基础。但由于芽孢杆菌的种类众多，其生防效果及产生的抗菌物质均存在较大差异，因此来自于芽孢杆菌的抗菌物质仍有待进一步开发。
大部分生防菌株依靠自身产生的活性物质实现对病原菌的抑制，其中抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMP)就是一类比较有代表性的活性物质。多年以来，人们从不同种类的生物体中发现了大量的未知抗菌肽，它们是一类带正电荷的两亲性小分子抗菌肽。这种小分子抗菌肽对细菌和病毒均具有抵抗作用，从而使病原不能够侵入细胞内部。因此，研究鉴定出芽孢杆菌中的抗菌肽具有重要的意义。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白，并鉴定其新功能。
本发明的第二目的是提供一种枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白的抗菌肽，并鉴定其功能。
本发明的第三目的是提供第二种枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白的抗菌肽，并鉴定其功能。
本发明的第四目的是提供第三种枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白的抗菌肽，并鉴定其功能。
本发明通过以下技术方案来实现：
一、一种枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
上述的枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白在抗疮痂链霉菌中的应用。
二、一种枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白的抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。
上述的枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白的抗菌肽在抑制疮痂链霉菌中的应用。
三、一种枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白的抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3 所示。
上述的枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白的抗菌肽在抑制疮痂链霉菌中的应用。
四、一种枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白的抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4 所示。
上述的枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白的抗菌肽在抑制疮痂链霉菌中的应用。
首先对枯草芽孢杆菌的培养液上清进行离子交换层析和分子筛纯化，对于分离到的蛋白质组分，检测其对病原菌的抗菌活性。具有抗菌活性的蛋白质组分进行 SDS-PAGE电泳，切取蛋白质条带进行质谱测序。测序结果经数据库比对分析确认蛋白质组分为一功能未知蛋白(GenBank登录号：WP_017418614.1)，命名为AMEP412。
随后通过抗菌肽在线预测的方法分析枯草芽孢杆菌的AMEP412蛋白的序列，预测得到3条抗菌肽：SEQ ID NO:2(GPILKALKALVSKVPWGKVAS)、SEQ ID NO:3(GKVASFLKWAGNLAAAAAKY)和SEQ ID NO:4 (GKKILAYIQKHPGKIVDWFLKGY)。随后进行多肽合成和活性测试，最终确认这3 条多肽对疮痂链霉菌具有抗菌活性。
采用上述技术方案的积极效果：本发明发现了一种枯草芽孢杆菌的AMEP412蛋白的抗菌活性，并进一步从枯草芽孢杆菌的AMEP412蛋白中鉴定出了3条抗菌肽序列，为生物防治工作积累了新的材料。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌上清液的阴离子交换层析图谱，S1、S2、S3和S4：分别为4 个洗脱峰；
图2为枯草芽孢杆菌不同分离组分对疮痂链霉菌的活性测试，CK：对照，1：离子交换层析洗脱峰S1，2：离子交换层析洗脱峰S2，3：离子交换层析洗脱峰S3，4：离子交换层析洗脱峰S4；
图3为离子交换洗脱峰S2样品的分子筛纯化峰图，F1、F2、F3分别为3个洗脱峰；
图4为分子筛纯化洗脱峰的抗菌活性测试，CK为对照，1为洗脱峰F1，2为洗脱峰F2，3为洗脱峰F3；
图5为M：低蛋白质分子量Marker，1：分子筛洗脱峰F2，B1：分子筛洗脱峰F2 中的目的蛋白质条带；
图6为蛋白质条带B1进行Maldi-TOF质谱测序分析得到的质谱图；
图7为在线预测获得的AMEP412蛋白中3种抗菌肽的抗菌活性测试结果，CK为对照，GS-21、GY-20、GY-23分别为3种抗菌肽；
图8为AMEP412重组蛋白纯化样品的SDS-PAGE结果，M为蛋白质分子量Marker，1为诱导表达后的上清液，2为经过亲和纯化的洗脱样品；
图9为AMEP412重组蛋白的抗菌活性测试结果，1为CK，2为重组AMEP412蛋白；
图10为AMEP412重组蛋白的最低抑菌浓度测试，1为400mM AMEP412蛋白，2 为200mM AMEP412蛋白，3为100mM AMEP412蛋白，4为50mM AMEP412蛋白， 5为25mM AMEP412蛋白，6为12.5mM AMEP412蛋白。
具体实施方式
以下通过实施例和试验例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本发明的范围。
本发明中生物材料的来源：
1、本发明所涉及的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BU412，于2016年3月23日在中国专利局或国际专利组织承认的保藏中心进行了专利程序保藏，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称为 CCTCC，保藏单位地址：中国. 武汉. 武汉大学，保藏编号：CCTCC M 2016142；
2、疮痂链霉菌：普城沙雷氏菌BU09的分离鉴定及其对疮痂链霉菌的防治效果，安徽农业科学，2017年第45卷11期，123-124页，作者：张竹君，刘权，该菌种一直保存在黑龙江八一农垦大学，并由申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料；
3、抗菌肽序列为委托上海楚肽生物科技有限公司合成。
实施例1
枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白的分离纯化与质谱鉴定。
将枯草芽孢杆菌接种至YME液体培养基(麦芽糖10g/L、酵母浸粉4g/L、葡萄糖4g/L、pH 7.5)进行过夜培养，12000g离心收集上清，经过0.22μm的滤膜过滤，使用AKTA蛋白纯化仪进行阴离子交换层析，使用的纯化柱为GE公司的Q hp阴离子交换柱(柱体积为5mL)。使用20mM的Tris-HCl(pH7.5)缓冲液上样并平衡，以0.5M NaCl，20mM Tris-HCl缓冲液进行0-100％的线性梯度洗脱，根据吸收峰收集蛋白组分 S1-S4(图1)。使用牛津杯法测定各分离组分对疮痂链霉菌的抗菌活性(图2)。对于具有抗菌活性的蛋白组分S2，使用3kDa截留孔径的超滤管进行浓缩，经AKTA蛋白纯化仪进行分子筛纯化，所使用的纯化柱为superdex-75分子筛纯化柱(柱体积为 24mL)。使用20mM的Tris-HCl(pH7.5)缓冲液进行平衡和洗脱，根据吸收峰收集蛋白组分F1-F3(图3)，使用牛津杯法测定各分离组分对疮痂链霉菌的抗菌活性(图4) 并通过SDS-PAGE电泳检测有抗菌活性的组分(图5)。
切取图5中的蛋白条带，将胶条送交上海中科新生命生物科技有限公司进行Maldi-TOF质谱测序(图6)，经Mascot软件搜索NCBI数据库，发现该蛋白条带属于一个功能未知的蛋白(GenBank登录号为WP_017418614.1)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。由于该蛋白未经命名，我们将其命名为AMEP412。
实施例2
枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白中抗菌肽的预测。
将AMEP412(GenBank登录号为WP_017418614.1)的氨基酸序列在CAMPR3数据库上进行抗菌肽区域的在线预测，发现AMEP412的多条多肽具有构成抗菌肽的可能，结合这些多肽在AMEP412蛋白的二级结构信息，从中选择3条多肽(表1)在 APD数据库进行在线分析。结果表明，3条多肽均能形成具有疏水面的α螺旋，可能具有抗菌肽的活性。根据3条多肽链氨基酸的个数，分别命名为GS-21、GY-20和GY-23。
表1预测的AMEP412蛋白抗菌肽的序列
试验例1
预测抗菌肽的合成与活性检测。
利用固相多肽合成技术合成3条枯草芽孢杆菌的AMEP412蛋白的候选抗菌肽，合成的多肽N端乙酰化，C端酰胺化，纯度达到95％以上。多肽以50mM终浓度溶解于 20mM的Tris-HCl(pH7.5)缓冲液中。使用牛津杯法测定这3条多肽对疮痂链霉菌的抗菌活性。结果显示，3条多肽均具有对疮痂链霉菌的抗菌活性，其中GS-21和GY-20 效果要优于GY-23(图7)。
试验例2
AMEP412重组蛋白的表达纯化与活性测试。
将AMEP412(GenBank登录号为WP_017418614.1)的基因序列交由北京华大基因生物有限公司进行全基因合成，并亚克隆到pET32a载体上，转化BL21(DE3)感受态细胞，获得阳性克隆。经IPTG诱导进行原核重组表达，收集菌体，超声破碎后的上清液使用Ni-NTA纯化柱进行亲和纯化，洗脱样品进行SDS-PAGE检测重组目标蛋白(图8)，并通过牛津杯法测试重组蛋白对疮痂链霉菌的抗菌活性(图9)。结果发现，重组目标蛋白对疮痂链霉菌具有抗菌活性。
试验例3
枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白最低抑菌浓度的测定。
通过Nano drop蛋白浓度检测仪将AMEP412重组蛋白进行浓度调整，设置浓度分别为400、200、100、50、25、12.5mM，通过牛津杯法测试这些蛋白样品对疮痂链霉菌的抗菌活性，检测其最低抑菌浓度(图10)。结果发现，50mM的重组蛋白具有抑菌活性，而25mM的重组蛋白则不具备明显的抑菌活性，说明枯草芽孢杆菌AMEP412 蛋白的最低抑菌浓度为50mM。
本发明发现了枯草芽孢杆菌未知功能蛋白AMEP412的对疮痂链霉菌的抗菌功能，并进一步从枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白中鉴定出了3条抗菌肽序列，为疮痂链霉菌的生物防治工作提供了新的材料。
序列表
<110> 黑龙江八一农垦大学
<120> 一种枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白的新功能及其抗菌肽的鉴定
<130> B009
<141> 2018-08-14
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 76
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
Met Phe Gly Pro Ile Leu Lys Ala Leu Lys Ala Leu Val Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Trp Gly Lys Val Ala Ser Phe Leu Lys Trp Ala Gly Asn Leu Ala
20 25 30
Ala Ala Ala Ala Lys Tyr Ser Tyr Thr Ser Gly Lys Lys Ile Leu Ala
35 40 45
Tyr Ile Gln Lys His Pro Gly Lys Ile Val Asp Trp Phe Leu Lys Gly
50 55 60
Tyr Ser Val Tyr Asp Val Ile Lys Met Ile Leu Gly
65 70 75
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 2
Gly Pro Ile Leu Lys Ala Leu Lys Ala Leu Val Ser Lys Val Pro Trp
1 5 10 15
Gly Lys Val Ala Ser
20
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 3
Gly Lys Val Ala Ser Phe Leu Lys Trp Ala Gly Asn Leu Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Lys Tyr
20
<210> 4
<211> 23
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 4
Gly Lys Lys Ile Leu Ala Tyr Ile Gln Lys His Pro Gly Lys Ile Val
1 5 10 15
Asp Trp Phe Leu Lys Gly Tyr
20

Claims (8)

1.一种枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白在抗疮痂链霉菌中的应用。
3.一种枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白的抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.权利要求3所述的枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白的抗菌肽在抑制疮痂链霉菌中的应用。
5.一种枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白的抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
6.权利要求5所述的枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白的抗菌肽在抑制疮痂链霉菌中的应用。
7.一种枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白的抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
8.权利要求7所述的枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白的抗菌肽在抑制疮痂链霉菌中的应用。
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